Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Νέες ανοσολογικές και φασματομετρικές μέθοδοι μάζας για σύνθετη ανάλυση επίμονων ολιγοσακχαριτών σε τροφοδοτικό καλαμποκιού προεπεξεργασμένο με AFEX.Η λιγνοκυτταρινική βιομάζα είναι μια βιώσιμη εναλλακτική λύση στα ορυκτά καύσιμα και χρησιμοποιείται ευρέως για την ανάπτυξη βιοτεχνολογιών για την παραγωγή προϊόντων όπως τρόφιμα, ζωοτροφές, καύσιμα και χημικά.Το κλειδί για αυτές τις τεχνολογίες είναι η ανάπτυξη ανταγωνιστικών διαδικασιών για τη μετατροπή των σύνθετων υδατανθράκων που υπάρχουν στα κυτταρικά τοιχώματα των φυτών σε απλά σάκχαρα όπως η γλυκόζη, η ξυλόζη και η αραβινόζη.Επειδή η λιγνοκυτταρινική βιομάζα είναι πολύ επίμονη, πρέπει να υποβληθεί σε θερμοχημικές επεξεργασίες (π.χ. απολέπιση ινών αμμωνίας (AFEX), αραιά οξέα (DA), ιοντικά υγρά (IL)) και βιολογικές επεξεργασίες (π.χ. ενζυματική υδρόλυση και μικροβιακή ζύμωση) σε συνδυασμό για να ληφθεί το επιθυμητό προϊόν..Ωστόσο, όταν χρησιμοποιούνται εμπορικά μυκητιακά ένζυμα στη διαδικασία υδρόλυσης, μόνο το 75-85% των διαλυτών σακχάρων που σχηματίζονται είναι μονοσακχαρίτες και το υπόλοιπο 15-25% είναι διαλυτοί, δυσεπίλυτοι ολιγοσακχαρίτες, οι οποίοι δεν είναι πάντα διαθέσιμοι στους μικροοργανισμούς.Προηγουμένως, απομονώσαμε και καθαρίσαμε επιτυχώς διαλυτούς επίμονους ολιγοσακχαρίτες χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό χρωματογραφίας διαχωρισμού άνθρακα και γης διατόμων και αποκλεισμού μεγέθους, και επίσης ερευνήσαμε τις ενζυμικές ανασταλτικές τους ιδιότητες.Βρήκαμε ότι οι ολιγοσακχαρίτες που περιέχουν υποκαταστάσεις μεθυλιωμένου ουρονικού οξέος υψηλότερου βαθμού πολυμερισμού (DP) είναι πιο δύσκολο να επεξεργαστούν με μίγματα ενζύμων του εμπορίου από ότι οι ολιγοσακχαρίτες χαμηλής DP και οι ουδέτεροι ολιγοσακχαρίτες.Εδώ αναφέρουμε τη χρήση πολλών πρόσθετων μεθόδων, συμπεριλαμβανομένου του προφίλ γλυκάνης χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) ειδικά για γλυκάνες φυτικής βιομάζας για τον χαρακτηρισμό δεσμών γλυκάνης στα τοιχώματα των φυτών και ενζυματικά υδρολύματα, ιονισμό εκρόφησης λέιζερ με τη βοήθεια μήτρας, φασματομετρία μάζας χρόνου πτήσης..Το MALDI-TOF-MS) χρησιμοποιεί διαγνωστικές κορυφές πληροφοριακής δομής που λαμβάνονται με φασματοσκοπία μετά από δευτερογενή διάσπαση αρνητικών ιόντων, αέρια χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας (GC-MS) για να χαρακτηρίσει δεσμούς ολιγοσακχαρίτη με και χωρίς παραγωγοποίηση.Λόγω του μικρού μεγέθους των ολιγοσακχαριτών (DP 4-20), αυτά τα μόρια είναι δύσκολο να χρησιμοποιηθούν για τη σύνδεση και τον χαρακτηρισμό του mAb.Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, εφαρμόσαμε μια νέα μέθοδο ακινητοποίησης ολιγοσακχαριτών με βάση τη σύζευξη βιοτίνης που σήμανε επιτυχώς την πλειονότητα των διαλυτών ολιγοσακχαριτών χαμηλής DP στην επιφάνεια της μικροπλάκας, η οποία στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε σε ένα σύστημα mAb υψηλής απόδοσης για ειδική ανάλυση απολίνωσης.Αυτή η νέα μέθοδος θα διευκολύνει την ανάπτυξη πιο προηγμένων αναλύσεων γλυκώματος υψηλής απόδοσης στο μέλλον που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό ολιγοσακχαριτών που υπάρχουν σε βιοδείκτες για διαγνωστικούς σκοπούς.
Η λιγνοκυτταρινική βιομάζα, που αποτελείται από γεωργικά, δασοκομικά, γρασίδι και ξυλώδη υλικά, είναι μια πιθανή πρώτη ύλη για την παραγωγή προϊόντων βιολογικής βάσης, συμπεριλαμβανομένων τροφίμων, ζωοτροφών, καυσίμων και χημικών πρόδρομων ουσιών για την παραγωγή προϊόντων υψηλότερης αξίας1.Οι υδατάνθρακες (όπως η κυτταρίνη και η ημικυτταρίνη) που υπάρχουν στα κυτταρικά τοιχώματα των φυτών αποπολυμερίζονται σε μονοσακχαρίτες με χημική επεξεργασία και βιομετασχηματισμό (όπως ενζυματική υδρόλυση και μικροβιακή ζύμωση).Οι συνήθεις προεπεξεργασίες περιλαμβάνουν διαστολή ινών αμμωνίας (AFEX), αραιό οξύ (DA), ιοντικό υγρό (IL) και έκρηξη ατμού (SE), οι οποίες χρησιμοποιούν συνδυασμό χημικών και θερμότητας για τη μείωση της παραγωγής λιγνοκυτταρίνης ανοίγοντας τα τοιχώματα των φυτών3,4.πείσμα της ύλης, 5. Η ενζυματική υδρόλυση πραγματοποιείται με υψηλό φορτίο στερεών χρησιμοποιώντας εμπορικά ένζυμα που περιέχουν ενεργούς υδατάνθρακες (CAZymes) και μικροβιακή ζύμωση με χρήση διαγονιδιακών ζυμών ή βακτηρίων για την παραγωγή καυσίμων και χημικών ουσιών με βιολογική βάση 6 .
Τα CAZymes στα εμπορικά ένζυμα αποτελούνται από ένα πολύπλοκο μείγμα ενζύμων που διασπούν συνεργικά σύνθετους δεσμούς υδατάνθρακα-ζάχαρης για να σχηματίσουν μονοσακχαρίτες2,7.Όπως αναφέραμε νωρίτερα, το πολύπλοκο δίκτυο αρωματικών πολυμερών λιγνίνης με υδατάνθρακες τα καθιστά εξαιρετικά δυσεπίλυτα, γεγονός που οδηγεί σε ατελή μετατροπή του σακχάρου, συσσωρεύοντας 15-25% των φυλετικών ολιγοσακχαριτών που δεν παράγονται κατά την ενζυματική υδρόλυση της προεπεξεργασμένης βιομάζας.Αυτό είναι ένα κοινό πρόβλημα με διάφορες μεθόδους προεπεξεργασίας βιομάζας.Μερικοί λόγοι για αυτό το σημείο συμφόρησης περιλαμβάνουν την αναστολή των ενζύμων κατά την υδρόλυση ή την απουσία ή τα χαμηλά επίπεδα βασικών βασικών ενζύμων που απαιτούνται για τη διάσπαση των δεσμών σακχάρου στη φυτική βιομάζα.Η κατανόηση της σύνθεσης και των δομικών χαρακτηριστικών των σακχάρων, όπως οι δεσμοί ζάχαρης στους ολιγοσακχαρίτες, θα μας βοηθήσει να βελτιώσουμε τη μετατροπή του σακχάρου κατά την υδρόλυση, καθιστώντας τις βιοτεχνολογικές διεργασίες ανταγωνιστικές ως προς το κόστος με τα προϊόντα που προέρχονται από πετρέλαιο.
Ο προσδιορισμός της δομής των υδατανθράκων είναι δύσκολος και απαιτεί συνδυασμό μεθόδων όπως υγρή χρωματογραφία (LC)11,12, φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR)13, τριχοειδική ηλεκτροφόρηση (CE)14,15,16 και φασματομετρία μάζας (MS)17.,δεκαοχτώ.Οι μέθοδοι MS όπως η φασματομετρία μάζας χρόνου πτήσης με εκρόφηση λέιζερ και ιονισμό χρησιμοποιώντας μήτρα (MALDI-TOF-MS) είναι μια ευέλικτη μέθοδος για τον εντοπισμό δομών υδατανθράκων.Πρόσφατα, η διαδοχική MS προσαγωγών ιόντων νατρίου που προκαλείται από σύγκρουση (CID) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την αναγνώριση δακτυλικών αποτυπωμάτων που αντιστοιχούν σε θέσεις προσκόλλησης ολιγοσακχαρίτη, ανωμερικές διαμορφώσεις, αλληλουχίες και θέσεις διακλάδωσης 20, 21.
Η ανάλυση γλυκάνης είναι ένα εξαιρετικό εργαλείο για τη σε βάθος αναγνώριση των δεσμών υδατανθράκων22.Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) που κατευθύνονται στη γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος των φυτών ως ανιχνευτές για την κατανόηση των σύνθετων δεσμών υδατανθράκων.Περισσότερα από 250 mAbs είναι διαθέσιμα παγκοσμίως, σχεδιασμένα ενάντια σε διάφορους γραμμικούς και διακλαδισμένους ολιγοσακχαρίτες που χρησιμοποιούν διάφορους σακχαρίτες24.Πολλά mAbs έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τον χαρακτηρισμό της δομής, της σύνθεσης και των τροποποιήσεων του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος, καθώς υπάρχουν σημαντικές διαφορές ανάλογα με τον τύπο των φυτικών κυττάρων, το όργανο, την ηλικία, το στάδιο ανάπτυξης και το περιβάλλον ανάπτυξης25,26.Πιο πρόσφατα, αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί για την κατανόηση πληθυσμών κυστιδίων σε φυτικά και ζωικά συστήματα και τους αντίστοιχους ρόλους τους στη μεταφορά γλυκάνης όπως προσδιορίζεται από υποκυτταρικούς δείκτες, αναπτυξιακά στάδια ή περιβαλλοντικά ερεθίσματα και για τον προσδιορισμό της ενζυμικής δραστηριότητας.Μερικές από τις διαφορετικές δομές γλυκανών και ξυλανών που έχουν αναγνωριστεί περιλαμβάνουν πηκτίνη (P), ξυλάνη (X), μαννάνη (Μ), ξυλογλυκάνες (XylG), γλυκάνες μεικτού δεσμού (MLG), αραβινοξυλάνη (ArbX), γαλακτομαννάνη (GalG), γλυκουρονικό οξύ-αραβινοξυλάνη (GA.rbArbAbA)9.
Ωστόσο, παρά όλες αυτές τις ερευνητικές προσπάθειες, μόνο λίγες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στη φύση της συσσώρευσης ολιγοσακχαριτών κατά την υδρόλυση υψηλού φορτίου στερεών (HSL), συμπεριλαμβανομένης της απελευθέρωσης ολιγοσακχαριτών, των αλλαγών του μήκους της ολιγομερικής αλυσίδας κατά την υδρόλυση, των διαφόρων πολυμερών χαμηλής DP και των καμπυλών τους.διανομές 30,31,32.Εν τω μεταξύ, αν και η ανάλυση γλυκάνης έχει αποδειχθεί χρήσιμο εργαλείο για μια ολοκληρωμένη ανάλυση της δομής της γλυκάνης, είναι δύσκολο να αξιολογηθούν υδατοδιαλυτοί ολιγοσακχαρίτες χαμηλής DP χρησιμοποιώντας μεθόδους αντισωμάτων.Μικρότεροι ολιγοσακχαρίτες DP με μοριακό βάρος μικρότερο από 5-10 kDa δεν δεσμεύονται στις πλάκες ELISA 33, 34 και ξεπλένονται πριν από την προσθήκη αντισώματος.
Εδώ, για πρώτη φορά, επιδεικνύουμε μια δοκιμασία ELISA σε επικαλυμμένες με αβιδίνη πλάκες χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα, συνδυάζοντας μια διαδικασία βιοτινυλίωσης ενός σταδίου για διαλυτούς πυρίμαχους ολιγοσακχαρίτες με ανάλυση γλυκόμ.Η προσέγγισή μας στην ανάλυση γλυκώματος επικυρώθηκε με ανάλυση που βασίζεται σε MALDI-TOF-MS και GC-MS συμπληρωματικών δεσμών ολιγοσακχαρίτη χρησιμοποιώντας παραγωγοποίηση τριμεθυλοσιλυλίου (TMS) συνθέσεων υδρολυμένου σακχάρου.Αυτή η καινοτόμος προσέγγιση μπορεί να αναπτυχθεί ως μέθοδος υψηλής απόδοσης στο μέλλον και να βρει ευρύτερη εφαρμογή στη βιοϊατρική έρευνα35.
Οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ενζύμων και των αντισωμάτων, όπως η γλυκοζυλίωση,36 επηρεάζουν τη βιολογική τους δραστηριότητα.Για παράδειγμα, οι αλλαγές στη γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών του ορού παίζουν σημαντικό ρόλο στη φλεγμονώδη αρθρίτιδα και οι αλλαγές στη γλυκοζυλίωση χρησιμοποιούνται ως διαγνωστικοί δείκτες37.Διάφορες γλυκάνες έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία ότι εμφανίζονται εύκολα σε μια ποικιλία ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των χρόνιων φλεγμονωδών ασθενειών του γαστρεντερικού σωλήνα και του ήπατος, ιογενείς λοιμώξεις, καρκίνοι των ωοθηκών, του μαστού και του προστάτη38,39,40.Η κατανόηση της δομής των γλυκανών με χρήση μεθόδων ELISA γλυκάνης που βασίζονται σε αντισώματα θα παρέχει πρόσθετη εμπιστοσύνη στη διάγνωση της νόσου χωρίς τη χρήση πολύπλοκων μεθόδων ΣΚΠ.
Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι οι επίμονοι ολιγοσακχαρίτες παρέμειναν μη υδρολυμένοι μετά από προεπεξεργασία και ενζυματική υδρόλυση (Εικόνα 1).Στην προηγουμένως δημοσιευμένη εργασία μας, αναπτύξαμε μια μέθοδο εκχύλισης στερεάς φάσης με ενεργό άνθρακα για την απομόνωση ολιγοσακχαριτών από προκατεργασμένο με AFEX υδρόλυση καλαμποκιού (ACSH)8.Μετά την αρχική εκχύλιση και διαχωρισμό, οι ολιγοσακχαρίτες κλασματοποιήθηκαν περαιτέρω με χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC) και συλλέχθηκαν κατά σειρά μοριακού βάρους.Τα μονομερή σακχάρου και τα ολιγομερή που απελευθερώθηκαν από διάφορες προεπεξεργασίες αναλύθηκαν με ανάλυση σύνθεσης σακχάρου.Κατά τη σύγκριση της περιεκτικότητας σε ολιγομερή σακχάρων που λαμβάνονται με διάφορες μεθόδους προεπεξεργασίας, η παρουσία επίμονων ολιγοσακχαριτών είναι ένα κοινό πρόβλημα στη μετατροπή της βιομάζας σε μονοσακχαρίτες και μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της απόδοσης σακχάρων κατά τουλάχιστον 10-15% και ακόμη και έως 18%.ΜΑΣ.Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για περαιτέρω μεγάλης κλίμακας παραγωγή κλασμάτων ολιγοσακχαρίτη.Το προκύπτον ACH και τα επόμενα κλάσματα του με διαφορετικά μοριακά βάρη χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματικό υλικό για τον χαρακτηρισμό των ολιγοσακχαριτών σε αυτή την εργασία.
Μετά την προκατεργασία και την ενζυματική υδρόλυση, οι επίμονοι ολιγοσακχαρίτες παρέμειναν μη υδρολυμένοι.Εδώ (Α) είναι μια μέθοδος διαχωρισμού ολιγοσακχαριτών στην οποία οι ολιγοσακχαρίτες απομονώνονται από προκατεργασμένο με AFEX προϊόν υδρόλυσης καλαμποκιού (ACSH) χρησιμοποιώντας μια γεμάτη κλίνη ενεργού άνθρακα και γης διατόμων.(Β) Μέθοδος διαχωρισμού ολιγοσακχαριτών.Οι ολιγοσακχαρίτες διαχωρίστηκαν περαιτέρω με χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC).(Γ) Σακχαριτικά μονομερή και ολιγομερή που απελευθερώνονται από διάφορες προεπεξεργασίες (αραιωμένο οξύ: DA, ιοντικό υγρό: IL και AFEX).Συνθήκες ενζυματικής υδρόλυσης: υψηλή φόρτωση στερεών 25% (w/w) (περίπου 8% φόρτωση γλυκάνης), 96 ώρες υδρόλυση, 20 mg/g εμπορική φόρτωση ενζύμων (αναλογία Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) και (D) μονομερή σακχάρου και ολιγοαραϋλοζη-κορροβινόζη x γλυκοαραβινόζη xx, γλυκοαρανυλο-οξειδωμένη οξεία AF πάνω (ACS).
Η ανάλυση γλυκάνης έχει αποδειχθεί χρήσιμο εργαλείο για μια ολοκληρωμένη δομική ανάλυση των γλυκανών σε εκχυλίσματα που απομονώνονται από υπολείμματα στερεάς βιομάζας.Ωστόσο, οι υδατοδιαλυτοί σακχαρίτες υποεκπροσωπούνται χρησιμοποιώντας αυτήν την παραδοσιακή μέθοδο41 επειδή οι ολιγοσακχαρίτες χαμηλού μοριακού βάρους είναι δύσκολο να ακινητοποιηθούν σε πλάκες ELISA και ξεπλένονται πριν από την προσθήκη αντισώματος.Επομένως, για τη δέσμευση και τον χαρακτηρισμό αντισωμάτων, χρησιμοποιήθηκε μέθοδος βιοτινυλίωσης ενός σταδίου για την επικάλυψη διαλυτών, μη συμμορφούμενων ολιγοσακχαριτών σε πλακίδια ELISA επικαλυμμένα με αβιδίνη.Αυτή η μέθοδος δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας το προηγουμένως παραγόμενο ACSH και ένα κλάσμα με βάση το μοριακό του βάρος (ή τον βαθμό πολυμερισμού, DP).Η βιοτινυλίωση ενός σταδίου χρησιμοποιήθηκε για την αύξηση της συγγένειας δέσμευσης ολιγοσακχαρίτη με την προσθήκη βιοτίνης-LC-υδραζιδίου στο αναγωγικό άκρο του υδατάνθρακα (Εικ. 2).Σε διάλυμα, η ομάδα ημιακετάλης στο αναγωγικό άκρο αντιδρά με την υδραζιδική ομάδα βιοτίνης-LC-υδραζιδίου για να σχηματίσει έναν δεσμό υδραζόνης.Παρουσία του αναγωγικού παράγοντα NaCNBH3, ο δεσμός υδραζόνης ανάγεται σε ένα σταθερό βιοτινυλιωμένο τελικό προϊόν.Με την τροποποίηση του άκρου μείωσης του σακχάρου, η σύνδεση ολιγοσακχαριτών χαμηλής DP σε πλάκες ELISA κατέστη δυνατή και στη μελέτη μας αυτό έγινε σε πλακίδια επικαλυμμένα με αβιδίνη χρησιμοποιώντας mAbs στοχευμένα σε γλυκάνη.
Έλεγχος μονοκλωνικών αντισωμάτων με βάση την ELISA για βιοτινυλιωμένους ολιγοσακχαρίτες.Εδώ (Α) συνδυασμένη βιοτινυλίωση ολιγοσακχαριτών και επακόλουθη διαλογή ELISA με mAbs στοχευμένα σε γλυκάνη σε πλακίδια επικαλυμμένα με NeutrAvidin και (Β) δείχνει μια διαδικασία ενός σταδίου για βιοτινυλίωση προϊόντων αντίδρασης.
Επικαλυμμένες με αβιδίνη πλάκες με αντισώματα συζευγμένα με ολιγοσακχαρίτη προστέθηκαν στη συνέχεια σε πρωτογενή και δευτερεύοντα αντισώματα και πλύθηκαν σε ένα ευαίσθητο στο φως και στο χρόνο μέσο.Αφού ολοκληρωθεί η δέσμευση αντισωμάτων, προσθέστε υπόστρωμα TMB για να επωαστεί η πλάκα.Η αντίδραση τελικά σταμάτησε με θειικό οξύ.Οι επωασμένες πλάκες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA για να προσδιοριστεί η ισχύς δέσμευσης κάθε αντισώματος για την ανίχνευση ειδικής για αντισώματα διασταυρούμενη σύνδεση.Για λεπτομέρειες και παραμέτρους του πειράματος, δείτε την αντίστοιχη ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι».
Αποδεικνύουμε τη χρησιμότητα αυτής της νέας μεθόδου για συγκεκριμένες εφαρμογές χαρακτηρίζοντας τους διαλυτούς ολιγοσακχαρίτες που υπάρχουν στο ACSH καθώς και σε ακατέργαστα και καθαρισμένα κλάσματα ολιγοσακχαριτών που απομονώνονται από λιγνοκυτταρινικά υδρολύματα.Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, οι πιο κοινές υποκατεστημένες με επίτοπο ξυλάνες που προσδιορίζονται στο ACSH χρησιμοποιώντας μεθόδους ανάλυσης βιοακυλιωμένου γλυκώματος είναι συνήθως ουρονικές (U) ή μεθυλουρονικές (MeU) και πηκτικές αραβινογαλακτάνες.Τα περισσότερα από αυτά βρέθηκαν επίσης στην προηγούμενη μελέτη μας σχετικά με την ανάλυση γλυκανών μη υδρολυμένων στερεών (UHS)43.
Ανίχνευση ανυπόφορων επιτόπων ολιγοσακχαρίτη χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται στη γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος.Το «ουδέτερο» κλάσμα είναι το κλάσμα ACN και το «όξινο» κλάσμα είναι το κλάσμα FA.Τα φωτεινότερα κόκκινα στον χάρτη θερμότητας υποδεικνύουν υψηλότερη περιεκτικότητα σε επίτοπο και τα φωτεινότερα μπλε υποδηλώνουν ένα κενό φόντο.Οι τιμές χρώματος στην κλίμακα βασίζονται σε ακατέργαστες τιμές OD για σκευάσματα N=2.Οι κύριοι επίτοποι που αναγνωρίζονται από τα αντισώματα φαίνονται στα δεξιά.
Αυτές οι μη κυτταρινικές δομές δεν μπορούσαν να διασπαστούν από τις πιο κοινές κυτταρινάσες και ημικυτταρινάσες στο ελεγμένο μίγμα ενζύμων του εμπορίου, το οποίο περιλαμβάνει τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα εμπορικά ένζυμα.Επομένως, απαιτούνται νέα βοηθητικά ένζυμα για την υδρόλυση τους.Χωρίς τα απαραίτητα βοηθητικά ένζυμα μη κυτταρίνης, αυτοί οι μη κυτταρινικοί δεσμοί εμποδίζουν την πλήρη μετατροπή σε μονοσακχαρίτες, ακόμη και αν τα μητρικά πολυμερή σακχάρων τους υδρολύονται εκτενώς σε βραχύτερα θραύσματα και διαλύονται χρησιμοποιώντας μίγματα ενζύμων του εμπορίου.
Περαιτέρω μελέτη της κατανομής του σήματος και της ισχύος δέσμευσής του έδειξε ότι οι επίτοποι δέσμευσης ήταν χαμηλότεροι σε κλάσματα σακχάρου υψηλής DP (A, B, C, DP έως 20+) από ότι σε κλάσματα χαμηλής DP (D, E, F, DP) στα διμερή) (Εικ. 1).Τα όξινα θραύσματα είναι πιο κοινά σε επιτόπους μη κυτταρίνης παρά σε ουδέτερα θραύσματα.Αυτά τα φαινόμενα είναι σύμφωνα με το πρότυπο που παρατηρήθηκε στην προηγούμενη μελέτη μας, όπου τα τμήματα υψηλής DP και οξέος ήταν πιο ανθεκτικά στην ενζυματική υδρόλυση.Επομένως, η παρουσία επιτόπων γλυκάνης χωρίς κυτταρίνη και υποκαταστάσεις U και MeU μπορεί να συμβάλει σημαντικά στη σταθερότητα των ολιγοσακχαριτών.Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η αποτελεσματικότητα δέσμευσης και ανίχνευσης μπορεί να είναι προβληματική για ολιγοσακχαρίτες χαμηλής DP, ειδικά εάν ο επίτοπος είναι ένας διμερής ή τριμερής ολιγοσακχαρίτης.Αυτό μπορεί να ελεγχθεί χρησιμοποιώντας εμπορικούς ολιγοσακχαρίτες διαφορετικών μηκών, ο καθένας από τους οποίους περιέχει μόνο έναν επίτοπο που συνδέεται με ένα συγκεκριμένο mAb.
Έτσι, η χρήση ειδικών για τη δομή αντισωμάτων αποκάλυψε ορισμένους τύπους ανυπόφορων δεσμών.Ανάλογα με τον τύπο του χρησιμοποιούμενου αντισώματος, το κατάλληλο σχέδιο απολίνωσης και την ισχύ του σήματος που παράγει (το περισσότερο και λιγότερο άφθονο), μπορούν να αναγνωριστούν νέα ένζυμα και να προστεθούν ημιποσοτικά στο μίγμα ενζύμων για πληρέστερη γλυκομετατροπή.Λαμβάνοντας ως παράδειγμα την ανάλυση των ολιγοσακχαριτών ACSH, μπορούμε να δημιουργήσουμε μια βάση δεδομένων δεσμών γλυκάνης για κάθε υλικό βιομάζας.Θα πρέπει να σημειωθεί εδώ ότι θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η διαφορετική συγγένεια των αντισωμάτων και εάν η συγγένειά τους είναι άγνωστη, αυτό θα δημιουργήσει ορισμένες δυσκολίες κατά τη σύγκριση των σημάτων διαφορετικών αντισωμάτων.Επιπλέον, η σύγκριση των δεσμών γλυκάνης μπορεί να λειτουργήσει καλύτερα μεταξύ δειγμάτων για το ίδιο αντίσωμα.Αυτοί οι επίμονοι δεσμοί μπορούν στη συνέχεια να συνδεθούν με τη βάση δεδομένων CAZyme, από την οποία μπορούμε να αναγνωρίσουμε ένζυμα, να επιλέξουμε υποψήφια ένζυμα και να ελέγξουμε για ένζυμα που διασπούν τους δεσμούς ή να αναπτύξουμε μικροβιακά συστήματα για την έκφραση αυτών των ενζύμων για χρήση σε βιοδιυλιστήρια44.
Για να αξιολογήσουμε πώς οι ανοσολογικές μέθοδοι συμπληρώνουν εναλλακτικές μεθόδους για τον χαρακτηρισμό ολιγοσακχαριτών χαμηλού μοριακού βάρους που υπάρχουν σε λιγνοκυτταρινικά υδρολύματα, πραγματοποιήσαμε MALDI (Εικ. 4, S1-S8) και ανάλυση σακχαριτών που προέρχονται από TMS με βάση το GC-MS στο ίδιο τμήμα ολιγοσακχαρίτη (Εικ. 5).Το MALDI χρησιμοποιείται για να συγκρίνει εάν η κατανομή μάζας των μορίων ολιγοσακχαρίτη ταιριάζει με την επιδιωκόμενη δομή.Στο σχ.Το σχήμα 4 δείχνει το MC των ουδέτερων στοιχείων ACN-A και ACN-B.Η ανάλυση ACN-A επιβεβαίωσε μια σειρά από σάκχαρα πεντόζης που κυμαίνονται από DP 4–8 (Εικ. 4) έως DP 22 (Εικ. S1), των οποίων τα βάρη αντιστοιχούν σε ολιγοσακχαρίτες MeU-ξυλάνης.Η ανάλυση ACN-B επιβεβαίωσε τη σειρά πεντόζης και γλυκοξυλάνης με DP 8-15.Σε συμπληρωματικό υλικό όπως το Σχήμα S3, οι χάρτες κατανομής μάζας όξινου τμήματος FA-C δείχνουν μια σειρά από (Me)U υποκατεστημένα σάκχαρα πεντόζης με DP 8-15 που είναι σύμφωνα με τις υποκατεστημένες ξυλάνες που βρέθηκαν στη διαλογή mAb με βάση ELISA.Οι επίτοποι είναι συνεπείς.
MALDI-MS φάσμα διαλυτών μη συμμορφούμενων ολιγοσακχαριτών που υπάρχουν στο ACS.Εδώ, (Α) ACN-A χαμηλού βάρους κλάσματα που περιέχουν μεθυλιωμένο ουρονικό οξύ (DP 4-8) υποκατεστημένοι ολιγοσακχαρίτες γλυκουροξυλάνης και (Β) ACN-B ξυλάνη και ολιγοσακχαρίτες μεθυλιωμένου ουρονικού οξέος υποκατεστημένοι με γλυκουροξυλάνη (DP 8-15).
Ανάλυση της σύστασης του υπολείμματος γλυκάνης των πυρίμαχων ολιγοσακχαριτών.Εδώ (Α) σύνθεση σακχαρίτη TMS διαφόρων κλασμάτων ολιγοσακχαρίτη που ελήφθη χρησιμοποιώντας ανάλυση GC-MS.(Β) Δομές διαφόρων σακχάρων που προέρχονται από TMS που υπάρχουν σε ολιγοσακχαρίτες.ACN – κλάσμα ακετονιτριλίου που περιέχει ουδέτερους ολιγοσακχαρίτες και FA – κλάσμα φερουλικού οξέος που περιέχει όξινους ολιγοσακχαρίτες.
Ένα άλλο ενδιαφέρον συμπέρασμα συνήχθη από την ανάλυση LC-MS του κλάσματος ολιγοσακχαρίτη, όπως φαίνεται στο Σχήμα S9 (οι μέθοδοι φαίνονται στο ηλεκτρονικό συμπληρωματικό υλικό).Θραύσματα ομάδων εξόζης και -OAc παρατηρήθηκαν επανειλημμένα κατά τη διάρκεια της απολίνωσης του κλάσματος ACN-B.Αυτό το εύρημα όχι μόνο επιβεβαιώνει τον κατακερματισμό που παρατηρείται στην ανάλυση γλυκόζης και MALDI-TOF, αλλά παρέχει επίσης νέες πληροφορίες σχετικά με πιθανά παράγωγα υδατανθράκων σε προεπεξεργασμένη λιγνοκυτταρινική βιομάζα.
Αναλύσαμε επίσης τη σύνθεση σακχάρου του κλάσματος ολιγοσακχαρίτη χρησιμοποιώντας παραγωγοποίηση σακχάρου TMS.Χρησιμοποιώντας GC-MS, προσδιορίσαμε τη σύνθεση των νευρικών (μη παραγώγων) και των όξινων σακχάρων (GluA και GalA) στο κλάσμα ολιγοσακχαρίτη (Εικ. 5).Το γλυκουρονικό οξύ βρίσκεται στα όξινα συστατικά C και D, ενώ το γαλακτουρονικό οξύ βρίσκεται στα όξινα συστατικά Α και Β, τα οποία είναι και τα δύο συστατικά υψηλής DP των όξινων σακχάρων.Αυτά τα αποτελέσματα όχι μόνο επιβεβαιώνουν τα δεδομένα μας ELISA και MALDI, αλλά είναι επίσης συνεπή με τις προηγούμενες μελέτες μας για τη συσσώρευση ολιγοσακχαριτών.Επομένως, πιστεύουμε ότι οι σύγχρονες ανοσολογικές μέθοδοι που χρησιμοποιούν βιοτινυλίωση ολιγοσακχαριτών και επακόλουθο έλεγχο ELISA είναι επαρκείς για την ανίχνευση διαλυτών ανυπόφορων ολιγοσακχαριτών σε διάφορα βιολογικά δείγματα.
Δεδομένου ότι οι μέθοδοι διαλογής mAb που βασίζονται σε ELISA έχουν επικυρωθεί με πολλές διαφορετικές μεθόδους, θέλαμε να διερευνήσουμε περαιτέρω τις δυνατότητες αυτής της νέας ποσοτικής μεθόδου.Δύο εμπορικοί ολιγοσακχαρίτες, ο ολιγοσακχαρίτης ξυλοεξασακχαρίτη (XHE) και 23-α-L-αραβινοφουρανοσυλ-ξυλοτριόζη (A2XX), αγοράστηκαν και δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας μια νέα προσέγγιση mAb που στοχεύει τη γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος.Το Σχήμα 6 δείχνει μια γραμμική συσχέτιση μεταξύ του βιοτινυλιωμένου σήματος δέσμευσης και της λογαριθμικής συγκέντρωσης της συγκέντρωσης ολιγοσακχαρίτη, υποδηλώνοντας ένα πιθανό μοντέλο προσρόφησης Langmuir.Μεταξύ των mAbs, τα CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 και CCRC-M151 συσχετίστηκαν με το XHE και τα CCRC-M108, CCRC-M109 και LM11 συσχετίστηκαν με το A2XX nm έως 01.Λόγω της περιορισμένης διαθεσιμότητας αντισωμάτων κατά τη διάρκεια του πειράματος, πραγματοποιήθηκαν περιορισμένα πειράματα με κάθε συγκέντρωση ολιγοσακχαρίτη.Θα πρέπει να σημειωθεί εδώ ότι ορισμένα αντισώματα αντιδρούν πολύ διαφορετικά στον ίδιο ολιγοσακχαρίτη ως υπόστρωμα, πιθανώς επειδή συνδέονται με ελαφρώς διαφορετικούς επιτόπους και μπορεί να έχουν πολύ διαφορετικές συγγένειες δέσμευσης.Οι μηχανισμοί και οι επιπτώσεις της ακριβούς αναγνώρισης επιτόπου θα είναι πολύ πιο περίπλοκοι όταν η νέα προσέγγιση mAb εφαρμοστεί σε πραγματικά δείγματα.
Δύο εμπορικοί ολιγοσακχαρίτες χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του εύρους ανίχνευσης διαφόρων mAb στόχευσης γλυκάνης.Εδώ, γραμμικές συσχετίσεις με λογαριθμική συγκέντρωση συγκέντρωσης ολιγοσακχαρίτη υποδεικνύουν πρότυπα προσρόφησης Langmuir για (Α) XHE με mAb και (Β) A2XX με mAb.Οι αντίστοιχοι επίτοποι υποδεικνύουν τις δομές των εμπορικών ολιγοσακχαριτών που χρησιμοποιούνται ως υποστρώματα στον προσδιορισμό.
Η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων στοχευμένων στη γλυκάνη (γλυκοκωμική ανάλυση ή έλεγχος mAb με βάση την ELISA) είναι ένα ισχυρό εργαλείο για τον σε βάθος χαρακτηρισμό των περισσότερων από τις κύριες γλυκάνες του κυτταρικού τοιχώματος που συνθέτουν τη φυτική βιομάζα.Ωστόσο, η κλασική ανάλυση γλυκάνης χαρακτηρίζει μόνο μεγαλύτερες γλυκάνες κυτταρικού τοιχώματος, καθώς οι περισσότεροι ολιγοσακχαρίτες δεν ακινητοποιούνται αποτελεσματικά σε πλάκες ELISA.Σε αυτή τη μελέτη, το καλαμπόκι που είχε υποστεί προεπεξεργασία AFEX υδρολύθηκε ενζυματικά σε υψηλή περιεκτικότητα σε στερεά.Η ανάλυση σακχάρου χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της σύστασης των ανυπόφορων υδατανθράκων του κυτταρικού τοιχώματος στο προϊόν υδρόλυσης.Ωστόσο, η ανάλυση mAb μικρότερων ολιγοσακχαριτών σε προϊόντα υδρόλυσης υποτιμάται και απαιτούνται πρόσθετα εργαλεία για την αποτελεσματική ακινητοποίηση των ολιγοσακχαριτών σε πλάκες ELISA.
Αναφέρουμε εδώ μια νέα και αποτελεσματική μέθοδο ακινητοποίησης ολιγοσακχαρίτη για διαλογή mAb με συνδυασμό βιοτινυλίωσης ολιγοσακχαρίτη ακολουθούμενη από διαλογή ELISA σε επικαλυμμένες πλάκες NeutrAvidin™.Οι ακινητοποιημένοι βιοτινυλιωμένοι ολιγοσακχαρίτες έδειξαν επαρκή συγγένεια για το αντίσωμα ώστε να καταστεί δυνατή η ταχεία και αποτελεσματική ανίχνευση των ανυπόφορων ολιγοσακχαριτών.Η ανάλυση της σύνθεσης αυτών των επίμονων ολιγοσακχαριτών με βάση τη φασματομετρία μάζας επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα αυτής της νέας προσέγγισης στον ανοσολογικό έλεγχο.Έτσι, αυτές οι μελέτες καταδεικνύουν ότι ο συνδυασμός βιοτινυλίωσης ολιγοσακχαριτών και διαλογής ELISA με μονοκλωνικά αντισώματα στοχευμένα στη γλυκάνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση σταυροδεσμών σε ολιγοσακχαρίτες και μπορεί να εφαρμοστεί ευρέως σε άλλες βιοχημικές μελέτες που χαρακτηρίζουν τη δομή των ολιγοσακχαριτών.
Αυτή η μέθοδος προσδιορισμού προφίλ γλυκάνης με βάση τη βιοτίνη είναι η πρώτη αναφορά που μπορεί να διερευνήσει τους ανυπόφορους δεσμούς υδατανθράκων των διαλυτών ολιγοσακχαριτών στη φυτική βιομάζα.Αυτό βοηθά να κατανοήσουμε γιατί ορισμένα μέρη της βιομάζας είναι τόσο επίμονα όταν πρόκειται για την παραγωγή βιοκαυσίμων.Αυτή η μέθοδος καλύπτει ένα σημαντικό κενό στις μεθόδους ανάλυσης γλυκώματος και επεκτείνει την εφαρμογή της σε ένα ευρύτερο φάσμα υποστρωμάτων πέρα ​​από τους φυτικούς ολιγοσακχαρίτες.Στο μέλλον, ενδέχεται να χρησιμοποιήσουμε τη ρομποτική για βιοτινυλίωση και να χρησιμοποιήσουμε τη μέθοδο που έχουμε αναπτύξει για ανάλυση δειγμάτων υψηλής απόδοσης με χρήση ELISA.
Το άχυρο καλαμποκιού (CS) που αναπτύχθηκε από υβριδικούς σπόρους Pioneer 33A14 συγκομίστηκε το 2010 από την Kramer Farms στο Ray του Κολοράντο.Με την άδεια του ιδιοκτήτη της γης, αυτή η βιομάζα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έρευνα. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν ξηρά < 6% υγρασίας σε σάκους με φερμουάρ σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν ξηρά < 6% υγρασίας σε σάκους με φερμουάρ σε θερμοκρασία δωματίου. Образцы храниль сухими при влажности < 6% σε πακέτο με застежкой-молнией при комнатной температура. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν ξηρά σε υγρασία <6% σε σάκους με φερμουάρ σε θερμοκρασία δωματίου.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах со застежкой-молнией при комнатной температура со влажностью < 6%. Τα δείγματα αποθηκεύονται σε σακούλες με φερμουάρ σε θερμοκρασία δωματίου με υγρασία < 6%.Η μελέτη συμμορφώθηκε με τις τοπικές και εθνικές οδηγίες.Η ανάλυση σύνθεσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο NREL.Η σύνθεση βρέθηκε να περιέχει 31,4% γλυκάνη, 18,7% ξυλάνη, 3,3% αραβινάνη, 1,2% γαλακτάνη, 2,2% ακετύλιο, 14,3% λιγνίνη, 1,7% πρωτεΐνη και 13,4% τέφρα.
Το Cellic® CTec2 (138 mg πρωτεΐνης/ml, παρτίδα VCNI 0001) είναι ένα σύνθετο μείγμα κυτταράσης, β-γλυκοσιδάσης και Cellic® HTec2 (157 mg πρωτεΐνης/ml, παρτίδα VHN00001) από τη Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Το Multifect Pectinase® (72 mg πρωτεΐνης/mL), ένα σύνθετο μείγμα ενζύμων αποικοδόμησης πηκτίνης, δωρήθηκε από την DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Οι συγκεντρώσεις ενζυμικής πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με εκτίμηση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη (και αφαιρώντας τη συνεισφορά του μη πρωτεϊνικού αζώτου) χρησιμοποιώντας ανάλυση αζώτου Kjeldahl (μέθοδος AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Η γη διατόμων 545 αγοράστηκε από την EMD Millipore (Billerica, ΜΑ).Ενεργός άνθρακας (DARCO, κόκκοι 100 mesh), Avicel (PH-101), ξυλάνη οξιάς και όλες οι άλλες χημικές ουσίες αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Η προεπεξεργασία AFEX πραγματοποιήθηκε στο GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, ΗΠΑ).Η προκατεργασία πραγματοποιήθηκε στους 140°C για 15 λεπτά.46 χρόνος παραμονής σε αναλογία 1:1 άνυδρης αμμωνίας προς βιομάζα σε φόρτωση 60% (w/w) σε αντιδραστήρα παρτίδας πάγκου από ανοξείδωτο χάλυβα (Parr Instruments Company).Χρειάστηκαν 30 λεπτά.Ο αντιδραστήρας έφτασε στους 140°C και η αμμωνία απελευθερώθηκε γρήγορα, επιτρέποντας στη βιομάζα να επιστρέψει γρήγορα σε θερμοκρασία δωματίου.Η σύνθεση του προκατεργασμένου καλαμποκιού με AFEX (ACS) ήταν παρόμοια με εκείνη του μη επεξεργασμένου καλαμποκιού (UT-CS).
Παρασκευάστηκε ACSH υψηλών στερεών 25% (β/β) (περίπου 8% φόρτιση δεξτράνης) ως πρώτη ύλη για μεγάλης κλίμακας παραγωγή ολιγοσακχαριτών.Η ενζυματική υδρόλυση του ACS πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μίγμα ενζύμων του εμπορίου που περιλαμβάνει Cellic® Ctec2 10 mg πρωτεΐνης/g γλυκάνης (σε προεπεξεργασμένη βιομάζα), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg πρωτεΐνης/g γλυκάνης και Multifect Pectinase (Genencor Inc, ΗΠΑ).).), 5 mg πρωτεΐνης/g δεξτράνης.Διεξήχθη ενζυματική υδρόλυση σε βιοαντιδραστήρα 5 λίτρων με όγκο εργασίας 3 λίτρα, ρΗ 4,8, 50°C και 250 rpm.Μετά από υδρόλυση για 96 ώρες, το υδρόλυμα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στις 6000 rpm για 30 λεπτά και στη συνέχεια στις 14000 rpm για 30 λεπτά για να απομακρυνθούν τα μη υδρολυμένα στερεά.Το υδρόλυμα στη συνέχεια υποβλήθηκε σε στείρα διήθηση μέσω ποτηριού ζέσεως φίλτρου 0,22 mm.Το διηθημένο υδρόλυμα αποθηκεύτηκε σε αποστειρωμένες φιάλες στους 4°C και στη συνέχεια κλασματοποιήθηκε σε άνθρακα.
Ανάλυση της σύνθεσης δειγμάτων βιομάζας με βάση το εκχύλισμα σύμφωνα με τις διαδικασίες εργαστηριακής ανάλυσης NREL: προετοιμασία δειγμάτων για ανάλυση σύνθεσης (NREL/TP-510-42620) και προσδιορισμός δομικών υδατανθράκων και λιγνίνης στη βιομάζα (NREL/TP-510 – 42618)47.
Η ανάλυση ολιγοσακχαρίτη του ρεύματος του προϊόντος υδρόλυσης διεξήχθη σε κλίμακα 2 ml χρησιμοποιώντας μέθοδο όξινης υδρόλυσης με βάση αυτόκλειστο.Αναμείξτε το δείγμα του προϊόντος υδρόλυσης με 69,7 μl θειικού οξέος 72% σε σωλήνα καλλιέργειας 10 ml με βιδωτό καπάκι και επωάστε για 1 ώρα σε πάγκο στους 121 °C, ψύξτε σε πάγο και διηθήστε σε ένα φιαλίδιο υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC).Η συγκέντρωση των ολιγοσακχαριτών προσδιορίστηκε αφαιρώντας τη συγκέντρωση των μονοσακχαριτών στο μη υδρολυμένο δείγμα από τη συνολική συγκέντρωση σακχάρου στο δείγμα που έχει υδρολυθεί με οξύ.
Οι συγκεντρώσεις γλυκόζης, ξυλόζης και αραβινόζης στην υδρολυμένη με οξύ βιομάζα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα Shimadzu HPLC εξοπλισμένο με αυτόματο δειγματολήπτη, θερμαντήρα στήλης, ισοκρατική αντλία και ανιχνευτή δείκτη διάθλασης σε στήλη Bio-Rad Aminex HPX-87H.Η στήλη διατηρήθηκε στους 50°C και εκλούστηκε με 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 σε νερό.ροή.
Το υπερκείμενο υδρόλυμα αραιώθηκε και αναλύθηκε για περιεκτικότητα μονομερούς και ολιγοσακχαρίτη.Τα μονομερή σάκχαρα που ελήφθησαν μετά από ενζυματική υδρόλυση αναλύθηκαν με HPLC εξοπλισμένη με στήλη Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P και στήλη φύλαξης τέφρας.Η θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε στους 80°C, ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε νερό με ρυθμό ροής 0,6 ml/min.Οι ολιγοσακχαρίτες προσδιορίστηκαν με υδρόλυση σε αραιό οξύ στους 121°C σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται στις παραφ.41, 48, 49.
Η ανάλυση σακχαρίτη διεξήχθη σε ακατέργαστα, προκατεργασμένα με AFEX και σε όλα τα μη υδρολυμένα υπολείμματα βιομάζας (συμπεριλαμβανομένης της παραγωγής εκχυλισμάτων σειριακών κυτταρικών τοιχωμάτων και της διαλογής τους mAb) χρησιμοποιώντας προηγουμένως περιγραφείσες διαδικασίες 27, 43, 50, 51.Για ανάλυση γλυκώματος, αδιάλυτα στην αλκοόλη υπολείμματα υλικού φυτικού κυτταρικού τοιχώματος παρασκευάζονται από υπολείμματα βιομάζας και υποβάλλονται σε σειριακή εκχύλιση με ολοένα και πιο επιθετικά αντιδραστήρια όπως οξαλικό αμμώνιο (50 mM), ανθρακικό νάτριο (50 mM και 0,5% w/v), CON.(1Μ και 4Μ, αμφότερα με 1% β/ο βοροϋδρίδιο του νατρίου) και χλωριώδες οξύ όπως περιγράφηκε προηγουμένως52,53.Τα εκχυλίσματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ELISA έναντι ενός συμπλόκου πάνελ mAb50 που κατευθύνεται στη γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος και οι αντιδράσεις δέσμευσης mAb παρουσιάστηκαν ως χάρτης θερμότητας.Τα mAbs που στοχεύουν τη γλυκάνη των φυτικών κυτταρικών τοιχωμάτων αγοράστηκαν από αποθέματα εργαστηρίου (σειρές CCRC, JIM και MAC).
Βιοτινυλίωση ολιγοσακχαριτών σε ένα στάδιο.Η σύζευξη των υδατανθράκων με βιοτίνη-LC-υδραζίδιο πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη διαδικασία.Βιοτίνη-LC-υδραζίδιο (4,6 mg/12 μmol) διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, 70 μl) με έντονη ανάδευση και θέρμανση στους 65° C για 1 λεπτό.Προστέθηκε παγόμορφο οξικό οξύ (30 μΙ) και το μίγμα χύθηκε σε κυανοβοροϋδρίδιο του νατρίου (6,4 mg/100 μmol) και διαλύθηκε πλήρως μετά από θέρμανση στους 65°C για περίπου 1 λεπτό.Στη συνέχεια, από 5 έως 8 μl του μίγματος της αντίδρασης προστέθηκαν στον ξηρό ολιγοσακχαρίτη (1-100 nmol) για να ληφθεί 10πλάσια ή μεγαλύτερη μοριακή περίσσεια της ετικέτας πάνω από το αναγωγικό άκρο.Η αντίδραση διεξήχθη στους 65°C για 2 ώρες, μετά τις οποίες τα δείγματα καθαρίστηκαν αμέσως.Δεν χρησιμοποιήθηκε κυανοβοροϋδρίδιο του νατρίου στα πειράματα σήμανσης χωρίς αναγωγή και τα δείγματα αντέδρασαν στους 65°C για 2,5 ώρες.
Επικάλυψη και πλύση με ELISA δειγμάτων βιοτινυλιωμένων ολιγοσακχαριτών.25 μl βιοτινυλιωμένων δειγμάτων (100 μl από κάθε συμπυκνωμένο δείγμα αραιωμένο σε 5 ml ρυθμιστικού διαλύματος Tris 0,1 Μ (TBS)) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο της επικαλυμμένης με αβιδίνη πλάκας.Τα φρεάτια ελέγχου επικαλύφθηκαν με 50 μl βιοτίνης σε συγκέντρωση 10 μg/ml σε 0,1 Μ TBS.Απιονισμένο νερό χρησιμοποιήθηκε ως επίστρωση για τυφλό μετρήσεις.Το δισκίο επωάστηκε για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι.Πλύνετε το πιάτο 3 φορές με 0,1% αποβουτυρωμένο γάλα σε 0,1 M TBS χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα αρ.11 για Grenier διαμέρισμα 3Α.
Προσθήκη και πλύση πρωτογενών αντισωμάτων.Προσθέστε 40 µl πρωτογενούς αντισώματος σε κάθε φρεάτιο.Επωάστε τη μικροπλάκα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι.Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές με 0,1% γάλα σε 0,1 Μ TBS χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα πλύσης #11 για το Grenier Flat 3Α.
Προσθέστε δευτερεύον αντίσωμα και πλύνετε.Προσθέστε 50 μl δευτερογενούς αντισώματος ποντικού/ποντικού (αραιωμένο 1:5000 σε 0,1% γάλα σε 0,1 M TBS) σε κάθε φρεάτιο.Επωάστε τη μικροπλάκα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι.Οι μικροπλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν 5 φορές με 0,1% γάλα σε 0,1 Μ TBS χρησιμοποιώντας πρόγραμμα πλύσης πλακών Grenier Flat 5Α #12.
Προσθήκη υποστρώματος.Προσθέστε 50 µl 3,3',5,5'-τετραμεθυλοβενζιδίνης (TMB) στο υπόστρωμα βάσης (προσθέτοντας 2 σταγόνες ρυθμιστικού διαλύματος, 3 σταγόνες TMB, 2 σταγόνες υπεροξείδιο του υδρογόνου σε 15 ml απιονισμένου νερού).Προετοιμάστε το υπόστρωμα TMB.και στροβιλίζεται πριν από τη χρήση).Επωάστε τη μικροπλάκα σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά.Στο σκοτάδι.
Ολοκληρώστε το βήμα και διαβάστε το tablet.Προσθέστε 50 µl θειικού οξέος 1 Ν σε κάθε φρεάτιο και καταγράψτε την απορρόφηση από 450 έως 655 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA.
Παρασκευάστε διαλύματα 1 mg/ml αυτών των αναλυτών σε απιονισμένο νερό: αραβινόζη, ραμνόζη, φουκόζη, ξυλόζη, γαλακτουρονικό οξύ (GalA), γλυκουρονικό οξύ (GlcA), μαννόζη, γλυκόζη, γαλακτόζη, λακτόζη, Ν-ακετυλομαννοζαμίνη (manNAc.glucosam),(glcNAc), Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη (galNAc), ινοσιτόλη (εσωτερικό πρότυπο).Παρασκευάστηκαν δύο πρότυπα προσθέτοντας τα διαλύματα σακχάρου 1 mg/mL που φαίνονται στον Πίνακα 1. Τα δείγματα καταψύχονται και λυοφιλοποιούνται στους -80°C μέχρι να απομακρυνθεί όλο το νερό (συνήθως περίπου 12-18 ώρες).
Προσθέστε 100–500 µg δείγματος σε σωλήνες βιδωτού καπακιού σε αναλυτικό ζυγό.Καταγράψτε το ποσό που προστέθηκε.Είναι καλύτερο να διαλύσετε το δείγμα σε μια συγκεκριμένη συγκέντρωση διαλύτη και να το προσθέσετε στο σωληνάριο ως υγρό κλάσμα.Χρησιμοποιήστε 20 μl ινοσιτόλης 1 mg/ml ως εσωτερικό πρότυπο για κάθε σωληνάριο δείγματος.Η ποσότητα του εσωτερικού προτύπου που προστίθεται στο δείγμα πρέπει να είναι ίδια με την ποσότητα του εσωτερικού προτύπου που προστίθεται στο πρότυπο σωληνάριο.
Προσθέστε 8 ml άνυδρης μεθανόλης σε ένα βιδωτό φιαλίδιο.Στη συνέχεια, 4 ml διαλύματος 3 Ν. μεθανολικού HCl, πωματίζονται και ανακινούνται.Αυτή η διαδικασία δεν χρησιμοποιεί νερό.
Προσθέστε 500 µl διαλύματος μεθανόλης 1 M HCl στα δείγματα ολιγοσακχαριτών και στα τυπικά σωληνάρια TMS.Τα δείγματα επωάστηκαν όλη τη νύχτα (168 ώρες) στους 80°C σε ένα θερμικό μπλοκ.Ξηράνετε το προϊόν μεθανόλυσης σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας πολλαπλή ξήρανσης.Προσθέστε 200 µl MeOH και στεγνώστε ξανά.Αυτή η διαδικασία επαναλαμβάνεται δύο φορές.Προσθέστε 200 μl μεθανόλης, 100 μl πυριδίνης και 100 μl οξικού ανυδρίτη στο δείγμα και ανακατέψτε καλά.Τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά.και αποξηραμένο.Προσθέστε 200 µl μεθανόλης και στεγνώστε ξανά.
Προσθέστε 200 µl Tri-Sil και καλυμμένο με θερμότητα σωλήνα για 20 λεπτά.80°C, στη συνέχεια ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου.Χρησιμοποιήστε μια πολλαπλή ξήρανσης για να στεγνώσετε περαιτέρω το δείγμα σε όγκο περίπου 50 μl.Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι δεν αφήσαμε τα δείγματα να στεγνώσουν εντελώς.
Προσθέστε 2 ml εξανίου και ανακατέψτε καλά με vortex.Γεμίστε τις άκρες των πιπετών Παστέρ (5-8 mm) με ένα κομμάτι υαλοβάμβακα εισάγοντας το υαλοβάμβακα πάνω από μια πιπέτα διαμέτρου 5-3/4 ίντσας.Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 3000 g για 2 λεπτά.Οποιαδήποτε αδιάλυτα υπολείμματα κατακρημνίζονται.Ξηράνετε το δείγμα στα 100-150 μl.Ένας όγκος περίπου 1 μl εγχύθηκε στο GC-MS σε αρχική θερμοκρασία 80 °C και αρχικό χρόνο 2,0 λεπτά (Πίνακας 2).