សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។កំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលអ្នកកំពុងប្រើមានកម្រិតគាំទ្រ CSS ។សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ក្នុងពេលនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្របន្ត យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
វិធីសាស្រ្ត immunological និង mass spectrometric ថ្មីសម្រាប់ការវិភាគស្មុគ្រស្មាញនៃ oligosaccharides ជាប់លាប់នៅក្នុងចង្ក្រានពោតដែលបានរៀបចំទុកជាមុនជាមួយ AFEX ។ជីវម៉ាស Lignocellulosic គឺជាជម្រើសប្រកបដោយនិរន្តរភាពចំពោះឥន្ធនៈហ្វូស៊ីល ហើយត្រូវបានប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយក្នុងការអភិវឌ្ឍន៍បច្ចេកវិទ្យាជីវសាស្រ្តសម្រាប់ផលិតផលិតផលដូចជា អាហារ ចំណី ឥន្ធនៈ និងសារធាតុគីមី។គន្លឹះនៃបច្ចេកវិទ្យាទាំងនេះគឺការអភិវឌ្ឍន៍នៃដំណើរការប្រកួតប្រជែងតម្លៃសម្រាប់ការបំប្លែងកាបូអ៊ីដ្រាតស្មុគស្មាញដែលមាននៅក្នុងជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិទៅជាជាតិស្ករសាមញ្ញដូចជាគ្លុយកូស xylose និង arabinose ។ដោយសារជីវម៉ាស់ lignocellulosic រឹងរូសខ្លាំង វាត្រូវតែទទួលការព្យាបាលដោយកម្ដៅ (ឧ. ការបន្សាបជាតិសរសៃអាម៉ូញាក់ (AFEX) អាស៊ីតរំលាយ (DA) សារធាតុរាវអ៊ីយ៉ុង (IL)) និងការព្យាបាលដោយជីវសាស្ត្រ (ឧ. អ៊ីដ្រូលីស្ទីម៉ាទីក និងអតិសុខុមប្រាណ fermentation) បញ្ចូលគ្នាដើម្បីទទួលបានផលិតផលដែលចង់បាន។.ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយនៅពេលដែលអង់ស៊ីមផ្សិតពាណិជ្ជកម្មត្រូវបានប្រើប្រាស់ក្នុងដំណើរការអ៊ីដ្រូលីស៊ីស មានតែ 75-85% នៃជាតិស្កររលាយដែលបានបង្កើតឡើងគឺ monosaccharides ហើយ 15-25% ដែលនៅសល់គឺជាសារធាតុ oligosaccharides ដែលមិនអាចរំលាយបាន ដែលមិនតែងតែមានសម្រាប់អតិសុខុមប្រាណ។ពីមុន យើងបានបំបែក និងបន្សុតដោយជោគជ័យនូវសារធាតុ oligosaccharides រឹងរូសដែលអាចរលាយបាន ដោយប្រើការរួមបញ្ចូលគ្នានៃកាបូន និងការបែងចែកផែនដី diatomaceous និងការមិនរាប់បញ្ចូលទំហំ chromatography ហើយក៏បានស៊ើបអង្កេតលក្ខណៈសម្បត្តិរារាំងអង់ស៊ីមរបស់ពួកគេផងដែរ។យើងបានរកឃើញថា oligosaccharides ដែលមានកម្រិតខ្ពស់នៃការជំនួសអាស៊ីត uronic methylated polymerization (DP) មានភាពលំបាកជាងក្នុងដំណើរការជាមួយនឹងការលាយអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មជាង DP ទាប និង oligosaccharides អព្យាក្រឹត។នៅទីនេះយើងរាយការណ៍អំពីការប្រើប្រាស់វិធីសាស្រ្តបន្ថែមមួយចំនួន រួមទាំងការធ្វើទម្រង់ glycan ដោយប្រើអង្គបដិប្រាណ monoclonal (mAbs) ជាក់លាក់ចំពោះ glycans ជីវម៉ាសរបស់រុក្ខជាតិដើម្បីកំណត់លក្ខណៈនៃចំណង glycan នៅក្នុងជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិ និង enzymatic hydrolysates, matrix-assisted laser desorption ionization, time-of-flight mass-spectrometry ។.MALDI-TOF-MS) ប្រើប្រាស់ចំណុចកំពូលនៃការវិនិច្ឆ័យដែលមានព័ត៌មានអំពីរចនាសម្ព័ន្ធ ដែលទទួលបានដោយ spectroscopy បន្ទាប់ពីការបំបែកបន្ទាប់បន្សំនៃអ៊ីយ៉ុងអវិជ្ជមាន ក្រូម៉ាតូក្រាមឧស្ម័ន និងវិសាលគមធំ (GC-MS) ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈនៃចំណង oligosaccharide ដោយមាន និងគ្មានដេរីវេ។ដោយសារតែទំហំតូចនៃ oligosaccharides (DP 4-20) ម៉ូលេគុលទាំងនេះពិបាកប្រើសម្រាប់ការចង mAb និងការកំណត់លក្ខណៈ។ដើម្បីជម្នះបញ្ហានេះ យើងបានអនុវត្តវិធីសាស្រ្ត immobilization oligosaccharide ដែលមានមូលដ្ឋានលើ biotin ថ្មីដែលដាក់ស្លាកដោយជោគជ័យនូវភាគច្រើននៃ oligosaccharides ទាបរលាយ DP នៅលើផ្ទៃ microplate ដែលបន្ទាប់មកត្រូវបានប្រើនៅក្នុងប្រព័ន្ធ mAb ឆ្លងកាត់ខ្ពស់សម្រាប់ការវិភាគជាក់លាក់នៃ ligation ។វិធីសាស្រ្តថ្មីនេះនឹងជួយសម្រួលដល់ការអភិវឌ្ឍន៍នៃការធ្វើតេស្ត glycome កម្រិតខ្ពស់បន្ថែមទៀតនាពេលអនាគត ដែលអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីញែក និងកំណត់លក្ខណៈរបស់ oligosaccharides ដែលមាននៅក្នុង biomarkers សម្រាប់គោលបំណងវិនិច្ឆ័យ។
ជីវម៉ាស Lignocellulosic ដែលផ្សំឡើងដោយសម្ភារៈកសិកម្ម ព្រៃឈើ ស្មៅ និងឈើ គឺជាចំណីដ៏មានសក្តានុពលសម្រាប់ផលិតផលិតផលជីវ- រួមមានអាហារ ចំណី ប្រេងឥន្ធនៈ និងសារធាតុគីមីមុនគេ ដើម្បីផលិតផលិតផលដែលមានតម្លៃខ្ពស់ជាង 1.កាបូអ៊ីដ្រាត (ដូចជា cellulose និង hemicellulose) ដែលមាននៅក្នុងជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិត្រូវបាន depolymerized ទៅជា monosaccharides ដោយដំណើរការគីមី និង biotransformation (ដូចជា enzymatic hydrolysis and microbial fermentation)។ការព្យាបាលមុនទូទៅរួមមានការពង្រីកជាតិសរសៃអាម៉ូញាក់ (AFEX) អាស៊ីតរំលាយ (DA) អង្គធាតុរាវអ៊ីយ៉ុង (IL) និងការផ្ទុះដោយចំហាយទឹក (SE) ដែលប្រើការរួមផ្សំនៃសារធាតុគីមី និងកំដៅដើម្បីកាត់បន្ថយការផលិត lignocellulose ដោយបើកជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិ3,4។ភាពរឹងចចេសនៃរូបធាតុ 5. អ៊ីដ្រូលីស្យូមអង់ស៊ីមត្រូវបានអនុវត្តនៅការផ្ទុកសារធាតុរឹងខ្ពស់ ដោយប្រើអង់ស៊ីមដែលមានផ្ទុកកាបូអ៊ីដ្រាតសកម្មពាណិជ្ជកម្ម (CAZymes) និងការបង្កាត់អតិសុខុមប្រាណដោយប្រើផ្សិតបំលែងហ្សែន ឬបាក់តេរី ដើម្បីផលិតឥន្ធនៈជីវៈ និងសារធាតុគីមី 6 ។
CAZymes នៅក្នុងអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មត្រូវបានផ្សំឡើងដោយល្បាយស្មុគស្មាញនៃអង់ស៊ីមដែលរួមគ្នាបំបែកចំណងកាបូអ៊ីដ្រាត-ជាតិស្ករស្មុគស្មាញដើម្បីបង្កើតជា monosaccharides2,7 ។ដូចដែលយើងបានរាយការណ៍ពីមុន បណ្តាញដ៏ស្មុគស្មាញនៃសារធាតុប៉ូលីម័រក្រអូបនៃ lignin ជាមួយកាបូអ៊ីដ្រាតធ្វើឱ្យពួកវាមានភាពទាក់ទាញខ្លាំង ដែលនាំឱ្យមានការបំប្លែងជាតិស្ករមិនពេញលេញ ប្រមូលផ្តុំ 15-25% នៃ oligosaccharides ផ្លូវភេទដែលមិនត្រូវបានផលិតកំឡុងពេល enzymatic hydrolysis នៃជីវម៉ាសដែលបានកែច្នៃរួច។នេះគឺជាបញ្ហាទូទៅមួយជាមួយនឹងវិធីព្យាបាលជីវម៉ាសផ្សេងៗ។ហេតុផលមួយចំនួនសម្រាប់បញ្ហាស្ទះនេះរួមមានការរារាំងអង់ស៊ីមក្នុងអំឡុងពេល hydrolysis ឬអវត្តមាន ឬកម្រិតទាបនៃអង់ស៊ីមសំខាន់ៗដែលត្រូវការដើម្បីបំបែកចំណងជាតិស្ករនៅក្នុងជីវម៉ាសរបស់រុក្ខជាតិ។ការយល់ដឹងអំពីសមាសភាព និងលក្ខណៈរចនាសម្ព័ន្ធនៃជាតិស្ករ ដូចជាចំណងជាតិស្ករនៅក្នុង oligosaccharides នឹងជួយយើងធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវការបំប្លែងជាតិស្ករក្នុងអំឡុងពេល hydrolysis ដែលធ្វើឱ្យដំណើរការជីវបច្ចេកវិទ្យាមានតម្លៃប្រកួតប្រជែងជាមួយនឹងផលិតផលដែលទទួលបានពីប្រេង។
ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធនៃកាបូអ៊ីដ្រាតគឺជាបញ្ហាប្រឈម និងតម្រូវឱ្យមានការរួមបញ្ចូលគ្នានៃវិធីសាស្រ្តដូចជា ក្រូម៉ាតូក្រាមរាវ (LC) 11,12, វិសាលគមមេដែកនុយក្លេអ៊ែរ (NMR)13, អេឡិចត្រុអេឡិចត្រិច capillary (CE) 14,15,16 និងម៉ាស់ spectrometry (MS)17 ។, ដប់ប្រាំបី។វិធីសាស្រ្ត MS ដូចជា វិសាលគមនៃពេលវេលាហោះហើរជាមួយនឹងការដកឡាស៊ែរ និងអ៊ីយ៉ូដ ដោយប្រើម៉ាទ្រីស (MALDI-TOF-MS) គឺជាវិធីសាស្ត្រចម្រុះសម្រាប់កំណត់រចនាសម្ព័ន្ធកាបូអ៊ីដ្រាត។ថ្មីៗនេះ ការប៉ះទង្គិចគ្នាដែលបណ្ដាលមកពីការបែកបាក់គ្នា (CID) tandem MS នៃសារធាតុបញ្ចូលអ៊ីយ៉ុងសូដ្យូម ត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយបំផុតដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណស្នាមម្រាមដៃដែលត្រូវគ្នាទៅនឹងទីតាំងភ្ជាប់ oligosaccharide ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធអាណូមិក លំដាប់ និងទីតាំងសាខា 20, 21 ។
ការវិភាគ Glycan គឺជាឧបករណ៍ដ៏ល្អសម្រាប់ការកំណត់អត្តសញ្ញាណស៊ីជម្រៅនៃចំណងកាបូអ៊ីដ្រាត 22 ។វិធីសាស្រ្តនេះប្រើអង្គបដិបក្ខ monoclonal (mAbs) ដែលដឹកនាំទៅ glycan ជញ្ជាំងកោសិកាដែលជាការស៊ើបអង្កេតដើម្បីយល់ពីទំនាក់ទំនងកាបូអ៊ីដ្រាតស្មុគស្មាញ។ច្រើនជាង 250 mAbs មាននៅទូទាំងពិភពលោក ដែលត្រូវបានរចនាឡើងប្រឆាំងនឹង oligosaccharides លីនេអ៊ែរ និងសាខាផ្សេងៗ ដោយប្រើ saccharides24 ផ្សេងៗ។mAbs ជាច្រើនត្រូវបានប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយដើម្បីកំណត់លក្ខណៈរចនាសម្ព័ន្ធ សមាសភាព និងការកែប្រែនៃជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិ ដោយសារវាមានភាពខុសគ្នាយ៉ាងសំខាន់អាស្រ័យលើប្រភេទកោសិការុក្ខជាតិ សរីរាង្គ អាយុ ដំណាក់កាលអភិវឌ្ឍន៍ និងបរិស្ថានលូតលាស់25,26។ថ្មីៗនេះ វិធីសាស្រ្តនេះត្រូវបានប្រើដើម្បីស្វែងយល់អំពីចំនួនប្រជាជនក្នុងសរសៃឈាមក្នុងប្រព័ន្ធរុក្ខជាតិ និងសត្វ និងតួនាទីរៀងៗខ្លួនក្នុងការដឹកជញ្ជូន glycan ដែលកំណត់ដោយសញ្ញាសម្គាល់កោសិការង ដំណាក់កាលអភិវឌ្ឍន៍ ឬកត្តាជំរុញបរិស្ថាន និងដើម្បីកំណត់សកម្មភាពអង់ស៊ីម។រចនាសម្ព័ន្ធផ្សេងគ្នាមួយចំនួននៃ glycans និង xylans ដែលត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណរួមមាន pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArabino-galact) និង 2.
ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ទោះបីជាមានកិច្ចខិតខំប្រឹងប្រែងស្រាវជ្រាវទាំងអស់នេះក៏ដោយ មានតែការសិក្សាមួយចំនួនប៉ុណ្ណោះដែលបានផ្តោតលើលក្ខណៈនៃការប្រមូលផ្តុំ oligosaccharide កំឡុងពេលផ្ទុកសារធាតុរឹងខ្ពស់ (HSL) hydrolysis រួមទាំងការបញ្ចេញ oligosaccharide ការផ្លាស់ប្តូរប្រវែងខ្សែសង្វាក់ oligomeric កំឡុងពេល hydrolysis ប៉ូលីម៊ែរ DP ទាបផ្សេងៗ និងខ្សែកោងរបស់វា។ការចែកចាយ 30,31,32 ។ទន្ទឹមនឹងនេះដែរ ទោះបីជាការវិភាគ glycan បានបង្ហាញថាជាឧបករណ៍មានប្រយោជន៍សម្រាប់ការវិភាគដ៏ទូលំទូលាយនៃរចនាសម្ព័ន្ធ glycan ក៏ដោយវាពិបាកក្នុងការវាយតម្លៃ DP oligosaccharides ទាបដែលរលាយក្នុងទឹកដោយប្រើវិធីសាស្ត្រអង្គបដិប្រាណ។DP oligosaccharides តូចជាងដែលមានទម្ងន់ម៉ូលេគុលតិចជាង 5-10 kDa មិនភ្ជាប់ទៅនឹងបន្ទះ ELISA 33, 34 ហើយត្រូវបានទឹកនាំទៅឆ្ងាយមុនពេលបន្ថែមអង្គបដិប្រាណ។
នៅទីនេះ ជាលើកដំបូង យើងបង្ហាញពីការវិភាគ ELISA លើចានដែលស្រោបដោយសារធាតុ avidin ដោយប្រើអង្គបដិប្រាណ monoclonal រួមបញ្ចូលគ្នានូវនីតិវិធី biotinylation មួយជំហានសម្រាប់ oligosaccharides refractory រលាយជាមួយនឹងការវិភាគ glycome ។វិធីសាស្រ្តរបស់យើងចំពោះការវិភាគ glycome ត្រូវបានធ្វើឱ្យមានសុពលភាពដោយការវិភាគផ្អែកលើ MALDI-TOF-MS និង GC-MS នៃតំណភ្ជាប់ oligosaccharide បំពេញបន្ថែមដោយប្រើ trimethylsilyl (TMS) ដេរីវេនៃសមាសធាតុជាតិស្ករអ៊ីដ្រូលីហ្សីន។វិធីសាស្រ្តប្រកបដោយភាពច្នៃប្រឌិតនេះ អាចត្រូវបានបង្កើតឡើងជាវិធីសាស្ត្រដែលមានលទ្ធផលខ្ពស់នាពេលអនាគត និងស្វែងរកការអនុវត្តកាន់តែទូលំទូលាយនៅក្នុងការស្រាវជ្រាវជីវវេជ្ជសាស្ត្រ35។
ការកែប្រែក្រោយការបកប្រែនៃអង់ស៊ីម និងអង្គបដិប្រាណ ដូចជា glycosylation 36 ប៉ះពាល់ដល់សកម្មភាពជីវសាស្រ្តរបស់ពួកគេ។ឧទាហរណ៍ ការផ្លាស់ប្តូរ glycosylation នៃប្រូតេអ៊ីនសេរ៉ូមដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការរលាកសន្លាក់ ហើយការផ្លាស់ប្តូរ glycosylation ត្រូវបានគេប្រើជាសញ្ញាសម្គាល់រោគវិនិច្ឆ័យ37។glycans ជាច្រើនត្រូវបានគេរាយការណ៍នៅក្នុងអក្សរសិល្ប៍ដើម្បីងាយស្រួលលេចឡើងក្នុងជំងឺជាច្រើនរួមទាំងជំងឺរលាករ៉ាំរ៉ៃនៃការរលាក gastrointestinal និងថ្លើម, ការឆ្លងមេរោគមេរោគ, អូវែរ, សុដន់, និងមហារីកក្រពេញប្រូស្តាត38,39,40។ការយល់ដឹងអំពីរចនាសម្ព័ន្ធនៃ glycans ដោយប្រើវិធីសាស្រ្ត glycan ELISA ដែលមានមូលដ្ឋានលើអង្គបដិប្រាណនឹងផ្តល់នូវទំនុកចិត្តបន្ថែមក្នុងការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យជំងឺដោយមិនចាំបាច់ប្រើវិធីសាស្រ្ត MS ស្មុគស្មាញ។
ការសិក្សាពីមុនរបស់យើងបានបង្ហាញថា oligosaccharides រឹងរូសនៅតែមិនមានជាតិទឹកបន្ទាប់ពីការព្យាបាលមុន និងអ៊ីដ្រូលីស្យូមអង់ស៊ីម (រូបភាពទី 1) ។នៅក្នុងការងារដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយពីមុនរបស់យើង យើងបានបង្កើតវិធីសាស្រ្តទាញយកធ្យូងដំណាក់កាលរឹងដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មដើម្បីបំបែក oligosaccharides ពី AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8 ។បន្ទាប់ពីការស្រង់ចេញដំបូង និងការបំបែកចេញ សារធាតុ oligosaccharides ត្រូវបានប្រភាគបន្ថែមទៀតដោយការដកទំហំក្រូម៉ាតូក្រាម (SEC) ហើយប្រមូលតាមលំដាប់នៃទម្ងន់ម៉ូលេគុល។ជាតិស្ករ monomers និង oligomers ដែលត្រូវបានបញ្ចេញពី pretreatment ផ្សេងៗត្រូវបានវិភាគដោយការវិភាគសមាសភាពជាតិស្ករ។នៅពេលប្រៀបធៀបមាតិកានៃជាតិស្ករ oligomers ដែលទទួលបានដោយវិធីព្យាបាលផ្សេងៗ វត្តមានរបស់ oligosaccharides រឹងរូសគឺជាបញ្ហាទូទៅក្នុងការបំប្លែងជីវម៉ាសទៅជា monosaccharides ហើយអាចនាំឱ្យមានការថយចុះទិន្នផលជាតិស្ករយ៉ាងហោចណាស់ 10-15% និងរហូតដល់ 18% ។ស.វិធីសាស្រ្តនេះត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការផលិតទ្រង់ទ្រាយធំបន្ថែមទៀតនៃប្រភាគ oligosaccharide ។លទ្ធផល ACH និងប្រភាគបន្តបន្ទាប់របស់វាជាមួយនឹងទម្ងន់ម៉ូលេគុលផ្សេងគ្នា ត្រូវបានគេប្រើជាសម្ភារៈពិសោធន៍សម្រាប់កំណត់លក្ខណៈនៃ oligosaccharides នៅក្នុងការងារនេះ។
បន្ទាប់​ពី​ការ​ព្យាបាល​មុន និង​អ៊ីដ្រូ​លី​ស៊ី​ម៉ា​ទីក អូ​លី​ហ្គោ​សា​ខា​រី​ដ​ដែល​នៅ​តែ​គ្មាន​ជាតិ​ទឹក ។នៅទីនេះ (A) គឺជាវិធីសាស្រ្តបំបែក oligosaccharide ដែល oligosaccharides ត្រូវបានញែកដាច់ពី AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) ដោយប្រើគ្រែវេចខ្ចប់នៃកាបូនដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម និង diatomaceous earth;(ខ) វិធីសាស្រ្តបំបែក oligosaccharides ។oligosaccharides ត្រូវបានបំបែកបន្ថែមទៀតដោយ chromatography ដកចេញទំហំ (SEC);(គ) Saccharide monomers និង oligomers ដែលត្រូវបានបញ្ចេញពីវិធីព្យាបាលមុនផ្សេងៗ (អាស៊ីតរំលាយ: DA, ionic liquid: IL និង AFEX)។លក្ខខណ្ឌអ៊ីដ្រូលីស្ទិចអង់ស៊ីម៖ ការផ្ទុកសារធាតុរឹងខ្ពស់ 25% (w/w) (ប្រហែល 8% ផ្ទុក glucan) អ៊ីដ្រូលីស៊ីស 96 ម៉ោង ការផ្ទុកអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្ម 20 mg/g (សមាមាត្រ Ctec2:Htec2: MP-2: 1:1) និង (D) ជាតិស្ករ monomers និង oligomers នៃគ្លុយកូស AF ពោត xylostre និង AC ដែលត្រូវបានបញ្ចេញពីចង្ក្រាន AF ។
ការវិភាគ Glycan បានបង្ហាញថាជាឧបករណ៍មានប្រយោជន៍សម្រាប់ការវិភាគរចនាសម្ព័ន្ធដ៏ទូលំទូលាយនៃ glycans នៅក្នុងសារធាតុចម្រាញ់ដែលដាច់ដោយឡែកពីសំណល់ជីវម៉ាសរឹង។ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សារធាតុ saccharides រលាយក្នុងទឹក ត្រូវបានបង្ហាញតិចតួចដោយប្រើវិធីសាស្រ្តប្រពៃណីនេះ 41 ដោយសារតែទម្ងន់ម៉ូលេគុល oligosaccharides ទាប ពិបាកក្នុងការធ្វើចលនានៅលើចាន ELISA ហើយត្រូវបានលាងសម្អាតមុនពេលបន្ថែមអង្គបដិប្រាណ។ដូច្នេះ សម្រាប់ការចងអង្គបដិប្រាណ និងការកំណត់លក្ខណៈ វិធីសាស្ត្រ biotinylation មួយជំហានត្រូវបានប្រើដើម្បីស្រោបសារធាតុ oligosaccharides ដែលរលាយ និងមិនអនុលោមតាមច្បាប់នៅលើចាន ELISA ដែលស្រោបដោយ avidin ។វិធីសាស្រ្តនេះត្រូវបានសាកល្បងដោយប្រើ ACSH ដែលផលិតពីមុនរបស់យើង និងប្រភាគដោយផ្អែកលើទម្ងន់ម៉ូលេគុលរបស់វា (ឬកម្រិតនៃវត្ថុធាតុ polymerization, DP) ។biotinylation មួយជំហានត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើនភាពស្និទ្ធស្នាលនៃការចង oligosaccharide ដោយបន្ថែម biotin-LC-hydrazide ទៅផ្នែកកាត់បន្ថយនៃកាបូអ៊ីដ្រាត (រូបភាពទី 2) ។នៅក្នុងដំណោះស្រាយ ក្រុម hemiacetal នៅចុងកាត់បន្ថយមានប្រតិកម្មជាមួយនឹងក្រុម hydrazide នៃ biotin-LC-hydrazide ដើម្បីបង្កើតជាចំណង hydrazone ។នៅក្នុងវត្តមាននៃភ្នាក់ងារកាត់បន្ថយ NaCNBH3 ចំណង hydrazone ត្រូវបានកាត់បន្ថយទៅជាផលិតផលចុង biotinylated មានស្ថេរភាព។ជាមួយនឹងការកែប្រែចុងកាត់បន្ថយជាតិស្ករ ការចងនៃ DP oligosaccharides ទាបទៅនឹងចាន ELISA អាចធ្វើទៅបាន ហើយនៅក្នុងការសិក្សារបស់យើង នេះត្រូវបានធ្វើនៅលើចានដែលស្រោបដោយ avidin ដោយប្រើ mAbs គោលដៅ glycan ។
ការពិនិត្យអង្គបដិប្រាណ monoclonal ដោយផ្អែកលើ ELISA សម្រាប់ biotinylated oligosaccharides ។នៅទីនេះ (A) ការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ biotinylation នៃ oligosaccharides និងការពិនិត្យ ELISA ជាបន្តបន្ទាប់ជាមួយនឹង mAbs គោលដៅ glycan នៅលើចានដែលស្រោបដោយ NeutrAvidin ហើយ (B) បង្ហាញពីនីតិវិធីមួយជំហានសម្រាប់ biotinylation នៃផលិតផលប្រតិកម្ម។
បន្ទាប់មកចានដែលស្រោបដោយសារធាតុ Avidin ជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណដែលផ្សំដោយ oligosaccharide ត្រូវបានបន្ថែមទៅអង្គបដិប្រាណបឋម និងបន្ទាប់បន្សំ ហើយលាងសម្អាតក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកដែលងាយនឹងប្រតិកម្មពន្លឺ និងពេលវេលា។បន្ទាប់ពីការចងអង់ទីករត្រូវបានបញ្ចប់ បន្ថែមស្រទាប់ខាងក្រោម TMB ដើម្បីភ្ញាស់ចាន។ទីបំផុតប្រតិកម្មត្រូវបានបញ្ឈប់ដោយអាស៊ីតស៊ុលហ្វួរីក។ចានភ្ញាស់ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើឧបករណ៍អាន ELISA ដើម្បីកំណត់កម្លាំងភ្ជាប់នៃអង្គបដិប្រាណនីមួយៗ ដើម្បីរកឃើញការភ្ជាប់ឆ្លងជាក់លាក់នៃអង្គបដិបក្ខ។សម្រាប់ព័ត៌មានលម្អិត និងប៉ារ៉ាម៉ែត្រនៃការពិសោធន៍ សូមមើលផ្នែកដែលត្រូវគ្នា "សម្ភារៈ និងវិធីសាស្ត្រ"។
យើងបង្ហាញពីអត្ថប្រយោជន៍នៃវិធីសាស្រ្តដែលបានបង្កើតថ្មីនេះសម្រាប់កម្មវិធីជាក់លាក់ដោយកំណត់លក្ខណៈនៃ oligosaccharides រលាយដែលមាននៅក្នុង ACSH ក៏ដូចជានៅក្នុងប្រភាគ oligosaccharide ឆៅ និងបន្សុតដែលដាច់ដោយឡែកពី lignocellulosic hydrolysates ។ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 3 សារធាតុ xylans ជំនួស epitope ទូទៅបំផុតដែលត្រូវបានកំណត់នៅក្នុង ACSH ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រ bioacylated glycome assay ជាធម្មតា uronic (U) ឬ methyluronic (MeU) និង pectic arabinogalactans ។ពួកគេភាគច្រើនត្រូវបានគេរកឃើញផងដែរនៅក្នុងការសិក្សាពីមុនរបស់យើងលើការវិភាគនៃ glycans នៃសារធាតុមិនអ៊ីដ្រូលីស៊ីត (UHS)43 ។
ការរកឃើញនៃអេពីតូប oligosaccharide recalcitrant ដោយប្រើអង្គបដិប្រាណ monoclonal ដែលដឹកនាំទៅ glycan ជញ្ជាំងកោសិកា។ប្រភាគ "អព្យាក្រឹត" គឺជាប្រភាគ ACN ហើយប្រភាគ "អាស៊ីត" គឺជាប្រភាគ FA ។ពណ៌ក្រហមភ្លឺជាងនៅលើផែនទីកំដៅបង្ហាញពីមាតិកាអេតូបខ្ពស់ជាង ហើយពណ៌ខៀវភ្លឺបង្ហាញពីផ្ទៃខាងក្រោយទទេ។តម្លៃពណ៌នៅលើមាត្រដ្ឋានគឺផ្អែកលើតម្លៃ OD ឆៅសម្រាប់រូបមន្ត N=2 ។អេពីតូបសំខាន់ៗដែលទទួលស្គាល់ដោយអង្គបដិប្រាណត្រូវបានបង្ហាញនៅខាងស្តាំ។
រចនាសម្ព័ន្ធដែលមិនមែនជាសែលុយឡូសទាំងនេះមិនអាចត្រូវបានបំបែកដោយកោសិកា និង hemicellulases ទូទៅបំផុតនៅក្នុងល្បាយអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មដែលបានសាកល្បង ដែលរួមបញ្ចូលអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មដែលប្រើជាទូទៅបំផុត។ដូច្នេះ អង់ស៊ីមជំនួយថ្មីត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ hydrolysis របស់វា។ដោយគ្មានអង់ស៊ីមគ្រឿងបន្លាស់ដែលមិនមែនជាសែលុយឡូសចាំបាច់ ចំណងដែលមិនមែនជាសែលុយឡូសទាំងនេះរារាំងការបំប្លែងទាំងស្រុងទៅជា monosaccharides ទោះបីជាប៉ូលីមែរស្ករមេរបស់ពួកគេត្រូវបានអ៊ីដ្រូលីស៊ីតយ៉ាងទូលំទូលាយទៅជាបំណែកខ្លីៗ និងរំលាយដោយប្រើល្បាយអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មក៏ដោយ។
ការសិក្សាបន្ថែមលើការចែកចាយសញ្ញា និងកម្លាំងភ្ជាប់របស់វាបានបង្ហាញថា អេពីតូបនៃការចងមានកម្រិតទាបជាងនៅក្នុងប្រភាគជាតិស្ករ DP ខ្ពស់ (A, B, C, DP រហូតដល់ 20+) ជាងប្រភាគ DP ទាប (D, E, F, DP) នៅក្នុង dimers) (រូបភាពទី 1)។បំណែកអាស៊ីតគឺជារឿងធម្មតានៅក្នុងអេពីតូបដែលមិនមែនជាសែលុយឡូសជាងបំណែកអព្យាក្រឹត។បាតុភូតទាំងនេះគឺស្របទៅនឹងគំរូដែលបានសង្កេតនៅក្នុងការសិក្សាពីមុនរបស់យើង ដែល DP និង moieties អាស៊ីតខ្ពស់មានភាពធន់នឹងអ៊ីដ្រូលីស្ទីកនៃអង់ស៊ីម។ដូច្នេះ វត្តមាន​នៃ epitopes glycan មិនមែន cellulose និង​ការ​ជំនួស U និង MeU អាច​រួមចំណែក​យ៉ាង​ខ្លាំង​ដល់​ស្ថិរភាព​នៃ oligosaccharides ។វាគួរតែត្រូវបានកត់សម្គាល់ថាប្រសិទ្ធភាពនៃការចងនិងការរកឃើញអាចមានបញ្ហាសម្រាប់ DP oligosaccharides ទាប ជាពិសេសប្រសិនបើ epitope គឺជា oligosaccharide dimeric ឬ trimeric ។វាអាចត្រូវបានសាកល្បងដោយប្រើ oligosaccharides ពាណិជ្ជកម្មដែលមានប្រវែងខុសៗគ្នា ដែលនីមួយៗមានអេពីតូបតែមួយគត់ដែលភ្ជាប់ទៅនឹង mAb ជាក់លាក់មួយ។
ដូច្នេះ ការប្រើប្រាស់អង្គបដិប្រាណជាក់លាក់នៃរចនាសម្ព័ន្ធបានបង្ហាញពីប្រភេទមួយចំនួននៃចំណង recalcitrant ។អាស្រ័យលើប្រភេទនៃអង្គបដិប្រាណដែលបានប្រើ លំនាំចងភ្ជាប់សមស្រប និងភាពខ្លាំងនៃសញ្ញាដែលវាបង្កើត (ភាគច្រើន និងតិចបំផុត) អង់ស៊ីមថ្មីអាចត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងបន្ថែមពាក់កណ្តាលបរិមាណទៅក្នុងល្បាយអង់ស៊ីមសម្រាប់ការបំប្លែង glycoconversion ពេញលេញបន្ថែមទៀត។យកការវិភាគនៃ ACSH oligosaccharides ជាឧទាហរណ៍ យើងអាចបង្កើតមូលដ្ឋានទិន្នន័យនៃចំណង glycan សម្រាប់សម្ភារៈជីវម៉ាសនីមួយៗ។គួរកត់សំគាល់នៅទីនេះថា ភាពស្និទ្ធស្នាលផ្សេងគ្នានៃអង្គបដិបក្ខគួរតែត្រូវបានគេយកមកពិចារណា ហើយប្រសិនបើភាពស្និទ្ធស្នាលរបស់វាមិនត្រូវបានគេដឹង វានឹងបង្កើតការលំបាកមួយចំនួននៅពេលប្រៀបធៀបសញ្ញានៃអង្គបដិបក្ខផ្សេងៗ។លើសពីនេះទៀតការប្រៀបធៀបនៃចំណង glycan អាចដំណើរការបានល្អបំផុតរវាងគំរូសម្រាប់អង្គបដិប្រាណដូចគ្នា។ចំណងរឹងរូសទាំងនេះអាចត្រូវបានភ្ជាប់ទៅមូលដ្ឋានទិន្នន័យ CAZyme ដែលយើងអាចកំណត់អត្តសញ្ញាណអង់ស៊ីម ជ្រើសរើសអង់ស៊ីមបេក្ខជន និងធ្វើតេស្តសម្រាប់អង់ស៊ីមបំបែកចំណង ឬអភិវឌ្ឍប្រព័ន្ធមីក្រូជីវសាស្រ្តដើម្បីបង្ហាញពីអង់ស៊ីមទាំងនេះសម្រាប់ប្រើប្រាស់ក្នុង biorefineries44។
ដើម្បីវាយតម្លៃពីរបៀបដែលវិធីសាស្រ្ត immunological បំពេញបន្ថែមវិធីសាស្រ្តជំនួសសម្រាប់កំណត់លក្ខណៈនៃទម្ងន់ម៉ូលេគុល oligosaccharides ទាបដែលមាននៅក្នុង lignocellulosic hydrolysates យើងបានអនុវត្ត MALDI (រូបភាពទី 4, S1-S8) និងការវិភាគនៃ saccharides ដែលបានមកពី TMS ដោយផ្អែកលើ GC-MS នៅលើបន្ទះដូចគ្នា (រូបភាព 5) part oligo ។MALDI ត្រូវបានប្រើដើម្បីប្រៀបធៀបថាតើការចែកចាយដ៏ធំនៃម៉ូលេគុល oligosaccharide ត្រូវគ្នានឹងរចនាសម្ព័ន្ធដែលបានគ្រោងទុក។នៅលើរូបភព។4 បង្ហាញ MC នៃសមាសធាតុអព្យាក្រឹត ACN-A និង ACN-B ។ការវិភាគ ACN-A បានបញ្ជាក់ពីជួរនៃជាតិស្ករ pentose ចាប់ពី DP 4-8 (រូបភាពទី 4) ដល់ DP 22 (រូបភាព S1) ដែលទម្ងន់របស់វាត្រូវនឹង MeU-xylan oligosaccharides ។ការវិភាគ ACN-B បានបញ្ជាក់ពីស៊េរី pentose និង glucoxylan ជាមួយ DP 8-15 ។នៅក្នុងសម្ភារៈបន្ថែមដូចជារូបភាព S3 ផែនទីចែកចាយម៉ាស់អាស៊ីត FA-C បង្ហាញជួរនៃជាតិស្ករ pentose ជំនួស (Me)U ជាមួយនឹង DP នៃ 8-15 ដែលស្របនឹង xylans ជំនួសដែលបានរកឃើញនៅក្នុងការបញ្ចាំង mAb ដែលមានមូលដ្ឋានលើ ELISA ។epitopes គឺស្រប។
វិសាលគម MALDI-MS នៃសារធាតុ oligosaccharides ដែលមិនអាចរលាយបានដែលមាននៅក្នុង ACS ។នៅទីនេះ (A) ACN-A ប្រភាគជួរទម្ងន់ទាបដែលមានអាស៊ីត uronic methylated (DP 4-8) ជំនួស glucuroxylan oligosaccharides និង (B) ACN-B xylan និង methylated uronic acid oligosaccharides ជំនួសដោយ glucuroxylan (DP 8-15)។
ការវិភាគនៃសមាសធាតុនៃសំណល់ glycan នៃ oligosaccharides refractory ។នៅទីនេះ (A) សមាសភាព TMS saccharide នៃប្រភាគ oligosaccharide ផ្សេងៗដែលទទួលបានដោយប្រើការវិភាគ GC-MS ។(ខ) រចនាសម្ព័ន្ធនៃជាតិស្ករ TMS ផ្សេងៗដែលមាននៅក្នុង oligosaccharides ។ACN - ប្រភាគ acetonitrile ដែលមាន oligosaccharides អព្យាក្រឹត និង FA - ប្រភាគអាស៊ីត ferulic ដែលមានអាស៊ីត oligosaccharides ។
ការសន្និដ្ឋានគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍មួយទៀតត្រូវបានដកចេញពីការវិភាគ LC-MS នៃប្រភាគ oligosaccharide ដូចដែលបានបង្ហាញនៅក្នុងរូបភាព S9 (វិធីសាស្រ្តអាចត្រូវបានគេមើលឃើញនៅក្នុងសម្ភារៈបន្ថែមអេឡិចត្រូនិច) ។បំណែកនៃក្រុម hexose និង -OAc ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញម្តងហើយម្តងទៀតក្នុងអំឡុងពេលចងភ្ជាប់នៃប្រភាគ ACN-B ។ការរកឃើញនេះមិនត្រឹមតែបញ្ជាក់ពីការបែងចែកដែលត្រូវបានអង្កេតនៅក្នុង glycome និងការវិភាគ MALDI-TOF ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងផ្តល់នូវព័ត៌មានថ្មីអំពីដេរីវេនៃកាបូអ៊ីដ្រាតដែលមានសក្តានុពលនៅក្នុងជីវម៉ាស់ lignocellulosic ដែលបានព្យាបាលមុនផងដែរ។
យើងក៏បានវិភាគសមាសភាពស្ករនៃប្រភាគ oligosaccharide ដោយប្រើការទាញយកជាតិស្ករ TMS ។ដោយប្រើ GC-MS យើងបានកំណត់សមាសភាពនៃសរសៃប្រសាទ (មិនមែនដេរីវេ) និងជាតិស្ករអាស៊ីត (GluA និង GalA) នៅក្នុងប្រភាគ oligosaccharide (រូបភាព 5) ។អាស៊ីត Glucuronic ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងសមាសធាតុអាស៊ីត C និង D ខណៈពេលដែលអាស៊ីត galacturonic ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងសមាសធាតុអាស៊ីត A និង B ដែលជាសមាសធាតុ DP ខ្ពស់នៃជាតិស្ករអាស៊ីត។លទ្ធផលទាំងនេះមិនត្រឹមតែបញ្ជាក់ពីទិន្នន័យ ELISA និង MALDI របស់យើងប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែវាក៏ស្របជាមួយនឹងការសិក្សាពីមុនរបស់យើងអំពីការប្រមូលផ្តុំ oligosaccharide ផងដែរ។ដូច្នេះហើយ យើងជឿថា វិធីសាស្រ្ត immunological ទំនើបដោយប្រើ biotinylation នៃ oligosaccharides និងការពិនិត្យ ELISA ជាបន្តបន្ទាប់គឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីរកឃើញ oligosaccharides recalcitrant រលាយក្នុងសំណាកជីវសាស្រ្តផ្សេងៗ។
ដោយសារវិធីសាស្រ្តពិនិត្យ mAb ដែលមានមូលដ្ឋានលើ ELISA ត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយវិធីសាស្រ្តផ្សេងៗគ្នាជាច្រើន យើងចង់ស្វែងយល់បន្ថែមអំពីសក្តានុពលនៃវិធីសាស្ត្របរិមាណថ្មីនេះ។សារធាតុ oligosaccharides ពាណិជ្ជកម្មពីរគឺ xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) និង 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) ត្រូវបានទិញ និងសាកល្បងដោយប្រើវិធីសាស្រ្ត mAb ថ្មីដែលកំណត់គោលដៅ glycan ជញ្ជាំងកោសិកា។រូបភាពទី 6 បង្ហាញពីទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែររវាងសញ្ញានៃការចង biotinylated និងកំហាប់កំណត់ហេតុនៃកំហាប់ oligosaccharide ដែលបង្ហាញពីគំរូ adsorption Langmuir ដែលអាចធ្វើទៅបាន។ក្នុងចំណោម mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, និង CCRC-M151 ជាប់ទាក់ទងជាមួយ XHE, និង CCRC-M108, CCRC-M109, និង LM11 ជាប់ទាក់ទងជាមួយ A2XX លើជួរនៃ 1010 ។ដោយសារតែភាពអាចរកបានមានកម្រិតនៃអង្គបដិប្រាណក្នុងអំឡុងពេលពិសោធន៍ ការពិសោធន៍មានកម្រិតត្រូវបានអនុវត្តជាមួយនឹងកំហាប់ oligosaccharide នីមួយៗ។វាគួរតែត្រូវបានកត់សម្គាល់នៅទីនេះថាអង្គបដិប្រាណខ្លះមានប្រតិកម្មខុសគ្នាយ៉ាងខ្លាំងចំពោះ oligosaccharide ដូចគ្នាជាស្រទាប់ខាងក្រោម សន្មតថាដោយសារតែពួកវាភ្ជាប់ទៅនឹងអេពីតូបខុសគ្នាបន្តិចបន្តួច ហើយអាចមានទំនាក់ទំនងស្អិតខុសគ្នាខ្លាំង។យន្តការ និងផលប៉ះពាល់នៃការកំណត់អត្តសញ្ញាណអេពីតូបត្រឹមត្រូវនឹងកាន់តែស្មុគស្មាញនៅពេលដែលវិធីសាស្រ្ត mAb ថ្មីត្រូវបានអនុវត្តចំពោះគំរូពិត។
oligosaccharides ពាណិជ្ជកម្មចំនួនពីរត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់ជួរនៃការរកឃើញនៃ mAbs គោលដៅ glycan ផ្សេងៗ។នៅទីនេះទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែរជាមួយកំហាប់កំណត់ហេតុនៃកំហាប់ oligosaccharide បង្ហាញពីគំរូនៃការស្រូបយក Langmuir សម្រាប់ (A) XHE ជាមួយ mAb និង (B) A2XX ជាមួយ mAb ។អេពីតូបដែលត្រូវគ្នាបង្ហាញពីរចនាសម្ព័ន្ធនៃ oligosaccharides ពាណិជ្ជកម្មដែលប្រើជាស្រទាប់ខាងក្រោមនៅក្នុងការវិភាគ។
ការប្រើប្រាស់អង្គបដិប្រាណ monoclonal ដែលកំណត់គោលដៅ glycan (ការវិភាគ glycocomic ឬការពិនិត្យ mAb ដែលមានមូលដ្ឋានលើ ELISA) គឺជាឧបករណ៍ដ៏មានអានុភាពសម្រាប់ការកំណត់លក្ខណៈស៊ីជម្រៅនៃ glycans ជញ្ជាំងកោសិកាសំខាន់ៗភាគច្រើនដែលបង្កើតជាជីវម៉ាសរបស់រុក្ខជាតិ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការវិភាគ glycan បុរាណកំណត់លក្ខណៈរបស់ glycans ជញ្ជាំងកោសិកាធំជាង ព្រោះថា oligosaccharides ភាគច្រើនមិនត្រូវបាន immobilized ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនៅលើចាន ELISA ។នៅក្នុងការសិក្សានេះ ចង្ក្រានពោតដែលបានព្យាបាលដោយ AFEX ត្រូវបានបំប្លែងដោយអង់ស៊ីមដោយអ៊ីដ្រូលីស៊ីមក្នុងបរិមាណសារធាតុរឹងខ្ពស់។ការវិភាគជាតិស្ករត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់សមាសភាពនៃកាបូអ៊ីដ្រាតជញ្ជាំងកោសិកា recalcitrant នៅក្នុង hydrolyzate ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការវិភាគ mAb នៃ oligosaccharides តូចជាងនៅក្នុង hydrolysates ត្រូវបានគេប៉ាន់ស្មានមិនដល់ ហើយឧបករណ៍បន្ថែមគឺត្រូវការជាចាំបាច់ដើម្បីធ្វើអោយ oligosaccharides immobilize ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនៅលើចាន ELISA ។
យើងរាយការណ៍នៅទីនេះនូវវិធីសាស្រ្ត immobilization oligosaccharide ប្រលោមលោក និងមានប្រសិទ្ធភាពសម្រាប់ការពិនិត្យ mAb ដោយរួមបញ្ចូលគ្នានូវ biotinylation oligosaccharide អមដោយការបញ្ចាំង ELISA នៅលើចានដែលស្រោបដោយ NeutrAvidin™។សារធាតុ oligosaccharides biotinylated immobilized បានបង្ហាញពីភាពស្និទ្ធស្នាលគ្រប់គ្រាន់សម្រាប់អង្គបដិបក្ខ ដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យរកឃើញយ៉ាងឆាប់រហ័ស និងមានប្រសិទ្ធភាពនៃ oligosaccharides ឡើងវិញ។ការវិភាគនៃសមាសភាពនៃ oligosaccharides រឹងរូសទាំងនេះដោយផ្អែកលើ spectrometry ដ៏ធំបានបញ្ជាក់ពីលទ្ធផលនៃវិធីសាស្រ្តថ្មីនេះដើម្បី immunoscreening ។ដូច្នេះ ការសិក្សាទាំងនេះបង្ហាញថា ការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ biotinylation oligosaccharide និងការពិនិត្យ ELISA ជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណ monoclonal កំណត់គោលដៅ glycan អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីរកមើល crosslinks នៅក្នុង oligosaccharides និងអាចត្រូវបានអនុវត្តយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងការសិក្សាជីវគីមីផ្សេងទៀតដែលកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធនៃ oligosaccharides ។
វិធីសាស្ត្រកំណត់ទម្រង់ glycan ដែលមានមូលដ្ឋានលើ biotin នេះគឺជារបាយការណ៍ដំបូងដែលមានសមត្ថភាពស៊ើបអង្កេតចំណងកាបូអ៊ីដ្រាត recalcitrant នៃ oligosaccharides រលាយក្នុងជីវម៉ាសរុក្ខជាតិ។នេះជួយឱ្យយល់ពីមូលហេតុដែលផ្នែកខ្លះនៃជីវម៉ាសមានភាពរឹងរូសនៅពេលនិយាយអំពីការផលិតជីវឥន្ធនៈ។វិធីសាស្រ្តនេះបំពេញចន្លោះដ៏សំខាន់មួយនៅក្នុងវិធីសាស្រ្តវិភាគ glycome និងពង្រីកកម្មវិធីរបស់វាទៅស្រទាប់ខាងក្រោមធំទូលាយលើសពី oligosaccharides រុក្ខជាតិ។នៅពេលអនាគត យើងអាចប្រើប្រាស់មនុស្សយន្តសម្រាប់ biotinylation ហើយប្រើវិធីសាស្រ្តដែលយើងបានបង្កើតសម្រាប់ការវិភាគគំរូដែលឆ្លងកាត់កម្រិតខ្ពស់ដោយប្រើ ELISA ។
ចំបើងពោត (CS) ដាំដុះពីគ្រាប់ពូជកូនកាត់ Pioneer 33A14 ត្រូវបានប្រមូលផលក្នុងឆ្នាំ 2010 ពីកសិដ្ឋាន Kramer នៅ Ray រដ្ឋ Colorado ។ដោយមានការអនុញ្ញាតពីម្ចាស់ដី ជីវម៉ាសនេះអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការស្រាវជ្រាវ។ សំណាកសំណាកត្រូវបានរក្សាទុកស្ងួត < 6% សំណើមនៅក្នុងថង់ zip-lock ក្នុងសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ សំណាកសំណាកត្រូវបានរក្សាទុកស្ងួត < 6% សំណើមនៅក្នុងថង់ zip-lock ក្នុងសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. គំរូត្រូវបានរក្សាទុកស្ងួតនៅសំណើម <6% នៅក្នុងថង់ខ្សែរ៉ូតនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中។样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. គំរូត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងថង់ខ្សែរ៉ូតនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ជាមួយនឹងសំណើម < 6% ។ការសិក្សាបានអនុលោមតាមគោលការណ៍ណែនាំក្នុងស្រុក និងថ្នាក់ជាតិ។ការវិភាគសមាសភាពត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើពិធីការ NREL ។សមាសភាពត្រូវបានគេរកឃើញថាមានផ្ទុក 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, ប្រូតេអ៊ីន 1.7% និង 13. 4% ផេះ។
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) គឺជាល្បាយស្មុគស្មាញនៃ cellulase, β-glucosidase និង Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) ពី Novozymes (Franklinton, NC, USA))។Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL) ដែលជាការបញ្ចូលគ្នាដ៏ស្មុគស្មាញនៃអង់ស៊ីមដែលបំផ្លាញសារធាតុ pectin ត្រូវបានបរិច្ចាគដោយ DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA)។ការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនអង់ស៊ីមត្រូវបានកំណត់ដោយការប៉ាន់ប្រមាណមាតិកាប្រូតេអ៊ីន (និងដកការរួមចំណែកនៃអាសូតដែលមិនមែនជាប្រូតេអ៊ីន) ដោយប្រើការវិភាគអាសូត Kjeldahl (វិធីសាស្ត្រ AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) ។Diatomaceous earth 545 ត្រូវបានទិញពី EMD Millipore (Billerica, MA)។កាបូនដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, និងសារធាតុគីមីផ្សេងទៀតទាំងអស់ត្រូវបានទិញពី Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)។
ការព្យាបាលដោយ AFEX ត្រូវបានអនុវត្តនៅ GLBRC (មន្ទីរពិសោធន៍ស្រាវជ្រាវការបំប្លែងជីវម៉ាស, MSU, Lansing, MI, USA)។ការព្យាបាលមុនត្រូវបានអនុវត្តនៅ 140 អង្សាសេរយៈពេល 15 នាទី។ពេលវេលាស្នាក់នៅ 46 នៅសមាមាត្រ 1: 1 នៃអាម៉ូញាក់គ្មានជាតិទឹកទៅនឹងជីវម៉ាសនៅ 60% (w/w) ផ្ទុកនៅក្នុងរ៉េអាក់ទ័រដែលធ្វើពីដែកអ៊ីណុក (ក្រុមហ៊ុន Parr Instruments Company) ។វាចំណាយពេល 30 នាទី។រ៉េអាក់ទ័រត្រូវបាននាំយកទៅសីតុណ្ហភាព 140°C ហើយអាម៉ូញាក់ត្រូវបានបញ្ចេញយ៉ាងលឿន ដែលអនុញ្ញាតឱ្យជីវម៉ាសត្រឡប់ទៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់វិញយ៉ាងឆាប់រហ័សសមាសភាពនៃចង្ក្រានពោតដែលបានព្យាបាលមុន AFEX (ACS) គឺស្រដៀងទៅនឹងចង្ក្រានពោតដែលមិនព្យាបាល (UT-CS)។
សារធាតុរឹងខ្ពស់ ACSH 25% (w/w) (ប្រហែល 8% dextran loading) ត្រូវបានរៀបចំជាសម្ភារៈចាប់ផ្តើមសម្រាប់ការផលិតទ្រង់ទ្រាយធំនៃ oligosaccharides ។អ៊ីដ្រូលីស្យូម អង់ស៊ីម នៃ ACS ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើល្បាយអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្ម រួមមាន Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (ក្នុងជីវម៉ាសដែលបានកែច្នៃ), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan, និង Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA)។)), ប្រូតេអ៊ីន 5 មីលីក្រាម / ក្រាម dextran ។អ៊ីដ្រូលីស្យូម អង់ស៊ីម ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងម៉ាស៊ីនប្រតិកម្មជីវឧស្ម័ន 5 លីត្រដែលមានបរិមាណការងារ 3 លីត្រ, pH 4.8, 50 ° C និង 250 rpm ។បន្ទាប់ពី hydrolysis អស់រយៈពេល 96 ម៉ោង hydrolyzate ត្រូវបានប្រមូលដោយ centrifugation នៅ 6000 rpm រយៈពេល 30 នាទី ហើយបន្ទាប់មកនៅ 14000 rpm រយៈពេល 30 នាទី ដើម្បីយកសារធាតុរាវ unhydrolysed ចេញ។បន្ទាប់មក អ៊ីដ្រូលីហ្សេត ត្រូវបានទទួលរងនូវការច្រោះមាប់មគ តាមរយៈធុងចម្រោះ 0.22 មីលីម៉ែត្រ។អ៊ីដ្រូលីហ្សេតដែលបានត្រងត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងដបក្រៀវនៅសីតុណ្ហភាព 4°C. ហើយបន្ទាប់មកប្រភាគនៅលើកាបូន។
ការវិភាគសមាសភាពនៃសំណាកជីវម៉ាស់ដែលមានមូលដ្ឋានលើការស្រង់ចេញដោយយោងតាមនីតិវិធីនៃការវិភាគមន្ទីរពិសោធន៍ NREL៖ ការរៀបចំសំណាកសម្រាប់ការវិភាគសមាសភាព (NREL/TP-510-42620) និងការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធកាបូអ៊ីដ្រាត និងលីណូនក្នុងជីវម៉ាស់ (NREL/TP-510 – 42618) 47 ។
ការវិភាគ Oligosaccharide នៃស្ទ្រីម hydrolyzate ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើមាត្រដ្ឋាន 2 មីលីលីត្រដោយប្រើវិធីសាស្រ្ត hydrolysis អាស៊ីតដែលមានមូលដ្ឋានលើ autoclave ។លាយសំណាកអ៊ីដ្រូលីហ្សេតជាមួយ 69.7 µl នៃអាស៊ីតស៊ុលហ្វួរីក 72% ក្នុងបំពង់វប្បធម៍មួកវីស 10 មីលីលី ហើយភ្ញាស់រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅលើតុនៅសីតុណ្ហភាព 121 អង្សាសេ ត្រជាក់លើទឹកកក ហើយត្រងចូលទៅក្នុងដបទឹកក្រូម៉ាតូក្រាម (HPLC) ដែលមានដំណើរការខ្ពស់។ការផ្តោតអារម្មណ៍នៃ oligosaccharides ត្រូវបានកំណត់ដោយការដកកំហាប់នៃ monosaccharides ក្នុងសំណាកដែលមិនមានជាតិអ៊ីដ្រូលីស៊ីតពីកំហាប់ជាតិស្ករសរុបនៅក្នុងសំណាកអាសុីតអ៊ីដ្រូលីហ្សីត។
កំហាប់គ្លុយកូស xylose និង arabinose នៅក្នុងជីវម៉ាស hydrolysed អាស៊ីតត្រូវបានវិភាគដោយប្រើប្រព័ន្ធ Shimadzu HPLC បំពាក់ដោយ autosampler, column heater, isocratic pump, and refractive index detector on a Bio-Rad Aminex HPX-87H column ។ជួរឈរត្រូវបានរក្សានៅសីតុណ្ហភាព 50 អង្សារសេហើយត្រូវបានបញ្ចេញដោយ 0.6 មីលីលីត្រ / នាទី 5 mM H2SO4 ក្នុងទឹក។លំហូរ។
សារធាតុ supernatant hydrolyzate ត្រូវបានពនឺ និងវិភាគសម្រាប់មាតិកា monomer និង oligosaccharide ។ជាតិស្ករ monomeric ដែលទទួលបានបន្ទាប់ពីការ hydrolysis អង់ស៊ីមត្រូវបានវិភាគដោយ HPLC បំពាក់ដោយជួរឈរ Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P និងជួរឈរការពារផេះ។សីតុណ្ហភាពជួរឈរត្រូវបានរក្សាទុកនៅ 80 ° C ទឹកត្រូវបានប្រើជាដំណាក់កាលចល័តដែលមានអត្រាលំហូរ 0.6 មីលីលីត្រ / នាទី។Oligosaccharides ត្រូវបានកំណត់ដោយអ៊ីដ្រូលីស៊ីសក្នុងអាស៊ីតរលាយនៅ 121 អង្សាសេយោងទៅតាមវិធីសាស្ត្រដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងឯកសារយោង។៤១, ៤៨, ៤៩។
ការវិភាគ Saccharide ត្រូវបានអនុវត្តលើវត្ថុធាតុដើម AFEX ដែលត្រូវបានព្យាបាលមុន និងសំណល់ជីវម៉ាស់ដែលមិនមានជាតិអ៊ីដ្រូលីស៊ីតទាំងអស់ (រួមទាំងការផលិតសារធាតុចម្រាញ់ពីជញ្ជាំងកោសិកាសៀរៀល និងការពិនិត្យ mAb របស់ពួកគេ) ដោយប្រើនីតិវិធីដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 27, 43, 50, 51 ។សម្រាប់ការវិភាគ glycome សំណល់ដែលមិនអាចរលាយបាននៃជាតិអាល់កុលនៃសម្ភារៈជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិត្រូវបានរៀបចំពីសំណល់ជីវម៉ាស និងត្រូវបានទទួលរងនូវការស្រង់ចេញជាសៀរៀលជាមួយនឹងសារធាតុប្រតិកម្មកាន់តែខ្លាំងដូចជា ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM និង 0.5% w/v), CON ។(1M និង 4M ទាំងពីរមាន 1% w/v sodium borohydride) និងអាស៊ីតក្លរីត ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 52,53។បន្ទាប់មកការស្រង់ចេញត្រូវបានទទួលរងនូវ ELISA ប្រឆាំងនឹងបន្ទះស្មុគស្មាញនៃ mAb50s ដែលដឹកនាំទៅ glycan ជញ្ជាំងកោសិកា ហើយប្រតិកម្មនៃការចង mAb ត្រូវបានបង្ហាញជាផែនទីកំដៅ។mAbs កំណត់គោលដៅ glycan ជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិត្រូវបានទិញពីស្តុកមន្ទីរពិសោធន៍ (ស៊េរី CCRC, JIM និង MAC) ។
ការធ្វើកោសល្យវិច័យមួយជំហាននៃ oligosaccharides ។ការបញ្ចូលគ្នានៃកាបូអ៊ីដ្រាតជាមួយ biotin-LC-hydrazide ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើនីតិវិធីដូចខាងក្រោម។Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ត្រូវបានរំលាយនៅក្នុង dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) ដោយការកូរ និងកំដៅយ៉ាងខ្លាំងក្លានៅ 65 ° C. រយៈពេល 1 នាទី។ទឹកអាស៊ីត Glacial acetic (30 µl) ត្រូវបានបន្ថែម ហើយល្បាយនេះត្រូវបានចាក់ទៅលើ សូដ្យូម cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) ហើយរំលាយទាំងស្រុងបន្ទាប់ពីកំដៅនៅ 65 ° C. ប្រហែល 1 នាទី។បន្ទាប់មក ពី 5 ទៅ 8 μl នៃល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានបន្ថែមទៅ oligosaccharide ស្ងួត (1-100 nmol) ដើម្បីទទួលបាន 10 ដងឬច្រើនជាងនេះ molar លើសនៃស្លាកនៅលើចុងកាត់បន្ថយ។ប្រតិកម្មត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាព 65 អង្សាសេរយៈពេល 2 ម៉ោងបន្ទាប់មកសំណាកត្រូវបានបន្សុតភ្លាមៗ។គ្មានជាតិសូដ្យូម cyanoborohydride ត្រូវបានប្រើប្រាស់ក្នុងការពិសោធន៍ដាក់ស្លាកដោយគ្មានការកាត់បន្ថយ ហើយសំណាកត្រូវបានប្រតិកម្មនៅសីតុណ្ហភាព 65°C រយៈពេល 2.5 ម៉ោង។
ថ្នាំកូត ELISA និងការលាងសំណាកនៃ biotinylated oligosaccharides ។25 μlនៃសំណាក biotinylated (100 μlនៃសំណាកប្រមូលផ្តុំនីមួយៗ diluted ក្នុង 5 ml នៃ 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) ត្រូវបានបន្ថែមទៅអណ្តូងនីមួយៗនៃចានដែលស្រោបដោយ avidin ។អណ្តូងត្រួតពិនិត្យត្រូវបានស្រោបដោយ 50 μlនៃ biotin នៅកំហាប់ 10 μg/ml ក្នុង 0.1 M TBS ។ទឹក Deionized ត្រូវបានគេប្រើជាថ្នាំកូតសម្រាប់ការវាស់វែងទទេ។ថេប្លេតត្រូវបាន incubated រយៈពេល 2 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់នៅក្នុងទីងងឹត។លាងចាន 3 ដងជាមួយទឹកដោះគោ 0.1% ក្នុង 0.1 M TBS ដោយប្រើកម្មវិធីលេខ។11 សម្រាប់ផ្ទះ Grenier 3A ។
ការបន្ថែមនិងការលាងសម្អាតអង្គបដិប្រាណបឋម។បន្ថែម 40 µl នៃអង្គបដិប្រាណបឋមទៅអណ្តូងនីមួយៗ។ដាក់មីក្រូប្លាកែតរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងទីងងឹត។បន្ទាប់មកចានត្រូវបានលាងសម្អាត 3 ដងជាមួយនឹងទឹកដោះគោ 0.1% ក្នុង 0.1M TBS ដោយប្រើកម្មវិធីលាងសម្អាត #11 សម្រាប់ Grenier Flat 3A ។
បន្ថែមអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំហើយលាងសម្អាត។បន្ថែមអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំរបស់កណ្តុរ/កណ្តុរ 50 µl (ពនលាយ 1:5000 ក្នុងទឹកដោះគោ 0.1% ក្នុង 0.1 M TBS) ទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗ។ដាក់មីក្រូប្លាកែតរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងទីងងឹត។បន្ទាប់មកមីក្រូប្លាតត្រូវបានលាងសម្អាត 5 ដងជាមួយនឹងទឹកដោះគោ 0.1% ក្នុង 0.1 M TBS ដោយប្រើកម្មវិធីលាងចាន Grenier Flat 5A #12 ។
ការបន្ថែមស្រទាប់ខាងក្រោម។បន្ថែម 50 µl នៃ 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ទៅស្រទាប់ខាងក្រោមមូលដ្ឋាន (ដោយបន្ថែម 2 ដំណក់នៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន 3 ដំណក់នៃ TMB, 2 ដំណក់នៃអ៊ីដ្រូសែន peroxide ទៅ 15 មីលីលីត្រនៃទឹក deionized) ។រៀបចំស្រទាប់ខាងក្រោម TMB ។និង vortex មុនពេលប្រើ) ។ដាក់មីក្រូប្លាតនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 30 នាទី។នៅក្នុងទីងងឹត។
បំពេញជំហានហើយអានកុំព្យូទ័របន្ទះ។បន្ថែម 50 µl នៃអាស៊ីតស៊ុលហ្វួរី 1 N ទៅអណ្តូងនីមួយៗ ហើយកត់ត្រាការស្រូបពី 450 ទៅ 655 nm ដោយប្រើឧបករណ៍អាន ELISA ។
រៀបចំដំណោះស្រាយ 1 mg/ml នៃការវិភាគទាំងនេះក្នុងទឹក deionized: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), អាស៊ីត glucuronic (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucos(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (ស្តង់ដារខាងក្នុង) ។ស្តង់ដារពីរត្រូវបានរៀបចំដោយបន្ថែមដំណោះស្រាយជាតិស្ករ 1 mg/mL ដែលបង្ហាញក្នុងតារាងទី 1 ។ គំរូត្រូវបានបង្កក និង lyophilized នៅ -80 ° C. រហូតដល់ទឹកទាំងអស់ត្រូវបានយកចេញ (ជាធម្មតាប្រហែល 12-18 ម៉ោង) ។
បន្ថែម 100-500 µg នៃគំរូទៅបំពង់វីសនៅលើសមតុល្យវិភាគ។កត់ត្រាចំនួនទឹកប្រាក់ដែលបានបន្ថែម។វាជាការល្អបំផុតក្នុងការរំលាយសំណាកនៅក្នុងកំហាប់ជាក់លាក់នៃសារធាតុរំលាយ ហើយបន្ថែមវាទៅក្នុងបំពង់ជា aliquot រាវ។ប្រើ 20 µl នៃ 1 mg/ml inositol ជាស្តង់ដារខាងក្នុងសម្រាប់បំពង់គំរូនីមួយៗ។បរិមាណស្តង់ដារខាងក្នុងដែលបានបន្ថែមទៅសំណាកគំរូត្រូវតែដូចគ្នានឹងបរិមាណស្តង់ដារខាងក្នុងដែលបានបន្ថែមទៅបំពង់ស្តង់ដារ។
បន្ថែមមេតាណុលគ្មានជាតិទឹក 8 មីលីលីត្រទៅក្នុងដបមួកវីស។បន្ទាប់មក 4 មីលីលីត្រនៃដំណោះស្រាយ 3 N. មេតាណុល HCl, បិទភ្ជាប់ និងរង្គោះរង្គើ។ដំណើរការនេះមិនប្រើទឹកទេ។
បន្ថែម 500 µl នៃដំណោះស្រាយមេតាណុល 1 M HCl ទៅសំណាក oligosaccharide និងបំពង់ TMS ស្តង់ដារ។គំរូត្រូវបាន incubated មួយយប់ (168 ម៉ោង) នៅ 80 ° C. នៅក្នុងប្លុកកម្ដៅមួយ។សម្ងួតផលិតផលមេតាណូលីសនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ដោយប្រើម៉ាស៊ីនសម្ងួត។បន្ថែម 200 μl MeOH ហើយស្ងួតម្តងទៀត។ដំណើរការនេះត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដង។បន្ថែម 200 µl នៃ methanol, 100 µl នៃ pyridine និង 100 µl នៃ acetic anhydride ទៅសំណាកហើយលាយផងដែរ។គំរូត្រូវបាន incubated នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់សម្រាប់ 30 នាទី។និងស្ងួត។បន្ថែមមេតាណុល 200 μl ហើយស្ងួតម្តងទៀត។
បន្ថែម 200 μlនៃ Tri-Sil និងបំពង់កំដៅរយៈពេល 20 នាទី។80 ° C បន្ទាប់មកត្រជាក់ទៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ប្រើឧបករណ៍សម្ងួត ដើម្បីសម្ងួតសំណាកបន្ថែមទៀតដល់បរិមាណប្រហែល 50 μl។វាជាការសំខាន់ក្នុងការកត់សម្គាល់ថាយើងមិនបានអនុញ្ញាតឱ្យសំណាកស្ងួតទាំងស្រុងនោះទេ។
បន្ថែម 2 មីលីលីត្រនៃ hexane និងលាយឱ្យបានល្អដោយ vortexing ។បំពេញគន្លឹះនៃបំពង់ប៉ាស្ទ័រ (5-8 មម) ជាមួយនឹងបំណែកនៃរោមចៀមកញ្ចក់ដោយបញ្ចូលរោមចៀមកញ្ចក់នៅលើកំពូលនៃបំពង់អង្កត់ផ្ចិត 5-3/4 អ៊ីញ។សំណាក​ត្រូវ​បាន​ផ្ចិត​នៅ​កម្រិត 3000 ក្រាម​រយៈពេល 2 នាទី។សំណល់មិនរលាយណាមួយត្រូវបានទឹកភ្លៀង។សម្ងួតសំណាកទៅ 100-150 μl។បរិមាណប្រហែល 1 μlត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុង GC-MS នៅសីតុណ្ហភាពដំបូង 80 ° C និងពេលវេលាដំបូង 2.0 នាទី (តារាង 2) ។