Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Nove imunološke in masne spektrometrične metode za kompleksno analizo obstojnih oligosaharidov v koruznem štedilniku, predhodno obdelanem z AFEX.Lignocelulozna biomasa je trajnostna alternativa fosilnim gorivom in se široko uporablja za razvoj biotehnologij za proizvodnjo izdelkov, kot so hrana, krma, goriva in kemikalije.Ključ do teh tehnologij je razvoj stroškovno konkurenčnih procesov za pretvorbo kompleksnih ogljikovih hidratov, prisotnih v celičnih stenah rastlin, v enostavne sladkorje, kot so glukoza, ksiloza in arabinoza.Ker je lignocelulozna biomasa zelo trdovratna, jo je treba v kombinaciji termokemičnih obdelav (npr. luščenje amoniakovih vlaken (AFEX), razredčenih kislin (DA), ionskih tekočin (IL)) in bioloških obdelav (npr. encimska hidroliza in mikrobna fermentacija) kombinirati, da dobimo želeni produkt..Kadar pa se v procesu hidrolize uporabljajo komercialni glivni encimi, je samo 75-85 % nastalih topnih sladkorjev monosaharidov, preostalih 15-25 % pa so topni, težko razpoložljivi oligosaharidi, ki niso vedno na voljo mikroorganizmom.Prej smo uspešno izolirali in očistili topne trdovratne oligosaharide z uporabo kombinacije ločevanja ogljika in diatomejske zemlje ter kromatografije z izločitvijo velikosti ter raziskali tudi njihove lastnosti zaviranja encimov.Ugotovili smo, da je oligosaharide, ki vsebujejo nadomestke metilirane uronske kisline z višjo stopnjo polimerizacije (DP), težje predelati s komercialnimi encimskimi mešanicami kot nizke DP in nevtralne oligosaharide.Tukaj poročamo o uporabi več dodatnih metod, vključno s profiliranjem glikana z uporabo monoklonskih protiteles (mAbs), specifičnih za glikane rastlinske biomase, za karakterizacijo glikanskih vezi v celičnih stenah rastlin in encimskih hidrolizatih, lasersko desorpcijsko ionizacijo s pomočjo matrice, masno spektrometrijo s časom leta..MALDI-TOF-MS) uporablja strukturno informativne diagnostične vrhove, pridobljene s spektroskopijo po sekundarnem razpadu negativnih ionov, plinsko kromatografijo in masno spektrometrijo (GC-MS) za karakterizacijo oligosaharidnih vezi z in brez derivatizacije.Zaradi majhne velikosti oligosaharidov (DP 4–20) je te molekule težko uporabiti za vezavo in karakterizacijo mAb.Da bi rešili to težavo, smo uporabili novo metodo imobilizacije oligosaharidov, ki temelji na konjugaciji z biotinom, ki je uspešno označila večino oligosaharidov, topnih z nizko vsebnostjo DP, na površini mikroplošče, ki je bila nato uporabljena v visoko zmogljivem sistemu mAb za specifično ligacijsko analizo.Ta nova metoda bo v prihodnosti olajšala razvoj naprednejših visoko zmogljivih testov glikoma, ki jih bo mogoče uporabiti za izolacijo in karakterizacijo oligosaharidov, prisotnih v biomarkerjih, za diagnostične namene.
Lignocelulozna biomasa, sestavljena iz kmetijskih, gozdarskih, travnih in lesnih materialov, je potencialna surovina za proizvodnjo proizvodov na biološki osnovi, vključno s hrano, krmo, gorivom in kemičnimi predhodnimi sestavinami za proizvodnjo izdelkov višje vrednosti1.Ogljikovi hidrati (kot sta celuloza in hemiceluloza), prisotni v celičnih stenah rastlin, se depolimerizirajo v monosaharide s kemično obdelavo in biotransformacijo (kot sta encimska hidroliza in mikrobna fermentacija).Običajne predobdelave vključujejo ekspanzijo amoniakovih vlaken (AFEX), razredčeno kislino (DA), ionsko tekočino (IL) in parno eksplozijo (SE), ki uporabljajo kombinacijo kemikalij in toplote za zmanjšanje proizvodnje lignoceluloze z odpiranjem celičnih sten rastlin3,4.trdovratnost snovi, 5. Encimska hidroliza se izvaja pri visoki obremenitvi s trdnimi snovmi z uporabo komercialnih aktivnih encimov, ki vsebujejo ogljikove hidrate (CAZymes) in mikrobna fermentacija z uporabo transgenih kvasovk ali bakterij za proizvodnjo goriv in kemikalij na biološki osnovi 6 .
CAZimi v komercialnih encimih so sestavljeni iz kompleksne mešanice encimov, ki sinergistično cepijo kompleksne vezi ogljikovih hidratov in sladkorja, da tvorijo monosaharide 2,7.Kot smo že poročali, jih zaradi kompleksne mreže aromatskih polimerov lignina z ogljikovimi hidrati zelo težko rešiti, kar vodi do nepopolne pretvorbe sladkorja, pri čemer se kopiči 15-25 % spolnih oligosaharidov, ki niso proizvedeni med encimsko hidrolizo predhodno obdelane biomase.To je pogosta težava pri različnih metodah predobdelave biomase.Nekateri razlogi za to ozko grlo vključujejo zaviranje encimov med hidrolizo ali odsotnost ali nizke ravni bistvenih bistvenih encimov, ki so potrebni za prekinitev sladkornih vezi v rastlinski biomasi.Razumevanje sestave in strukturnih značilnosti sladkorjev, kot so sladkorne vezi v oligosaharidah, nam bo pomagalo izboljšati pretvorbo sladkorja med hidrolizo, zaradi česar bodo biotehnološki procesi stroškovno konkurenčni proizvodom, pridobljenim iz nafte.
Določanje strukture ogljikovih hidratov je zahtevno in zahteva kombinacijo metod, kot so tekočinska kromatografija (LC)11,12, jedrska magnetna resonančna spektroskopija (NMR)13, kapilarna elektroforeza (CE)14,15,16 in masna spektrometrija (MS)17., osemnajst.Metode MS, kot je masna spektrometrija s časom preleta z lasersko desorpcijo in ionizacijo z uporabo matrice (MALDI-TOF-MS), so vsestranska metoda za identifikacijo struktur ogljikovih hidratov.V zadnjem času je bila tandemska MS aduktov natrijevih ionov, povzročena s trkom, najpogosteje uporabljena za identifikacijo prstnih odtisov, ki ustrezajo položajem pritrditve oligosaharidov, anomernim konfiguracijam, zaporedjem in položajem razvejanja 20, 21.
Analiza glikanov je odlično orodje za poglobljeno identifikacijo vezi ogljikovih hidratov22.Ta metoda uporablja monoklonska protitelesa (mAbs), usmerjena na glikan rastlinske celične stene, kot sonde za razumevanje povezav kompleksnih ogljikovih hidratov.Po vsem svetu je na voljo več kot 250 mAb, zasnovanih proti različnim linearnim in razvejanim oligosaharidom z uporabo različnih saharidov24.Več mAb se pogosto uporablja za karakterizacijo strukture, sestave in modifikacij rastlinske celične stene, saj obstajajo pomembne razlike glede na vrsto rastlinske celice, organ, starost, razvojno stopnjo in rastno okolje 25, 26.V zadnjem času je bila ta metoda uporabljena za razumevanje populacij veziklov v rastlinskih in živalskih sistemih in njihove vloge pri transportu glikanov, kot jih določajo podcelični markerji, razvojne stopnje ali okoljski dražljaji, ter za določanje encimske aktivnosti.Nekatere od identificiranih različnih struktur glikanov in ksilanov vključujejo pektin (P), ksilan (X), manan (M), ksiloglukane (XylG), mešane glukane (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomanan (GalG), glukuronsko kislino-arabinoksilan (GArbX) in arabino-galaktan (ArbG)29.
Vendar se je kljub vsem tem raziskovalnim prizadevanjem le nekaj študij osredotočilo na naravo kopičenja oligosaharidov med hidrolizo z visoko obremenitvijo s trdnimi snovmi (HSL), vključno s sproščanjem oligosaharidov, spremembami dolžine oligomerne verige med hidrolizo, različnimi polimeri z nizko DP in njihovimi krivuljami.razdelitve 30,31,32.Medtem, čeprav se je analiza glikana izkazala za uporabno orodje za celovito analizo strukture glikana, je težko ovrednotiti vodotopne oligosaharide z nizko DP z uporabo metod protiteles.Manjši DP oligosaharidi z molekulsko maso manj kot 5-10 kDa se ne vežejo na ELISA plošče 33, 34 in se sperejo pred dodatkom protiteles.
Tukaj prvič prikazujemo test ELISA na ploščah, prevlečenih z avidinom, z uporabo monoklonskih protiteles, pri čemer združujemo enostopenjski postopek biotinilacije za topne neodzivne oligosaharide z analizo glikoma.Naš pristop k analizi glikoma je bil potrjen z analizo komplementarnih oligosaharidnih povezav na podlagi MALDI-TOF-MS in GC-MS z uporabo trimetilsililne (TMS) derivatizacije hidroliziranih sladkornih sestavkov.Ta inovativni pristop se lahko v prihodnosti razvije kot visoko zmogljiva metoda in najde širšo uporabo v biomedicinskih raziskavah35.
Posttranslacijske modifikacije encimov in protiteles, kot je glikozilacija,36 vplivajo na njihovo biološko aktivnost.Na primer, spremembe v glikozilaciji serumskih beljakovin igrajo pomembno vlogo pri vnetnem artritisu, spremembe v glikozilaciji pa se uporabljajo kot diagnostični markerji37.V literaturi so poročali, da se različni glikani zlahka pojavijo pri različnih boleznih, vključno s kroničnimi vnetnimi boleznimi prebavil in jeter, virusnimi okužbami, rakom jajčnikov, dojk in prostate38,39,40.Razumevanje strukture glikanov z uporabo glikanskih ELISA metod, ki temeljijo na protitelesih, bo zagotovilo dodatno zaupanje v diagnozo bolezni brez uporabe kompleksnih MS metod.
Naša prejšnja študija je pokazala, da so trdovratni oligosaharidi po predobdelavi in ​​encimski hidrolizi ostali nehidrolizirani (slika 1).V našem predhodno objavljenem delu smo razvili metodo ekstrakcije na trdni fazi z aktivnim ogljem za izolacijo oligosaharidov iz koruznega hidrolizata (ACSH), predhodno obdelanega z AFEX.Po začetni ekstrakciji in ločevanju smo oligosaharide nadalje frakcionirali z velikostno izključitveno kromatografijo (SEC) in zbrali po vrstnem redu glede na molekulsko maso.Sladkorne monomere in oligomere, sproščene iz različnih predobdelav, smo analizirali z analizo sestave sladkorja.Če primerjamo vsebnost sladkornih oligomerov, pridobljenih z različnimi metodami predobdelave, je prisotnost trdovratnih oligosaharidov pogosta težava pri pretvorbi biomase v monosaharide in lahko privede do zmanjšanja donosa sladkorja za vsaj 10-15 % in celo do 18 %.ZDA.Ta metoda se uporablja za nadaljnjo obsežno proizvodnjo frakcij oligosaharidov.Nastali ACH in njegove naslednje frakcije z različnimi molekulskimi masami so bile uporabljene kot eksperimentalni material za karakterizacijo oligosaharidov v tem delu.
Po predobdelavi in ​​encimski hidrolizi so obstojni oligosaharidi ostali nehidrolizirani.Tukaj (A) je metoda ločevanja oligosaharidov, pri kateri se oligosaharidi izolirajo iz hidrolizata koruznega pekovca (ACSH), predhodno obdelanega z AFEX, z uporabo polnila iz aktivnega oglja in diatomejske zemlje;(B) Metoda za ločevanje oligosaharidov.Oligosaharide smo nadalje ločili z izključitveno kromatografijo (SEC);(C) Saharidni monomeri in oligomeri, sproščeni iz različnih predobdelav (razredčena kislina: DA, ionska tekočina: IL in AFEX).Pogoji encimske hidrolize: visoka obremenitev s trdnimi snovmi 25 % (m/m) (približno 8 % obremenitev glukana), 96-urna hidroliza, 20 mg/g komercialne obremenitve z encimi (razmerje Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) in (D) Monomeri sladkorja in oligomeri glukoze, ksiloze in arabinoze, sproščeni iz koruznega kuhalnika, predhodno obdelanega z AFEX ( ACS).
Analiza glikanov se je izkazala za uporabno orodje za celovito strukturno analizo glikanov v ekstraktih, izoliranih iz trdnih ostankov biomase.Vendar pa so vodotopni saharidi premalo zastopani s to tradicionalno metodo41, ker je oligosaharide z nizko molekulsko maso težko imobilizirati na ploščah ELISA in se izperejo pred dodatkom protiteles.Zato smo za vezavo protiteles in karakterizacijo uporabili enostopenjsko biotinilacijsko metodo za prevleko topnih, neskladnih oligosaharidov na ploščah ELISA, prevlečenih z avidinom.Ta metoda je bila preizkušena z uporabo našega predhodno proizvedenega ACSH in frakcije na podlagi njegove molekulske mase (ali stopnje polimerizacije, DP).Enostopenjsko biotinilacijo smo uporabili za povečanje afinitete za vezavo oligosaharida z dodajanjem biotin-LC-hidrazida na redukcijski konec ogljikovih hidratov (slika 2).V raztopini hemiacetalna skupina na redukcijskem koncu reagira s hidrazidno skupino biotin-LC-hidrazida, da nastane hidrazonska vez.V prisotnosti redukcijskega sredstva NaCNBH3 se hidrazonska vez reducira v stabilen biotiniliran končni produkt.S spremembo konca za zmanjševanje sladkorja je postala možna vezava oligosaharidov z nizko DP na plošče ELISA, v naši študiji pa je bilo to narejeno na ploščah, prevlečenih z avidinom, z uporabo mAbs, usmerjenih na glikan.
Preverjanje monoklonskih protiteles na osnovi ELISA za biotinilirane oligosaharide.Tukaj (A) kombinirana biotinilacija oligosaharidov in kasnejši pregled ELISA z mAbs, usmerjenimi na glikan, na ploščah, prevlečenih z NeutrAvidinom, in (B) prikazuje enostopenjski postopek za biotinilacijo reakcijskih produktov.
Plošče, prevlečene z avidinom, z oligosaharidno konjugiranimi protitelesi smo nato dodali primarnim in sekundarnim protitelesom in jih sprali v mediju, občutljivem na svetlobo in čas.Ko je vezava protiteles končana, dodajte substrat TMB za inkubacijo plošče.Reakcijo smo dokončno ustavili z žveplovo kislino.Inkubirane plošče so bile analizirane z uporabo bralnika ELISA, da se določi vezavna moč vsakega protitelesa, da se odkrije za protitelesa specifično navzkrižno povezovanje.Za podrobnosti in parametre poskusa glejte ustrezen razdelek »Materiali in metode«.
Dokazujemo uporabnost te na novo razvite metode za posebne aplikacije z karakterizacijo topnih oligosaharidov, prisotnih v ACSH, kot tudi v surovih in prečiščenih oligosaharidnih frakcijah, izoliranih iz lignoceluloznih hidrolizatov.Kot je prikazano na sliki 3, so najpogostejši z epitopom substituirani ksilani, identificirani v ACSH z uporabo metod testiranja bioaciliranega glikoma, običajno uronski (U) ali metiluronski (MeU) in pektični arabinogalaktani.Večino smo jih našli tudi v naši prejšnji študiji o analizi glikanov nehidroliziranih trdnih snovi (UHS)43.
Odkrivanje neposlušnih oligosaharidnih epitopov z uporabo monoklonskega protitelesa, usmerjenega proti glikanu celične stene."Nevtralna" frakcija je frakcija ACN, "kisla" frakcija pa je frakcija FA.Svetlejše rdeče barve na toplotni karti označujejo višjo vsebnost epitopov, svetlejše modre barve pa označujejo prazno ozadje.Barvne vrednosti na lestvici temeljijo na surovih vrednostih OD za formulacije N=2.Glavni epitopi, ki jih prepoznajo protitelesa, so prikazani na desni.
Teh neceluloznih struktur najpogostejše celulaze in hemicelulaze v testirani komercialni encimski mešanici, ki vključuje najpogosteje uporabljene komercialne encime, niso mogle cepiti.Zato so za njihovo hidrolizo potrebni novi pomožni encimi.Brez potrebnih neceluloznih pomožnih encimov te necelulozne vezi preprečujejo popolno pretvorbo v monosaharide, tudi če so njihovi matični sladkorni polimeri obsežno hidrolizirani v krajše fragmente in raztopljeni z uporabo komercialnih encimskih mešanic.
Nadaljnja študija porazdelitve signala in njegove vezavne moči je pokazala, da so bili vezavni epitopi nižji v frakcijah sladkorja z visokim DP (A, B, C, DP do 20+) kot v frakcijah z nizkim DP (D, E, F, DP) v dimerjih) (slika 1).Kislinski fragmenti so pogostejši v neceluloznih epitopih kot nevtralni fragmenti.Ti pojavi so skladni z vzorcem, opaženim v naši prejšnji študiji, kjer so bili visoki DP in kislinski deli bolj odporni na encimsko hidrolizo.Zato lahko prisotnost neceluloznih glikanskih epitopov ter substitucij U in MeU močno prispeva k stabilnosti oligosaharidov.Opozoriti je treba, da sta učinkovitost vezave in detekcije lahko problematični za oligosaharide z nizko DP, zlasti če je epitop dimerni ali trimerni oligosaharid.To je mogoče testirati z uporabo komercialnih oligosaharidov različnih dolžin, od katerih vsak vsebuje le en epitop, ki se veže na specifično mAb.
Tako je uporaba strukturno specifičnih protiteles razkrila nekatere vrste neposlušnih vezi.Odvisno od vrste uporabljenega protitelesa, ustreznega ligacijskega vzorca in moči signala, ki ga proizvede (največ in najmanj) je mogoče identificirati nove encime in jih polkvantitativno dodati mešanici encimov za popolnejšo glikokonverzijo.Če za primer vzamemo analizo oligosaharidov ACSH, lahko ustvarimo bazo podatkov glikanskih vezi za vsak biomasni material.Pri tem je treba opozoriti, da je treba upoštevati različno afiniteto protiteles in če njihova afiniteta ni znana, bo to povzročilo določene težave pri primerjavi signalov različnih protiteles.Poleg tega lahko primerjava glikanskih vezi najbolje deluje med vzorci za isto protitelo.Te trdovratne vezi lahko nato povežemo z bazo podatkov CAZyme, iz katere lahko identificiramo encime, izberemo kandidatne encime in testiramo encime, ki prekinjajo vezi, ali razvijemo mikrobne sisteme za izražanje teh encimov za uporabo v biorafinerijah44.
Da bi ocenili, kako imunološke metode dopolnjujejo alternativne metode za karakterizacijo oligosaharidov z nizko molekulsko maso, prisotnih v lignoceluloznih hidrolizatih, smo izvedli MALDI (sl. 4, S1-S8) in analizo saharidov, pridobljenih iz TMS, na podlagi GC-MS na isti plošči (sl. 5) oligosaharidni del.MALDI se uporablja za primerjavo, ali se masna porazdelitev molekul oligosaharidov ujema s predvideno strukturo.Na sl.4 prikazuje MC nevtralnih komponent ACN-A in ACN-B.Analiza ACN-A je potrdila vrsto pentoznih sladkorjev v razponu od DP 4–8 (slika 4) do DP 22 (slika S1), katerih uteži ustrezajo oligosaharidom MeU-ksilan.Analiza ACN-B je potrdila serijo pentoze in glukoksilana z DP 8-15.V dodatnem materialu, kot je Slika S3, zemljevidi porazdelitve mase kislih delov FA-C prikazujejo vrsto (Me)U substituiranih pentoznih sladkorjev z DP 8-15, ki so skladni s substituiranimi ksilani, najdenimi pri presejanju mAb na osnovi ELISA.Epitopi so skladni.
MALDI-MS spekter topnih neskladnih oligosaharidov, prisotnih v ACS.Tukaj (A) frakcije z nizko maso ACN-A, ki vsebujejo metilirano uronsko kislino (DP 4-8), substituirane oligosaharide glukuroksilana, in (B) ACN-B ksilan in oligosaharide metilirane uronske kisline, substituirane z glukuroksilanom (DP 8-15).
Analiza sestave glikanskega ostanka ognjevzdržnih oligosaharidov.Tukaj (A) TMS saharidna sestava različnih frakcij oligosaharidov, pridobljena z analizo GC-MS.(B) Strukture različnih sladkorjev, pridobljenih iz TMS, prisotnih v oligosaharidih.ACN – frakcija acetonitrila, ki vsebuje nevtralne oligosaharide in FA – frakcija ferulne kisline, ki vsebuje kisle oligosaharide.
Drug zanimiv zaključek je bil narejen iz analize LC-MS frakcije oligosaharidov, kot je prikazano na sliki S9 (metode so vidne v elektronskem dodatnem gradivu).Fragmente heksoznih in -OAc skupin smo večkrat opazili med ligacijo frakcije ACN-B.Ta ugotovitev ne samo potrjuje razdrobljenost, opaženo pri analizi glikoma in MALDI-TOF, ampak tudi zagotavlja nove informacije o potencialnih derivatih ogljikovih hidratov v predhodno obdelani lignocelulozni biomasi.
Analizirali smo tudi sladkorno sestavo oligosaharidne frakcije z derivatizacijo sladkorja TMS.Z GC-MS smo določili sestavo živčnih (nederivativnih) in kislih sladkorjev (GluA in GalA) v oligosaharidni frakciji (slika 5).Glukuronsko kislino najdemo v kislih komponentah C in D, galakturonsko kislino pa v kislih komponentah A in B, ki sta obe komponenti kislih sladkorjev z visokim DP.Ti rezultati ne le potrjujejo naše podatke ELISA in MALDI, ampak so tudi skladni z našimi prejšnjimi študijami kopičenja oligosaharidov.Zato verjamemo, da so sodobne imunološke metode z uporabo biotinilacije oligosaharidov in naknadnega presejanja ELISA zadostne za odkrivanje topnih nepopustljivih oligosaharidov v različnih bioloških vzorcih.
Ker so presejalne metode mAb na osnovi ELISA potrjene z več različnimi metodami, smo želeli nadalje raziskati potencial te nove kvantitativne metode.Dva komercialna oligosaharida, ksiloheksasaharid oligosaharid (XHE) in 23-α-L-arabinofuranozil-ksilotrioza (A2XX), sta bila kupljena in preizkušena z uporabo novega pristopa mAb, ki cilja na glikan celične stene.Slika 6 prikazuje linearno korelacijo med biotiniliranim vezavnim signalom in logaritemsko koncentracijo koncentracije oligosaharidov, kar kaže na možen Langmuirjev model adsorpcije.Med mAbs so CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 in CCRC-M151 korelirali z XHE, CCRC-M108, CCRC-M109 in LM11 pa z A2XX v razponu od 1 nm do 100 nano.Zaradi omejene razpoložljivosti protiteles med poskusom so bili izvedeni omejeni poskusi z vsako koncentracijo oligosaharida.Tu je treba opozoriti, da se nekatera protitelesa zelo različno odzivajo na isti oligosaharid kot substrat, verjetno zato, ker se vežejo na nekoliko drugačne epitope in imajo lahko zelo različne vezavne afinitete.Mehanizmi in posledice natančne identifikacije epitopa bodo veliko bolj zapleteni, ko bo nov pristop mAb uporabljen na resničnih vzorcih.
Dva komercialna oligosaharida sta bila uporabljena za določitev obsega detekcije različnih mAbs, ki ciljajo na glikan.Tu linearne korelacije z logaritmom koncentracije koncentracije oligosaharidov kažejo vzorce Langmuirjeve adsorpcije za (A) XHE z mAb in (B) A2XX z mAb.Ustrezni epitopi nakazujejo strukture komercialnih oligosaharidov, uporabljenih kot substrati v testu.
Uporaba monoklonskih protiteles, usmerjenih na glikan (glikokomska analiza ali presejanje mAb na osnovi ELISA), je močno orodje za poglobljeno karakterizacijo večine glavnih glikanov celične stene, ki sestavljajo rastlinsko biomaso.Vendar pa klasična analiza glikanov označuje le glikane večjih celičnih sten, saj večina oligosaharidov ni učinkovito imobilizirana na ploščah ELISA.V tej študiji je bil koruzni štedilnik, predhodno obdelan z AFEX, encimsko hidroliziran pri visoki vsebnosti trdnih snovi.Analiza sladkorja je bila uporabljena za določitev sestave neposlušnih ogljikovih hidratov celične stene v hidrolizatu.Vendar je analiza mAb manjših oligosaharidov v hidrolizatih podcenjena in potrebna so dodatna orodja za učinkovito imobilizacijo oligosaharidov na ploščah ELISA.
Tukaj poročamo o novi in ​​učinkoviti metodi imobilizacije oligosaharidov za presejanje mAb s kombinacijo biotinilacije oligosaharidov, ki ji sledi presejanje ELISA na ploščah, prevlečenih z NeutrAvidin™.Imobilizirani biotinilirani oligosaharidi so pokazali zadostno afiniteto za protitelesa, da so omogočili hitro in učinkovito odkrivanje neposlušnih oligosaharidov.Analiza sestave teh trdovratnih oligosaharidov na podlagi masne spektrometrije je potrdila rezultate tega novega pristopa k imunskemu pregledu.Tako te študije dokazujejo, da se lahko kombinacija biotinilacije oligosaharidov in testa ELISA z monoklonskimi protitelesi, usmerjenimi na glikan, uporabi za odkrivanje navzkrižnih povezav v oligosaharidih in se lahko široko uporablja v drugih biokemičnih študijah, ki označujejo strukturo oligosaharidov.
Ta metoda profiliranja glikana na osnovi biotina je prvo poročilo, ki je sposobno raziskati neposlušne vezi ogljikovih hidratov topnih oligosaharidov v rastlinski biomasi.To pomaga razumeti, zakaj so nekateri deli biomase tako trdovratni, ko gre za proizvodnjo biogoriv.Ta metoda zapolnjuje pomembno vrzel v metodah analize glikoma in razširja svojo uporabo na širši spekter substratov, ki presegajo rastlinske oligosaharide.V prihodnosti bomo morda uporabili robotiko za biotinilacijo in uporabili metodo, ki smo jo razvili za visoko zmogljivo analizo vzorcev z uporabo ELISA.
Koruzna slama (CS), pridelana iz hibridnih semen Pioneer 33A14, je bila pridelana leta 2010 na kmetijah Kramer v Rayu v Koloradu.Z dovoljenjem lastnika zemljišča se lahko ta biomasa uporablja za raziskave. Vzorci so bili shranjeni na suhem < 6% vlage v vrečkah z zadrgo pri sobni temperaturi. Vzorci so bili shranjeni na suhem < 6% vlage v vrečkah z zadrgo pri sobni temperaturi. Obrazci so bili shranjeni suhi pri vlažnosti < 6% v paketih z zadrževalno-molnico pri sobni temperaturi. Vzorci so bili shranjeni na suhem pri <6% vlažnosti v vrečkah z zadrgo pri sobni temperaturi.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Obrazci hranijo v paketu z zaščitno-molnico pri sobni temperaturi z vlažnostjo < 6%. Vzorce hranimo v vrečkah na zadrgo pri sobni temperaturi z vlažnostjo < 6 %.Študija je bila v skladu z lokalnimi in nacionalnimi smernicami.Analiza sestave je bila izvedena s protokolom NREL.Ugotovljeno je bilo, da sestavek vsebuje 31,4 % glukana, 18,7 % ksilana, 3,3 % arabinana, 1,2 % galaktana, 2,2 % acetila, 14,3 % lignina, 1,7 % beljakovin in 13,4 % pepela.
Cellic® CTec2 (138 mg beljakovin/ml, serija VCNI 0001) je kompleksna mešanica celulaze, β-glukozidaze in Cellic® HTec2 (157 mg beljakovin/ml, serija VHN00001) podjetja Novozymes (Franklinton, NC, ZDA)).Multifect Pectinase® (72 mg beljakovin/ml), kompleksno mešanico encimov, ki razgrajujejo pektin, je donirala DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ZDA).Koncentracije encimskih beljakovin so bile določene z ocenjevanjem vsebnosti beljakovin (in odštevanjem prispevka neproteinskega dušika) z uporabo Kjeldahlove analize dušika (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ZDA).Diatomejska zemlja 545 je bila kupljena pri EMD Millipore (Billerica, MA).Aktivno oglje (DARCO, granule 100 mesh), Avicel (PH-101), bukov ksilan in vse druge kemikalije so bile kupljene pri Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Predobdelava AFEX je bila izvedena v GLBRC (Raziskovalni laboratorij za pretvorbo biomase, MSU, Lansing, MI, ZDA).Predobdelavo smo izvedli pri 140 °C 15 minut.46 zadrževalni čas pri razmerju 1:1 brezvodnega amoniaka proti biomasi pri 60 % (m/m) obremenitvi v namiznem šaržnem reaktorju iz nerjavečega jekla (Parr Instruments Company).Trajalo je 30 minut.Reaktor so segreli na 140 °C in amoniak se je hitro sprostil, kar je omogočilo, da se biomasa hitro vrne na sobno temperaturo.Sestava predhodno obdelane koruzne pečnice (ACS) AFEX je bila podobna sestavi neobdelane koruzne pečnice (UT-CS).
ACSH z visoko vsebnostjo trdnih snovi 25 % (mas./mas.) (približno 8 % nalaganja dekstrana) je bil pripravljen kot izhodiščni material za proizvodnjo oligosaharidov v velikem obsegu.Encimsko hidrolizo ACS smo izvedli z uporabo komercialne mešanice encimov, ki vključuje Cellic® Ctec2 10 mg beljakovin/g glukana (v predhodno obdelani biomasi), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg beljakovin/g glukana in Multifect Pectinase (Genencor Inc, ZDA).).), 5 mg beljakovin/g dekstrana.Encimsko hidrolizo smo izvedli v 5-litrskem bioreaktorju z delovno prostornino 3 litre, pH 4,8, 50 °C in 250 vrt/min.Po hidrolizi 96 ur smo hidrolizat zbrali s centrifugiranjem pri 6000 obratih na minuto 30 minut in nato pri 14000 obratih na minuto 30 minut, da smo odstranili nehidrolizirane trdne snovi.Hidrolizat smo nato izpostavili sterilni filtraciji skozi 0,22 mm filtrirno čašo.Filtriran hidrolizat smo shranili v sterilnih steklenicah pri 4 °C in nato frakcionirali na oglju.
Analiza sestave vzorcev biomase na osnovi ekstrakta po postopkih laboratorijske analize NREL: priprava vzorcev za analizo sestave (NREL/TP-510-42620) in določanje strukturnih ogljikovih hidratov in lignina v biomasi (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosaharidno analizo toka hidrolizata smo izvedli v 2 ml merilu z uporabo metode kislinske hidrolize na osnovi avtoklava.Vzorec hidrolizata zmešajte s 69,7 µl 72-odstotne žveplove kisline v 10-mililitrski epruveti za kulturo z navojno zaporko in inkubirajte 1 uro na namizju pri 121 °C, ohladite na ledu in filtrirajte v vialo za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC).Koncentracijo oligosaharidov smo določili tako, da smo koncentracijo monosaharidov v nehidroliziranem vzorcu odšteli od celotne koncentracije sladkorja v kislinsko hidroliziranem vzorcu.
Koncentracije glukoze, ksiloze in arabinoze v kislinsko hidrolizirani biomasi so bile analizirane s sistemom Shimadzu HPLC, opremljenim s samodejnim vzorčevalnikom, grelnikom kolone, izokratsko črpalko in detektorjem lomnega količnika na koloni Bio-Rad Aminex HPX-87H.Kolono vzdržujemo pri 50 °C in eluiramo s 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 v vodi.tok.
Supernatant hidrolizata smo razredčili in analizirali na vsebnost monomerov in oligosaharidov.Monomerne sladkorje, pridobljene po encimski hidrolizi, smo analizirali s HPLC, opremljeno s kolono Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P in kolono za zaščito pred pepelom.Temperaturo kolone smo vzdrževali pri 80 °C, kot mobilno fazo smo uporabili vodo s pretokom 0,6 ml/min.Oligosaharide smo določili s hidrolizo v razredčeni kislini pri 121 °C po metodah, opisanih v ref.41, 48, 49.
Analiza saharidov je bila izvedena na surovih, predhodno obdelanih z AFEX in vseh nehidroliziranih ostankih biomase (vključno s proizvodnjo serijskih ekstraktov celične stene in njihovim presejanjem mAb) z uporabo predhodno opisanih postopkov 27, 43, 50, 51.Za analizo glikoma se v alkoholu netopni ostanki materiala rastlinske celične stene pripravijo iz ostankov biomase in izpostavijo serijski ekstrakciji z vse bolj agresivnimi reagenti, kot je amonijev oksalat (50 mM), natrijev karbonat (50 mM in 0,5 % w/v), CON.(1M in 4M, oba z 1 % m/v natrijevega borohidrida) in kislinski klorit, kot je opisano prej52,53.Ekstrakte smo nato podvrgli testu ELISA proti kompleksni plošči mAb50, usmerjenih na glikan celične stene, in reakcije vezave mAb so predstavili kot toplotni zemljevid.mAbs, ki ciljajo na glikan rastlinske celične stene, so bili kupljeni iz laboratorijskih zalog (serije CCRC, JIM in MAC).
Enostopenjska biotinilacija oligosaharidov.Konjugacijo ogljikovih hidratov z biotin-LC-hidrazidom smo izvedli po naslednjem postopku.Biotin-LC-hidrazid (4,6 mg/12 μmol) smo raztopili v dimetil sulfoksidu (DMSO, 70 μl) z močnim mešanjem in segrevanjem pri 65 °C 1 minuto.Dodali smo ledocetno kislino (30 ul) in zmes zlili na natrijev cianoborohidrid (6,4 mg/100 umol) in popolnoma raztopili po segrevanju pri 65 °C približno 1 minuto.Nato smo posušenemu oligosaharidu (1-100 nmol) dodali od 5 do 8 μl reakcijske zmesi, da smo dobili 10-kratni ali več molski presežek oznake nad reducirajočim koncem.Reakcijo smo izvajali pri 65 °C 2 uri, nato pa smo vzorce takoj očistili.V poskusih označevanja brez redukcije ni bil uporabljen natrijev cianoborohidrid in vzorci so reagirali pri 65 °C 2,5 ure.
ELISA premazovanje in pranje vzorcev biotiniliranih oligosaharidov.25 μl biotiniliranih vzorcev (100 μl vsakega koncentriranega vzorca, razredčenega v 5 ml 0,1 M raztopine Tris pufra (TBS)) smo dodali v vsako vdolbino plošče, prevlečene z avidinom.Kontrolne vdolbinice smo prekrili s 50 μl biotina v koncentraciji 10 μg/ml v 0,1 M TBS.Kot premaz za slepe meritve je bila uporabljena deionizirana voda.Tableto smo inkubirali 2 uri pri sobni temperaturi v temi.Ploščo 3-krat sperite z 0,1 % posnetim mlekom v 0,1 M TBS s programom št.11 za stanovanje Grenier 3A.
Dodajanje in izpiranje primarnih protiteles.V vsako jamico dodajte 40 µl primarnega protitelesa.Inkubirajte mikroploščo 1 uro pri sobni temperaturi v temi.Plošče smo nato 3-krat sprali z 0,1 % mleka v 0,1 M TBS z uporabo programa pranja #11 za Grenier Flat 3A.
Dodajte sekundarno protitelo in sperite.Dodajte 50 µl mišjega/podganjega sekundarnega protitelesa (razredčenega 1:5000 v 0,1 % mleku v 0,1 M TBS) v vsako jamico.Inkubirajte mikroploščo 1 uro pri sobni temperaturi v temi.Mikroplošče smo nato 5-krat sprali z 0,1 % mleka v 0,1 M TBS z uporabo Grenier Flat 5A programa za pranje plošč #12.
Dodajanje substrata.V osnovni substrat dodamo 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) (z dodajanjem 2 kapljic pufra, 3 kapljic TMB, 2 kapljic vodikovega peroksida v 15 ml deionizirane vode).Pripravite substrat TMB.in pred uporabo pretresite).Inkubirajte mikroploščo pri sobni temperaturi 30 minut.V temi.
Dokončajte korak in preberite tabelo.V vsako jamico dodajte 50 µl 1 N žveplove kisline in z ELISA čitalnikom zabeležite absorbanco od 450 do 655 nm.
Pripravite 1 mg/ml raztopine teh analitov v deionizirani vodi: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksiloza, galakturonska kislina (GalA), glukuronska kislina (GlcA), manoza, glukoza, galaktoza, laktoza, N-acetilmanozamin (manNAc), N-acetilglukozamin.(glcNAc), N-acetilgalaktozamin (galNAc), inozitol (notranji standard).Pripravili smo dva standarda z dodajanjem raztopin sladkorja 1 mg/mL, prikazanih v tabeli 1. Vzorci so bili zamrznjeni in liofilizirani pri -80 °C, dokler ni bila odstranjena vsa voda (običajno približno 12-18 ur).
Dodajte 100–500 µg vzorca v epruvete z navojno zaporko na analitski tehtnici.Zabeležite dodani znesek.Najbolje je, da vzorec raztopite v določeni koncentraciji topila in ga dodate v epruveto kot tekoči alikvot.Uporabite 20 µl 1 mg/ml inozitola kot notranji standard za vsako epruveto z vzorcem.Količina notranjega standarda, dodanega vzorcu, mora biti enaka količini notranjega standarda, dodanega v standardno epruveto.
V vialo z navojno zaporko dodajte 8 ml brezvodnega metanola.Nato 4 ml 3 N. metanolne raztopine HCl, pokrijte in pretresite.Ta postopek ne uporablja vode.
Vzorcem oligosaharidov in standardnim TMS epruvetam dodajte 500 µl 1 M raztopine metanola HCl.Vzorci so bili inkubirani čez noč (168 ur) pri 80 °C v termalnem bloku.Produkt metanolize posušite pri sobni temperaturi z uporabo sušilnega kolektorja.Dodamo 200 µl MeOH in ponovno posušimo.Ta postopek se ponovi dvakrat.Vzorcu dodamo 200 µl metanola, 100 µl piridina in 100 µl anhidrida ocetne kisline in dobro premešamo.Vzorci so bili inkubirani pri sobni temperaturi 30 minut.in posušeno.Dodamo 200 µl metanola in ponovno posušimo.
Dodajte 200 µl Tri-Sil in segrevajte zaprto epruveto 20 minut.80°C, nato ohladimo na sobno temperaturo.Uporabite sušilni kolektor za nadaljnje sušenje vzorca do prostornine približno 50 µl.Pomembno je omeniti, da vzorcev nismo pustili popolnoma posušiti.
Dodamo 2 ml heksana in dobro premešamo z vrtinčenjem.Napolnite konice Pasteurjevih pipet (5–8 mm) s kosom steklene volne, tako da vstavite stekleno volno na vrh pipete s premerom 5–3/4 palca.Vzorce centrifugiramo pri 3000 g 2 minuti.Morebitni netopni ostanki se oborijo.Vzorec posušite na 100–150 µl.Volumen približno 1 μl je bil vbrizgan v GC-MS pri začetni temperaturi 80 °C in začetnem času 2,0 minuti (tabela 2).