សូមអរគុណសម្រាប់ការចូលមើលគេហទំព័រ Nature.com។ កំណែកម្មវិធីរុករកដែលអ្នកកំពុងប្រើមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។ ដើម្បីទទួលបានបទពិសោធន៍ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកដែលបានធ្វើបច្ចុប្បន្នភាព (ឬបិទរបៀបឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ ទន្ទឹមនឹងនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
វិធីសាស្ត្រ​ភាពស៊ាំ និង​ម៉ាស​ស្ពិចត្រូម៉ែត្រ​ថ្មី​សម្រាប់​ការវិភាគ​ស្មុគស្មាញ​នៃ​អូលីហ្គោសាក់ការីត​ដែល​មាន​រយៈពេល​យូរ​នៅក្នុង​ដើម​ពោត​ដែល​បាន​ព្យាបាល​ជាមុន​ជាមួយ AFEX។ ជីវម៉ាស​លីណូសែលុយឡូស​គឺជា​ជម្រើស​ប្រកបដោយ​និរន្តរភាព​ជំនួស​ឲ្យ​ឥន្ធនៈ​ហ្វូស៊ីល ហើយ​ត្រូវបាន​ប្រើប្រាស់​យ៉ាង​ទូលំទូលាយ​ដើម្បី​អភិវឌ្ឍ​បច្ចេកវិទ្យា​ជីវសាស្ត្រ​សម្រាប់​ការផលិត​ផលិតផល​ដូចជា​អាហារ ចំណី​សត្វ ឥន្ធនៈ និង​សារធាតុគីមី។ គន្លឹះ​នៃ​បច្ចេកវិទ្យា​ទាំងនេះ​គឺ​ការអភិវឌ្ឍ​ដំណើរការ​ដែលមាន​ការប្រកួតប្រជែង​ផ្នែក​ថ្លៃដើម​សម្រាប់​បំលែង​កាបូអ៊ីដ្រាត​ស្មុគស្មាញ​ដែល​មាន​នៅក្នុង​ជញ្ជាំង​កោសិកា​រុក្ខជាតិ​ទៅជា​ស្ករ​សាមញ្ញ​ដូចជា​គ្លុយកូស ស៊ីឡូស និង​អារ៉ាប៊ីណូស។ ដោយសារតែ​ជីវម៉ាស​លីណូសែលុយឡូស​មាន​ភាពរឹងរូស​ខ្លាំង វា​ត្រូវតែ​ទទួលរង​នូវ​ការព្យាបាលដោយ​កម្ដៅ (ឧទាហរណ៍ ការបក​ស្បែក​សរសៃ​អាម៉ូញាក់ (AFEX) អាស៊ីត​ពនលាយ (DA) សារធាតុរាវ​អ៊ីយ៉ុង (IL)) និង​ការព្យាបាល​ជីវសាស្ត្រ (ឧទាហរណ៍ ការ​រំលាយ​អង់ស៊ីម និង​ការ​រំលាយ​មីក្រូសរីរាង្គ) រួម​គ្នា​ដើម្បី​ទទួលបាន​ផលិតផល​ដែល​ចង់បាន។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅពេលដែល​អង់ស៊ីម​ផ្សិត​ពាណិជ្ជកម្ម​ត្រូវបាន​ប្រើប្រាស់​ក្នុង​ដំណើរការ​រំលាយ មានតែ 75-85% នៃ​ស្ករ​រលាយ​ដែល​បាន​បង្កើតឡើង​គឺជា​ម៉ូណូសាក់ការីត ហើយ 15-25% ដែលនៅសល់​គឺជា​អូលីហ្គោសាក់ការីត​រលាយ​ដែល​មិនអាច​ដោះស្រាយ​បាន ដែល​មិន​តែងតែ​មាន​សម្រាប់​មីក្រូសរីរាង្គ​នោះទេ។ ពីមុន យើងបានញែក និងបន្សុទ្ធអូលីហ្គោសាក់ការីតរឹងរូសរលាយដោយជោគជ័យ ដោយប្រើការរួមបញ្ចូលគ្នានៃការបំបែកកាបូន និងដីឌីអាតូម និងក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីដោយមិនរាប់បញ្ចូលទំហំ ហើយក៏បានស៊ើបអង្កេតលក្ខណៈសម្បត្តិរារាំងអង់ស៊ីមរបស់វាផងដែរ។ យើងបានរកឃើញថា អូលីហ្គោសាក់ការីតដែលមានកម្រិតខ្ពស់នៃការប៉ូលីមែររីសាស្យុង (DP) ដែលមានមេទីលក្នុងការជំនួសអាស៊ីតអ៊ុយរិច ពិបាកដំណើរការជាងជាមួយនឹងល្បាយអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មជាងអូលីហ្គោសាក់ការីត DP ទាប និងអព្យាក្រឹត។ នៅទីនេះ យើងរាយការណ៍ពីការប្រើប្រាស់វិធីសាស្រ្តបន្ថែមជាច្រើន រួមទាំងការវិភាគគ្លីកានដោយប្រើអង្គបដិប្រាណម៉ូណូក្លូណាល (mAbs) ជាក់លាក់ចំពោះគ្លីកានជីវម៉ាសរុក្ខជាតិ ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈចំណងគ្លីកាននៅក្នុងជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិ និងអ៊ីដ្រូលីសេតអង់ស៊ីម អ៊ីយ៉ូនីសបំលែងដោយឡាស៊ែរជំនួយម៉ាទ្រីស ម៉ាស្ទ្រីតម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រីពេលវេលាហោះហើរ (MALDI-TOF-MS) ប្រើកំពូលរោគវិនិច្ឆ័យដែលមានព័ត៌មានរចនាសម្ព័ន្ធ ដែលទទួលបានដោយស្ពិចត្រូស្កូបបន្ទាប់ពីការរលួយបន្ទាប់បន្សំនៃអ៊ីយ៉ុងអវិជ្ជមាន ក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីឧស្ម័ន និងម៉ាស្ទ្រីតម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រី (GC-MS) ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈចំណងអូលីហ្គោសាក់ការីតជាមួយ និងដោយគ្មានដេរីវ៉ាទីស។ ដោយសារតែទំហំតូចនៃអូលីហ្គោសាក់ការីត (DP 4–20) ម៉ូលេគុលទាំងនេះពិបាកប្រើសម្រាប់ការភ្ជាប់ និងកំណត់លក្ខណៈ mAb។ ដើម្បីជម្នះបញ្ហានេះ យើងបានអនុវត្តវិធីសាស្ត្រថ្មីមួយដែលធ្វើឲ្យអូលីហ្គោសាក់ការីតមិនអាចចល័តបាន ដែលមានមូលដ្ឋានលើការផ្សំជីវទីន ដែលបានដាក់ស្លាកសញ្ញាអូលីហ្គោសាក់ការីតរលាយក្នុងទឹកដែលមាន DP ទាបភាគច្រើននៅលើផ្ទៃមីក្រូផ្លាត ដែលបន្ទាប់មកត្រូវបានប្រើនៅក្នុងប្រព័ន្ធ mAb ដែលមានអត្រាលំហូរខ្ពស់សម្រាប់ការវិភាគចងភ្ជាប់ជាក់លាក់។ វិធីសាស្ត្រថ្មីនេះនឹងជួយសម្រួលដល់ការអភិវឌ្ឍនៃការវិភាគគ្លីកូមដែលមានអត្រាលំហូរខ្ពស់កម្រិតខ្ពស់នាពេលអនាគត ដែលអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីញែក និងកំណត់លក្ខណៈអូលីហ្គោសាក់ការីតដែលមាននៅក្នុងជីវសញ្ញាណសម្រាប់គោលបំណងវិនិច្ឆ័យ។
ជីវម៉ាសលីញ៉ូសែលុយឡូស ដែលផ្សំឡើងពីសម្ភារៈកសិកម្ម ព្រៃឈើ ស្មៅ និងឈើ គឺជាវត្ថុធាតុដើមដ៏មានសក្តានុពលសម្រាប់ការផលិតផលិតផលជីវសាស្រ្ត រួមទាំងអាហារ ចំណីសត្វ ឥន្ធនៈ និងសារធាតុគីមីផ្សំ ដើម្បីផលិតផលិតផលដែលមានតម្លៃខ្ពស់ជាងមុន1. កាបូអ៊ីដ្រាត (ដូចជាសែលុយឡូស និងអេមីសែលុយឡូស) ដែលមាននៅក្នុងជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិ ត្រូវបានរំលាយទៅជាម៉ូណូសាក់ការីត ដោយដំណើរការគីមី និងការបំលែងជីវសាស្រ្ត (ដូចជាការបំបែកដោយអង់ស៊ីម និងដំណើរការ fermentation មីក្រូសរីរាង្គ)។ ការព្យាបាលជាមុនទូទៅរួមមាន ការពង្រីកសរសៃអាម៉ូញាក់ (AFEX) អាស៊ីតពនឺ (DA) អង្គធាតុរាវអ៊ីយ៉ុង (IL) និងការផ្ទុះដោយចំហាយទឹក (SE) ដែលប្រើការរួមបញ្ចូលគ្នានៃសារធាតុគីមី និងកំដៅ ដើម្បីកាត់បន្ថយការផលិតលីញ៉ូសែលុយឡូស ដោយការបើកជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិ3,4. ភាពរឹងរូសនៃរូបធាតុ5. ការបំបែកដោយអង់ស៊ីមត្រូវបានអនុវត្តនៅបន្ទុករឹងខ្ពស់ ដោយប្រើអង់ស៊ីមដែលមានផ្ទុកកាបូអ៊ីដ្រាតសកម្មពាណិជ្ជកម្ម (CAZymes) និងដំណើរការ fermentation មីក្រូសរីរាង្គ ដោយប្រើដំបែ ឬបាក់តេរីប្តូរហ្សែន ដើម្បីផលិតឥន្ធនៈ និងសារធាតុគីមីដែលមានមូលដ្ឋានលើជីវសាស្រ្ត6.
សារធាតុ CAZymes នៅក្នុងអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មត្រូវបានផ្សំឡើងដោយល្បាយស្មុគស្មាញនៃអង់ស៊ីមដែលកាត់ចំណងកាបូអ៊ីដ្រាតស្មុគស្មាញ-ស្ករដោយសហការគ្នាដើម្បីបង្កើតជាម៉ូណូសាការីត 2,7។ ដូចដែលយើងបានរាយការណ៍ពីមុន បណ្តាញស្មុគស្មាញនៃប៉ូលីមែរអារ៉ូម៉ាទិចនៃលីងនីនជាមួយកាបូអ៊ីដ្រាតធ្វើឱ្យវាពិបាកដោះស្រាយខ្ពស់ ដែលនាំឱ្យមានការបំលែងជាតិស្ករមិនពេញលេញ ដោយប្រមូលផ្តុំ 15-25% នៃអូលីហ្គោសាការីតភេទដែលមិនត្រូវបានផលិតក្នុងអំឡុងពេលអ៊ីដ្រូលីសអង់ស៊ីមនៃជីវម៉ាសដែលបានព្យាបាលជាមុន។ នេះគឺជាបញ្ហាទូទៅជាមួយនឹងវិធីសាស្រ្តព្យាបាលជាមុននៃជីវម៉ាសផ្សេងៗ។ ហេតុផលមួយចំនួនសម្រាប់ចំណុចកកស្ទះនេះរួមមានការរារាំងអង់ស៊ីមក្នុងអំឡុងពេលអ៊ីដ្រូលីស ឬអវត្តមាន ឬកម្រិតទាបនៃអង់ស៊ីមសំខាន់ៗដែលត្រូវការដើម្បីបំបែកចំណងស្ករនៅក្នុងជីវម៉ាសរុក្ខជាតិ។ ការយល់ដឹងអំពីសមាសភាព និងលក្ខណៈរចនាសម្ព័ន្ធនៃជាតិស្ករ ដូចជាចំណងស្ករនៅក្នុងអូលីហ្គោសាការីត នឹងជួយយើងឱ្យប្រសើរឡើងនូវការបំលែងជាតិស្ករក្នុងអំឡុងពេលអ៊ីដ្រូលីស ដែលធ្វើឱ្យដំណើរការជីវបច្ចេកវិទ្យាមានតម្លៃសមរម្យជាមួយនឹងផលិតផលដែលមានប្រភពមកពីប្រេងកាត។
ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធនៃកាបូអ៊ីដ្រាតគឺជាបញ្ហាប្រឈម ហើយតម្រូវឱ្យមានការរួមបញ្ចូលគ្នានៃវិធីសាស្រ្តដូចជា ក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីរាវ (LC)11,12 វិសាលគមអនុភាពម៉ាញេទិកនុយក្លេអ៊ែរ (NMR)13 អេឡិចត្រូផូរីស៊ីសកាពីឡា (CE)14,15,16 និងម៉ាស្សស្ពិចត្រូម៉ែត្រី (MS)17។ ដប់ប្រាំបី។ វិធីសាស្រ្ត MS ដូចជាម៉ាស្សស្ពិចត្រូម៉ែត្រីពេលវេលាហោះហើរជាមួយនឹងការបញ្ចេញឡាស៊ែរ និងអ៊ីយ៉ូដដោយប្រើម៉ាទ្រីស (MALDI-TOF-MS) គឺជាវិធីសាស្រ្តដែលអាចប្រើប្រាស់បានច្រើនយ៉ាងសម្រាប់កំណត់អត្តសញ្ញាណរចនាសម្ព័ន្ធកាបូអ៊ីដ្រាត។ ថ្មីៗនេះ MS tandem Dissociation ដែលបង្កឡើងដោយការប៉ះទង្គិច (CID) នៃសារធាតុបន្ថែមអ៊ីយ៉ុងសូដ្យូមត្រូវបានគេប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយបំផុតដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណស្នាមម្រាមដៃដែលត្រូវគ្នាទៅនឹងទីតាំងភ្ជាប់អូលីហ្គោសាក់ការីត ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធអាណូមឺរ លំដាប់ និងទីតាំងមែកធាង 20, 21។
ការវិភាគគ្លីកាន គឺជាឧបករណ៍ដ៏ល្អមួយសម្រាប់ការកំណត់អត្តសញ្ញាណស៊ីជម្រៅនៃចំណងកាបូអ៊ីដ្រាត22។ វិធីសាស្ត្រនេះប្រើអង្គបដិប្រាណម៉ូណូក្លូណាល់ (mAbs) ដែលដឹកនាំទៅកាន់ជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិគ្លីកានជាការស៊ើបអង្កេតដើម្បីយល់ពីតំណភ្ជាប់កាបូអ៊ីដ្រាតស្មុគស្មាញ។ មាន mAbs ជាង 250 នៅទូទាំងពិភពលោក ដែលត្រូវបានរចនាឡើងប្រឆាំងនឹងអូលីហ្គោសាក់ការីតលីនេអ៊ែរ និងមែកឈើផ្សេងៗដោយប្រើសាក់ការីតផ្សេងៗ24។ mAbs ជាច្រើនត្រូវបានគេប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយដើម្បីកំណត់លក្ខណៈរចនាសម្ព័ន្ធ សមាសភាព និងការកែប្រែនៃជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិ ព្រោះមានភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់អាស្រ័យលើប្រភេទកោសិការុក្ខជាតិ សរីរាង្គ អាយុ ដំណាក់កាលអភិវឌ្ឍន៍ និងបរិស្ថានលូតលាស់25,26។ ថ្មីៗនេះ វិធីសាស្ត្រនេះត្រូវបានគេប្រើដើម្បីយល់ពីចំនួនប្រជាជនវេស៊ីខលនៅក្នុងប្រព័ន្ធរុក្ខជាតិ និងសត្វ និងតួនាទីរៀងៗខ្លួនរបស់ពួកគេនៅក្នុងការដឹកជញ្ជូនគ្លីកាន ដូចដែលបានកំណត់ដោយសញ្ញាសម្គាល់រងកោសិកា ដំណាក់កាលអភិវឌ្ឍន៍ ឬការរំញោចបរិស្ថាន និងដើម្បីកំណត់សកម្មភាពអង់ស៊ីម។ រចនាសម្ព័ន្ធផ្សេងៗគ្នាមួយចំនួននៃគ្លីកាន និងស៊ីឡាន ដែលត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណរួមមាន ប៉ិចទីន (P), ស៊ីឡាន (X), ម៉ាន់ណាន (M), ស៊ីឡូគ្លុយកាន (XylG), គ្លុយកានចំណងចម្រុះ (MLG), អារ៉ាប៊ីណូស៊ីឡាន (ArbX), ហ្គាឡាក់តូម៉ាន់ណាន (GalG), អាស៊ីតគ្លូគូរ៉ូនិក-អារ៉ាប៊ីណូស៊ីឡាន (GArbX) និង អារ៉ាប៊ីណូ-ហ្គាឡាក់តាន (ArbG)29។
ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ បើទោះបីជាមានការខិតខំប្រឹងប្រែងស្រាវជ្រាវទាំងអស់នេះក៏ដោយ ក៏មានតែការសិក្សាមួយចំនួនតូចប៉ុណ្ណោះដែលផ្តោតលើលក្ខណៈនៃការប្រមូលផ្តុំអូលីហ្គោសាក់ការីតក្នុងអំឡុងពេលអ៊ីដ្រូលីសផ្ទុកសារធាតុរឹងខ្ពស់ (HSL) រួមទាំងការបញ្ចេញអូលីហ្គោសាក់ការីត ការផ្លាស់ប្តូរប្រវែងខ្សែសង្វាក់អូលីហ្គោមឺរក្នុងអំឡុងពេលអ៊ីដ្រូលីស ប៉ូលីមែរ DP ទាបជាច្រើន និងខ្សែកោងរបស់វា។ ការចែកចាយ 30,31,32។ ទន្ទឹមនឹងនេះ ទោះបីជាការវិភាគគ្លីកានបានបង្ហាញថាជាឧបករណ៍មានប្រយោជន៍សម្រាប់ការវិភាគដ៏ទូលំទូលាយនៃរចនាសម្ព័ន្ធគ្លីកានក៏ដោយ វាពិបាកក្នុងការវាយតម្លៃអូលីហ្គោសាក់ការីត DP ទាបដែលរលាយក្នុងទឹកដោយប្រើវិធីសាស្ត្រអង្គបដិប្រាណ។ អូលីហ្គោសាក់ការីត DP តូចជាងដែលមានទម្ងន់ម៉ូលេគុលតិចជាង 5-10 kDa មិនភ្ជាប់ទៅនឹងបន្ទះ ELISA 33, 34 ទេ ហើយត្រូវបានលាងសម្អាតចេញមុនពេលបន្ថែមអង្គបដិប្រាណ។
នៅទីនេះ ជាលើកដំបូង យើងបង្ហាញពីការវិភាគ ELISA លើបន្ទះដែលស្រោបដោយអាវីឌីន ដោយប្រើអង្គបដិប្រាណម៉ូណូក្លូណាល់ ដោយរួមបញ្ចូលគ្នានូវនីតិវិធីជីវទីនីលមួយជំហានសម្រាប់អូលីហ្គោសាក់ការីតធន់នឹងសារធាតុរលាយជាមួយនឹងការវិភាគគ្លីកូម។ វិធីសាស្រ្តរបស់យើងចំពោះការវិភាគគ្លីកូមត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយការវិភាគដោយផ្អែកលើ MALDI-TOF-MS និង GC-MS នៃតំណភ្ជាប់អូលីហ្គោសាក់ការីតបំពេញបន្ថែមដោយប្រើដេរីវ៉ាទីស trimethylsilyl (TMS) នៃសមាសធាតុស្ករ hydrolyzed។ វិធីសាស្រ្តប្រកបដោយភាពច្នៃប្រឌិតនេះអាចត្រូវបានបង្កើតឡើងជាវិធីសាស្រ្តដែលមានទិន្នផលខ្ពស់នាពេលអនាគត និងស្វែងរកការអនុវត្តកាន់តែទូលំទូលាយនៅក្នុងការស្រាវជ្រាវជីវវេជ្ជសាស្ត្រ35។
ការកែប្រែក្រោយការបកប្រែនៃអង់ស៊ីម និងអង្គបដិប្រាណ ដូចជា glycosylation36 ប៉ះពាល់ដល់សកម្មភាពជីវសាស្រ្តរបស់វា។ ឧទាហរណ៍ ការផ្លាស់ប្តូរ glycosylation នៃប្រូតេអ៊ីនសេរ៉ូមដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងជំងឺរលាកសន្លាក់ ហើយការផ្លាស់ប្តូរ glycosylation ត្រូវបានប្រើជាសញ្ញាសម្គាល់រោគវិនិច្ឆ័យ37។ គ្លីកានជាច្រើនត្រូវបានរាយការណ៍នៅក្នុងអក្សរសិល្ប៍ថាលេចឡើងយ៉ាងងាយស្រួលនៅក្នុងជំងឺជាច្រើនប្រភេទ រួមទាំងជំងឺរលាករ៉ាំរ៉ៃនៃបំពង់រំលាយអាហារ និងថ្លើម ការឆ្លងមេរោគ មហារីកអូវែរ សុដន់ និងក្រពេញប្រូស្តាត38,39,40។ ការយល់ដឹងអំពីរចនាសម្ព័ន្ធនៃគ្លីកានដោយប្រើវិធីសាស្ត្រ glycan ELISA ដែលមានមូលដ្ឋានលើអង្គបដិប្រាណនឹងផ្តល់នូវទំនុកចិត្តបន្ថែមក្នុងការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យជំងឺដោយមិនចាំបាច់ប្រើវិធីសាស្ត្រ MS ស្មុគស្មាញ។
ការសិក្សាពីមុនរបស់យើងបានបង្ហាញថា អូលីហ្គោសាក់ការីតរឹងរូសនៅតែមិនរលាយក្នុងទឹកបន្ទាប់ពីការព្យាបាលជាមុន និងការរំលាយដោយអង់ស៊ីម (រូបភាពទី 1)។ នៅក្នុងការងារដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយពីមុនរបស់យើង យើងបានបង្កើតវិធីសាស្ត្រទាញយកដំណាក់កាលរឹងរបស់ធ្យូងដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម ដើម្បីញែកអូលីហ្គោសាក់ការីតចេញពី AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8។ បន្ទាប់ពីការស្រង់ចេញ និងការបំបែកដំបូង អូលីហ្គោសាក់ការីតត្រូវបានបំបែកបន្ថែមទៀតដោយប្រើ size exclusion chromatography (SEC) ហើយប្រមូលតាមលំដាប់ទម្ងន់ម៉ូលេគុល។ ម៉ូណូម័រស្ករ និងអូលីហ្គោស្មែរដែលបញ្ចេញចេញពីការព្យាបាលជាមុនផ្សេងៗត្រូវបានវិភាគដោយការវិភាគសមាសភាពស្ករ។ នៅពេលប្រៀបធៀបមាតិកានៃអូលីហ្គោស្មែរស្ករដែលទទួលបានដោយវិធីសាស្ត្រព្យាបាលជាមុនផ្សេងៗ វត្តមាននៃអូលីហ្គោសាក់ការីតរឹងរូសគឺជាបញ្ហាទូទៅក្នុងការបំលែងជីវម៉ាសទៅជាម៉ូណូសាក់ការីត ហើយអាចនាំឱ្យមានការថយចុះទិន្នផលស្ករយ៉ាងហោចណាស់ 10-15% និងរហូតដល់ 18%។ សហរដ្ឋអាមេរិក។ វិធីសាស្ត្រនេះត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការផលិតប្រភាគអូលីហ្គោសាក់ការីតទ្រង់ទ្រាយធំបន្ថែមទៀត។ ACH លទ្ធផល និងប្រភាគជាបន្តបន្ទាប់របស់វាដែលមានទម្ងន់ម៉ូលេគុលខុសៗគ្នា ត្រូវបានប្រើជាសម្ភារៈពិសោធន៍សម្រាប់ការកំណត់លក្ខណៈនៃអូលីហ្គោសាក់ការីតនៅក្នុងការងារនេះ។
បន្ទាប់ពីការព្យាបាលជាមុន និងការរំលាយដោយអង់ស៊ីម អូលីហ្គោសាក់ការីតដែលនៅស្ថិតស្ថេរនៅតែមិនរំលាយដោយទឹកដដែល។ នៅទីនេះ (ក) គឺជាវិធីសាស្ត្របំបែកអូលីហ្គោសាក់ការីត ដែលអូលីហ្គោសាក់ការីតត្រូវបានញែកចេញពីសារធាតុរំលាយពោតដែលបានព្យាបាលជាមុន (ACSH) ដោយ AFEX ដោយប្រើធ្យូងដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម និងដីឌីអាតូមិចដែលខ្ចប់រួចជាស្រេច; (ខ) វិធីសាស្ត្រសម្រាប់បំបែកអូលីហ្គោសាក់ការីត។ អូលីហ្គោសាក់ការីតត្រូវបានបំបែកបន្ថែមទៀតដោយក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីដែលដកចេញទំហំ (SEC); (គ) ម៉ូណូម័រ និងអូលីហ្គោម័រសាក់ការីតដែលបញ្ចេញចេញពីការព្យាបាលជាមុនផ្សេងៗ (អាស៊ីតពនលាយ៖ DA សារធាតុរាវអ៊ីយ៉ុង៖ IL និង AFEX)។ លក្ខខណ្ឌ​នៃ​ការ​រំលាយ​ដោយ​អង់ស៊ីម៖ ការ​ផ្ទុក​សារធាតុ​រឹង​ខ្ពស់ 25% (w/w) (ប្រហែល 8% នៃ​ការ​ផ្ទុក​គ្លុយកូស) ការ​រំលាយ​ដោយ​អង់ស៊ីម 96 ម៉ោង ការ​ផ្ទុក​អង់ស៊ីម​ពាណិជ្ជកម្ម 20 mg/g (សមាមាត្រ Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) និង (D) ម៉ូណូម័រ​ស្ករ និង​អូលីហ្គោម័រ​នៃ​គ្លុយកូស ស៊ីឡូស និង​អារ៉ាប៊ីណូស​ដែល​បញ្ចេញ​ចេញពី​ដើម​ពោត​ដែល​បាន​ព្យាបាល​ជាមុន (ACS) របស់ AFEX។
ការវិភាគគ្លីកានបានបង្ហាញថាជាឧបករណ៍មានប្រយោជន៍សម្រាប់ការវិភាគរចនាសម្ព័ន្ធដ៏ទូលំទូលាយនៃគ្លីកាននៅក្នុងសារធាតុចម្រាញ់ដែលញែកចេញពីសំណល់ជីវម៉ាសរឹង។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សារធាតុសាក់ការីតរលាយក្នុងទឹកត្រូវបានតំណាងតិចតួចដោយប្រើវិធីសាស្ត្រប្រពៃណីនេះ 41 ពីព្រោះអូលីហ្គោសាក់ការីតទម្ងន់ម៉ូលេគុលទាបពិបាកក្នុងការធ្វើឱ្យអសកម្មនៅលើបន្ទះ ELISA ហើយត្រូវបានលាងសម្អាតមុនពេលបន្ថែមអង្គបដិប្រាណ។ ដូច្នេះ សម្រាប់ការចង និងកំណត់លក្ខណៈអង្គបដិប្រាណ វិធីសាស្ត្រជីវទីនីឡាស្យុងមួយជំហានត្រូវបានប្រើដើម្បីស្រោបអូលីហ្គោសាក់ការីតរលាយដែលមិនអនុលោមតាមលើបន្ទះ ELISA ដែលស្រោបដោយអាវីឌីន។ វិធីសាស្ត្រនេះត្រូវបានសាកល្បងដោយប្រើ ACSH ដែលផលិតពីមុនរបស់យើង និងប្រភាគដោយផ្អែកលើទម្ងន់ម៉ូលេគុលរបស់វា (ឬកម្រិតនៃប៉ូលីមែរ DP)។ ជីវទីនីឡាស្យុងមួយជំហានត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើនភាពស្និទ្ធស្នាលនៃការចងអូលីហ្គោសាក់ការីតដោយបន្ថែមប៊ីយ៉ូទីន-LC-អ៊ីដ្រាហ្សីតទៅចុងកាត់បន្ថយនៃកាបូអ៊ីដ្រាត (រូបភាពទី 2)។ នៅក្នុងដំណោះស្រាយ ក្រុមហេមីអាសេតាលនៅចុងកាត់បន្ថយមានប្រតិកម្មជាមួយក្រុមអ៊ីដ្រាហ្សីតនៃប៊ីយ៉ូទីន-LC-អ៊ីដ្រាហ្សីតដើម្បីបង្កើតជាចំណងអ៊ីដ្រាហ្សូន។ នៅក្នុងវត្តមាននៃសារធាតុកាត់បន្ថយ NaCNBH3 ចំណងអ៊ីដ្រាហ្សូនត្រូវបានកាត់បន្ថយទៅជាផលិតផលចុងក្រោយដែលមានស្ថេរភាពនៃជីវទីន។ ជាមួយនឹងការកែប្រែចុងកាត់បន្ថយជាតិស្ករ ការភ្ជាប់នៃអូលីហ្គោសាក់ការីត DP ទាបទៅនឹងបន្ទះ ELISA បានក្លាយជាអាចធ្វើទៅបាន ហើយនៅក្នុងការសិក្សារបស់យើង ការនេះត្រូវបានធ្វើឡើងលើបន្ទះស្រោបដោយអាវីឌីនដោយប្រើ mAbs ដែលកំណត់គោលដៅដោយគ្លីកាន។
ការត្រួតពិនិត្យអង្គបដិប្រាណម៉ូណូក្លូណាល់ដោយផ្អែកលើ ELISA សម្រាប់អូលីហ្គោសាក់ការីដែលមានជីវទីន។ នៅទីនេះ (ក) រួមបញ្ចូលគ្នានូវជីវទីននៃអូលីហ្គោសាក់ការី និងការត្រួតពិនិត្យ ELISA ជាបន្តបន្ទាប់ជាមួយ mAbs ដែលកំណត់គោលដៅគ្លីកាននៅលើចានស្រោបដោយ NeutrAvidin និង (ខ) បង្ហាញពីនីតិវិធីមួយជំហានសម្រាប់ជីវទីននៃផលិតផលប្រតិកម្ម។
បន្ទះ​ដែល​ស្រោប​ដោយ​អាវីឌីន​ជាមួយ​អង្គបដិប្រាណ​ដែល​ភ្ជាប់​អូលីហ្គោសាក់ការីត​ត្រូវ​បាន​បន្ថែម​ទៅ​អង្គបដិប្រាណ​បឋម និង​បន្ទាប់បន្សំ ហើយ​លាង​សម្អាត​ក្នុង​ឧបករណ៍​ផ្ទុក​ពន្លឺ និង​ពេលវេលា។ បន្ទាប់​ពី​ការ​ភ្ជាប់​អង្គបដិប្រាណ​ត្រូវ​បាន​បញ្ចប់ សូម​បន្ថែម​ស្រទាប់​ខាងក្រោម TMB ដើម្បី​ភ្ញាស់​បន្ទះ។ ប្រតិកម្ម​ត្រូវ​បាន​បញ្ឈប់​ជា​ស្ថាពរ​ជាមួយ​អាស៊ីត​ស៊ុលហ្វួរិក។ បន្ទះ​ដែល​ភ្ញាស់​ត្រូវ​បាន​វិភាគ​ដោយ​ប្រើ​ឧបករណ៍​អាន ELISA ដើម្បី​កំណត់​កម្លាំង​ភ្ញាស់​នៃ​អង្គបដិប្រាណ​នីមួយៗ ដើម្បី​រក​ឃើញ​ការ​ភ្ជាប់​ឆ្លង​ជាក់លាក់​នៃ​អង្គបដិប្រាណ។ សម្រាប់​ព័ត៌មាន​លម្អិត និង​ប៉ារ៉ាម៉ែត្រ​នៃ​ការ​ពិសោធន៍ សូម​មើល​ផ្នែក​ដែល​ត្រូវ​គ្នា "សម្ភារៈ និង​វិធីសាស្ត្រ"។
យើងបង្ហាញពីប្រយោជន៍នៃវិធីសាស្ត្រដែលទើបនឹងអភិវឌ្ឍថ្មីនេះសម្រាប់កម្មវិធីជាក់លាក់ដោយកំណត់លក្ខណៈអូលីហ្គោសាក់ការីតរលាយដែលមាននៅក្នុង ACSH ក៏ដូចជានៅក្នុងប្រភាគអូលីហ្គោសាក់ការីតឆៅ និងបរិសុទ្ធដែលញែកចេញពីអ៊ីដ្រូលីសេតលីញ៉ូសែលុយឡូស។ ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 3 ស៊ីឡានជំនួសអេពីតូបទូទៅបំផុតដែលត្រូវបានកំណត់នៅក្នុង ACSH ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រវិភាគគ្លីកូមជីវអាស៊ីឡាតជាធម្មតាគឺអ៊ុយរ៉ុនិច (U) ឬមេទីលអ៊ុយរ៉ុនិច (MeU) និងអារ៉ាប៊ីណូហ្គាឡាក់តង់ប៉ិចទិក។ ភាគច្រើននៃពួកវាក៏ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងការសិក្សាពីមុនរបស់យើងលើការវិភាគគ្លីកាននៃសារធាតុរឹងដែលមិនបានអ៊ីដ្រូលីស (UHS)43។
ការរកឃើញអេពីតូបអូលីហ្គោសាក់ការីតដែលច្របូកច្របល់ដោយប្រើអង្គបដិប្រាណម៉ូណូក្លូណាល់ដែលដឹកនាំទៅកាន់គ្លីកានជញ្ជាំងកោសិកា។ ប្រភាគ "អព្យាក្រឹត" គឺជាប្រភាគ ACN និងប្រភាគ "អាស៊ីត" គឺជាប្រភាគ FA។ ពណ៌ក្រហមភ្លឺជាងនៅលើផែនទីកំដៅបង្ហាញពីមាតិកាអេពីតូបខ្ពស់ ហើយពណ៌ខៀវភ្លឺជាងបង្ហាញពីផ្ទៃខាងក្រោយទទេ។ តម្លៃពណ៌នៅលើមាត្រដ្ឋានគឺផ្អែកលើតម្លៃ OD ឆៅសម្រាប់រូបមន្ត N=2។ អេពីតូបសំខាន់ៗដែលទទួលស្គាល់ដោយអង្គបដិប្រាណត្រូវបានបង្ហាញនៅខាងស្តាំ។
រចនាសម្ព័ន្ធមិនមែនសែលុយឡូសទាំងនេះមិនអាចត្រូវបានបំបែកដោយសែលុយឡូស និងអេមីសែលុយឡូសទូទៅបំផុតនៅក្នុងល្បាយអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មដែលបានសាកល្បង ដែលរួមមានអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មដែលប្រើជាទូទៅបំផុតនោះទេ។ ដូច្នេះ អង់ស៊ីមជំនួយថ្មីត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការបំបែករបស់វា។ បើគ្មានអង់ស៊ីមបន្ថែមមិនមែនសែលុយឡូសចាំបាច់ទេ ចំណងមិនមែនសែលុយឡូសទាំងនេះការពារការបំលែងទាំងស្រុងទៅជាម៉ូណូសាក់ការីត ទោះបីជាប៉ូលីមែរស្ករមេរបស់វាត្រូវបានបំបែកយ៉ាងទូលំទូលាយទៅជាបំណែកខ្លីៗ និងរំលាយដោយប្រើល្បាយអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មក៏ដោយ។
ការសិក្សាបន្ថែមអំពីការចែកចាយសញ្ញា និងកម្លាំងចងរបស់វាបានបង្ហាញថា អេពីតូបចងមានកម្រិតទាបជាងនៅក្នុងប្រភាគស្ករ DP ខ្ពស់ (A, B, C, DP រហូតដល់ 20+) ជាងនៅក្នុងប្រភាគ DP ទាប (D, E, F, DP) ក្នុងឌីមឺរ (រូបភាពទី 1)។ បំណែកអាស៊ីតមានច្រើននៅក្នុងអេពីតូបមិនមែនសែលុយឡូសជាងបំណែកអព្យាក្រឹត។ បាតុភូតទាំងនេះស្របនឹងគំរូដែលបានសង្កេតឃើញនៅក្នុងការសិក្សាមុនរបស់យើង ដែល DP ខ្ពស់ និងសមាសធាតុអាស៊ីតមានភាពធន់នឹងការបំបែកអង់ស៊ីម។ ដូច្នេះ វត្តមាននៃអេពីតូបគ្លីកានមិនមែនសែលុយឡូស និងការជំនួស U និង MeU អាចរួមចំណែកយ៉ាងខ្លាំងដល់ស្ថេរភាពនៃអូលីហ្គោសាក់ការីត។ គួរកត់សម្គាល់ថា ប្រសិទ្ធភាពចង និងការរកឃើញអាចជាបញ្ហាសម្រាប់អូលីហ្គោសាក់ការីត DP ទាប ជាពិសេសប្រសិនបើអេពីតូបគឺជាអូលីហ្គោសាក់ការីតឌីមឺរ ឬទ្រីមឺរ។ នេះអាចត្រូវបានសាកល្បងដោយប្រើអូលីហ្គោសាក់ការីតពាណិជ្ជកម្មដែលមានប្រវែងខុសៗគ្នា ដែលនីមួយៗមានអេពីតូបតែមួយដែលភ្ជាប់ទៅនឹង mAb ជាក់លាក់មួយ។
ដូច្នេះ ការប្រើប្រាស់អង្គបដិប្រាណជាក់លាក់តាមរចនាសម្ព័ន្ធបានបង្ហាញពីប្រភេទជាក់លាក់នៃចំណង recalcitrant ។ អាស្រ័យលើប្រភេទនៃអង្គបដិប្រាណដែលបានប្រើ លំនាំចងសមស្រប និងកម្លាំងនៃសញ្ញាដែលវាបង្កើត (ភាគច្រើន និងតិចបំផុត) អង់ស៊ីមថ្មីអាចត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងបន្ថែមពាក់កណ្តាលបរិមាណទៅក្នុងល្បាយអង់ស៊ីមសម្រាប់ការបំលែង glycoconversion កាន់តែពេញលេញ។ ដោយយកការវិភាគនៃ oligosaccharides ACSH ជាឧទាហរណ៍ យើងអាចបង្កើតមូលដ្ឋានទិន្នន័យនៃចំណង glycan សម្រាប់សម្ភារៈជីវម៉ាសនីមួយៗ។ គួរកត់សម្គាល់នៅទីនេះថា ទំនាក់ទំនងខុសគ្នានៃអង្គបដិប្រាណគួរតែត្រូវបានយកមកពិចារណា ហើយប្រសិនបើទំនាក់ទំនងរបស់ពួកគេមិនស្គាល់ នេះនឹងបង្កើតការលំបាកមួយចំនួននៅពេលប្រៀបធៀបសញ្ញានៃអង្គបដិប្រាណផ្សេងៗគ្នា។ លើសពីនេះ ការប្រៀបធៀបចំណង glycan អាចដំណើរការបានល្អបំផុតរវាងគំរូសម្រាប់អង្គបដិប្រាណដូចគ្នា។ ចំណងរឹងរូសទាំងនេះអាចត្រូវបានភ្ជាប់ទៅនឹងមូលដ្ឋានទិន្នន័យ CAZyme ដែលយើងអាចកំណត់អត្តសញ្ញាណអង់ស៊ីម ជ្រើសរើសអង់ស៊ីមបេក្ខជន និងសាកល្បងអង់ស៊ីមបំបែកចំណង ឬបង្កើតប្រព័ន្ធអតិសុខុមប្រាណដើម្បីបង្ហាញអង់ស៊ីមទាំងនេះសម្រាប់ប្រើប្រាស់ក្នុងរោងចក្រចម្រាញ់ជីវภาพ។
ដើម្បីវាយតម្លៃពីរបៀបដែលវិធីសាស្ត្រភាពស៊ាំបំពេញបន្ថែមវិធីសាស្ត្រជំនួសសម្រាប់កំណត់លក្ខណៈអូលីហ្គោសាក់ការីតទម្ងន់ម៉ូលេគុលទាបដែលមាននៅក្នុងអ៊ីដ្រូលីសេតលីញ៉ូសែលុយឡូស យើងបានអនុវត្តការវិភាគ MALDI (រូបភាពទី 4, S1-S8) និងការវិភាគសាក់ការីតដែលមានប្រភពមកពី TMS ដោយផ្អែកលើ GC-MS នៅលើបន្ទះដូចគ្នា (រូបភាពទី 5) នៃផ្នែកអូលីហ្គោសាក់ការីត។ MALDI ត្រូវបានប្រើដើម្បីប្រៀបធៀបថាតើការចែកចាយម៉ាស់នៃម៉ូលេគុលអូលីហ្គោសាក់ការីតត្រូវគ្នានឹងរចនាសម្ព័ន្ធដែលបានគ្រោងទុកឬអត់។ នៅលើរូបភាពទី 4 បង្ហាញ MC នៃសមាសធាតុអព្យាក្រឹត ACN-A និង ACN-B។ ការវិភាគ ACN-A បានបញ្ជាក់ពីជួរនៃជាតិស្ករ pentose ចាប់ពី DP 4–8 (រូបភាពទី 4) ដល់ DP 22 (រូបភាព S1) ដែលទម្ងន់របស់ពួកវាត្រូវគ្នាទៅនឹងអូលីហ្គោសាក់ការីត MeU-xylan។ ការវិភាគ ACN-B បានបញ្ជាក់ពីស៊េរី pentose និង glucoxylan ជាមួយ DP 8-15។ នៅក្នុងសម្ភារៈបន្ថែមដូចជារូបភាព S3 ផែនទីចែកចាយម៉ាស់សមាសធាតុអាស៊ីត FA-C បង្ហាញពីជួរនៃជាតិស្ករ pentose ជំនួស (Me)U ដែលមាន DP ពី 8-15 ដែលស្របនឹងស៊ីឡានជំនួសដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងការត្រួតពិនិត្យ mAb ដែលមានមូលដ្ឋានលើ ELISA។ អេពីតូបគឺស្របគ្នា។
វិសាលគម MALDI-MS នៃអូលីហ្គោសាក់ការីតរលាយដែលមិនអនុលោមតាមដែលមាននៅក្នុង ACS។ នៅទីនេះ (ក) ប្រភាគ ACN-A ជួរទម្ងន់ទាបដែលមានអាស៊ីតអ៊ុយរ៉ុកដែលមានមេទីល (DP 4-8) បានជំនួសអូលីហ្គោសាក់ការីតគ្លូគូរ៉ូស៊ីឡាន និង (ខ) អូលីហ្គោសាក់ការីតអាស៊ីតអ៊ុយរ៉ុកដែលមានមេទីល ACN-B ជំនួសដោយគ្លូគូរ៉ូស៊ីឡាន (DP 8-15)។
ការវិភាគសមាសភាពនៃសំណល់គ្លីកាននៃអូលីហ្គោសាក់ការីតធន់នឹងកម្ដៅ។ នៅទីនេះ (ក) សមាសធាតុសាក់ការីត TMS នៃប្រភាគអូលីហ្គោសាក់ការីតផ្សេងៗដែលទទួលបានដោយប្រើការវិភាគ GC-MS។ (ខ) រចនាសម្ព័ន្ធនៃជាតិស្ករដែលមានប្រភពមកពី TMS ផ្សេងៗដែលមាននៅក្នុងអូលីហ្គោសាក់ការីត។ ACN – ប្រភាគអាសេតូនីទ្រីលដែលមានអូលីហ្គោសាក់ការីតអព្យាក្រឹត និង FA – ប្រភាគអាស៊ីតហ្វេរូលិកដែលមានអូលីហ្គោសាក់ការីតអាស៊ីត។
ការសន្និដ្ឋានគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍មួយទៀតត្រូវបានទាញចេញពីការវិភាគ LC-MS នៃប្រភាគអូលីហ្គោសាក់ការីត ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាព S9 (វិធីសាស្រ្តអាចមើលឃើញនៅក្នុងសម្ភារៈបន្ថែមអេឡិចត្រូនិច)។ បំណែកនៃក្រុមហិចសូស និង -OAc ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញម្តងហើយម្តងទៀតក្នុងអំឡុងពេលចងប្រភាគ ACN-B។ ការរកឃើញនេះមិនត្រឹមតែបញ្ជាក់ពីបំណែកដែលសង្កេតឃើញនៅក្នុងការវិភាគគ្លីកូម និង MALDI-TOF ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងផ្តល់ព័ត៌មានថ្មីអំពីដេរីវេកាបូអ៊ីដ្រាតដែលមានសក្តានុពលនៅក្នុងជីវម៉ាសលីហ្គោសែលុយឡូសដែលបានព្យាបាលជាមុនផងដែរ។
យើងក៏បានវិភាគសមាសធាតុស្ករនៃប្រភាគអូលីហ្គោសាក់ការីតដោយប្រើដេរីវ៉ាទីសស្ករ TMS។ ដោយប្រើ GC-MS យើងបានកំណត់សមាសធាតុនៃជាតិស្ករសរសៃប្រសាទ (មិនមែនដេរីវ៉ាទីស) និងជាតិស្ករអាស៊ីត (GluA និង GalA) នៅក្នុងប្រភាគអូលីហ្គោសាក់ការីត (រូបភាពទី 5)។ អាស៊ីតគ្លូគូរូរ៉ូនិកត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងសមាសធាតុអាស៊ីត C និង D ខណៈពេលដែលអាស៊ីតហ្គាឡាក់ទូរ៉ូនិកត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងសមាសធាតុអាស៊ីត A និង B ដែលទាំងពីរនេះគឺជាសមាសធាតុ DP ខ្ពស់នៃជាតិស្ករអាស៊ីត។ លទ្ធផលទាំងនេះមិនត្រឹមតែបញ្ជាក់ពីទិន្នន័យ ELISA និង MALDI របស់យើងប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែវាក៏ស្របនឹងការសិក្សាពីមុនរបស់យើងអំពីការប្រមូលផ្តុំអូលីហ្គោសាក់ការីតផងដែរ។ ដូច្នេះ យើងជឿជាក់ថាវិធីសាស្រ្តភាពស៊ាំទំនើបដោយប្រើជីវទីនីលនៃអូលីហ្គោសាក់ការីត និងការត្រួតពិនិត្យ ELISA ជាបន្តបន្ទាប់គឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីរកឃើញអូលីហ្គោសាក់ការីតដែលរលាយក្នុងគំរូជីវសាស្រ្តផ្សេងៗ។
ដោយសារតែវិធីសាស្ត្រត្រួតពិនិត្យ mAb ដែលមានមូលដ្ឋានលើ ELISA ត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយវិធីសាស្ត្រផ្សេងៗគ្នាជាច្រើន យើងចង់ស្វែងយល់បន្ថែមអំពីសក្តានុពលនៃវិធីសាស្ត្របរិមាណថ្មីនេះ។ អូលីហ្គោសាក់ការីតពាណិជ្ជកម្មពីរគឺ xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) និង 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) ត្រូវបានទិញ និងសាកល្បងដោយប្រើវិធីសាស្ត្រ mAb ថ្មីដែលកំណត់គោលដៅលើជញ្ជាំងកោសិកា glycan។ រូបភាពទី 6 បង្ហាញពីទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែររវាងសញ្ញាភ្ជាប់ biotinylated និងកំហាប់ log នៃកំហាប់ oligosaccharide ដែលបង្ហាញពីគំរូ adsorption Langmuir ដែលអាចធ្វើទៅបាន។ ក្នុងចំណោម mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 និង CCRC-M151 មានទំនាក់ទំនងជាមួយ XHE ហើយ CCRC-M108, CCRC-M109 និង LM11 មានទំនាក់ទំនងជាមួយ A2XX លើជួរពី 1 nm ដល់ 100 nano។ ដោយសារតែភាពអាចរកបានមានកំណត់នៃអង្គបដិប្រាណក្នុងអំឡុងពេលពិសោធន៍ ការពិសោធន៍មានកំណត់ត្រូវបានអនុវត្តជាមួយនឹងកំហាប់អូលីហ្គោសាក់ការីតនីមួយៗ។ គួរកត់សម្គាល់នៅទីនេះថា អង្គបដិប្រាណមួយចំនួនមានប្រតិកម្មខុសគ្នាខ្លាំងចំពោះអូលីហ្គោសាក់ការីតដូចគ្នានឹងស្រទាប់ខាងក្រោម ប្រហែលជាដោយសារតែពួកវាភ្ជាប់ទៅនឹងអេពីតូបខុសគ្នាបន្តិចបន្តួច ហើយអាចមានសម្ព័ន្ធភាពចងខុសគ្នាខ្លាំង។ យន្តការ និងផលវិបាកនៃការកំណត់អត្តសញ្ញាណអេពីតូបត្រឹមត្រូវនឹងមានភាពស្មុគស្មាញជាងនៅពេលដែលវិធីសាស្រ្ត mAb ថ្មីត្រូវបានអនុវត្តចំពោះគំរូពិតប្រាកដ។
អូលីហ្គោសាក់ការីតពាណិជ្ជកម្មពីរត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់ជួរនៃការរកឃើញនៃ mAbs ដែលកំណត់គោលដៅគ្លីកានជាច្រើន។ នៅទីនេះ ទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែរជាមួយនឹងកំហាប់កំណត់ហេតុនៃកំហាប់អូលីហ្គោសាក់ការីតបង្ហាញពីគំរូស្រូបយក Langmuir សម្រាប់ (A) XHE ជាមួយ mAb និង (B) A2XX ជាមួយ mAb។ អេពីតូបដែលត្រូវគ្នាបង្ហាញពីរចនាសម្ព័ន្ធនៃអូលីហ្គោសាក់ការីតពាណិជ្ជកម្មដែលប្រើជាស្រទាប់ខាងក្រោមនៅក្នុងការវិភាគ។
ការប្រើប្រាស់អង្គបដិប្រាណម៉ូណូក្លូណាល់ដែលកំណត់គោលដៅដោយគ្លីកាន (ការវិភាគគ្លីកូមិក ឬការត្រួតពិនិត្យ mAb ដោយផ្អែកលើ ELISA) គឺជាឧបករណ៍ដ៏មានឥទ្ធិពលមួយសម្រាប់ការកំណត់លក្ខណៈស៊ីជម្រៅនៃគ្លីកានជញ្ជាំងកោសិកាសំខាន់ៗភាគច្រើនដែលបង្កើតជាជីវម៉ាសរុក្ខជាតិ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការវិភាគគ្លីកានបុរាណកំណត់លក្ខណៈតែគ្លីកានជញ្ជាំងកោសិកាធំៗប៉ុណ្ណោះ ព្រោះអូលីហ្គោសាក់ការីតភាគច្រើនមិនត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មនៅលើបន្ទះ ELISA ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពទេ។ នៅក្នុងការសិក្សានេះ ពោតដែលបានព្យាបាលជាមុនដោយ AFEX ត្រូវបានអ៊ីដ្រូលីសដោយអង់ស៊ីមនៅកម្រិតសារធាតុរឹងខ្ពស់។ ការវិភាគជាតិស្ករត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់សមាសភាពនៃកាបូអ៊ីដ្រាតជញ្ជាំងកោសិកាដែលមានលក្ខណៈមិនស្ថិតស្ថេរនៅក្នុងអ៊ីដ្រូលីហ្សាត។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការវិភាគ mAb នៃអូលីហ្គោសាក់ការីតតូចៗនៅក្នុងអ៊ីដ្រូលីសាតត្រូវបានប៉ាន់ស្មានមិនដល់ ហើយឧបករណ៍បន្ថែមគឺត្រូវការដើម្បីធ្វើឱ្យអូលីហ្គោសាក់ការីតមិនដំណើរការនៅលើបន្ទះ ELISA ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព។
យើងរាយការណ៍នៅទីនេះអំពីវិធីសាស្ត្រថ្មីមួយដែលមានប្រសិទ្ធភាព និងថ្មីសម្រាប់ការធ្វើអសកម្មអូលីហ្គោសាក់ការីតសម្រាប់ការត្រួតពិនិត្យ mAb ដោយការរួមបញ្ចូលគ្នារវាងជីវទីនីឡាស្យុងអូលីហ្គោសាក់ការីត និងការត្រួតពិនិត្យ ELISA លើបន្ទះស្រោបដោយ NeutrAvidin™។ អូលីហ្គោសាក់ការីតជីវទីនីឡាស្យុងដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យអសកម្មបានបង្ហាញពីភាពស្និទ្ធស្នាលគ្រប់គ្រាន់សម្រាប់អង្គបដិប្រាណដើម្បីឱ្យអាចរកឃើញអូលីហ្គោសាក់ការីតដែលច្របូកច្របល់បានយ៉ាងឆាប់រហ័ស និងមានប្រសិទ្ធភាព។ ការវិភាគសមាសភាពនៃអូលីហ្គោសាក់ការីតរឹងរូសទាំងនេះដោយផ្អែកលើម៉ាស្សស្ពិចត្រូម៉ែត្រីបានបញ្ជាក់ពីលទ្ធផលនៃវិធីសាស្រ្តថ្មីនេះចំពោះការត្រួតពិនិត្យភាពស៊ាំ។ ដូច្នេះ ការសិក្សាទាំងនេះបង្ហាញថាការរួមបញ្ចូលគ្នារវាងជីវទីនីឡាស្យុងអូលីហ្គោសាក់ការីត និងការត្រួតពិនិត្យ ELISA ជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណម៉ូណូក្លូណាលដែលកំណត់គោលដៅគ្លីកានអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីរកឃើញតំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់នៅក្នុងអូលីហ្គោសាក់ការីត និងអាចត្រូវបានអនុវត្តយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងការសិក្សាជីវគីមីផ្សេងទៀតដែលកំណត់លក្ខណៈរចនាសម្ព័ន្ធរបស់អូលីហ្គោសាក់ការីត។
វិធីសាស្ត្រ​វិភាគ​គ្លីកាន​ដែលមានមូលដ្ឋានលើ​ប៊ីយ៉ូទីន​នេះ គឺជារបាយការណ៍ដំបូងគេដែលមានសមត្ថភាពស៊ើបអង្កេតចំណងកាបូអ៊ីដ្រាត​ដែល​មិន​អាច​បត់បែន​បាន​នៃ​អូលីហ្គោសាក់ការីត​រលាយ​ក្នុង​ជីវម៉ាស​រុក្ខជាតិ។ នេះជួយឱ្យយល់ថាហេតុអ្វីបានជាផ្នែកខ្លះនៃជីវម៉ាសរឹងរូសខ្លាំងនៅពេលនិយាយអំពីការផលិតឥន្ធនៈជីវសាស្ត្រ។ វិធីសាស្ត្រនេះបំពេញចន្លោះប្រហោងដ៏សំខាន់មួយនៅក្នុងវិធីសាស្ត្រវិភាគគ្លីកូម និងពង្រីកការអនុវត្តរបស់វាទៅកាន់ស្រទាប់ខាងក្រោមជាច្រើនលើសពីអូលីហ្គោសាក់ការីតរុក្ខជាតិ។ នៅពេលអនាគត យើងអាចប្រើមនុស្សយន្តសម្រាប់ជីវទីនីល និងប្រើវិធីសាស្ត្រដែលយើងបានបង្កើតសម្រាប់ការវិភាគគំរូដែលមានទិន្នផលខ្ពស់ដោយប្រើ ELISA។
ចំបើងពោត (CS) ដែលដាំដុះពីគ្រាប់ពូជកូនកាត់ Pioneer 33A14 ត្រូវបានប្រមូលផលនៅឆ្នាំ 2010 ពីកសិដ្ឋាន Kramer ក្នុងទីក្រុង Ray រដ្ឋ Colorado។ ដោយមានការអនុញ្ញាតពីម្ចាស់ដី ជីវម៉ាសនេះអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការស្រាវជ្រាវ។ សំណាកត្រូវបានរក្សាទុកស្ងួត សំណើម < 6% ក្នុងថង់បិទជិត នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ សំណាកត្រូវបានរក្សាទុកស្ងួត សំណើម < 6% ក្នុងថង់បិទជិត នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. គំរូត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងសភាពស្ងួតនៅសំណើម <6% ក្នុងថង់ដែលមានស៊ីបនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中។样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. គំរូត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងថង់រ៉ូតនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ជាមួយសំណើម < 6%។ការសិក្សានេះបានអនុវត្តតាមគោលការណ៍ណែនាំក្នុងស្រុក និងជាតិ។ ការវិភាគសមាសធាតុត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើពិធីការ NREL។ សមាសធាតុនេះត្រូវបានគេរកឃើញថាមានផ្ទុក glucan 31.4%, xylan 18.7%, arabinan 3.3%, galactan 1.2%, acetyl 2.2%, lignin 14.3%, ប្រូតេអ៊ីន 1.7% និងផេះ 13.4%។
Cellic® CTec2 (ប្រូតេអ៊ីន 138 មីលីក្រាម/មីលីលីត្រ លេខកូដ VCNI 0001) គឺជាល្បាយស្មុគស្មាញនៃសែលុយឡូស β-glucosidase និង Cellic® HTec2 (ប្រូតេអ៊ីន 157 មីលីក្រាម/មីលីលីត្រ លេខកូដ VHN00001) ពី Novozymes (Franklinton, NC, USA)។ Multifect Pectinase® (ប្រូតេអ៊ីន 72 មីលីក្រាម/មីលីលីត្រ) ដែលជាល្បាយស្មុគស្មាញនៃអង់ស៊ីមបំបែក pectin ត្រូវបានបរិច្ចាគដោយ DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA)។ កំហាប់ប្រូតេអ៊ីនអង់ស៊ីមត្រូវបានកំណត់ដោយការប៉ាន់ប្រមាណមាតិកាប្រូតេអ៊ីន (និងដកការរួមចំណែកនៃអាសូតមិនមែនប្រូតេអ៊ីន) ដោយប្រើការវិភាគអាសូត Kjeldahl (វិធីសាស្ត្រ AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA)។ ដីឌីអាតូម 545 ត្រូវបានទិញពី EMD Millipore (Billerica, MA)។ កាបូនដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម (DARCO, គ្រាប់ 100 mesh), Avicel (PH-101), ស៊ីឡានប៊ីច និងសារធាតុគីមីផ្សេងទៀតទាំងអស់ត្រូវបានទិញពី Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)។
ការព្យាបាលជាមុនរបស់ AFEX ត្រូវបានអនុវត្តនៅ GLBRC (មន្ទីរពិសោធន៍ស្រាវជ្រាវការបំលែងជីវម៉ាស, MSU, Lansing, MI, សហរដ្ឋអាមេរិក)។ ការព្យាបាលជាមុនត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាព 140°C រយៈពេល 15 នាទី។ ពេលវេលាស្នាក់នៅ 46 នៅសមាមាត្រ 1:1 នៃអាម៉ូញាក់គ្មានជាតិទឹកទៅនឹងជីវម៉ាស នៅការផ្ទុក 60% (w/w) នៅក្នុងរ៉េអាក់ទ័របាច់ដែកអ៊ីណុក (ក្រុមហ៊ុន Parr Instruments)។ វាចំណាយពេល 30 នាទី។ រ៉េអាក់ទ័រត្រូវបាននាំទៅ 140°C ហើយអាម៉ូញាក់ត្រូវបានបញ្ចេញយ៉ាងឆាប់រហ័ស ដែលអនុញ្ញាតឱ្យជីវម៉ាសត្រឡប់ទៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់វិញយ៉ាងឆាប់រហ័ស។ សមាសធាតុនៃឡដុតពោតដែលបានព្យាបាលជាមុន (ACS) របស់ AFEX គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងឡដុតពោតដែលមិនបានព្យាបាល (UT-CS)។
សារធាតុរឹងខ្ពស់ ACSH 25% (w/w) (ប្រហែល 8% នៃការផ្ទុក dextran) ត្រូវបានរៀបចំជាវត្ថុធាតុដើមសម្រាប់ការផលិត oligosaccharides ទ្រង់ទ្រាយធំ។ ការបំបែកដោយអង់ស៊ីមនៃ ACS ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើល្បាយអង់ស៊ីមពាណិជ្ជកម្មរួមមាន Cellic® Ctec2 10 mg ប្រូតេអ៊ីន/g glucan (ក្នុងជីវម៉ាសដែលបានព្យាបាលជាមុន) Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC) 5 mg ប្រូតេអ៊ីន/g glucan និង Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA)។ ), 5 mg ប្រូតេអ៊ីន/g dextran។ ការបំបែកដោយអង់ស៊ីមត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុង bioreactor 5 លីត្រ ដែលមានបរិមាណធ្វើការ 3 លីត្រ pH 4.8, 50°C និង 250 rpm។ បន្ទាប់ពីការបំបែករយៈពេល 96 ម៉ោង សារធាតុ hydrolyzate ត្រូវបានប្រមូលដោយការ centrifugation ក្នុងល្បឿន 6000 rpm រយៈពេល 30 នាទី ហើយបន្ទាប់មកក្នុងល្បឿន 14000 rpm រយៈពេល 30 នាទី ដើម្បីយកសារធាតុរឹងដែលមិនទាន់បំបែកចេញ។ បន្ទាប់មក អ៊ីដ្រូលីហ្សាតត្រូវបានច្រោះមាប់មគតាមរយៈប៊ីកឺរតម្រងទំហំ 0.22 មីលីម៉ែត្រ។ អ៊ីដ្រូលីហ្សាតដែលច្រោះរួចត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងដបមាប់មគនៅសីតុណ្ហភាព 4°C ហើយបន្ទាប់មកបំបែកជាប្រភាគលើកាបូន។
ការវិភាគសមាសភាពនៃសំណាកជីវម៉ាសដែលមានមូលដ្ឋានលើសារធាតុចម្រាញ់ស្របតាមនីតិវិធីវិភាគមន្ទីរពិសោធន៍ NREL៖ ការរៀបចំសំណាកសម្រាប់ការវិភាគសមាសភាព (NREL/TP-510-42620) និងការកំណត់កាបូអ៊ីដ្រាតរចនាសម្ព័ន្ធ និងលីញីននៅក្នុងជីវម៉ាស (NREL/TP-510 – 42618)47។
ការវិភាគអូលីហ្គោសាក់ការីតនៃស្ទ្រីមអ៊ីដ្រូលីហ្សាតត្រូវបានអនុវត្តលើមាត្រដ្ឋាន 2 មីលីលីត្រ ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រអ៊ីដ្រូលីសាតអាស៊ីតដែលមានមូលដ្ឋានលើអូតូក្លេវ។ លាយគំរូអ៊ីដ្រូលីសាតជាមួយនឹងអាស៊ីតស៊ុលហ្វួរិក 72% ចំនួន 69.7 µl ក្នុងបំពង់វប្បធម៌ដែលមានគម្របវីស 10 មីលីលីត្រ ហើយភ្ញាស់រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅលើតុនៅសីតុណ្ហភាព 121°C ទុកឱ្យត្រជាក់លើទឹកកក រួចច្រោះចូលទៅក្នុងដបក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីរាវដំណើរការខ្ពស់ (HPLC)។ កំហាប់អូលីហ្គោសាក់ការីតត្រូវបានកំណត់ដោយការដកកំហាប់ម៉ូណូសាក់ការីតនៅក្នុងគំរូដែលមិនបានអ៊ីដ្រូលីសាតចេញពីកំហាប់ជាតិស្ករសរុបនៅក្នុងគំរូដែលអ៊ីដ្រូលីសាតដោយអាស៊ីត។
កំហាប់គ្លុយកូស ស៊ីឡូស និងអារ៉ាប៊ីណូសនៅក្នុងជីវម៉ាសដែលចម្រាញ់ចេញពីអាស៊ីតត្រូវបានវិភាគដោយប្រើប្រព័ន្ធ Shimadzu HPLC ដែលបំពាក់ដោយឧបករណ៍យកសំណាកដោយស្វ័យប្រវត្តិ ឧបករណ៍កម្តៅជួរឈរ ម៉ាស៊ីនបូមអ៊ីសូក្រាត និងឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាសន្ទស្សន៍ចំណាំងបែរនៅលើជួរឈរ Bio-Rad Aminex HPX-87H។ ជួរឈរត្រូវបានរក្សានៅសីតុណ្ហភាព 50°C ហើយត្រូវបានចម្រាញ់ជាមួយ 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ក្នុងលំហូរទឹក។
សារធាតុរាវ​ខាងលើ​ដែល​មាន​ជាតិ​អ៊ីដ្រូលីហ្សេត​ត្រូវ​បាន​ពនលាយ និង​វិភាគ​រក​មាតិកា​ម៉ូណូម័រ និង​អូលីហ្គោសាក់ការីត។ ស្ករ​ម៉ូណូម័រ​ដែល​ទទួល​បាន​បន្ទាប់​ពី​ការ​រំលាយ​ដោយ​អង់ស៊ីម​ត្រូវ​បាន​វិភាគ​ដោយ HPLC ដែល​បំពាក់​ដោយ​ជួរឈរ Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P និង​ជួរឈរ​ការពារ​ផេះ។ សីតុណ្ហភាព​ជួរឈរ​ត្រូវ​បាន​រក្សា​នៅ​សីតុណ្ហភាព 80°C ទឹក​ត្រូវ​បាន​ប្រើ​ជា​ដំណាក់កាល​ចល័ត​ដែល​មាន​អត្រា​លំហូរ 0.6 មីលីលីត្រ/នាទី។ អូលីហ្គោសាក់ការីត​ត្រូវ​បាន​កំណត់​ដោយ​ការ​រំលាយ​ក្នុង​អាស៊ីត​ពនលាយ​នៅ​សីតុណ្ហភាព 121°C យោង​តាម​វិធីសាស្ត្រ​ដែល​បាន​ពិពណ៌នា​នៅ​ក្នុង​ឯកសារ​យោង 41, 48, 49។
ការវិភាគសាការីតត្រូវបានអនុវត្តលើសំណល់ជីវម៉ាសឆៅ សំណល់ AFEX ដែលបានព្យាបាលជាមុន និងសំណល់ជីវម៉ាសទាំងអស់ដែលមិនបានចម្រាញ់ចេញពីទឹក (រួមទាំងការផលិតសារធាតុចម្រាញ់ជញ្ជាំងកោសិកាស៊េរី និងការត្រួតពិនិត្យ mAb របស់វា) ដោយប្រើនីតិវិធីដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 27, 43, 50, 51។ ចំពោះការវិភាគគ្លីកូម សំណល់ដែលមិនរលាយក្នុងអាល់កុលនៃសម្ភារៈជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិត្រូវបានរៀបចំពីសំណល់ជីវម៉ាស ហើយត្រូវបានទទួលរងនូវការស្រង់ចេញស៊េរីជាមួយនឹងសារធាតុប្រតិកម្មកាន់តែខ្លាំងឡើងដូចជាអាម៉ូញ៉ូមអុកស៊ីឡាត (50 mM) សូដ្យូមកាបូណាត (50 mM និង 0.5% w/v) CON. (1M និង 4M ទាំងពីរជាមួយសូដ្យូមបូរ៉ូអ៊ីដ្រីត 1% w/v) និងអាស៊ីតក្លរីតដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 52,53។ បន្ទាប់មកសារធាតុចម្រាញ់ត្រូវបានទទួលរងនូវ ELISA ប្រឆាំងនឹងបន្ទះស្មុគស្មាញនៃ mAb50s ដែលតម្រង់ទៅគ្លីកានជញ្ជាំងកោសិកា ហើយប្រតិកម្មភ្ជាប់ mAb ត្រូវបានបង្ហាញជាផែនទីកំដៅ។ mAbs ដែលកំណត់គោលដៅគ្លីកានជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិត្រូវបានទិញពីស្តុកមន្ទីរពិសោធន៍ (ស៊េរី CCRC, JIM និង MAC)។
ជីវទីនីឡាស្យុងមួយជំហាននៃអូលីហ្គោសាក់ការីត។ ការផ្សំកាបូអ៊ីដ្រាតជាមួយប៊ីយ៉ូទីន-LC-អ៊ីដ្រាហ្សីតត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើនីតិវិធីដូចខាងក្រោម។ ប៊ីយ៉ូទីន-LC-អ៊ីដ្រាហ្សីត (4.6 mg/12 μmol) ត្រូវបានរំលាយក្នុងឌីមេទីលស៊ុលហ្វុកស៊ីត (DMSO, 70 μl) ដោយការកូរខ្លាំងៗ និងកំដៅនៅសីតុណ្ហភាព 65°C រយៈពេល 1 នាទី។ អាស៊ីតអាសេទិកទឹកកក (30 µl) ត្រូវបានបន្ថែម ហើយល្បាយនេះត្រូវបានចាក់ទៅលើសូដ្យូមស៊ីយ៉ាណូបូរ៉ូអ៊ីដ្រីត (6.4 mg/100 µmol) ហើយរំលាយទាំងស្រុងបន្ទាប់ពីកំដៅនៅសីតុណ្ហភាព 65°C រយៈពេលប្រហែល 1 នាទី។ បន្ទាប់មក ល្បាយប្រតិកម្មពី 5 ទៅ 8 μl ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងអូលីហ្គោសាក់ការីតស្ងួត (1-100 nmol) ដើម្បីទទួលបានម៉ូលលើស 10 ដង ឬច្រើនជាងនេះនៃស្លាកលើចុងកាត់បន្ថយ។ ប្រតិកម្មត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាព 65°C រយៈពេល 2 ម៉ោង បន្ទាប់ពីនោះគំរូត្រូវបានបន្សុទ្ធភ្លាមៗ។ គ្មានសូដ្យូមស៊ីយ៉ាណូបូរ៉ូអ៊ីដ្រីតត្រូវបានប្រើនៅក្នុងការពិសោធន៍ដាក់ស្លាកដោយគ្មានការកាត់បន្ថយនោះទេ ហើយគំរូត្រូវបានប្រតិកម្មនៅសីតុណ្ហភាព 65°C រយៈពេល 2.5 ម៉ោង។
ការស្រោប ELISA និងការលាងសម្អាតគំរូអូលីហ្គោសាក់ការីដែលមានជីវទីន។ គំរូជីវទីនចំនួន 25 μl (100 μl នៃគំរូប្រមូលផ្តុំនីមួយៗដែលពនលាយក្នុង 5 ml នៃដំណោះស្រាយសតិបណ្ដោះអាសន្ន Tris 0.1 M (TBS)) ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗនៃបន្ទះស្រោបដោយអាវីឌីន។ អណ្តូងត្រួតពិនិត្យត្រូវបានស្រោបដោយជីវទីនចំនួន 50 μl ក្នុងកំហាប់ 10 μg/ml ក្នុង 0.1 M TBS។ ទឹកដែលគ្មានអ៊ីយ៉ូដត្រូវបានប្រើជាថ្នាំកូតសម្រាប់ការវាស់វែងទទេ។ ថេប្លេតត្រូវបានភ្ញាស់រយៈពេល 2 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងទីងងឹត។ លាងសម្អាតបន្ទះចំនួន 3 ដងជាមួយទឹកដោះគោដែលមានជាតិខ្លាញ់ 0.1% ក្នុង 0.1 M TBS ដោយប្រើកម្មវិធីលេខ 11 សម្រាប់ Grenier flat 3A។
ការបន្ថែម និងការលាងសម្អាតអង្គបដិប្រាណបឋម។ បន្ថែមអង្គបដិប្រាណបឋម ៤០ µl ទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗ។ ភ្ញាស់មីក្រូផ្លាតរយៈពេល ១ ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងទីងងឹត។ បន្ទាប់មក ផ្លាតត្រូវបានលាងសម្អាតចំនួន ៣ ដងជាមួយទឹកដោះគោ ០.១% ក្នុង TBS ០.១M ដោយប្រើកម្មវិធីលាងសម្អាតលេខ ១១ សម្រាប់ Grenier Flat 3A។
បន្ថែមអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំ រួចលាងសម្អាត។ បន្ថែមអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំកណ្ដុរ/កណ្ដុរចំនួន 50 µl (ពនលាយ 1:5000 ក្នុងទឹកដោះគោ 0.1% ក្នុង TBS 0.1 M) ទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗ។ ភ្ញាស់មីក្រូផ្លាតរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងទីងងឹត។ បន្ទាប់មក មីក្រូផ្លាតត្រូវបានលាងសម្អាតចំនួន 5 ដងជាមួយទឹកដោះគោ 0.1% ក្នុង TBS 0.1 M ដោយប្រើកម្មវិធីលាងចាន Grenier Flat 5A #12។
ការបន្ថែមស្រទាប់ខាងក្រោម។ បន្ថែម 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ចំនួន 50 µl ទៅក្នុងស្រទាប់ខាងក្រោម (ដោយបន្ថែមសារធាតុ buffer ចំនួន 2 ដំណក់, TMB ចំនួន 3 ដំណក់, អ៊ីដ្រូសែន peroxide ចំនួន 2 ដំណក់ ទៅក្នុងទឹក deionized ចំនួន 15 មីលីលីត្រ)។ រៀបចំស្រទាប់ខាងក្រោម TMB និង vortex មុនពេលប្រើ)។ ភ្ញាស់មីក្រូផ្លាតនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 30 នាទី។ ក្នុងទីងងឹត។
បំពេញជំហាននេះ ហើយអានថេប្លេត។ បន្ថែមអាស៊ីតស៊ុលហ្វួរិក 1 N ចំនួន 50 µl ទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗ ហើយកត់ត្រាការស្រូបយកពី 450 ដល់ 655 nm ដោយប្រើឧបករណ៍អាន ELISA។
រៀបចំដំណោះស្រាយ 1 mg/ml នៃសារធាតុវិភាគទាំងនេះក្នុងទឹកដែលគ្មានអ៊ីយ៉ុង៖ arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (ស្តង់ដារខាងក្នុង)។ ស្តង់ដារពីរត្រូវបានរៀបចំដោយបន្ថែមដំណោះស្រាយស្ករ 1 mg/mL ដែលបង្ហាញក្នុងតារាងទី 1។ គំរូត្រូវបានកក និងស្ងួតនៅសីតុណ្ហភាព -80°C រហូតដល់ទឹកទាំងអស់ត្រូវបានយកចេញ (ជាធម្មតាប្រហែល 12-18 ម៉ោង)។
បន្ថែមសំណាកចំនួន 100–500 µg ទៅក្នុងបំពង់ដែលមានគម្របវីសនៅលើជញ្ជីងវិភាគ។ កត់ត្រាបរិមាណដែលបានបន្ថែម។ វាជាការល្អបំផុតក្នុងការរំលាយសំណាកក្នុងកំហាប់ជាក់លាក់នៃសារធាតុរំលាយ ហើយបន្ថែមវាទៅក្នុងបំពង់ជាបរិមាណរាវ។ ប្រើអ៊ីណូស៊ីតូល 1 មីលីក្រាម/មីលីលីត្រ ចំនួន 20 µl ជាស្តង់ដារខាងក្នុងសម្រាប់បំពង់សំណាកនីមួយៗ។ បរិមាណស្តង់ដារខាងក្នុងដែលបានបន្ថែមទៅក្នុងសំណាកត្រូវតែដូចគ្នានឹងបរិមាណស្តង់ដារខាងក្នុងដែលបានបន្ថែមទៅក្នុងបំពង់ស្តង់ដារ។
បន្ថែមមេតាណុលអាន់ហៃដ្រូស ៨ មីលីលីត្រទៅក្នុងដបដែលមានគម្របវីស។ បន្ទាប់មកបន្ថែមដំណោះស្រាយមេតាណុល HCl ៣ N ចំនួន ៤ មីលីលីត្រ បិទគម្រប និងអង្រួន។ ដំណើរការនេះមិនប្រើទឹក។
បន្ថែមដំណោះស្រាយមេតាណុល HCl 1 M ចំនួន 500 µl ទៅក្នុងគំរូអូលីហ្គោសាក់ការីត និងបំពង់ TMS ស្តង់ដារ។ គំរូត្រូវបានភ្ញាស់ពេញមួយយប់ (168 ម៉ោង) នៅសីតុណ្ហភាព 80°C ក្នុងប្លុកកម្ដៅ។ សម្ងួតផលិតផលមេតាណុលលីសនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ដោយប្រើម៉ាស៊ីនសម្ងួត។ បន្ថែម MeOH ចំនួន 200 µl ហើយសម្ងួតម្តងទៀត។ ដំណើរការនេះត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដង។ បន្ថែមមេតាណុលចំនួន 200 µl ពីរីឌីនចំនួន 100 µl និងអាសេទិកអាន់ហ៊ីដ្រីតចំនួន 100 µl ទៅក្នុងគំរូ ហើយលាយឱ្យសព្វ។ គំរូត្រូវបានភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 30 នាទី។ ហើយសម្ងួត។ បន្ថែមមេតាណុលចំនួន 200 µl ហើយសម្ងួតម្តងទៀត។
បន្ថែម Tri-Sil ចំនួន 200 µl រួចបិទគម្របឱ្យជិតរយៈពេល 20 នាទី។ ទុកក្នុងសីតុណ្ហភាព 80°C បន្ទាប់មកទុកឱ្យត្រជាក់ដល់សីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ប្រើម៉ាស៊ីនសម្ងួតដើម្បីសម្ងួតសំណាកបន្ថែមទៀតដល់បរិមាណប្រហែល 50 µl។ វាជាការសំខាន់ដែលត្រូវកត់សម្គាល់ថា យើងមិនបានអនុញ្ញាតឱ្យសំណាកស្ងួតទាំងស្រុងនោះទេ។
បន្ថែម​អ៊ិចសាន 2 មីលីលីត្រ ហើយ​លាយ​ឲ្យ​សព្វ​ដោយ​ការ​បង្វិល​ខ្យល់។ ចាក់​សរសៃ​កញ្ចក់​មួយ​ដុំ​ចូល​ចុង​បំពង់​ប៉ាស្ទ័រ (5-8 ម.ម) ដោយ​បញ្ចូល​សរសៃ​កញ្ចក់​នៅ​ពីលើ​បំពង់​ដែលមាន​អង្កត់ផ្ចិត 5-3/4 អ៊ីញ។ គំរូ​ត្រូវ​បាន​បង្វិល​ក្នុង​កម្លាំង 3000 ក្រាម​រយៈពេល 2 នាទី។ សំណល់​ដែល​មិន​រលាយ​ត្រូវ​បាន​ធ្លាក់។ សម្ងួត​គំរូ​ដល់ 100-150 µl។ បរិមាណ​ប្រហែល 1 μl ត្រូវ​បាន​ចាក់​ចូល​ទៅ​ក្នុង GC-MS នៅ​សីតុណ្ហភាព​ដំបូង 80°C និង​រយៈពេល​ដំបូង 2.0 នាទី (តារាងទី 2)។