Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, σας συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Νέες ανοσολογικές και φασματομετρικές μέθοδοι μάζας για την πολύπλοκη ανάλυση επίμονων ολιγοσακχαριτών σε καλαμποκόσπορο προεπεξεργασμένο με AFEX. Η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα είναι μια βιώσιμη εναλλακτική λύση στα ορυκτά καύσιμα και χρησιμοποιείται ευρέως για την ανάπτυξη βιοτεχνολογιών για την παραγωγή προϊόντων όπως τρόφιμα, ζωοτροφές, καύσιμα και χημικά. Το κλειδί για αυτές τις τεχνολογίες είναι η ανάπτυξη ανταγωνιστικών από πλευράς κόστους διεργασιών για τη μετατροπή σύνθετων υδατανθράκων που υπάρχουν στα κυτταρικά τοιχώματα των φυτών σε απλά σάκχαρα όπως γλυκόζη, ξυλόζη και αραβινόζη. Επειδή η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα είναι πολύ επίμονη, πρέπει να υποβληθεί σε θερμοχημικές επεξεργασίες (π.χ., απολέπιση ινών αμμωνίας (AFEX), αραιά οξέα (DA), ιοντικά υγρά (IL)) και βιολογικές επεξεργασίες (π.χ., ενζυμική υδρόλυση και μικροβιακή ζύμωση) σε συνδυασμό για να ληφθεί το επιθυμητό προϊόν. . Ωστόσο, όταν χρησιμοποιούνται εμπορικά μυκητιακά ένζυμα στη διαδικασία υδρόλυσης, μόνο το 75-85% των διαλυτών σακχάρων που σχηματίζονται είναι μονοσακχαρίτες και το υπόλοιπο 15-25% είναι διαλυτοί, δυσεπίλυτοι ολιγοσακχαρίτες, οι οποίοι δεν είναι πάντα διαθέσιμοι στους μικροοργανισμούς. Προηγουμένως, έχουμε απομονώσει και καθαρίσει με επιτυχία διαλυτούς επίμονους ολιγοσακχαρίτες χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό χρωματογραφίας διαχωρισμού και αποκλεισμού μεγέθους με άνθρακα και γης διατόμων, και επίσης διερευνήσαμε τις ιδιότητες αναστολής ενζύμων τους. Διαπιστώσαμε ότι οι ολιγοσακχαρίτες που περιέχουν υποκαταστάσεις μεθυλιωμένου ουρονικού οξέος υψηλότερου βαθμού πολυμερισμού (DP) είναι πιο δύσκολο να υποστούν επεξεργασία με εμπορικά μείγματα ενζύμων από τους ολιγοσακχαρίτες χαμηλού DP και τους ουδέτερους ολιγοσακχαρίτες. Εδώ αναφέρουμε τη χρήση αρκετών πρόσθετων μεθόδων, συμπεριλαμβανομένης της δημιουργίας προφίλ γλυκάνης χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) ειδικά για τις γλυκάνες φυτικής βιομάζας για τον χαρακτηρισμό δεσμών γλυκάνης σε κυτταρικά τοιχώματα φυτών και ενζυματικά υδρολύματα, ιονισμό εκρόφησης με λέιζερ υποβοηθούμενο από μήτρα, φασματομετρία μάζας χρόνου πτήσης. . Το MALDI-TOF-MS) χρησιμοποιεί διαγνωστικές κορυφές που λαμβάνονται με πληροφορίες για τη δομή και λαμβάνονται με φασματοσκοπία μετά από δευτερογενή αποσύνθεση αρνητικών ιόντων, αέρια χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας (GC-MS) για τον χαρακτηρισμό δεσμών ολιγοσακχαριτών με και χωρίς παραγοντοποίηση. Λόγω του μικρού μεγέθους των ολιγοσακχαριτών (DP 4-20), αυτά τα μόρια είναι δύσκολο να χρησιμοποιηθούν για σύνδεση και χαρακτηρισμό mAb. Για να ξεπεράσουμε αυτό το πρόβλημα, εφαρμόσαμε μια νέα μέθοδο ακινητοποίησης ολιγοσακχαριτών βασισμένη στη σύζευξη βιοτίνης, η οποία επισήμανε με επιτυχία την πλειονότητα των διαλυτών ολιγοσακχαριτών χαμηλού DP στην επιφάνεια της μικροπλάκας, η οποία στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε σε ένα σύστημα mAb υψηλής απόδοσης για ειδική ανάλυση σύνδεσης. Αυτή η νέα μέθοδος θα διευκολύνει την ανάπτυξη πιο προηγμένων δοκιμασιών γλυκομίσης υψηλής απόδοσης στο μέλλον, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό ολιγοσακχαριτών που υπάρχουν σε βιοδείκτες για διαγνωστικούς σκοπούς.
Η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα, που αποτελείται από γεωργικά, δασικά, χόρτα και ξυλώδη υλικά, αποτελεί πιθανή πρώτη ύλη για την παραγωγή βιολογικών προϊόντων, συμπεριλαμβανομένων τροφίμων, ζωοτροφών, καυσίμων και χημικών προδρόμων για την παραγωγή προϊόντων υψηλότερης αξίας1. Οι υδατάνθρακες (όπως η κυτταρίνη και η ημικυτταρίνη) που υπάρχουν στα κυτταρικά τοιχώματα των φυτών αποπολυμερίζονται σε μονοσακχαρίτες μέσω χημικής επεξεργασίας και βιομετασχηματισμού (όπως ενζυματική υδρόλυση και μικροβιακή ζύμωση). Οι συνήθεις προεπεξεργασίες περιλαμβάνουν την επέκταση ινών αμμωνίας (AFEX), το αραιό οξύ (DA), το ιοντικό υγρό (IL) και την έκρηξη ατμού (SE), οι οποίες χρησιμοποιούν έναν συνδυασμό χημικών ουσιών και θερμότητας για τη μείωση της παραγωγής λιγνοκυτταρίνης ανοίγοντας τα κυτταρικά τοιχώματα των φυτών3,4. Η ενζυμική υδρόλυση πραγματοποιείται σε υψηλό φορτίο στερεών χρησιμοποιώντας εμπορικά ενεργά ένζυμα που περιέχουν υδατάνθρακες (CAZymes) και μικροβιακή ζύμωση χρησιμοποιώντας διαγονιδιακές ζύμες ή βακτήρια για την παραγωγή βιολογικών καυσίμων και χημικών ουσιών6.
Τα CAZymes στα εμπορικά ένζυμα αποτελούνται από ένα σύνθετο μείγμα ενζύμων που διασπούν συνεργιστικά τους σύνθετους δεσμούς υδατανθράκων-σακχάρου για να σχηματίσουν μονοσακχαρίτες2,7. Όπως αναφέραμε νωρίτερα, το σύνθετο δίκτυο αρωματικών πολυμερών λιγνίνης με υδατάνθρακες τα καθιστά εξαιρετικά δύσχρηστα, γεγονός που οδηγεί σε ατελή μετατροπή σακχάρου, συσσωρεύοντας 15-25% ολιγοσακχαριτών φύλου που δεν παράγονται κατά την ενζυμική υδρόλυση της προεπεξεργασμένης βιομάζας. Αυτό είναι ένα κοινό πρόβλημα με διάφορες μεθόδους προεπεξεργασίας βιομάζας. Μερικοί λόγοι για αυτό το σημείο συμφόρησης περιλαμβάνουν την αναστολή των ενζύμων κατά την υδρόλυση ή την απουσία ή τα χαμηλά επίπεδα βασικών ενζύμων που απαιτούνται για τη διάσπαση των δεσμών σακχάρου στη φυτική βιομάζα. Η κατανόηση της σύνθεσης και των δομικών χαρακτηριστικών των σακχάρων, όπως οι δεσμοί σακχάρου στους ολιγοσακχαρίτες, θα μας βοηθήσει να βελτιώσουμε τη μετατροπή σακχάρου κατά την υδρόλυση, καθιστώντας τις βιοτεχνολογικές διεργασίες ανταγωνιστικές από πλευράς κόστους με τα προϊόντα που προέρχονται από το πετρέλαιο.
Ο προσδιορισμός της δομής των υδατανθράκων είναι δύσκολος και απαιτεί συνδυασμό μεθόδων όπως η υγρή χρωματογραφία (LC)11,12, η ​​φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR)13, η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (CE)14,15,16 και η φασματομετρία μάζας (MS)17. ,δεκαοκτώ. Οι μέθοδοι MS όπως η φασματομετρία μάζας χρόνου πτήσης με εκρόφηση και ιονισμό με λέιζερ χρησιμοποιώντας μια μήτρα (MALDI-TOF-MS) είναι μια ευέλικτη μέθοδος για την αναγνώριση δομών υδατανθράκων. Πρόσφατα, η διαδοχική MS με επαγόμενη από σύγκρουση διάσπαση (CID) των προϊόντων προσθήκης ιόντων νατρίου έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτερα για την αναγνώριση δακτυλικών αποτυπωμάτων που αντιστοιχούν σε θέσεις προσκόλλησης ολιγοσακχαριτών, ανωμερικές διαμορφώσεις, αλληλουχίες και θέσεις διακλάδωσης 20, 21.
Η ανάλυση γλυκάνης είναι ένα εξαιρετικό εργαλείο για την εις βάθος αναγνώριση των δεσμών υδατανθράκων22. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) που κατευθύνονται στη γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος των φυτών ως ανιχνευτές για την κατανόηση των σύνθετων υδατανθρακικών δεσμών. Περισσότερα από 250 mAbs είναι διαθέσιμα παγκοσμίως, σχεδιασμένα έναντι διαφόρων γραμμικών και διακλαδισμένων ολιγοσακχαριτών χρησιμοποιώντας διάφορους σακχαρίτες24. Αρκετά mAbs έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τον χαρακτηρισμό της δομής, της σύνθεσης και των τροποποιήσεων του κυτταρικού τοιχώματος των φυτών, καθώς υπάρχουν σημαντικές διαφορές ανάλογα με τον τύπο του φυτικού κυττάρου, το όργανο, την ηλικία, το στάδιο ανάπτυξης και το περιβάλλον ανάπτυξης25,26. Πιο πρόσφατα, αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί για την κατανόηση των πληθυσμών κυστιδίων σε φυτικά και ζωικά συστήματα και των αντίστοιχων ρόλων τους στη μεταφορά γλυκάνης, όπως προσδιορίζεται από υποκυτταρικούς δείκτες, αναπτυξιακά στάδια ή περιβαλλοντικά ερεθίσματα, και για τον προσδιορισμό της ενζυματικής δραστηριότητας. Μερικές από τις διαφορετικές δομές γλυκανών και ξυλανών που έχουν εντοπιστεί περιλαμβάνουν την πηκτίνη (P), την ξυλάνη (X), τη μαννάνη (M), τις ξυλογλυκάνες (XylG), τις γλυκάνες μικτών δεσμών (MLG), την αραβινοξυλάνη (ArbX), τη γαλακτομαννάνη (GalG), το γλυκουρονικό οξύ-αραβινοξυλάνη (GArbX) και την αραβινο-γαλακτάνη (ArbG)29.
Ωστόσο, παρά όλες αυτές τις ερευνητικές προσπάθειες, μόνο λίγες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στη φύση της συσσώρευσης ολιγοσακχαριτών κατά την υδρόλυση υψηλού φορτίου στερεών (HSL), συμπεριλαμβανομένης της απελευθέρωσης ολιγοσακχαριτών, των αλλαγών στο μήκος της ολιγομερούς αλυσίδας κατά την υδρόλυση, διαφόρων πολυμερών χαμηλού DP και των καμπυλών κατανομής τους 30,31,32. Εν τω μεταξύ, αν και η ανάλυση γλυκανών έχει αποδειχθεί χρήσιμο εργαλείο για μια ολοκληρωμένη ανάλυση της δομής των γλυκανών, είναι δύσκολο να αξιολογηθούν οι υδατοδιαλυτοί ολιγοσακχαρίτες χαμηλού DP χρησιμοποιώντας μεθόδους αντισωμάτων. Μικρότεροι ολιγοσακχαρίτες DP με μοριακό βάρος μικρότερο από 5-10 kDa δεν συνδέονται με πλάκες ELISA 33, 34 και απομακρύνονται με έκπλυση πριν από την προσθήκη αντισωμάτων.
Εδώ, για πρώτη φορά, παρουσιάζουμε μια δοκιμασία ELISA σε πλάκες επικαλυμμένες με αβιδίνη χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα, συνδυάζοντας μια διαδικασία βιοτινυλίωσης ενός σταδίου για διαλυτούς ανθεκτικούς ολιγοσακχαρίτες με ανάλυση γλυκομερών. Η προσέγγισή μας στην ανάλυση γλυκομερών επικυρώθηκε με ανάλυση συμπληρωματικών ολιγοσακχαριτικών δεσμών με βάση MALDI-TOF-MS και GC-MS χρησιμοποιώντας τριμεθυλοσιλυλική (TMS) παραγώγιση υδρολυμένων συνθέσεων σακχάρων. Αυτή η καινοτόμος προσέγγιση μπορεί να αναπτυχθεί ως μέθοδος υψηλής απόδοσης στο μέλλον και να βρει ευρύτερη εφαρμογή στη βιοϊατρική έρευνα35.
Οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ενζύμων και των αντισωμάτων, όπως η γλυκοζυλίωση,36 επηρεάζουν τη βιολογική τους δράση. Για παράδειγμα, οι αλλαγές στη γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών του ορού παίζουν σημαντικό ρόλο στη φλεγμονώδη αρθρίτιδα και οι αλλαγές στη γλυκοζυλίωση χρησιμοποιούνται ως διαγνωστικοί δείκτες37. Διάφορες γλυκάνες έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία ότι εμφανίζονται εύκολα σε μια ποικιλία ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων χρόνιων φλεγμονωδών ασθενειών του γαστρεντερικού σωλήνα και του ήπατος, ιογενών λοιμώξεων, καρκίνου των ωοθηκών, του μαστού και του προστάτη38,39,40. Η κατανόηση της δομής των γλυκανών χρησιμοποιώντας μεθόδους ELISA γλυκανών που βασίζονται σε αντισώματα θα παρέχει πρόσθετη εμπιστοσύνη στη διάγνωση ασθενειών χωρίς τη χρήση σύνθετων μεθόδων MS.
Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι οι επίμονοι ολιγοσακχαρίτες παρέμειναν μη υδρολυμένοι μετά την προεπεξεργασία και την ενζυματική υδρόλυση (Σχήμα 1). Στην προηγουμένως δημοσιευμένη εργασία μας, αναπτύξαμε μια μέθοδο εκχύλισης στερεάς φάσης με ενεργό άνθρακα για την απομόνωση ολιγοσακχαριτών από προεπεξεργασμένο με AFEX υδρολυμένο καλαμπόκι (ACSH)8. Μετά την αρχική εκχύλιση και διαχωρισμό, οι ολιγοσακχαρίτες κλασματώθηκαν περαιτέρω με χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC) και συλλέχθηκαν κατά σειρά μοριακού βάρους. Τα μονομερή και τα ολιγομερή ζάχαρης που απελευθερώθηκαν από διάφορες προεπεξεργασίες αναλύθηκαν με ανάλυση σύνθεσης ζάχαρης. Κατά τη σύγκριση της περιεκτικότητας σε ολιγομερή ζάχαρης που ελήφθησαν με διάφορες μεθόδους προεπεξεργασίας, η παρουσία επίμονων ολιγοσακχαριτών είναι ένα κοινό πρόβλημα στη μετατροπή της βιομάζας σε μονοσακχαρίτες και μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της απόδοσης ζάχαρης κατά τουλάχιστον 10-15% και ακόμη και έως 18%. ΗΠΑ. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για περαιτέρω παραγωγή κλασμάτων ολιγοσακχαριτών σε μεγάλη κλίμακα. Το προκύπτον ACH και τα επόμενα κλάσματά του με διαφορετικά μοριακά βάρη χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματικό υλικό για τον χαρακτηρισμό των ολιγοσακχαριτών σε αυτή την εργασία.
Μετά την προεπεξεργασία και την ενζυμική υδρόλυση, οι επίμονοι ολιγοσακχαρίτες παρέμειναν μη υδρολυμένοι. Εδώ (Α) παρουσιάζεται μια μέθοδος διαχωρισμού ολιγοσακχαριτών στην οποία οι ολιγοσακχαρίτες απομονώνονται από υδρολυμένο καλαμπόκι (ACSH) που έχει υποστεί προεπεξεργασία με AFEX χρησιμοποιώντας μια συσσωρευμένη κλίνη ενεργού άνθρακα και γης διατόμων. (Β) Μέθοδος διαχωρισμού ολιγοσακχαριτών. Οι ολιγοσακχαρίτες διαχωρίστηκαν περαιτέρω με χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC). (Γ) Μονομερή και ολιγομερή σακχαριτών που απελευθερώθηκαν από διάφορες προεπεξεργασίες (αραιωμένο οξύ: DA, ιοντικό υγρό: IL και AFEX). Συνθήκες ενζυμικής υδρόλυσης: υψηλή περιεκτικότητα σε στερεά 25% (w/w) (περίπου 8% φόρτωση γλυκάνης), υδρόλυση 96 ωρών, φόρτωση εμπορικού ενζύμου 20 mg/g (αναλογία Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) και (Δ) Μονομερή και ολιγομερή ζάχαρης γλυκόζης, ξυλόζης και αραβινόζης που απελευθερώθηκαν από καλαμπόκι (ACS) που έχει υποστεί προεπεξεργασία με AFEX.
Η ανάλυση γλυκανών έχει αποδειχθεί χρήσιμο εργαλείο για μια ολοκληρωμένη δομική ανάλυση γλυκανών σε εκχυλίσματα που απομονώνονται από στερεά υπολείμματα βιομάζας. Ωστόσο, οι υδατοδιαλυτοί σακχαρίτες υποεκπροσωπούνται χρησιμοποιώντας αυτήν την παραδοσιακή μέθοδο41 επειδή οι ολιγοσακχαρίτες χαμηλού μοριακού βάρους είναι δύσκολο να ακινητοποιηθούν σε πλάκες ELISA και ξεπλένονται πριν από την προσθήκη αντισωμάτων. Επομένως, για τη δέσμευση και τον χαρακτηρισμό των αντισωμάτων, χρησιμοποιήθηκε μια μέθοδος βιοτινυλίωσης ενός σταδίου για την επικάλυψη διαλυτών, μη συμμορφούμενων ολιγοσακχαριτών σε πλάκες ELISA επικαλυμμένες με αβιδίνη. Αυτή η μέθοδος δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας το προηγουμένως παραγόμενο ACSH μας και ένα κλάσμα με βάση το μοριακό του βάρος (ή βαθμό πολυμερισμού, DP). Χρησιμοποιήθηκε βιοτινυλίωση ενός σταδίου για την αύξηση της συγγένειας δέσμευσης ολιγοσακχαριτών προσθέτοντας βιοτίνη-LC-υδραζίδιο στο αναγωγικό άκρο του υδατάνθρακα (Εικ. 2). Σε διάλυμα, η ομάδα ημιακετάλης στο αναγωγικό άκρο αντιδρά με την ομάδα υδραζιδίου της βιοτίνης-LC-υδραζιδίου για να σχηματίσει έναν δεσμό υδραζόνης. Παρουσία του αναγωγικού παράγοντα NaCNBH3, ο δεσμός υδραζόνης ανάγεται σε ένα σταθερό βιοτινυλιωμένο τελικό προϊόν. Με την τροποποίηση του άκρου μείωσης της ζάχαρης, κατέστη δυνατή η σύνδεση ολιγοσακχαριτών χαμηλού DP σε πλάκες ELISA, και στη μελέτη μας αυτό έγινε σε πλάκες επικαλυμμένες με αβιδίνη χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) στοχευμένα σε γλυκάνη.
Διαλογή μονοκλωνικών αντισωμάτων με βάση την ELISA για βιοτινυλιωμένους ολιγοσακχαρίτες. Εδώ (Α) συνδυάζεται η βιοτινυλίωση ολιγοσακχαριτών και η επακόλουθη διαλογή ELISA με μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) στοχευμένα σε γλυκάνες σε πλάκες επικαλυμμένες με NeutrAvidin και (Β) παρουσιάζεται μια διαδικασία ενός σταδίου για τη βιοτινυλίωση των προϊόντων αντίδρασης.
Στη συνέχεια, προστέθηκαν πλάκες επικαλυμμένες με αβιδίνη με αντισώματα συζευγμένα με ολιγοσακχαρίτες στα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα και πλύθηκαν σε φωτοευαίσθητο και χρονοευαίσθητο μέσο. Μετά την ολοκλήρωση της σύνδεσης των αντισωμάτων, προστέθηκε υπόστρωμα TMB για την επώαση της πλάκας. Η αντίδραση διακόπηκε τελικά με θειικό οξύ. Οι επωασμένες πλάκες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA για να προσδιοριστεί η ισχύς σύνδεσης κάθε αντισώματος για την ανίχνευση διασύνδεσης ειδικής για τα αντισώματα. Για λεπτομέρειες και παραμέτρους του πειράματος, ανατρέξτε στην αντίστοιχη ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι».
Δείχνουμε τη χρησιμότητα αυτής της πρόσφατα αναπτυγμένης μεθόδου για συγκεκριμένες εφαρμογές χαρακτηρίζοντας τους διαλυτούς ολιγοσακχαρίτες που υπάρχουν στο ACSH καθώς και σε ακατέργαστα και καθαρισμένα κλάσματα ολιγοσακχαριτών που απομονώνονται από λιγνοκυτταρινικά υδρολύματα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, οι πιο συνηθισμένες ξυλάνες με υποκατάσταση επιτόπου που αναγνωρίζονται στο ACSH χρησιμοποιώντας μεθόδους δοκιμασίας βιοακυλιωμένων γλυκωμάτων είναι συνήθως οι ουρονικές (U) ή μεθυλουρονικές (MeU) και πηκτικές αραβινογαλακτάνες. Οι περισσότερες από αυτές βρέθηκαν επίσης στην προηγούμενη μελέτη μας σχετικά με την ανάλυση γλυκανών μη υδρολυμένων στερεών (UHS)43.
Ανίχνευση ανθεκτικών ολιγοσακχαριτικών επιτόπων χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται στη γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος. Το «ουδέτερο» κλάσμα είναι το κλάσμα ACN και το «όξινο» κλάσμα είναι το κλάσμα FA. Τα φωτεινότερα κόκκινα στον θερμικό χάρτη υποδεικνύουν υψηλότερη περιεκτικότητα σε επίτοπα και τα φωτεινότερα μπλε υποδεικνύουν κενό φόντο. Οι τιμές χρώματος στην κλίμακα βασίζονται σε ακατέργαστες τιμές OD για σκευάσματα N=2. Τα κύρια επίτοπα που αναγνωρίζονται από τα αντισώματα εμφανίζονται στα δεξιά.
Αυτές οι μη κυτταρινικές δομές δεν μπορούσαν να διασπαστούν από τις πιο κοινές κυτταρινάσες και ημικυτταρινάσες στο δοκιμασμένο εμπορικό μείγμα ενζύμων, το οποίο περιλαμβάνει τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα εμπορικά ένζυμα. Επομένως, απαιτούνται νέα βοηθητικά ένζυμα για την υδρόλυσή τους. Χωρίς τα απαραίτητα μη κυτταρινικά βοηθητικά ένζυμα, αυτοί οι μη κυτταρινικοί δεσμοί εμποδίζουν την πλήρη μετατροπή σε μονοσακχαρίτες, ακόμη και αν τα μητρικά τους πολυμερή σακχάρου υδρολύονται εκτενώς σε μικρότερα θραύσματα και διαλύονται χρησιμοποιώντας εμπορικά μείγματα ενζύμων.
Περαιτέρω μελέτη της κατανομής του σήματος και της ισχύος δέσμευσής του έδειξε ότι οι επίτοποι σύνδεσης ήταν χαμηλότεροι στα κλάσματα σακχάρων με υψηλό DP (A, B, C, DP έως 20+) από ό,τι στα κλάσματα με χαμηλό DP (D, E, F, DP) σε διμερή (Εικ. 1). Τα θραύσματα οξέος είναι πιο συχνά σε μη κυτταρινικά επίτοπα από ό,τι σε ουδέτερα θραύσματα. Αυτά τα φαινόμενα συμφωνούν με το πρότυπο που παρατηρήθηκε στην προηγούμενη μελέτη μας, όπου τα υψηλά DP και τα όξινα τμήματα ήταν πιο ανθεκτικά στην ενζυμική υδρόλυση. Επομένως, η παρουσία μη κυτταρινικών γλυκανικών επίτοπων και οι υποκαταστάσεις U και MeU μπορούν να συμβάλουν σημαντικά στη σταθερότητα των ολιγοσακχαριτών. Πρέπει να σημειωθεί ότι η αποτελεσματικότητα σύνδεσης και ανίχνευσης μπορεί να είναι προβληματική για τους ολιγοσακχαρίτες με χαμηλό DP, ειδικά εάν το επίτοπο είναι ένας διμερής ή τριμερής ολιγοσακχαρίτης. Αυτό μπορεί να ελεγχθεί χρησιμοποιώντας εμπορικούς ολιγοσακχαρίτες διαφορετικών μηκών, καθένας από τους οποίους περιέχει μόνο ένα επίτοπο που συνδέεται με ένα συγκεκριμένο mAb.
Έτσι, η χρήση αντισωμάτων ειδικών για τη δομή αποκάλυψε ορισμένους τύπους ανθεκτικών δεσμών. Ανάλογα με τον τύπο του αντισώματος που χρησιμοποιείται, το κατάλληλο πρότυπο σύνδεσης και την ισχύ του σήματος που παράγει (περισσότερο και λιγότερο άφθονο), νέα ένζυμα μπορούν να αναγνωριστούν και να προστεθούν ημι-ποσοτικά στο μείγμα ενζύμων για πληρέστερη γλυκομετατροπή. Λαμβάνοντας ως παράδειγμα την ανάλυση των ολιγοσακχαριτών ACSH, μπορούμε να δημιουργήσουμε μια βάση δεδομένων με δεσμούς γλυκάνης για κάθε υλικό βιομάζας. Πρέπει να σημειωθεί εδώ ότι πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η διαφορετική συγγένεια των αντισωμάτων και, εάν η συγγένειά τους είναι άγνωστη, αυτό θα δημιουργήσει ορισμένες δυσκολίες κατά τη σύγκριση των σημάτων διαφορετικών αντισωμάτων. Επιπλέον, η σύγκριση των δεσμών γλυκάνης μπορεί να λειτουργήσει καλύτερα μεταξύ δειγμάτων για το ίδιο αντίσωμα. Αυτοί οι επίμονοι δεσμοί μπορούν στη συνέχεια να συνδεθούν με τη βάση δεδομένων CAZyme, από την οποία μπορούμε να αναγνωρίσουμε ένζυμα, να επιλέξουμε υποψήφια ένζυμα και να δοκιμάσουμε ένζυμα που διασπούν τους δεσμούς ή να αναπτύξουμε μικροβιακά συστήματα για την έκφραση αυτών των ενζύμων για χρήση σε βιοδιυλιστήρια44.
Για να αξιολογήσουμε τον τρόπο με τον οποίο οι ανοσολογικές μέθοδοι συμπληρώνουν εναλλακτικές μεθόδους για τον χαρακτηρισμό ολιγοσακχαριτών χαμηλού μοριακού βάρους που υπάρχουν σε λιγνοκυτταρινούχα υδρολύματα, πραγματοποιήσαμε MALDI (Εικ. 4, S1-S8) και ανάλυση σακχαριτών που προέρχονται από TMS με βάση την GC-MS στο ίδιο τμήμα ολιγοσακχαρίτη του πάνελ (Εικ. 5). Η MALDI χρησιμοποιείται για να συγκρίνουμε εάν η κατανομή μάζας των μορίων ολιγοσακχαρίτη ταιριάζει με την επιδιωκόμενη δομή. Στο σχήμα 4 φαίνεται η MC των ουδέτερων συστατικών ACN-A και ACN-B. Η ανάλυση ACN-A επιβεβαίωσε μια σειρά σακχάρων πεντόζης που κυμαίνονταν από DP 4-8 (Εικ. 4) έως DP 22 (Εικ. S1), των οποίων τα βάρη αντιστοιχούν σε ολιγοσακχαρίτες MeU-ξυλάνης. Η ανάλυση ACN-B επιβεβαίωσε τη σειρά πεντόζης και γλυκοξυλάνης με DP 8-15. Σε συμπληρωματικό υλικό όπως το Σχήμα S3, οι χάρτες κατανομής μάζας όξινης ομάδας FA-C δείχνουν μια περιοχή σακχάρων πεντόζης υποκατεστημένων με (Me)U με DP 8-15 που είναι συμβατά με τις υποκατεστημένες ξυλάνες που βρέθηκαν σε διαλογή mAb με βάση την ELISA. Τα επίτοπα είναι συνεπή.
Φάσμα MALDI-MS διαλυτών μη συμμορφούμενων ολιγοσακχαριτών που υπάρχουν στο ACS. Εδώ, (Α) κλάσματα χαμηλού βάρους ACN-A που περιέχουν ολιγοσακχαρίτες γλυκουροξυλάνης υποκατεστημένους με μεθυλιωμένο ουρονικό οξύ (DP 4-8) και (Β) ξυλάνη ACN-B και ολιγοσακχαρίτες μεθυλιωμένου ουρονικού οξέος υποκατεστημένους με γλυκουροξυλάνη (DP 8-15).
Ανάλυση της σύνθεσης του υπολείμματος γλυκάνης των ανθεκτικών ολιγοσακχαριτών. Εδώ (Α) Σύνθεση σακχαρίτη TMS διαφόρων κλασμάτων ολιγοσακχαριτών που λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση GC-MS. (Β) Δομές διαφόρων σακχάρων που προέρχονται από TMS και υπάρχουν σε ολιγοσακχαρίτες. ACN – κλάσμα ακετονιτριλίου που περιέχει ουδέτερους ολιγοσακχαρίτες και FA – κλάσμα φερουλικού οξέος που περιέχει όξινους ολιγοσακχαρίτες.
Ένα άλλο ενδιαφέρον συμπέρασμα εξήχθη από την ανάλυση LC-MS του κλάσματος ολιγοσακχαριτών, όπως φαίνεται στο Σχήμα S9 (οι μέθοδοι μπορούν να φανούν στο ηλεκτρονικό συμπληρωματικό υλικό). Θραύσματα ομάδων εξόζης και -OAc παρατηρήθηκαν επανειλημμένα κατά τη διάρκεια της σύνδεσης του κλάσματος ACN-B. Αυτό το εύρημα όχι μόνο επιβεβαιώνει τον κατακερματισμό που παρατηρήθηκε στην ανάλυση γλυκομού και MALDI-TOF, αλλά παρέχει επίσης νέες πληροφορίες σχετικά με πιθανά παράγωγα υδατανθράκων σε προεπεξεργασμένη λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα.
Αναλύσαμε επίσης τη σύνθεση σακχάρων του κλάσματος ολιγοσακχαριτών χρησιμοποιώντας παράγωγο σακχάρων TMS. Χρησιμοποιώντας GC-MS, προσδιορίσαμε τη σύνθεση νευρωνικών (μη παράγωγων) και όξινων σακχάρων (GluA και GalA) στο κλάσμα ολιγοσακχαριτών (Εικ. 5). Το γλυκουρονικό οξύ βρίσκεται στα όξινα συστατικά C και D, ενώ το γαλακτουρονικό οξύ βρίσκεται στα όξινα συστατικά A και B, τα οποία είναι και τα δύο συστατικά υψηλού DP των όξινων σακχάρων. Αυτά τα αποτελέσματα όχι μόνο επιβεβαιώνουν τα δεδομένα ELISA και MALDI, αλλά είναι επίσης σύμφωνα με τις προηγούμενες μελέτες μας για τη συσσώρευση ολιγοσακχαριτών. Επομένως, πιστεύουμε ότι οι σύγχρονες ανοσολογικές μέθοδοι που χρησιμοποιούν βιοτινυλίωση ολιγοσακχαριτών και επακόλουθη διαλογή ELISA είναι επαρκείς για την ανίχνευση διαλυτών ανθεκτικών ολιγοσακχαριτών σε διάφορα βιολογικά δείγματα.
Δεδομένου ότι οι μέθοδοι διαλογής mAb που βασίζονται στην ELISA έχουν επικυρωθεί με διάφορες μεθόδους, θέλαμε να διερευνήσουμε περαιτέρω τις δυνατότητες αυτής της νέας ποσοτικής μεθόδου. Δύο εμπορικοί ολιγοσακχαρίτες, ο ξυλοεξασακχαριτικός ολιγοσακχαρίτης (XHE) και η 23-α-L-αραβινοφουρανοζυλο-ξυλοτριόζη (A2XX), αγοράστηκαν και δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας μια νέα προσέγγιση mAb που στοχεύει τη γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος. Το Σχήμα 6 δείχνει μια γραμμική συσχέτιση μεταξύ του βιοτινυλιωμένου σήματος σύνδεσης και της λογαριθμικής συγκέντρωσης της συγκέντρωσης ολιγοσακχαρίτη, υποδηλώνοντας ένα πιθανό μοντέλο προσρόφησης Langmuir. Μεταξύ των mAbs, τα CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 και CCRC-M151 συσχετίστηκαν με το XHE, και τα CCRC-M108, CCRC-M109 και LM11 συσχετίστηκαν με το A2XX σε ένα εύρος από 1 nm έως 100 nano. Λόγω της περιορισμένης διαθεσιμότητας αντισωμάτων κατά τη διάρκεια του πειράματος, πραγματοποιήθηκαν περιορισμένα πειράματα με κάθε συγκέντρωση ολιγοσακχαρίτη. Θα πρέπει να σημειωθεί εδώ ότι ορισμένα αντισώματα αντιδρούν πολύ διαφορετικά στον ίδιο ολιγοσακχαρίτη ως υπόστρωμα, πιθανώς επειδή συνδέονται με ελαφρώς διαφορετικούς επίτοπους και μπορούν να έχουν πολύ διαφορετικές συγγένειες σύνδεσης. Οι μηχανισμοί και οι επιπτώσεις της ακριβούς ταυτοποίησης επιτόπων θα είναι πολύ πιο περίπλοκοι όταν η νέα προσέγγιση των mAb εφαρμοστεί σε πραγματικά δείγματα.
Δύο εμπορικοί ολιγοσακχαρίτες χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του εύρους ανίχνευσης διαφόρων μονοκλωνικών αντισωμάτων (mAbs) που στοχεύουν γλυκάνες. Εδώ, οι γραμμικές συσχετίσεις με τη λογαριθμική συγκέντρωση της συγκέντρωσης ολιγοσακχαριτών υποδεικνύουν πρότυπα προσρόφησης Langmuir για (Α) XHE με mAb και (Β) A2XX με mAb. Τα αντίστοιχα επίτοπα υποδεικνύουν τις δομές των εμπορικών ολιγοσακχαριτών που χρησιμοποιούνται ως υποστρώματα στη δοκιμασία.
Η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων στοχευμένων σε γλυκάνες (γλυκοκομική ανάλυση ή έλεγχος mAb με βάση την ELISA) είναι ένα ισχυρό εργαλείο για τον εις βάθος χαρακτηρισμό των περισσότερων από τις κύριες γλυκάνες του κυτταρικού τοιχώματος που αποτελούν τη βιομάζα των φυτών. Ωστόσο, η κλασική ανάλυση γλυκάνης χαρακτηρίζει μόνο μεγαλύτερες γλυκάνες κυτταρικού τοιχώματος, καθώς οι περισσότεροι ολιγοσακχαρίτες δεν ακινητοποιούνται αποτελεσματικά σε πλάκες ELISA. Σε αυτή τη μελέτη, προεπεξεργασμένο με AFEX καλαμπόκι υδρολύθηκε ενζυματικά σε υψηλή περιεκτικότητα σε στερεά. Η ανάλυση ζάχαρης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της σύνθεσης των ανθεκτικών υδατανθράκων του κυτταρικού τοιχώματος στο υδρόλυμα. Ωστόσο, η ανάλυση mAb μικρότερων ολιγοσακχαριτών σε υδρολύματα υποτιμάται και απαιτούνται πρόσθετα εργαλεία για την αποτελεσματική ακινητοποίηση των ολιγοσακχαριτών σε πλάκες ELISA.
Αναφέρουμε εδώ μια νέα και αποτελεσματική μέθοδο ακινητοποίησης ολιγοσακχαριτών για τον έλεγχο mAb συνδυάζοντας βιοτινυλίωση ολιγοσακχαριτών ακολουθούμενη από έλεγχο ELISA σε πλάκες επικαλυμμένες με NeutrAvidin™. Οι ακινητοποιημένοι βιοτινυλιωμένοι ολιγοσακχαρίτες έδειξαν επαρκή συγγένεια για το αντίσωμα, επιτρέποντας την ταχεία και αποτελεσματική ανίχνευση ανθεκτικών ολιγοσακχαριτών. Η ανάλυση της σύνθεσης αυτών των επίμονων ολιγοσακχαριτών με βάση τη φασματομετρία μάζας επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα αυτής της νέας προσέγγισης στην ανοσοδιαλογή. Έτσι, αυτές οι μελέτες καταδεικνύουν ότι ο συνδυασμός βιοτινυλίωσης ολιγοσακχαριτών και ελέγχου ELISA με μονοκλωνικά αντισώματα στοχευμένα σε γλυκάνες μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση διασυνδέσεων σε ολιγοσακχαρίτες και μπορεί να εφαρμοστεί ευρέως σε άλλες βιοχημικές μελέτες που χαρακτηρίζουν τη δομή των ολιγοσακχαριτών.
Αυτή η μέθοδος προσδιορισμού γλυκάνης με βάση τη βιοτίνη είναι η πρώτη αναφορά που είναι ικανή να διερευνήσει τους ανθεκτικούς υδατανθρακικούς δεσμούς των διαλυτών ολιγοσακχαριτών στη φυτική βιομάζα. Αυτό βοηθά στην κατανόηση του γιατί ορισμένα μέρη της βιομάζας είναι τόσο πεισματάρικα όσον αφορά την παραγωγή βιοκαυσίμων. Αυτή η μέθοδος καλύπτει ένα σημαντικό κενό στις μεθόδους ανάλυσης γλυκομών και επεκτείνει την εφαρμογή της σε ένα ευρύτερο φάσμα υποστρωμάτων πέρα ​​από τους φυτικούς ολιγοσακχαρίτες. Στο μέλλον, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τη ρομποτική για βιοτινυλίωση και να χρησιμοποιήσουμε τη μέθοδο που έχουμε αναπτύξει για ανάλυση υψηλής απόδοσης δειγμάτων χρησιμοποιώντας ELISA.
Το άχυρο καλαμποκιού (CS) που καλλιεργήθηκε από υβριδικούς σπόρους Pioneer 33A14 συλλέχθηκε το 2010 από τα Kramer Farms στο Ray του Κολοράντο. Με την άδεια του γαιοκτήμονα, αυτή η βιομάζα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έρευνα. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε ξηρό μέρος με υγρασία < 6% σε σακούλες με φερμουάρ σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε ξηρό μέρος με υγρασία < 6% σε σακούλες με φερμουάρ σε θερμοκρασία δωματίου. Образцы храниль сухими при влажности < 6% σε πακέτο με застежкой-молнией при комнатной температура. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε ξηρό μέρος με υγρασία <6% σε σακούλες με φερμουάρ σε θερμοκρασία δωματίου.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах со застежкой-молнией при комнатной температура со влажностью < 6%. Τα δείγματα φυλάσσονται σε σακούλες με φερμουάρ σε θερμοκρασία δωματίου με υγρασία < 6%.Η μελέτη συμμορφώθηκε με τις τοπικές και εθνικές οδηγίες. Η ανάλυση σύνθεσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο NREL. Διαπιστώθηκε ότι η σύνθεση περιείχε 31,4% γλυκάνη, 18,7% ξυλάνη, 3,3% αραβινάνη, 1,2% γαλακτάνη, 2,2% ακετύλιο, 14,3% λιγνίνη, 1,7% πρωτεΐνη και 13,4% τέφρα.
Το Cellic® CTec2 (138 mg πρωτεΐνης/ml, παρτίδα VCNI 0001) είναι ένα σύνθετο μείγμα κυτταρινάσης, β-γλυκοσιδάσης και Cellic® HTec2 (157 mg πρωτεΐνης/ml, παρτίδα VHN00001) από την Novozymes (Franklinton, NC, ΗΠΑ)). Το Multifect Pectinase® (72 mg πρωτεΐνης/mL), ένα σύνθετο μείγμα ενζύμων αποικοδόμησης πηκτίνης, δωρήθηκε από την DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ΗΠΑ). Οι συγκεντρώσεις ενζυμικών πρωτεϊνών προσδιορίστηκαν εκτιμώντας την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη (και αφαιρώντας τη συμβολή του μη πρωτεϊνικού αζώτου) χρησιμοποιώντας ανάλυση αζώτου Kjeldahl (μέθοδος AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ΗΠΑ). Η γη διατόμων 545 αγοράστηκε από την EMD Millipore (Billerica, MA). Ενεργός άνθρακας (DARCO, κόκκοι 100 mesh), Avicel (PH-101), ξυλάνη οξιάς και όλες οι άλλες χημικές ουσίες αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Η προεπεξεργασία με AFEX πραγματοποιήθηκε στο GLBRC (Εργαστήριο Έρευνας Μετατροπής Βιομάζας, MSU, Lansing, MI, ΗΠΑ). Η προεπεξεργασία πραγματοποιήθηκε στους 140°C για 15 λεπτά. Χρόνος παραμονής 46 σε αναλογία 1:1 άνυδρης αμμωνίας προς βιομάζα με φόρτωση 60% (w/w) σε αντιδραστήρα παρτίδας από ανοξείδωτο χάλυβα (Parr Instruments Company). Χρειάστηκαν 30 λεπτά. Ο αντιδραστήρας φέρθηκε στους 140°C και η αμμωνία απελευθερώθηκε ταχέως, επιτρέποντας στη βιομάζα να επιστρέψει γρήγορα σε θερμοκρασία δωματίου. Η σύνθεση του προεπεξεργασμένου θερισμού καλαμποκιού (ACS) με AFEX ήταν παρόμοια με αυτή του μη επεξεργασμένου θερισμού καλαμποκιού (UT-CS).
Παρασκευάστηκε ACSH 25% (w/w) με υψηλή περιεκτικότητα σε στερεά (περίπου 8% φορτίο δεξτράνης) ως αρχικό υλικό για την παραγωγή ολιγοσακχαριτών σε μεγάλη κλίμακα. Η ενζυμική υδρόλυση του ACS πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό μείγμα ενζύμων που περιελάμβανε Cellic® Ctec2 10 mg πρωτεΐνης/g γλυκάνης (σε προεπεξεργασμένη βιομάζα), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg πρωτεΐνης/g γλυκάνης και Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg πρωτεΐνης/g δεξτράνης. Η ενζυμική υδρόλυση πραγματοποιήθηκε σε βιοαντιδραστήρα 5 λίτρων με λειτουργικό όγκο 3 λίτρων, pH 4,8, 50°C και 250 rpm. Μετά από υδρόλυση για 96 ώρες, το υδρόλυμα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στις 6000 rpm για 30 λεπτά και στη συνέχεια στις 14000 rpm για 30 λεπτά για την απομάκρυνση των μη υδρολυμένων στερεών. Το υδρόλυμα υποβλήθηκε στη συνέχεια σε αποστειρωμένη διήθηση μέσω ποτηριού ζέσεως φίλτρου 0,22 mm. Το διηθημένο υδρόλυμα αποθηκεύτηκε σε αποστειρωμένες φιάλες στους 4°C και στη συνέχεια κλασματώθηκε σε άνθρακα.
Ανάλυση της σύνθεσης δειγμάτων βιομάζας με βάση το εκχύλισμα σύμφωνα με τις διαδικασίες εργαστηριακής ανάλυσης NREL: προετοιμασία δειγμάτων για ανάλυση σύνθεσης (NREL/TP-510-42620) και προσδιορισμός δομικών υδατανθράκων και λιγνίνης στη βιομάζα (NREL/TP-510 – 42618)47.
Η ανάλυση ολιγοσακχαριτών του ρεύματος υδρολυμένου προϊόντος πραγματοποιήθηκε σε κλίμακα 2 ml χρησιμοποιώντας μια μέθοδο όξινης υδρόλυσης που βασίζεται σε αυτόκλειστο. Αναμίξτε το δείγμα υδρολυμένου προϊόντος με 69,7 µl θειικού οξέος 72% σε έναν σωλήνα καλλιέργειας με βιδωτό καπάκι των 10 ml και επωάστε για 1 ώρα σε πάγκο στους 121 °C, ψύξτε σε πάγο και διηθήστε σε φιαλίδιο υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Η συγκέντρωση των ολιγοσακχαριτών προσδιορίστηκε αφαιρώντας τη συγκέντρωση των μονοσακχαριτών στο μη υδρολυμένο δείγμα από τη συνολική συγκέντρωση σακχάρων στο δείγμα που υδρολύθηκε με οξύ.
Οι συγκεντρώσεις γλυκόζης, ξυλόζης και αραβινόζης στην όξινα υδρολυμένη βιομάζα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Shimadzu HPLC εξοπλισμένο με αυτόματο δειγματολήπτη, θερμαντήρα στήλης, ισοκρατική αντλία και ανιχνευτή δείκτη διάθλασης σε στήλη Bio-Rad Aminex HPX-87H. Η στήλη διατηρήθηκε στους 50°C και εκλούστηκε με 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 σε νερό.
Το υπερκείμενο υγρό του υδρολύματος αραιώθηκε και αναλύθηκε για την περιεκτικότητα σε μονομερή και ολιγοσακχαρίτες. Τα μονομερή σάκχαρα που ελήφθησαν μετά από ενζυμική υδρόλυση αναλύθηκαν με HPLC εξοπλισμένη με στήλη Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P και στήλη προστασίας από την τέφρα. Η θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε στους 80°C, το νερό χρησιμοποιήθηκε ως κινητή φάση με ρυθμό ροής 0,6 ml/min. Οι ολιγοσακχαρίτες προσδιορίστηκαν με υδρόλυση σε αραιό οξύ στους 121°C σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται στις παραπομπές 41, 48, 49.
Η ανάλυση σακχαριτών πραγματοποιήθηκε σε ακατέργαστα, προεπεξεργασμένα με AFEX και όλα τα μη υδρολυμένα υπολείμματα βιομάζας (συμπεριλαμβανομένης της παραγωγής σειριακών εκχυλισμάτων κυτταρικού τοιχώματος και της διαλογής mAb τους) χρησιμοποιώντας προηγουμένως περιγραφείσες διαδικασίες 27, 43, 50, 51. Για την ανάλυση γλυκώματος, αδιάλυτα σε αλκοόλ υπολείμματα υλικού κυτταρικού τοιχώματος φυτών παρασκευάζονται από υπολείμματα βιομάζας και υποβάλλονται σε σειριακή εκχύλιση με ολοένα και πιο επιθετικά αντιδραστήρια όπως οξαλικό αμμώνιο (50 mM), ανθρακικό νάτριο (50 mM και 0,5% w/v), CON. (1M και 4M, και τα δύο με 1% w/v βοροϋδρίδιο νατρίου) και όξινο χλωρίτη όπως περιγράφηκε προηγουμένως 52,53. Τα εκχυλίσματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ELISA έναντι ενός σύνθετου πάνελ mAb50 που κατευθύνονταν στη γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος και οι αντιδράσεις σύνδεσης mAb παρουσιάστηκαν ως χάρτης θερμότητας. Τα mAb που στοχεύουν τη γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος φυτών αγοράστηκαν από εργαστηριακά αποθέματα (σειρές CCRC, JIM και MAC).
Βιοτινυλίωση ολιγοσακχαριτών σε ένα βήμα. Η σύζευξη υδατανθράκων με βιοτίνη-LC-υδραζίδιο πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη διαδικασία. Βιοτίνη-LC-υδραζίδιο (4,6 mg/12 μmol) διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, 70 μl) με έντονη ανάδευση και θέρμανση στους 65°C για 1 λεπτό. Προστέθηκε παγόμορφο οξικό οξύ (30 μl) και το μείγμα χύθηκε σε κυανοβοροϋδρίδιο νατρίου (6,4 mg/100 μmol) και διαλύθηκε πλήρως μετά από θέρμανση στους 65°C για περίπου 1 λεπτό. Στη συνέχεια, από 5 έως 8 μl του μείγματος αντίδρασης προστέθηκαν στον ξηρό ολιγοσακχαρίτη (1-100 nmol) για να ληφθεί 10πλάσια ή μεγαλύτερη μοριακή περίσσεια της ετικέτας πάνω από το αναγωγικό άκρο. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε στους 65°C για 2 ώρες, μετά την οποία τα δείγματα καθαρίστηκαν αμέσως. Στα πειράματα επισήμανσης δεν χρησιμοποιήθηκε κυανοβοροϋδρίδιο του νατρίου χωρίς αναγωγή και τα δείγματα αντέδρασαν στους 65°C για 2,5 ώρες.
Επικάλυψη και πλύση δειγμάτων βιοτινυλιωμένων ολιγοσακχαριτών με ELISA. 25 μl βιοτινυλιωμένων δειγμάτων (100 μl από κάθε συμπυκνωμένο δείγμα αραιωμένα σε 5 ml ρυθμιστικού διαλύματος Tris 0,1 M (TBS)) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας επικαλυμμένης με αβιδίνη. Τα φρεάτια ελέγχου επικαλύφθηκαν με 50 μl βιοτίνης σε συγκέντρωση 10 μg/ml σε 0,1 M TBS. Απιονισμένο νερό χρησιμοποιήθηκε ως επικάλυψη για τις τυφλές μετρήσεις. Το δισκίο επωάστηκε για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Πλύνετε την πλάκα 3 φορές με 0,1% άπαχο γάλα σε 0,1 M TBS χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα αρ. 11 για το Grenier flat 3A.
Προσθήκη και πλύση πρωτογενών αντισωμάτων. Προσθέστε 40 µl πρωτογενούς αντισώματος σε κάθε φρεάτιο. Επωάστε τη μικροπλάκα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, οι πλάκες πλύθηκαν 3 φορές με γάλα 0,1% σε 0,1M TBS χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα πλύσης #11 για το Grenier Flat 3A.
Προσθέστε δευτερογενές αντίσωμα και πλύνετε. Προσθέστε 50 µl δευτερογενούς αντισώματος ποντικού/αρουραίου (αραιωμένο 1:5000 σε γάλα 0,1% σε 0,1 M TBS) σε κάθε φρεάτιο. Επωάστε τη μικροπλάκα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, οι μικροπλάκες πλύθηκαν 5 φορές με γάλα 0,1% σε 0,1 M TBS χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα πλύσης πλακών Grenier Flat 5A #12.
Προσθήκη υποστρώματος. Προσθέστε 50 µl 3,3′,5,5′-τετραμεθυλοβενζιδίνης (TMB) στο βασικό υπόστρωμα (προσθέτοντας 2 σταγόνες ρυθμιστικού διαλύματος, 3 σταγόνες TMB, 2 σταγόνες υπεροξειδίου του υδρογόνου σε 15 ml απιονισμένου νερού). Προετοιμάστε το υπόστρωμα TMB και ανακινήστε σε στροβιλισμό πριν από τη χρήση). Επωάστε τη μικροπλάκα σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Στο σκοτάδι.
Ολοκληρώστε το βήμα και διαβάστε το δισκίο. Προσθέστε 50 µl θειικού οξέος 1 N σε κάθε φρεάτιο και καταγράψτε την απορρόφηση από 450 έως 655 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη ELISA.
Παρασκευάστε διαλύματα 1 mg/ml αυτών των αναλυτών σε απιονισμένο νερό: αραβινόζη, ραμνόζη, φουκόζη, ξυλόζη, γαλακτουρονικό οξύ (GalA), γλυκουρονικό οξύ (GlcA), μαννόζη, γλυκόζη, γαλακτόζη, λακτόζη, Ν-ακετυλομαννοζαμίνη (manNAc), Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (glcNAc), Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη (galNAc), ινοσιτόλη (εσωτερικό πρότυπο). Παρασκευάστηκαν δύο πρότυπα με την προσθήκη των διαλυμάτων ζάχαρης 1 mg/mL που φαίνονται στον Πίνακα 1. Τα δείγματα καταψύχονται και λυοφιλοποιούνται στους -80°C μέχρι να απομακρυνθεί όλο το νερό (συνήθως περίπου 12-18 ώρες).
Προσθέστε 100–500 µg δείγματος σε δοκιμαστικούς σωλήνες με βιδωτό καπάκι σε έναν αναλυτικό ζυγό. Καταγράψτε την ποσότητα που προστέθηκε. Είναι καλύτερο να διαλύσετε το δείγμα σε μια συγκεκριμένη συγκέντρωση διαλύτη και να το προσθέσετε στον δοκιμαστικό σωλήνα ως υγρό κλάσμα. Χρησιμοποιήστε 20 µl ινοσιτόλης 1 mg/ml ως εσωτερικό πρότυπο για κάθε δοκιμαστικό σωλήνα. Η ποσότητα του εσωτερικού προτύπου που προστίθεται στο δείγμα πρέπει να είναι η ίδια με την ποσότητα του εσωτερικού προτύπου που προστίθεται στον δοκιμαστικό σωλήνα.
Προσθέστε 8 ml άνυδρης μεθανόλης σε ένα φιαλίδιο με βιδωτό καπάκι. Στη συνέχεια, προσθέστε 4 ml μεθανολικού διαλύματος HCl 3 N, κλείστε το καπάκι και ανακινήστε. Σε αυτή τη διαδικασία δεν χρησιμοποιείται νερό.
Προσθέστε 500 µl διαλύματος μεθανόλης HCl 1 M στα δείγματα ολιγοσακχαριτών και στους τυπικούς σωλήνες TMS. Τα δείγματα επωάστηκαν όλη τη νύχτα (168 ώρες) στους 80°C σε θερμικό μπλοκ. Ξηράνετε το προϊόν μεθανόλυσης σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας πολλαπλή ξήρανσης. Προσθέστε 200 µl MeOH και ξηράνετε ξανά. Αυτή η διαδικασία επαναλαμβάνεται δύο φορές. Προσθέστε 200 µl μεθανόλης, 100 µl πυριδίνης και 100 µl οξικού ανυδρίτη στο δείγμα και ανακατέψτε καλά. Τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και ξηράνθηκαν. Προσθέστε 200 µl μεθανόλης και ξηράνετε ξανά.
Προσθέστε 200 µl Tri-Sil και θερμάνετε το σωληνάριο με καπάκι για 20 λεπτά. Θερμάνετε τους 80°C και στη συνέχεια ψύξτε σε θερμοκρασία δωματίου. Χρησιμοποιήστε μια πολλαπλή ξήρανσης για να ξηράνετε περαιτέρω το δείγμα σε όγκο περίπου 50 µl. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι δεν αφήσαμε τα δείγματα να στεγνώσουν εντελώς.
Προσθέστε 2 ml εξανίου και ανακατέψτε καλά με στροβιλισμό. Γεμίστε τις άκρες των πιπετών Pasteur (5-8 mm) με ένα κομμάτι υαλοβάμβακα εισάγοντας το υαλοβάμβακα πάνω από μια πιπέτα διαμέτρου 5-3/4 ίντσας. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 3000 g για 2 λεπτά. Τυχόν αδιάλυτα υπολείμματα καθιζάνουν. Ξηράνετε το δείγμα στα 100-150 µl. Ένας όγκος περίπου 1 μl εγχύθηκε στο GC-MS σε αρχική θερμοκρασία 80 °C και αρχικό χρόνο 2,0 λεπτών (Πίνακας 2).