Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
Új immunológiai és tömegspektrometriai módszerek perzisztens oligoszacharidok komplex elemzésére AFEX-szel előkezelt kukoricakeményítőben.A lignocellulóz biomassza a fosszilis tüzelőanyagok fenntartható alternatívája, és széles körben használják biotechnológiák fejlesztésére olyan termékek előállítására, mint például az élelmiszerek, takarmányok, üzemanyagok és vegyszerek.E technológiák kulcsa a költség-versenyképes eljárások kifejlesztése a növényi sejtfalban jelenlévő összetett szénhidrátok egyszerű cukrokká, például glükózzá, xilózzá és arabinózzá történő átalakítására.Mivel a lignocellulóz tartalmú biomassza nagyon makacs, termokémiai kezeléseknek (pl. ammóniaszál-hámlasztás (AFEX), híg savak (DA), ionos folyadékok (IL)) és biológiai kezeléseknek (pl. enzimes hidrolízis és mikrobiális fermentáció) együttesen kell alávetni a kívánt termék előállításához..Ha azonban kereskedelmi forgalomban lévő gomba enzimeket használnak a hidrolízis folyamatában, a képződött oldható cukroknak csak 75-85%-a monoszacharid, a fennmaradó 15-25%-a pedig oldható, nehezen kezelhető oligoszacharid, amely nem mindig elérhető a mikroorganizmusok számára.Korábban sikeresen izoláltunk és tisztítottunk oldható makacs oligoszacharidokat szén- és kovaföld elválasztási és méretkizárásos kromatográfia kombinációjával, és vizsgáltuk enzimgátló tulajdonságaikat is.Azt találtuk, hogy a magasabb polimerizációs fokú (DP) metilált uronsav szubsztitúciót tartalmazó oligoszacharidokat nehezebb feldolgozni a kereskedelemben kapható enzimkeverékekkel, mint az alacsony DP-tartalmú és semleges oligoszacharidokat.Itt számos további módszer alkalmazásáról számolunk be, beleértve a növényi biomassza glikánokra specifikus monoklonális antitestek (mAb-k) felhasználásával végzett glikán profilalkotást a növényi sejtfalak glikánkötéseinek és enzimatikus hidrolizátumok jellemzésére, a mátrix által segített lézeres deszorpciós ionizációt, a repülési idő tömegspektrometriáját..A MALDI-TOF-MS) a negatív ionok másodlagos bomlása után spektroszkópiával, gázkromatográfiával és tömegspektrometriával (GC-MS) kapott szerkezetinformatív diagnosztikai csúcsokat használ az oligoszacharid kötések jellemzésére derivatizálással és anélkül.Az oligoszacharidok kis mérete (DP 4–20) miatt ezek a molekulák nehezen használhatók mAb kötésére és jellemzésére.Ennek a problémának a leküzdésére egy új, biotinkonjugáción alapuló oligoszacharid immobilizációs módszert alkalmaztunk, amely sikeresen jelölte meg az alacsony DP-ben oldódó oligoszacharidok többségét a mikrolemez felületén, amelyet azután egy nagy áteresztőképességű mAb rendszerben használtunk specifikus ligálási analízishez.Ez az új módszer megkönnyíti a jövőben fejlettebb, nagy áteresztőképességű glikomás vizsgálatok kifejlesztését, amelyek felhasználhatók a biomarkerekben jelenlévő oligoszacharidok diagnosztikai célú izolálására és jellemzésére.
A mezőgazdasági, erdészeti, fű- és fás szárú anyagokból álló lignocellulóz biomassza potenciális alapanyag a bioalapú termékek előállításához, beleértve az élelmiszereket, takarmányokat, üzemanyagokat és vegyi prekurzorokat a magasabb értékű termékek előállításához1.A növényi sejtfalban jelenlévő szénhidrátok (például cellulóz és hemicellulóz) kémiai feldolgozás és biotranszformáció (például enzimatikus hidrolízis és mikrobiális fermentáció) útján monoszacharidokká depolimerizálódnak.A gyakori előkezelések közé tartozik az ammóniaszálas expanzió (AFEX), híg sav (DA), ionos folyadék (IL) és gőzrobbanás (SE), amelyek vegyszerek és hő kombinációjával csökkentik a lignocellulóz termelést a növényi sejtfalak felnyitásával3,4.az anyag makacssága, 5. Az enzimatikus hidrolízist nagy szilárdanyag-terhelés mellett, kereskedelmi forgalomban kapható aktív szénhidráttartalmú enzimek (CAZymes) és mikrobiális fermentáció segítségével hajtják végre, transzgenikus élesztőkkel vagy baktériumokkal bioalapú üzemanyagok és vegyszerek előállítására 6 .
A kereskedelmi enzimekben található CAZimek olyan komplex enzimkeverékből állnak, amely szinergikusan hasítja az összetett szénhidrát-cukor kötéseket, így monoszacharidokat képeznek2,7.Amint arról korábban beszámoltunk, a lignin és a szénhidrátok aromás polimereinek összetett hálózata rendkívül nehezen kezelhetővé teszi őket, ami nem teljes cukorkonverzióhoz vezet, felhalmozva a nemi oligoszacharidok 15-25%-át, amelyek nem keletkeznek az előkezelt biomassza enzimatikus hidrolízise során.Ez gyakori probléma a különböző biomassza előkezelési módszereknél.Ennek a szűk keresztmetszetnek néhány oka az enzimgátlás a hidrolízis során, vagy a növényi biomasszában lévő cukorkötések megszakításához szükséges esszenciális enzimek hiánya vagy alacsony szintje.A cukrok összetételének és szerkezeti jellemzőinek, például az oligoszacharidokban lévő cukorkötéseknek a megértése elősegíti a cukor átalakulásának javítását a hidrolízis során, így a biotechnológiai folyamatok költség-versenyképesek a kőolajból származó termékekkel.
A szénhidrátok szerkezetének meghatározása kihívást jelent, és olyan módszerek kombinációját igényli, mint a folyadékkromatográfia (LC)11,12, a mágneses magrezonancia spektroszkópia (NMR)13, a kapilláris elektroforézis (CE)14,15,16 és a tömegspektrometria (MS)17.,tizennyolc.Az MS módszerek, mint például a repülési idő tömegspektrometriája lézeres deszorpcióval és mátrixot használó ionizációval (MALDI-TOF-MS), sokoldalú módszer a szénhidrátszerkezetek azonosítására.A közelmúltban a nátriumion-adduktok ütközés-indukált disszociációs (CID) tandem MS-ét használják legszélesebb körben az oligoszacharid kapcsolódási pozícióknak, anomer konfigurációknak, szekvenciáknak és elágazási pozícióknak megfelelő ujjlenyomatok azonosítására20, 21.
A glikánelemzés kiváló eszköz a szénhidrátkötések mélyreható azonosítására22.Ez a módszer a növényi sejtfal glikánjaira irányított monoklonális antitesteket (mAb-ket) használ próbaként a komplex szénhidrát kötések megértéséhez.Világszerte több mint 250 mAb áll rendelkezésre, amelyeket különféle szacharidok felhasználásával különféle lineáris és elágazó láncú oligoszacharidok ellen terveztek24.Számos mAb-t széles körben alkalmaztak a növényi sejtfal szerkezetének, összetételének és módosításainak jellemzésére, mivel jelentős különbségek vannak a növényi sejttípustól, szervtől, életkortól, fejlődési szakasztól és növekedési környezettől függően25,26.A közelmúltban ezt a módszert használták a növényi és állati rendszerek vezikulapopulációinak és a glikántranszportban betöltött szerepének megértésére, amelyet szubcelluláris markerek, fejlődési szakaszok vagy környezeti ingerek határoznak meg, valamint az enzimatikus aktivitás meghatározására.Az azonosított glikánok és xilánok különböző szerkezetei közé tartozik a pektin (P), a xilán (X), a mannán (M), a xiloglukánok (XylG), a vegyes kötésű glükánok (MLG), az arabinoxilán (ArbX), a galaktomannán (GalG), a glükuronsav-arabinoxilán (GArb-G) és az arabinoxilán (GArbX)9.
Mindezen kutatási erőfeszítések ellenére azonban csak néhány tanulmány foglalkozott a nagy szilárdanyag-terhelés (HSL) hidrolízis során bekövetkező oligoszacharid-felhalmozódás természetével, beleértve az oligoszacharidok felszabadulását, az oligomer lánchosszúság változásait a hidrolízis során, a különböző alacsony DP polimereket és azok görbéit.eloszlások 30,31,32.Eközben, bár a glikánanalízis hasznos eszköznek bizonyult a glikánszerkezet átfogó elemzéséhez, nehéz a vízben oldódó, alacsony DP-tartalmú oligoszacharidokat antitestmódszerekkel értékelni.A kisebb, 5-10 kDa-nál kisebb molekulatömegű DP oligoszacharidok nem kötődnek a 33., 34. ELISA-lemezekhez, és az ellenanyag hozzáadása előtt lemossák őket.
Itt először mutatunk be egy ELISA vizsgálatot avidinnel bevont lemezeken, monoklonális antitesteket használva, kombinálva az oldható, tűzálló oligoszacharidok egylépéses biotinilezési eljárását glikóanalízissel.Glikóm-elemzési megközelítésünket a komplementer oligoszacharid kötések MALDI-TOF-MS és GC-MS alapú analízise igazolta hidrolizált cukorkészítmények trimetilszilil- (TMS) származékképzésével.Ez az innovatív megközelítés a jövőben nagy áteresztőképességű módszerként fejleszthető, és szélesebb körben alkalmazható az orvosbiológiai kutatásban35.
Az enzimek és antitestek poszttranszlációs módosulásai, mint például a glikoziláció36, befolyásolják biológiai aktivitásukat.Például a szérumfehérjék glikozilációjának változásai fontos szerepet játszanak a gyulladásos ízületi gyulladásban, és a glikoziláció változásait diagnosztikai markerekként használják37.Az irodalomban beszámoltak arról, hogy különféle glikánok könnyen megjelennek különféle betegségekben, beleértve a gyomor-bél traktus és a máj krónikus gyulladásos betegségeit, vírusfertőzéseket, petefészek-, emlő- és prosztatarákokat38,39,40.A glikánok szerkezetének megértése antitest-alapú glikán ELISA módszerekkel további magabiztosságot biztosít a betegségek diagnosztizálásában, összetett SM-módszerek alkalmazása nélkül.
Korábbi vizsgálatunk kimutatta, hogy a makacs oligoszacharidok hidrolizálatlanok maradtak az előkezelés és az enzimes hidrolízis után (1. ábra).Korábban publikált munkánkban aktív szén szilárdfázisú extrakciós módszert fejlesztettünk ki oligoszacharidok izolálására AFEX-el előkezelt kukoricaszárító hidrolizátumból (ACSH)8.A kezdeti extrakció és elválasztás után az oligoszacharidokat méretkizárásos kromatográfiával (SEC) tovább frakcionáltuk, és molekulatömeg szerint összegyűjtöttük.A különböző előkezelésekből felszabaduló cukormonomereket és oligomereket cukorösszetétel-analízissel elemeztük.A különféle előkezelési módszerekkel nyert cukoroligomerek tartalmának összehasonlításakor a makacs oligoszacharidok jelenléte gyakori probléma a biomassza monoszacharidokká történő átalakulásában, és a cukorhozam legalább 10-15%-os, de akár 18%-os csökkenéséhez is vezethet.MINKET.Ezt a módszert az oligoszacharid frakciók további nagyüzemi előállítására használják.A kapott ACH-t és az azt követő különböző molekulatömegű frakciókat kísérleti anyagként használtuk fel az oligoszacharidok jellemzésére ebben a munkában.
Az előkezelés és az enzimes hidrolízis után a perzisztens oligoszacharidok hidrolizálatlanok maradtak.Itt (A) egy oligoszacharid elválasztási módszert mutatunk be, amelyben az oligoszacharidokat AFEX-el előkezelt kukoricacsillapító hidrolizátumból (ACSH) izolálják aktív szénből és kovaföldből álló töltött ágy használatával;(B) Módszer oligoszacharidok elválasztására.Az oligoszacharidokat tovább választottuk méretkizárásos kromatográfiával (SEC);(C) Különféle előkezelésekből felszabaduló szacharid monomerek és oligomerek (hígított sav: DA, ionos folyadék: IL és AFEX).Enzimatikus hidrolízis körülményei: magas, 25 tömeg%-os szilárdanyag-tartalom (körülbelül 8 tömeg%-os glükántartalom), 96 órás hidrolízis, 20 mg/g kereskedelmi enzimterhelés (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 arány) és (D) Cukormonomerek és cukormonomerek és oligomerek (korrózált glükóz- és ararázból előfelszabadult AFX-glükóz-ACN-ból S).
A glükánanalízis hasznos eszköznek bizonyult a szilárd biomassza-maradványokból izolált kivonatokban található glikánok átfogó szerkezeti elemzéséhez.A vízoldható szacharidok azonban alulreprezentáltak ezzel a hagyományos módszerrel41, mivel a kis molekulatömegű oligoszacharidokat nehéz rögzíteni az ELISA lemezeken, és az antitest hozzáadása előtt kimosódnak.Ezért az antitestek megkötésére és jellemzésére egy egylépéses biotinilációs módszert alkalmaztak az oldható, nem kompatibilis oligoszacharidok bevonására avidinnel bevont ELISA lemezeken.Ezt a módszert a korábban előállított ACSH-val és annak molekulatömegén (vagy polimerizációs fokán, DP-n) alapuló frakcióval teszteltük.Egylépéses biotinilezést alkalmaztunk az oligoszacharid kötési affinitás növelésére biotin-LC-hidrazid hozzáadásával a szénhidrát redukáló végéhez (2. ábra).Az oldatban a redukáló végén lévő félacetálcsoport reakcióba lép a biotin-LC-hidrazid hidrazidcsoportjával, és hidrazonkötést hoz létre.A NaCNBH3 redukálószer jelenlétében a hidrazonkötés stabil biotinilezett végtermékké redukálódik.A cukorredukáló vég módosításával lehetővé vált az alacsony DP-s oligoszacharidok ELISA lemezekhez való kötődése, melyet vizsgálatunkban avidinnel bevont lemezeken hajtottunk végre glikán-célzott mAb-ek segítségével.
Monoklonális antitestek szűrése ELISA alapján biotinilált oligoszacharidokra.Itt (A) az oligoszacharidok kombinált biotinilezése és az azt követő ELISA-szűrés glikán-célzott mAb-ekkel NeutrAvidin-nel bevont lemezeken, és (B) a reakciótermékek biotinilezésének egylépéses eljárását mutatja be.
Ezután oligoszacharid-konjugált antitesteket tartalmazó avidinnel bevont lemezeket adtunk az elsődleges és másodlagos antitestekhez, és fény- és időérzékeny közegben mostuk.Miután az antitest kötődése befejeződött, adjon hozzá TMB szubsztrátot a lemez inkubálásához.A reakciót végül kénsavval leállítjuk.Az inkubált lemezeket ELISA-leolvasóval elemeztük, hogy meghatározzuk az egyes antitestek kötési erősségét az antitest-specifikus keresztkötések kimutatása érdekében.A kísérlet részleteit és paramétereit lásd a megfelelő „Anyagok és módszerek” részben.
Az ACSH-ban, valamint lignocellulóz hidrolizátumokból izolált nyers és tisztított oligoszacharid frakciókban jelenlévő oldható oligoszacharidok jellemzésével mutatjuk be ennek az újonnan kifejlesztett módszernek a specifikus alkalmazásokhoz való hasznosságát.Amint a 3. ábrán látható, az ACSH-ban bioacilezett glikómérték-vizsgálati módszerekkel azonosított leggyakoribb epitóppal helyettesített xilánok általában az uron (U) vagy metiluron (MeU) és pektin arabinogalaktánok.Legtöbbjüket a nem hidrolizált szilárd anyagok (UHS) glikánjainak elemzésével foglalkozó korábbi tanulmányunkban is megtaláltuk43.
Renitens oligoszacharid epitópok kimutatása sejtfalglikán elleni monoklonális antitesttel.A „semleges” frakció az ACN-frakció, a „savas” frakció pedig az FA-frakció.A hőtérkép világosabb vörösei magasabb epitóptartalmat, a világosabb kékek pedig üres hátteret jeleznek.A skála színértékei az N=2 készítmények nyers OD értékein alapulnak.Az antitestek által felismert fő epitópok a jobb oldalon láthatók.
Ezeket a nem cellulóz szerkezeteket a leggyakrabban használt cellulázok és hemicellulázok nem tudták hasítani a vizsgált kereskedelmi enzimkeverékben, amely a leggyakrabban használt kereskedelmi enzimeket tartalmazza.Ezért hidrolízisükhöz új segédenzimekre van szükség.A szükséges nem-cellulóz járulékos enzimek nélkül ezek a nem cellulóz kötések megakadályozzák a teljes átalakulást monoszacharidokká, még akkor is, ha a kiindulási cukor polimerjeit nagymértékben hidrolizálják rövidebb fragmensekre, és kereskedelmi enzimkeverékekkel feloldják.
A jeleloszlás és annak kötési erősségének további vizsgálata azt mutatta, hogy a kötődő epitópok alacsonyabbak voltak a magas DP cukorfrakciókban (A, B, C, DP 20+-ig), mint az alacsony DP frakciókban (D, E, F, DP) dimerekben) (1. ábra).A savas fragmentumok gyakrabban fordulnak elő a nem cellulóz epitópokban, mint a semleges fragmensekben.Ezek a jelenségek összhangban vannak az előző vizsgálatunkban megfigyelt mintázattal, ahol a magas DP és savas csoportok ellenállóbbak voltak az enzimatikus hidrolízissel szemben.Ezért a nem cellulóz glikán epitópok jelenléte, valamint az U és MeU szubsztitúciók nagyban hozzájárulhatnak az oligoszacharidok stabilitásához.Meg kell jegyezni, hogy a kötődés és a detektálás hatékonysága problémás lehet az alacsony DP oligoszacharidok esetében, különösen, ha az epitóp dimer vagy trimer oligoszacharid.Ezt különböző hosszúságú kereskedelmi oligoszacharidokkal lehet tesztelni, amelyek mindegyike csak egy epitópot tartalmaz, amely egy specifikus mAb-hez kötődik.
Így a szerkezet-specifikus antitestek alkalmazása bizonyos típusú ellenszegülő kötéseket tárt fel.A felhasznált antitest típusától, a megfelelő ligálási mintától és az általa termelt jel erősségétől (legtöbbször és legkevésbé előforduló) függően új enzimek azonosíthatók, és félkvantitatív módon hozzáadhatók az enzimkeverékhez a teljesebb glikokonverzió érdekében.Az ACSH oligoszacharidok elemzését példának vesszük, minden biomassza anyaghoz létrehozhatunk egy adatbázist a glikánkötésekről.Itt kell megjegyezni, hogy az antitestek eltérő affinitását figyelembe kell venni, és ha az affinitásuk ismeretlen, ez bizonyos nehézségeket okoz a különböző antitestek jeleinek összehasonlításakor.Ezenkívül a glikánkötések összehasonlítása működhet a legjobban ugyanazon antitest mintái között.Ezek a makacs kötések azután összekapcsolhatók a CAZyme adatbázissal, amelyből azonosíthatunk enzimeket, kiválaszthatjuk az enzimjelölteket és tesztelhetjük a kötésbontó enzimeket, vagy mikrobiális rendszereket fejleszthetünk ezen enzimek expresszálására biofinomítókban44.
Annak értékelésére, hogy az immunológiai módszerek hogyan egészítik ki az alternatív módszereket a lignocellulóz hidrolizátumokban jelenlévő kis molekulatömegű oligoszacharidok jellemzésére, elvégeztük a MALDI-t (4. ábra, S1-S8) és a TMS-eredetű szacharidok GC-MS alapján történő elemzését ugyanazon a panelen (5. ábra) oligoszacharid részen.A MALDI-t annak összehasonlítására használják, hogy az oligoszacharid molekulák tömegeloszlása ​​megfelel-e a tervezett szerkezetnek.ábrán.A 4. ábra az ACN-A és az ACN-B semleges komponensek MC-jét mutatja.Az ACN-A elemzés megerősítette a DP 4–8 (4. ábra) és a DP 22 (S1. ábra) közötti pentózcukrokat, amelyek tömege a MeU-xilán oligoszacharidoknak felel meg.Az ACN-B analízis megerősítette a pentóz és glükoxilán sorozatot a DP 8-15-tel.Az olyan kiegészítő anyagokban, mint az S3. ábra, az FA-C savas molekularész tömegeloszlási térképei a (Me)U szubsztituált pentóz cukrok tartományát mutatják 8-15 DP-vel, amelyek összhangban vannak az ELISA-alapú mAb-szűrés során talált helyettesített xilánokkal.Az epitópok konzisztensek.
Az ACS-ben jelenlévő oldható, nem megfelelő oligoszacharidok MALDI-MS spektruma.Itt (A) ACN-A alacsony tömegű frakciók, amelyek metilált uronsavval (DP 4-8) szubsztituált glükuroxilán oligoszacharidokat és (B) ACN-B xilánt és metilált uronsav oligoszacharidokat tartalmaznak glükuroxilánnal (DP 8-15).
A tűzálló oligoszacharidok glikánmaradékának összetételének elemzése.Itt (A) GC-MS analízissel nyert különböző oligoszacharid frakciók TMS szacharid összetétele.(B) Az oligoszacharidokban jelen lévő különböző TMS-eredetű cukrok szerkezete.ACN – semleges oligoszacharidokat tartalmazó acetonitrilfrakció és FA – savas oligoszacharidokat tartalmazó ferulsavfrakció.
Egy másik érdekes következtetést vontunk le az oligoszacharid frakció LC-MS analíziséből, amint az az S9 ábrán látható (a módszereket az elektronikus kiegészítő anyagban láthatjuk).Az ACN-B frakció ligálása során hexóz és -OAc csoportok fragmenseit ismételten megfigyeltük.Ez a megállapítás nemcsak megerősíti a glikóm és MALDI-TOF analízis során megfigyelt fragmentációt, hanem új információkkal szolgál az előkezelt lignocellulóz biomasszában előforduló lehetséges szénhidrát származékokról is.
Elemeztük az oligoszacharid frakció cukorösszetételét is TMS cukorszármazékosítással.GC-MS segítségével meghatároztuk a neurális (nem származékos) és savas cukrok (GluA és GalA) összetételét az oligoszacharid frakcióban (5. ábra).A glükuronsav a savas C és D komponensben, míg a galakturonsav a savas A és B komponensben található, amelyek mindkettő a savas cukrok magas DP komponensei.Ezek az eredmények nemcsak megerősítik ELISA és MALDI adatainkat, hanem összhangban vannak az oligoszacharid felhalmozódásra vonatkozó korábbi vizsgálatainkkal is.Ezért úgy gondoljuk, hogy az oligoszacharidok biotinilezését és az azt követő ELISA-szűrést alkalmazó korszerű immunológiai módszerek elegendőek az oldható, ellenszenves oligoszacharidok kimutatására különböző biológiai mintákban.
Mivel az ELISA-alapú mAb szűrési módszereket számos különböző módszerrel validálták, tovább kívántuk vizsgálni az új kvantitatív módszerben rejlő lehetőségeket.Két kereskedelmi oligoszacharidot, a xilohexaszacharid oligoszacharidot (XHE) és a 23-α-L-arabinofuranozil-xilotriózt (A2XX) vásároltuk meg, és teszteltük egy új mAb megközelítéssel, amely a sejtfal glikánját célozza meg.A 6. ábra lineáris korrelációt mutat be a biotinilált kötőszignál és az oligoszacharidkoncentráció logaritmikus koncentrációja között, ami egy lehetséges Langmuir-adszorpciós modellre utal.Az mAb-k közül a CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 és CCRC-M151 korrelált az XHE-vel, a CCRC-M108, CCRC-M109 és LM11 pedig 100 nanométeres tartományban korrelált az A2XX-szel.Az antitestek korlátozott elérhetősége miatt a kísérlet során minden oligoszacharid koncentrációval korlátozott kísérleteket végeztünk.Itt meg kell jegyezni, hogy egyes antitestek nagyon eltérően reagálnak ugyanarra az oligoszacharidra, mint szubsztrátra, feltehetően azért, mert kissé eltérő epitópokhoz kötődnek, és nagyon eltérő kötési affinitással rendelkezhetnek.A pontos epitóp azonosítás mechanizmusai és következményei sokkal összetettebbek lesznek, ha az új mAb megközelítést valódi mintákra alkalmazzák.
Két kereskedelmi forgalomban lévő oligoszacharidot használtunk a különböző glikán-célzó mAb-k kimutatási tartományának meghatározására.Itt az oligoszacharidkoncentráció logaritmikus koncentrációjával való lineáris korrelációk az (A) XHE és mAb (B) A2XX Langmuir adszorpciós mintázatait jelzik mAb-vel.A megfelelő epitópok jelzik a vizsgálatban szubsztrátként használt kereskedelmi oligoszacharidok szerkezetét.
A glikánra célzott monoklonális antitestek használata (glikokomikus elemzés vagy ELISA-alapú mAb-szűrés) hatékony eszköz a növényi biomasszát alkotó fő sejtfal-glikánok többségének mélyreható jellemzésére.A klasszikus glikánanalízis azonban csak a nagyobb sejtfal-glikánokat jellemzi, mivel a legtöbb oligoszacharid nincs hatékonyan immobilizálva ELISA lemezeken.Ebben a vizsgálatban az AFEX-el előkezelt kukoricakeményítőt enzimatikusan hidrolizáltuk magas szárazanyag-tartalom mellett.Cukoranalízissel határozták meg a hidrolizátumban lévő ellenszegült sejtfal-szénhidrátok összetételét.A hidrolizátumokban lévő kisebb oligoszacharidok mAb-elemzését azonban alábecsülik, és további eszközökre van szükség az oligoszacharidok ELISA-lemezeken történő hatékony rögzítéséhez.
Itt egy új és hatékony oligoszacharid immobilizálási módszert mutatunk be mAb-szűréshez, az oligoszacharid-biotiniláció, majd az ELISA-szűrés kombinálásával NeutrAvidin™ bevont lemezeken.Az immobilizált biotinilezett oligoszacharidok elegendő affinitást mutattak az ellenanyaghoz ahhoz, hogy lehetővé tegyék a visszautasító oligoszacharidok gyors és hatékony kimutatását.Ezen makacs oligoszacharidok összetételének tömegspektrometriás elemzése megerősítette az immunszűrés ezen új megközelítésének eredményeit.Így ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy az oligoszacharid biotiniláció és az ELISA szűrés glikán célzott monoklonális antitestekkel való kombinációja felhasználható oligoszacharidok keresztkötéseinek kimutatására, és széles körben alkalmazható más, az oligoszacharidok szerkezetét jellemző biokémiai vizsgálatokban.
Ez a biotin alapú glikán profilalkotási módszer az első olyan jelentés, amely képes megvizsgálni az oldható oligoszacharidok ellenszegülő szénhidrátkötéseit a növényi biomasszában.Ez segít megérteni, hogy a biomassza egyes részei miért olyan makacsok, amikor bioüzemanyag-előállításról van szó.Ez a módszer egy fontos hiányt pótol a glikomelemzési módszerekben, és a növényi oligoszacharidokon túl a szubsztrátok szélesebb körére is kiterjeszti alkalmazását.A jövőben a robotikát használhatjuk a biotinilezéshez, és az általunk kifejlesztett módszert a minták ELISA-val történő nagy áteresztőképességű elemzésére.
A Pioneer 33A14 hibrid magokból termesztett kukoricaszalmát (CS) 2010-ben betakarították a Colorado állambeli Ray állambeli Kramer Farms-tól.A földtulajdonos engedélyével ez a biomassza kutatásra felhasználható. A mintákat szárazon, < 6% nedvesség mellett, cipzáras tasakban, szobahőmérsékleten tároltuk. A mintákat szárazon, < 6% nedvesség mellett, cipzáras tasakban, szobahőmérsékleten tároltuk. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. A mintákat szárazon, <6% páratartalom mellett, cipzáras tasakban, szobahőmérsékleten tároltuk.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. A mintákat cipzáras tasakban, szobahőmérsékleten, 6% alatti páratartalom mellett tároljuk.A vizsgálat megfelelt a helyi és országos irányelveknek.Az összetételi elemzést az NREL protokoll segítségével végeztük.A készítmény 31,4% glükánt, 18,7% xilánt, 3,3% arabinánt, 1,2% galaktánt, 2,2% acetilt, 14,3% lignint, 1,7% fehérjét és 13,4% hamut tartalmaz.
A Cellic® CTec2 (138 mg fehérje/ml, VCNI 0001 tétel) celluláz, β-glükozidáz és Cellic® HTec2 (157 mg fehérje/ml, VHN00001 tétel) komplex keveréke a Novozymes-től (Franklinton, NC, USA)).A Multifect Pectinase®-t (72 mg fehérje/ml), a pektinbontó enzimek komplex keverékét a DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) adományozta.Az enzimfehérje-koncentrációkat a fehérjetartalom becslésével (és a nem fehérje nitrogén hozzájárulásának kivonásával) határoztuk meg Kjeldahl nitrogénanalízissel (AOAC módszer 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Az 545 diatómaföldet az EMD Millipore-tól (Billerica, MA) vásároltuk.Az aktív szenet (DARCO, 100 mesh szemcsék), az Avicelt (PH-101), a bükk-xilánt és az összes többi vegyszert a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO) vásároltuk.
Az AFEX előkezelést a GLBRC-ben (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) végeztük.Az előkezelést 140 °C-on 15 percig végeztük.46 tartózkodási idő 1:1 vízmentes ammónia/biomassza arány mellett 60%-os (w/w) töltés mellett rozsdamentes acél asztali szakaszos reaktorban (Parr Instruments Company).30 percig tartott.A reaktort 140 °C-ra melegítjük, és az ammóniát gyorsan felszabadítjuk, lehetővé téve, hogy a biomassza gyorsan visszatérjen szobahőmérsékletre.Az AFEX előkezelt kukoricakeverő (ACS) összetétele hasonló volt a kezeletlen kukorica tűzhelyéhez (UT-CS).
Az oligoszacharidok nagyüzemi előállításához kiindulási anyagként nagy szilárdanyag-tartalmú ACSH 25% (w/w) (körülbelül 8% dextrán töltés) állítottunk elő.Az ACS enzimatikus hidrolízisét kereskedelmi enzimkeverékkel végeztük, amely Cellic® Ctec2 10 mg fehérje/g glükánt (előkezelt biomasszában), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg fehérje/g glükán és Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) tartalmazott.).), 5 mg fehérje/g dextrán.Az enzimatikus hidrolízist 5 literes bioreaktorban hajtottuk végre, 3 liter munkatérfogattal, pH 4,8, 50 °C és 250 fordulat/perc.96 órás hidrolízis után a hidrolizátumot centrifugálással gyűjtöttük össze 6000 rpm-en 30 percig, majd 14 000 rpm-en 30 percig, hogy eltávolítsuk a nem hidrolizált szilárd anyagokat.A hidrolizátumot ezután steril szűrésnek vetjük alá egy 0,22 mm-es szűrőpoháron.A szűrt hidrolizátumot steril palackokban tároltuk 4 °C-on, majd szénnel frakcionáltuk.
Kivonat alapú biomassza minták összetételének elemzése NREL laboratóriumi elemzési eljárások szerint: minták előkészítése összetételelemzésre (NREL/TP-510-42620) és szerkezeti szénhidrátok és lignin meghatározása a biomasszában (NREL/TP-510 – 42618)47.
A hidrolizátumáram oligoszacharid elemzését 2 ml-es méretben, autokláv alapú savas hidrolízis módszerrel végeztük.Keverje össze a hidrolizátummintát 69,7 µl 72%-os kénsavval egy 10 ml-es csavaros kupakos tenyészcsőben, és inkubálja 1 órán át asztalon 121 °C-on, hűtse le jégen, és szűrje át egy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) fiolába.Az oligoszacharidok koncentrációját úgy határoztuk meg, hogy a nem hidrolizált mintában lévő monoszacharidok koncentrációját kivontuk a savval hidrolizált minta teljes cukorkoncentrációjából.
A savval hidrolizált biomassza glükóz-, xilóz- és arabinózkoncentrációit egy Shimadzu HPLC rendszerrel elemeztük, amely automatikus mintavevővel, oszlopfűtővel, izokratikus pumpával és törésmutató-detektorral volt felszerelve Bio-Rad Aminex HPX-87H oszlopon.Az oszlopot 50 °C-on tartottuk, és 0,6 ml/perc 5 mM vizes H2SO4-gyel eluáltuk.folyam.
A hidrolizátum felülúszóját hígítottuk, és monomer- és oligoszacharid-tartalmát analizáltuk.Az enzimatikus hidrolízis után kapott monomer cukrokat HPLC-vel elemeztük Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P oszloppal és hamuvédő oszloppal.Az oszlop hőmérsékletét 80 °C-on tartottuk, mozgófázisként vizet használtunk 0,6 ml/perc áramlási sebességgel.Az oligoszacharidokat híg savban 121 °C-on végzett hidrolízissel határoztuk meg a refs.41, 48, 49.
A szacharidanalízist nyers, AFEX-szel előkezelt és minden nem hidrolizált biomassza maradékon (beleértve a sorozatos sejtfalkivonatok előállítását és azok mAb-szűrését) a korábban leírt 27, 43, 50, 51 eljárásokkal végeztük.Glikóm-analízishez a növényi sejtfal anyag alkoholban oldhatatlan maradványait biomassza-maradványokból állítják elő, és sorozatos extrakciónak vetik alá egyre agresszívebb reagensekkel, mint például ammónium-oxalát (50 mM), nátrium-karbonát (50 mM és 0,5% w/v), CON.(1 M és 4 M, mindkettő 1 tömeg/térfogat%-os nátrium-bór-hidriddel) és savklorit a korábban leírtak szerint52,53.A kivonatokat ezután ELISA-nak vetettük alá a sejtfal-glikánra irányított komplex mAb50-panel ellen, és az mAb-kötési reakciókat hőtérképként mutattuk be.A növényi sejtfal-glikánt megcélzó mAb-ket laboratóriumi készletekből (CCRC, JIM és MAC sorozat) vásároltuk.
Oligoszacharidok egylépéses biotinilezése.A szénhidrátok konjugálását biotin-LC-hidraziddal a következő eljárással végeztük.Biotin-LC-hidrazidot (4,6 mg/12 μmol) dimetil-szulfoxidban (DMSO, 70 μl) oldottunk fel erőteljes keverés és 65 °C-on 1 perces melegítés közben.30 µl jégecetet adunk hozzá, és az elegyet nátrium-ciano-bór-hidridre (6,4 mg/100 µmol) öntjük, és 65 °C-on körülbelül 1 percig tartó melegítés után teljesen feloldjuk.Ezután 5-8 μl reakcióelegyet adtunk a szárított oligoszacharidhoz (1-100 nmol), hogy 10-szeres vagy több moláris felesleget kapjunk a redukáló véghez képest.A reakciót 65 °C-on 2 órán át végeztük, majd a mintákat azonnal megtisztítottuk.A jelölési kísérletekben nátrium-ciano-bór-hidridet nem használtunk redukció nélkül, és a mintákat 65 °C-on 2,5 órán át reagáltattuk.
Biotinilezett oligoszacharidok mintáinak ELISA bevonása és mosása.25 μl biotinilált mintát (100 μl minden koncentrált mintából 5 ml 0,1 M Tris pufferoldattal (TBS) hígítva) adtunk az avidinnel bevont lemez minden egyes üregébe.A kontroll lyukakat 50 μl biotinnal vontuk be 10 μg/ml koncentrációban 0,1 M TBS-ben.A vakmérésekhez bevonatként ionmentes vizet használtunk.A tablettát 2 órán át szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk.Mossuk ki a lemezt 3-szor 0,1%-os fölözött tejjel 0,1 M TBS-ben a 2. sz.11 Grenier 3A lakáshoz.
Primer antitestek hozzáadása és mosása.Adjon 40 µl primer antitestet minden egyes lyukhoz.Inkubálja a mikrolemezt 1 órán át szobahőmérsékleten, sötétben.A lemezeket azután háromszor mostuk 0,1% tejjel 0,1 M TBS-ben a 11-es számú mosóprogram segítségével a Grenier Flat 3A-hoz.
Adjunk hozzá másodlagos antitestet és mossuk le.Adjon 50 µl egér/patkány másodlagos antitestet (1:5000 arányban hígítva 0,1% tejben 0,1 M TBS-ben) minden egyes lyukba.Inkubálja a mikrolemezt 1 órán át szobahőmérsékleten, sötétben.A mikrolemezeket ezután ötször mostuk 0,1%-os tejjel 0,1 M TBS-ben a Grenier Flat 5A 12. számú lemezmosási program használatával.
Aljzat hozzáadása.Adjon 50 µl 3,3',5,5'-tetrametilbenzidint (TMB) az alapszubsztrátumhoz (2 csepp puffer, 3 csepp TMB, 2 csepp hidrogén-peroxid hozzáadásával 15 ml ionmentesített vízhez).Készítse elő a TMB hordozót.és használat előtt vortexelje).Inkubálja a mikrolemezt szobahőmérsékleten 30 percig.Sötétben.
Hajtsa végre a lépést, és olvassa el a táblagépet.Adjon 50 µl 1 N kénsavat minden egyes lyukhoz, és rögzítse az abszorbanciát 450 és 655 nm között ELISA olvasó segítségével.
Készítsen 1 mg/ml-es oldatokat ezekből az analitokból ionmentesített vízben: arabinóz, ramnóz, fukóz, xilóz, galakturonsav (GalA), glükuronsav (GlcA), mannóz, glükóz, galaktóz, laktóz, N-acetilmannózamin (manNAc), N-acetil-glükózamin.(glcNAc), N-acetil-galaktózamin (galNAc), inozit (belső standard).Két standardot készítettünk az 1. táblázatban látható 1 mg/ml-es cukoroldatok hozzáadásával. A mintákat lefagyasztjuk és -80 °C-on liofilizáljuk, amíg az összes vizet eltávolítjuk (általában körülbelül 12-18 óra).
Adjon hozzá 100–500 µg mintát csavaros kupakkal ellátott csövekhez analitikai mérlegen.Jegyezze fel a hozzáadott összeget.A legjobb, ha a mintát meghatározott koncentrációjú oldószerben oldjuk fel, és folyékony alikvotként adjuk a csőhöz.Használjon 20 µl 1 mg/ml inozitot belső standardként minden mintacsőhöz.A mintához hozzáadott belső standard mennyiségének meg kell egyeznie a standard csőbe adott belső standard mennyiségével.
Adjon hozzá 8 ml vízmentes metanolt egy csavaros kupakkal ellátott injekciós üveghez.Ezután 4 ml 3 N metanolos HCl-oldatot adunk hozzá, lezárjuk és összerázzuk.Ez az eljárás nem használ vizet.
Adjunk 500 µl 1 M HCl metanolos oldatot az oligoszacharid mintákhoz és a standard TMS csövekhez.A mintákat egy éjszakán át (168 óra) 80 °C-on termikus blokkban inkubáltuk.Szárítsuk a metanollízis terméket szobahőmérsékleten egy szárítócső segítségével.Adjunk hozzá 200 µl MeOH-t és szárítsuk meg újra.Ezt a folyamatot kétszer megismételjük.Adjunk a mintához 200 µl metanolt, 100 µl piridint és 100 µl ecetsavanhidridet, és jól keverjük össze.A mintákat szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk.és szárítjuk.Adjunk hozzá 200 µl metanolt és szárítsuk meg újra.
Adjon hozzá 200 µl Tri-Sil-t, és melegítse a kupakkal lezárt csövet 20 percig.80 °C-ra, majd szobahőmérsékletre hűtjük.Használjon szárítócsövet a minta további szárításához körülbelül 50 µl térfogatra.Fontos megjegyezni, hogy nem hagytuk, hogy a minták teljesen megszáradjanak.
Adjunk hozzá 2 ml hexánt, és keverjük jól vortex segítségével.Töltse meg a Pasteur-pipetták (5-8 mm) hegyét egy darab üveggyapottal úgy, hogy az üveggyapotot egy 5-3/4 hüvelyk átmérőjű pipetta tetejére helyezi.A mintákat 3000 g-vel centrifugáltuk 2 percig.Az oldhatatlan maradékot kicsapjuk.Szárítsa meg a mintát 100-150 µl-re.Körülbelül 1 μl térfogatot fecskendeztünk a GC-MS-be 80 °C kezdeti hőmérsékleten és 2,0 perces kezdeti idővel (2. táblázat).