Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Ձեր օգտագործած բրաուզերի տարբերակը ունի սահմանափակ CSS աջակցություն:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Միևնույն ժամանակ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը կներկայացնենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Նոր իմունոլոգիական և զանգվածային սպեկտրաչափական մեթոդներ կայուն օլիգոսաքարիդների համալիր վերլուծության համար եգիպտացորենի սնկով նախապես մշակված AFEX-ով:Lignocellulosic կենսազանգվածը կայուն այլընտրանք է հանածո վառելիքին և լայնորեն օգտագործվում է կենսատեխնոլոգիաների զարգացման համար այնպիսի ապրանքների արտադրության համար, ինչպիսիք են սննդամթերքը, կերերը, վառելանյութերը և քիմիական նյութերը:Այս տեխնոլոգիաների բանալին ծախսերի մրցակցային գործընթացների զարգացումն է բույսերի բջիջների պատերում առկա բարդ ածխաջրերը վերածելու պարզ շաքարների, ինչպիսիք են գլյուկոզա, քսիլոզա և արաբինոզա:Քանի որ լիգնոցելյուլոզային կենսազանգվածը շատ համառ է, այն պետք է ենթարկվի ջերմաքիմիական մշակումների (օրինակ՝ ամոնիակ մանրաթելերի շերտավորում (AFEX), նոսր թթուներ (DA), իոնային հեղուկներ (IL)) և կենսաբանական մշակումներ (օրինակ՝ ֆերմենտային հիդրոլիզ և մանրէաբանական խմորում)՝ համակցված ցանկալի արտադրանք ստանալու համար:.Այնուամենայնիվ, երբ հիդրոլիզի գործընթացում օգտագործվում են առևտրային սնկային ֆերմենտներ, ձևավորված լուծվող շաքարների միայն 75-85%-ն են մոնոսաքարիդներ, իսկ մնացած 15-25%-ը լուծելի, չլուծվող օլիգոսաքարիդներ, որոնք միշտ չէ, որ հասանելի են միկրոօրգանիզմներին:Նախկինում մենք հաջողությամբ մեկուսացրել և մաքրել ենք լուծվող համառ օլիգոսաքարիդները՝ օգտագործելով ածխածնի և դիատոմային հողի տարանջատման և չափի բացառման քրոմատոգրաֆիայի համակցությունը, ինչպես նաև ուսումնասիրել ենք դրանց ֆերմենտի արգելակող հատկությունները:Մենք պարզել ենք, որ պոլիմերացման ավելի բարձր աստիճանի (DP) մեթիլացված ուրոնաթթվի փոխարինումներ պարունակող օլիգոսաքարիդներն ավելի դժվար են մշակվում կոմերցիոն ֆերմենտային խառնուրդներով, քան ցածր DP և չեզոք օլիգոսաքարիդները:Այստեղ մենք զեկուցում ենք մի քանի լրացուցիչ մեթոդների կիրառման մասին, ներառյալ գլիկանի պրոֆիլավորումը՝ օգտագործելով մոնոկլոնալ հակամարմիններ (mAbs), որոնք հատուկ են բույսերի կենսազանգվածի գլիկաններին՝ բույսերի բջիջների պատերին և ֆերմենտային հիդրոլիզատներում գլիկանային կապերը բնութագրելու համար, մատրիցային օգնությամբ լազերային դեզորբցիոն իոնացում, թռիչքի ժամանակի զանգվածային սպեկտրոմետրիա:.MALDI-TOF-MS) օգտագործում է կառուցվածքային-տեղեկատվական ախտորոշիչ գագաթները, որոնք ստացվել են սպեկտրոսկոպիայի միջոցով բացասական իոնների երկրորդական քայքայումից հետո, գազային քրոմատագրություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա (GC-MS)՝ բնութագրելու օլիգոսաքարիդային կապերը ածանցյալացումով և առանց դրա:Օլիգոսաքարիդների փոքր չափերի պատճառով (DP 4–20) այս մոլեկուլները դժվար է օգտագործել մԱբ-ի միացման և բնութագրման համար:Այս խնդիրը հաղթահարելու համար մենք կիրառեցինք բիոտինի կոնյուգացիայի վրա հիմնված օլիգոսաքարիդների անշարժացման նոր մեթոդ, որը հաջողությամբ պիտակավորեց ցածր DP լուծվող օլիգոսաքարիդների մեծ մասը միկրոափսեի մակերեսին, որն այնուհետև օգտագործվեց բարձր թողունակության mAb համակարգում՝ հատուկ կապակցման վերլուծության համար:Այս նոր մեթոդը կնպաստի գլիկոմի բարձր թողունակության ավելի առաջադեմ վերլուծությունների մշակմանը ապագայում, որոնք կարող են օգտագործվել ախտորոշիչ նպատակներով բիոմարկերներում առկա օլիգոսաքարիդները մեկուսացնելու և բնութագրելու համար:
Գյուղատնտեսական, անտառային, խոտածածկ և փայտային նյութերից կազմված լիգնոցելյուլոզային կենսազանգվածը պոտենցիալ հումք է կենսաբանական հիմքով արտադրանքի, ներառյալ սննդամթերքի, կերերի, վառելիքի և քիմիական պրեկուրսորների արտադրության համար՝ ավելի բարձր արժեքով արտադրանք1:Բույսերի բջիջների պատերում առկա ածխաջրերը (օրինակ՝ ցելյուլոզը և կիսցելյուլոզը) ապապոլիմերացվում են մոնոսաքարիդների՝ քիմիական վերամշակման և կենսատրանսֆորմացիայի միջոցով (ինչպիսիք են ֆերմենտային հիդրոլիզը և մանրէաբանական խմորումը):Ընդհանուր նախնական մշակումները ներառում են ամոնիակային մանրաթելերի ընդլայնումը (AFEX), նոսր թթու (DA), իոնային հեղուկ (IL) և գոլորշու պայթյուն (SE), որոնք օգտագործում են քիմիական նյութերի և ջերմության համադրություն՝ նվազեցնելու լիգնոցելյուլոզայի արտադրությունը՝ բացելով բույսերի բջիջների պատերը3,4:նյութի համառությունը, 5. Ֆերմենտային հիդրոլիզն իրականացվում է պինդ նյութերի բարձր բեռնվածությամբ՝ օգտագործելով առևտրային ակտիվ ածխաջրեր պարունակող ֆերմենտներ (CAZymes) և մանրէաբանական խմորում, օգտագործելով տրանսգենային խմորիչներ կամ բակտերիաներ՝ կենսաբանական վառելիքի և քիմիական նյութերի արտադրության համար 6:
Առևտրային ֆերմենտներում CAZymes-ը կազմված է ֆերմենտների բարդ խառնուրդից, որոնք սիներգետիկորեն ճեղքում են բարդ ածխաջրածին-շաքարային կապերը՝ ձևավորելով մոնոսաքարիդներ2,7:Ինչպես ավելի վաղ հայտնել էինք, ածխաջրերի հետ լիգնինի անուշաբույր պոլիմերների բարդ ցանցը դրանք դարձնում է խիստ անլուծելի, ինչը հանգեցնում է շաքարի թերի փոխակերպման՝ կուտակելով սեռական օլիգոսաքարիդների 15-25%-ը, որոնք չեն արտադրվում նախապես մշակված կենսազանգվածի ֆերմենտային հիդրոլիզի ժամանակ:Սա ընդհանուր խնդիր է կենսազանգվածի նախնական մշակման տարբեր մեթոդների հետ:Այս խցանման որոշ պատճառներ ներառում են հիդրոլիզի ժամանակ ֆերմենտների արգելակումը կամ էական էական ֆերմենտների բացակայությունը կամ ցածր մակարդակները, որոնք անհրաժեշտ են բույսերի կենսազանգվածում շաքարային կապերը կոտրելու համար:Հասկանալով շաքարների բաղադրությունը և կառուցվածքային բնութագրերը, ինչպիսիք են օլիգոսաքարիդների շաքարային կապերը, մեզ կօգնի բարելավել շաքարի փոխակերպումը հիդրոլիզի ժամանակ՝ բիոտեխնոլոգիական գործընթացները գներով մրցունակ դարձնելով նավթից ստացված արտադրանքների հետ:
Ածխաջրերի կառուցվածքը որոշելը դժվար է և պահանջում է մեթոդների համակցություն, ինչպիսիք են հեղուկ քրոմատոգրաֆիան (LC)11,12, միջուկային մագնիսական ռեզոնանսային սպեկտրոսկոպիան (NMR)13, մազանոթային էլեկտրաֆորեզը (CE)14,15,16 և զանգվածային սպեկտրոմետրիան (MS)17:, տասնութ.MS մեթոդները, ինչպիսիք են թռիչքի ժամանակի զանգվածային սպեկտրոմետրիան՝ լազերային կլանմամբ և իոնացմամբ, օգտագործելով մատրիցա (MALDI-TOF-MS), ածխաջրային կառուցվածքների նույնականացման բազմակողմանի մեթոդ է:Վերջերս նատրիումի իոնային հավելումների բախման հետևանքով առաջացած դիսոցիացիայի (CID) տանդեմ MS-ն առավել լայնորեն օգտագործվում է օլիգոսաքարիդների կցման դիրքերին, անոմերային կոնֆիգուրացիաներին, հաջորդականություններին և ճյուղավորման դիրքերին համապատասխանող մատնահետքերը բացահայտելու համար 20, 21:
Գլիկանի անալիզը հիանալի գործիք է ածխաջրային կապերի խորը նույնականացման համար22:Այս մեթոդը օգտագործում է մոնոկլոնալ հակամարմիններ (mAbs), որոնք ուղղված են բույսերի բջջային պատի գլիկանին՝ որպես զոնդ՝ հասկանալու բարդ ածխաջրային կապերը:Ամբողջ աշխարհում հասանելի է ավելի քան 250 մԱբ, որոնք նախատեսված են տարբեր գծային և ճյուղավորված օլիգոսաքարիդների դեմ՝ օգտագործելով տարբեր սախարիդներ24:Բույսերի բջջային պատի կառուցվածքը, կազմը և փոփոխությունները բնութագրելու համար լայնորեն օգտագործվել են մի քանի մԱԲ, քանի որ կան էական տարբերություններ՝ կախված բույսերի բջիջների տեսակից, օրգանից, տարիքից, զարգացման փուլից և աճի միջավայրից25,26:Վերջերս այս մեթոդը օգտագործվել է բույսերի և կենդանական համակարգերում վեզիկուլների պոպուլյացիաները հասկանալու և գլիկանի փոխադրման մեջ նրանց համապատասխան դերերը, որոնք որոշվում են ենթաբջջային մարկերներով, զարգացման փուլերով կամ շրջակա միջավայրի ազդակներով, և որոշելու ֆերմենտային ակտիվությունը:Գլիկանների և քսիլանների որոշ տարբեր կառուցվածքներ, որոնք հայտնաբերվել են, ներառում են պեկտինը (P), քսիլանը (X), մանանը (M), քսիլօղլուկանները (XylG), խառը կապի գլյուկանները (MLG), արաբինօքսիլան (ArbX), գալակտոմանանը (GalG), գլյուկուրոնաթթու-արաբինօքսիլան (GA.rbGA) և 9.rbgalactylan (GA.rbgalactylan):
Այնուամենայնիվ, չնայած այս բոլոր հետազոտական ​​ջանքերին, միայն մի քանի ուսումնասիրություններ են կենտրոնացել օլիգոսաքարիդների կուտակման բնույթի վրա բարձր պինդ նյութերի (HSL) հիդրոլիզի ժամանակ, ներառյալ օլիգոսաքարիդների արտազատումը, օլիգոմերային շղթայի երկարության փոփոխությունները հիդրոլիզի ընթացքում, տարբեր ցածր DP պոլիմերներ և դրանց կորեր:բաշխումներ 30,31,32.Միևնույն ժամանակ, թեև գլիկանի անալիզն ապացուցել է, որ օգտակար գործիք է գլիկանի կառուցվածքի համապարփակ վերլուծության համար, դժվար է գնահատել ջրում լուծվող ցածր DP օլիգոսաքարիդները՝ օգտագործելով հակամարմինների մեթոդները:5-10 կԴա-ից պակաս մոլեկուլային քաշ ունեցող ավելի փոքր DP օլիգոսաքարիդները չեն կապվում ELISA 33, 34 թիթեղներին և լվանում են մինչև հակամարմինների ավելացումը:
Այստեղ, առաջին անգամ, մենք ցուցադրում ենք ELISA վերլուծություն ավիդինով պատված թիթեղների վրա՝ օգտագործելով մոնոկլոնալ հակամարմիններ՝ համատեղելով լուծվող հրակայուն օլիգոսաքարիդների մեկ քայլով բիոտինիլացման ընթացակարգը գլիկոմի վերլուծության հետ:Գլիկոմի վերլուծության մեր մոտեցումը հաստատվել է MALDI-TOF-MS-ի և GC-MS-ի վրա հիմնված կոմպլեմենտար օլիգոսաքարիդային կապերի վերլուծությամբ՝ օգտագործելով հիդրոլիզացված շաքարի բաղադրությունների տրիմեթիլսիլիլային (TMS) դերիվատացումը:Այս նորարարական մոտեցումը կարող է ապագայում մշակվել որպես բարձր արդյունավետության մեթոդ և ավելի լայն կիրառություն գտնել կենսաբժշկական հետազոտություններում35:
Ֆերմենտների և հակամարմինների հետթարգմանական փոփոխությունները, ինչպիսին է գլիկոզիլացումը36, ազդում են դրանց կենսաբանական ակտիվության վրա:Օրինակ, շիճուկի սպիտակուցների գլիկոզիլացման փոփոխությունները կարևոր դեր են խաղում բորբոքային արթրիտի դեպքում, իսկ գլիկոզիլացման փոփոխություններն օգտագործվում են որպես ախտորոշիչ մարկերներ37:Գրականության մեջ հաղորդվել է, որ տարբեր գլիկաններ հեշտությամբ հայտնվում են մի շարք հիվանդությունների ժամանակ, ներառյալ ստամոքս-աղիքային տրակտի և լյարդի քրոնիկական բորբոքային հիվանդությունները, վիրուսային վարակները, ձվարանների, կրծքագեղձի և շագանակագեղձի քաղցկեղը38,39,40:Գլիկանների կառուցվածքի ըմբռնումը հակամարմինների վրա հիմնված գլիկանի ELISA մեթոդների միջոցով լրացուցիչ վստահություն կհաղորդի հիվանդության ախտորոշմանը՝ առանց MS բարդ մեթոդների օգտագործման:
Մեր նախորդ ուսումնասիրությունը ցույց է տվել, որ համառ օլիգոսաքարիդները մնացել են չհիդրոլիզացված նախնական մշակումից և ֆերմենտային հիդրոլիզից հետո (Նկար 1):Մեր նախկինում հրապարակված աշխատանքում մենք մշակել ենք ակտիվացված փայտածուխի պինդ փուլով արդյունահանման մեթոդ՝ օլիգոսաքարիդները AFEX-ով նախապես մշակված եգիպտացորենի ցորենի հիդրոլիզատից (ACSH) մեկուսացնելու համար:Նախնական արդյունահանումից և տարանջատումից հետո օլիգոսաքարիդները հետագայում մասնատվեցին չափի բացառման քրոմատոգրաֆիայի միջոցով (SEC) և հավաքվեցին մոլեկուլային քաշի կարգով:Շաքարի մոնոմերները և օլիգոմերները, որոնք ազատվել են տարբեր նախնական մշակումներից, վերլուծվել են շաքարի բաղադրության վերլուծությամբ:Տարբեր նախնական մշակման մեթոդներով ստացված շաքարի օլիգոմերների պարունակությունը համեմատելիս, համառ օլիգոսաքարիդների առկայությունը սովորական խնդիր է կենսազանգվածը մոնոսախարիդների փոխակերպման մեջ և կարող է հանգեցնել շաքարի եկամտաբերության նվազմանը առնվազն 10-15% և նույնիսկ մինչև 18%:ԱՄՆ.Այս մեթոդը օգտագործվում է օլիգոսաքարիդ ֆրակցիաների հետագա լայնածավալ արտադրության համար:Ստացված ACH-ը և նրա հետագա տարբեր մոլեկուլային կշիռներով ֆրակցիաները օգտագործվել են որպես փորձարարական նյութ այս աշխատանքում օլիգոսաքարիդների բնութագրման համար:
Նախնական մշակումից և ֆերմենտային հիդրոլիզից հետո կայուն օլիգոսաքարիդները մնացին չհիդրոլիզացված:Այստեղ (A)-ն օլիգոսաքարիդների տարանջատման մեթոդն է, որտեղ օլիգոսաքարիդները մեկուսացվում են AFEX-ով նախապես մշակված եգիպտացորենի հիդրոլիզատից (ACSH)՝ օգտագործելով ակտիվացված ածխածնի և դիատոմային հողի լցոնված շերտը.(Բ) Օլիգոսաքարիդների տարանջատման մեթոդ.Օլիգոսաքարիդները հետագայում առանձնացվել են չափի բացառման քրոմատոգրաֆիայով (SEC);(C) Սախարիդային մոնոմերներ և օլիգոմերներ, որոնք ազատվում են տարբեր նախնական մշակումներից (նոսրացված թթու՝ DA, իոնային հեղուկ՝ IL և AFEX):Ֆերմենտային հիդրոլիզի պայմաններ. պինդ նյութերի բարձր բեռնում 25% (ք/վ) (մոտավորապես 8% գլյուկանի բեռնում), 96 ժամ հիդրոլիզ, 20 մգ/գ առևտրային ֆերմենտային բեռնում (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 հարաբերակցություն) և (D) շաքարի մոնոմերներ և օլիգոարոնոզա-կորոնոզա, օլիգոարենոզա-քորոնոզա-էքսոմերներից ազատված: ավելի քան (ACS):
Գլիկանի վերլուծությունն ապացուցել է, որ օգտակար գործիք է պինդ կենսազանգվածի մնացորդներից մեկուսացված գլիկանների ամբողջական կառուցվածքային վերլուծության համար:Այնուամենայնիվ, ջրում լուծվող սախարիդները քիչ են ներկայացված այս ավանդական մեթոդի կիրառմամբ41, քանի որ ցածր մոլեկուլային քաշի օլիգոսաքարիդները դժվար է անշարժացնել ELISA թիթեղների վրա և լվանում են մինչև հակամարմինների ավելացումը:Հետևաբար, հակամարմինների կապակցման և բնութագրման համար օգտագործվել է բիոտինիլացման մեկ քայլ մեթոդ՝ ավիդինով պատված ELISA թիթեղների վրա լուծվող, չհամապատասխանող օլիգոսաքարիդները ծածկելու համար:Այս մեթոդը փորձարկվել է մեր նախկինում արտադրված ACSH-ի և նրա մոլեկուլային քաշի (կամ պոլիմերացման աստիճանի, DP) վրա հիմնված մասնաբաժնի միջոցով:Մեկ քայլ բիոտինիլացումն օգտագործվել է օլիգոսաքարիդների կապակցման մերձեցումը բարձրացնելու համար՝ ավելացնելով բիոտին-LC-հիդրազիդ ածխաջրերի վերականգնող ծայրին (նկ. 2):Լուծման մեջ հեմիացետալ խումբը վերականգնող վերջում փոխազդում է բիոտին-LC-հիդրազիդի հիդրազիդ խմբի հետ՝ ձևավորելով հիդրազոնային կապ:NaCNBH3 վերականգնող նյութի առկայության դեպքում հիդրազոնային կապը վերածվում է կայուն բիոտինիլացված վերջնական արտադրանքի:Շաքարավազը նվազեցնող վերջի փոփոխությամբ հնարավոր դարձավ ցածր DP օլիգոսաքարիդների միացումը ELISA թիթեղներին, և մեր ուսումնասիրության մեջ դա արվեց ավիդինով պատված թիթեղների վրա՝ օգտագործելով գլիկան թիրախավորված մԱԲ:
ELISA-ի հիման վրա մոնոկլոնալ հակամարմինների սկրինինգ բիոտինիլացված օլիգոսաքարիդների համար:Այստեղ (A) օլիգոսաքարիդների համակցված բիոտինիլացումը և հետագա ELISA ցուցադրումը գլիկանի թիրախավորված մԱԲ-ներով NeutrAvidin ծածկված թիթեղների վրա և (B) ցույց է տալիս ռեակցիայի արտադրանքի բիոտինիլացման մեկ քայլ ընթացակարգը:
Ավիդինով պատված թիթեղները օլիգոսաքարիդով կոնյուգացված հակամարմիններով ավելացվել են առաջնային և երկրորդային հակամարմիններին և լվացվել լույսի և ժամանակի նկատմամբ զգայուն միջավայրում:Հակամարմինների կապումն ավարտվելուց հետո ավելացրեք TMB սուբստրատ՝ ափսեը ինկուբացնելու համար:Արձագանքը վերջապես դադարեցվել է ծծմբաթթվով։Ինկուբացված թիթեղները վերլուծվել են ELISA ընթերցողի միջոցով՝ որոշելու յուրաքանչյուր հակամարմինի կապակցման ուժը՝ հակամարմիններին հատուկ խաչաձեւ կապը հայտնաբերելու համար:Փորձի մանրամասների և պարամետրերի համար տե՛ս «Նյութեր և մեթոդներ» համապատասխան բաժինը:
Մենք ցույց ենք տալիս այս նոր մշակված մեթոդի օգտակարությունը հատուկ կիրառությունների համար՝ բնութագրելով ACSH-ում առկա լուծվող օլիգոսաքարիդները, ինչպես նաև լիգնոցելյուլոզային հիդրոլիզատներից մեկուսացված հում և մաքրված օլիգոսաքարիդ ֆրակցիաներում:Ինչպես ցույց է տրված Նկար 3-ում, ACSH-ում հայտնաբերված էպիտոպով փոխարինված քսիլանները՝ օգտագործելով բիոացիլացված գլիկոմի վերլուծության մեթոդները, սովորաբար ուրոնիկ (U) կամ մեթիլուրոնիկ (MeU) և պեկտիկ արաբինոգալակտաններն են:Դրանց մեծ մասը հայտնաբերվել է նաև չհիդրոլիզացված պինդ նյութերի գլիկանների (UHS) վերլուծության վերաբերյալ մեր նախորդ ուսումնասիրության մեջ43:
Բջջային պատի գլիկանին ուղղված մոնոկլոնալ հակամարմինների հայտնաբերում, որոնք հակասում են օլիգոսաքարիդային էպիտոպներին:«Չեզոք» կոտորակը ACN մասն է, իսկ «թթվային» կոտորակը FA մասն է:Ջերմային քարտեզի վրա ավելի վառ կարմիրները ցույց են տալիս էպիտոպի ավելի բարձր պարունակություն, իսկ ավելի վառ կապույտները ցույց են տալիս դատարկ ֆոն:Գույնի արժեքները սանդղակի վրա հիմնված են հումքի OD արժեքների վրա N=2 ձևակերպումների համար:Հակամարմինների կողմից ճանաչված հիմնական էպիտոպները ցուցադրված են աջ կողմում:
Այս ոչ ցելյուլոզային կառուցվածքները չեն կարող ճեղքվել ամենատարածված ցելյուլազներով և հեմիցելուլազներով փորձարկված առևտրային ֆերմենտային խառնուրդում, որը ներառում է առավել հաճախ օգտագործվող առևտրային ֆերմենտները:Ուստի դրանց հիդրոլիզի համար անհրաժեշտ են նոր օժանդակ ֆերմենտներ։Առանց անհրաժեշտ ոչ ցելյուլոզային օժանդակ ֆերմենտների, այս ոչ ցելյուլոզային կապերը կանխում են ամբողջական փոխակերպումը մոնոսաքարիդների, նույնիսկ եթե դրանց հիմնական շաքարային պոլիմերները լայնորեն հիդրոլիզացվում են ավելի կարճ բեկորների և լուծարվում՝ օգտագործելով առևտրային ֆերմենտային խառնուրդներ:
Ազդանշանի բաշխման և դրա կապակցման ուժի հետագա ուսումնասիրությունը ցույց է տվել, որ կապող էպիտոպներն ավելի ցածր են բարձր DP շաքարի ֆրակցիաներում (A, B, C, DP մինչև 20+), քան ցածր DP ֆրակցիաներում (D, E, F, DP) դիմերներում) (նկ. 1):Թթվային բեկորները ավելի տարածված են ոչ ցելյուլոզային էպիտոպներում, քան չեզոք բեկորները:Այս երևույթները համահունչ են մեր նախորդ ուսումնասիրության օրինաչափությանը, որտեղ բարձր DP և թթվային մասերը ավելի դիմացկուն էին ֆերմենտային հիդրոլիզի նկատմամբ:Հետևաբար, ոչ ցելյուլոզային գլիկանի էպիտոպների և U և MeU փոխարինումների առկայությունը կարող է մեծապես նպաստել օլիգոսաքարիդների կայունությանը:Հարկ է նշել, որ կապի և հայտնաբերման արդյունավետությունը կարող է խնդրահարույց լինել ցածր DP օլիգոսաքարիդների համար, հատկապես, եթե էպիտոպը դիմերային կամ տրիմերային օլիգոսաքարիդ է:Սա կարող է փորձարկվել՝ օգտագործելով տարբեր երկարությունների առևտրային օլիգոսաքարիդներ, որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում է միայն մեկ էպիտոպ, որը կապվում է հատուկ մԱբ-ի հետ:
Այսպիսով, կառուցվածքին հատուկ հակամարմինների օգտագործումը բացահայտեց որոշակի տիպի հակազդող կապեր:Կախված օգտագործվող հակամարմինների տեսակից, կապակցման համապատասխան ձևից և դրա արտադրած ազդանշանի ուժից (առավել և ամենաքիչ առատ), նոր ֆերմենտներ կարող են հայտնաբերվել և կիսաքանակորեն ավելացվել ֆերմենտային խառնուրդին՝ ավելի ամբողջական գլիկոփոխակերպման համար:Որպես օրինակ վերցնելով ACSH օլիգոսաքարիդների վերլուծությունը՝ մենք կարող ենք ստեղծել գլիկանային կապերի տվյալների բազա յուրաքանչյուր կենսազանգվածի նյութի համար:Այստեղ պետք է նշել, որ պետք է հաշվի առնել հակամարմինների տարբեր մերձեցումը, և եթե դրանց մերձեցումն անհայտ է, ապա դա որոշակի դժվարություններ կստեղծի տարբեր հակամարմինների ազդանշանները համեմատելիս։Բացի այդ, գլիկանային կապերի համեմատությունը կարող է լավագույնս աշխատել նույն հակամարմինների նմուշների միջև:Այս համառ կապերը կարող են այնուհետև կապվել CAZyme տվյալների բազայի հետ, որտեղից մենք կարող ենք բացահայտել ֆերմենտները, ընտրել թեկնածու ֆերմենտները և փորձարկել կապը կոտրող ֆերմենտները կամ մշակել մանրէաբանական համակարգեր՝ արտահայտելու այդ ֆերմենտները՝ կենսազոհարարություններում օգտագործելու համար44:
Գնահատելու համար, թե ինչպես են իմունոլոգիական մեթոդները լրացնում լիգնոցելյուլոզային հիդրոլիզատներում առկա ցածր մոլեկուլային քաշով օլիգոսաքարիդների բնութագրման այլընտրանքային մեթոդները, մենք կատարեցինք MALDI (նկ. 4, S1-S8) և TMS-ից ստացված սախարիդների վերլուծություն, որոնք հիմնված են GC-MS-ի վրա, նույն վահանակի վրա (նկ. 5) օլիգոսաքարիդային մասում:MALDI-ն օգտագործվում է համեմատելու համար, թե արդյոք օլիգոսաքարիդների մոլեկուլների զանգվածային բաշխումը համապատասխանում է նախատեսված կառուցվածքին:Նկ.4-ը ցույց է տալիս ACN-A և ACN-B չեզոք բաղադրիչների MC-ն:ACN-A վերլուծությունը հաստատեց պենտոզային շաքարների մի շարք՝ DP 4-8 (նկ. 4) մինչև DP 22 (նկ. S1), որոնց կշիռները համապատասխանում են MeU-xylan օլիգոսաքարիդներին:ACN-B անալիզը հաստատեց պենտոզայի և գլյուկօքսիլանի շարքը DP 8-15-ով:Լրացուցիչ նյութում, ինչպիսին է Նկար S3-ը, FA-C թթվային մասի զանգվածի բաշխման քարտեզները ցույց են տալիս (Me)U փոխարինված պենտոզայի շաքարների մի շարք 8-15 DP-ով, որոնք համահունչ են ELISA-ի վրա հիմնված mAb զննման ժամանակ հայտնաբերված փոխարինված քսիլաններին:Էպիտոպները համահունչ են:
ACS-ում առկա լուծվող չհամապատասխանող օլիգոսաքարիդների MALDI-MS սպեկտրը:Այստեղ, (A) ACN-A ցածր քաշի տիրույթի ֆրակցիաներ, որոնք պարունակում են մեթիլացված ուրոնաթթու (DP 4-8) փոխարինված գլյուկուրոքսիլանի օլիգոսաքարիդներ և (B) ACN-B քսիլան և մեթիլացված ուրոնաթթվի օլիգոսաքարիդներ՝ փոխարինված գլյուկուրոքսիլանով (DP 8-15):
Հրակայուն օլիգոսաքարիդների գլիկանի մնացորդի բաղադրության վերլուծություն:Այստեղ (A) տարբեր օլիգոսաքարիդ ֆրակցիաների TMS սախարիդային բաղադրությունը, որը ստացվել է GC-MS վերլուծության միջոցով:(B) Օլիգոսաքարիդներում առկա TMS-ից ստացված տարբեր շաքարների կառուցվածքները:ACN – ացետոնիտրիլային ֆրակցիա, որը պարունակում է չեզոք օլիգոսաքարիդներ և FA – ֆերուլաթթու ֆրակցիա, որը պարունակում է թթու օլիգոսաքարիդներ:
Մեկ այլ հետաքրքիր եզրակացություն է արվել օլիգոսաքարիդ ֆրակցիայի LC-MS վերլուծությունից, ինչպես ցույց է տրված Նկար S9-ում (մեթոդները կարելի է տեսնել էլեկտրոնային լրացուցիչ նյութում):ACN-B ֆրակցիայի կապակցման ժամանակ բազմիցս դիտվել են hexose և -OAc խմբերի բեկորներ:Այս բացահայտումը ոչ միայն հաստատում է գլիկոմի և MALDI-TOF վերլուծության մեջ նկատված մասնատումը, այլև նոր տեղեկություններ է տալիս նախապես մշակված լիգնոցելյուլոզային կենսազանգվածում հնարավոր ածխաջրածին ածանցյալների մասին:
Մենք նաև վերլուծել ենք օլիգոսաքարիդ ֆրակցիայի շաքարային բաղադրությունը՝ օգտագործելով TMS շաքարի դերիվատացումը:Օգտագործելով GC-MS, մենք որոշեցինք նյարդային (ոչ ածանցյալ) և թթվային շաքարների (GluA և GalA) բաղադրությունը օլիգոսաքարիդային ֆրակցիայում (նկ. 5):Գլյուկուրոնաթթուն հայտնաբերված է թթվային C և D բաղադրիչներում, իսկ գալակտուրոնաթթուն՝ A և B թթվային բաղադրիչներում, որոնք երկուսն էլ թթվային շաքարների բարձր DP բաղադրիչներ են:Այս արդյունքները ոչ միայն հաստատում են մեր ELISA-ի և MALDI-ի տվյալները, այլ նաև համահունչ են օլիգոսաքարիդների կուտակման մեր նախորդ ուսումնասիրություններին:Հետևաբար, մենք կարծում ենք, որ ժամանակակից իմունոլոգիական մեթոդները, որոնք օգտագործում են օլիգոսաքարիդների բիոտինիլացումը և հետագա ELISA սքրինինգը, բավարար են տարբեր կենսաբանական նմուշներում լուծվող հակազդող օլիգոսաքարիդներ հայտնաբերելու համար:
Քանի որ ELISA-ի վրա հիմնված mAb սկրինինգի մեթոդները վավերացվել են մի քանի տարբեր մեթոդներով, մենք ցանկանում էինք հետագայում ուսումնասիրել այս նոր քանակական մեթոդի ներուժը:Երկու առևտրային օլիգոսաքարիդներ՝ քսիլոհեքսասախարիդ օլիգոսաքարիդը (XHE) և 23-α-L-արաբինոֆուրանոզիլ-քսիլոտրիոզը (A2XX), գնվել և փորձարկվել են բջջային պատի գլիկանին ուղղված նոր mAb մոտեցման միջոցով:Նկար 6-ը ցույց է տալիս գծային հարաբերակցությունը բիոտինիլացված կապող ազդանշանի և օլիգոսաքարիդների կոնցենտրացիայի լոգարիթմական կոնցենտրացիայի միջև՝ առաջարկելով Լանգմյուիրի կլանման հնարավոր մոդելը:ՄԱԲ-ներից CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 և CCRC-M151 փոխկապակցված են XHE-ի հետ, իսկ CCRC-M108, CCRC-M109 և LM11 փոխկապակցված են A2XX-ի հետ na00-ից մինչև 10 միջակայքում:Փորձի ընթացքում հակամարմինների սահմանափակ հասանելիության պատճառով սահմանափակ փորձեր են իրականացվել օլիգոսաքարիդների յուրաքանչյուր կոնցենտրացիայի հետ:Այստեղ պետք է նշել, որ որոշ հակամարմիններ շատ տարբեր կերպ են արձագանքում նույն օլիգոսաքարիդին՝ որպես սուբստրատի, հավանաբար այն պատճառով, որ դրանք կապվում են մի փոքր տարբեր էպիտոպների հետ և կարող են ունենալ շատ տարբեր կապող կապեր:Էպիտոպի ճշգրիտ նույնականացման մեխանիզմներն ու հետևանքները շատ ավելի բարդ կլինեն, երբ նոր mAb մոտեցումը կիրառվի իրական նմուշների վրա:
Երկու առևտրային օլիգոսաքարիդներ են օգտագործվել տարբեր գլիկան թիրախավորող մԱԲ-ների հայտնաբերման տիրույթը որոշելու համար:Այստեղ, օլիգոսաքարիդների կոնցենտրացիայի լոգարիթմական կոնցենտրացիայի հետ գծային հարաբերակցությունը ցույց է տալիս Լանգմյուիրի կլանման օրինաչափությունները (A) XHE-ի համար mAb-ով և (B) A2XX-ի հետ mAb-ով:Համապատասխան էպիտոպները ցույց են տալիս առևտրային օլիգոսաքարիդների կառուցվածքները, որոնք օգտագործվում են որպես հետազոտության մեջ որպես սուբստրատներ:
Գլիկանին ուղղված մոնոկլոնալ հակամարմինների օգտագործումը (գլիկոկոմիկ վերլուծություն կամ ELISA-ի վրա հիմնված mAb ցուցադրություն) հզոր գործիք է բույսերի կենսազանգվածը կազմող հիմնական բջջային պատի գլիկանների մեծ մասի խորը բնութագրման համար:Այնուամենայնիվ, դասական գլիկանի վերլուծությունը բնութագրում է միայն ավելի մեծ բջջային պատի գլիկանները, քանի որ օլիգոսաքարիդների մեծ մասը արդյունավետորեն անշարժացված չէ ELISA թիթեղների վրա:Այս ուսումնասիրության մեջ AFEX-ով նախապես մշակված եգիպտացորենի սնուցիչը ֆերմենտային հիդրոլիզացվել է պինդ նյութերի բարձր պարունակությամբ:Շաքարի անալիզը օգտագործվել է հիդրոլիզատի մեջ չհակասող բջջային պատի ածխաջրերի բաղադրությունը որոշելու համար:Այնուամենայնիվ, հիդրոլիզատներում ավելի փոքր օլիգոսաքարիդների mAb վերլուծությունը թերագնահատված է, և լրացուցիչ գործիքներ են անհրաժեշտ՝ ELISA թիթեղների վրա օլիգոսաքարիդներն արդյունավետորեն անշարժացնելու համար:
Մենք այստեղ զեկուցում ենք օլիգոսաքարիդների անշարժացման նոր և արդյունավետ մեթոդ մԱբ-ի ցուցադրման համար՝ համատեղելով օլիգոսաքարիդային բիոտինիլացումը, որին հաջորդում է ELISA ցուցադրումը NeutrAvidin™ ծածկված թիթեղների վրա:Անշարժացված բիոտինիլացված օլիգոսաքարիդները ցույց տվեցին բավարար մերձեցում հակամարմինների համար, որպեսզի հնարավոր դառնա արագ և արդյունավետ հայտնաբերել հակազդող օլիգոսաքարիդները:Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի վրա հիմնված այս համառ օլիգոսաքարիդների բաղադրության վերլուծությունը հաստատեց իմունոսկրինինգի այս նոր մոտեցման արդյունքները:Այսպիսով, այս ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ օլիգոսաքարիդների բիոտինիլացման և ELISA ցուցադրման համադրությունը գլիկան-ուղղված մոնոկլոնալ հակամարմինների հետ կարող է օգտագործվել օլիգոսաքարիդներում խաչաձև կապերը հայտնաբերելու համար և կարող է լայնորեն կիրառվել օլիգոսաքարիդների կառուցվածքը բնութագրող այլ կենսաքիմիական հետազոտություններում:
Բիոտինի վրա հիմնված գլիկանի պրոֆիլավորման այս մեթոդը առաջին զեկույցն է, որը կարող է ուսումնասիրել բույսերի կենսազանգվածում լուծվող օլիգոսաքարիդների անկայուն ածխաջրային կապերը:Սա օգնում է հասկանալ, թե ինչու են կենսազանգվածի որոշ մասեր այդքան համառ, երբ խոսքը վերաբերում է կենսավառելիքի արտադրությանը:Այս մեթոդը լրացնում է գլիկոմի վերլուծության մեթոդների կարևոր բացը և տարածում է դրա կիրառումը բույսերի օլիգոսաքարիդներից դուրս սուբստրատների ավելի լայն շրջանակի վրա:Ապագայում մենք կարող ենք օգտագործել ռոբոտաշինությունը բիոտինիլացման համար և օգտագործել այն մեթոդը, որը մենք մշակել ենք ELISA-ի միջոցով նմուշների բարձր թողունակության վերլուծության համար:
Եգիպտացորենի ծղոտը (CS) աճեցված Pioneer 33A14 հիբրիդային սերմերից հավաքվել է 2010 թվականին Կոլորադոյի Ռեյ քաղաքի Կրամեր ֆերմերից:Հողատիրոջ թույլտվությամբ այս կենսազանգվածը կարող է օգտագործվել հետազոտության համար։ Նմուշները պահվել են չոր < 6% խոնավության մեջ, փակվող պայուսակներում սենյակային ջերմաստիճանում: Նմուշները պահվել են չոր < 6% խոնավության մեջ, փակվող պայուսակներում սենյակային ջերմաստիճանում: Образцы храниль сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температура. Նմուշները պահվում էին չոր պայմաններում <6% խոնավության պայմաններում կայծակաճարմանդ տոպրակներում սենյակային ջերմաստիճանում:样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температура с влажностью < 6%. Նմուշները պահվում են կայծակաճարմանդ տոպրակներում՝ սենյակային ջերմաստիճանում, խոնավությամբ <6%:Ուսումնասիրությունը համապատասխանում էր տեղական և ազգային ուղեցույցներին:Կոմպոզիցիոն վերլուծությունը կատարվել է NREL արձանագրության միջոցով:Պարզվել է, որ կազմը պարունակում է 31,4% գլյուկան, 18,7% քսիլան, 3,3% արաբինան, 1,2% գալակտան, 2,2% ացետիլ, 14,3% լիգնին, 1,7% սպիտակուց և 13,4% մոխիր։
Cellic® CTec2 (138 մգ սպիտակուց/մլ, լոտ VCNI 0001) ցելյուլազայի, β-գլյուկոզիդազի և Cellic® HTec2 (157 մգ սպիտակուց/մլ, լոտ VHN00001) Novozymes-ից (Ֆրանկլինթոն, NC, ԱՄՆ) համալիր խառնուրդ է:Multifect Pectinase® (72 մգ սպիտակուց/մլ), պեկտին քայքայող ֆերմենտների բարդ խառնուրդ, նվիրաբերվել է DuPont Industrial Biosciences-ի կողմից (Palo Alto, CA, ԱՄՆ):Ֆերմենտային սպիտակուցի կոնցենտրացիաները որոշվել են սպիտակուցի պարունակությունը գնահատելով (և հանելով ոչ սպիտակուցային ազոտի ներդրումը)՝ օգտագործելով Kjeldahl-ի ազոտի վերլուծությունը (AOAC մեթոդ 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ԱՄՆ):Diatomaceous earth 545-ը գնվել է EMD Millipore-ից (Billerica, MA):Ակտիվացված ածխածինը (DARCO, 100 mesh հատիկներ), Avicel (PH-101), հաճարենու քսիլանը և բոլոր այլ քիմիական նյութերը գնվել են Sigma-Aldrich-ից (Սենթ Լուիս, ԱՄՆ):
AFEX-ի նախնական մշակումը կատարվել է GLBRC-ում (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, ԱՄՆ):Նախամշակումն իրականացվել է 140°C ջերմաստիճանում 15 րոպե:46 բնակության ժամանակը անջուր ամոնիակի և կենսազանգվածի 1:1 հարաբերակցությամբ 60% (ք/վ) բեռնումով չժանգոտվող պողպատից նստարանային խմբաքանակային ռեակտորում (Parr Instruments Company):Այն տեւեց 30 րոպե։Ռեակտորը հասցվեց մինչև 140°C, և ամոնիակն արագորեն ազատվեց, ինչը թույլ տվեց կենսազանգվածին արագ վերադառնալ սենյակային ջերմաստիճանի:AFEX-ի նախապես մշակված եգիպտացորենի եփուկի (ACS) բաղադրությունը նման էր չմշակված եգիպտացորենի եփուկի (UT-CS):
Բարձր պինդ ACSH 25% (w/w) (մոտ 8% դեքստրանի բեռնում) պատրաստվել է որպես օլիգոսաքարիդների լայնածավալ արտադրության մեկնարկային նյութ:ACS-ի ֆերմենտային հիդրոլիզն իրականացվել է կոմերցիոն ֆերմենտային խառնուրդի միջոցով, ներառյալ Cellic® Ctec2 10 մգ սպիտակուց/գ գլյուկան (նախապես մշակված կենսազանգվածում), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 մգ սպիտակուց/գ գլյուկան և Multifect Pectinase (Genencor Inc, ԱՄՆ):)), 5 մգ սպիտակուց/գ դեքստրան։Ֆերմենտային հիդրոլիզը կատարվել է 5 լիտրանոց բիոռեակտորում՝ 3 լիտր աշխատանքային ծավալով, pH 4,8, 50°C և 250 պտ/րոպե։96 ժամ հիդրոլիզից հետո հիդրոլիզատը հավաքվել է ցենտրիֆուգման միջոցով 6000 rpm 30 րոպե, իսկ հետո 14000 rpm 30 րոպե՝ չհիդրոլիզացված պինդ նյութերը հեռացնելու համար:Այնուհետև հիդրոլիզատը ենթարկվել է ստերիլ զտման 0,22 մմ ֆիլտրով բաժակի միջոցով:Զտված հիդրոլիզատը պահվում էր ստերիլ շշերի մեջ 4°C-ում և այնուհետև մասնատվում ածխածնի վրա:
Էքստրակտի վրա հիմնված կենսազանգվածի նմուշների բաղադրության վերլուծություն՝ համաձայն NREL լաբորատոր անալիզի ընթացակարգերի. բաղադրության վերլուծության համար նմուշների պատրաստում (NREL/TP-510-42620) և կենսազանգվածում կառուցվածքային ածխաջրերի և լիգնինի որոշում (NREL/TP-510 – 42618)47.
Հիդրոլիզատի հոսքի օլիգոսաքարիդային վերլուծությունը կատարվել է 2 մլ սանդղակով՝ օգտագործելով ավտոկլավի վրա հիմնված թթու հիդրոլիզի մեթոդը:Հիդրոլիզատի նմուշը խառնել 69,7 մկլ 72% ծծմբաթթվի հետ 10 մլ պտուտակային կափարիչով կուլտուրայի խողովակում և 1 ժամ ինկուբացնել նստարանին 121 °C ջերմաստիճանում, սառեցնել սառույցի վրա և զտել բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատագրման (HPLC) սրվակի մեջ:Օլիգոսաքարիդների կոնցենտրացիան որոշվել է չհիդրոլիզացված նմուշում մոնոսաքարիդների կոնցենտրացիան թթվային հիդրոլիզացված նմուշում շաքարի ընդհանուր կոնցենտրացիայից հանելով:
Գլյուկոզայի, քսիլոզայի և արաբինոզի կոնցենտրացիաները թթվային հիդրոլիզացված կենսազանգվածում վերլուծվել են Shimadzu HPLC համակարգի միջոցով, որը հագեցած է ավտոսամպլիչով, սյունակային տաքացուցիչով, իզոկրատական ​​պոմպով և բեկման ինդեքսով դետեկտորով Bio-Rad Aminex HPX-87H սյունակի վրա:Սյունակը պահվել է 50°C-ում և 0,6 մլ/րոպե 5 մՄ H2SO4 ջրով զտվել:հոսքը.
Հիդրոլիզատի վերին նյութը նոսրացվել և վերլուծվել է մոնոմերի և օլիգոսաքարիդների պարունակության համար:Ֆերմենտային հիդրոլիզից հետո ստացված մոնոմերային շաքարները վերլուծվել են HPLC-ով, որը հագեցած է Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P սյունակով և մոխրի պաշտպանիչ սյունակով:Սյունակի ջերմաստիճանը պահպանվել է 80°C-ում, ջուրն օգտագործվել է որպես շարժական փուլ՝ 0,6 մլ/րոպե հոսքի արագությամբ:Օլիգոսաքարիդները որոշվել են 121°C-ում նոսր թթվի մեջ հիդրոլիզով` համաձայն refs-ում նկարագրված մեթոդների:41, 48, 49։
Սախարիդների վերլուծությունը կատարվել է հում, AFEX-ով նախապես մշակված և բոլոր ոչ հիդրոլիզացված կենսազանգվածի մնացորդների վրա (ներառյալ սերիական բջջային պատի քաղվածքների արտադրությունը և դրանց մԱբ-ի ցուցադրումը)՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրված ընթացակարգերը 27, 43, 50, 51:Գլիկոմի վերլուծության համար բուսական բջիջների պատի նյութի սպիրտում չլուծվող մնացորդները պատրաստվում են կենսազանգվածի մնացորդներից և ենթարկվում սերիական արդյունահանման՝ գնալով ավելի ագրեսիվ ռեագենտներով, ինչպիսիք են ամոնիումի օքսալատը (50 մՄ), նատրիումի կարբոնատը (50 մՄ և 0,5% վ/վ), CON:(1M և 4M, երկուսն էլ 1% w/v նատրիումի բորոհիդրիդով) և թթու քլորիտով, ինչպես նախկինում նկարագրված է52,53:Այնուհետև քաղվածքները ենթարկվել են ELISA-ի՝ mAb50-ների բարդ վահանակի դեմ, որն ուղղված է դեպի բջջային պատի գլիկան, և mAb կապող ռեակցիաները ներկայացվել են որպես ջերմային քարտեզ:Բույսերի բջիջների պատերի գլիկանին ուղղված մԱԲ-ները ձեռք են բերվել լաբորատոր պաշարներից (CCRC, JIM և MAC շարքեր):
Օլիգոսաքարիդների մեկ փուլային բիոտինիլացում.Ածխաջրերի միացումը բիոտին-LC-հիդրազիդով կատարվել է հետևյալ ընթացակարգով.Բիոտին-LC-հիդրազիդը (4,6 մգ/12 մկմոլ) լուծարվել է դիմեթիլսուլֆօքսիդի մեջ (DMSO, 70 մկլ) ուժեղ խառնելով և 1 րոպե տաքացնելով 65°C-ում:Սառցադաշտային քացախաթթու (30 մկլ) ավելացվեց և խառնուրդը լցվեց նատրիումի ցիանոբորոհիդրիդի վրա (6,4 մգ/100 մկմոլ) և ամբողջությամբ լուծվեց 65°C-ում մոտ 1 րոպե տաքացնելուց հետո:Այնուհետև 5-ից 8 մկլ ռեակցիայի խառնուրդը ավելացվել է չորացրած օլիգոսաքարիդին (1-100 նմոլ), որպեսզի ստացվի պիտակի 10 անգամ կամ ավելի մոլային ավելցուկ նվազող ծայրի վրա:Ռեակցիան իրականացվել է 65°C ջերմաստիճանում 2 ժամ, որից հետո նմուշներն անմիջապես մաքրվել են:Նատրիումի ցիանոբորոհիդրիդ չի օգտագործվել պիտակավորման փորձերում՝ առանց կրճատման, և նմուշները արձագանքել են 65°C-ում 2,5 ժամ:
ELISA ծածկույթ և բիոտինիլացված օլիգոսաքարիդների նմուշների լվացում:Ավիդինով պատված ափսեի յուրաքանչյուր հորին ավելացվել է 25 մկլ բիոտինիլացված նմուշ (100 մկլ յուրաքանչյուր խտացված նմուշից նոսրացված 5 մլ 0,1 Մ տրիս բուֆերային լուծույթի (TBS) մեջ:Վերահսկիչ հորերը պատվել են 50 մկլ բիոտինով 10 մկգ/մլ կոնցենտրացիայով 0,1 M TBS-ում:Դիոնացված ջուրը օգտագործվել է որպես ծածկույթ դատարկ չափումների համար:Պլանշետը 2 ժամ ինկուբացվել է սենյակային ջերմաստիճանում մթության մեջ:Լվացեք ափսեը 3 անգամ 0,1% յուղազերծված կաթով 0,1 M TBS-ում՝ օգտագործելով No ծրագրի միջոցով:11 համար Գրենյե բնակարան 3A.
Առաջնային հակամարմինների ավելացում և լվացում.Յուրաքանչյուր հորին ավելացրեք 40 մկլ առաջնային հակամարմին:Միկրոափսեը 1 ժամ ինկուբացնում ենք մթության մեջ սենյակային ջերմաստիճանում:Այնուհետև ափսեները լվացվել են 3 անգամ 0,1% կաթով 0,1 M TBS-ում, օգտագործելով Grenier Flat 3A լվացման ծրագիրը #11:
Ավելացնել երկրորդական հակամարմին և լվանալ:Յուրաքանչյուր հորի մեջ ավելացրեք 50 մկլ մկնիկի/առնետի երկրորդական հակամարմին (նոսրացված 1:5000 0,1% կաթի մեջ 0,1 M TBS-ում):Միկրոափսեը 1 ժամ ինկուբացնում ենք մթության մեջ սենյակային ջերմաստիճանում:Այնուհետև միկրոափսեները լվացվեցին 5 անգամ 0,1% կաթով 0,1 M TBS-ում՝ օգտագործելով Grenier Flat 5A թիթեղների լվացման թիվ 12 ծրագիրը:
Սուբստրատի ավելացում:Բազային հիմքին ավելացրեք 50 մկլ 3,3',5,5'-տետրամեթիլբենզիդին (TMB) (ավելացնելով 2 կաթիլ բուֆեր, 3 կաթիլ TMB, 2 կաթիլ ջրածնի պերօքսիդ 15 ​​մլ դեիոնացված ջրին):Պատրաստեք TMB ենթաշերտը:և օգտագործելուց առաջ հորձանուտ):Միկրոափսեը 30 րոպե ինկուբացնել սենյակային ջերմաստիճանում:Մթության մեջ.
Ավարտեք քայլը և կարդացեք պլանշետը:Յուրաքանչյուր հորին ավելացրեք 50 մկլ 1 N ծծմբաթթու և գրանցեք ներծծումը 450-ից մինչև 655 նմ ELISA ընթերցողի միջոցով:
Դիոնացված ջրում պատրաստեք այս անալիտների 1 մգ/մլ լուծույթները՝ արաբինոզա, ռամնոզա, ֆուկոզա, քսիլոզա, գալակտուրոնաթթու (GalA), գլյուկուրոնաթթու (GlcA), մանոզ, գլյուկոզա, գալակտոզա, լակտոզա, N-ացետիլմաննոզամին (manNAc.(glcNAc), N-ացետիլգալակտոզամին (galNAc), ինոզիտոլ (ներքին ստանդարտ):Պատրաստվել են երկու ստանդարտներ՝ ավելացնելով 1 մգ/մլ շաքարի լուծույթները, որոնք ներկայացված են Աղյուսակ 1-ում: Նմուշները սառեցվում և լիոֆիլացվում են -80°C-ում մինչև ամբողջ ջուրը հեռացվի (սովորաբար մոտ 12-18 ժամ):
Անալիտիկ մնացորդի վրա պտուտակավոր գլխարկ խողովակներին ավելացրեք 100–500 մկգ նմուշ:Գրանցեք ավելացված գումարը:Լավագույնն այն է, որ նմուշը լուծարվի լուծիչի հատուկ կոնցենտրացիայի մեջ և այն ավելացվի խողովակի մեջ որպես հեղուկ մասնիկ:Օգտագործեք 20 մկլ 1 մգ/մլ ինոզիտոլ՝ որպես ներքին ստանդարտ յուրաքանչյուր նմուշի խողովակի համար:Նմուշին ավելացված ներքին ստանդարտի քանակը պետք է նույնը լինի ստանդարտ խողովակին ավելացված ներքին ստանդարտի քանակին:
Պտուտակային գլխարկով սրվակի մեջ ավելացրեք 8 մլ անջուր մեթանոլ:Այնուհետև 4 մլ 3 N. մեթանոլային HCl լուծույթ, ծածկված և թափահարված:Այս գործընթացում ջուր չի օգտագործվում:
Օլիգոսաքարիդների նմուշներին և ստանդարտ TMS խողովակներին ավելացրեք 500 մկլ 1 M HCl մեթանոլի լուծույթ:Նմուշները ինկուբացվել են գիշերում (168 ժամ) 80°C ջերմաստիճանում ջերմային բլոկում:Չորացնել մեթանոլիզի արտադրանքը սենյակային ջերմաստիճանում, օգտագործելով չորացման կոլեկտոր:Ավելացնել 200 մկլ MeOH և նորից չորացնել:Այս գործընթացը կրկնվում է երկու անգամ:Նմուշին ավելացրեք 200 մկլ մեթանոլ, 100 մկլ պիրիդին և 100 մկլ քացախային անհիդրիդ և լավ խառնեք:Նմուշները ինկուբացվել են սենյակային ջերմաստիճանում 30 րոպե:և չորացրած:Ավելացնել 200 մկլ մեթանոլ և նորից չորացնել:
Ավելացնել 200 մկլ Tri-Sil և 20 րոպե տաքացնել փակ խողովակը:80°C, այնուհետև սառչել մինչև սենյակային ջերմաստիճան:Օգտագործեք չորացման կոլեկտոր՝ նմուշը հետագայում չորացնելու համար մինչև մոտավորապես 50 մկլ ծավալը:Կարևոր է նշել, որ մենք թույլ չենք տվել, որ նմուշներն ամբողջությամբ չորանան:
Ավելացնել 2 մլ հեքսան և պտտեցնելով լավ խառնել։Լրացրեք Pasteur պիպետների ծայրերը (5-8 մմ) ապակե բուրդով, ապակե բուրդը ներդնելով 5-3/4 դյույմ տրամագծով պիպետտի վրա:Նմուշները ցենտրիֆուգվել են 3000 գ-ում 2 րոպե:Ցանկացած չլուծվող մնացորդները նստվածք են ստանում:Չորացնել նմուշը մինչև 100-150 մկլ:Մոտավորապես 1 μl ծավալը ներարկվել է GC-MS-ի մեջ 80 °C սկզբնական ջերմաստիճանում և 2,0 րոպե սկզբնական ժամանակում (Աղյուսակ 2):