გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
AFEX-ით წინასწარ დამუშავებულ სიმინდის ღუმელში მუდმივი ოლიგოსაქარიდების კომპლექსური ანალიზისთვის ახალი იმუნოლოგიური და მას-სპექტრომეტრიული მეთოდები. ლიგნოცელულოზური ბიომასა წარმოადგენს წიაღისეული საწვავის მდგრად ალტერნატივას და ფართოდ გამოიყენება ბიოტექნოლოგიების შესამუშავებლად ისეთი პროდუქტების წარმოებისთვის, როგორიცაა საკვები, საკვები, საწვავი და ქიმიკატები. ამ ტექნოლოგიების გასაღები არის ფასდაკლებით კონკურენტუნარიანი პროცესების შემუშავება მცენარის უჯრედის კედლებში არსებული რთული ნახშირწყლების მარტივ შაქრებად, როგორიცაა გლუკოზა, ქსილოზა და არაბინოზა. იმის გამო, რომ ლიგნოცელულოზური ბიომასა ძალიან ჯიუტია, სასურველი პროდუქტის მისაღებად ის უნდა დაექვემდებაროს თერმოქიმიურ დამუშავებას (მაგ., ამიაკის ბოჭკოების აქერცვლა (AFEX), განზავებული მჟავები (DA), იონური სითხეები (IL)) და ბიოლოგიურ დამუშავებას (მაგ., ფერმენტული ჰიდროლიზი და მიკრობული დუღილი). თუმცა, როდესაც ჰიდროლიზის პროცესში გამოიყენება კომერციული სოკოვანი ფერმენტები, წარმოქმნილი ხსნადი შაქრების მხოლოდ 75-85% არის მონოსაქარიდები, ხოლო დარჩენილი 15-25% არის ხსნადი, უმართავი ოლიგოსაქარიდები, რომლებიც ყოველთვის არ არის ხელმისაწვდომი მიკროორგანიზმებისთვის. ადრე, ჩვენ წარმატებით გამოვყავით და გავწმინდეთ ხსნადი ჯიუტი ოლიგოსაქარიდები ნახშირბადისა და დიატომური მიწის გამოყოფისა და ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფიის კომბინაციის გამოყენებით, ასევე გამოვიკვლიეთ მათი ფერმენტების ინჰიბიტორული თვისებები. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ოლიგოსაქარიდები, რომლებიც შეიცავს პოლიმერიზაციის (DP) მაღალი ხარისხის მეთილირებულ ურონის მჟავას ჩანაცვლებას, უფრო რთული დასამუშავებელია კომერციული ფერმენტების ნარევებით, ვიდრე დაბალი DP და ნეიტრალური ოლიგოსაქარიდები. აქ ჩვენ წარმოგიდგენთ რამდენიმე დამატებითი მეთოდის გამოყენებას, მათ შორის გლიკანის პროფილირებას მონოკლონური ანტისხეულების (mAbs) გამოყენებით, რომლებიც სპეციფიკურია მცენარის ბიომასის გლიკანებისთვის, მცენარის უჯრედის კედლებსა და ფერმენტულ ჰიდროლიზატებში გლიკანური ბმების დასახასიათებლად, მატრიცის დახმარებით ლაზერული დეზორბციის იონიზაციას, ფრენის დროის მას-სპექტრომეტრიას. . MALDI-TOF-MS) იყენებს სტრუქტურულ-ინფორმაციულ დიაგნოსტიკურ პიკებს, რომლებიც მიიღება სპექტროსკოპიით უარყოფითი იონების მეორადი დაშლის შემდეგ, გაზის ქრომატოგრაფიით და მას-სპექტრომეტრიით (GC-MS) ოლიგოსაქარიდური ბმების დასახასიათებლად დერივატიზაციით და მის გარეშე. ოლიგოსაქარიდების მცირე ზომის გამო (DP 4–20), ეს მოლეკულები რთულია გამოსაყენებლად mAb-ის შეკავშირებისა და დასახასიათებლად. ამ პრობლემის გადასაჭრელად, ჩვენ გამოვიყენეთ ბიოტინის კონიუგაციაზე დაფუძნებული ოლიგოსაქარიდის იმობილიზაციის ახალი მეთოდი, რომელმაც წარმატებით მონიშნა მიკროფირფიტის ზედაპირზე დაბალი DP ხსნადი ოლიგოსაქარიდების უმეტესობა, რომელიც შემდეგ გამოიყენეს მაღალი გამტარუნარიანობის mAb სისტემაში სპეციფიკური ლიგაციის ანალიზისთვის. ეს ახალი მეთოდი მომავალში ხელს შეუწყობს უფრო მოწინავე მაღალი გამტარუნარიანობის გლიკომის ანალიზების შემუშავებას, რომელთა გამოყენება შესაძლებელია ბიომარკერებში არსებული ოლიგოსაქარიდების იზოლირებისა და დასახასიათებლად დიაგნოსტიკური მიზნებისთვის.
ლიგნოცელულოზური ბიომასა, რომელიც შედგება სასოფლო-სამეურნეო, სატყეო, ბალახოვანი და ხის მასალებისგან, წარმოადგენს პოტენციურ ნედლეულს ბიოპროდუქტების წარმოებისთვის, მათ შორის საკვების, საკვების, საწვავის და ქიმიური პრეკურსორების წარმოებისთვის, რათა წარმოიქმნას უფრო მაღალი ღირებულების მქონე პროდუქტები1. მცენარეთა უჯრედის კედლებში არსებული ნახშირწყლები (როგორიცაა ცელულოზა და ჰემიცელულოზა) დეპოლიმერიზდება მონოსაქარიდებად ქიმიური დამუშავებით და ბიოტრანსფორმაციით (როგორიცაა ფერმენტული ჰიდროლიზი და მიკრობული დუღილი). გავრცელებული წინასწარი დამუშავება მოიცავს ამიაკის ბოჭკოების გაფართოებას (AFEX), განზავებულ მჟავას (DA), იონურ სითხეს (IL) და ორთქლის აფეთქებას (SE), რომლებიც იყენებენ ქიმიკატებისა და სითბოს კომბინაციას ლიგნოცელულოზის წარმოების შესამცირებლად მცენარის უჯრედის კედლების გახსნით3,4. ნივთიერების სიჯიუტე, 5. ფერმენტული ჰიდროლიზი ხორციელდება მაღალი მყარი დატვირთვის დროს კომერციული აქტიური ნახშირწყლების შემცველი ფერმენტების (CAZymes) გამოყენებით და მიკრობული დუღილი ტრანსგენური საფუარების ან ბაქტერიების გამოყენებით ბიოზე დაფუძნებული საწვავის და ქიმიკატების წარმოებისთვის6.
კომერციულ ფერმენტებში არსებული CAZyms შედგება ფერმენტების რთული ნარევისგან, რომლებიც სინერგიულად არღვევენ ნახშირწყალ-შაქრის რთულ ბმებს მონოსაქარიდების წარმოსაქმნელად2,7. როგორც ადრე აღვნიშნეთ, ლიგნინისა და ნახშირწყლების არომატული პოლიმერების რთული ქსელი მათ ძალიან რთულს ხდის, რაც იწვევს შაქრის არასრულ გარდაქმნას, რის შედეგადაც გროვდება სქესობრივი ოლიგოსაქარიდების 15-25%, რომლებიც არ წარმოიქმნება წინასწარ დამუშავებული ბიომასის ფერმენტული ჰიდროლიზის დროს. ეს ბიომასის სხვადასხვა წინასწარი დამუშავების მეთოდის საერთო პრობლემაა. ამ შეფერხების ზოგიერთი მიზეზი მოიცავს ჰიდროლიზის დროს ფერმენტების ინჰიბირებას, ან მცენარეულ ბიომასაში შაქრის ბმების გასაწყვეტად საჭირო აუცილებელი ფერმენტების არარსებობას ან დაბალ დონეს. შაქრების შემადგენლობისა და სტრუქტურული მახასიათებლების გაგება, როგორიცაა ოლიგოსაქარიდებში შაქრის ბმები, დაგვეხმარება ჰიდროლიზის დროს შაქრის გარდაქმნის გაუმჯობესებაში, რაც ბიოტექნოლოგიურ პროცესებს ნავთობპროდუქტებისგან მიღებულ პროდუქტებთან შედარებით კონკურენტუნარიანს გახდის.
ნახშირწყლების სტრუქტურის განსაზღვრა რთულია და მოითხოვს ისეთი მეთოდების კომბინაციას, როგორიცაა თხევადი ქრომატოგრაფია (LC)11,12, ბირთვულ-მაგნიტურ-რეზონანსული სპექტროსკოპია (NMR)13, კაპილარული ელექტროფორეზი (CE)14,15,16 და მას-სპექტრომეტრია (MS)17. ,თვრამეტი. MS მეთოდები, როგორიცაა ლაზერული დესორბციისა და იონიზაციის დროის მას-სპექტრომეტრია მატრიცის გამოყენებით (MALDI-TOF-MS), ნახშირწყლების სტრუქტურების იდენტიფიცირების მრავალმხრივი მეთოდია. ბოლო დროს, ნატრიუმის იონური ადუქტების შეჯახებით გამოწვეული დისოციაციის (CID) ტანდემური მას-სპექტრომეტრია ყველაზე ფართოდ გამოიყენება ოლიგოსაქარიდის შეერთების პოზიციების, ანომერული კონფიგურაციების, თანმიმდევრობების და განშტოების პოზიციების შესაბამისი თითის ანაბეჭდების იდენტიფიცირებისთვის 20, 21.
გლიკანის ანალიზი შესანიშნავი ინსტრუმენტია ნახშირწყლოვანი ბმების სიღრმისეული იდენტიფიცირებისთვის22. ეს მეთოდი იყენებს მონოკლონურ ანტისხეულებს (mAbs), რომლებიც მიმართულია მცენარის უჯრედის კედლის გლიკანზე, როგორც ზონდები, რათა გაიგოს რთული ნახშირწყლოვანი კავშირები. მსოფლიოში ხელმისაწვდომია 250-ზე მეტი mAb, რომლებიც შექმნილია სხვადასხვა ხაზოვანი და განშტოებული ოლიგოსაქარიდების წინააღმდეგ სხვადასხვა საქარიდების გამოყენებით24. რამდენიმე mAb ფართოდ გამოიყენება მცენარის უჯრედის კედლის სტრუქტურის, შემადგენლობისა და მოდიფიკაციების დასახასიათებლად, რადგან არსებობს მნიშვნელოვანი განსხვავებები მცენარის უჯრედის ტიპის, ორგანოს, ასაკის, განვითარების სტადიისა და ზრდის გარემოს მიხედვით25,26. ბოლო დროს, ეს მეთოდი გამოიყენება მცენარეთა და ცხოველთა სისტემებში ვეზიკულების პოპულაციების და მათი შესაბამისი როლების გასაგებად გლიკანის ტრანსპორტში, რაც განისაზღვრება სუბუჯრედული მარკერებით, განვითარების სტადიებით ან გარემო სტიმულებით, და ფერმენტული აქტივობის დასადგენად. გლიკანებისა და ქსილანების ზოგიერთი განსხვავებული სტრუქტურა, რომლებიც იდენტიფიცირებულია, მოიცავს პექტინს (P), ქსილანს (X), მანანს (M), ქსილოგლუკანებს (XylG), შერეული ბმების გლუკანებს (MLG), არაბინოქსილანს (ArbX), გალაქტომანანს (GalG), გლუკურონის მჟავა-არაბინოქსილანს (GArbX) და არაბინო-გალაქტანს (ArbG)29.
თუმცა, ამ ყველა კვლევითი ძალისხმევის მიუხედავად, მხოლოდ რამდენიმე კვლევა იყო ფოკუსირებული ოლიგოსაქარიდების დაგროვების ბუნებაზე მაღალი მყარი ნივთიერებების დატვირთვის (HSL) ჰიდროლიზის დროს, მათ შორის ოლიგოსაქარიდების გამოთავისუფლებაზე, ოლიგომერული ჯაჭვის სიგრძის ცვლილებებზე ჰიდროლიზის დროს, სხვადასხვა დაბალი DP პოლიმერებსა და მათ განაწილების მრუდებზე 30,31,32. ამასობაში, მიუხედავად იმისა, რომ გლიკანის ანალიზი აღმოჩნდა სასარგებლო ინსტრუმენტი გლიკანის სტრუქტურის ყოვლისმომცველი ანალიზისთვის, რთულია წყალში ხსნადი დაბალი DP ოლიგოსაქარიდების შეფასება ანტისხეულების მეთოდების გამოყენებით. უფრო მცირე DP ოლიგოსაქარიდები, რომელთა მოლეკულური წონა 5-10 kDa-ზე ნაკლებია, არ უკავშირდება ELISA ფირფიტებს 33, 34 და ანტისხეულების დამატებამდე ირეცხება.
აქ, პირველად, ჩვენ ვაჩვენებთ ELISA ანალიზს ავიდინით დაფარულ ფირფიტებზე მონოკლონური ანტისხეულების გამოყენებით, ხსნადი რეფრაქტერული ოლიგოსაქარიდებისთვის ერთსაფეხურიანი ბიოტინილირების პროცედურის გლიკომის ანალიზთან ერთად. გლიკომის ანალიზისადმი ჩვენი მიდგომა დადასტურდა MALDI-TOF-MS და GC-MS-ზე დაფუძნებული დამატებითი ოლიგოსაქარიდული კავშირების ანალიზით, ჰიდროლიზებული შაქრის შემადგენლობების ტრიმეთილსილილის (TMS) დერივატიზაციის გამოყენებით. ეს ინოვაციური მიდგომა შეიძლება შემუშავდეს, როგორც მაღალი გამტარუნარიანობის მეთოდი მომავალში და უფრო ფართო გამოყენება იპოვოს ბიოსამედიცინო კვლევებში35.
ფერმენტებისა და ანტისხეულების პოსტტრანსლაციური მოდიფიკაციები, როგორიცაა გლიკოზილირება,36 გავლენას ახდენს მათ ბიოლოგიურ აქტივობაზე. მაგალითად, შრატის ცილების გლიკოზილირების ცვლილებები მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ანთებითი ართრიტის დროს და გლიკოზილირების ცვლილებები გამოიყენება დიაგნოსტიკურ მარკერებად37. ლიტერატურაში აღწერილია სხვადასხვა გლიკანის ადვილად გამოვლენა სხვადასხვა დაავადების დროს, მათ შორის კუჭ-ნაწლავის ტრაქტისა და ღვიძლის ქრონიკული ანთებითი დაავადებების, ვირუსული ინფექციების, საკვერცხეების, სარძევე ჯირკვლისა და პროსტატის კიბოს დროს38,39,40. გლიკანების სტრუქტურის გაგება ანტისხეულებზე დაფუძნებული გლიკანის ELISA მეთოდების გამოყენებით, დაავადების დიაგნოზის დასმას დამატებით ნდობას უზრუნველყოფს რთული გაფანტული სკლეროზის მეთოდების გამოყენების გარეშე.
ჩვენმა წინა კვლევამ აჩვენა, რომ ჯიუტი ოლიგოსაქარიდები წინასწარი დამუშავებისა და ფერმენტული ჰიდროლიზის შემდეგ არაჰიდროლიზებული რჩებოდა (სურათი 1). ჩვენს ადრე გამოქვეყნებულ ნაშრომში შევიმუშავეთ გააქტიურებული ნახშირის მყარი ფაზის ექსტრაქციის მეთოდი ოლიგოსაქარიდების AFEX-ით წინასწარ დამუშავებული სიმინდის სათესლე ჰიდროლიზატიდან (ACSH)8 იზოლირებისთვის. საწყისი ექსტრაქციისა და გამოყოფის შემდეგ, ოლიგოსაქარიდები შემდგომში დაიყო ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფიით (SEC) და შეგროვდა მოლეკულური წონის მიხედვით. სხვადასხვა წინასწარი დამუშავებიდან გამოთავისუფლებული შაქრის მონომერები და ოლიგომერები გაანალიზდა შაქრის შემადგენლობის ანალიზით. სხვადასხვა წინასწარი დამუშავების მეთოდით მიღებული შაქრის ოლიგომერების შემცველობის შედარებისას, ჯიუტი ოლიგოსაქარიდების არსებობა საერთო პრობლემაა ბიომასის მონოსაქარიდებად გარდაქმნისას და შეიძლება გამოიწვიოს შაქრის მოსავლიანობის შემცირება მინიმუმ 10-15%-ით და 18%-მდეც კი. აშშ-ში. ეს მეთოდი გამოიყენება ოლიგოსაქარიდების ფრაქციების შემდგომი მასშტაბური წარმოებისთვის. შედეგად მიღებული ACH და მისი შემდგომი ფრაქციები სხვადასხვა მოლეკულური წონით გამოყენებული იქნა ექსპერიმენტულ მასალად ოლიგოსაქარიდების დასახასიათებლად ამ ნაშრომში.
წინასწარი დამუშავებისა და ფერმენტული ჰიდროლიზის შემდეგ, მუდმივი ოლიგოსაქარიდები არაჰიდროლიზირებული დარჩა. აქ (A) წარმოდგენილია ოლიგოსაქარიდების გამოყოფის მეთოდი, რომლის დროსაც ოლიგოსაქარიდები იზოლირებულია AFEX-ით წინასწარ დამუშავებული სიმინდის სათესლე ჰიდროლიზატიდან (ACSH) გააქტიურებული ნახშირბადის და დიატომური მიწის შეფუთული ფენის გამოყენებით; (B) ოლიგოსაქარიდების გამოყოფის მეთოდი. ოლიგოსაქარიდები შემდგომ გამოიყო ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფიით (SEC); (C) სხვადასხვა წინასწარი დამუშავებიდან გამოთავისუფლებული საქარიდის მონომერები და ოლიგომერები (განზავებული მჟავა: DA, იონური სითხე: IL და AFEX). ფერმენტული ჰიდროლიზის პირობები: მყარი ნივთიერებების მაღალი შემცველობა 25% (w/w) (დაახლოებით 8% გლუკანის დატვირთვა), 96 საათიანი ჰიდროლიზი, 20 მგ/გ კომერციული ფერმენტული დატვირთვა (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 თანაფარდობა) და (D) AFEX-ით წინასწარ დამუშავებული სიმინდის სათესლედან (ACS) გამოთავისუფლებული შაქრის მონომერები და გლუკოზის, ქსილოზის და არაბინოზის ოლიგომერები.
გლიკანის ანალიზი სასარგებლო ინსტრუმენტი აღმოჩნდა გლიკანების ყოვლისმომცველი სტრუქტურული ანალიზისთვის მყარი ბიომასის ნარჩენებიდან იზოლირებულ ექსტრაქტებში. თუმცა, წყალში ხსნადი საქარიდები ნაკლებად არის წარმოდგენილი ამ ტრადიციული მეთოდის გამოყენებით41, რადგან დაბალი მოლეკულური წონის ოლიგოსაქარიდების იმობილიზაცია ELISA ფირფიტებზე რთულია და ისინი ანტისხეულების დამატებამდე ირეცხება. ამიტომ, ანტისხეულების შეკავშირებისა და დახასიათებისთვის, ერთსაფეხურიანი ბიოტინილირების მეთოდი გამოყენებული იქნა ხსნადი, შეუთავსებელი ოლიგოსაქარიდების ავიდინით დაფარულ ELISA ფირფიტებზე დასაფარად. ეს მეთოდი გამოცდილი იქნა ჩვენს მიერ ადრე წარმოებული ACSH-ის და მისი მოლეკულური წონის (ან პოლიმერიზაციის ხარისხის, DP) მიხედვით ფრაქციის გამოყენებით. ერთსაფეხურიანი ბიოტინილირება გამოყენებული იქნა ოლიგოსაქარიდთან შეკავშირების აფინურობის გასაზრდელად, ნახშირწყლების აღმდგენ ბოლოში ბიოტინ-LC-ჰიდრაზიდის დამატებით (სურ. 2). ხსნარში, აღმდგენ ბოლოში ჰემიაცეტალური ჯგუფი რეაგირებს ბიოტინ-LC-ჰიდრაზიდის ჰიდრაზიდულ ჯგუფთან ჰიდრაზონული ბმის წარმოქმნით. აღმდგენ აგენტ NaCNBH3-ის თანაობისას, ჰიდრაზონური ბმა აღდგება სტაბილურ ბიოტინილირებულ საბოლოო პროდუქტამდე. შაქრის შემამცირებელი ბოლოების მოდიფიკაციით, დაბალი DP ოლიგოსაქარიდების ELISA ფირფიტებთან შეკავშირება შესაძლებელი გახდა და ჩვენს კვლევაში ეს განხორციელდა ავიდინით დაფარულ ფირფიტებზე გლიკან-მიზნობრივი mAbs-ის გამოყენებით.
მონოკლონური ანტისხეულების სკრინინგი ბიოტინილირებული ოლიგოსაქარიდების ELISA მეთოდით. ​​აქ (A) გაერთიანებულია ოლიგოსაქარიდების ბიოტინილირება და შემდგომი ELISA სკრინინგი გლიკან-მიზნობრივი mAbs-ებით NeutrAvidin-ით დაფარულ ფირფიტებზე და (B) ნაჩვენებია რეაქციის პროდუქტების ბიოტინილირების ერთსაფეხურიანი პროცედურა.
ოლიგოსაქარიდთან კონიუგირებული ანტისხეულების შემცველი ავიდინით დაფარული ფირფიტები შემდეგ დაემატა პირველად და მეორად ანტისხეულებს და გაირეცხა სინათლისა და დროის მიმართ მგრძნობიარე გარემოში. ანტისხეულების შეკავშირების დასრულების შემდეგ, ფირფიტის ინკუბაციისთვის დაამატეთ TMB სუბსტრატი. რეაქცია საბოლოოდ შეჩერდა გოგირდმჟავით. ინკუბირებული ფირფიტები გაანალიზდა ELISA წამკითხველის გამოყენებით, რათა დადგინდეს თითოეული ანტისხეულის შეკავშირების სიძლიერე ანტისხეულ-სპეციფიკური ჯვარედინი შეკავშირების დასადგენად. ექსპერიმენტის დეტალებისა და პარამეტრებისთვის იხილეთ შესაბამისი განყოფილება „მასალები და მეთოდები“.
ჩვენ ვაჩვენებთ ამ ახლად შემუშავებული მეთოდის სარგებლიანობას სპეციფიკური გამოყენებისთვის ACSH-ში არსებული ხსნადი ოლიგოსაქარიდების დახასიათებით, ასევე ლიგნოცელულოზური ჰიდროლიზატებიდან იზოლირებული ნედლი და გაწმენდილი ოლიგოსაქარიდების ფრაქციებში. როგორც ნაჩვენებია ნახაზ 3-ში, ბიოაცილირებული გლიკომის ანალიზის მეთოდების გამოყენებით ACSH-ში იდენტიფიცირებული ყველაზე გავრცელებული ეპიტოპ-ჩანაცვლებული ქსილანები, როგორც წესი, არის ურონის (U) ან მეთილურონის (MeU) და პექტინის არაბინოგალაქტანები. მათი უმეტესობა ასევე აღმოჩენილი იქნა ჩვენს წინა კვლევაში, რომელიც ეხებოდა არაჰიდროლიზებული მყარი ნივთიერებების (UHS) გლიკანების ანალიზს43.
უჯრედის კედლის გლიკანის მიმართ მიმართული მონოკლონური ანტისხეულის გამოყენებით, რომელიც მდგრადი ოლიგოსაქარიდის ეპიტოპების აღმოჩენას გულისხმობს. „ნეიტრალური“ ფრაქცია არის ACN ფრაქცია, ხოლო „მჟავე“ ფრაქცია არის FA ფრაქცია. სითბურ რუკაზე უფრო კაშკაშა წითელი ფერები ეპიტოპის უფრო მაღალ შემცველობაზე მიუთითებს, ხოლო კაშკაშა ლურჯი - ცარიელ ფონზე. შკალაზე ფერის მნიშვნელობები ეფუძნება N=2 ფორმულირებების ნედლ OD მნიშვნელობებს. ანტისხეულების მიერ ამოცნობილი ძირითადი ეპიტოპები ნაჩვენებია მარჯვნივ.
ეს არაცელულოზური სტრუქტურები ვერ დაიშლებოდა ყველაზე გავრცელებული ცელულოზებისა და ჰემიცელულოზების მიერ ტესტირებულ კომერციულ ფერმენტულ ნარევში, რომელიც მოიცავს ყველაზე ხშირად გამოყენებულ კომერციულ ფერმენტებს. ამიტომ, მათი ჰიდროლიზისთვის საჭიროა ახალი დამხმარე ფერმენტები. აუცილებელი არაცელულოზური დამხმარე ფერმენტების გარეშე, ეს არაცელულოზური ბმები ხელს უშლის მონოსაქარიდებად სრულ გარდაქმნას, მაშინაც კი, თუ მათი მშობელი შაქრის პოლიმერები ინტენსიურად ჰიდროლიზდება უფრო მოკლე ფრაგმენტებად და იხსნება კომერციული ფერმენტული ნარევების გამოყენებით.
სიგნალის განაწილებისა და მისი შეკავშირების სიძლიერის შემდგომმა შესწავლამ აჩვენა, რომ შეკავშირების ეპიტოპები უფრო დაბალი იყო მაღალი DP შაქრის ფრაქციებში (A, B, C, DP 20+-მდე), ვიდრე დაბალი DP ფრაქციებში (D, E, F, DP) დიმერებში (სურ. 1). მჟავა ფრაგმენტები უფრო ხშირია არაცელულოზურ ეპიტოპებში, ვიდრე ნეიტრალურ ფრაგმენტებში. ეს მოვლენები შეესაბამება ჩვენს წინა კვლევაში დაფიქსირებულ ნიმუშს, სადაც მაღალი DP და მჟავა ფრაგმენტები უფრო მდგრადი იყო ფერმენტული ჰიდროლიზის მიმართ. ამიტომ, არაცელულოზური გლიკანის ეპიტოპების და U და MeU ჩანაცვლებების არსებობამ შეიძლება მნიშვნელოვნად შეუწყოს ხელი ოლიგოსაქარიდების სტაბილურობას. უნდა აღინიშნოს, რომ შეკავშირებისა და აღმოჩენის ეფექტურობა შეიძლება პრობლემური იყოს დაბალი DP ოლიგოსაქარიდებისთვის, განსაკუთრებით თუ ეპიტოპი არის დიმერული ან ტრიმერული ოლიგოსაქარიდი. ამის შემოწმება შესაძლებელია სხვადასხვა სიგრძის კომერციული ოლიგოსაქარიდების გამოყენებით, რომელთაგან თითოეული შეიცავს მხოლოდ ერთ ეპიტოპს, რომელიც უკავშირდება კონკრეტულ mAb-ს.
ამგვარად, სტრუქტურა-სპეციფიკური ანტისხეულების გამოყენებამ გამოავლინა გარკვეული ტიპის მედეგი ბმები. გამოყენებული ანტისხეულის ტიპის, შესაბამისი ლიგაციის ნიმუშისა და მის მიერ წარმოქმნილი სიგნალის სიძლიერის (ყველაზე და ნაკლებად უხვად) მიხედვით, შესაძლებელია ახალი ფერმენტების იდენტიფიცირება და ნახევრად რაოდენობრივად დამატება ფერმენტულ ნარევში უფრო სრული გლიკოკონვერსიისთვის. ACSH ოლიგოსაქარიდების ანალიზის მაგალითის სახით, ჩვენ შეგვიძლია შევქმნათ გლიკანური ბმების მონაცემთა ბაზა თითოეული ბიომასის მასალისთვის. აქვე უნდა აღინიშნოს, რომ უნდა იქნას გათვალისწინებული ანტისხეულების განსხვავებული აფინურობა და თუ მათი აფინურობა უცნობია, ეს გარკვეულ სირთულეებს შექმნის სხვადასხვა ანტისხეულების სიგნალების შედარებისას. გარდა ამისა, გლიკანური ბმების შედარება შეიძლება საუკეთესოდ იმუშაოს ერთი და იგივე ანტისხეულის ნიმუშებს შორის. ეს ჯიუტი ბმები შემდეგ შეიძლება დაუკავშირდეს CAZyme მონაცემთა ბაზას, საიდანაც შეგვიძლია ფერმენტების იდენტიფიცირება, კანდიდატი ფერმენტების შერჩევა და ბმების დამრღვევი ფერმენტების ტესტირება, ან მიკრობული სისტემების შემუშავება ამ ფერმენტების გამოსახატავად ბიორეფინერებში გამოსაყენებლად44.
იმის შესაფასებლად, თუ როგორ ავსებენ იმუნოლოგიური მეთოდები ლიგნოცელულოზურ ჰიდროლიზატებში არსებული დაბალი მოლეკულური წონის ოლიგოსაქარიდების დასახასიათებლად ალტერნატიულ მეთოდებს, ჩვენ ჩავატარეთ MALDI (სურ. 4, S1-S8) და TMS-ისგან მიღებული საქარიდების ანალიზი GC-MS-ზე დაყრდნობით იმავე პანელის (სურ. 5) ოლიგოსაქარიდულ ნაწილზე. MALDI გამოიყენება იმის შესადარებლად, შეესაბამება თუ არა ოლიგოსაქარიდის მოლეკულების მასის განაწილება დაგეგმილ სტრუქტურას. სურ. 4-ზე ნაჩვენებია ნეიტრალური კომპონენტების ACN-A და ACN-B მასის განაწილება. ACN-A ანალიზმა დაადასტურა პენტოზური შაქრების დიაპაზონი DP 4–8-დან (სურ. 4) DP 22-მდე (სურ. S1), რომელთა წონები შეესაბამება MeU-ქსილანურ ოლიგოსაქარიდებს. ACN-B ანალიზმა დაადასტურა პენტოზური და გლუკოქსილანური სერიები DP 8-15-ით. დამატებით მასალაში, როგორიცაა სურათი S3, FA-C მჟავე ფრაგმენტის მასის განაწილების რუკები აჩვენებს (Me)U-ით ჩანაცვლებული პენტოზური შაქრების დიაპაზონს 8-15 DP-ით, რაც შეესაბამება ELISA-ზე დაფუძნებული mAb სკრინინგის დროს აღმოჩენილ ჩანაცვლებულ ქსილანებს. ეპიტოპები თანმიმდევრულია.
ACS-ში არსებული ხსნადი შეუთავსებელი ოლიგოსაქარიდების MALDI-MS სპექტრი. აქ, (A) ACN-A დაბალი წონის დიაპაზონის ფრაქციები, რომლებიც შეიცავს მეთილირებულ ურონის მჟავას (DP 4-8) ჩანაცვლებულ გლუკუროქსილან ოლიგოსაქარიდებს და (B) ACN-B ქსილანს და მეთილირებულ ურონის მჟავას ოლიგოსაქარიდებს, რომლებიც ჩანაცვლებულია გლუკუროქსილანით (DP 8-15).
რეფრაქტერული ოლიგოსაქარიდების გლიკანური ნაშთის შემადგენლობის ანალიზი. აქ (A) GC-MS ანალიზის გამოყენებით მიღებული სხვადასხვა ოლიგოსაქარიდის ფრაქციების TMS საქარიდის შემადგენლობა. (B) ოლიგოსაქარიდებში არსებული სხვადასხვა TMS-წარმოებული შაქრების სტრუქტურები. ACN – ნეიტრალური ოლიგოსაქარიდების შემცველი აცეტონიტრილის ფრაქცია და FA – მჟავა ოლიგოსაქარიდების შემცველი ფერულის მჟავას ფრაქცია.
კიდევ ერთი საინტერესო დასკვნა გამოიტანეს ოლიგოსაქარიდის ფრაქციის LC-MS ანალიზიდან, როგორც ეს ნაჩვენებია ნახაზ S9-ზე (მეთოდები შეგიძლიათ იხილოთ ელექტრონულ დამატებით მასალაში). ჰექსოზის და -OAc ჯგუფების ფრაგმენტები არაერთხელ დაფიქსირდა ACN-B ფრაქციის ლიგაციის დროს. ეს აღმოჩენა არა მხოლოდ ადასტურებს გლიკომისა და MALDI-TOF ანალიზში დაფიქსირებულ ფრაგმენტაციას, არამედ გვაწვდის ახალ ინფორმაციას წინასწარ დამუშავებულ ლიგნოცელულოზურ ბიომასაში ნახშირწყლების პოტენციური წარმოებულების შესახებ.
ასევე გავაანალიზეთ ოლიგოსაქარიდების ფრაქციის შაქრის შემადგენლობა TMS შაქრის დერივატიზაციის გამოყენებით. GC-MS-ის გამოყენებით, განვსაზღვრეთ ნეირონული (არადერივაციული) და მჟავე შაქრების (GluA და GalA) შემადგენლობა ოლიგოსაქარიდულ ფრაქციაში (სურ. 5). გლუკურონის მჟავა გვხვდება მჟავე კომპონენტებში C და D, ხოლო გალაქტურონის მჟავა გვხვდება მჟავე კომპონენტებში A და B, რომლებიც ორივე მჟავე შაქრების მაღალი DP კომპონენტებია. ეს შედეგები არა მხოლოდ ადასტურებს ჩვენს ELISA და MALDI მონაცემებს, არამედ შეესაბამება ოლიგოსაქარიდების დაგროვების ჩვენს წინა კვლევებს. ამიტომ, ჩვენ გვჯერა, რომ ოლიგოსაქარიდების ბიოტინილირებისა და შემდგომი ELISA სკრინინგის გამოყენებით თანამედროვე იმუნოლოგიური მეთოდები საკმარისია სხვადასხვა ბიოლოგიურ ნიმუშებში ხსნადი რეკალციტრანტული ოლიგოსაქარიდების აღმოსაჩენად.
ვინაიდან ELISA-ზე დაფუძნებული mAb სკრინინგის მეთოდები რამდენიმე სხვადასხვა მეთოდით იქნა დადასტურებული, ჩვენ გვინდოდა ამ ახალი რაოდენობრივი მეთოდის პოტენციალის შემდგომი შესწავლა. ორი კომერციული ოლიგოსაქარიდი, ქსილოჰექსასაქარიდის ოლიგოსაქარიდი (XHE) და 23-α-L-არაბინოფურანოზილ-ქსილოტრიოზი (A2XX), შეძენილი და გამოსცადეს უჯრედის კედლის გლიკანზე მიმართული ახალი mAb მიდგომის გამოყენებით. სურათი 6 აჩვენებს ბიოტინილირებულ შეკავშირების სიგნალსა და ოლიგოსაქარიდის კონცენტრაციის ლოგარითმულ კონცენტრაციას შორის წრფივ კორელაციას, რაც მიუთითებს ლენგმიურის ადსორბციის შესაძლო მოდელზე. mAb-ებს შორის, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 და CCRC-M151 კორელაციაში იყო XHE-სთან, ხოლო CCRC-M108, CCRC-M109 და LM11 კორელაციაში იყო A2XX-თან 1 ნმ-დან 100 ნანომდე დიაპაზონში. ექსპერიმენტის დროს ანტისხეულების შეზღუდული ხელმისაწვდომობის გამო, თითოეული ოლიგოსაქარიდის კონცენტრაციით შეზღუდული ექსპერიმენტები ჩატარდა. აქვე უნდა აღინიშნოს, რომ ზოგიერთი ანტისხეული ძალიან განსხვავებულად რეაგირებს ერთსა და იმავე ოლიგოსაქარიდზე, როგორც სუბსტრატზე, სავარაუდოდ იმიტომ, რომ ისინი უკავშირდებიან ოდნავ განსხვავებულ ეპიტოპებს და შეიძლება ჰქონდეთ ძალიან განსხვავებული შეკავშირების აფინურობა. ეპიტოპის ზუსტი იდენტიფიკაციის მექანიზმები და შედეგები გაცილებით უფრო რთული იქნება, როდესაც ახალი mAb მიდგომა რეალურ ნიმუშებზე იქნება გამოყენებული.
სხვადასხვა გლიკან-მიზნობრივი mAbs-ის აღმოჩენის დიაპაზონის დასადგენად გამოყენებული იქნა ორი კომერციული ოლიგოსაქარიდი. აქ, ოლიგოსაქარიდის კონცენტრაციის ლოგარითმული კონცენტრაციით წრფივი კორელაცია მიუთითებს ლენგმიურის ადსორბციის ნიმუშებზე (A) XHE mAb-თან და (B) A2XX mAb-თან. შესაბამისი ეპიტოპები მიუთითებს ანალიზში სუბსტრატებად გამოყენებული კომერციული ოლიგოსაქარიდების სტრუქტურებზე.
გლიკან-მიზნობრივი მონოკლონური ანტისხეულების გამოყენება (გლიკოკომიური ანალიზი ან ELISA-ზე დაფუძნებული mAb სკრინინგი) წარმოადგენს ძლიერ ინსტრუმენტს მცენარის ბიომასის შემადგენელი ძირითადი უჯრედის კედლის გლიკანების უმეტესობის სიღრმისეული დახასიათებისთვის. თუმცა, კლასიკური გლიკანური ანალიზი ახასიათებს მხოლოდ უფრო დიდ უჯრედის კედლის გლიკანებს, რადგან ოლიგოსაქარიდების უმეტესობა ეფექტურად არ იმობილიზებულია ELISA ფირფიტებზე. ამ კვლევაში, AFEX-ით წინასწარ დამუშავებული სიმინდის ღვეზელი ფერმენტულად ჰიდროლიზდა მაღალი მყარი ნივთიერებების შემცველობით. შაქრის ანალიზი გამოყენებული იქნა ჰიდროლიზატში მდგრადი უჯრედის კედლის ნახშირწყლების შემადგენლობის დასადგენად. თუმცა, ჰიდროლიზატებში მცირე ზომის ოლიგოსაქარიდების mAb ანალიზი არასაკმარისად არის შეფასებული და ოლიგოსაქარიდების ELISA ფირფიტებზე ეფექტური იმობილიზაციისთვის საჭიროა დამატებითი ინსტრუმენტები.
აქ ჩვენ წარმოგიდგენთ mAb სკრინინგისთვის ოლიგოსაქარიდის იმობილიზაციის ახალ და ეფექტურ მეთოდს, რომელიც აერთიანებს ოლიგოსაქარიდის ბიოტინილირებას, რასაც მოჰყვება ELISA სკრინინგ NeutrAvidin™-ით დაფარულ ფირფიტებზე. იმობილიზებული ბიოტინილირებული ოლიგოსაქარიდები ავლენენ საკმარის აფინურობას ანტისხეულის მიმართ, რაც უზრუნველყოფს მედეგი ოლიგოსაქარიდების სწრაფ და ეფექტურ გამოვლენას. ამ ჯიუტი ოლიგოსაქარიდების შემადგენლობის ანალიზმა მას-სპექტრომეტრიის საფუძველზე დაადასტურა იმუნოსკრინინგის ამ ახალი მიდგომის შედეგები. ამრიგად, ეს კვლევები აჩვენებს, რომ ოლიგოსაქარიდის ბიოტინილირებისა და ELISA სკრინინგის კომბინაცია გლიკან-მიზნობრივ მონოკლონურ ანტისხეულებთან შეიძლება გამოყენებულ იქნას ოლიგოსაქარიდებში ჯვარედინი ბმების აღმოსაჩენად და შეიძლება ფართოდ იქნას გამოყენებული ოლიგოსაქარიდების სტრუქტურის დამახასიათებელ სხვა ბიოქიმიურ კვლევებში.
ბიოტინზე დაფუძნებული გლიკანის პროფილირების ეს მეთოდი პირველი ანგარიშია, რომელსაც შეუძლია შეისწავლოს მცენარეულ ბიომასაში ხსნადი ოლიგოსაქარიდების მდგრადი ნახშირწყლოვანი ბმები. ეს ხელს უწყობს იმის გაგებას, თუ რატომ არის ბიომასის ზოგიერთი ნაწილი ასეთი ჯიუტი ბიოსაწვავის წარმოებისას. ეს მეთოდი ავსებს გლიკომის ანალიზის მეთოდებში არსებულ მნიშვნელოვან ხარვეზს და აფართოებს მის გამოყენებას მცენარეული ოლიგოსაქარიდების მიღმა სუბსტრატების უფრო ფართო სპექტრზე. მომავალში, შესაძლოა, რობოტიკა გამოვიყენოთ ბიოტინილირებისთვის და გამოვიყენოთ ჩვენს მიერ შემუშავებული მეთოდი ELISA-ს გამოყენებით ნიმუშების მაღალი გამტარუნარიანობის ანალიზისთვის.
Pioneer 33A14 ჰიბრიდული თესლიდან მოყვანილი სიმინდის ჩალა (CS) 2010 წელს კოლორადოს შტატის ქალაქ რეიში, კრამერის ფერმებში იქნა მოკრეფილი. მიწის მესაკუთრის ნებართვით, ამ ბიომასის გამოყენება კვლევისთვის შესაძლებელია. ნიმუშები ინახებოდა მშრალ, < 6%-იან ტენიანობაზე, ელვაშესაკრავ პარკებში, ოთახის ტემპერატურაზე. ნიმუშები ინახებოდა მშრალ, < 6%-იან ტენიანობაზე, ელვაშესაკრავ პარკებში, ოთახის ტემპერატურაზე. Образцы храниль сухими при влажности < 6% პაკეტში სასტეჟკოй-молнией при комнатной ტემპერატურა. ნიმუშები ინახებოდა მშრალ ადგილას <6%-იანი ტენიანობის პირობებში, ელვაშესაკრავ პარკებში, ოთახის ტემპერატურაზე.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температура со влажностью < 6%. ნიმუშები ინახება ელვაშესაკრავ პარკებში ოთახის ტემპერატურაზე, 6%-ზე ნაკლები ტენიანობით.კვლევა შეესაბამებოდა ადგილობრივ და ეროვნულ მითითებებს. შემადგენლობის ანალიზი ჩატარდა NREL პროტოკოლის გამოყენებით. დადგინდა, რომ შემადგენლობა შეიცავდა 31.4% გლუკანს, 18.7% ქსილანს, 3.3% არაბინანს, 1.2% გალაქტანს, 2.2% აცეტილს, 14.3% ლიგნინს, 1.7% ცილას და 13.4% ნაცარს.
Cellic® CTec2 (138 მგ ცილა/მლ, პარტია VCNI 0001) წარმოადგენს ცელულაზას, β-გლუკოზიდაზას და Cellic® HTec2-ის (157 მგ ცილა/მლ, პარტია VHN00001) კომპლექსურ ნარევს Novozymes-ისგან (ფრანკლინტონი, ჩრდილოეთი კაროლინა, აშშ)). Multifect Pectinase® (72 მგ ცილა/მლ), პექტინის დამშლელი ფერმენტების კომპლექსური ნაზავი, წარმოდგენილია DuPont Industrial Biosciences-ის (პალო ალტო, კალიფორნია, აშშ) მიერ. ფერმენტის ცილის კონცენტრაციები განისაზღვრა ცილის შემცველობის შეფასებით (და არაცილის აზოტის წვლილის გამოკლებით) კიელდალის აზოტის ანალიზის გამოყენებით (AOAC მეთოდი 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., ითაკა, ნიუ-იორკი, აშშ). დიატომური მიწა 545 შეძენილი იქნა EMD Millipore-ისგან (ბილერიკა, მასაჩუსეტსი). გააქტიურებული ნახშირბადი (DARCO, 100 mesh გრანულები), Avicel (PH-101), წიფლის ქსილანი და ყველა სხვა ქიმიკატი შეძენილი იქნა Sigma-Aldrich-ისგან (სენტ-ლუისი, მისური).
AFEX-ის წინასწარი დამუშავება ჩატარდა GLBRC-ში (ბიომასის გარდაქმნის კვლევითი ლაბორატორია, MSU, ლანსინგი, მიჩიგანი, აშშ). წინასწარი დამუშავება ჩატარდა 140°C ტემპერატურაზე 15 წუთის განმავლობაში. 46 წუთიანი დაყოვნების დრო უწყლო ამიაკისა და ბიომასის 1:1 თანაფარდობით 60%-იანი (w/w) დატვირთვით უჟანგავი ფოლადის სამაგიდო პარტიულ რეაქტორში (Parr Instruments Company). ამას 30 წუთი დასჭირდა. რეაქტორი 140°C-მდე გაცხელდა და ამიაკი სწრაფად გამოიყო, რამაც ბიომასა სწრაფად დაუბრუნდა ოთახის ტემპერატურას. AFEX-ის წინასწარ დამუშავებული სიმინდის სათესლე მასალის (ACS) შემადგენლობა მსგავსი იყო დაუმუშავებელი სიმინდის სათესლე მასალის (UT-CS) შემადგენლობასთან.
ოლიგოსაქარიდების ფართომასშტაბიანი წარმოებისთვის საწყისი მასალის სახით მომზადდა მაღალი მყარი შემცველობის ACSH 25% (w/w) (დაახლოებით 8% დექსტრანის დატვირთვა). ACS-ის ფერმენტული ჰიდროლიზი ჩატარდა კომერციული ფერმენტული ნარევის გამოყენებით, რომელიც მოიცავდა Cellic® Ctec2 10 მგ ცილა/გ გლუკანს (წინასწარ დამუშავებულ ბიომასაში), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 მგ ცილა/გ გლუკანს და Multifect Pectinase (Genencor Inc, აშშ). ), 5 მგ ცილა/გ დექსტრანს. ფერმენტული ჰიდროლიზი ჩატარდა 5 ლიტრიან ბიორეაქტორში, 3 ლიტრი სამუშაო მოცულობით, pH 4.8, 50°C და 250 ბრ/წთ. 96-საათიანი ჰიდროლიზის შემდეგ, ჰიდროლიზატი შეგროვდა ცენტრიფუგირებით 6000 ბრ/წთ-ზე 30 წუთის განმავლობაში და შემდეგ 14000 ბრ/წთ-ზე 30 წუთის განმავლობაში არაჰიდროლიზებული მყარი ნივთიერებების მოსაშორებლად. შემდეგ ჰიდროლიზატი სტერილურ ფილტრაციას დაექვემდებარა 0.22 მმ-იანი ფილტრის ჭიქაში. გაფილტრული ჰიდროლიზატი ინახებოდა სტერილურ ბოთლებში 4°C ტემპერატურაზე და შემდეგ ნახშირბადზე ფრაქციონირებული იყო.
ექსტრაქტზე დაფუძნებული ბიომასის ნიმუშების შემადგენლობის ანალიზი NREL ლაბორატორიული ანალიზის პროცედურების მიხედვით: ნიმუშების მომზადება შემადგენლობის ანალიზისთვის (NREL/TP-510-42620) და სტრუქტურული ნახშირწყლებისა და ლიგნინის განსაზღვრა ბიომასაში (NREL/TP-510 – 42618)47.
ჰიდროლიზატის ნაკადის ოლიგოსაქარიდების ანალიზი ჩატარდა 2 მლ მასშტაბზე, ავტოკლავზე დაფუძნებული მჟავა ჰიდროლიზის მეთოდის გამოყენებით. ჰიდროლიზატის ნიმუში შეურიეთ 69.7 მკლ 72%-იან გოგირდმჟავას 10 მლ ხრახნიან თავსახურიან კულტივირების მილში და ინკუბაცია მოახდინეთ 1 საათის განმავლობაში დახლზე 121°C ტემპერატურაზე, გააგრილეთ ყინულზე და გაფილტრეთ მაღალი ხარისხის თხევადი ქრომატოგრაფიის (HPLC) ფლაკონში. ოლიგოსაქარიდების კონცენტრაცია განისაზღვრა მჟავა-ჰიდროლიზებულ ნიმუშში შაქრის საერთო კონცენტრაციიდან არაჰიდროლიზებულ ნიმუშში მონოსაქარიდების კონცენტრაციის გამოკლებით.
მჟავა ჰიდროლიზებულ ბიომასაში გლუკოზის, ქსილოზისა და არაბინოზის კონცენტრაციები გაანალიზდა Shimadzu HPLC სისტემის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო ავტოსემპლერით, სვეტის გამათბობლით, იზოკრატიული ტუმბოთი და რეფრაქციული ინდექსის დეტექტორით Bio-Rad Aminex HPX-87H სვეტზე. სვეტი შენარჩუნებული იყო 50°C ტემპერატურაზე და ელუირებული იყო 0.6 მლ/წთ 5 mM H2SO4-ით წყალში.
ჰიდროლიზატის ზედა ფენა განზავდა და გაანალიზდა მონომერისა და ოლიგოსაქარიდის შემცველობაზე. ფერმენტული ჰიდროლიზის შემდეგ მიღებული მონომერული შაქრები გაანალიზდა HPLC-ით, რომელიც აღჭურვილი იყო Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P სვეტით და ნაცრისგან დამცავი სვეტით. სვეტის ტემპერატურა შენარჩუნებული იყო 80°C-ზე, მოძრავ ფაზად გამოყენებული იყო წყალი 0.6 მლ/წთ ნაკადის სიჩქარით. ოლიგოსაქარიდები განისაზღვრა განზავებულ მჟავაში ჰიდროლიზით 121°C-ზე, 41, 48, 49 მითითებებში აღწერილი მეთოდების შესაბამისად.
საქარიდის ანალიზი ჩატარდა ნედლ, AFEX-ით წინასწარ დამუშავებულ და ყველა არაჰიდროლიზებულ ბიომასის ნარჩენებზე (მათ შორის სერიული უჯრედის კედლის ექსტრაქტების წარმოება და მათი mAb სკრინინგები) ადრე აღწერილი პროცედურების გამოყენებით 27, 43, 50, 51. გლიკომის ანალიზისთვის, მცენარეული უჯრედის კედლის მასალის ალკოჰოლში უხსნადი ნარჩენები მზადდება ბიომასის ნარჩენებისგან და ექვემდებარება სერიულ ექსტრაქციას სულ უფრო აგრესიული რეაგენტებით, როგორიცაა ამონიუმის ოქსალატი (50 mM), ნატრიუმის კარბონატი (50 mM და 0.5% w/v), CON. (1M და 4M, ორივე 1% w/v ნატრიუმის ბოროჰიდრიდით) და მჟავა ქლორიტი, როგორც ადრე იყო აღწერილი 52,53. შემდეგ ექსტრაქტები დაექვემდებარა ELISA-ს უჯრედის კედლის გლიკანზე მიმართული mAb50-ების კომპლექსური პანელის მიმართ და mAb შეკავშირების რეაქციები წარმოდგენილი იყო სითბური რუკის სახით. მცენარის უჯრედის კედლის გლიკანზე მიმართული mAb-ები შეძენილი იქნა ლაბორატორიული მარაგებიდან (CCRC, JIM და MAC სერიები).
ოლიგოსაქარიდების ერთსაფეხურიანი ბიოტინილირება. ნახშირწყლების ბიოტინ-LC-ჰიდრაზიდთან კონიუგაცია განხორციელდა შემდეგი პროცედურის გამოყენებით. ბიოტინ-LC-ჰიდრაზიდი (4.6 მგ/12 მკმოლ) გახსნეს დიმეთილსულფოქსიდში (DMSO, 70 მკლ) ენერგიული მორევისა და 65°C ტემპერატურაზე გაცხელების გზით 1 წუთის განმავლობაში. დაემატა გამყინვარების ძმარმჟავა (30 მკლ) და ნარევი ჩაასხეს ნატრიუმის ციანობოროჰიდრიდზე (6.4 მგ/100 მკმოლ) და მთლიანად გახსნეს 65°C ტემპერატურაზე დაახლოებით 1 წუთის განმავლობაში გაცხელების შემდეგ. შემდეგ, რეაქციის ნარევის 5-დან 8 მკლ-მდე დაემატა გამშრალ ოლიგოსაქარიდს (1-100 ნმოლ), რათა მიღებულ იქნას მარკერის 10-ჯერ ან მეტი მოლური სიჭარბე აღმდგენ ბოლოზე. რეაქცია ჩატარდა 65°C ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში, რის შემდეგაც ნიმუშები დაუყოვნებლივ გაიწმინდა. აღდგენის გარეშე ეტიკეტირების ექსპერიმენტებში ნატრიუმის ციანობოროჰიდრიდი არ გამოიყენებოდა და ნიმუშები რეაქციაში შედიოდა 65°C ტემპერატურაზე 2.5 საათის განმავლობაში.
ბიოტინილირებული ოლიგოსაქარიდების ნიმუშების ELISA დაფარვა და გარეცხვა. ავიდინით დაფარული ფირფიტის თითოეულ ჭაში დაემატა ბიოტინილირებული ნიმუშების 25 მკლ (თითოეული კონცენტრირებული ნიმუშის 100 მკლ განზავებული 5 მლ 0.1 M Tris ბუფერულ ხსნარში (TBS)). საკონტროლო ჭები დაფარული იყო 50 მკლ ბიოტინით 10 მკგ/მლ კონცენტრაციით 0.1 M TBS-ში. ცარიელი გაზომვებისთვის საფარის სახით გამოყენებული იყო დეიონიზებული წყალი. ტაბლეტი ინკუბირებული იყო 2 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე, სიბნელეში. ფირფიტა 3-ჯერ გარეცხეთ 0.1%-იანი უცხიმო რძით 0.1 M TBS-ში, Grenier flat 3A-სთვის განკუთვნილი პროგრამის #11 გამოყენებით.
პირველადი ანტისხეულების დამატება და გარეცხვა. თითოეულ ჭაში დაამატეთ 40 მკლ პირველადი ანტისხეული. მიკროფირფიტა ინკუბირებულია 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე, სიბნელეში. შემდეგ ფირფიტები 3-ჯერ გაირეცხა 0.1%-იანი რძით 0.1M TBS ხსნარში, Grenier Flat 3A-სთვის განკუთვნილი გარეცხვის პროგრამის #11 გამოყენებით.
დაამატეთ მეორადი ანტისხეული და გარეცხეთ. თითოეულ ჭაში დაამატეთ 50 მკლ თაგვის/ვირთხის მეორადი ანტისხეული (განზავებული 1:5000 თანაფარდობით 0.1%-იან რძეში 0.1 M TBS ხსნარში). მიკროფირფიტა ინკუბირებულია 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე, სიბნელეში. შემდეგ მიკროფირფიტები 5-ჯერ გარეცხილია 0.1%-იანი რძით 0.1 M TBS ხსნარში, Grenier Flat 5A ფირფიტის გარეცხვის პროგრამის #12 გამოყენებით.
სუბსტრატის დამატება. ფუძის სუბსტრატს დაუმატეთ 50 მკლ 3,3′,5,5′-ტეტრამეთილბენზიდინი (TMB) (ბუფერის 2 წვეთი, TMB-ის 3 წვეთი, წყალბადის ზეჟანგის 2 წვეთი 15 მლ დეიონიზებულ წყალში დამატებით). მოამზადეთ TMB სუბსტრატი და გამოყენებამდე მოურიეთ). მიკროფირფიტა ინკუბირებული უნდა იყოს ოთახის ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში. სიბნელეში.
დაასრულეთ ნაბიჯი და წაიკითხეთ ტაბლეტის შინაარსი. თითოეულ ჭაში დაამატეთ 50 მკლ 1 ნ გოგირდმჟავა და ELISA წამკითხველის გამოყენებით ჩაიწერეთ აბსორბცია 450-დან 655 ნმ-მდე.
დეიონიზებულ წყალში მოამზადეთ შემდეგი ანალიტების 1 მგ/მლ ხსნარები: არაბინოზა, რამნოზა, ფუკოზა, ქსილოზა, გალაქტურონის მჟავა (GalA), გლუკურონის მჟავა (GlcA), მანოზა, გლუკოზა, გალაქტოზა, ლაქტოზა, N-აცეტილმანოზამინი (manNAc), N-აცეტილგლუკოზამინი (glcNAc), N-აცეტილგალაქტოზამინი (galNAc), ინოზიტოლი (შიდა სტანდარტი). ცხრილში 1 მოცემული 1 მგ/მლ შაქრის ხსნარების დამატებით მომზადდა ორი სტანდარტი. ნიმუშები იყინება და ლიოფილიზდება -80°C ტემპერატურაზე, სანამ წყალი მთლიანად არ მოიხსნება (ჩვეულებრივ, დაახლოებით 12-18 საათი).
ანალიტიკურ სასწორზე ხრახნიან თავსახურიან მილებში დაამატეთ 100–500 მკგ ნიმუში. ჩაიწერეთ დამატებული რაოდენობა. უმჯობესია ნიმუში გახსნათ გამხსნელის კონკრეტული კონცენტრაციით და მილში დაამატოთ თხევადი ალიკვოტის სახით. თითოეული ნიმუშის მილისთვის გამოიყენეთ 20 მკლ 1 მგ/მლ ინოზიტოლი, როგორც შიდა სტანდარტი. ნიმუშში დამატებული შიდა სტანდარტის რაოდენობა უნდა იყოს იგივე, რაც სტანდარტულ მილში დამატებული შიდა სტანდარტის რაოდენობა.
ხრახნიან თავსახურიან ფლაკონში დაამატეთ 8 მლ უწყლო მეთანოლი. შემდეგ 4 მლ 3 ნ მეთანოლური HCl ხსნარი, დაახურეთ თავსახური და შეანჯღრიეთ. ამ პროცესში წყალი არ გამოიყენება.
ოლიგოსაქარიდის ნიმუშებსა და სტანდარტულ TMS მილებს დაუმატეთ 500 მკლ 1 M HCl მეთანოლის ხსნარი. ნიმუშები ინკუბირებული იქნა მთელი ღამით (168 საათი) 80°C ტემპერატურაზე თერმულ ბლოკში. მეთანოლიზის პროდუქტი გააშრეთ ოთახის ტემპერატურაზე გამშრობი კოლექტორის გამოყენებით. დაუმატეთ 200 მკლ MeOH და ხელახლა გააშრეთ. ეს პროცესი ორჯერ მეორდება. ნიმუშს დაუმატეთ 200 მკლ მეთანოლი, 100 მკლ პირიდინი და 100 მკლ ძმარმჟავას ანჰიდრიდი და კარგად აურიეთ. ნიმუშები ინკუბირებული იქნა ოთახის ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში და შემდეგ გაშრეს. დაუმატეთ 200 მკლ მეთანოლი და ხელახლა გააშრეთ.
დაამატეთ 200 µლ Tri-Sil და დაახურეთ თავსახური ტუბს 20 წუთის განმავლობაში. გააცხელეთ 80°C ტემპერატურაზე, შემდეგ გააგრილეთ ოთახის ტემპერატურამდე. გამოიყენეთ საშრობი კოლექტორი ნიმუშის გასაშრობად დაახლოებით 50 µლ მოცულობამდე. მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ ჩვენ არ დავუშვით ნიმუშების სრულად გაშრობა.
დაამატეთ 2 მლ ჰექსანი და კარგად აურიეთ მორევინგის საშუალებით. პასტერის პიპეტების წვერები (5-8 მმ) შეავსეთ მინის ბამბის ნაჭრით, მინის ბამბა მოათავსეთ 5-3/4 ინჩი დიამეტრის პიპეტში. ნიმუშები დაცენტრიფუგდა 3000 გ-ზე 2 წუთის განმავლობაში. უხსნადი ნარჩენები დაილექა. ნიმუში გააშრეთ 100-150 µლ-მდე. დაახლოებით 1 µლ მოცულობა შეიყვანეს GC-MS-ში 80°C საწყისი ტემპერატურისა და 2.0 წუთის საწყისი დროის განმავლობაში (ცხრილი 2).