דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com.דער בלעטערער ווערסיע איר נוצן האט לימיטעד CSS שטיצן.פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ דערהייַנטיקט בלעטערער (אָדער דיסייבאַל קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer).אין דער דערווייל, צו ענשור פארבליבן שטיצן, מיר וועלן מאַכן דעם פּלאַץ אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
ניו ימיונאַלאַדזשיקאַל און מאַסע ספּעקטראָמעטריק מעטהאָדס פֿאַר קאָמפּלעקס אַנאַליסיס פון פּערסיסטענט אָליגאָסאַקשאַרידעס אין פּאַפּשוי סטאָווער פּרעטרעאַטעד מיט AFEX.ליגנאָסעללולאָסיק בייאַמאַס איז אַ סאַסטיינאַבאַל אָלטערנאַטיוו צו פאַסאַל פיואַלז און איז וויידלי געניצט צו אַנטוויקלען ביאָטעטשנאָלאָגיעס פֿאַר די פּראָדוקציע פון ​​פּראָדוקטן אַזאַ ווי עסנוואַרג, קאָרמען, פיואַלז און קעמיקאַלז.דער שליסל צו די טעקנאַלאַדזשיז איז די אַנטוויקלונג פון קאָס-קאַמפּעטיטיוו פּראַסעסאַז פֿאַר קאַנווערטינג קאָמפּלעקס קאַרבאָוכיידרייץ פאָרשטעלן אין פאַבריק צעל ווענט אין פּשוט שוגערז אַזאַ ווי גלוקאָוס, קסילאָסע און אַראַבינאָסע.ווייַל ליגנאָסעללולאָסיק בייאַמאַס איז זייער פאַרביסן, עס מוזן זיין אונטערטעניק צו טערמאַקעמיקאַל טריטמאַנץ (למשל, אַמאָוניאַ פיברע עקספאָולייישאַן (AFEX), צעפירן אַסאַדז (DA), יאָניק ליקווידס (IL)) און בייאַלאַדזשיקאַל טריטמאַנץ (למשל, ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס און מייקראָוביאַל פערמאַנטיישאַן) אין קאָמבינאַציע צו באַקומען די געוואלט פּראָדוקט..אָבער, ווען געשעפט פונגאַל ענזימעס זענען געניצט אין די כיידראַלאַסאַס פּראָצעס, בלויז 75-85% פון די סאַליאַבאַל שוגערז געשאפן זענען מאָנאָסאַקשאַרידעס, און די רוען 15-25% זענען סאַליאַבאַל, ינטראַקטאַבאַל אָליגאָסאַקשאַרידעס, וואָס זענען נישט שטענדיק בנימצא צו מייקראָואָרגאַניזאַמז.ביז אַהער, מיר האָבן הצלחה אפגעזונדערט און פּיוראַפייד סאַליאַבאַל פאַרביסן אָליגאָסאַקשאַרידעס ניצן אַ קאָמבינאַציע פון ​​טשאַד און דייאַטערי ערד צעשיידונג און גרייס יקסקלוזשאַן קראָומאַטאַגראַפי, און אויך ינוועסטאַגייטאַד זייער ענזיים ינכיבאַטאָרי פּראָפּערטיעס.מיר האָבן געפֿונען אַז אָליגאָסאַקשאַרידעס מיט אַ העכער גראַד פון פּאַלימעראַזיישאַן (דפּ) מעטהילאַטעד וראָניק זויער סאַבסטיטיושאַנז זענען מער שווער צו פּראָצעס מיט געשעפט ענזיים בלענדז ווי נידעריק דפּ און נייטראַל אָליגאָסאַקשאַרידעס.דאָ מיר באַריכט די נוצן פון עטלעכע נאָך מעטהאָדס, אַרייַנגערעכנט גלייקאַן פּראָפילינג ניצן מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדיעס (מאַבס) ספּעציפיש צו פאַבריק בייאַמאַס גלייקאַנז צו קעראַקטערייז גלייקאַן קייטן אין פאַבריק צעל ווענט און ענזימאַטיק כיידראַלאַסייץ, מאַטריץ-אַססיסטעד לייזער דעסאָרפּטיאָן ייאַנאַזיישאַן, צייט-פון-פלי מאַסע-ספּעקטראָמעטרי..MALDI-TOF-MS) ניצט סטרוקטור-ינפאָרמאַטיוו דיאַגנאָסטיק פּיקס באקומען דורך ספּעקטראַסקאָפּי נאָך צווייטיק פאַרפוילן פון נעגאַטיוו ייאַנז, גאַז קראָומאַטאַגראַפי און מאַסע ספּעקטראָמעטרי (GC-MS) צו קעראַקטערייז אָליגאָסאַקשאַריד קייטן מיט און אָן דעריוואַטאַזיישאַן.רעכט צו דער קליין גרייס פון אָליגאָסאַקשאַרידעס (דפּ 4-20), די מאַלאַקיולז זענען שווער צו נוצן פֿאַר מאַב ביינדינג און כאַראַקטעריזיישאַן.צו באַקומען דעם פּראָבלעם, מיר האָבן געווענדט אַ נייַ ביאָטין קאָנדזשוגאַטיאָן-באזירט אָליגאָסאַקשאַריד ימאָובאַליזיישאַן אופֿן וואָס הצלחה לייבאַלד די מערהייַט פון נידעריק דפּ סאַליאַבאַל אָליגאָסאַקשאַרידעס אויף די מיקראָפּלאַטע ייבערפלאַך, וואָס איז דעמאָלט געניצט אין אַ הויך טרופּוט מאַב סיסטעם פֿאַר ספּעציפיש ליגיישאַן אַנאַליסיס.דער נייַע אופֿן וועט פאַסילאַטייט די אַנטוויקלונג פון מער אַוואַנסירטע גלייקאָום אַסאַסאַז מיט הויך טרופּוט אין דער צוקונפֿט וואָס קענען זיין גענוצט צו יזאָלירן און קעראַקטערייז אָליגאָסאַקטשאַרידעס פאָרשטעלן אין ביאָמאַרקערס פֿאַר דיאַגנאָסטיק צוועקן.
ליגנאָסעללולאָסיק בייאַמאַס, קאַמפּאָוזד פון לאַנדווירטשאַפטלעך, פאָרעסטרי, גראָז און ווודי מאַטעריאַלס, איז אַ פּאָטענציעל פידז פֿאַר די פּראָדוקציע פון ​​ביאָ-באזירט פּראָדוקטן, אַרייַנגערעכנט עסנוואַרג, פיטער, ברענוואַרג און כעמישער פּריקערסערז צו פּראָדוצירן העכער ווערט פּראָדוקטן1.קאַרבאָוכיידרייץ (אַזאַ ווי סעליאַלאָוס און העמיסעללולאָסע) פאָרשטעלן אין פאַבריק צעל ווענט זענען דעפּאָלימערייזד אין מאָנאָסאַקשאַרידעס דורך כעמישער פּראַסעסינג און ביאָטראַנספאָרמאַטיאָן (אַזאַ ווי ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס און מייקראָוביאַל פערמאַנטיישאַן).פּראָסט פאַר-טריטמאַנץ אַרייַננעמען אַמאָוניאַ פיברע יקספּאַנשאַן (AFEX), צעפירן זויער (DA), יאָניק פליסיק (IL), און פּאַרע יקספּלאָוזשאַן (SE), וואָס נוצן אַ קאָמבינאַציע פון ​​קעמיקאַלז און היץ צו רעדוצירן ליגנאָוסעללולאָס פּראָדוקציע דורך עפן פאַבריק צעל ווענט3,4.עקשנות פון ענין, 5. ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס איז געפירט אויס אין אַ הויך סאָלידס מאַסע ניצן געשעפט אַקטיוו קאַרבאָוכיידרייט-מיט ענזימעס (CAZymes) און מייקראָוביאַל פערמאַנטיישאַן ניצן טראַנסגעניק הייוון אָדער באַקטיריאַ צו פּראָדוצירן ביאָ-באזירט פיואַלז און קעמיקאַלז 6 .
CAZymes אין געשעפט ענזימעס זענען פארפאסט פון אַ קאָמפּלעקס געמיש פון ענזימעס וואָס סינערגיסטיקלי שפּאַלטן קאָמפּלעקס קאַרבאָוכיידרייט-צוקער קייטן צו פאָרעם מאָנאָסאַקשאַרידעס2,7.ווי מיר געמאלדן פריער, די קאָמפּלעקס נעץ פון עראַמאַטיק פּאָלימערס פון ליגנין מיט קאַרבאָוכיידרייץ מאכט זיי העכסט ינטראַקטאַבאַל, וואָס פירט צו דערענדיקט קאַנווערזשאַן פון צוקער, אַקיומיאַלייטינג 15-25% פון געשלעכט אָליגאָסאַקשאַרידעס וואָס זענען נישט געשאפן בעשאַס ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס פון פּרעטרעאַטעד בייאַמאַס.דאָס איז אַ פּראָסט פּראָבלעם מיט פאַרשידן בייאַמאַס פּרעטרעאַטמענט מעטהאָדס.עטלעכע סיבות פֿאַר דעם באַטאַלנעק אַרייַננעמען ענזיים ינאַבישאַן בעשאַס כיידראַלאַסאַס, אָדער דער אַוועק אָדער נידעריק לעוועלס פון יקערדיק יקערדיק ענזימעס וואָס זענען פארלאנגט צו ברעכן צוקער קייטן אין פאַבריק בייאַמאַס.פארשטאנד פון דעם זאַץ און סטראַקטשעראַל קעראַקטעריסטיקס פון שוגערז, אַזאַ ווי די צוקער קייטן אין אָליגאָסאַקשאַרידעס, וועט העלפֿן אונדז פֿאַרבעסערן צוקער קאַנווערזשאַן בעשאַס כיידראַלאַסאַס, און מאַכן ביאָטעטשנאָלאָגיקאַל פּראַסעסאַז קאָס-קאַמפּעטיטיוו מיט נאַפט-דערייווד פּראָדוקטן.
באַשטימען די סטרוקטור פון קאַרבאָוכיידרייץ איז טשאַלאַנדזשינג און ריקווייערז אַ קאָמבינאַציע פון ​​​​מיטלען אַזאַ ווי פליסיק קראָומאַטאַגראַפי (LC) 11,12, יאָדער מאַגנעטיק רעזאַנאַנס ספּעקטראָסקאָפּי (נמר) 13, קאַפּאַלערי עלעקטראָפאָרעסיס (CE) 14,15,16 און מאַסע ספּעקטראָמעטרי (MS) 17.,אכצן .MS מעטהאָדס אַזאַ ווי צייט-פון-פלי מאַסע ספּעקטראָמעטרי מיט לאַזער דעסאָרפּטיאָן און ייאַנאַזיישאַן ניצן אַ מאַטריץ (MALDI-TOF-MS) זענען אַ ווערסאַטאַל אופֿן פֿאַר ידענטיפיינג קאַרבאָוכיידרייט סטראַקטשערז.לעצטנס, Collision-Induced Dissociation (CID) טאַנדאַם MS פון סאָדיום יאָן אַדדוקץ איז מערסט וויידלי געניצט צו ידענטיפיצירן פינגגערפּרינץ קאָראַספּאַנדינג צו אָליגאָסאַקשאַריד אַטאַטשמאַנט שטעלעס, אַנאַמעריק קאַנפיגיעריישאַנז, סיקוואַנסיז און בראַנטשינג שטעלעס 20, 21.
גלייקאַן אַנאַליסיס איז אַ ויסגעצייכנט געצייַג פֿאַר טיף לעגיטימאַציע פון ​​קאַרבאָוכיידרייט קייטן22.דער אופֿן ניצט מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדיעס (מאַבס) דירעקטעד צו פאַבריק צעל וואַנט גלייקאַן ווי פּראָבעס צו פֿאַרשטיין קאָמפּלעקס קאַרבאָוכיידרייט לינגקאַדזשאַז.מער ווי 250 מאַבס זענען בנימצא ווערלדווייד, דיזיינד קעגן פאַרשידן לינעאַר און בראַנטשט אָליגאָסאַקשאַרידעס ניצן פאַרשידן סאַקשאַרידעס24.עטלעכע מאַבס האָבן שוין וויידלי געניצט צו קעראַקטערייז די סטרוקטור, זאַץ און מאָדיפיקאַטיאָנס פון די פאַבריק צעל וואַנט, ווייַל עס זענען באַטייטיק דיפעראַנסיז דיפּענדינג אויף פאַבריק צעל טיפּ, אָרגאַן, עלטער, אַנטוויקלונג בינע און וווּקס סוויווע25,26.מער לעצטנס, דעם אופֿן איז געניצט צו פֿאַרשטיין וועסיקלע פּאַפּיאַליישאַנז אין פאַבריק און כייַע סיסטעמען און זייער ריספּעקטיוו ראָלעס אין גלייקאַן אַריבערפירן ווי באשלאסן דורך סובסעללולאַר מאַרקערס, אַנטוויקלונג סטאַגעס אָדער ינווייראַנמענאַל סטימיאַליי, און צו באַשטימען ענזימאַטיק טעטיקייט.עטלעכע פון ​​​​די פאַרשידענע סטראַקטשערז פון גלייקאַנז און קסילאַנז וואָס זענען יידענאַפייד אַרייַננעמען פּעקטין (פּ), קסילאַן (רענטגענ), מאַנאַן (מ), קסילאָגלוקאַנס (קסילג), געמישט בונד גלוקאַנז (מלג), אַראַבינאָקסילאַן (אַרבקס), גאַלאַקטאָמאַננאַן (גאַלג), גלוקוראָניק זויער-אַראַבינאָקסילאַן (גאַרבינאָקס) (אַראַבינאָקס) גאַלאַן (אַרבינאַר.
אָבער, טראָץ אַלע די פאָרשונג השתדלות, בלויז אַ ביסל שטודיום האָבן פאָוקיסט אויף די נאַטור פון אַקיומיאַליישאַן פון אָליגאָסאַקשאַרידע בעשאַס כיידראַלאַסאַס פון הויך סאָלידס מאַסע (HSL), אַרייַנגערעכנט אָליגאָסאַקערייד מעלדונג, אָליגאָמעריק קייט לענג ענדערונגען בעשאַס כיידראַלאַסאַס, פאַרשידן נידעריק דפּ פּאָלימערס און זייער קורוועס.דיסטריביושאַנז 30,31,32.דערווייַל, כאָטש גלייקאַן אַנאַליסיס איז פּראָווען צו זיין אַ נוציק געצייַג פֿאַר אַ פולשטענדיק אַנאַליסיס פון גלייקאַן סטרוקטור, עס איז שווער צו אָפּשאַצן וואַסער-סאַליאַבאַל נידעריק דפּ אָליגאָסאַקשאַרידעס מיט אַנטיבאָדי מעטהאָדס.קלענערער דפּ אָליגאָסאַקשאַרידעס מיט אַ מאָלעקולאַר וואָג פון ווייניקער ווי 5-10 kDa בינדן נישט צו עליסאַ פּלאַטעס 33, 34 און זענען געוואשן אַוועק איידער אַנטיבאָדי אַדישאַן.
דאָ, פֿאַר די ערשטער מאָל, מיר באַווייַזן אַן ELISA אַסייַ אויף אַווידין-קאָוטאַד פּלאַטעס ניצן מאַנאַקלאָנאַל אַנטיבאָדיעס, קאַמביינינג אַ איין-שריט ביאָטינילאַטיאָן פּראָצעדור פֿאַר סאַליאַבאַל ראַפראַקטערי אָליגאָסאַקשאַרידעס מיט גלייקאָום אַנאַליסיס.אונדזער צוגאַנג צו גלייקאָום אַנאַליסיס איז געווען וואַלאַדייטאַד דורך MALDI-TOF-MS און GC-MS באזירט אַנאַליסיס פון קאַמפּלאַמענטשי אָליגאָסאַקשאַריד לינגקאַדזשאַז ניצן טרימעטהילסיליל (TMS) דעריוואַטאַזיישאַן פון כיידראַלייזד צוקער חיבורים.דער ינאַווייטיוו צוגאַנג קענען זיין דעוועלאָפּעד ווי אַ הויך-טרופּוט אופֿן אין דער צוקונפֿט און געפֿינען אַ ברייט אַפּלאַקיישאַן אין ביאָמעדיקאַל פאָרשונג35.
פּאָסט-טראַנסליישאַנאַל מאָדיפיקאַטיאָנס פון ענזימעס און אַנטיבאָדיעס, אַזאַ ווי גלייקאַסיליישאַן, 36 ווירקן זייער בייאַלאַדזשיקאַל טעטיקייט.פֿאַר בייַשפּיל, ענדערונגען אין גלייקאַסיליישאַן פון סערום פּראָטעינס שפּילן אַ וויכטיק ראָלע אין ינפלאַמאַטאָרי אַרטריט, און ענדערונגען אין גלייקאַסיליישאַן זענען געניצט ווי דיאַגנאָסטיק מאַרקערס.עטלעכע גלייקאַנז זענען רעפּאָרטעד אין דער ליטעראַטור צו זיין גלייך אין אַ פאַרשיידנקייַט פון חולאתן, אַרייַנגערעכנט כראָניש ינפלאַמאַטאָרי חולאתן פון די גאַסטראָוינטעסטאַנאַל שעטעך און לעבער, וויראַל ינפעקשאַנז, אָווועריאַן, ברוסט און פּראָסטאַט קאַנסערץ38,39,40.פארשטאנד פון די סטרוקטור פון גלייקאַנז ניצן אַנטיבאָדי-באזירט גלייקאַן ELISA מעטהאָדס וועט צושטעלן נאָך בטחון אין דיאַגנאָסיס פון קרענק אָן די נוצן פון קאָמפּלעקס MS מעטהאָדס.
אונדזער פריערדיקן לערנען געוויזן אַז פאַרביסן אָליגאָסאַקשאַרידעס פארבליבן ונהידראָליזעד נאָך פּרעטרעאַטמענט און ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס (פיגורע 1).אין אונדזער פריער ארויס ווערק, מיר דעוועלאָפּעד אַן אַקטיווייטיד האָלצקוילן האַרט-פאַסע יקסטראַקשאַן אופֿן צו יזאָלירן אָליגאָסאַקשאַרידעס פון AFEX-פּרעטרעאַטעד פּאַפּשוי סטאָווער כיידראַלאַזאַט (ACSH) 8.נאָך ערשט יקסטראַקשאַן און צעשיידונג, די אָליגאָסאַקשאַרידעס זענען נאָך פראַקשאַנייטיד דורך גרייס יקסקלוזשאַן קראָומאַטאַגראַפי (SEC) און געזאמלט אין סדר פון מאָלעקולאַר וואָג.צוקער מאָנאָמערס און אָליגאָמערס באפרייט פון פאַרשידן פּרעטרעאַטמענץ זענען אַנאַלייזד דורך צוקער זאַץ אַנאַליסיס.ווען קאַמפּערינג די אינהאַלט פון צוקער אָליגאָמערז באקומען דורך פאַרשידן פּרעטרעאַטמענט מעטהאָדס, די בייַזייַן פון פאַרביסן אָליגאָסאַקשאַרידעס איז אַ פּראָסט פּראָבלעם אין די קאַנווערזשאַן פון בייאַמאַס צו מאָנאָסאַקשאַרידעס און קענען פירן צו אַ רעדוקציע אין צוקער טראָגן פון בייַ מינדסטער 10-15% און אפילו אַרויף צו 18%.יו.דעם אופֿן איז געניצט פֿאַר ווייַטער גרויס-וואָג פּראָדוקציע פון ​​אָליגאָסאַקשאַרידע פראַקשאַנז.די ריזאַלטינג ACH און זייַן סאַבסאַקוואַנט פראַקשאַנז מיט פאַרשידענע מאָלעקולאַר ווייץ זענען געניצט ווי יקספּערמענאַל מאַטעריאַל פֿאַר די כאַראַקטעריזיישאַן פון אָליגאָסאַקשאַרידעס אין דעם אַרבעט.
נאָך פּרעטרעאַטמענט און ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס, פּערסיסטענט אָליגאָסאַקשאַרידעס פארבליבן אַנהידראָליזעד.דאָ (א) איז אַן אָליגאָסאַקשאַריד צעשיידונג אופֿן אין וואָס אָליגאָסאַקשאַרידעס זענען אפגעזונדערט פון AFEX-פּרעטרעאַטעד פּאַפּשוי סטאָווער הידראָליזאַטע (אַקש) ניצן אַ פּאַקט בעט פון אַקטיווייטיד טשאַד און דייאַטאָמאַסעאַס ערד;(ב) מעטאָד פֿאַר צעשיידונג פון אָליגאָסאַקשאַרידעס.די אָליגאָסאַקשאַרידעס זענען ווייַטער אפגעשיידט דורך גרייס יקסקלוזשאַן קראָומאַטאַגראַפי (סעק);(C) סאַקשאַריד מאָנאָמערז און אָליגאָמערס באפרייט פון פאַרשידן פּרעטרעאַטמענץ (דילוטאַד זויער: דאַ, ייאַניק פליסיק: IL און AFEX).ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס טנאָים: הויך סאָלידס לאָודינג פון 25% (וו / וו) (בעערעך 8% גלוקאַן לאָודינג), 96 שעה כיידראַלאַסאַס, 20 מג / ג געשעפט ענזיים לאָודינג (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 פאַרהעלטעניש) און (ד) צוקער מאָנאָמערס און אָליגאָמערס פון גלוקאָוס, פּרעאָסאָקסילאָסע און AFS רעפּריזענטיד פון גלוקאָוס, סטאָוואַראַ פּאַפּשוי און אַפסס.
גלייקאַן אַנאַליסיס איז פּראָווען צו זיין אַ נוציק געצייַג פֿאַר אַ פולשטענדיק סטראַקטשעראַל אַנאַליסיס פון גלייקאַנז אין עקסטראַקץ אפגעזונדערט פון האַרט בייאַמאַס רעזאַדוז.אָבער, וואַסער-סאַליאַבאַל סאַקשאַרידעס זענען אַנדעררעפּריזענטיד מיט דעם טראדיציאנעלן אופֿן41 ווייַל אָליגאָסאַקשאַרידעס מיט נידעריק מאָלעקולאַר וואָג זענען שווער צו ימאָובאַלייז אויף עליסאַ פּלאַטעס און זענען געוואשן אויס איידער אַנטיבאָדי אַדישאַן.דעריבער, פֿאַר אַנטיבאָדי ביינדינג און כאַראַקטעריזיישאַן, אַ איין-שריט ביאָטינילאַטיאָן אופֿן איז געניצט צו מאַנטל סאַליאַבאַל, ניט-געהאָרכיק אָליגאָסאַקשאַרידעס אויף אַווידין-קאָוטאַד עליסאַ פּלאַטעס.דער אופֿן איז טעסטעד מיט אונדזער פריער געשאפן ACSH און אַ בראָכצאָל באזירט אויף זיין מאָלעקולאַר וואָג (אָדער גראַד פון פּאַלימעראַזיישאַן, דפּ).איין-שריט ביאָטינילאַטיאָן איז געניצט צו פאַרגרעסערן אָליגאָסאַקשאַרידע ביינדינג קירבות דורך אַדינג ביאָטין-לק-הידראַזידע צו די רידוסינג סוף פון די קאַרבאָוכיידרייט (Fig. 2).אין לייזונג, די העמיאַסעטאַל גרופּע אין די רידוסינג סוף ריאַקץ מיט די כיידראַזידע גרופּע פון ​​ביאָטין-לק-הידראַזידע צו פאָרעם אַ כיידראַזאָנע בונד.אין דעם בייַזייַן פון די רידוסינג אַגענט NaCNBH3, די הידראַזאָנע בונד איז רידוסט צו אַ סטאַביל ביאָטינילאַטעד סוף פּראָדוקט.מיט די מאָדיפיקאַטיאָן פון די צוקער רידוסינג סוף, ביינדינג פון נידעריק דפּ אָליגאָסאַקשאַרידעס צו עליסאַ פּלאַטעס געווארן מעגלעך, און אין אונדזער לערנען דאָס איז געווען געטאן אויף אַווידין-קאָוטאַד פּלאַטעס ניצן גלייקאַן-טאַרגעטעד מאַבס.
זיפּונג פון מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדיעס באזירט אויף עליסאַ פֿאַר ביאָטינילאַטעד אָליגאָסאַקשאַרידעס.דאָ (א) קאַמביינד ביאָטינילאַטיאָן פון אָליגאָסאַקשאַרידעס און סאַבסאַקוואַנט ELISA זיפּונג מיט גלייקאַן-טאַרגעטעד מאַבס אויף נעוטראַווידין קאָוטאַד פּלאַטעס און (ב) ווייזט אַ איין-שריט פּראָצעדור פֿאַר ביאָטינילאַטיאָן פון אָפּרוף פּראָדוקטן.
אַווידין-קאָוטאַד פּלאַטעס מיט אָליגאָסאַקשאַריד-קאָנדזשוגאַטעד אַנטיבאָדיעס זענען דעמאָלט צוגעגעבן צו ערשטיק און צווייטיק אַנטיבאָדיעס און געוואשן אין אַ ליכט און צייט-שפּירעוודיק מיטל.נאָך אַנטיבאָדי ביינדינג איז גאַנץ, לייגן TMB סאַבסטרייט צו ינגקיובייט די טעלער.דער רעאקציע איז ענדליך אפגעשטעלט געווארן מיט שוועבל-זויערע.די ינגקיובייטיד פּלאַטעס זענען אַנאַלייזד מיט אַן ELISA לייענער צו באַשטימען די ביינדינג שטאַרקייַט פון יעדער אַנטיבאָדי צו דעטעקט אַנטיבאָדי-ספּעציפיש קרייַז-לינקינג.פֿאַר דעטאַילס און פּאַראַמעטערס פון דער עקספּערימענט, זען די קאָראַספּאַנדינג אָפּטיילונג "מאַטעריאַלן און מעטהאָדס".
מיר באַווייַזן די נוצן פון דעם ניי דעוועלאָפּעד אופֿן פֿאַר ספּעציפיש אַפּלאַקיישאַנז דורך קעראַקטערייזינג די סאַליאַבאַל אָליגאָסאַקשאַרידעס פאָרשטעלן אין ACSH ווי געזונט ווי אין גראָב און פּיוראַפייד אָליגאָסאַקשאַריד פראַקשאַנז אפגעזונדערט פון ליגנאָסעללולאָסיק כיידראַלאַסייץ.ווי געוויזן אין פיגור 3, די מערסט פּראָסט עפּיטאָופּ-סאַבסטאַטוטאַד קסילאַנז יידענאַפייד אין ACSH ניצן ביאָאַסילאַטעד גלייקאָום אַסייַ מעטהאָדס זענען יוזשאַוואַלי וראָניק (ו) אָדער מעטהילוראָניק (מעו) און פּעקטיק אַראַבינאָגאַלאַקטאַנס.רובֿ פון זיי זענען אויך געפֿונען אין אונדזער פריערדיקן לערנען וועגן אַנאַליסיס פון גלייקאַנז פון ניט-כיידראַלייזד סאָלידס (UHS)43.
דיטעקשאַן פון רעקאַלסיטראַנט אָליגאָסאַקשאַרידע עפּיטאַפּס ניצן אַ מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי דירעקטעד צו די גלייקאַן צעל וואַנט.די "נייטראַל" בראָכצאָל איז די ACN בראָכצאָל און די "אַסידיק" בראָכצאָל איז די פאַ בראָכצאָל.ברייטער רעדס אויף די העאַטמאַפּ אָנווייַזן העכער עפּיטאָופּ אינהאַלט, און ברייטער בלוז אָנווייַזן אַ ליידיק הינטערגרונט.קאָליר וואַלועס אויף די וואָג זענען באזירט אויף רוי אָד וואַלועס פֿאַר פאָרמיוליישאַנז N = 2.די הויפּט עפּיטאָפּעס אנערקענט דורך די אַנטיבאָדיעס זענען געוויזן אויף די רעכט.
די ניט-סעללולאָסע סטראַקטשערז קען נישט זיין קלעאַוועד דורך די מערסט פּראָסט סעללולאַסעס און העמיסעללולאַסעס אין די טעסטעד געשעפט ענזיים געמיש, וואָס כולל די מערסט קאַמאַנלי געוויינט געשעפט ענזימעס.דעריבער, נייַ אַגזיליערי ענזימעס זענען פארלאנגט פֿאַר זייער כיידראַלאַסאַס.אָן די נייטיק ניט-סעללולאָסע אַקסעסערי ענזימעס, די ניט-סעללולאָסע קייטן פאַרמייַדן גאַנץ קאַנווערזשאַן צו מאָנאָסאַקשאַרידעס, אפילו אויב זייער פאָטער צוקער פּאָלימערס זענען יקסטענסיוולי כיידראַלייזד אין קירצער פראַגמאַנץ און צעלאָזן מיט געשעפט ענזיים מיקסטשערז.
ווייַטער לערנען פון סיגנאַל פאַרשפּרייטונג און זייַן ביינדינג שטאַרקייַט געוויזן אַז ביינדינג עפּיטאָפּעס זענען נידעריקער אין הויך דפּ צוקער פראַקשאַנז (א, ב, C, דפּ אַרויף צו 20+) ווי אין נידעריק דפּ פראַקשאַנז (ד, E, F, דפּ) אין דימערז) (Fig. 1).זויער פראַגמאַנץ זענען מער געוויינטלעך אין ניט-סעללולאָסע עפּיטאָופּס ווי נייטראַל פראַגמאַנץ.די דערשיינונגען זענען קאָנסיסטענט מיט דעם מוסטער באמערקט אין אונדזער פריערדיקן לערנען, ווו הויך דפּ און זויער מאָיעטעס זענען מער קעגנשטעליק צו ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס.דעריבער, די בייַזייַן פון ניט-סעללולאָסע גלייקאַן עפּיטאָופּס און U און MeU סאַבסטיטושאַנז קענען זייער ביישטייערן צו די פעסטקייַט פון די אָליגאָסאַקשאַרידעס.עס זאָל זיין אנגעוויזן אַז ביינדינג און דיטעקשאַן עפעקטיווקייַט קענען זיין פּראָבלעמאַטיק פֿאַר נידעריק דפּ אָליגאָסאַקשאַרידעס, ספּעציעל אויב די עפּיטאָופּ איז אַ דימעריק אָדער טרימעריק אָליגאָסאַקשאַריד.דאָס קענען זיין טעסטעד מיט געשעפט אָליגאָסאַקשאַרידעס פון פאַרשידענע לענגקטס, יעדער מיט בלויז איין עפּיטאָופּ וואָס ביינדז צו אַ ספּעציפיש מאַב.
אזוי, די נוצן פון סטרוקטור-ספּעציפיש אַנטיבאָדיעס אנטפלעקט זיכער טייפּס פון ריסאַליטראַנט קייטן.דעפּענדינג אויף די טיפּ פון אַנטיבאָדי געניצט, די צונעמען ליגיישאַן מוסטער און די שטאַרקייט פון די סיגנאַל עס טראגט (רובֿ און קלענסטער שעפעדיק), נייַ ענזימעס קענען זיין יידענאַפייד און מוסיף האַלב-קוואַנטיטאַטיוועלי צו די ענזיים געמיש פֿאַר מער גאַנץ גלייקאָוקאַנווערזשאַן.גענומען די אַנאַליסיס פון ACSH אָליגאָסאַקשאַרידעס ווי אַ ביישפּיל, מיר קענען שאַפֿן אַ דאַטאַבייס פון גלייקאַן קייטן פֿאַר יעדער בייאַמאַס מאַטעריאַל.עס זאָל זיין אנגעוויזן דאָ אַז די פאַרשידענע קירבות פון אַנטיבאָדיעס זאָל זיין גענומען אין חשבון, און אויב זייער קירבות איז אומבאַקאַנט, דאָס וועט מאַכן זיכער שוועריקייטן ווען קאַמפּערינג די סיגנאַלז פון פאַרשידענע אַנטיבאָדיעס.אין אַדישאַן, פאַרגלייַך פון גלייקאַן קייטן קען אַרבעט בעסטער צווישן סאַמפּאַלז פֿאַר דער זעלביקער אַנטיבאָדי.די פאַרביסן קייטן קענען דעריבער זיין לינגקט צו די CAZyme דאַטאַבייס, פֿון וואָס מיר קענען ידענטיפיצירן ענזימעס, אויסקלייַבן קאַנדידאַט ענזימעס און פּרובירן פֿאַר בונד-ברייקינג ענזימעס, אָדער אַנטוויקלען מייקראָוביאַל סיסטעמען צו אויסדריקן די ענזימעס פֿאַר נוצן אין ביאָרעפינעריז44.
צו אָפּשאַצן ווי ימיונאַלאַדזשיקאַל מעטהאָדס דערגאַנג אָלטערנאַטיוו מעטהאָדס פֿאַר קעראַקטערייזינג נידעריק מאָלעקולאַר וואָג אָליגאָסאַקשאַרידעס פאָרשטעלן אין ליגנאָסעללולאָסיק כיידראַלאַסייץ, מיר דורכגעקאָכט MALDI (Fig. 4, S1-S8) און אַנאַליסיס פון TMS-דערייווד סאַקשאַרידעס באזירט אויף GC-MS אויף דער זעלביקער טאַפליע (Fig. 5) אָליגאָסאַקשאַריד טייל.MALDI איז געניצט צו פאַרגלייַכן צי די מאַסע פאַרשפּרייטונג פון אָליגאָסאַקשאַריד מאַלאַקיולז גלייַכן די בדעה סטרוקטור.אויף פ.4 ווייזט די מק פון די נייטראַל קאַמפּאָונאַנץ ACN-A און ACN-B.אַקן-א אַנאַליסיס באשטעטיקט אַ קייט פון פּענטאָוס שוגערז ריינדזשינג פון דפּ 4-8 (Fig. 4) צו DP 22 (Fig. S1), וועמענס ווייץ שטימען צו מעו-קסילאַן אָליגאָסאַקשאַרידעס.ACN-B אַנאַליסיס באשטעטיקט די פּענטאָוסע און גלוקאָקסילאַן סעריע מיט DP 8-15.אין סאַפּלאַמענטערי מאַטעריאַל אַזאַ ווי פיגורע ס 3, FA-C אַסידיק מאָיעטי מאַסע פאַרשפּרייטונג מאַפּס ווייַזן אַ קייט פון (Me)U סאַבסטאַטוטאַד פּענטאָוס שוגערז מיט אַ דפּ פון 8-15 וואָס זענען קאָנסיסטענט מיט די סאַבסטאַטוטאַד קסילאַנז געפֿונען אין ELISA-באזירט מאַב זיפּונג.די עפּיטאַפּס זענען קאָנסיסטענט.
MALDI-MS ספּעקטרום פון סאַליאַבאַל ניט-געהאָרכיק אָליגאָסאַקשאַרידעס פאָרשטעלן אין ACS.דאָ, (א) אַקן-א נידעריק וואָג קייט פראַקשאַנז מיט מעטהילאַטעד וראָניק זויער (דפּ 4-8) סאַבסטאַטוטאַד גלוקוראָקסילאַן אָליגאָסאַקשאַרידעס און (ב) אַקן-ב קסילאַן און מעטהילאַטעד וראָניק זויער אָליגאָסאַקשאַרידעס סאַבסטאַטוטאַד מיט גלוקוראָקסילאַן (דפּ 8-15).
אַנאַליסיס פון דער זאַץ פון די גלייקאַן רעזאַדו פון ראַפראַקטערי אָליגאָסאַקשאַרידעס.דאָ (א) TMS סאַקשאַריד זאַץ פון פאַרשידן אָליגאָסאַקשאַריד פראַקשאַנז באקומען מיט GC-MS אַנאַליסיס.(ב) סטראַקטשערז פון פאַרשידן טמס-דערייווד שוגערז פאָרשטעלן אין אָליגאָסאַקשאַרידעס.ACN - אַסעטאָניטרילע בראָכצאָל מיט נייטראַל אָליגאָסאַקשאַרידעס און FA - פערוליק זויער בראָכצאָל מיט זויער אָליגאָסאַקשאַרידעס.
אן אנדער טשיקאַווע מסקנא איז געווען ציען פֿון די LC-MS אַנאַליסיס פון די אָליגאָסאַקשאַרידע בראָכצאָל, ווי געוויזן אין פיגורע ס 9 (מיטלען קענען זיין געזען אין די עלעקטראָניש סאַפּלאַמענטערי מאַטעריאַל).פראַגמאַנץ פון העקסאָסע און -OAc גרופּעס זענען ריפּיטידלי באמערקט בעשאַס ליגיישאַן פון די ACN-B בראָכצאָל.דער דערגייונג ניט בלויז קאַנפערמז די פראַגמאַנטיישאַן באמערקט אין גלייקאָום און MALDI-TOF אַנאַליסיס, אָבער אויך גיט נייַע אינפֿאָרמאַציע וועגן פּאָטענציעל קאַרבאָוכיידרייט דעריוואַטיווז אין פּרעטרעאַטעד ליגנאָסעללולאָסיק בייאַמאַס.
מיר אויך אַנאַלייזד די צוקער זאַץ פון די אָליגאָסאַקשאַריד בראָכצאָל ניצן TMS צוקער דעריוואַטאַזיישאַן.מיט גק-מס, מיר באשלאסן די זאַץ פון נעוראַל (ניט-דעריוואַטיוו) און אַסידיק שוגערז (גלואַ און גאַלאַ) אין די אָליגאָסאַקשאַרידע בראָכצאָל (פיגורע 5).גלוקוראָניק זויער איז געפֿונען אין אַסידיק קאַמפּאָונאַנץ C און D, בשעת גאַלאַקטוראָניק זויער איז געפֿונען אין אַסידיק קאַמפּאָונאַנץ A און B, וואָס ביידע זענען הויך דפּ קאַמפּאָונאַנץ פון אַסידיק שוגערז.די רעזולטאַטן ניט בלויז באַשטעטיקן אונדזער ELISA און MALDI דאַטן, אָבער זענען אויך קאָנסיסטענט מיט אונדזער פריערדיקן שטודיום פון אַקיומיאַליישאַן פון אָליגאָסאַקשאַרידע.דעריבער, מיר גלויבן אַז מאָדערן ימיונאַלאַדזשיקאַל מעטהאָדס ניצן ביאָטינילאַטיאָן פון אָליגאָסאַקשאַרידעס און סאַבסאַקוואַנט ELISA זיפּונג זענען גענוג צו דעטעקט סאַליאַבאַל ריקאַלסיטראַנט אָליגאָסאַקטשאַרידעס אין פאַרשידן בייאַלאַדזשיקאַל סאַמפּאַלז.
זינט ELISA-באזירט מאַב זיפּונג מעטהאָדס זענען וואַלאַדייטאַד דורך עטלעכע פאַרשידענע מעטהאָדס, מיר געוואלט צו ווייַטער ויספאָרשן די פּאָטענציעל פון דעם נייַע קוואַנטיטאַטיווע אופֿן.צוויי געשעפט אָליגאָסאַקשאַרידעס, קסילאָהעקסאַסאַקשאַרידע אָליגאָסאַקשאַרידע (XHE) און 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), זענען פּערטשאַסט און טעסטעד מיט אַ נייַע מאַב צוגאַנג טאַרגאַטינג די גלייקאַן פון די צעל וואַנט.פיגור 6 ווייזט אַ לינעאַר קאָראַליישאַן צווישן די ביאָטינילאַטעד ביינדינג סיגנאַל און די קלאָץ קאַנסאַנטריישאַן פון אָליגאָסאַקשאַרידע קאַנסאַנטריישאַן, סאַגדזשעסטינג אַ מעגלעך לאַנגמויר אַדסאָרפּטיאָן מאָדעל.צווישן די מאַבס, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, און CCRC-M151 קאָראַלייטאַד מיט XHE, און CCRC-M108, CCRC-M109, און LM11 קאָראַלייטאַד מיט A2XXn נאָם איבער אַ קייט פון 100n.רעכט צו דער לימיטעד אַוויילאַבילאַטי פון אַנטיבאָדיעס בעשאַס דער עקספּערימענט, לימיטעד יקספּעראַמאַנץ זענען דורכגעקאָכט מיט יעדער אָליגאָסאַקשאַריד קאַנסאַנטריישאַן.עס זאָל זיין באמערקט דאָ אַז עטלעכע אַנטיבאָדיעס רעאַגירן זייער אַנדערש צו דער זעלביקער אָליגאָסאַקשאַריד ווי אַ סאַבסטרייט, מאַשמאָעס ווייַל זיי בינדן צו אַ ביסל פאַרשידענע עפּיטאָופּס און קענען האָבן זייער פאַרשידענע ביינדינג אַפיניטיעס.די מעקאַניזאַמז און ימפּלאַקיישאַנז פון פּינטלעך עפּיטאָפּע לעגיטימאַציע וועט זיין פיל מער קאָמפּליצירט ווען די נייַע מאַב צוגאַנג איז געווענדט צו פאַקטיש סאַמפּאַלז.
צוויי געשעפט אָליגאָסאַקשאַרידעס זענען געניצט צו באַשטימען די דיטעקשאַן קייט פון פאַרשידן גלייקאַן-טאַרגעטינג מאַבס.דאָ, לינעאַר קאָראַליישאַנז מיט לאָג קאַנסאַנטריישאַן פון אָליגאָסאַקשאַריד קאַנסאַנטריישאַן אָנווייַזן Langmuir אַדסאָרפּטיאָן פּאַטערנז פֿאַר (א) XHE מיט מאַב און (ב) A2XX מיט מאַב.די קאָראַספּאַנדינג עפּיטאָופּס אָנווייַזן די סטראַקטשערז פון די געשעפט אָליגאָסאַקשאַרידעס געניצט ווי סאַבסטרייץ אין די אַסעי.
די נוצן פון גלייקאַן-טאַרגעטעד מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדיעס (גלייקקאָמיק אַנאַליסיס אָדער עליסאַ-באזירט מאַב זיפּונג) איז אַ שטאַרק געצייַג פֿאַר טיף קעראַקטעריסטיקס פון רובֿ פון די הויפּט גלייקאַנז פון צעל וואַנט וואָס מאַכן די פאַבריק בייאַמאַס.אָבער, קלאַסיש גלייקאַן אַנאַליסיס בלויז קעראַקטערייזאַז גרעסערע צעל וואַנט גלייקאַנז, ווייַל רובֿ אָליגאָסאַקשאַרידעס זענען נישט ימאָובאַלייזד אויף ELISA פּלאַטעס.אין דעם לערנען, AFEX-פּרעטרעאַטעד פּאַפּשוי סטאָווער איז ענזימאַטיקלי כיידראַלייזד מיט אַ הויך סאָלידס אינהאַלט.צוקער אַנאַליסיס איז געניצט צו באַשטימען דעם זאַץ פון ריקאַלסיטראַנט צעל וואַנט קאַרבאָוכיידרייץ אין די הידראָליזאַטע.אָבער, מאַב אַנאַליסיס פון קלענערער אָליגאָסאַקשאַרידעס אין כיידראַלאַסייץ איז אַנדערעסטאַמייטיד, און נאָך מכשירים זענען דארף צו יפעקטיוולי ימאָובאַלייז אָליגאָסאַקשאַרידעס אויף עליסאַ פּלאַטעס.
מיר באַריכט דאָ אַ ראָמאַן און עפעקטיוו אָליגאָסאַקשאַריד ימאָובאַלאַזיישאַן אופֿן פֿאַר מאַב זיפּונג דורך קאַמביינינג אָליגאָסאַקשאַריד ביאָטינילאַטיאָן נאכגעגאנגען דורך עליסאַ זיפּונג אויף נעוטראַווידין ™ קאָוטאַד פּלאַטעס.די ימאָובאַלייזד ביאָטינילאַטעד אָליגאָסאַקשאַרידעס געוויזן גענוג קירבות פֿאַר די אַנטיבאָדי צו געבן גיך און עפעקטיוו דיטעקשאַן פון רעקאַלסיטראַנט אָליגאָסאַקשאַרידעס.אַנאַליסיס פון דעם זאַץ פון די פאַרביסן אָליגאָסאַקשאַרידעס באזירט אויף מאַסע ספּעקטראָמעטרי באשטעטיקט די רעזולטאַטן פון דעם נייַע צוגאַנג צו ימיונאָסקרענינג.אזוי, די שטודיום באַווייַזן אַז די קאָמבינאַציע פון ​​​​אָליגאָסאַקשאַריד ביאָטינילאַטיאָן און ELISA זיפּונג מיט גלייקאַן-טאַרגעטעד מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדיעס קענען זיין געוויינט צו דעטעקט קראָססלינקס אין אָליגאָסאַקשאַרידעס און קענען זיין וויידלי געווענדט אין אנדערע בייאָוקעמיקאַל שטודיום וואָס קעראַקטערייז די סטרוקטור פון אָליגאָסאַקטשאַרידעס.
דעם ביאָטין-באזירט גלייקאַן פּראָפילינג אופֿן איז דער ערשטער באַריכט וואָס איז ביכולת צו ויספאָרשן די ריקאַלסיטראַנט קאַרבאָוכיידרייט קייטן פון סאַליאַבאַל אָליגאָסאַקשאַרידעס אין פאַבריק בייאַמאַס.דאָס העלפּס צו פֿאַרשטיין וואָס עטלעכע טיילן פון בייאַמאַס זענען אַזוי פאַרביסן ווען עס קומט צו פּראָדוקציע פון ​​ביאָפועל.דער אופֿן פילז אַ וויכטיק ריס אין גלייקאָום אַנאַליסיס מעטהאָדס און יקסטענדז זייַן אַפּלאַקיישאַן צו אַ ברייט קייט פון סאַבסטרייץ ווייַטער פון פאַבריק אָליגאָסאַקשאַרידעס.אין דער צוקונפֿט, מיר קענען נוצן ראָובאַטיקס פֿאַר ביאָטינילאַטיאָן און נוצן דעם אופֿן וואָס מיר האָבן דעוועלאָפּעד פֿאַר הויך-דורכקייט אַנאַליסיס פון סאַמפּאַלז ניצן ELISA.
פּאַפּשוי שטרוי (CS) דערוואַקסן פון פּיאָניר 33A14 כייבריד זאמען איז כאַרוואַסטיד אין 2010 פון קראַמער פאַרמס אין Ray, קאָלאָראַדאָ.מיט דער דערלויבעניש פון די לאַנדאָונער, דעם בייאַמאַס קענען ווערן געניצט פֿאַר פאָרשונג. די סאַמפּאַלז זענען סטאָרד טרוקן < 6% נעץ אין פאַרשלעסלען-שלאָס באַגס אין צימער טעמפּעראַטור. די סאַמפּאַלז זענען סטאָרד טרוקן < 6% נעץ אין פאַרשלעסלען-שלאָס באַגס אין צימער טעמפּעראַטור. ינוועסטאַגייטינג קאַנסאַנטריישאַנז פֿאַר קאַנסאַנטריישאַן < 6% אין קאַנסאַנטריישאַנז מיט די קאַנסאַנטרייטאַד קאָמפּיוטער. סאַמפּאַלז זענען סטאָרד טרוקן אין <6% הומידיטי אין זיפּפּערד באַגס אין צימער טעמפּעראַטור.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% די רעקאַמאַנדיישאַנז פון די קאַנסאַנטריישאַן מיט די קאַנסאַנטריישאַן פון די קאַנסאַנטריישאַן מיט < 6%. סאַמפּאַלז זענען סטאָרד אין בליצ - שלעסל באַגס אין צימער טעמפּעראַטור מיט הומידיטי <6%.דער שטודיע איז נאכגעגאנגען מיט לאקאלע און נאציאנאלע גיידליינז.קאָמפּאָסיטיאָנאַל אַנאַליסיס איז דורכגעקאָכט מיט די NREL פּראָטאָקאָל.דער זאַץ איז געפונען צו אַנטהאַלטן 31.4% גלוקאַן, 18.7% קסילאַן, 3.3% אַראַבינאַן, 1.2% גאַלאַקטאַן, 2.2% אַסעטיל, 14.3% ליגנין, 1.7% פּראָטעין און 13.4% אַש.
Cellic® CTec2 (138 מג פּראָטעין / מל, פּלאַץ VCNI 0001) איז אַ קאָמפּלעקס געמיש פון סעללולאַסע, β-גלוקאָוסידאַסע און Cellic® HTec2 (157 מג פּראָטעין / מל, פּלאַץ VHN00001) פֿון Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 מג פּראָטעין / מל), אַ קאָמפּלעקס צונויפגיסן פון פּעקטין דיגריידינג ענזימעס, איז דאָונייטיד דורך DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).ענזיים פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַנז זענען באשלאסן דורך עסטימאַטעד פּראָטעין אינהאַלט (און סאַבטראַקטינג די צושטייַער פון ניט-פּראָטעין ניטראָגען) ניצן Kjeldahl ניטראָגען אַנאַליסיס (AOAC אופֿן 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).דיאַטאָמאַסעאָוס ערד 545 איז פּערטשאַסט פֿון EMD Millipore (Billerica, MA).אַקטיווייטיד טשאַד (DARCO, 100 מעש גראַניאַלז), אַוויסעל (PH-101), ביטש קסילאַן, און אַלע אנדערע קעמיקאַלז זענען פּערטשאַסט פֿון Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX פּרעטרעאַטמענט איז דורכגעקאָכט אין GLBRC (ביאָמאַסס קאַנווערזשאַן פאָרשונג לאַבאָראַטאָרי, MSU, Lansing, MI, USA).פאַר-באַהאַנדלונג איז געפירט אויס ביי 140 ° סי פֿאַר 15 מינוט.46 וווינאָרט צייט אין 1:1 פאַרהעלטעניש פון אַנהידראָוס אַמאָוניאַ צו בייאַמאַס ביי 60% (וו/וו) לאָודינג אין אַ ומבאַפלעקט שטאָל בענטשטאָפּ פּעקל רעאַקטאָר (Parr Instruments Company).עס האָט געדויערט 30 מינוט.דער רעאַקטאָר איז געבראכט צו 140 ° C און די אַמאָוניאַ איז ראַפּאַדלי באפרייט, אַלאַוינג די בייאַמאַס צו געשווינד צוריקקומען צו צימער טעמפּעראַטור.דער זאַץ פון AFEX פאַר-באהאנדלט פּאַפּשוי סטאָווער (ACS) איז געווען ענלעך צו אַז פון אַנטריטיד פּאַפּשוי סטאָווער (UT-CS).
הויך סאָלידס ACSH 25% (וו / וו) (בעערעך 8% דעקסטראַן לאָודינג) איז געווען צוגעגרייט ווי אַ סטאַרטינג מאַטעריאַל פֿאַר גרויס וואָג פּראָדוקציע פון ​​אָליגאָסאַקשאַרידעס.ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס פון ACS איז דורכגעקאָכט מיט אַ געשעפט ענזיים געמיש אַרייַנגערעכנט Cellic® Ctec2 10 מג פּראָטעין / ג גלוקאַן (אין פּרעטרעאַטעד בייאַמאַס), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 מג פּראָטעין / ג גלוקאַן, און Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 מג פּראָטעין / ג דעקסטראַן.ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס איז דורכגעקאָכט אין אַ 5-ליטער ביאָרעאַקטאָר מיט אַ אַרבעט באַנד פון 3 ליטער, ף 4.8, 50 ° C און 250 רפּם.נאָך כיידראַלאַסאַס פֿאַר 96 שעה, די הידראָליזאַטע איז געזאמלט דורך סענטריפוגאַטיאָן ביי 6000 רפּם פֿאַר 30 מינוט און דעמאָלט בייַ 14000 רפּם פֿאַר 30 מינוט צו באַזייַטיקן אַנהידראָליסיסעד סאָלידס.די הידראָליזאַטע איז דעמאָלט אונטערטעניק צו סטערילע פילטריישאַן דורך אַ 0.22 מם פילטער ביקער.די פילטערד הידראָליזאַטע איז סטאָרד אין סטערילע לאגלען בייַ 4 ° סי און דעמאָלט פראַקשאַנייטיד אויף טשאַד.
אַנאַליסיס פון דער זאַץ פון עקסטראַקט-באזירט בייאַמאַס סאַמפּאַלז לויט צו NREL לאַבאָראַטאָריע אַנאַליסיס פּראָוסידזשערז: צוגרייטונג פון סאַמפּאַלז פֿאַר זאַץ אַנאַליסיס (NREL / TP-510-42620) און באַשטימונג פון סטראַקטשעראַל קאַרבאָוכיידרייץ און ליגנין אין בייאַמאַס (NREL / TP-510 - 42618)47.
אָליגאָסאַקשאַריד אַנאַליסיס פון די כיידראַלאַזאַט טייַך איז געווען דורכגעקאָכט אויף אַ 2 מל וואָג מיט אַ אַוטאָקלאַוו-באזירט זויער כיידראַלאַסאַס אופֿן.מישן די כיידראַלייזד מוסטער מיט 69.7 μל פון 72% סאַלפיוריק זויער אין אַ 10 מל שרויף היטל קולטור רער און ינגקיובייט פֿאַר 1 שעה אויף אַ בענטשטאָפּ ביי 121 °C, קיל אויף אייז און פילטער אין אַ הויך פאָרשטעלונג פליסיק קראָומאַטאַגראַפי (הפּלק) וויאַל.די קאַנסאַנטריישאַן פון אָליגאָסאַקשאַרידעס איז באשלאסן דורך סאַבטראַקטינג די קאַנסאַנטריישאַן פון מאָנאָסאַקשאַרידעס אין די ניט-כיידראַלייזד מוסטער פון די גאַנץ צוקער קאַנסאַנטריישאַן אין די זויער-כיידראַלייזד מוסטער.
גלוקאָוס, קסילאָסע און אַראַבינאָסע קאַנסאַנטריישאַנז אין די זויער כיידראַלייזד בייאַמאַס זענען אַנאַלייזד מיט אַ שימאַדזו הפּלק סיסטעם יקוויפּט מיט אַ אַוטאָסאַמפּלער, זייַל כיטער, יסאָקראַטיק פּאָמפּע און רעפראַקטיווע אינדעקס דעטעקטאָר אויף אַ ביאָ-ראַד אַמינעקס הפּקס-87 ה זייַל.דער זייַל איז געווען מיינטיינד בייַ 50 ° C און ילוטאַד מיט 0.6 מל / מין 5 מם ה2סאָ4 אין וואַסער.לויפן.
די כיידראַלייזד סופּערנאַטאַנט איז דיילוטאַד און אַנאַלייזד פֿאַר מאָנאָמער און אָליגאָסאַקשאַריד אינהאַלט.מאָנאָמעריק שוגערז באקומען נאָך ענזימאַטיק כיידראַלאַסאַס זענען אַנאַלייזד דורך HPLC יקוויפּט מיט אַ Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P זייַל און אַן אַש היטן זייַל.דער זייַל טעמפּעראַטור איז געווען מיינטיינד בייַ 80 ° C, וואַסער איז געניצט ווי די רירעוודיק פאַסע מיט אַ לויפן קורס פון 0.6 מל / מין.אָליגאָסאַקשאַרידעס זענען באשלאסן דורך כיידראַלאַסאַס אין צעפירן זויער ביי 121 ° C לויט די מעטהאָדס דיסקרייבד אין רעפס.41 , 48 , 49 .
סאַקשאַריד אַנאַליסיס איז געווען דורכגעקאָכט אויף רוי, AFEX פאַר-באהאנדלט און אַלע ניט-הידראָליזעד בייאַמאַס רעזאַדוז (אַרייַנגערעכנט פּראָדוקציע פון ​​סיריאַל צעל וואַנט עקסטראַקץ און זייער מאַב זיפּונג) ניצן פריער דיסקרייבד פּראָוסידזשערז 27, 43, 50, 51.פֿאַר גלייקאָום אַנאַליסיס, אַלקאָהאָל-ינסאַליאַבאַל רעזאַדוז פון פאַבריק צעל וואַנט מאַטעריאַל זענען צוגעגרייט פון בייאַמאַס רעזאַדוז און אונטערטעניק צו סיריאַל יקסטראַקשאַן מיט ינקריסינגלי אַגרעסיוו ריידזשאַנץ אַזאַ ווי אַמאָוניאַם אָקסאַלאַטע (50 מם), סאָדיום קאַרבאַנייט (50 מם און 0.5% וו / וו), CON.(1 ם און 4 ם, ביידע מיט 1% וו/וו סאָדיום באָראָהידרידע) און זויער טשלאָרייט ווי פריער דיסקרייבד52,53.די אויסצוגן זענען דערנאָך אונטערטעניק צו ELISA קעגן אַ קאָמפּלעקס טאַפליע פון ​​מאַב 50 ס דירעקטעד צו די גלייקאַן פון די צעל וואַנט, און די מאַב ביינדינג ריאַקשאַנז זענען דערלאנגט ווי אַ היץ מאַפּע.מאַבס טאַרגאַטינג פאַבריק צעל וואַנט גלייקאַן זענען פּערטשאַסט פֿון לאַבאָראַטאָריע סטאַקס (CCRC, JIM און MAC סעריע).
איין-שריט ביאָטינילאַטיאָן פון אָליגאָסאַקשאַרידעס.די קאַנדזשוגיישאַן פון קאַרבאָוכיידרייץ מיט ביאָטין-לק-הידראַזידע איז דורכגעקאָכט מיט די פאלגענדע פּראָצעדור.ביאָטין-לק-הידראַזידע (4.6 מג / 12 μמאָל) איז צעלאָזן אין דימעטהיל סולפאָקסידע (דמסאָ, 70 μל) דורך קראַפטיק סטערינג און באַהיצונג בייַ 65 ° סי פֿאַר 1 מין.גליישאַל אַסעטיק זויער (30 μל) איז צוגעגעבן און די געמיש איז געווען אויסגעגאסן אויף סאָדיום סיאַנאָבאָראָהידרידע (6.4 מג / 100 μמאָל) און גאָר צעלאָזן נאָך באַהיצונג ביי 65 ° סי פֿאַר וועגן 1 מינוט.דערנאָך, 5-8 μל פון די אָפּרוף געמיש איז מוסיף צו די דאַר אָליגאָסאַקשאַריד (1-100 נמאָל) צו באַקומען אַ 10-פאַרלייגן אָדער מער מאָלאַר וידעפדיק פון די פירמע איבער די רידוסינג סוף.דער אָפּרוף איז געפירט אויס ביי 65 ° C פֿאַר 2 שעה, נאָך וואָס די סאַמפּאַלז זענען מיד פּיוראַפייד.קיין סאָדיום סיאַנאָבאָראָהידרידע איז געניצט אין די לייבלינג יקספּעראַמאַנץ אָן רעדוקציע, און די סאַמפּאַלז זענען ריאַקטאַד בייַ 65 ° סי פֿאַר 2.5 שעה.
ELISA קאָוטינג און וואַשינג סאַמפּאַלז פון ביאָטינילאַטעד אָליגאָסאַקשאַרידעס.25 μל ביאָטינילאַטעד סאַמפּאַלז (100 μל פון יעדער קאַנסאַנטרייטאַד מוסטער דיילוטאַד אין 5 מל פון 0.1 ם טריס באַפער לייזונג (טבס)) זענען צוגעגעבן צו יעדער געזונט פון די אַווידין-קאָוטאַד טעלער.קאָנטראָל וועלז זענען קאָוטאַד מיט 50 μל ביאָטין אין אַ קאַנסאַנטריישאַן פון 10 μג / מל אין 0.1 עם טבס.דעיאָניזעד וואַסער איז געניצט ווי אַ קאָוטינג פֿאַר ליידיק מעזשערמאַנץ.די טאַבלעט איז ינגקיובייטיד פֿאַר 2 שעה אין צימער טעמפּעראַטור אין דער פינצטער.וואַשן די טעלער 3 מאל מיט 0.1% אָפּגעשעפּטע מילך אין 0.1 עם טבס ניצן פּראָגראַם נומ.11 פֿאַר גרעניער פלאַך 3 אַ.
דערצו און וואַשינג פון ערשטיק אַנטיבאָדיעס.לייג 40 μל ערשטיק אַנטיבאָדי צו יעדער געזונט.ינגקיובייט די מיקראָפּלאַטע פֿאַר 1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור אין דער פינצטער.די פּלאַטעס זענען דעמאָלט געוואשן 3 מאל מיט 0.1% מילך אין 0.1 ם טבס ניצן וואַש פּראָגראַם # 11 פֿאַר Grenier Flat 3A.
לייג צווייטיק אַנטיבאָדי און וואַשן.לייג 50 μל פון מויז / שטשור צווייטיק אַנטיבאָדי (דיילוטאַד 1:5000 אין 0.1% מילך אין 0.1 עם טבס) צו יעדער געזונט.ינגקיובייט די מיקראָפּלאַטע פֿאַר 1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור אין דער פינצטער.די מיקראָפּלאַטעס זענען דעמאָלט געוואשן 5 מאל מיט 0.1% מילך אין 0.1 עם טבס ניצן Grenier Flat 5A טעלער וואַש פּראָגראַם #12.
אַדינג אַ סאַבסטרייט.לייג 50 μל פון 3,3′,5,5′-טעטראַמעטהילבענזידינע (טמב) צו די באַזע סאַבסטרייט (דורך אַדינג 2 טראפנס פון באַפער, 3 טראפנס פון טמב, 2 טראפנס פון הידראָגען פּעראַקסייד צו 15 מל פון דייאַנייזד וואַסער).צוגרייטן די TMB סאַבסטרייט.און וואָרטעקס איידער נוצן).ינגקיובייט די מיקראָפּלאַטע אין צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 30 מינוט.אין דער פינצטער.
פאַרענדיקן דעם שריט און לייענען די טאַבלעט.לייג 50 μל פון 1 N סאַלפיוריק זויער צו יעדער געזונט און רעקאָרדירן די אַבזאָרבאַנס פון 450 צו 655 נם ניצן אַן עליסאַ לייענער.
צוגרייטן 1 מג / מל סאַלושאַנז פון די אַנאַליטעס אין דייאָניזעד וואַסער: אַראַבינאָסע, רהאַמנאָסע, פוקאָסע, קסילאָסע, גאַלאַקטוראָניק זויער (גאַלאַ), גלוקוראָניק זויער (גלקאַ), מאַננאָסע, גלוקאָוס, גאַלאַקטאָסע, לאַקטאָוס, N-אַסעטילמאַננאָסאַמינע (מאַננאַק), N-אַסעטילגלוקאָסאַמינע.(גלקNAc), N-אַסעטילגאַלאַקטאָסאַמינע (גאַלNAc), ינאָסיטאָל (ינערלעך נאָרמאַל).צוויי סטאַנדאַרדס זענען צוגעגרייט דורך אַדינג די 1 מג / מל צוקער סאַלושאַנז געוויזן אין טאַבלע 1. סאַמפּאַלז זענען פאַרפרוירן און ליאָפיליזעד בייַ -80 ° סי ביז אַלע וואַסער איז אַוועקגענומען (יוזשאַוואַלי וועגן 12-18 שעה).
לייג 100-500 μג פון מוסטער צו שרויף היטל טובז אויף אַן אַנאַליטיש וואָג.רעקאָרד די סומע צוגעגעבן.עס איז בעסטער צו צעלאָזן די מוסטער אין אַ ספּעציפיש קאַנסאַנטריישאַן פון סאַלוואַנט און לייגן עס צו די רער ווי אַ פליסיק אַליקוואָט.ניצן 20 μל פון 1 מג / מל ינאָסיטאָל ווי אַ ינערלעך נאָרמאַל פֿאַר יעדער מוסטער רער.די סומע פון ​​ינערלעך נאָרמאַל צוגעגעבן צו די מוסטער מוזן זיין די זעלבע ווי די סומע פון ​​​​ינערלעך נאָרמאַל צוגעגעבן צו די נאָרמאַל רער.
לייג 8 מל פון אַנהידראָוס מעטאַנאָל צו אַ שרויף היטל וויאַל.דעמאָלט 4 מל פון 3 ן מעטאַנאָליק הקל לייזונג, קאַפּט און שאַקינג.דעם פּראָצעס טוט נישט נוצן וואַסער.
לייג 500 μל פון 1 M HCl מעטאַנאָל לייזונג צו די אָליגאָסאַקשאַריד סאַמפּאַלז און נאָרמאַל טמס טובז.סאַמפּאַלז זענען ינקובייטיד יבערנאַכטיק (168 שעה) בייַ 80 ° סי אין אַ טערמאַל בלאָק.טרוקן די מעטאַנאָליסיס פּראָדוקט אין צימער טעמפּעראַטור ניצן אַ דרייינג מאַניפאָולד.לייג 200 μל מעאָה און טרוקן ווידער.דעם פּראָצעס איז ריפּיטיד צוויי מאָל.לייג 200 μל מעטאַנאָל, 100 μל פּירידינע און 100 μל אַסעטיק אַנהידרידע צו די מוסטער און מישן געזונט.סאַמפּאַלז זענען ינגקיובייטיד אין צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 30 מינוט.און דאַר.לייג 200 μל מעטאַנאָל און טרוקן ווידער.
לייג 200 μל טרי-סיל און היץ קאַפּט רער פֿאַר 20 מינוט.80 ° C, דעמאָלט קולד צו צימער טעמפּעראַטור.ניצן אַ דרייינג מאַניפאָולד צו ווייַטער טרוקן די מוסטער צו אַ באַנד פון בעערעך 50 μל.עס איז וויכטיק צו טאָן אַז מיר האָבן נישט לאָזן די סאַמפּאַלז גאָר טרוקן.
לייג 2 מל פון העקסאַן און מישן געזונט דורך וואָרטעקסינג.פּלאָמבירן די עצות פון פּאַסטער פּיפּעטטעס (5-8 מם) מיט אַ שטיק פון גלאז וואָל דורך ינסערטינג די גלאז וואָל אויף שפּיץ פון אַ 5-3/4 אינטש דיאַמעטער פּיפּעטטע.סאַמפּאַלז זענען סענטריפוגעד בייַ 3000 ג פֿאַר 2 מינוט.קיין ינסאַליאַבאַל רעזאַדוז זענען פּריסיפּיטייטיד.טרוקן די מוסטער צו 100-150 μל.א באַנד פון בעערעך 1 μל איז ינדזשעקטיד אין די GC-MS אין אַן ערשט טעמפּעראַטור פון 80 ° C און אַן ערשט צייט פון 2.0 מינוט (טאַבלע 2).