Merci fir besicht Nature.com.D'Browser Versioun déi Dir benotzt huet limitéiert CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).An der Tëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir de Site ouni Stiler a JavaScript maachen.
Nei immunologesch a Massespektrometresch Methoden fir komplex Analyse vu persistent Oligosacchariden am Maisstover virbehandelt mat AFEX.Lignocellulose Biomass ass eng nohalteg Alternativ zu fossille Brennstoffer a gëtt wäit benotzt fir Biotechnologien ze entwéckelen fir d'Produktioun vu Produkter wéi Liewensmëttel, Fudder, Brennstoffer a Chemikalien.De Schlëssel fir dës Technologien ass d'Entwécklung vu Käschtekompetitiv Prozesser fir komplex Kuelenhydrater, déi a Planzenzellmaueren präsent sinn, an einfach Zucker wéi Glukos, Xylose an Arabinose ëmzewandelen.Well lignocellulose Biomass ganz haartnäckeg ass, muss se thermochemesch Behandlungen (zB Ammoniakfaser Peeling (AFEX), verdënntem Saieren (DA), ionesche Flëssegkeeten (IL)) a biologesch Behandlungen (zB enzymatesch Hydrolyse a mikrobieller Fermentatioun) a Kombinatioun ënnerworf ginn fir de gewënschte Produkt ze kréien..Wéi och ëmmer, wann kommerziell Pilz Enzyme am Hydrolyseprozess benotzt ginn, sinn nëmmen 75-85% vun de geformte löslechen Zucker Monosacchariden, an déi reschtlech 15-25% sinn löslech, intractabel Oligosacchariden, déi net ëmmer fir Mikroorganismen verfügbar sinn.Virdrun hu mir erfollegräich isoléiert a gereinegt löslech haartnäckege Oligosacchariden mat enger Kombinatioun vu Kuelestoff a Diatomaceous Äerd Trennung a Gréisst Ausgrenzung Chromatographie, an och hir Enzyminhibitoreigenschaften ënnersicht.Mir hunn erausfonnt datt Oligosacchariden déi méi héije Grad vun der Polymeriséierung (DP) methyléierter Uronsäuresubstitutioun enthalen, méi schwéier mat kommerziellen Enzymmëschungen ze veraarbecht wéi niddereg DP an neutral Oligosacchariden.Hei mellen mir d'Benotzung vu verschiddenen zousätzleche Methoden, dorënner Glykanprofiléierung mat monoklonalen Antikörper (mAbs) spezifesch fir Planzbiomass Glykanen fir Glykanbindungen a Planzenzellmaueren an enzymatesch Hydrolysaten ze charakteriséieren, Matrix-assistéiert Laser Desorptioun Ioniséierung, Zäit-of-Flight Massspektrometrie..MALDI-TOF-MS) benotzt strukturinformativ diagnostesch Peaks, déi duerch Spektroskopie nom sekundären Zerfall vun negativen Ionen, Gaschromatographie a Massespektrometrie (GC-MS) kritt goufen, fir Oligosaccharidbindungen mat an ouni Derivatioun ze charakteriséieren.Wéinst der klenger Gréisst vun Oligosacchariden (DP 4-20), sinn dës Molekülle schwéier fir mAb Bindung a Charakteriséierung ze benotzen.Fir dëse Problem ze iwwerwannen, hu mir eng nei Biotin Konjugatioun-baséiert Oligosaccharide Immobiliséierungsmethod applizéiert, déi d'Majoritéit vun nidderegen DP-löslechen Oligosacchariden op der Mikroplate Uewerfläch erfollegräich markéiert huet, déi duerno an engem héijen Duerchgang mAb System fir spezifesch Ligatiounsanalyse benotzt gouf.Dës nei Method erliichtert d'Entwécklung vu méi fortgeschratten héije Glykomanalysen an der Zukunft, déi benotzt kënne ginn fir Oligosacchariden, déi a Biomarker präsent sinn, fir diagnostesch Zwecker ze isoléieren an ze charakteriséieren.
Lignocellulosesch Biomass, besteet aus landwirtschaftlechen, Bëschaarbecht, Gras a Holzmaterialien, ass e potenzielle Fudder fir d'Produktioun vu biobaséierte Produkter, dorënner Liewensmëttel, Fudder, Brennstoff a chemesch Virgänger fir méi héichwäerteg Produkter ze produzéieren1.Kuelenhydrater (wéi Zellulose an Hemicellulose) präsent a Planzenzellmaueren ginn duerch chemesch Veraarbechtung a Biotransformatioun an Monosacchariden depolymeriséiert (wéi enzymatesch Hydrolyse a mikrobieller Fermentatioun).Gemeinsam Virbehandlungen enthalen Ammoniakfaser Expansioun (AFEX), verdënntem Säure (DA), ionesch Flëssegkeet (IL), an Dampexplosioun (SE), déi eng Kombinatioun vu Chemikalien an Hëtzt benotze fir d'Lignocelluloseproduktioun ze reduzéieren andeems se Planzenzellmaueren opmaachen3,4.Stubbornness vun der Matière, 5. Enzymatesch Hydrolyse gëtt bei enger héijer Feststoffbelaaschtung duerch kommerziell aktiv Kohlenhydrat-enthale Enzymen (CAZymes) a mikrobieller Fermentatioun mat transgenen Hefen oder Bakterien duerchgefouert fir biobaséiert Brennstoffer a Chemikalien ze produzéieren 6 .
CAZymes a kommerziellen Enzyme besteet aus enger komplexer Mëschung vun Enzymen déi synergistesch komplex Kohlenhydrat-Zockerbindungen spalten fir Monosacchariden ze bilden2,7.Wéi mir virdru gemellt hunn, mécht de komplexe Netz vun aromatesche Polymere vu Lignin mat Kuelenhydrater se héich intractabel, wat zu enger onvollstänneger Zockerkonversioun féiert, 15-25% vu Geschlecht Oligosacchariden accumuléieren, déi net während der enzymatescher Hydrolyse vun der virbehandelt Biomass produzéiert ginn.Dëst ass e gemeinsame Problem mat verschiddene Biomass Virbehandlungsmethoden.E puer Grënn fir dëse Flaschenhals enthalen Enzyminhibitioun wärend der Hydrolyse, oder d'Feele oder niddereg Niveaue vun essentielle essentielle Enzymen déi erfuerderlech sinn fir Zockerbindungen an der Planzebiomass ze briechen.D'Zesummesetzung an d'strukturell Charakteristike vun Zucker ze verstoen, sou wéi d'Zockerbindungen an Oligosacchariden, hëlleft eis d'Zockerkonversioun während der Hydrolyse ze verbesseren, wat biotechnologesch Prozesser Käschtekompetitiv mat Petrol-ofgeleete Produkter mécht.
D'Bestëmmung vun der Struktur vu Kuelenhydrater ass Erausfuerderung a erfuerdert eng Kombinatioun vu Methoden wéi Flëssegchromatographie (LC) 11,12, Nuklearmagnetesch Resonanzspektroskopie (NMR)13, Kapillär Elektrophorese (CE) 14,15,16 a Massespektrometrie (MS)17.,uechtzéng.MS Methoden wéi Zäit-of-Flight Massespektrometrie mat Laser Desorption an Ioniséierung mat enger Matrix (MALDI-TOF-MS) sinn eng villsäiteg Method fir Kohlenhydratstrukturen z'identifizéieren.Viru kuerzem ass Collision-Induced Dissociation (CID) Tandem MS vun Natriumionaddukten am meeschte verbreet benotzt fir Fangerofdréck ze identifizéieren entspriechend Oligosaccharid-Befestigungspositiounen, anomeresch Konfiguratiounen, Sequenzen a Verzweigungspositiounen 20, 21.
Glycan Analyse ass en exzellent Tool fir eng detailléiert Identifikatioun vu Kohbhydratbindungen22.Dës Method benotzt monoklonal Antikörper (mAbs) geriicht fir Zellmauer Glykan ze planzen als Sonden fir komplex Kohlenhydratverbindungen ze verstoen.Méi wéi 250 mAbs sinn weltwäit verfügbar, entworf géint verschidde linear a verzweigt Oligosacchariden mat verschiddene Sacchariden24.Verschidde mAbs goufe wäit benotzt fir d'Struktur, d'Zesummesetzung an d'Modifikatioune vun der Planzzellmauer ze charakteriséieren, well et wesentlech Differenzen ofhängeg vun der Planzzellart, Uergel, Alter, Entwécklungsstadium a Wuesstumsëmfeld25,26.Méi kierzlech gouf dës Method benotzt fir Vesikelpopulatiounen a Planzen- an Déieresystemer ze verstoen an hir jeeweileg Rollen am Glykantransport wéi bestëmmt duerch subzelluläre Markéierer, Entwécklungsstadien oder Ëmweltreizungen, an fir enzymatesch Aktivitéit ze bestëmmen.E puer vun de verschiddene Strukture vu Glykanen a Xylanen, déi identifizéiert goufen, enthalen Pektin (P), Xylan (X), Mannan (M), Xyloglucanen (XylG), Mixed Bond Glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), Galactomannan (GalG), Glucuronsäure-arabinoxylan (GArbinoX) (GarbinoX) (GarbinoX) (Galanar.
Wéi och ëmmer, trotz all dëse Fuerschungsefforten, hunn nëmmen e puer Studien sech op d'Natur vun der Oligosaccharid Akkumulation während der Hydrolyse mat héijer Feststoffbelaaschtung (HSL) konzentréiert, dorënner Oligosaccharid Verëffentlechung, oligomer Kettelängt Ännerungen während der Hydrolyse, verschidde Low DP Polymeren, an hir Kéiren.Verdeelungen 30,31,32.Mëttlerweil, obwuel glycan Analyse als nëtzlech Instrument fir eng ëmfaassend Analyse vun glycan Struktur bewisen huet, ass et schwéier Waasser-soluble niddereg DP Oligosaccharides mat Antikörper Methoden ze bewäerten.Kleng DP Oligosacchariden mat engem Molekulargewiicht vu manner wéi 5-10 kDa binden net un d'ELISA Placke 33, 34 a gi virum Antikörper Additioun ewech gewäsch.
Hei, fir d'éischte Kéier, demonstréiere mir en ELISA Assay op avidin-beschichtete Placke mat monoklonalen Antikörper, kombinéiert eng een-Schrëtt Biotinylatiounsprozedur fir soluble refraktär Oligosacchariden mat Glykomanalyse.Eis Approche zu Glycome Analyse war vun MALDI-TOF-MS an GC-MS baséiert Analyse vun komplementar Oligosaccharide Verknëppung validéiert mat trimethylsilyl (TMS) derivatization vun hydrolyzed Zocker Zesummesetzung.Dës innovativ Approche kann als High-Throughput Method an Zukunft entwéckelt ginn a méi breet Uwendung an der biomedizinescher Fuerschung fannen35.
Post-translational Modifikatioune vun Enzymen an Antikörper, wéi Glykosylatioun,36 beaflossen hir biologesch Aktivitéit.Zum Beispill, Verännerungen an der Glykosylatioun vu Serumproteine ​​spillen eng wichteg Roll bei der entzündlecher Arthritis, a Verännerungen an der Glykosylatioun ginn als diagnostesch Marker37 benotzt.Verschidde Glykane goufen an der Literatur gemellt fir einfach a ville Krankheeten optrieden, dorënner chronesch entzündlech Krankheeten vum Magen-Darmtrakt an der Liewer, viral Infektiounen, Eierstocks-, Broscht- a Prostatakarque38,39,40.D'Struktur vun de Glykanen ze verstoen mat Antikörper-baséiert Glykan ELISA Methoden gëtt zousätzlech Vertrauen an der Krankheet Diagnos ouni d'Benotzung vu komplexe MS Methoden.
Eis fréier Etude huet gewisen datt haartnäckege Oligosacchariden no der Virbehandlung an der enzymatescher Hydrolyse onhydrolyséiert bliwwen sinn (Dorënner 1).An eisem virdru publizéierten Wierk hu mir eng Aktivkohle Festphase Extraktiounsmethod entwéckelt fir Oligosacchariden aus AFEX-virbehandelt Mais Stover Hydrolysat (ACSH)8 ze isoléieren.No der initialer Extraktioun an der Trennung goufen d'Oligosacchariden weider duerch Gréisst Ausgrenzungschromatographie (SEC) fraktionéiert a gesammelt an der Reiefolleg vum Molekulargewiicht.Zockermonomeren an Oligomeren, déi aus verschiddene Virbehandlungen verëffentlecht goufen, goufen duerch Zocker Zesummesetzung Analyse analyséiert.Wann Dir den Inhalt vun Zocker-Oligomeren vergläicht, déi duerch verschidde Virbehandlungsmethoden kritt goufen, ass d'Präsenz vun haartnäckege Oligosacchariden e gemeinsame Problem bei der Konversioun vun der Biomass op Monosacchariden a kann zu enger Reduktioun vun der Zockerausbezuelung vun op d'mannst 10-15% a souguer bis zu 18% féieren.US.Dës Method gëtt fir weider grouss Produktioun vun Oligosaccharid Fraktiounen benotzt.Déi resultéierend ACH a seng spéider Fraktiounen mat verschiddene Molekulargewiicht goufen als experimentell Material fir d'Charakteriséierung vun Oligosacchariden an dëser Aarbecht benotzt.
No der Virbehandlung an der enzymatescher Hydrolyse sinn persistent Oligosacchariden onhydrolyséiert bliwwen.Hei (A) ass eng Oligosaccharid-Trennungsmethod, an där Oligosacchariden aus AFEX-pretreated Mais Stover Hydrolysat (ACSH) isoléiert sinn, mat engem gepackten Bett vun Aktivkohle a Diatomaceous Äerd;(B) Method fir Trennung vun Oligosacchariden.D'oligosaccharides sech weider duerch Gréisst Exklusioun chromatography (SEC) getrennt;(C) Saccharidmonomeren an Oligomeren aus verschiddene Virbehandlungen verëffentlecht (verdünnt Säure: DA, ionesch Flëssegkeet: IL an AFEX).Enzymatesch Hydrolysebedéngungen: héich Feststoffbelaaschtung vu 25% (w/w) (ongeféier 8% Glukanbelaaschtung), 96 Stonnen Hydrolyse, 20 mg/g kommerziell Enzymbelaaschtung (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 Verhältnis) an (D) Zockermonomeren an Oligomere vu Glukose, Preosexylose-AC aus AFS-Verëffentlechung (EX)
Glycan Analyse huet bewisen en nëtzlecht Tool ze sinn fir eng ëmfaassend strukturell Analyse vu Glykanen an Extrakten isoléiert vu feste Biomassreschter.Wéi och ëmmer, Waasserlöslech Sacchariden sinn ënnerrepresentéiert mat dëser traditioneller Method41 well Oligosacchariden mat nidderegen molekulare Gewiicht schwéier op ELISA Placke ze immobiliséieren a virum Antikörper Additioun erausgewäsch ginn.Dofir, fir Antikörperbindung a Charakteriséierung, gouf eng Een-Schrëtt Biotinylatiounsmethod benotzt fir löslech, net-kompatibel Oligosacchariden op avidin-beschichtete ELISA Placke ze coatéieren.Dës Method gouf getest mat eisem virdru produzéierte ACSH an enger Fraktioun baséiert op sengem Molekulargewiicht (oder Grad vun der Polymeriséierung, DP).Ee-Schrëtt Biotinylatioun gouf benotzt fir d'Oligosaccharid-bindend Affinitéit ze erhéijen andeems Biotin-LC-Hydrazid op d'reduzéiert Enn vum Kohlenhydrat addéiert (Fig. 2).An der Léisung reagéiert d'hemiacetal Grupp um reduzéierende Enn mat der Hydrazidgrupp vu Biotin-LC-Hydrazid fir eng Hydrazonbindung ze bilden.An der Präsenz vum Reduktiounsmëttel NaCNBH3 gëtt d'Hydrazonbindung op e stabile biotinyléierten Endprodukt reduzéiert.Mat der Ännerung vun der Zocker reduzéieren Enn, bindend vun niddereg DP oligosaccharides zu ELISA Placke gouf méiglech, an eiser Etude war dëst op avidin-Beschichtete Placke mat glycan-cibléiert mAbs gemaach.
Screening vu monoklonalen Antikörper baséiert op ELISA fir biotinyléiert Oligosacchariden.Hei (A) kombinéiert Biotinylatioun vun Oligosacchariden a spéider ELISA Screening mat glycan-geziilten mAbs op NeutrAvidin Beschichtete Placke an (B) weist eng Een-Schrëtt Prozedur fir Biotinylatioun vu Reaktiounsprodukter.
Avidin-beschichtete Placke mat Oligosaccharid-konjugéierten Antikörper goufen dann zu primären a sekundären Antikörper bäigefüügt an an engem Liicht- an Zäitempfindleche Medium gewascht.Nodeems d'Antikörperbindung fäerdeg ass, add TMB Substrat fir d'Plack ze inkubéieren.D'Reaktioun gouf endlech mat Schwefelsäure gestoppt.Déi inkubéiert Placke goufen mat engem ELISA Lieser analyséiert fir d'bindend Kraaft vun all Antikörper ze bestëmmen fir antikörperspezifesch Cross-linking z'entdecken.Fir Detailer a Parameteren vum Experiment, kuckt déi entspriechend Rubrik "Materialien a Methoden".
Mir demonstréieren d'Nëtzlechkeet vun dëser nei entwéckelter Method fir spezifesch Uwendungen andeems d'löslech Oligosacchariden präsent sinn an ACSH wéi och a rau a gereinegt Oligosaccharid Fraktiounen isoléiert aus lignocellulosesche Hydrolysaten charakteriséieren.Wéi an der Figur 3 gewisen, sinn déi heefegst epitop-substituéiert Xylanen, déi an ACSH identifizéiert ginn mat bioacyléierte Glykom-Assay-Methoden, normalerweis uronesch (U) oder methyluronesch (MeU) a pektesch arabinogalaktanen.Déi meescht vun hinnen goufen och an eiser fréierer Etude iwwer d'Analyse vu Glykanen vun net-hydrolyséierte Feststoffer (UHS)43 fonnt.
Detektioun vu recalcitranten Oligosaccharidepitopen mat engem monoklonalen Antikörper, deen op den Zellmauer Glykan riicht.Déi "neutral" Fraktioun ass d'ACN Fraktioun an déi "sauer" Fraktioun ass d'FA Fraktioun.Méi hell Roten op der Hëtztkaart weisen méi héije Epitopgehalt un, a méi hell Blos weisen en eidelen Hannergrond un.Faarfwäerter op der Skala baséieren op rau OD Wäerter fir Formuléierungen N = 2.Déi Haaptepitopen, déi vun den Antikörper unerkannt sinn, ginn op der rietser Säit gewisen.
Dës Net-cellulose Strukture konnten net vun den heefegsten Cellulasen an Hemicellulasen an der getester kommerziell Enzymmëschung gespléckt ginn, déi déi meescht benotzt kommerziell Enzyme enthält.Dofir sinn nei Hëllefs-Enzyme fir hir Hydrolyse erfuerderlech.Ouni déi néideg Net-cellulose-Accessoire-Enzyme verhënneren dës Net-cellulose-Bindungen eng komplett Konversioun zu Monosacchariden, och wann hir Elteren Zuckerpolymerer extensiv hydrolyséiert ginn a méi kuerz Fragmenter a mat kommerziellen Enzymmëschungen opgeléist ginn.
Weider Etude vun Signal Verdeelung a seng bindender Kraaft gewisen, datt bindend epitopes an héich DP Zocker Fraktiounen (A, B, C, DP bis 20+) manner wéi an niddereg DP Fraktiounen (D, E, F, DP) an dimers waren) (Figebam. 1).Säure Fragmenter si méi heefeg an Net-cellulose Epitopen wéi neutral Fragmenter.Dës Phänomener si konsequent mam Muster dat an eiser viregter Etude observéiert gouf, wou héich DP a Säuremoieë méi resistent géint enzymatesch Hydrolyse waren.Dofir kann d'Präsenz vun Net-cellulose Glykan Epitopen an U a MeU Ersatzstécker vill zu der Stabilitéit vun den Oligosacchariden bäidroen.Et sollt bemierkt datt d'Bindung an d'Detektiounseffizienz fir niddereg DP Oligosacchariden problematesch ka sinn, besonnesch wann d'Epitop en dimer oder trimeresch Oligosaccharid ass.Dëst kann getest ginn mat kommerziellen Oligosacchariden vu verschiddene Längt, all enthält nëmmen eng Epitop, déi un e spezifesche mAb bindet.
Also huet d'Benotzung vu strukturspezifesche Antikörper verschidden Aarte vu widderspréchleche Bindungen opgedeckt.Ofhängeg vun der Aart vum benotzten Antikörper, dem entspriechende Ligatiounsmuster an der Stäerkt vum Signal dat et produzéiert (am meeschten a mannst reichend), kënnen nei Enzyme identifizéiert ginn an semi-quantitativ an d'Enzymmëschung bäigefüügt ginn fir méi komplett Glykokonversioun.D'Analyse vun ACSH Oligosacchariden als Beispill ze huelen, kënne mir eng Datebank vu Glykanbindungen fir all Biomassmaterial erstellen.Et sollt hei bemierkt ginn datt déi verschidde Affinitéit vun Antikörper berücksichtegt ginn, a wann hir Affinitéit onbekannt ass, wäert dëst gewësse Schwieregkeete kreéieren wann Dir d'Signaler vu verschiddenen Antikörper vergläicht.Zousätzlech kann de Verglach vu Glykanobligatiounen am beschten tëscht Proben fir deeselwechten Antikörper funktionnéieren.Dës haartnäckege Bindungen kënnen dann un d'CAZyme-Datebank verbonne ginn, aus där mir Enzyme identifizéieren, Kandidatenzyme auswielen a fir Bindungsbriechende Enzyme testen oder mikrobielle Systemer entwéckelen fir dës Enzyme auszedrécken fir an Bioraffinerien ze benotzen44.
Fir ze evaluéieren wéi immunologesch Methoden alternativ Methoden ergänzen fir Low-molekulare Gewiicht Oligosacchariden präsent an lignocellulosic hydrolysates ze charakteriséieren, gesuergt mir MALDI (Lalumi 4, S1-S8) an Analyse vun TMS-ofgeleet Saccharide baséiert op GC-MS op der selwechter Rot (Figebam. 5) oligosaccharide Deel.MALDI gëtt benotzt fir ze vergläichen ob d'Massverdeelung vun Oligosaccharidmoleküle mat der geplangter Struktur entsprécht.Op Fig.4 weist den MC vun den neutralen Komponenten ACN-A an ACN-B.ACN-A Analyse bestätegt eng Rei vun pentose Zucker rangéiert vun DP 4-8 (Lalumi 4) bis DP 22 (Lalumi S1), hir Gewiichter entspriechen MeU-xylan oligosaccharides.ACN-B Analyse confirméiert der pentose an glucoxylan Serie mat DP 8-15.An Ergänzungsmaterial wéi Figur S3, FA-C sauerem Moiety Mass Verdeelungskaarten weisen eng Rei vu (Me) U substituéiert Pentose Zucker mat enger DP vun 8-15, déi konsequent mat de substituéierten Xylanen am ELISA-baséierten mAb Screening sinn.D'Epitopen sinn konsequent.
MALDI-MS Spektrum vun löslechen net-konforme Oligosacchariden, déi an ACS präsent sinn.Hei, (A) ACN-A niddereg Gewiicht Gamme Fraktiounen enthalen methylated uronsäure (DP 4-8) substituéiert glucuroxylan oligosaccharides an (B) ACN-B Xylan an methylated uronsäure oligosaccharides ersat mat glucuroxylan (DP 8-15).
Analyse vun der Zesummesetzung vum Glykanreschter vu refractaire Oligosacchariden.Hei (A) TMS Saccharide Zesummesetzung vun verschiddenen Oligosaccharide Fraktiounen kritt mat GC-MS Analyse.(B) Strukture vu verschiddenen TMS-ofgeleeten Zucker präsent an Oligosacchariden.ACN - Acetonitril Fraktioun mat neutralen Oligosacchariden an FA - Ferulinsäure Fraktioun mat Säure Oligosacchariden.
Eng aner interessant Conclusioun gouf aus der LC-MS Analyse vun der Oligosaccharidfraktioun gezunn, wéi an der Figur S9 gewisen (Methoden kënnen am elektroneschen Zousazmaterial gesi ginn).Fragmenter vun Hexose an -OAc Gruppen goufen ëmmer erëm während ligation vun der ACN-B Fraktioun observéiert.Dës Entdeckung bestätegt net nëmmen d'Fragmentatioun, déi a Glykom a MALDI-TOF Analyse observéiert gëtt, awer liwwert och nei Informatioun iwwer potenziell Kuelenhydrater Derivate an der virbehandelt lignocellulosescher Biomass.
Mir analyséieren och d'Zocker Zesummesetzung vun der Oligosaccharide Fraktioun mat TMS Zocker derivatization benotzt.Mat GC-MS, bestëmmt mir d'Zesummesetzung vun neural (Net-Derivat) an saierzege Zucker (GluA an GalA) an der oligosaccharide Fraktioun (Lalumi 5).Glucuronsäure gëtt a sauer Komponenten C an D fonnt, wärend Galakturonsäure a sauer Komponenten A a B fonnt gëtt, déi allebéid héich DP Komponente vu sauer Zucker sinn.Dës Resultater bestätegen net nëmmen eis ELISA a MALDI Daten, awer sinn och konsequent mat eise fréiere Studien vun der Oligosaccharid Akkumulation.Dofir gleewen mir datt modern immunologesch Methoden mat Biotinylatioun vun Oligosacchariden a spéider ELISA-Screening genuch sinn fir soluble recalcitrant Oligosacchariden a verschiddene biologesche Proben z'entdecken.
Zënter ELISA-baséiert mAb Duerchmusterungsmethoden duerch verschidde verschidde Methoden validéiert goufen, wollte mir d'Potenzial vun dëser neier quantitativer Method weider entdecken.Zwee kommerziell Oligosacchariden, Xylohexasaccharide Oligosaccharide (XHE) an 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), goufen kaaft a getest mat enger neier mAb Approche déi den Zellmauer Glykan zielt.Figur 6 weist eng linear Korrelatioun tëscht der biotinylated bindend Signal an der Log Konzentratioun vun Oligosaccharide Konzentratioun, suggeréiert eng méiglech Langmuir adsorption Modell.Ënnert de mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, an CCRC-M151 korreléiert mat XHE, an CCRC-M108, CCRC-M109, an LM11 korreléiert mat A2XX iwwer eng Rei vun 100n nam.Wéinst der limitéierter Disponibilitéit vun Antikörper während dem Experiment goufen limitéiert Experimenter mat all Oligosaccharid Konzentratioun gemaach.Et sollt hei bemierkt ginn datt e puer Antikörper ganz anescht op datselwecht Oligosaccharid als Substrat reagéieren, viraussiichtlech well se un liicht verschidden Epitope binden a ganz ënnerschiddlech bindend Affinitéite kënnen hunn.D'Mechanismen an d'Implikatioune vun der korrekter Epitopidentifikatioun wäerte vill méi komplex sinn wann déi nei mAb Approche op echt Echantillon applizéiert gëtt.
Zwee kommerziell Oligosacchariden goufen benotzt fir d'Erkennungsbereich vu verschiddene glycan-gezielte mAbs ze bestëmmen.Hei, linear Korrelatiounen mat Log Konzentratioun vun Oligosaccharide Konzentratioun uginn Langmuir adsorption Mustere fir (A) XHE mat mAb an (B) A2XX mat mAb.Déi entspriechend Epitope weisen op d'Strukturen vun de kommerziellen Oligosacchariden, déi als Substrate an der Assay benotzt ginn.
D'Benotzung vu glycan-geziilten monoklonalen Antikörper (glycokomesch Analyse oder ELISA-baséiert mAb-Screening) ass e mächtegt Instrument fir déifgräifend Charakteriséierung vun de meescht vun de groussen Zellmauerglycanen, déi d'Pflanzenbiomass ausmaachen.Wéi och ëmmer, klassesch Glykananalyse charakteriséiert nëmme méi grouss Zellmauer Glykanen, well déi meescht Oligosacchariden net effizient op ELISA Placken immobiliséiert sinn.An dëser Etude, AFEX-pretreated Mais Stover war enzymatesch hydrolyzed bei engem héich Feststoffer Inhalt.Zocker Analyse gouf benotzt fir d'Zesummesetzung vu recalcitranten Zellmauer Kuelenhydrater am Hydrolysat ze bestëmmen.Wéi och ëmmer, mAb Analyse vu méi klengen Oligosacchariden an Hydrolysaten gëtt ënnerschat, an zousätzlech Tools si gebraucht fir effektiv Oligosacchariden op ELISA Placken ze immobiliséieren.
Mir berichten hei eng nei an effizient Oligosaccharid Immobiliséierungsmethod fir mAb Screening andeems Dir Oligosaccharid Biotinylatioun kombinéiert gefollegt vun ELISA Screening op NeutrAvidin ™ Beschichtete Placke.Déi immobiliséiert biotinyléiert Oligosacchariden hunn genuch Affinitéit fir den Antikörper gewisen fir séier an effizient Detektioun vu widderspréchlechen Oligosacchariden z'erméiglechen.Analyse vun der Zesummesetzung vun dësen haartnäckege Oligosacchariden baséiert op Massespektrometrie bestätegt d'Resultater vun dëser neier Approche fir Immunoscreening.Also weisen dës Studien datt d'Kombinatioun vun der Oligosaccharid Biotinylatioun an ELISA Screening mat glycan-geziilten monoklonalen Antikörper ka benotzt ginn fir Crosslinks an Oligosacchariden z'entdecken a ka wäit an aner biochemesch Studien applizéiert ginn, déi d'Struktur vun Oligosacchariden charakteriséieren.
Dës Biotin-baséiert Glykanprofiléierungsmethod ass den éischte Bericht fäeg fir déi widderspréchlech Kohlenhydratbindunge vun löslechen Oligosacchariden an der Planzebiomass z'ënnersichen.Dëst hëlleft ze verstoen firwat verschidden Deeler vun der Biomass sou haartnäckeg sinn wann et ëm d'Biobrennstoffproduktioun kënnt.Dës Method fëllt e wichtege Lück an de Glykomanalysemethoden a verlängert seng Uwendung op eng méi breet Palette vu Substrate iwwer Planz Oligosacchariden.An Zukunft kënne mir Robotik fir Biotinylatioun benotzen an d'Method benotzen déi mir fir High-Throughput Analyse vu Proben mat ELISA entwéckelt hunn.
Maisstréi (CS) ugebaut aus Pioneer 33A14 Hybrid Somen gouf am Joer 2010 vu Kramer Farms zu Ray, Colorado gesammelt.Mat der Erlaabnis vum Grondbesëtzer kann dës Biomass fir Fuerschung benotzt ginn. D'Probe goufen trocken < 6% Feuchtigkeit an Zip-Lockbeutel bei Raumtemperatur gelagert. D'Probe goufen trocken < 6% Feuchtigkeit an Zip-Lockbeutel bei Raumtemperatur gelagert. D'Veraarbechtung vun der Verëffentlechung fir d'Verwäertung < 6% op d'Pakete mat der Erhéijung vun der Kommissioun. Echantillon goufen dréchen bei <6% Fiichtegkeet an zippered Poschen bei Raumtemperatur gespäichert.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% D'Unzuel vun de Verhältnisser mat der Verëffentlechung vun der Eenheet ass manner wéi 6%. D'Probe ginn an Zipperbeutel bei Raumtemperatur mat enger Fiichtegkeet <6% gelagert.D'Etude entsprécht lokalen an nationalen Richtlinnen.Compositional Analyse war mat der NREL Protokoll gesuergt.D'Zesummesetzung gouf fonnt fir 31,4% Glukan, 18,7% Xylan, 3,3% Arabinan, 1,2% Galactan, 2,2% Acetyl, 14,3% Lignin, 1,7% Protein an 13,4% Asche ze enthalen.
Cellic® CTec2 (138 mg Protein / ml, vill VCNI 0001) ass eng komplex Mëschung aus Cellulase, β-Glucosidase an Cellic® HTec2 (157 mg Protein / ml, vill VHN00001) vun Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg Protein / ml), eng komplex Mëschung vu Pektin-degradéierend Enzymen, gouf vun DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) gespent.Enzym Protein Konzentratioune sech duerch Schätzung Protein Inhalt (an subtracting de Bäitrag vun Net-Protein Stéckstoff) mat Kjeldahl Stéckstoff Analyse (AOAC Method 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) bestëmmt.Diatomaceous Earth 545 gouf vun EMD Millipore (Billerica, MA) kaaft.Aktivéiert Kuelestoff (DARCO, 100 Mesh Granules), Avicel (PH-101), Bichen Xylan, an all aner Chemikalien goufen aus Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) kaaft.
AFEX Virbehandlung gouf am GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) gemaach.Virbehandlung gouf bei 140 ° C fir 15 Minutten duerchgefouert.46 Openthaltszäit bei 1: 1 Verhältnis vun Waasserfräi Ammoniak zu Biomass bei 60% (w/w) Luede an engem Edelstahl Benchtop Batch Reaktor (Parr Instruments Company).Et huet 30 Minutten gedauert.De Reakter gouf op 140°C bruecht an d'Ammoniak gouf séier fräigelooss, sou datt d'Biomass séier op Raumtemperatur zréckkoum.D'Zesummesetzung vum AFEX pre-behandelt Mais Stover (ACS) war ähnlech wéi déi vun onbehandelt Mais Stover (UT-CS).
Héich Feststoffer ACSH 25% (w/w) (ongeféier 8% Dextranbelaaschtung) gouf als Startmaterial fir grouss Skala Produktioun vun Oligosacchariden virbereet.Enzymatesch Hydrolyse vun ACS gouf mat enger kommerziell Enzymmëschung gesuergt, dorënner Cellic® Ctec2 10 mg Protein / g Glucan (an virbehandelt Biomass), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg Protein / g Glucan, a Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg Protein/g Dextran.Enzymatesch Hydrolyse gouf an engem 5-Liter Bioreaktor mat engem Aarbechtsvolumen vun 3 Liter, pH 4,8, 50°C an 250 U/min duerchgefouert.No der Hydrolyse fir 96 Stonnen gouf d'Hydrolysat duerch Zentrifugéierung bei 6000 rpm fir 30 Minutten an dann bei 14000 rpm fir 30 Minutten gesammelt fir onhydrolyséiert Feststoffer ze entfernen.D'Hydrolysat gouf duerno steril Filtratioun duerch en 0,22 mm Filterbecher ënnerworf.De gefilterte Hydrolysat gouf an sterile Fläschen bei 4 ° C gelagert an duerno op Kuelestoff fraktionéiert.
Analyse vun der Zesummesetzung vun Extrait-baséiert Biomass Echantillon no NREL Labor Analyse Prozeduren: Preparatioun vun Echantillon fir Zesummesetzung Analyse (NREL/TP-510-42620) an Determinatioun vun strukturell Kuelenhydrater an Lignin an Biomass (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosaccharide Analyse vum Hydrolysatstroum gouf op enger 2 ml Skala mat enger Autoklav-baséierter Säurehydrolysemethod gemaach.Mix d'Hydrolysatprobe mat 69,7 μl 72% Schwefelsäure an engem 10 ml Schraube-Kulturröhre a inkubéiert fir 1 Stonn op engem Bänk op 121 ° C, killt op Äis a filtert an eng High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Fläsch.D'Konzentratioun vun Oligosacchariden gouf festgeluecht andeems d'Konzentratioun vu Monosacchariden an der net-hydrolyséierter Probe vun der Gesamtzockerkonzentratioun an der sauerhydrolyséierter Probe subtrahéiert.
Glukose, Xylose, an Arabinose Konzentratioune an der sauer hydrolyséierter Biomass goufen analyséiert mat engem Shimadzu HPLC System ausgestatt mat engem Autosampler, Kolonnheizung, isokratescher Pompel, a Refraktiounsindexdetektor op enger Bio-Rad Aminex HPX-87H Kolonn.D'Kolonn gouf bei 50 ° C gehal an mat 0,6 ml / min 5 mM H2SO4 am Waasser eluéiert.fléissen.
D'Hydrolysat Supernatant gouf verdënntem an analyséiert fir Monomer an Oligosaccharid Inhalt.Monomer Zucker, déi no enzymatesch Hydrolyse kritt goufen, goufen duerch HPLC analyséiert, ausgestatt mat enger Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P Kolonn an enger Äscheschutzkolonn.D'Kolonntemperatur gouf bei 80 ° C behalen, Waasser gouf als mobil Phase mat enger Flowrate vun 0,6 ml / min benotzt.Oligosaccharide goufen duerch Hydrolyse a verdënntem Säure bei 121 ° C bestëmmt no de Methoden, déi an Refs beschriwwe ginn.41, 48, 49.
Saccharide Analyse gouf op rau, AFEX virbehandelt an all net-hydrolyséiert Biomassreschter (och d'Produktioun vu Serienzellmauerextrakter an hir mAb-Screening) mat virdru beschriwwenen Prozeduren 27, 43, 50, 51 gemaach.Fir Glykomanalyse ginn alkohol-onlöslech Reschter vu Planzenzellmauermaterial aus Biomassreschter virbereet a mat Serienextraktioun mat ëmmer méi aggressive Reagens wéi Ammoniumoxalat (50 mM), Natriumkarbonat (50 mM an 0,5% w/v), CON.(1M a 4M, béid mat 1% w/v Natriumborhydrid) a Säurechlorit wéi virdru beschriwwen52,53.D'Extrakter goufen dunn ELISA géint e komplexe Panel vu mAb50s ënnerworf, déi op d'Zellmauerglycan geriicht goufen, an d'mAb bindend Reaktiounen goufen als Hëtztkaart presentéiert.mAbs gezielt Planz Zell Mauer glycan sech aus Labo Stock (CCRC, JIM an MAC Serie) kaaft.
Een-Schrëtt Biotinylatioun vun Oligosacchariden.D'Konjugatioun vu Kuelenhydrater mat Biotin-LC-Hydrazid gouf mat der folgender Prozedur gemaach.Biotin-LC-Hydrazid (4,6 mg / 12 μmol) gouf an Dimethylsulfoxid (DMSO, 70 μl) duerch kräfteg Rührung an Heizung bei 65 ° C fir 1 min opgeléist.Glacial Essigsäure (30 µl) gouf derbäigesat an d'Mëschung gouf op Natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 µmol) gegoss a komplett opgeléist no der Erwiermung bei 65 ° C fir ongeféier 1 Minutt.Duerno gouf vu 5 bis 8 μl vun der Reaktiounsmëschung an d'getrocknene Oligosaccharid (1-100 nmol) bäigefüügt fir en 10-fach oder méi molar Iwwerschoss vum Label iwwer d'Reduktiounsend ze kréien.D'Reaktioun gouf bei 65 ° C fir 2 Stonnen duerchgefouert, duerno goufen d'Proben direkt gereinegt.Keen Natriumcyanoborhydrid gouf an den Etikettexperimenter ouni Reduktioun benotzt, an d'Proben goufen bei 65 ° C fir 2,5 Stonnen reagéiert.
ELISA Beschichtung a Wäschung vu Proben vu biotinyléierten Oligosacchariden.25 μl vun biotinylated Echantillon (100 μl vun all konzentréiert Prouf verdënntem an 5 ml vun 0,1 M Tris Puffer Léisung (TBS)) goufen zu all gutt vun der avidin-Beschichtete Plack dobäi.Kontroll Wells goufen mat 50 μl Biotin bei enger Konzentratioun vun 10 μg /ml an 0,1 M TBS beschichtet.Deioniséiert Waasser gouf als Beschichtung fir eidel Miessunge benotzt.D'Tablet gouf fir 2 Stonnen bei Raumtemperatur an der Däischtert inkubéiert.Wäscht d'Plack 3 Mol mat 0,1% geschmiert Mëllech an 0,1 M TBS mam Programm Nr.11 fir Grenier Appartement 3A.
Additioun a Wäschung vu primäre Antikörper.Füügt 40 μl primär Antikörper an all Well.Inkubéiert d'Mikroplate fir 1 Stonn bei Raumtemperatur am Däischteren.D'Placke goufen dann 3 Mol mat 0,1% Mëllech an 0,1M TBS mat Wäschprogramm #11 fir Grenier Flat 3A gewäsch.
Sekundär Antikörper derbäi a wäschen.Füügt 50 μl Maus / Ratten Secondaire Antikörper (verdünnt 1:5000 an 0,1% Mëllech an 0,1 M TBS) an all Well.Inkubéiert d'Mikroplate fir 1 Stonn bei Raumtemperatur am Däischteren.D'Mikroplatte goufen duerno 5 Mol mat 0,1% Mëllech an 0,1 M TBS mat Grenier Flat 5A Plattewäschprogramm #12 gewäsch.
Füügt e Substrat.Füügt 50 μl 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) op de Basissubstrat (duerch 2 Tropfen Puffer, 3 Tropfen TMB, 2 Tropfen Waasserstoffperoxid op 15 ml deioniséiertem Waasser).Preparéieren den TMB Substrat.a virum Gebrauch vortex).Inkubéiert d'Mikroplate bei Raumtemperatur fir 30 Minutten.Am Däischteren.
Fëllt de Schrëtt aus a liest den Tablet.Füügt 50 μl vun 1 N Schwefelsäure an all Brunn a notéiert d'Absorptioun vu 450 bis 655 nm mat engem ELISA Lieser.
Bereet 1 mg / ml Léisunge vun dësen Analyten an deioniséiertem Waasser: Arabinose, Rhamnose, Fukose, Xylose, Galacturonsäure (GalA), Glucuronsäure (GlcA), Mannose, Glukose, Galaktose, Laktose, N-Acetylmannosamin (manNAc), N-Acetylglucosamin.(glcNAc), N-Acetylgalactosamin (galNAc), Inositol (intern Standard).Zwee Standarde goufen virbereet andeems d'1 mg / ml Zockerléisungen an der Tabell 1 derbäigesat ginn. Echantillon ginn gefruer a lyophiliséiert bei -80 ° C. bis all Waasser ofgeschaaft gëtt (normalerweis ongeféier 12-18 Stonnen).
Füügt 100-500 µg Probe an d'Schraubekappen op engem analytesche Balance.Notéiert de Betrag dobäigesat.Et ass am beschten d'Probe an enger spezifescher Konzentratioun vu Léisungsmëttel opzeléisen an et an d'Röhre als flësseg Aliquot ze addéieren.Benotzt 20 μl vun 1 mg / ml Inositol als intern Standard fir all Proberöhre.D'Quantitéit vum internen Standard, deen un d'Probe bäigefüügt gëtt, muss d'selwecht sinn wéi d'Quantitéit vum internen Standard, deen an d'Standardröhre bäigefüügt gëtt.
Füügt 8 ml Waasserfräi Methanol an e Schraufdeckelfläsch.Dann 4 ml vun 3 N. methanolic HCl Léisung, capped a geschüchtert.Dëse Prozess benotzt kee Waasser.
Füügt 500 μl vun 1 M HCl Methanol Léisung un d'Oligosaccharid Proben a Standard TMS Tubes.Echantillon goufen iwwer Nuecht (168 Stonnen) bei 80 ° C. an engem thermesche Block incubated.Dréchent de Methanollyseprodukt bei Raumtemperatur mat engem Trocknungsmanifold.200 μl MeOH addéieren an erëm dréchen.Dëse Prozess gëtt zweemol widderholl.Füügt 200 μl Methanol, 100 μl Pyridin an 100 μl Essiganhydrid an d'Probe a gutt vermëschen.Echantillon goufen bei Raumtemperatur fir 30 Minutten inkubéiert.an gedréchent.Fügt 200 μl Methanol derbäi a trocken erëm.
Füügt 200 μl Tri-Sil a waarmt d'Tube fir 20 Minutten.80 ° C, dann op Raumtemperatur ofkillt.Benotzt en Trocknungsmanifold fir d'Probe weider bis zu engem Volume vun ongeféier 50 µl ze trocken.Et ass wichteg ze notéieren datt mir d'Proben net erlaabt hunn komplett ze dréchen.
2 ml Hexan derbäisetzen a gutt duerch Wirbelen vermëschen.Fëllt d'Spëtze vu Pasteur-Pipetten (5-8 mm) mat engem Stéck Glaswoll, andeems Dir d'Glaswoll uewen op enger Pipette mat engem 5-3/4 Zoll Duerchmiesser setzt.Echantillon goufen bei 3000 g fir 2 Minutten centrifuged.All insoluble Reschter ginn ausgefall.Dréchent d'Probe op 100-150 µl.E Volume vun ongeféier 1 μl war an der GC-MS bei enger éischter Temperatur vun 80 ° C an eng initial Zäit vun 2,0 Minutten injizéiert (Table 2).