Mèsi paske w vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Antretan, pou asire sipò kontinye, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Nouvo metòd iminolojik ak espektwometrik mas pou analiz konplèks oligosakarid ki pèsistan nan stover mayi pretrete ak AFEX.Biomass lignocellulosic se yon altènatif dirab pou konbistib fosil epi li lajman itilize pou devlope bioteknoloji pou pwodiksyon pwodwi tankou manje, manje, konbistib ak pwodui chimik.Kle nan teknoloji sa yo se devlopman nan pri-konpetitif pwosesis pou konvèti idrat kabòn konplèks ki prezan nan mi selil plant yo nan sik senp tankou glikoz, ksiloz ak arabinoz.Paske biomass lignocellulosic trè fè tèt di, li dwe sibi tretman tèmochimik (egzanp, èksfolyasyon fib amonyak (AFEX), asid dilye (DA), likid iyonik (IL)) ak tretman byolojik (egzanp, idroliz anzimatik ak fèmantasyon mikwòb) an konbinezon pou jwenn pwodwi a vle..Sepandan, lè yo itilize anzim chanpiyon komèsyal yo nan pwosesis idwoliz la, sèlman 75-85% nan sik idrosolubl ki fòme yo se monosakarid, ak 15-25% ki rete yo se oligosakarid idrosolubl, ki pa toujou disponib pou mikwo-òganis.Précédemment, nou te avèk siksè izole ak pirifye idrosolubl oligosakarid fè tèt di lè l sèvi avèk yon konbinezon de kabòn ak separasyon latè dyatom ak chromatografi esklizyon gwosè, epi tou li te envestige pwopriyete inhibitor anzim yo.Nou te jwenn ke oligosakarid ki gen pi wo degre de polymérisation (DP) methylated sibstitisyon asid uronik yo pi difisil nan pwosesis ak melanj anzim komèsyal pase DP ki ba ak oligosakarid net.Isit la nou rapòte itilizasyon plizyè metòd adisyonèl, ki gen ladan profilaj glikan lè l sèvi avèk antikò monoklonal (mAbs) espesifik nan glikan biomass plant pou karakterize lyezon glikan nan mi selil plant yo ak idrolysat anzimatik, iyonizasyon desorption lazè asistans matris, espektrometri mas tan-of-vol..MALDI-TOF-MS) sèvi ak pik dyagnostik estrikti-enfòmatif yo te jwenn pa espektroskopi apre pouri segondè nan iyon negatif, gaz chromatografi ak espektrometri mas (GC-MS) pou karakterize lyezon oligosakarid ak ak san derivasyon.Akòz ti gwosè oligosakarid (DP 4-20), molekil sa yo difisil pou itilize pou lye ak karakterizasyon mAb.Pou simonte pwoblèm sa a, nou te aplike yon nouvo metòd imobilizasyon oligosakarid ki baze sou konjigezon biotin ki te make avèk siksè majorite oligosakarid ki ba DP idrosolubl sou sifas mikroplak la, ki te itilize lè sa a nan yon sistèm mAb debi segondè pou analiz ligasyon espesifik.Nouvo metòd sa a pral fasilite devlopman tès glikòm ki pi avanse nan tan kap vini an ki ka itilize pou izole ak karakterize oligosakarid ki prezan nan biomarqueurs pou rezon dyagnostik.
Byomass lignocellulosic, ki konpoze de materyèl agrikòl, forè, zèb ak bwa, se yon materyo potansyèl pou pwodiksyon pwodwi ki baze sou biyo, ki gen ladan manje, manje, gaz ak pwodui chimik précurseurs pou pwodwi pwodwi ki pi gwo valè1.Kaboyidrat (tankou seluloz ak emizeluloz) prezan nan mi selil plant yo depolymerize nan monosakarid pa pwosesis chimik ak biotransformation (tankou idroliz anzimatik ak fèmantasyon mikwòb).Pre-tretman komen yo enkli ekspansyon fib amonyak (AFEX), asid dilye (DA), likid iyonik (IL), ak eksplozyon vapè (SE), ki sèvi ak yon konbinezon de pwodwi chimik ak chalè diminye pwodiksyon lignocellulose pa louvri miray selil plant3,4.fè tèt di nan matyè, 5. Idwoliz anzimatik te pote soti nan yon chaj solid ki wo lè l sèvi avèk anzim komèsyal ki gen idrat kabòn aktif (CAZymes) ak fèmantasyon mikwòb lè l sèvi avèk ledven transjenik oswa bakteri yo pwodwi konbistib ki baze sou bio ak pwodui chimik 6 .
CAZymes nan anzim komèsyal yo konpoze de yon melanj konplèks nan anzim ki sinèrjetik koupe lyezon konplèks idrat kabòn-sik pou fòme monosakarid2,7.Kòm nou te rapòte pi bonè, rezo konplèks polymère aromat nan lignin ak idrat kabòn fè yo trè entrayab, ki mennen nan konvèsyon sik enkonplè, akimile 15-25% nan oligosakarid sèks ki pa pwodui pandan idroliz anzimatik nan byomass la pretrete.Sa a se yon pwoblèm komen ak divès metòd pretretman byomass.Gen kèk rezon pou kou boutèy sa a gen ladan anpèchman anzim pandan idroliz, oswa absans oswa nivo ba nan anzim esansyèl esansyèl ki oblije kraze lyezon sik nan byomass plant yo.Konprann konpozisyon ak karakteristik estriktirèl sik, tankou lyezon sik nan oligosakarid, pral ede nou amelyore konvèsyon sik pandan idroliz, fè pwosesis biotechnologique pri-konpetitif ak pwodwi petwòl ki sòti.
Detèmine estrikti idrat kabòn yo difisil epi li mande yon konbinezon de metòd tankou likid chromatografi (LC) 11,12, nikleyè mayetik sonorite spectroscopy (NMR) 13, elektwoforèz kapilè (CE) 14, 15, 16 ak espektrometri mas (MS) 17., dizwit.Metòd MS tankou espektometri mas tan-de-vòl ak desorption lazè ak ionizasyon lè l sèvi avèk yon matris (MALDI-TOF-MS) se yon metòd versatile pou idantifye estrikti idrat kabòn.Dènyèman, kolizyon-induced dissociation (CID) tandem MS nan adduct ion sodyòm te pi lajman itilize pou idantifye anprent dwèt ki koresponn ak pozisyon atachman oligosakarid, konfigirasyon anomerik, sekans, ak pozisyon branch 20, 21.
Analiz glikan se yon zouti ekselan pou idantifikasyon an pwofondè nan lyezon idrat kabòn22.Metòd sa a sèvi ak antikò monoklonal (mAbs) ki dirije nan glikan miray selil plant yo kòm sond pou konprann lyen idrat kabòn konplèks.Plis pase 250 mAb yo disponib atravè lemond, ki fèt kont divès kalite oligosakarid lineyè ak branche lè l sèvi avèk divès sakarid24.Plizyè mAb yo te lajman itilize pou karakterize estrikti, konpozisyon, ak modifikasyon miray selil plant la, paske gen diferans enpòtan ki depann de kalite selil plant, ògàn, laj, etap devlopman, ak anviwònman kwasans25,26.Plis dènyèman, yo te itilize metòd sa a pou konprann popilasyon vesik nan sistèm plant ak bèt ak wòl respektif yo nan transpò glikan jan yo detèmine pa makè subselilè, etap devlopman, oswa stimuli anviwònman an, epi detèmine aktivite anzimatik.Kèk nan diferan estrikti glycans ak xylans ki te idantifye genyen ladan yo pèktin (P), xylan (X), manan (M), xyloglucans (XylG), melanje bond glucans (MLG), arabinoksilan (ArbX), galactomannan (GalG), asid glukuronik-arabinoksilan (GArbX) ak 9 arabino-Galactan.
Sepandan, malgre tout efò rechèch sa yo, sèlman kèk etid yo te konsantre sou nati akimilasyon oligosakarid pandan idroliz chaj solid (HSL), ki gen ladan lage oligosakarid, chanjman longè chèn oligomerik pandan idroliz, divès kalite polymère ki ba DP, ak koub yo.distribisyon 30,31,32.Pandan se tan, byenke analiz glycan pwouve yo dwe yon zouti itil pou yon analiz konplè nan estrikti glycan, li difisil pou evalye oligosakarid DP ba idrosolubl lè l sèvi avèk metòd antikò.Pi piti oligosakarid DP ki gen yon pwa molekilè ki mwens pase 5-10 kDa pa mare nan plak ELISA 33, 34 epi yo lave anvan adisyon antikò.
Isit la, pou premye fwa, nou demontre yon tès ELISA sou plak avidin-kouvwi lè l sèvi avèk antikò monoklonal, konbine yon pwosedi biotinilation yon sèl etap pou oligosakarid refractory idrosolubl ak analiz glikòm.MALDI-TOF-MS ak analiz ki baze sou GC-MS te valide apwòch nou an nan analiz glikòm nan lyen konplemantè oligosakarid lè l sèvi avèk trimethylsilil (TMS) derivatization nan konpozisyon sik idrolize.Apwòch inovatè sa a ka devlope kòm yon metòd wo-debi nan lavni epi jwenn aplikasyon pi laj nan rechèch byomedikal35.
Modifikasyon apre-tradiksyon nan anzim ak antikò, tankou glikozilasyon,36 afekte aktivite byolojik yo.Pou egzanp, chanjman nan glikozilasyon nan pwoteyin serik jwe yon wòl enpòtan nan atrit enflamatwa, ak chanjman nan glikozilasyon yo itilize kòm makè dyagnostik37.Gen plizyè glikan yo te rapòte nan literati a fasilman parèt nan yon varyete de maladi, ki gen ladan maladi enflamatwa kwonik nan aparèy la gastwoentestinal ak fwa, enfeksyon viral, ovè, tete, ak kansè pwostat38,39,40.Konprann estrikti glikan lè l sèvi avèk metòd ELISA glikan ki baze sou antikò pral bay plis konfyans nan dyagnostik maladi san yo pa itilize metòd MS konplèks.
Etid anvan nou an te montre ke oligosakarid fè tèt di rete unhydrolyzed apre pretreatman ak idroliz anzimatik (Figi 1).Nan travay nou te pibliye deja, nou te devlope yon metòd ekstraksyon solid-faz chabon aktive pou izole oligosakarid ki soti nan idrolysat mayi ki te deja trete AFEX (ACSH)8.Apre premye ekstraksyon ak separasyon, oligosakarid yo te plis fraksyone pa chromatografi esklizyon gwosè (SEC) ak kolekte nan lòd nan pwa molekilè.Yo te analize monomè sik ak oligomèr ki soti nan plizyè pretreatman pa analiz konpozisyon sik.Lè w konpare kontni an nan oligomèr sik ki te jwenn nan divès metòd pretreatment, prezans nan oligosakarid fè tèt di se yon pwoblèm komen nan konvèsyon nan byomass nan monosakarid epi li ka mennen nan yon rediksyon nan sede sik nan omwen 10-15% e menm jiska 18%.US.Metòd sa a itilize pou plis pwodiksyon gwo echèl fraksyon oligosakarid.ACH ki kapab lakòz ak fraksyon ki vin apre li yo ak diferan pwa molekilè yo te itilize kòm materyèl eksperimantal pou karakterizasyon oligosakarid nan travay sa a.
Apre pretretman ak idroliz anzimatik, oligosakarid ki pèsistan rete unhydrolysed.Isit la (A) se yon metòd separasyon oligosakarid kote oligosakarid yo izole nan AFEX-pretreated mayi stover hydrolyzate (ACSH) lè l sèvi avèk yon kabann chaje nan kabòn aktive ak latè dyatom;(B) Metòd pou separasyon oligosakarid.Oligosakarid yo te plis separe pa gwosè esklizyon chromatografi (SEC);(C) Sakarid monomè ak oligomèr ki soti nan divès kalite pretreatments (asid dilye: DA, likid iyonik: IL ak AFEX).Kondisyon idrolyse anzimatik: gwo solid chaje 25% (w/w) (apeprè 8% glucan loading), 96 èdtan idwoliz, 20 mg/g komèsyal anzim loading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 rapò) ak (D) Monomère sik ak oligomèr nan glikoz, EX xylose lage nan glikoz, EX xylose-stored ak preskripsyon.
Analiz Glycan te pwouve yo dwe yon zouti itil pou yon analiz estriktirèl konplè nan glikan nan ekstrè izole nan résidus byomass solid.Sepandan, sakarid dlo-idrosolubl yo soureprezante lè l sèvi avèk metòd tradisyonèl sa a41 paske oligosakarid ki ba pwa molekilè difisil pou imobilize sou plak ELISA epi yo lave anvan adisyon antikò.Se poutèt sa, pou antikò obligatwa ak karakterizasyon, yo te itilize yon metòd biotinilation yon sèl-etap pou rad idrosolubl, ki pa konfòme oligosakarid sou plak ELISA avidin-kouvwi.Metòd sa a te teste lè l sèvi avèk ACSH deja pwodwi nou an ak yon fraksyon ki baze sou pwa molekilè li yo (oswa degre nan polimerizasyon, DP).Yo te itilize yon sèl-etap biotinylasyon pou ogmante afinite obligatwa oligosakarid lè yo ajoute biotin-LC-hydrazide nan fen diminye idrat kabòn la (figi 2).Nan solisyon, gwoup hemiacetal nan fen diminye reyaji ak gwoup idrazid biotin-LC-hydrazide pou fòme yon kosyon idrazon.Nan prezans ajan rediksyon NaCNBH3, kosyon idrazon la redwi a yon pwodwi fen ki estab biotinylated.Avèk modifikasyon nan fen sik la diminye, obligatwa nan oligosakarid DP ki ba nan plak ELISA te vin posib, ak nan etid nou an sa a te fè sou plak avidin-kouvwi lè l sèvi avèk mAbs glycan ki vize.
Depistaj antikò monoklonal ki baze sou ELISA pou oligosakarid biotinilate.Isit la (A) konbine biotinylation oligosakarid ak tès depistaj ELISA ki vin apre ak mAbs glycan ki vize sou plak kouvwi NeutrAvidin ak (B) montre yon pwosedi yon sèl etap pou biotinylation nan pwodwi reyaksyon.
Lè sa a, yo te ajoute plak Avidin-kouvwi ak antikò oligosakarid-konjige nan antikò prensipal ak segondè epi lave nan yon mwayen limyè ak tan-sansib.Apre lyezon antikò fini, ajoute substra TMB pou enkube plak la.Reyaksyon an te finalman sispann ak asid silfirik.Plak enkubasyon yo te analize lè l sèvi avèk yon lektè ELISA pou detèmine fòs la obligatwa nan chak antikò pou detekte antikò-espesifik cross-linking.Pou plis detay ak paramèt eksperyans lan, gade nan seksyon korespondan "Materyèl ak Metòd".
Nou demontre itilite metòd sa a ki fèk devlope pou aplikasyon espesifik lè nou karakterize oligosakarid idrosolubl prezan nan ACSH kòm byen ke nan fraksyon oligosakarid brit ak pirifye izole nan idroliz lignocellulosic.Jan yo montre nan Figi 3, xylans ki pi komen epitop-ranplase yo idantifye nan ACSH lè l sèvi avèk metòd analiz glikòm bioacilated yo anjeneral uronik (U) oswa methyluronic (MeU) ak arabinogalactans pektik.Pifò nan yo te jwenn tou nan etid anvan nou an sou analiz la nan glikan nan solid ki pa idrolize (UHS)43.
Deteksyon epitop oligosakarid rekalsitran lè l sèvi avèk yon antikò monoklonal ki dirije nan glikan miray selil la.Fraksyon "net" se fraksyon ACN ak fraksyon "asid" se fraksyon FA.Pi klere wouj sou heatmap la endike pi wo kontni epitop, ak pi klere ble endike yon background vid.Valè koulè sou echèl la baze sou valè OD anvan tout koreksyon pou fòmilasyon N = 2.Epitop prensipal yo rekonèt pa antikò yo montre sou bò dwat la.
Estrikti ki pa seluloz sa yo pa t 'kapab koupe pa cellulases ki pi komen ak emicellulases nan melanj anzim komèsyal teste, ki gen ladan anzim komèsyal ki pi souvan itilize yo.Se poutèt sa, nouvo anzim oksilyè yo mande pou idroliz yo.San yo pa nesesè anzim akseswar ki pa seluloz, lyezon ki pa seluloz sa yo anpeche konvèsyon konplè nan monosakarid, menm si polymère sik paran yo idrolize anpil nan fragman ki pi kout epi fonn lè l sèvi avèk melanj anzim komèsyal yo.
Plis etid sou distribisyon siyal ak fòs obligatwa li yo te montre ke epitop obligatwa yo te pi ba nan fraksyon sik DP segondè (A, B, C, DP jiska 20+) pase nan fraksyon DP ki ba (D, E, F, DP) nan dimè) (Fig. 1).Fragman asid yo pi komen nan epitop ki pa seluloz pase fragman net.Fenomèn sa yo konsistan avèk modèl yo te obsève nan etid anvan nou an, kote gwo DP ak asid yo te pi rezistan nan idroliz anzimatik.Se poutèt sa, prezans nan epitop glycan ki pa seluloz ak sibstitisyon U ak MeU ka anpil kontribye nan estabilite nan oligosakarid yo.Li ta dwe remake ke efikasite obligatwa ak deteksyon ka pwoblèm pou oligosakarid DP ki ba, espesyalman si epitop la se yon oligosakarid dimerik oswa trimerik.Sa a ka teste lè l sèvi avèk oligosakarid komèsyal ki gen diferan longè, chak gen sèlman yon epitop ki mare nan yon mAb espesifik.
Kidonk, itilizasyon antikò estrikti-espesifik revele sèten kalite lyezon rekalsitran.Tou depan de kalite antikò yo itilize, modèl ligasyon ki apwopriye a, ak fòs siyal li pwodui (pi ak pi piti abondan), yo ka idantifye nouvo anzim epi ajoute semi-quantitative nan melanj anzim la pou plis konplè glikokonvèsyon.Pran analiz ACSH oligosakarid kòm yon egzanp, nou ka kreye yon baz done nan lyezon glikan pou chak materyèl byomass.Li ta dwe remake isit la ke diferan afinite nan antikò yo ta dwe pran an kont, epi si afinite yo se enkoni, sa a pral kreye sèten difikilte lè yo konpare siyal yo nan antikò diferan.Anplis de sa, konparezon nan lyezon glikan ka travay pi byen ant echantiyon pou menm antikò a.Lè sa a, lyezon fè tèt di sa yo ka lye nan baz done CAZyme a, ki soti nan ki nou ka idantifye anzim, chwazi anzim kandida ak tès pou anzim ki kase lyezon, oswa devlope sistèm mikwòb pou eksprime anzim sa yo pou itilize nan byorafineri44.
Pou evalye ki jan metòd iminolojik konpleman metòd altènatif pou karakterize oligosakarid pwa molekilè ki ba prezan nan idroliz lignocellulosic, nou te fè MALDI (Fig. 4, S1-S8) ak analiz de sakarid ki sòti nan TMS ki baze sou GC-MS sou panèl la menm (Fig. 5) pati oligosakarid.MALDI yo itilize pou konpare si distribisyon an mas nan molekil oligosakarid matche ak estrikti a gen entansyon.Sou fig.4 montre MC konpozan net ACN-A ak ACN-B.Analiz ACN-A konfime yon seri sik pentoz ki sòti nan DP 4-8 (figi 4) rive nan DP 22 (figi S1), ki gen pwa ki koresponn ak oligosakarid MeU-xylan.Analiz ACN-B konfime seri pentoz ak glukoksilan ak DP 8-15.Nan materyèl siplemantè tankou Figi S3, kat distribisyon mas asid FA-C montre yon seri sik pentoz (Me)U ranplase ak yon DP 8-15 ki konsistan avèk xylans ranplase yo jwenn nan tès depistaj mAb ki baze sou ELISA.Epitop yo konsistan.
MALDI-MS spectre nan oligosakarid idrosolubl ki pa konfòme prezan nan ACS.Isit la, (A) ACN-A fraksyon ranje pwa ki ba ki gen asid methylated uronic (DP 4-8) ranplase glucuroxylan oligosaccharides ak (B) ACN-B xylan ak methylated uronic acid oligosaccharides ranplase ak glucuroxylan (DP 8-15).
Analiz de konpozisyon rezidi glikan oligosakarid refractory.Isit la (A) TMS sakarid konpozisyon divès fraksyon oligosakarid yo jwenn lè l sèvi avèk analiz GC-MS.(B) Estrikti divès kalite sik ki sòti nan TMS ki prezan nan oligosakarid.ACN - fraksyon acetonitrile ki gen oligosakarid net ak FA - fraksyon asid ferulik ki gen oligosakarid asid.
Yon lòt konklizyon enteresan te tire nan analiz LC-MS nan fraksyon oligosakarid la, jan yo montre nan Figi S9 (metòd yo ka wè nan materyèl siplemantè elektwonik la).Fragman nan gwoup hexose ak -OAc yo te repete obsève pandan ligasyon nan fraksyon nan ACN-B.Konklizyon sa a pa sèlman konfime fwagmantasyon yo obsève nan analiz glikòm ak MALDI-TOF, men tou, bay nouvo enfòmasyon sou potansyèl dérivés idrat kabòn nan byomass lignocellulosic pretrete.
Nou menm tou nou analize konpozisyon sik nan fraksyon oligosakarid la lè l sèvi avèk derivatizasyon sik TMS.Sèvi ak GC-MS, nou detèmine konpozisyon neral (ki pa dérivés) ak sik asid (GluA ak GalA) nan fraksyon oligosakarid la (figi 5).Asid glukuronik yo jwenn nan eleman asid C ak D, pandan y ap asid galakturonik yo jwenn nan eleman asid A ak B, tou de nan yo se eleman DP segondè nan sik asid.Rezilta sa yo pa sèlman konfime done ELISA ak MALDI nou yo, men yo konsistan tou ak etid anvan nou yo sou akimilasyon oligosakarid.Se poutèt sa, nou kwè ke metòd iminolojik modèn lè l sèvi avèk biotinylation nan oligosakarid ak tès depistaj ELISA ki vin apre yo ase yo detekte idrosolubl oligosakarid rekalsitran nan divès echantiyon byolojik.
Depi metòd tès depistaj mAb ki baze sou ELISA yo te valide pa plizyè metòd diferan, nou te vle plis eksplore potansyèl nouvo metòd quantitative sa a.De oligosakarid komèsyal yo, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ak 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), yo te achte ak teste lè l sèvi avèk yon nouvo apwòch mAb vize glycan miray selil la.Figi 6 montre yon korelasyon lineyè ant siyal la obligatwa biotinylate ak konsantrasyon nan log nan konsantrasyon oligosakarid, sijere yon modèl adsorption Langmuir posib.Pami mAb yo, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ak CCRC-M151 ki gen rapò ak XHE, ak CCRC-M108, CCRC-M109, ak LM11 ki gen rapò ak A2XX sou yon seri de 1 nm a 100 nano.Akòz disponiblite limite nan antikò pandan eksperyans la, eksperyans limite yo te fèt ak chak konsantrasyon oligosakarid.Li ta dwe remake isit la ke kèk antikò reyaji yon fason trè diferan nan menm oligosakarid la kòm yon substra, prezimableman paske yo mare nan epitop yon ti kras diferan epi yo ka gen trè diferan afinite obligatwa.Mekanis ak enplikasyon idantifikasyon egzat epitop yo pral pi konplèks lè yo aplike nouvo apwòch mAb nan echantiyon reyèl.
De oligosakarid komèsyal yo te itilize pou detèmine seri deteksyon divès kalite mAb ki vize glikan.Isit la, korelasyon lineyè ak konsantrasyon log nan konsantrasyon oligosakarid endike modèl adsorption Langmuir pou (A) XHE ak mAb ak (B) A2XX ak mAb.Epitop korespondan yo endike estrikti oligosakarid komèsyal yo itilize kòm substrats nan tès la.
Itilizasyon antikò monoklonal glycan ki vize (analiz glikokomik oswa tès depistaj mAb ki baze sou ELISA) se yon zouti pwisan pou karakterizasyon an pwofondè nan pifò gwo glikan miray selil ki fòme byomass plant yo.Sepandan, analiz glikan klasik sèlman karakterize pi gwo glikan miray selil yo, paske pifò oligosakarid yo pa imobilize avèk efikasite sou plak ELISA.Nan etid sa a, AFEX-pretrete mayi stover te enzymatically hydrolyzed nan yon kontni solid ki wo.Yo te itilize analiz sik pou detèmine konpozisyon idrat kabòn rekalsitran miray selil yo nan idroliz la.Sepandan, analiz mAb nan pi piti oligosakarid nan idrolysat yo souzèstime, ak zouti adisyonèl yo bezwen efektivman imobilize oligosakarid sou plak ELISA.
Nou rapòte isit la yon metòd imobilizasyon oligosakarid roman ak efikas pou tès depistaj mAb pa konbine biotinilation oligosakarid ki te swiv pa tès depistaj ELISA sou plak NeutrAvidin™ kouvwi.Oligosakarid biotinyl ki immobilize yo te montre ase afinite pou antikò a pou pèmèt deteksyon rapid ak efikas oligosakarid rekalsitran.Analiz de konpozisyon oligosakarid sa yo fè tèt di ki baze sou espektrometri mas konfime rezilta nouvo apwòch sa a nan imunoscreening.Se konsa, etid sa yo demontre ke konbinezon an nan oligosakarid biotinylation ak tès depistaj ELISA ak antikò monoklonal glycan ki vize yo ka itilize pou detekte retik nan oligosakarid epi yo ka lajman aplike nan lòt etid byochimik karakterize estrikti nan oligosakarid.
Metòd glycan ki baze sou biotin sa a se premye rapò ki kapab mennen ankèt sou lyezon idrat kabòn rekalsitran nan oligosakarid idrosolubl nan byomass plant yo.Sa a ede konprann poukisa kèk pati nan byomass yo tèlman fè tèt di lè li rive pwodiksyon biocarburant.Metòd sa a ranpli yon espas enpòtan nan metòd analiz glikòm ak pwolonje aplikasyon li nan yon seri pi laj de substrats pi lwen pase oligosakarid plant yo.Nan tan kap vini an, nou ka sèvi ak robotik pou biotinilation epi sèvi ak metòd nou te devlope pou analiz segondè-debi echantiyon yo lè l sèvi avèk ELISA.
Paille mayi (CS) ki te grandi nan grenn ibrid Pioneer 33A14 te rekòlte an 2010 nan Kramer Farms nan Ray, Kolorado.Ak pèmisyon mèt tè a, biomass sa a ka itilize pou rechèch. Echantiyon yo te estoke sèk <6% imidite nan sache zip-lock nan tanperati chanm. Echantiyon yo te estoke sèk <6% imidite nan sache zip-lock nan tanperati chanm. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнатной при комтнахп. Echantiyon yo te estoke sèk nan <6% imidite nan sak zip nan tanperati chanm.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Echantiyon yo estoke nan sache zip nan tanperati chanm ak imidite <6%.Etid la respekte direktiv lokal ak nasyonal yo.Yo te fè analiz konpozisyon lè l sèvi avèk pwotokòl NREL la.Yo te jwenn konpozisyon an genyen 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% asetil, 14.3% lignin, 1.7% pwoteyin ak 13.4% sann.
Cellic® CTec2 (138 mg pwoteyin/ml, anpil VCNI 0001) se yon melanj konplèks nan selulaz, β-glucosidase ak Cellic® HTec2 (157 mg pwoteyin/ml, anpil VHN00001) soti nan Novozymes (Franklinton, NC, USA)).DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) te bay Multifect Pectinase® (72 mg pwoteyin/mL), yon melanj konplèks nan anzim degradan pèktin.Konsantrasyon pwoteyin anzim yo te detèmine pa estime kontni pwoteyin (ak soustraksyon kontribisyon azòt ki pa pwoteyin) lè l sèvi avèk analiz azòt Kjeldahl (metòd AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Latè dyatom 545 te achte nan men EMD Millipore (Billerica, MA).Aktive kabòn (DARCO, 100 may granules), Avicel (PH-101), Beech xylan, ak tout lòt pwodwi chimik yo te achte nan men Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Yo te fè pretretman AFEX nan GLBRC (Biomass Konvèsyon Rechèch Laboratwa, MSU, Lansing, MI, USA).Pre-tretman te pote soti nan 140 ° C pou 15 minit.46 tan rezidans nan rapò 1:1 nan amonyak anidrid ak byomass nan 60% (w / w) loading nan yon raktor pakèt asye pur (Parr Instruments Company).Li te pran 30 minit.Yo te pote raktor a nan 140 ° C ak amonyak la te rapidman lage, sa ki pèmèt byomass la byen vit retounen nan tanperati chanm.Konpozisyon AFEX pre-treated corn stover (ACS) te sanble ak sa ki pa trete corn stover (UT-CS).
Segondè solid ACSH 25% (w/w) (apeprè 8% chaj dextran) te prepare kòm yon materyèl kòmanse pou pwodiksyon gwo echèl oligosakarid.Yo te fè idroliz anzimatik nan ACS lè l sèvi avèk yon melanj anzim komèsyal ki gen ladan Cellic® Ctec2 10 mg pwoteyin / g glukan (nan byomass pretrete), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg pwoteyin / g glukan, ak Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg pwoteyin / g dextran.Idwoliz anzimatik te pote soti nan yon bioreactor 5-lit ak yon volim k ap travay nan 3 lit, pH 4.8, 50 ° C ak 250 rpm.Apre idwoliz pou 96 èdtan, yo te kolekte idwoliz la nan santrifujasyon nan 6000 rpm pou 30 minit ak Lè sa a, nan 14000 rpm pou 30 minit pou retire solid unhydrolysed.Lè sa a, idrolysat la te sibi filtraj esteril nan yon gode filtre 0.22 mm.Yo te estoke idrolysat filtre a nan boutèy esteril nan 4 ° C ak Lè sa a, fraksyon sou kabòn.
Analiz konpozisyon echantiyon biomass ki baze sou ekstrè dapre pwosedi analiz laboratwa NREL: preparasyon echantiyon pou analiz konpozisyon (NREL/TP-510-42620) ak detèminasyon idrat kabòn estriktirèl ak lignin nan byomass (NREL/TP-510 – 42618)47.
Yo te fè analiz oligosakarid nan kouran idwoliz la sou yon echèl 2 ml lè l sèvi avèk yon metòd idwoliz asid ki baze sou otoklav.Melanje echantiyon idrolizat la ak 69.7 µl asid silfirik 72% nan yon tib kiltivasyon bouchon vis 10 ml epi enkube pou 1 èdtan sou yon tab nan 121 °C, fre sou glas epi filtre nan yon flakon kwomatografi likid segondè (HPLC).Konsantrasyon oligosakarid yo te detèmine pa soustraksyon konsantrasyon monosakarid nan echantiyon ki pa idrolize a nan konsantrasyon total sik nan echantiyon asid idrolize a.
Konsantrasyon glikoz, ksiloz, ak arabinoz nan byomass idrolize asid la te analize lè l sèvi avèk yon sistèm Shimadzu HPLC ekipe ak yon autosampler, chofaj kolòn, ponp izokratik, ak detektè endèks refraktif sou yon kolòn Bio-Rad Aminex HPX-87H.Te kolòn nan kenbe nan 50 ° C ak eluye ak 0.6 ml / min 5 mM H2SO4 nan dlo.koule.
Yo te dilye sipènatan idrolysat la epi analize pou kontni monomè ak oligosakarid.Sik monomerik yo te jwenn apre idroliz anzimatik yo te analize pa HPLC ekipe ak yon kolòn Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ak yon kolòn gad sann.Tanperati kolòn nan te kenbe nan 80 ° C, dlo yo te itilize kòm faz mobil lan ak yon pousantaj koule nan 0.6 ml / min.Oligosakarid yo te detèmine pa idroliz nan asid dilye nan 121 ° C dapre metòd yo dekri nan ref.41, 48, 49.
Sakarid analiz te fèt sou anvan tout koreksyon, AFEX trete ak tout rezidi byomass ki pa idrolize (ki gen ladan pwodiksyon ekstrè mi selil seri ak tès depistaj mAb yo) lè l sèvi avèk pwosedi ki dekri deja 27, 43, 50, 51.Pou analiz glikòm, résidus alkòl-ensolubl nan materyèl miray selil plant yo prepare soti nan résidus byomass ak sibi ekstraksyon seri ak reyaktif de pli zan pli agresif tankou oksalat amonyòm (50 mM), kabonat sodyòm (50 mM ak 0.5% w / v), CON.(1M ak 4M, tou de ak 1% w / v borohydride sodyòm) ak klorit asid jan yo dekri deja52,53.Lè sa a, ekstrè yo te sibi ELISA kont yon panèl konplèks nan mAb50s ki te dirije nan glycan miray selil la, ak reyaksyon yo obligatwa mAb yo te prezante kòm yon kat chalè.mAbs vize plant selil mi glycan yo te achte nan aksyon laboratwa (CCRC, JIM ak seri MAC).
Yon sèl etap biotinilation oligosakarid.Konjigezon nan idrat kabòn ak biotin-LC-hydrazide te fèt lè l sèvi avèk pwosedi sa a.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) te fonn nan dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) pa vibran wòdpòte ak chofaj nan 65 ° C. pou 1 min.Yo te ajoute asid acetic glasyal (30 µl) epi yo te vide melanj lan sou cyanoborohydride sodyòm (6.4 mg/100 µmol) epi li fonn nèt apre yo fin chofe a 65 ° C pou apeprè 1 minit.Lè sa a, yo te ajoute soti nan 5 a 8 μl nan melanj reyaksyon an nan oligosakarid sèk la (1-100 nmol) pou jwenn yon eksè 10-pliye oswa plis molè nan etikèt la sou fen a diminye.Reyaksyon an te pote soti nan 65 ° C pou 2 èdtan, apre sa echantiyon yo te imedyatman pirifye.Pa gen okenn cyanoborohydride sodyòm te itilize nan eksperyans yo etikèt san rediksyon, ak echantiyon yo te reyaji nan 65 ° C. pou 2.5 èdtan.
ELISA kouch ak lave echantiyon oligosakarid biotinylated.25 μl echantiyon biotinylated (100 μl nan chak echantiyon konsantre dilye nan 5 ml nan 0.1 M Tris solisyon tanpon (TBS)) yo te ajoute nan chak pi nan plak la avidin-kouvwi.Pwi kontwòl yo te kouvwi ak 50 μl nan biotin nan yon konsantrasyon nan 10 μg / ml nan 0.1 M TBS.Yo te itilize dlo deyonize kòm yon kouch pou mezi vid.Yo te enkube tablèt la pou 2 èdtan nan tanperati chanm nan fè nwa a.Lave plak la 3 fwa ak 0.1% lèt ekreme nan 0.1 M TBS lè l sèvi avèk pwogram No.11 pou Grenier plat 3A.
Adisyon ak lave nan antikò prensipal yo.Ajoute 40 µl antikò prensipal nan chak pi.Enkube mikroplak la pou 1 èdtan nan tanperati chanm nan fè nwa a.Lè sa a, plak yo te lave 3 fwa ak 0.1% lèt nan 0.1M TBS lè l sèvi avèk pwogram lave #11 pou Grenier Flat 3A.
Ajoute antikò segondè epi lave.Ajoute 50 µl antikò segondè sourit/rat (dilye 1:5000 nan 0.1% lèt nan 0.1 M TBS) nan chak pi.Enkube mikroplak la pou 1 èdtan nan tanperati chanm nan fè nwa a.Lè sa a, yo te lave mikroplak yo 5 fwa ak 0.1% lèt nan 0.1 M TBS lè l sèvi avèk pwogram lave plak Grenier Flat 5A #12.
Ajoute yon substra.Ajoute 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) nan substra baz la (pa ajoute 2 gout tanpon, 3 gout TMB, 2 gout oksijene idwojèn nan 15 ml dlo deyonize).Prepare substra TMB a.ak vortex anvan ou itilize).Enkube mikroplak la nan tanperati chanm pou 30 minit.Nan fè nwa a.
Ranpli etap la epi li tablèt la.Ajoute 50 µl asid silfirik 1 N nan chak pi epi anrejistre absorpsyon ant 450 ak 655 nm lè l sèvi avèk yon lektè ELISA.
Prepare 1 mg/ml solisyon analit sa yo nan dlo deyonize: arabinoz, rhamnose, fucose, xylose, asid galakturonik (GalA), asid glukuronik (GlcA), mannoz, glikoz, galaktoz, laktoz, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (estanda entèn).Yo te prepare de estanda lè yo ajoute solisyon sik 1 mg/mL yo montre nan Tablo 1. Echantiyon yo jele ak lyofilize nan -80 ° C jiskaske yo retire tout dlo (anjeneral apeprè 12-18 èdtan).
Ajoute 100–500 µg echantiyon nan tib bouchon vis sou yon balans analyse.Ekri kantite lajan an ajoute.Li pi bon pou fonn echantiyon an nan yon konsantrasyon espesifik nan sòlvan epi ajoute li nan tib la kòm yon aliquot likid.Sèvi ak 20 µl 1 mg/ml inositol kòm yon estanda entèn pou chak tib echantiyon.Kantite estanda entèn ki ajoute nan echantiyon an dwe menm ak kantite estanda entèn ki ajoute nan tib estanda a.
Ajoute 8 ml metanol anidrid nan yon flakon bouchon vis.Lè sa a, 4 ml nan 3 N. methanolic HCl solisyon, bouche epi souke.Pwosesis sa a pa sèvi ak dlo.
Ajoute 500 µl solisyon 1 M HCl metanol nan echantiyon oligosakarid yo ak tib estanda TMS yo.Echantiyon yo te enkube lannwit lan (168 èdtan) nan 80 ° C nan yon blòk tèmik.Seche pwodwi metanoliz la nan tanperati chanm lè l sèvi avèk yon manifoul siye.Ajoute 200 µl MeOH epi sèk ankò.Pwosesis sa a repete de fwa.Ajoute 200 µl metanol, 100 µl piridin ak 100 µl anhydride acetic nan echantiyon an epi melanje byen.Yo te enkube echantiyon yo nan tanperati chanm pou 30 minit.epi seche.Ajoute 200 µl metanol epi sèk ankò.
Ajoute 200 µl Tri-Sil ak tib chalè ki kouvri pou 20 minit.80 ° C, Lè sa a, refwadi nan tanperati chanm.Sèvi ak yon manifoul siye pou plis seche echantiyon an nan yon volim apeprè 50 µl.Li enpòtan sonje ke nou pa t pèmèt echantiyon yo sèk nèt.
Ajoute 2 ml hexane epi melanje byen nan vortexing.Ranpli pwent pipèt Pasteur (5-8 mm) ak yon moso lenn vè lè w mete lenn vè a sou tèt yon pipèt dyamèt 5-3/4 pous.Echantiyon yo te santrifuje nan 3000 g pou 2 minit.Nenpòt rezidi ensolubl yo presipite.Seche echantiyon an nan 100-150 µl.Yo te enjekte yon volim apeprè 1 μl nan GC-MS nan yon tanperati inisyal 80 °C ak yon tan inisyal 2.0 minit (Tablo 2).