Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে সীমিত CSS সমর্থন রয়েছে৷সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷ইতিমধ্যে, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করতে, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটিকে রেন্ডার করব।
নতুন ইমিউনোলজিকাল এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রিক পদ্ধতিগুলি AFEX এর সাথে প্রিট্রিটেড কর্ন স্টোভারে স্থায়ী অলিগোস্যাকারাইডের জটিল বিশ্লেষণের জন্য।লিগনোসেলুলোসিক বায়োমাস জীবাশ্ম জ্বালানির একটি টেকসই বিকল্প এবং খাদ্য, খাদ্য, জ্বালানি এবং রাসায়নিকের মতো পণ্য উৎপাদনের জন্য জৈবপ্রযুক্তি বিকাশে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়।এই প্রযুক্তিগুলির মূল চাবিকাঠি হল উদ্ভিদ কোষের দেয়ালে উপস্থিত জটিল কার্বোহাইড্রেটগুলিকে গ্লুকোজ, জাইলোজ এবং অ্যারাবিনোজের মতো সাধারণ শর্করাতে রূপান্তর করার জন্য ব্যয়-প্রতিযোগিতামূলক প্রক্রিয়াগুলির বিকাশ।যেহেতু লিগনোসেলুলোসিক জৈববস্তু খুবই একগুঁয়ে, এটিকে থার্মোকেমিক্যাল চিকিৎসা (যেমন, অ্যামোনিয়া ফাইবার এক্সফোলিয়েশন (AFEX), পাতলা অ্যাসিড (DA), আয়নিক তরল (IL)) এবং জৈবিক চিকিত্সা (যেমন, এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস এবং মাইক্রোবিয়াল ফার্মেন্টেশন) করতে হবে।.যাইহোক, যখন বাণিজ্যিক ছত্রাকের এনজাইমগুলি হাইড্রোলাইসিস প্রক্রিয়ায় ব্যবহার করা হয়, তখন গঠিত দ্রবণীয় শর্করার মাত্র 75-85% হল মনোস্যাকারাইড, এবং বাকি 15-25% হল দ্রবণীয়, নিরবচ্ছিন্ন অলিগোস্যাকারাইড, যা সবসময় অণুজীবের কাছে পাওয়া যায় না।পূর্বে, আমরা কার্বন এবং ডায়াটোমাসিয়াস আর্থ সেপারেশন এবং সাইজ এক্সক্লুশন ক্রোমাটোগ্রাফির সংমিশ্রণ ব্যবহার করে দ্রবণীয় একগুঁয়ে অলিগোস্যাকারাইডগুলিকে সফলভাবে বিচ্ছিন্ন এবং বিশুদ্ধ করেছি এবং তাদের এনজাইম প্রতিরোধক বৈশিষ্ট্যগুলিও তদন্ত করেছি।আমরা দেখেছি যে উচ্চ মাত্রার পলিমারাইজেশন (DP) মিথাইলেড ইউরোনিক অ্যাসিড প্রতিস্থাপন ধারণকারী অলিগোস্যাকারাইডগুলি কম ডিপি এবং নিরপেক্ষ অলিগোস্যাকারাইডের তুলনায় বাণিজ্যিক এনজাইম মিশ্রণের সাথে প্রক্রিয়া করা আরও কঠিন।এখানে আমরা উদ্ভিদ কোষের প্রাচীর এবং এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসেট, ম্যাট্রিক্স-সহায়তা লেজার ডিসোর্পশন আয়নাইজেশন, টাইম-অফ-ফ্লাইট ভর-স্পেকট্রোমেট্রিতে গ্লাইকান বন্ডগুলিকে চিহ্নিত করতে উদ্ভিদ জৈববস্তু গ্লাইকানগুলির জন্য নির্দিষ্ট মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (mAbs) ব্যবহার করে গ্লাইকান প্রোফাইলিং সহ বেশ কয়েকটি অতিরিক্ত পদ্ধতির ব্যবহারের প্রতিবেদন করি।.MALDI-TOF-MS) অলিগোস্যাকারাইড বন্ডগুলিকে ডেরিভেটাইজেশন সহ এবং ছাড়াই চিহ্নিত করতে নেতিবাচক আয়ন, গ্যাস ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি (GC-MS) এর গৌণ ক্ষয়ের পরে স্পেকট্রোস্কোপি দ্বারা প্রাপ্ত কাঠামো-তথ্যমূলক ডায়গনিস্টিক পিকগুলি ব্যবহার করে।অলিগোস্যাকারাইডের ছোট আকারের কারণে (DP 4-20), এই অণুগুলি mAb বাইন্ডিং এবং চরিত্রায়নের জন্য ব্যবহার করা কঠিন।এই সমস্যাটি কাটিয়ে ওঠার জন্য, আমরা একটি নতুন বায়োটিন কনজুগেশন-ভিত্তিক অলিগোস্যাকারাইড ইমোবিলাইজেশন পদ্ধতি প্রয়োগ করেছি যা মাইক্রোপ্লেট পৃষ্ঠে কম ডিপি দ্রবণীয় অলিগোস্যাকারাইডের সংখ্যাগরিষ্ঠকে সফলভাবে লেবেল করেছে, যা নির্দিষ্ট বন্ধন বিশ্লেষণের জন্য একটি উচ্চ থ্রুপুট এমএবি সিস্টেমে ব্যবহৃত হয়েছিল।এই নতুন পদ্ধতিটি ভবিষ্যতে আরও উন্নত উচ্চ থ্রুপুট গ্লাইকোম অ্যাসেসের বিকাশকে সহজতর করবে যা ডায়াগনস্টিক উদ্দেশ্যে বায়োমার্কারগুলিতে উপস্থিত অলিগোস্যাকারাইডগুলিকে বিচ্ছিন্ন করতে এবং চিহ্নিত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।
লিগনোসেলুলোসিক বায়োমাস, যা কৃষি, বনজ, ঘাস এবং কাঠের উপকরণ দিয়ে গঠিত, উচ্চ মূল্যের পণ্য উৎপাদনের জন্য খাদ্য, খাদ্য, জ্বালানি এবং রাসায়নিক অগ্রদূত সহ জৈব-ভিত্তিক পণ্য উৎপাদনের জন্য একটি সম্ভাব্য ফিডস্টক।উদ্ভিদ কোষের দেয়ালে উপস্থিত কার্বোহাইড্রেট (যেমন সেলুলোজ এবং হেমিসেলুলোজ) রাসায়নিক প্রক্রিয়াকরণ এবং বায়োট্রান্সফরমেশন (যেমন এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস এবং মাইক্রোবিয়াল ফার্মেন্টেশন) দ্বারা মনোস্যাকারাইডে ডিপোলিমারাইজ করা হয়।সাধারণ প্রাক-চিকিৎসাগুলির মধ্যে রয়েছে অ্যামোনিয়া ফাইবার এক্সপেনশন (AFEX), পাতলা অ্যাসিড (DA), আয়নিক তরল (IL), এবং বাষ্প বিস্ফোরণ (SE), যা উদ্ভিদ কোষের প্রাচীর খুলে লিগনোসেলুলোজ উৎপাদন কমাতে রাসায়নিক এবং তাপের সংমিশ্রণ ব্যবহার করে।পদার্থের একগুঁয়েতা, 5. বাণিজ্যিক সক্রিয় কার্বোহাইড্রেট-ধারণকারী এনজাইম (CAZymes) এবং জীবাণু-ভিত্তিক জ্বালানী এবং রাসায়নিক উত্পাদন করতে ট্রান্সজেনিক ইস্ট বা ব্যাকটেরিয়া ব্যবহার করে মাইক্রোবিয়াল গাঁজন ব্যবহার করে উচ্চ কঠিন পদার্থের লোডে এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস করা হয়।
বাণিজ্যিক এনজাইমের CAZymesগুলি এনজাইমের একটি জটিল মিশ্রণ দ্বারা গঠিত যা সমন্বিতভাবে জটিল কার্বোহাইড্রেট-চিনির বন্ধনকে মোনোস্যাকারাইডস 2,7 গঠনের জন্য বিচ্ছিন্ন করে।যেমনটি আমরা আগেই জানিয়েছি, কার্বোহাইড্রেট সহ লিগনিনের সুগন্ধযুক্ত পলিমারের জটিল নেটওয়ার্ক তাদের অত্যন্ত জটিল করে তোলে, যা অসম্পূর্ণ চিনির রূপান্তর ঘটায়, 15-25% যৌন অলিগোস্যাকারাইড জমা করে যা প্রিট্রিটেড বায়োমাসের এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিসের সময় উত্পাদিত হয় না।এটি বিভিন্ন বায়োমাস প্রিট্রিটমেন্ট পদ্ধতির একটি সাধারণ সমস্যা।এই বাধার কিছু কারণের মধ্যে রয়েছে হাইড্রোলাইসিসের সময় এনজাইম বাধা, বা উদ্ভিদ জৈববস্তুতে চিনির বন্ধন ভাঙার জন্য প্রয়োজনীয় প্রয়োজনীয় এনজাইমের অনুপস্থিতি বা নিম্ন স্তর।শর্করার গঠন এবং কাঠামোগত বৈশিষ্ট্যগুলি বোঝা, যেমন অলিগোস্যাকারাইডে চিনির বন্ধন, আমাদেরকে হাইড্রোলাইসিসের সময় চিনির রূপান্তর উন্নত করতে সাহায্য করবে, বায়োটেকনোলজিকাল প্রক্রিয়াগুলিকে পেট্রোলিয়াম থেকে প্রাপ্ত পণ্যগুলির সাথে খরচ-প্রতিযোগিতামূলক করে তুলবে৷
কার্বোহাইড্রেটের গঠন নির্ধারণ করা চ্যালেঞ্জিং এবং এর জন্য তরল ক্রোমাটোগ্রাফি (LC)11,12, নিউক্লিয়ার ম্যাগনেটিক রেজোন্যান্স স্পেকট্রোস্কোপি (NMR)13, কৈশিক ইলেক্ট্রোফোরেসিস (CE) 14,15,16 এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি (MS)17 এর মতো পদ্ধতির সমন্বয় প্রয়োজন।,আঠার.এমএস পদ্ধতি যেমন টাইম-অফ-ফ্লাইট ভর স্পেকট্রোমেট্রি সহ লেজার ডিসর্পশন এবং একটি ম্যাট্রিক্স ব্যবহার করে আয়নাইজেশন (মালডি-টফ-এমএস) কার্বোহাইড্রেট গঠন শনাক্ত করার জন্য একটি বহুমুখী পদ্ধতি।সম্প্রতি, অলিগোস্যাকারাইড সংযুক্তি অবস্থান, অ্যানোমেরিক কনফিগারেশন, সিকোয়েন্স এবং ব্রাঞ্চিং পজিশন 20, 21 এর সাথে সম্পর্কিত আঙ্গুলের ছাপ সনাক্ত করতে সোডিয়াম আয়ন অ্যাডাক্টের সংঘর্ষ-প্ররোচিত বিচ্ছিন্নতা (সিআইডি) ট্যান্ডেম এমএস সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত হয়েছে।
গ্লাইকান বিশ্লেষণ হল কার্বোহাইড্রেট বন্ড 22 এর গভীরতা সনাক্তকরণের জন্য একটি চমৎকার হাতিয়ার।এই পদ্ধতিটি জটিল কার্বোহাইড্রেট সংযোগগুলি বোঝার জন্য প্রোব হিসাবে কোষের প্রাচীর গ্লাইকান উদ্ভিদের জন্য নির্দেশিত মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (এমএবিএস) ব্যবহার করে।250 টিরও বেশি mAbs বিশ্বব্যাপী উপলব্ধ, বিভিন্ন স্যাকারাইড ব্যবহার করে বিভিন্ন রৈখিক এবং শাখাযুক্ত অলিগোস্যাকারাইডের বিপরীতে ডিজাইন করা হয়েছে।উদ্ভিদ কোষ প্রাচীরের গঠন, গঠন এবং পরিবর্তনগুলিকে চিহ্নিত করার জন্য বেশ কিছু mAbs ব্যাপকভাবে ব্যবহার করা হয়েছে, কারণ উদ্ভিদ কোষের ধরন, অঙ্গ, বয়স, বিকাশের পর্যায় এবং বৃদ্ধির পরিবেশের উপর নির্ভর করে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য রয়েছে 25,26।অতি সম্প্রতি, এই পদ্ধতিটি উদ্ভিদ ও প্রাণীর সিস্টেমে ভেসিকল জনসংখ্যা এবং গ্লাইকান পরিবহনে তাদের নিজ নিজ ভূমিকা বোঝার জন্য ব্যবহার করা হয়েছে যেমন সাবসেলুলার মার্কার, বিকাশের পর্যায়, বা পরিবেশগত উদ্দীপনা দ্বারা নির্ধারিত হয় এবং এনজাইমেটিক কার্যকলাপ নির্ধারণ করা হয়।গ্লাইকান এবং জাইলানগুলির বিভিন্ন কাঠামো যা শনাক্ত করা হয়েছে তার মধ্যে রয়েছে পেকটিন (পি), জাইলান (এক্স), মান্নান (এম), জাইলোগলুকানস (এক্সাইলজি), মিশ্র বন্ড গ্লুকানস (এমএলজি), অ্যারাবিনোক্সিলান (আরবিএক্স), গ্যালাক্টোম্যানান (গালজি), গ্লুকুরোনিক অ্যাসিড-অ্যারাবিনোক্সাইলান (জিএআরবিনোক্সাল্যান)।
যাইহোক, এই সমস্ত গবেষণা প্রচেষ্টা সত্ত্বেও, শুধুমাত্র কয়েকটি গবেষণায় হাই সলিড লোড (HSL) হাইড্রোলাইসিসের সময় অলিগোস্যাকারাইড জমা হওয়ার প্রকৃতির উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করা হয়েছে, যার মধ্যে অলিগোস্যাকারাইড রিলিজ, হাইড্রোলাইসিসের সময় অলিগোমেরিক চেইন দৈর্ঘ্যের পরিবর্তন, বিভিন্ন নিম্ন ডিপি পলিমার এবং তাদের বক্ররেখা রয়েছে।বিতরণ 30,31,32।এদিকে, যদিও গ্লাইকান বিশ্লেষণ গ্লাইকান গঠনের ব্যাপক বিশ্লেষণের জন্য একটি দরকারী টুল হিসাবে প্রমাণিত হয়েছে, তবে অ্যান্টিবডি পদ্ধতি ব্যবহার করে জলে দ্রবণীয় কম ডিপি অলিগোস্যাকারাইডের মূল্যায়ন করা কঠিন।5-10 kDa এর কম আণবিক ওজন সহ ছোট ডিপি অলিগোস্যাকারাইডগুলি ELISA প্লেট 33, 34 এর সাথে আবদ্ধ হয় না এবং অ্যান্টিবডি সংযোজনের আগে ধুয়ে যায়।
এখানে, প্রথমবারের মতো, আমরা গ্লাইকোম বিশ্লেষণের সাথে দ্রবণীয় অবাধ্য অলিগোস্যাকারাইডের জন্য এক-পদক্ষেপের বায়োটিনিলেশন পদ্ধতির সমন্বয়ে মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে অ্যাভিডিন-কোটেড প্লেটের উপর একটি ELISA পরীক্ষা প্রদর্শন করি।গ্লাইকম বিশ্লেষণের জন্য আমাদের দৃষ্টিভঙ্গি হাইড্রোলাইজড চিনির রচনাগুলির ট্রাইমেথাইলসিলিল (টিএমএস) ডেরাইভেটাইজেশন ব্যবহার করে পরিপূরক অলিগোস্যাকারাইড সংযোগগুলির MALDI-TOF-MS এবং GC-MS ভিত্তিক বিশ্লেষণ দ্বারা বৈধ করা হয়েছিল।এই উদ্ভাবনী পদ্ধতিটি ভবিষ্যতে একটি উচ্চ-থ্রুপুট পদ্ধতি হিসাবে বিকাশ করা যেতে পারে এবং বায়োমেডিকাল গবেষণায় বৃহত্তর প্রয়োগ খুঁজে পেতে পারে35।
এনজাইম এবং অ্যান্টিবডিগুলির অনুবাদ-পরবর্তী পরিবর্তন, যেমন গ্লাইকোসিলেশন, 36 তাদের জৈবিক কার্যকলাপকে প্রভাবিত করে।উদাহরণস্বরূপ, সিরাম প্রোটিনের গ্লাইকোসিলেশনের পরিবর্তনগুলি প্রদাহজনক আর্থ্রাইটিসে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে এবং গ্লাইকোসিলেশনের পরিবর্তনগুলি ডায়াগনস্টিক মার্কার হিসাবে ব্যবহৃত হয়37।গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল ট্র্যাক্ট এবং লিভারের দীর্ঘস্থায়ী প্রদাহজনিত রোগ, ভাইরাল সংক্রমণ, ডিম্বাশয়, স্তন এবং প্রোস্টেট ক্যান্সার 38,39,40 সহ বিভিন্ন রোগে বিভিন্ন গ্লাইকান সহজেই উপস্থিত হওয়ার জন্য সাহিত্যে রিপোর্ট করা হয়েছে।অ্যান্টিবডি-ভিত্তিক গ্লাইকান ELISA পদ্ধতি ব্যবহার করে গ্লাইক্যানের গঠন বোঝা জটিল এমএস পদ্ধতি ব্যবহার না করেই রোগ নির্ণয়ে অতিরিক্ত আস্থা প্রদান করবে।
আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে একগুঁয়ে অলিগোস্যাকারাইডগুলি প্রিট্রিটমেন্ট এবং এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস (চিত্র 1) এর পরে হাইড্রোলাইজড থেকে যায়।আমাদের পূর্বে প্রকাশিত কাজে, আমরা AFEX-প্রিট্রিটেড কর্ন স্টোভার হাইড্রোলাইজেট (ACSH)8 থেকে অলিগোস্যাকারাইডগুলিকে বিচ্ছিন্ন করার জন্য একটি সক্রিয় কাঠকয়লা সলিড-ফেজ নিষ্কাশন পদ্ধতি তৈরি করেছি।প্রাথমিক নিষ্কাশন এবং পৃথকীকরণের পরে, অলিগোস্যাকারাইডগুলি আকার বর্জন ক্রোমাটোগ্রাফি (এসইসি) দ্বারা আরও ভগ্নাংশ করা হয়েছিল এবং আণবিক ওজনের ক্রমে সংগ্রহ করা হয়েছিল।বিভিন্ন প্রিট্রিটমেন্ট থেকে মুক্তি পাওয়া সুগার মনোমার এবং অলিগোমারগুলি চিনির রচনা বিশ্লেষণ দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।বিভিন্ন প্রিট্রিটমেন্ট পদ্ধতি দ্বারা প্রাপ্ত চিনির অলিগোমারের বিষয়বস্তুর তুলনা করার সময়, একগুঁয়ে অলিগোস্যাকারাইডের উপস্থিতি বায়োমাসকে মনোস্যাকারাইডে রূপান্তরের ক্ষেত্রে একটি সাধারণ সমস্যা এবং চিনির ফলন কমপক্ষে 10-15% এবং এমনকি 18% পর্যন্ত হ্রাস করতে পারে।আমাদের.এই পদ্ধতিটি অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশের আরও বড় আকারের উৎপাদনের জন্য ব্যবহৃত হয়।ফলস্বরূপ ACH এবং বিভিন্ন আণবিক ওজন সহ এর পরবর্তী ভগ্নাংশগুলি এই কাজে অলিগোস্যাকারাইডগুলির বৈশিষ্ট্যের জন্য পরীক্ষামূলক উপাদান হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।
প্রিট্রিটমেন্ট এবং এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিসের পরে, অবিরাম অলিগোস্যাকারাইডগুলি হাইড্রোলাইসড থেকে যায়।এখানে (A) হল একটি অলিগোস্যাকারাইড বিচ্ছেদ পদ্ধতি যেখানে অ্যাক্টিভেটেড কার্বন এবং ডায়াটোমাসিয়াস আর্থের একটি প্যাকড বেড ব্যবহার করে AFEX-প্রিট্রিটেড কর্ন স্টোভার হাইড্রোলাইজেট (ACSH) থেকে অলিগোস্যাকারাইডগুলিকে আলাদা করা হয়;(খ) অলিগোস্যাকারাইড আলাদা করার পদ্ধতি।অলিগোস্যাকারাইডগুলিকে সাইজ এক্সক্লুশন ক্রোমাটোগ্রাফি (SEC) দ্বারা আরও আলাদা করা হয়েছিল;(C) স্যাকারাইড মনোমার এবং অলিগোমারগুলি বিভিন্ন প্রিট্রিটমেন্ট থেকে মুক্তি পায় (পাতলা অ্যাসিড: DA, আয়নিক তরল: IL এবং AFEX)।এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস শর্ত: 25% (w/w) উচ্চ কঠিন লোডিং (প্রায় 8% গ্লুকান লোডিং), 96 ঘন্টা হাইড্রোলাইসিস, 20 mg/g বাণিজ্যিক এনজাইম লোডিং (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 অনুপাত) এবং (D) এবং সুগার থেকে মুক্তি পাওয়া সুগার এবং জিকোম্যালকোসোম্যারোসিওম্যাল এনজাইম। EX প্রি-ট্রিটেড কর্ন স্টোভার (ACS)।
Glycan বিশ্লেষণ কঠিন জৈববস্তু অবশিষ্টাংশ থেকে বিচ্ছিন্ন নির্যাস মধ্যে glycans একটি ব্যাপক কাঠামোগত বিশ্লেষণের জন্য একটি দরকারী টুল হতে প্রমাণিত হয়েছে.যাইহোক, জলে দ্রবণীয় স্যাকারাইডগুলি এই ঐতিহ্যবাহী পদ্ধতি ব্যবহার করে উপস্থাপিত হয়41 কারণ কম আণবিক ওজনের অলিগোস্যাকারাইডগুলি ELISA প্লেটে স্থির করা কঠিন এবং অ্যান্টিবডি যোগ করার আগে ধুয়ে ফেলা হয়।অতএব, অ্যান্টিবডি বাইন্ডিং এবং চরিত্রায়নের জন্য, অ্যাভিডিন-প্রলিপ্ত ELISA প্লেটে দ্রবণীয়, অ-সঙ্গত অলিগোস্যাকারাইডগুলি আবরণ করার জন্য একটি এক-পদক্ষেপ বায়োটিনিলেশন পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়েছিল।এই পদ্ধতিটি আমাদের পূর্বে উত্পাদিত ACSH এবং এর আণবিক ওজন (বা পলিমারাইজেশন ডিগ্রী, ডিপি) এর উপর ভিত্তি করে একটি ভগ্নাংশ ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল।কার্বোহাইড্রেটের হ্রাসকারী প্রান্তে বায়োটিন-এলসি-হাইড্রাইজাইড যুক্ত করে অলিগোস্যাকারাইড বাইন্ডিং অ্যাফিনিটি বাড়ানোর জন্য এক-পদক্ষেপ বায়োটিনিলেশন ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র 2)।দ্রবণে, হ্রাসকারী প্রান্তে হেমিয়াসিটাল গ্রুপ বায়োটিন-এলসি-হাইড্রাজাইডের হাইড্রাজাইড গ্রুপের সাথে বিক্রিয়া করে একটি হাইড্রাজোন বন্ধন তৈরি করে।হ্রাসকারী এজেন্ট NaCNBH3 এর উপস্থিতিতে, হাইড্রাজোন বন্ড একটি স্থিতিশীল বায়োটিনিলেটেড শেষ পণ্যে হ্রাস পায়।চিনি হ্রাসকারী প্রান্তের পরিবর্তনের সাথে, কম ডিপি অলিগোস্যাকারাইডের ELISA প্লেটে বাঁধাই সম্ভব হয়েছিল এবং আমাদের গবেষণায় এটি গ্লাইকান-লক্ষ্যযুক্ত এমএবিএস ব্যবহার করে অ্যাভিডিন-কোটেড প্লেটে করা হয়েছিল।
বায়োটিনিলেটেড অলিগোস্যাকারাইডের জন্য ELISA ভিত্তিক মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডিগুলির স্ক্রীনিং।এখানে (A) অলিগোস্যাকারাইডের সম্মিলিত বায়োটিনিলেশন এবং পরবর্তী ELISA স্ক্রিনিং নিউট্রাভিডিন প্রলিপ্ত প্লেটে গ্লাইকান-লক্ষ্যযুক্ত এমএবিএসের সাথে এবং (বি) প্রতিক্রিয়া পণ্যগুলির বায়োটিনিলেশনের জন্য একটি এক-পদক্ষেপ পদ্ধতি দেখায়।
অলিগোস্যাকারাইড-কনজুগেটেড অ্যান্টিবডি সহ অ্যাভিডিন-কোটেড প্লেটগুলিকে তারপর প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক অ্যান্টিবডিগুলিতে যুক্ত করা হয়েছিল এবং হালকা এবং সময়-সংবেদনশীল মাধ্যমে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল।অ্যান্টিবডি বাইন্ডিং সম্পূর্ণ হওয়ার পরে, প্লেটটি ইনকিউবেট করতে TMB সাবস্ট্রেট যোগ করুন।সালফিউরিক অ্যাসিড দিয়ে শেষ পর্যন্ত প্রতিক্রিয়া বন্ধ করা হয়েছিল।অ্যান্টিবডি-নির্দিষ্ট ক্রস-লিঙ্কিং সনাক্ত করতে প্রতিটি অ্যান্টিবডির বাঁধাই শক্তি নির্ধারণ করতে একটি ELISA রিডার ব্যবহার করে ইনকিউবেটেড প্লেটগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।পরীক্ষার বিস্তারিত এবং পরামিতিগুলির জন্য, সংশ্লিষ্ট বিভাগ "উপাদান এবং পদ্ধতি" দেখুন।
আমরা ACSH-এ উপস্থিত দ্রবণীয় অলিগোস্যাকারাইডের পাশাপাশি লিগনোসেলুলোসিক হাইড্রোলাইসেট থেকে বিচ্ছিন্ন অশোধিত এবং বিশুদ্ধ অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশের বৈশিষ্ট্য দ্বারা নির্দিষ্ট অ্যাপ্লিকেশনের জন্য এই নতুন উন্নত পদ্ধতির উপযোগিতা প্রদর্শন করি।চিত্র 3-তে দেখানো হয়েছে, বায়োঅ্যাসিলেটেড গ্লাইকোম অ্যাস পদ্ধতি ব্যবহার করে ACSH-তে চিহ্নিত সবচেয়ে সাধারণ এপিটোপ-প্রতিস্থাপিত জাইলানগুলি সাধারণত ইউরোনিক (U) বা মেথিলুরোনিক (MeU) এবং পেকটিক অ্যারাবিনোগাল্যাকট্যান।নন-হাইড্রোলাইজড সলিডস (ইউএইচএস) 43 এর গ্লাইক্যানগুলির বিশ্লেষণে আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় তাদের বেশিরভাগই পাওয়া গেছে।
কোষ প্রাচীর গ্লাইক্যানে নির্দেশিত মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে রিকালসিট্রান্ট অলিগোস্যাকারাইড এপিটোপস সনাক্তকরণ।"নিরপেক্ষ" ভগ্নাংশ হল ACN ভগ্নাংশ এবং "অম্লীয়" ভগ্নাংশ হল FA ভগ্নাংশ।হিটম্যাপের উজ্জ্বল লালগুলি উচ্চতর এপিটোপ সামগ্রী নির্দেশ করে এবং উজ্জ্বল নীলগুলি একটি ফাঁকা পটভূমি নির্দেশ করে।স্কেলে রঙের মানগুলি N=2 সূত্রগুলির জন্য কাঁচা OD মানের উপর ভিত্তি করে।অ্যান্টিবডি দ্বারা স্বীকৃত প্রধান এপিটোপগুলি ডানদিকে দেখানো হয়েছে।
এই নন-সেলুলোজ কাঠামোগুলিকে পরীক্ষিত বাণিজ্যিক এনজাইম মিশ্রণে সবচেয়ে সাধারণ সেলুলাস এবং হেমিসেলুসেস দ্বারা ক্লিভ করা যায় না, যার মধ্যে সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত বাণিজ্যিক এনজাইম রয়েছে।অতএব, তাদের হাইড্রোলাইসিসের জন্য নতুন সহায়ক এনজাইম প্রয়োজন।প্রয়োজনীয় নন-সেলুলোজ আনুষঙ্গিক এনজাইম ব্যতীত, এই নন-সেলুলোজ বন্ধনগুলি মনোস্যাকারাইডে সম্পূর্ণ রূপান্তরকে বাধা দেয়, এমনকি যদি তাদের মূল চিনির পলিমারগুলিকে ছোট টুকরোগুলিতে ব্যাপকভাবে হাইড্রোলাইজ করা হয় এবং বাণিজ্যিক এনজাইম মিশ্রণ ব্যবহার করে দ্রবীভূত করা হয়।
সিগন্যাল বন্টন এবং এর বাঁধাই শক্তির আরও অধ্যয়ন দেখিয়েছে যে বাইন্ডিং এপিটোপগুলি উচ্চ ডিপি চিনির ভগ্নাংশে (A, B, C, DP 20+ পর্যন্ত) কম ডিপি ভগ্নাংশের (D, E, F, DP) ডাইমারগুলিতে কম ছিল) (চিত্র 1)।নিরপেক্ষ খণ্ডের তুলনায় নন-সেলুলোজ এপিটোপে অ্যাসিডের টুকরো বেশি দেখা যায়।এই ঘটনাগুলি আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় পর্যবেক্ষণ করা প্যাটার্নের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে উচ্চ ডিপি এবং অ্যাসিড ময়েটিগুলি এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিসের জন্য বেশি প্রতিরোধী ছিল।অতএব, নন-সেলুলোজ গ্লাইকান এপিটোপস এবং U এবং MeU প্রতিস্থাপনের উপস্থিতি অলিগোস্যাকারাইডগুলির স্থিতিশীলতায় ব্যাপকভাবে অবদান রাখতে পারে।এটি লক্ষ করা উচিত যে কম ডিপি অলিগোস্যাকারাইডের জন্য বাঁধাই এবং সনাক্তকরণ দক্ষতা সমস্যাযুক্ত হতে পারে, বিশেষত যদি এপিটোপটি একটি ডাইমেরিক বা ট্রাইমেরিক অলিগোস্যাকারাইড হয়।এটি বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের বাণিজ্যিক অলিগোস্যাকারাইড ব্যবহার করে পরীক্ষা করা যেতে পারে, প্রতিটিতে শুধুমাত্র একটি এপিটোপ থাকে যা একটি নির্দিষ্ট mAb এর সাথে আবদ্ধ থাকে।
এইভাবে, কাঠামো-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলির ব্যবহার নির্দিষ্ট ধরণের রিকালসিট্রান্ট বন্ড প্রকাশ করে।ব্যবহৃত অ্যান্টিবডির ধরন, উপযুক্ত বন্ধন প্যাটার্ন এবং এটি যে সংকেত উৎপন্ন করে তার উপর নির্ভর করে (সবচেয়ে বেশি এবং কম পরিমাণে) নতুন এনজাইমগুলি সনাক্ত করা যেতে পারে এবং আরও সম্পূর্ণ গ্লাইকোকনভারশনের জন্য এনজাইম মিশ্রণে আধা-পরিমাণগতভাবে যোগ করা যেতে পারে।একটি উদাহরণ হিসাবে ACSH oligosaccharides বিশ্লেষণ গ্রহণ করে, আমরা প্রতিটি জৈববস্তু উপাদানের জন্য গ্লাইকান বন্ডের একটি ডাটাবেস তৈরি করতে পারি।এখানে উল্লেখ করা উচিত যে অ্যান্টিবডিগুলির বিভিন্ন সখ্যতা বিবেচনায় নেওয়া উচিত এবং যদি তাদের সখ্যতা অজানা থাকে তবে এটি বিভিন্ন অ্যান্টিবডিগুলির সংকেতগুলির তুলনা করার সময় নির্দিষ্ট অসুবিধা তৈরি করবে।উপরন্তু, একই অ্যান্টিবডির নমুনার মধ্যে গ্লাইকান বন্ডের তুলনা সবচেয়ে ভালো কাজ করতে পারে।এই একগুঁয়ে বন্ডগুলি তখন CAZyme ডাটাবেসের সাথে সংযুক্ত করা যেতে পারে, যেখান থেকে আমরা এনজাইমগুলি সনাক্ত করতে পারি, প্রার্থীর এনজাইম নির্বাচন করতে পারি এবং বন্ড-ব্রেকিং এনজাইমগুলির জন্য পরীক্ষা করতে পারি, বা বায়োরিফাইনারিতে ব্যবহারের জন্য এই এনজাইমগুলি প্রকাশ করার জন্য মাইক্রোবায়াল সিস্টেম বিকাশ করতে পারি।
লিগনোসেলুলোসিক হাইড্রোলাইসেটে উপস্থিত কম আণবিক ওজনের অলিগোস্যাকারাইডের বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের জন্য কীভাবে ইমিউনোলজিকাল পদ্ধতিগুলি বিকল্প পদ্ধতির পরিপূরক তা মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা একই প্যানেলে GC-MS-এর উপর ভিত্তি করে MALDI (চিত্র 4, S1-S8) এবং TMS-প্রাপ্ত স্যাকারাইডগুলির বিশ্লেষণ করেছি।অলিগোস্যাকারাইড অণুর ভর বণ্টন কাঙ্ক্ষিত কাঠামোর সাথে মেলে কিনা তা তুলনা করতে MALDI ব্যবহার করা হয়।ডুমুর উপর.4 ACN-A এবং ACN-B নিরপেক্ষ উপাদানগুলির MC দেখায়।ACN-A বিশ্লেষণ DP 4–8 (চিত্র 4) থেকে DP 22 (চিত্র S1) পর্যন্ত পেন্টোজ শর্করার একটি পরিসীমা নিশ্চিত করেছে, যার ওজন MeU-xylan oligosaccharides-এর সাথে মিলে যায়।ACN-B বিশ্লেষণ ডিপি 8-15 সহ পেন্টোজ এবং গ্লুকোক্সিলান সিরিজ নিশ্চিত করেছে।পরিপূরক উপাদানে যেমন চিত্র S3, FA-C অ্যাসিডিক আংশিক ভর বন্টন মানচিত্রগুলি 8-15 ডিপি সহ (Me)U প্রতিস্থাপিত পেন্টোজ শর্করা দেখায় যা ELISA-ভিত্তিক mAb স্ক্রীনিংয়ে পাওয়া প্রতিস্থাপিত জাইলানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।এপিটোপগুলি সামঞ্জস্যপূর্ণ।
ACS-এ উপস্থিত দ্রবণীয় নন-কমপ্লায়েন্ট অলিগোস্যাকারাইডের MALDI-MS বর্ণালী।এখানে, (A) ACN-A কম ওজনের সীমার ভগ্নাংশ যাতে মিথাইলেড ইউরোনিক অ্যাসিড (DP 4-8) প্রতিস্থাপিত গ্লুকুরক্সিলান অলিগোস্যাকারাইড এবং (B) ACN-B xylan এবং মিথাইলেড ইউরোনিক অ্যাসিড অলিগোস্যাকারাইডগুলি গ্লুকুরক্সিলান (DP 8-15) এর সাথে প্রতিস্থাপিত হয়।
অবাধ্য অলিগোস্যাকারাইডের গ্লাইকান অবশিষ্টাংশের গঠন বিশ্লেষণ।এখানে (A) জিসি-এমএস বিশ্লেষণ ব্যবহার করে প্রাপ্ত বিভিন্ন অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশের টিএমএস স্যাকারাইড রচনা।(B) অলিগোস্যাকারাইডে উপস্থিত বিভিন্ন TMS-প্রাপ্ত শর্করার গঠন।ACN - নিরপেক্ষ অলিগোস্যাকারাইড ধারণকারী অ্যাসিটোনিট্রিল ভগ্নাংশ এবং এফএ - অ্যাসিড অলিগোস্যাকারাইড ধারণকারী ফেরুলিক অ্যাসিড ভগ্নাংশ।
অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশের LC-MS বিশ্লেষণ থেকে আরেকটি আকর্ষণীয় উপসংহার টানা হয়েছিল, যেমন চিত্র S9 এ দেখানো হয়েছে (পদ্ধতিগুলি বৈদ্যুতিন পরিপূরক উপাদানগুলিতে দেখা যেতে পারে)।ACN-B ভগ্নাংশের বন্ধন চলাকালীন হেক্সোজ এবং -OAc গোষ্ঠীর টুকরোগুলি বারবার পরিলক্ষিত হয়েছিল।এই অনুসন্ধানটি শুধুমাত্র গ্লাইকোম এবং মালডি-টফ বিশ্লেষণে পরিলক্ষিত বিভক্তকরণকে নিশ্চিত করে না, তবে প্রিট্রিটেড লিগনোসেলুলোসিক বায়োমাসে সম্ভাব্য কার্বোহাইড্রেট ডেরাইভেটিভস সম্পর্কে নতুন তথ্যও সরবরাহ করে।
আমরা টিএমএস চিনির ডেরিভেটাইজেশন ব্যবহার করে অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশের চিনির গঠনও বিশ্লেষণ করেছি।GC-MS ব্যবহার করে, আমরা অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশে নিউরাল (নন-ডেরিভেটিভ) এবং অ্যাসিডিক শর্করা (GluA এবং GalA) এর গঠন নির্ধারণ করেছি (চিত্র 5)।গ্লুকুরোনিক অ্যাসিড অ্যাসিডিক উপাদান C এবং D-তে পাওয়া যায়, যখন গ্যালাকচুরোনিক অ্যাসিড অ্যাসিডিক উপাদান A এবং B-তে পাওয়া যায়, উভয়ই অ্যাসিডিক শর্করার উচ্চ ডিপি উপাদান।এই ফলাফলগুলি শুধুমাত্র আমাদের ELISA এবং MALDI ডেটা নিশ্চিত করে না, তবে অলিগোস্যাকারাইড জমার আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।অতএব, আমরা বিশ্বাস করি যে অলিগোস্যাকারাইডের বায়োটিনিলেশন এবং পরবর্তী ELISA স্ক্রীনিং ব্যবহার করে আধুনিক ইমিউনোলজিকাল পদ্ধতিগুলি বিভিন্ন জৈবিক নমুনায় দ্রবণীয় রিক্যালসিট্রান্ট অলিগোস্যাকারাইড সনাক্ত করার জন্য যথেষ্ট।
যেহেতু ELISA-ভিত্তিক mAb স্ক্রীনিং পদ্ধতিগুলি বিভিন্ন পদ্ধতি দ্বারা বৈধ করা হয়েছে, তাই আমরা এই নতুন পরিমাণগত পদ্ধতির সম্ভাব্যতা আরও অন্বেষণ করতে চেয়েছিলাম।দুটি বাণিজ্যিক অলিগোস্যাকারাইড, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) এবং 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), কোষ প্রাচীর গ্লাইকানকে লক্ষ্য করে একটি নতুন এমএবি পদ্ধতি ব্যবহার করে কেনা এবং পরীক্ষা করা হয়েছিল।চিত্র 6 বায়োটিনিলেটেড বাঁধাই সংকেত এবং অলিগোস্যাকারাইড ঘনত্বের লগ ঘনত্বের মধ্যে একটি রৈখিক সম্পর্ক দেখায়, সম্ভাব্য ল্যাংমুইর শোষণ মডেলের পরামর্শ দেয়।mAbs-এর মধ্যে, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, এবং CCRC-M151 XHE এর সাথে সম্পর্কযুক্ত, এবং CCRC-M108, CCRC-M109, এবং LM11 A2XX-এর সাথে 1 থেকে 1 মিলিমিটার পর্যন্ত সম্পর্কযুক্ত।পরীক্ষার সময় অ্যান্টিবডিগুলির সীমিত প্রাপ্যতার কারণে, প্রতিটি অলিগোস্যাকারাইড ঘনত্বের সাথে সীমিত পরীক্ষা করা হয়েছিল।এখানে উল্লেখ করা উচিত যে কিছু অ্যান্টিবডি একই অলিগোস্যাকারাইডের সাথে সাবস্ট্রেট হিসাবে খুব ভিন্নভাবে প্রতিক্রিয়া দেখায়, সম্ভবত কারণ তারা সামান্য ভিন্ন এপিটোপে আবদ্ধ হয় এবং খুব আলাদা আবদ্ধতা থাকতে পারে।সঠিক এপিটোপ সনাক্তকরণের প্রক্রিয়া এবং প্রভাবগুলি আরও জটিল হবে যখন নতুন এমএবি পদ্ধতি বাস্তব নমুনায় প্রয়োগ করা হয়।
দুটি বাণিজ্যিক অলিগোস্যাকারাইড বিভিন্ন গ্লাইকান-টার্গেটিং এমএবিএসের সনাক্তকরণ পরিসীমা নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।এখানে, অলিগোস্যাকারাইড ঘনত্বের লগ ঘনত্বের সাথে রৈখিক পারস্পরিক সম্পর্ক (A) mAb-এর সাথে XHE এবং mAb-এর সাথে A2XX-এর জন্য ল্যাংমুইর শোষণের ধরণ নির্দেশ করে।সংশ্লিষ্ট এপিটোপগুলি পরীক্ষায় সাবস্ট্রেট হিসাবে ব্যবহৃত বাণিজ্যিক অলিগোস্যাকারাইডগুলির কাঠামো নির্দেশ করে।
গ্লাইকান-টার্গেটেড মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডিগুলির ব্যবহার (গ্লাইকোকমিক বিশ্লেষণ বা ELISA-ভিত্তিক mAb স্ক্রীনিং) উদ্ভিদের জৈববস্তু তৈরি করে এমন বেশিরভাগ প্রধান কোষ প্রাচীর গ্লাইক্যানগুলির গভীরতার বৈশিষ্ট্যের জন্য একটি শক্তিশালী হাতিয়ার।যাইহোক, ক্লাসিক্যাল গ্লাইকান বিশ্লেষণ শুধুমাত্র বৃহত্তর কোষ প্রাচীরের গ্লাইকানকে চিহ্নিত করে, কারণ বেশিরভাগ অলিগোস্যাকারাইড ELISA প্লেটে দক্ষতার সাথে স্থির থাকে না।এই সমীক্ষায়, AFEX-প্রিট্রিটেড কর্ন স্টোভারকে এনজাইম্যাটিকভাবে হাইড্রোলাইজ করা হয়েছিল একটি উচ্চ কঠিন উপাদানে।হাইড্রোলাইজেটে রিকালসিট্রান্ট সেল প্রাচীর কার্বোহাইড্রেটের সংমিশ্রণ নির্ধারণ করতে চিনির বিশ্লেষণ ব্যবহার করা হয়েছিল।যাইহোক, হাইড্রোলাইসেটগুলিতে ছোট অলিগোস্যাকারাইডগুলির এমএবি বিশ্লেষণকে অবমূল্যায়ন করা হয় এবং ELISA প্লেটে অলিগোস্যাকারাইডগুলিকে কার্যকরভাবে স্থির করার জন্য অতিরিক্ত সরঞ্জামের প্রয়োজন হয়।
আমরা এখানে অলিগোস্যাকারাইড বায়োটিনিলেশনের সমন্বয়ে এমএবি স্ক্রীনিংয়ের জন্য একটি অভিনব এবং দক্ষ অলিগোস্যাকারাইড ইমোবিলাইজেশন পদ্ধতির রিপোর্ট করছি যার পরে নিউট্রাভিডিন ™ প্রলিপ্ত প্লেটে ELISA স্ক্রীনিং করা হয়েছে।অবিচলিত বায়োটিনিলেটেড অলিগোস্যাকারাইডগুলি অ্যান্টিবডির জন্য পর্যাপ্ত সখ্যতা দেখিয়েছে যাতে দ্রুত এবং দক্ষ অলিগোস্যাকারাইডগুলি দ্রুত সনাক্ত করা যায়।ভর স্পেকট্রোমেট্রির উপর ভিত্তি করে এই একগুঁয়ে অলিগোস্যাকারাইডগুলির রচনার বিশ্লেষণ ইমিউনোস্ক্রিনিংয়ের এই নতুন পদ্ধতির ফলাফল নিশ্চিত করেছে।এইভাবে, এই গবেষণাগুলি দেখায় যে অলিগোস্যাকারাইড বায়োটিনিলেশন এবং গ্লাইকান-লক্ষ্যযুক্ত মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডিগুলির সাথে ELISA স্ক্রীনিংয়ের সংমিশ্রণটি অলিগোস্যাকারাইডগুলিতে ক্রসলিঙ্কগুলি সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে এবং অলিগোস্যাকারাইডের গঠন বৈশিষ্ট্যযুক্ত অন্যান্য জৈব রাসায়নিক গবেষণায় ব্যাপকভাবে প্রয়োগ করা যেতে পারে।
এই বায়োটিন-ভিত্তিক গ্লাইকান প্রোফাইলিং পদ্ধতিটি উদ্ভিদ জৈববস্তুতে দ্রবণীয় অলিগোস্যাকারাইডের রিকালসিট্রান্ট কার্বোহাইড্রেট বন্ডগুলি তদন্ত করতে সক্ষম প্রথম প্রতিবেদন।এটি বুঝতে সাহায্য করে কেন বায়োমাসের কিছু অংশ জৈব জ্বালানী উৎপাদনের ক্ষেত্রে এত একগুঁয়ে।এই পদ্ধতিটি গ্লাইকম বিশ্লেষণ পদ্ধতির একটি গুরুত্বপূর্ণ শূন্যতা পূরণ করে এবং উদ্ভিদ অলিগোস্যাকারাইডের বাইরে বিস্তৃত স্তরে এর প্রয়োগকে প্রসারিত করে।ভবিষ্যতে, আমরা বায়োটিনিলেশনের জন্য রোবোটিক্স ব্যবহার করতে পারি এবং ELISA ব্যবহার করে নমুনাগুলির উচ্চ-থ্রুপুট বিশ্লেষণের জন্য যে পদ্ধতি তৈরি করেছি তা ব্যবহার করতে পারি।
পাইওনিয়ার 33A14 হাইব্রিড বীজ থেকে উৎপন্ন কর্ন স্ট্র (CS) 2010 সালে রে, কলোরাডোর ক্র্যামার ফার্ম থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল।জমির মালিকের অনুমতি নিয়ে এই বায়োমাস গবেষণার জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে। নমুনাগুলি ঘরের তাপমাত্রায় জিপ-লক ব্যাগে শুষ্ক <6% আর্দ্রতা সংরক্ষণ করা হয়েছিল। নমুনাগুলি ঘরের তাপমাত্রায় জিপ-লক ব্যাগে শুষ্ক <6% আর্দ্রতা সংরক্ষণ করা হয়েছিল। Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. নমুনাগুলি ঘরের তাপমাত্রায় জিপারযুক্ত ব্যাগে <6% আর্দ্রতায় শুকনো সংরক্ষণ করা হয়েছিল।样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%। নমুনাগুলি জিপার ব্যাগে আর্দ্রতা <6% সহ ঘরের তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়।গবেষণাটি স্থানীয় এবং জাতীয় নির্দেশিকা মেনে চলে।রচনাগত বিশ্লেষণ NREL প্রোটোকল ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।রচনাটিতে 31.4% গ্লুকান, 18.7% জাইলান, 3.3% অ্যারাবিনান, 1.2% গ্যালাকটান, 2.2% এসিটাইল, 14.3% লিগনিন, 1.7% প্রোটিন এবং 13. 4% অ্যাশ পাওয়া গেছে।
Cellic® CTec2 (138 mg প্রোটিন/ml, lot VCNI 0001) হল নোভোজাইমস (ফ্রাঙ্কলিন্টন, এনসি, ইউএসএ) থেকে সেলুলাস, β-গ্লুকোসিডেস এবং সেলিক® HTec2 (157 mg প্রোটিন/ml, lot VHN00001) এর একটি জটিল মিশ্রণ।মাল্টিফেক্ট পেকটিনেজ® (72 মিলিগ্রাম প্রোটিন/এমএল), পেকটিন ডিগ্রেডিং এনজাইমের একটি জটিল মিশ্রণ, ডুপন্ট ইন্ডাস্ট্রিয়াল বায়োসায়েন্সেস (পালো অল্টো, সিএ, ইউএসএ) দ্বারা দান করা হয়েছিল।Kjeldahl নাইট্রোজেন বিশ্লেষণ (AOAC পদ্ধতি 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) ব্যবহার করে প্রোটিন সামগ্রী অনুমান করে (এবং নন-প্রোটিন নাইট্রোজেনের অবদান বিয়োগ) দ্বারা এনজাইম প্রোটিন ঘনত্ব নির্ধারণ করা হয়েছিল।ডায়াটোমাসিয়াস আর্থ 545 ইএমডি মিলিপুর (বিলেরিকা, এমএ) থেকে কেনা হয়েছিল।অ্যাক্টিভেটেড কার্বন (DARCO, 100 মেশ গ্রানুলস), Avicel (PH-101), beech xylan এবং অন্যান্য সব রাসায়নিক সিগমা-অলড্রিচ (সেন্ট লুইস, MO) থেকে কেনা হয়েছিল।
AFEX pretreatment GLBRC (বায়োমাস কনভার্সন রিসার্চ ল্যাবরেটরি, MSU, Lansing, MI, USA) এ সঞ্চালিত হয়েছিল।প্রাক-চিকিত্সা 140 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 15 মিনিটের জন্য করা হয়েছিল।একটি স্টেইনলেস স্টীল বেঞ্চটপ ব্যাচ রিঅ্যাক্টরে (Parr Instruments Company) 60% (w/w) লোডিং এ অ্যানহাইড্রাস অ্যামোনিয়া এবং বায়োমাসের অনুপাত 1:1 অনুপাতে 46 বাসস্থানের সময়।এটি 30 মিনিট সময় নিয়েছে।চুল্লিটিকে 140 ডিগ্রি সেলসিয়াসে নিয়ে আসা হয়েছিল এবং অ্যামোনিয়া দ্রুত নিঃসৃত হয়েছিল, যার ফলে বায়োমাস দ্রুত ঘরের তাপমাত্রায় ফিরে আসতে পারে।AFEX প্রি-ট্রিটেড কর্ন স্টোভার (ACS) এর সংমিশ্রণটি অপরিশোধিত কর্ন স্টোভার (UT-CS) এর মতোই ছিল।
উচ্চ কঠিন পদার্থ ACSH 25% (w/w) (প্রায় 8% ডেক্সট্রান লোডিং) অলিগোস্যাকারাইডের বড় আকারের উত্পাদনের জন্য একটি প্রাথমিক উপাদান হিসাবে প্রস্তুত করা হয়েছিল।ACS-এর এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস Cellic® Ctec2 10 মিলিগ্রাম প্রোটিন/জি গ্লুকান (প্রিট্রিটেড বায়োমাসে), Htec2 (নোভোজাইমস, ফ্র্যাঙ্কলিন্টন, এনসি), 5 মিলিগ্রাম প্রোটিন/জি গ্লুকান, এবং মাল্টিফেক্ট পেকটিনেজ (জেনকোর ইনক, ইউএসএ) সহ একটি বাণিজ্যিক এনজাইম মিশ্রণ ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।)), 5 মিলিগ্রাম প্রোটিন/জি ডেক্সট্রান।এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস একটি 5-লিটার বায়োরিয়্যাক্টরে 3 লিটার, pH 4.8, 50°C এবং 250 rpm এর কাজের ভলিউম সহ বাহিত হয়েছিল।96 ঘন্টা ধরে হাইড্রোলাইসিস করার পর, হাইড্রোলাইজেটকে 6000 rpm-এ 30 মিনিটের জন্য এবং তারপর 14000 rpm-এ 30 মিনিটের জন্য আনহাইড্রোলাইজড কঠিন পদার্থ অপসারণের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল।হাইড্রোলাইজেট তখন 0.22 মিমি ফিল্টার বীকারের মাধ্যমে জীবাণুমুক্ত পরিস্রাবণের শিকার হয়।ফিল্টার করা হাইড্রোলাইজেটকে জীবাণুমুক্ত বোতলে 4°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয় এবং তারপরে কার্বনে ভগ্নাংশ করা হয়।
এনআরইএল পরীক্ষাগার বিশ্লেষণ পদ্ধতি অনুসারে নির্যাস-ভিত্তিক বায়োমাস নমুনার রচনার বিশ্লেষণ: রচনা বিশ্লেষণের জন্য নমুনা তৈরি করা (NREL/TP-510-42620) এবং বায়োমাসে কাঠামোগত কার্বোহাইড্রেট এবং লিগনিন নির্ধারণ (NREL/TP-510) – 4718।
অটোক্লেভ-ভিত্তিক অ্যাসিড হাইড্রোলাইসিস পদ্ধতি ব্যবহার করে 2 মিলি স্কেলে হাইড্রোলাইজেট প্রবাহের অলিগোস্যাকারাইড বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।একটি 10 ​​মিলি স্ক্রু ক্যাপ কালচার টিউবে 69.7 μl 72% সালফিউরিক অ্যাসিডের সাথে হাইড্রোলাইজেট নমুনা মেশান এবং 121 ডিগ্রি সেলসিয়াসে বেঞ্চটপে 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করুন, বরফের উপর ঠাণ্ডা করুন এবং একটি উচ্চ কার্যকারিতা লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি (HPLC) শিশিতে ফিল্টার করুন।অ্যাসিড-হাইড্রোলাইজড নমুনায় মোট চিনির ঘনত্ব থেকে নন-হাইড্রোলাইজড নমুনায় মনোস্যাকারাইডের ঘনত্ব বিয়োগ করে অলিগোস্যাকারাইডের ঘনত্ব নির্ধারণ করা হয়েছিল।
অ্যাসিড হাইড্রোলাইজড বায়োমাসে গ্লুকোজ, জাইলোজ এবং অ্যারাবিনোজের ঘনত্ব একটি বায়ো-র্যাড অ্যামিনেক্স HPX-87H কলামে একটি অটোস্যাম্পলার, কলাম হিটার, আইসোক্র্যাটিক পাম্প এবং প্রতিসরাঙ্ক সূচক আবিষ্কারক দিয়ে সজ্জিত একটি শিমাদজু এইচপিএলসি সিস্টেম ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।কলামটি 50°C এ রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং জলে 0.6 মিলি/মিনিট 5 মিমি H2SO4 দিয়ে নির্গত করা হয়েছিল।প্রবাহ
হাইড্রোলাইজেট সুপারনাট্যান্টকে পাতলা করা হয়েছিল এবং মনোমার এবং অলিগোস্যাকারাইড সামগ্রীর জন্য বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিসের পরে প্রাপ্ত মনোমেরিক শর্করাগুলি একটি বায়ো-র্যাড (হারকিউলিস, CA) অ্যামিনেক্স HPX-87P কলাম এবং একটি ছাই গার্ড কলাম দিয়ে সজ্জিত HPLC দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।কলামের তাপমাত্রা 80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল, জল 0.6 মিলি/মিনিট প্রবাহের হার সহ মোবাইল ফেজ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।রেফসে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে 121 ডিগ্রি সেলসিয়াসে পাতলা অ্যাসিডে হাইড্রোলাইসিস দ্বারা অলিগোস্যাকারাইডগুলি নির্ধারণ করা হয়েছিল।৪১, ৪৮, ৪৯।
স্যাকারাইড বিশ্লেষণ পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি 27, 43, 50, 51 ব্যবহার করে কাঁচা, AFEX প্রাক-চিকিত্সা করা এবং সমস্ত নন-হাইড্রোলাইজড বায়োমাস অবশিষ্টাংশ (ক্রমিক কোষ প্রাচীরের নির্যাস এবং তাদের এমএবি স্ক্রীনিং সহ) সঞ্চালিত হয়েছিল।গ্লাইকম বিশ্লেষণের জন্য, উদ্ভিদ কোষের প্রাচীরের উপাদানের অ্যালকোহল-অদ্রবণীয় অবশিষ্টাংশগুলি জৈববস্তুর অবশিষ্টাংশ থেকে প্রস্তুত করা হয় এবং ক্রমবর্ধমান আক্রমণাত্মক বিকারক যেমন অ্যামোনিয়াম অক্সালেট (50 মিমি), সোডিয়াম কার্বনেট (50 মিমি এবং 0.5% w/v), CON সহ ক্রমবর্ধমান নিষ্কাশনের শিকার হয়।(1M এবং 4M, উভয়ই 1% w/v সোডিয়াম বোরোহাইড্রাইড সহ) এবং পূর্বে বর্ণিত হিসাবে এসিড ক্লোরিট ৫২,৫৩।নির্যাসগুলি তখন কোষ প্রাচীর গ্লাইক্যানের দিকে নির্দেশিত mAb50s-এর একটি জটিল প্যানেলের বিরুদ্ধে ELISA-এর অধীন ছিল এবং mAb বাইন্ডিং প্রতিক্রিয়াগুলিকে তাপ মানচিত্র হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছিল।উদ্ভিদ কোষ প্রাচীর গ্লাইকান লক্ষ্য করে mAbs পরীক্ষাগার স্টক (CCRC, JIM এবং MAC সিরিজ) থেকে কেনা হয়েছিল।
অলিগোস্যাকারাইডের এক-ধাপে বায়োটিনিলেশন।বায়োটিন-এলসি-হাইড্রাইজাইডের সাথে কার্বোহাইড্রেটের সংমিশ্রণ নিম্নলিখিত পদ্ধতি ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ডাইমিথাইল সালফক্সাইড (DMSO, 70 μl) মধ্যে দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং 1 মিনিটের জন্য 65 ° সে. তাপমাত্রায় প্রবল নাড়াচাড়া করে এবং গরম করে।গ্লাসিয়াল অ্যাসিটিক অ্যাসিড (30 μl) যোগ করা হয়েছিল এবং মিশ্রণটি সোডিয়াম সায়ানোবোরোহাইড্রাইড (6.4 mg/100 μmol) এর উপর ঢেলে দেওয়া হয়েছিল এবং প্রায় 1 মিনিটের জন্য 65 ডিগ্রি সেলসিয়াসে গরম করার পরে সম্পূর্ণরূপে দ্রবীভূত করা হয়েছিল।তারপরে, 5 থেকে 8 μl প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি শুকনো অলিগোস্যাকারাইডে (1-100 nmol) যোগ করা হয়েছিল যাতে হ্রাসকারী প্রান্তে লেবেলের 10-গুণ বা তার বেশি মোলার অতিরিক্ত পাওয়া যায়।প্রতিক্রিয়াটি 2 ঘন্টার জন্য 65 ডিগ্রি সেলসিয়াসে করা হয়েছিল, তারপরে নমুনাগুলি অবিলম্বে শুদ্ধ করা হয়েছিল।কোন সোডিয়াম সায়ানোবোরোহাইড্রাইড লেবেলিং পরীক্ষায় হ্রাস ছাড়াই ব্যবহার করা হয়নি, এবং নমুনাগুলি 2.5 ঘন্টার জন্য 65 ° C এ প্রতিক্রিয়া করা হয়েছিল।
ELISA আবরণ এবং বায়োটিনিলেটেড অলিগোস্যাকারাইডের নমুনা ধোয়া।25 μl বায়োটিনিলেটেড নমুনা (প্রতিটি ঘনীভূত নমুনার 100 μl 0.1 এম ট্রিস বাফার দ্রবণ (টিবিএস) এর 5 মিলি মিশ্রিত) অ্যাভিডিন-কোটেড প্লেটের প্রতিটি কূপে যোগ করা হয়েছিল।নিয়ন্ত্রণ কূপগুলি 0.1 M TBS-এ 10 μg/ml ঘনত্বে 50 μl বায়োটিন দিয়ে প্রলিপ্ত ছিল।ডিওনাইজড জল ফাঁকা পরিমাপের জন্য আবরণ হিসাবে ব্যবহৃত হত।ট্যাবলেটটি অন্ধকারে ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টা ধরে রাখা হয়েছিল।প্রোগ্রাম নং ব্যবহার করে ০.১% স্কিমড মিল্ক দিয়ে ০.১ এম টিবিএসে ৩ বার প্লেট ধুয়ে ফেলুন।গ্রেনিয়ার ফ্ল্যাট 3A এর জন্য 11।
প্রাথমিক অ্যান্টিবডি সংযোজন এবং ধোয়া।প্রতিটি কূপে 40 μl প্রাথমিক অ্যান্টিবডি যোগ করুন।অন্ধকারে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টা মাইক্রোপ্লেটটি সেঁকুন।গ্রেনিয়ার ফ্ল্যাট 3A-এর জন্য ওয়াশ প্রোগ্রাম #11 ব্যবহার করে 0.1M টিবিএস-এ 0.1% দুধ দিয়ে প্লেটগুলি 3 বার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল।
সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যোগ করুন এবং ধুয়ে ফেলুন।প্রতিটি কূপে 50 µl মাউস/ইঁদুর সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (0.1% দুধে 1:5000 মিশ্রিত 0.1 M TBS) যোগ করুন।অন্ধকারে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টা মাইক্রোপ্লেটটি সেঁকুন।গ্রেনিয়ার ফ্ল্যাট 5A প্লেট ওয়াশ প্রোগ্রাম #12 ব্যবহার করে মাইক্রোপ্লেটগুলিকে 0.1 M TBS-এ 0.1% দুধ দিয়ে 5 বার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল।
একটি সাবস্ট্রেট যোগ করা হচ্ছে।বেস সাবস্ট্রেটে 50 μl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) যোগ করুন (2 ফোঁটা বাফার, 3 ফোঁটা TMB, 2 ফোঁটা হাইড্রোজেন পারক্সাইড 15 মিলি ডিওনাইজড জলে যোগ করে)।টিএমবি সাবস্ট্রেট প্রস্তুত করুন।এবং ব্যবহারের আগে ঘূর্ণি)।30 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় মাইক্রোপ্লেটটি সেঁকুন।অন্ধকারে.
ধাপটি সম্পূর্ণ করুন এবং ট্যাবলেটটি পড়ুন।প্রতিটি কূপে 50 μl 1 N সালফিউরিক অ্যাসিড যোগ করুন এবং একটি ELISA রিডার ব্যবহার করে 450 থেকে 655 nm পর্যন্ত শোষণ রেকর্ড করুন।
ডিওনাইজড জলে এই বিশ্লেষকগুলির 1 মিলিগ্রাম/মিলি দ্রবণ প্রস্তুত করুন: অ্যারাবিনোজ, র্যামনোজ, ফুকোজ, জাইলোজ, গ্যালাকটুরোনিক অ্যাসিড (GalA), গ্লুকুরোনিক অ্যাসিড (GlcA), ম্যাননোস, গ্লুকোজ, গ্যালাকটোজ, ল্যাকটোজ, এন-এসিটিলম্যানোসামাইন (ম্যানটিএনএএলসি-এনএসি),(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), ইনোসিটল (অভ্যন্তরীণ মান)।সারণী 1-এ দেখানো 1 মিলিগ্রাম/মিলি চিনির সমাধান যোগ করে দুটি মান প্রস্তুত করা হয়েছিল। সমস্ত জল সরানো না হওয়া পর্যন্ত নমুনাগুলি হিমায়িত করা হয় এবং -80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে লাইওফিলাইজ করা হয় (সাধারণত প্রায় 12-18 ঘন্টা)।
বিশ্লেষণাত্মক ভারসাম্যে ক্যাপ টিউব স্ক্রু করতে 100-500 µg নমুনা যোগ করুন।যোগ করা পরিমাণ রেকর্ড করুন।দ্রাবকের একটি নির্দিষ্ট ঘনত্বে নমুনাটি দ্রবীভূত করা এবং তরল অ্যালিকোট হিসাবে টিউবে যুক্ত করা ভাল।প্রতিটি নমুনা টিউবের জন্য একটি অভ্যন্তরীণ মান হিসাবে 1 mg/ml ইনোসিটলের 20 μl ব্যবহার করুন।নমুনায় যোগ করা অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ডের পরিমাণ অবশ্যই স্ট্যান্ডার্ড টিউবে যোগ করা অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ডের পরিমাণের সমান হতে হবে।
একটি স্ক্রু ক্যাপ শিশিতে 8 মিলি অ্যানহাইড্রাস মিথানল যোগ করুন।তারপর 3 এন মিথানোলিক এইচসিএল দ্রবণের 4 মিলি, ক্যাপ এবং ঝাঁকান।এই প্রক্রিয়া জল ব্যবহার করে না।
অলিগোস্যাকারাইডের নমুনা এবং স্ট্যান্ডার্ড TMS টিউবে 500 μl 1 M HCl মিথানল দ্রবণ যোগ করুন।একটি থার্মাল ব্লকে নমুনাগুলি রাতারাতি (168 ঘন্টা) 80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউব করা হয়েছিল।মেথানোলাইসিস পণ্যটি ঘরের তাপমাত্রায় শুকানোর বহুগুণ ব্যবহার করে শুকিয়ে নিন।200 μl MeOH যোগ করুন এবং আবার শুকিয়ে নিন।এই প্রক্রিয়া দুইবার পুনরাবৃত্তি হয়।নমুনায় 200 µl মিথানল, 100 µl পাইরিডিন এবং 100 µl অ্যাসিটিক অ্যানহাইড্রাইড যোগ করুন এবং ভালভাবে মেশান।নমুনাগুলি 30 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল।এবং শুকনো।200 μl মিথানল যোগ করুন এবং আবার শুকিয়ে নিন।
200 μl ট্রাই-সিল যোগ করুন এবং 20 মিনিটের জন্য ক্যাপড টিউব গরম করুন।80 ডিগ্রি সেলসিয়াস, তারপর ঘরের তাপমাত্রায় ঠান্ডা করা হয়।নমুনাটিকে প্রায় 50 μl ভলিউমে শুকানোর জন্য একটি শুকানোর বহুগুণ ব্যবহার করুন।এটি লক্ষ করা গুরুত্বপূর্ণ যে আমরা নমুনাগুলিকে সম্পূর্ণরূপে শুকানোর অনুমতি দিইনি।
2 মিলি হেক্সেন যোগ করুন এবং ঘূর্ণি দ্বারা ভালভাবে মিশ্রিত করুন।5-3/4 ইঞ্চি ব্যাসের পাইপেটের উপরে কাচের উল ঢুকিয়ে পাস্তুর পাইপেটের টিপস (5-8 মিমি) কাচের উলের টুকরো দিয়ে পূরণ করুন।নমুনাগুলি 2 মিনিটের জন্য 3000 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল।কোন অদ্রবণীয় অবশিষ্টাংশ precipitated হয়.নমুনাটি 100-150 μl পর্যন্ত শুকিয়ে নিন।আনুমানিক 1 μl এর একটি ভলিউম GC-MS-এ 80 °C এর প্রাথমিক তাপমাত্রা এবং 2.0 মিনিটের প্রাথমিক সময়ে (সারণী 2) ইনজেকশন করা হয়েছিল।