Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад.Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед).Дар ҳамин ҳол, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript пешкаш хоҳем кард.
Усулҳои нави иммунологӣ ва масс-спектрометрӣ барои таҳлили комплексии олигосахаридҳои доимӣ дар печи ҷуворимакка бо AFEX коркардшуда.Биомассаи lignocellulosic алтернативаи устувор ба сӯзишвории истихроҷшуда мебошад ва барои таҳияи биотехнологияҳо барои истеҳсоли маҳсулот ба монанди ғизо, ғизо, сӯзишворӣ ва кимиёвӣ васеъ истифода мешавад.Калиди ин технологияҳо таҳияи равандҳои рақобатпазир барои табдил додани карбогидратҳои мураккабе, ки дар деворҳои ҳуҷайраҳои растанӣ мавҷуданд, ба қандҳои оддӣ ба монанди глюкоза, ксилоза ва арабиноза мебошад.Азбаски биомассаи лигноселлюлозӣ хеле якрав аст, он бояд ба коркарди термохимиявӣ (масалан, эксфолиатсияи нахи аммиак (AFEX), кислотаҳои моеъ (DA), моеъҳои ионӣ (IL)) ва табобатҳои биологӣ (масалан, гидролизи ферментативӣ ва ферментатсияи микробҳо) дар якҷоягӣ барои ба даст овардани маҳсулоти дилхоҳ гузарад..Аммо хангоми дар чараёни гидролиз ферментхои тичоратии занбурўги истифодашаванда танхо 75-85% кандхои халшавандаи хосилшаванда моносахаридхо ва 15-25% бокимонда олигосахаридхои халшавандаи халшаванда мебошанд, ки на хамеша барои микроорганизмхо дастрасанд.Қаблан, мо олигосахаридҳои якрав ҳалшавандаро бо истифода аз омехтаи ҷудокунии карбон ва диатомии замин ва хроматографияи истисноии андоза бомуваффақият ҷудо ва тоза кардем ва инчунин хосиятҳои ингибитории ферментҳои онҳоро таҳқиқ кардем.Мо дарёфтем, ки олигосахаридҳои дорои дараҷаи баландтари полимеризатсия (ДП) ивазкунандаи кислотаи метилонидашудаи урониро коркард кардан бо омехтаҳои ферментҳои тиҷоратӣ нисбат ба олигосахаридҳои пасти DP ва нейтралӣ мушкилтар аст.Дар ин ҷо мо дар бораи истифодаи якчанд усулҳои иловагӣ, аз ҷумла профили гликанӣ бо истифода аз антителоҳои моноклоналӣ (mAbs) хоси гликанҳои биомассаи растанӣ барои тавсифи пайвандҳои гликан дар деворҳои ҳуҷайраҳои растанӣ ва гидролизатҳои ферментативӣ, ионизатсияи лазерии десорбсияи матритсавӣ, масс-спектрометрияи вақти парвоз гузориш медиҳем..MALDI-TOF-MS) қуллаҳои ташхиси сохторӣ-маълумотиро истифода мебарад, ки тавассути спектроскопия пас аз таназзули дуввуми ионҳои манфӣ, хроматографияи газ ва масс-спектрометрия (GC-MS) ба даст оварда шудаанд, барои тавсифи пайвандҳои олигосахаридҳо бо ва бидуни ҳосилшавӣ.Аз сабаби андозаи хурди олигосахаридҳо (DP 4–20), истифодаи ин молекулаҳо барои пайвастшавӣ ва тавсифи mAb душвор аст.Барои бартараф кардани ин мушкилот, мо усули нави иммобилизатсияи олигосахаридҳои биотинро дар асоси конъюгатсионӣ татбиқ кардем, ки аксарияти олигосахаридҳои ҳалшавандаи пасти DP-ро дар сатҳи микроплата бомуваффақият қайд кард, ки баъдан дар системаи гузариши баланди mAb барои таҳлили мушаххаси ligation истифода мешуд.Ин усули нав ба таҳияи таҳлилҳои пешрафтаи баландсифати гликомӣ дар оянда мусоидат хоҳад кард, ки метавонанд барои ҷудо ва тавсифи олигосахаридҳои дар биомаркерҳо мавҷудбуда бо мақсадҳои ташхис истифода шаванд.
Биомассаи лигноселлюлозӣ, ки аз маводи кишоварзӣ, ҷангалпарварӣ, алаф ва чӯбӣ иборат аст, як захираи эҳтимолӣ барои истеҳсоли маҳсулоти биологӣ, аз ҷумла хӯрокворӣ, хӯрокворӣ, сӯзишворӣ ва прекурсорҳои кимиёвӣ барои истеҳсоли маҳсулоти арзишманд мебошад1.Карбогидратҳо (ба монанди селлюлоза ва гемицеллюлоза), ки дар деворҳои ҳуҷайраҳои растанӣ мавҷуданд, тавассути коркарди кимиёвӣ ва биотрансформация (ба монанди гидролизи ферментӣ ва ферментатсияи микробҳо) ба моносахаридҳо деполимеризатсия мешаванд.Табобатҳои маъмулии пешазинтихоботӣ васеъшавии нахи аммиак (AFEX), кислотаи ҳалшуда (DA), моеъи ионӣ (IL) ва таркиши буғро (SE) дар бар мегиранд, ки омезиши кимиёвӣ ва гармиро барои коҳиш додани истеҳсоли лигноселлюлоза тавассути кушодани деворҳои ҳуҷайраҳои растанӣ истифода мебаранд3,4.якрав будани материя, 5. Гидролизи ферментативӣ дар сарбории баланд бо истифода аз ферментҳои карбогидратдори фаъоли тиҷоратӣ (CAZymes) ва ферментатсияи микробҳо бо истифода аз хамиртурушҳои трансгенӣ ё бактерияҳо барои истеҳсоли сӯзишворӣ ва кимиёвӣ дар асоси биологӣ гузаронида мешавад 6 .
CAZymes дар ферментҳои тиҷоратӣ аз омехтаи мураккаби ферментҳо иборатанд, ки ба таври синергетикӣ пайвандҳои мураккаби карбогидрат-шакарро ҷудо карда, моносахаридҳоро ташкил медиҳанд2,7.Тавре ки қаблан хабар дода будем, шабакаи мураккаби полимерҳои хушбӯйи лигнин бо карбогидратҳо онҳоро хеле ноустувор мегардонад, ки боиси конверсияи нопурраи қанд мегардад ва 15-25% олигосахаридҳои ҷинсиро ҷамъ мекунанд, ки ҳангоми гидролизи ферментативии биомассаи қаблан коркардшуда ҳосил намешаванд.Ин як мушкили маъмул бо усулҳои гуногуни коркарди биомасса аст.Баъзе сабабҳои ин монеа ин ҷилавгирӣ аз ферментҳо ҳангоми гидролиз ё набудани ё пасти ферментҳои муҳими муҳимро дар бар мегиранд, ки барои шикастани пайвандҳои шакар дар биомассаи растанӣ заруранд.Фаҳмидани таркиб ва хусусиятҳои сохтории қандҳо, аз қабили пайвандҳои шакар дар олигосахаридҳо, ба мо кӯмак мекунад, ки табдили шакарро ҳангоми гидролиз беҳтар созем ва равандҳои биотехнологиро бо маҳсулоти нафтӣ рақобатпазир созем.
Муайян кардани сохтори карбогидратҳо душвор аст ва маҷмӯи усулҳо ба монанди хроматографияи моеъ (LC)11,12, спектроскопияи резонанси магнитии ядроӣ (NMR)13, электрофорези капиллярӣ (CE)14,15,16 ва масс-спектрометрия (MS)17 талаб мекунад., ҳаждаҳ.Усулҳои MS ба монанди масс-спектрометрияи вақти парвоз бо десорбсияи лазерӣ ва ионизатсия бо истифода аз матритса (MALDI-TOF-MS) як усули универсалӣ барои муайян кардани сохторҳои карбогидратҳо мебошанд.Ба наздикӣ, тандеми MS-и бархӯрд дар бархӯрд (CID) аз иловаҳои ионҳои натрий барои муайян кардани изи ангуштони мувофиқ ба мавқеъҳои замимаи олигосахаридҳо, конфигуратсияҳои аномерӣ, пайдарпаӣ ва мавқеъҳои шохадор 20, 21 истифода мешуданд.
Таҳлили гликан як воситаи олиҷаноб барои муайян кардани амиқи пайвандҳои карбогидратҳо мебошад22.Ин усул антителоҳои моноклоналиро (mAbs) истифода мебарад, ки ба гликани девори ҳуҷайра ҳамчун зондҳо барои фаҳмидани пайвандҳои мураккаби карбогидрат равона карда шудаанд.Зиёда аз 250 мАб дар саросари ҷаҳон дастрасанд, ки бар зидди олигосахаридҳои гуногуни хатӣ ва шохадор бо истифода аз сахаридҳои гуногун тарҳрезӣ шудаанд24.Якчанд мАбҳо барои тавсифи сохтор, таркиб ва тағирёбии девори ҳуҷайраи растанӣ ба таври васеъ истифода шудаанд, зеро вобаста ба намуди ҳуҷайра, узв, синну сол, марҳилаи рушд ва муҳити афзоиш фарқиятҳои назаррас мавҷуданд25,26.Ба наздикӣ, ин усул барои фаҳмидани популятсияҳои весикулҳо дар системаҳои растанӣ ва ҳайвонот ва нақшҳои мувофиқи онҳо дар интиқоли гликанҳо, ки аз ҷониби маркерҳои зерҳуҷайраҳо, марҳилаҳои рушд ё ангезаҳои муҳити зист муайян карда мешаванд ва барои муайян кардани фаъолияти ферментативӣ истифода мешуданд.Баъзе аз сохторҳои гуногуни гликанҳо ва ксиланҳо, ки муайян карда шудаанд, иборатанд аз пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюканҳо (XylG), глюканҳои пайвастагиҳои омехта (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), кислотаи глюкуронӣ-арабиноксилан (GAbinoG) ва arab2).
Аммо, сарфи назар аз ҳамаи ин кӯшишҳои тадқиқотӣ, танҳо якчанд тадқиқот ба табиати ҷамъшавии олигосахаридҳо ҳангоми гидролизи сарбории баланди моддаҳои сахт (HSL), аз ҷумла ҷудошавии олигосахаридҳо, тағирёбии дарозии занҷири олигомерӣ ҳангоми гидролиз, полимерҳои гуногуни пасти DP ва каҷҳои онҳо нигаронида шудаанд.тақсимот 30,31,32.Дар ҳамин ҳол, гарчанде ки таҳлили гликан як воситаи муфид барои таҳлили ҳамаҷонибаи сохтори гликан исбот шудааст, арзёбии олигосахаридҳои дар об ҳалшавандаи пасти ДП бо истифода аз усулҳои антитело душвор аст.Олигосахаридҳои хурдтари DP бо вазни молекулавии камтар аз 5-10 кДа ба плитаҳои ELISA 33, 34 пайваст намешаванд ва пеш аз илова кардани антитело шуста мешаванд.
Дар ин ҷо, бори аввал, мо таҳлили ELISA-ро дар плитаҳои бо авидин пӯшонидашуда бо истифода аз антителоҳои моноклоналӣ нишон медиҳем, ки як марҳилаи биотинилизатсияро барои олигосахаридҳои ҳалшаванда бо таҳлили гликом муттаҳид мекунад.Муносибати мо ба таҳлили гликом тавассути таҳлили MALDI-TOF-MS ва GC-MS дар асоси пайвандҳои олигосахаридҳои комплементарӣ бо истифода аз ҳосилшавии триметилсилил (TMS) аз таркибҳои шакар гидролизшуда тасдиқ карда шуд.Ин равиши инноватсионӣ метавонад дар оянда ҳамчун як усули баландсуръат таҳия карда шавад ва дар тадқиқоти биотиббӣ татбиқи васеътар пайдо шавад35.
Модификатсияҳои пас аз трансляциявии ферментҳо ва антителоҳо, ба монанди гликозилизатсия36, ба фаъолияти биологии онҳо таъсир мерасонанд.Масалан, таѓйироти гликозилизатсияи сафедањои хуноба дар артритњои илтињобї наќши муњим мебозад ва таѓйироти гликозилизатсия њамчун аломатњои ташхис истифода мешавад37.Дар адабиёт гузориш дода шудааст, ки гликанҳои гуногун ба осонӣ дар бемориҳои гуногун, аз ҷумла бемориҳои музмини илтиҳобии рӯдаи рӯда ва ҷигар, сироятҳои вирусӣ, саратони тухмдонҳо, сина ва простата пайдо мешаванд38,39,40.Фаҳмидани сохтори гликанҳо бо истифода аз усулҳои антитело дар асоси гликани ИФА эътимоди иловагиро дар ташхиси беморӣ бидуни истифодаи усулҳои мураккаби MS таъмин мекунад.
Тадқиқоти қаблии мо нишон дод, ки олигосахаридҳои якрав пас аз коркарди пешакӣ ва гидролизи ферментативӣ гидролиз нашуда мемонанд (Расми 1).Дар кори қаблан нашршудаи худ, мо як усули истихроҷи ангиштсанги фаъоли марҳилаи сахтро барои ҷудо кардани олигосахаридҳо аз гидролизати пеш аз коркардшудаи ҷуворимакка (ACSH) 8 таҳия кардем.Пас аз истихроҷ ва ҷудокунии аввалия, олигосахаридҳо минбаъд бо хроматографияи истисноии андоза (SEC) тақсим карда шуданд ва аз рӯи вазни молекулавӣ ҷамъ карда шуданд.Мономерҳо ва олигомерҳои қанд, ки аз коркардҳои гуногун бароварда шудаанд, тавассути таҳлили таркиби шакар таҳлил карда шуданд.Ҳангоми муқоисаи таркиби олигомерҳои қанд, ки бо усулҳои гуногуни пеш аз коркард ба даст оварда шудаанд, мавҷудияти олигосахаридҳои якрав дар табдили биомасса ба моносахаридҳо як мушкили маъмулӣ буда, метавонад боиси кам шудани ҳосили шакар 10-15% ва ҳатто то 18% гардад.ШМА.Ин усул барои минбаъд ба таври васеъ истехсол кардани фракцияхои олигосахаридхо истифода мешавад.Дар ин кор ACH ҳосилшуда ва фраксияҳои минбаъдаи он бо вазнҳои гуногуни молекулавӣ ҳамчун маводи таҷрибавӣ барои тавсифи олигосахаридҳо истифода шуданд.
Пас аз коркарди пешакӣ ва гидролизи ферментативӣ, олигосахаридҳои доимӣ гидролиз нашуда монданд.Дар ин ҷо (A) як усули ҷудокунии олигосахаридҳо мебошад, ки дар он олигосахаридҳо аз гидролизати бо AFEX коркардшудаи ҷуворимакка (ACSH) бо истифода аз кати печонидашудаи карбони фаъолшуда ва хоки диатомӣ ҷудо карда мешаванд;$B) Усули људокунии олигосахаридњо.Олигосахаридҳо минбаъд бо хроматографияи истисноии андоза (SEC) ҷудо карда шуданд;$C) Мономерњои сахарид ва олигомерњо, ки аз муомилоти пешакї озод мешаванд (кислотаи мањлул: DA, моеъи ионї: IL ва AFEX).Шароитҳои гидролизи ферментативӣ: сарбории баланди моддаҳои сахти 25% (в/в) (тақрибан 8% боркунии глюкан), 96 соат гидролиз, 20 мг/г боркунии ферментҳои тиҷоратӣ (таносуби Ctec2: Htec2: MP-2: 1: 1) ва (D) Мономерҳои қанд ва олигомерҳои пеш аз AFF, стоилоза ва стоилозаи AFF ҷудошуда. ACS).
Таҳлили гликанҳо як воситаи муфид барои таҳлили ҳамаҷонибаи сохтории гликанҳо дар иқтибосҳое мебошад, ки аз пасмондаҳои сахти биомасса ҷудо карда шудаанд.Бо вуҷуди ин, сахаридҳои дар об ҳалшаванда бо истифода аз ин усули анъанавӣ кам муаррифӣ карда мешаванд41, зеро олигосахаридҳои вазнаш пасти молекулярӣ дар пластинаҳои ELISA имобилизатсия кардан душвор аст ва пеш аз илова кардани антитело шуста мешаванд.Аз ин рӯ, барои пайвастшавӣ ва тавсифи антитело усули як қадами биотинилизатсия барои пӯшонидани олигосахаридҳои ҳалшаванда ва номувофиқ дар плитаҳои бо авидин пӯшонидашудаи ELISA истифода шуд.Ин усул бо истифода аз ACSH-и қаблан истеҳсолшудаи мо ва фраксия дар асоси вазни молекулавии он (ё дараҷаи полимеризатсия, DP) озмуда шуд.Биотинилизатсияи як қадам барои баланд бардоштани наздикии олигосахаридҳо тавассути илова кардани биотин-LC-гидразид ба охири коҳиши карбогидрат истифода шуд (расми 2).Дар маҳлул, гурӯҳи гемиацеталӣ дар охири коҳишёбанда бо гурӯҳи гидразиди биотин-LC-гидразид реаксия карда, пайванди гидразонаро ба вуҷуд меорад.Дар ҳузури агенти коҳишдиҳандаи NaCNBH3, пайванди гидразон ба маҳсулоти ниҳоии устувори биотинилшуда коҳиш меёбад.Бо тағир додани охири коҳишдиҳандаи шакар, пайваст кардани олигосахаридҳои пасти DP ба плитаҳои ELISA имконпазир шуд ва дар таҳқиқоти мо ин кор дар плитаҳои бо авидин пӯшонидашуда бо истифода аз mAb-ҳои ҳадафноки гликан анҷом дода шуд.
Скрининги антителоҳои моноклоналӣ дар асоси ELISA барои олигосахаридҳои биотинилшуда.Дар ин ҷо (A) омехтаи биотинилизатсияи олигосахаридҳо ва скрининги минбаъдаи ELISA бо мАбҳои ба гликан-мақсаднок дар лавҳаҳои пӯшидаи NeutrAvidin ва (B) тартиби як қадами биотинилизатсияи маҳсулоти реаксияро нишон медиҳад.
Пас аз он плитаҳои бо авидин пӯшонидашуда бо антителоҳои бо олигосахарид пайвастшуда ба антителоҳои ибтидоӣ ва дуюмдараҷа илова карда шуданд ва дар муҳити ҳассос ба рӯшноӣ ва вақт шуста шуданд.Пас аз ба итмом расидани ҳатмии антитело, субстрати TMB илова кунед, то плитаро инкубатор кунед.Дар ниҳоят реаксия бо кислотаи сулфат қатъ карда шуд.Пластинаҳои инкубатсияшуда бо истифода аз хонандаи ELISA таҳлил карда шуданд, то қувваи ҳатмии ҳар як антителоро барои муайян кардани пайванди салибҳои мушаххаси антитело муайян кунанд.Барои тафсилот ва параметрҳои таҷриба, ба бахши дахлдори «Материалҳо ва усулҳо» нигаред.
Мо фоиданокии ин усули нав таҳияшударо барои барномаҳои мушаххас тавассути тавсифи олигосахаридҳои ҳалшаванда дар ACSH, инчунин дар фраксияҳои олигосахаридҳои хом ва тозашуда, ки аз гидролизатҳои лигноселлулосӣ ҷудо карда шудаанд, нишон медиҳем.Тавре ки дар расми 3 нишон дода шудааст, ксиланҳои маъмултарини эпитопи ивазшаванда дар ACSH бо истифода аз усулҳои таҳлили биоацилонидашудаи гликоми одатан уронӣ (U) ё метилуронӣ (MeU) ва арабиногалактанҳои пектикӣ мебошанд.Аксарияти онҳо инчунин дар таҳқиқоти қаблии мо оид ба таҳлили гликанҳои сахти гидролизнашуда (UHS)43 пайдо шуданд.
Муайян кардани эпитопҳои олигосахаридҳои саркашӣ бо истифода аз антителоҳои моноклоналӣ, ки ба гликани девори ҳуҷайра нигаронида шудааст.Фраксияи "бетараф" фраксияи ACN ва фраксияи "кислотӣ" фраксияи FA мебошад.Рангҳои дурахшонтар дар харитаи гармӣ миқдори баланди эпитопро нишон медиҳанд ва блюзҳои равшантар заминаи холӣ доранд.Арзиши ранг дар миқёс ба арзишҳои хоми OD барои формулаҳои N = 2 асос ёфтааст.Дар тарафи рост эпитопҳои асосии аз ҷониби антитело эътирофшуда нишон дода шудаанд.
Ин сохторҳои ғайри селлюлозаро селлюлазаҳо ва гемицеллюлазаҳои маъмултарин дар омехтаи ферментҳои тиҷории санҷидашуда, ки ферментҳои маъмултарини тиҷоратиро дар бар мегиранд, ҷудо карда натавонистанд.Аз ин рӯ, барои гидролиз кардани онҳо ферментҳои нави ёрирасон лозиманд.Бе ферментҳои иловагии ғайри селлюлоза, ин пайвандҳои ғайри селлюлоза табдили пурра ба моносахаридҳоро пешгирӣ мекунанд, ҳатто агар полимерҳои қанди волидайни онҳо ба порчаҳои кӯтоҳтар ба таври васеъ гидролиз шуда, бо истифода аз омехтаҳои ферментҳои тиҷоратӣ гудохта шаванд.
Омӯзиши минбаъдаи тақсимоти сигнал ва қувваи ҳатмии он нишон дод, ки эпитопҳои ҳатмӣ дар фраксияҳои қанди баланди DP (A, B, C, DP то 20+) нисбат ба фраксияҳои пасти DP (D, E, F, DP) дар димерҳо) камтар буданд (расми 1).Порчаҳои кислота дар эпитопҳои ғайри селлюлоза назар ба пораҳои нейтралӣ бештар маъмуланд.Ин падидаҳо бо намунае, ки дар таҳқиқоти қаблии мо мушоҳида шудааст, мувофиқат мекунанд, ки дар он қисмҳои баланди DP ва кислотаҳо ба гидролизи ферментативӣ бештар тобовар буданд.Аз ин рӯ, мавҷудияти эпитопҳои гликанҳои ғайри селлюлоза ва ивазкунии U ва MeU метавонанд ба устувории олигосахаридҳо мусоидат кунанд.Бояд қайд кард, ки самаранокии пайвастшавӣ ва муайянкунӣ барои олигосахаридҳои пасти DP метавонад мушкил бошад, хусусан агар эпитоп олигосахариди димерӣ ё тримерӣ бошад.Инро бо истифода аз олигосахаридҳои тиҷоратии дарозии гуногун санҷидан мумкин аст, ки ҳар яки онҳо танҳо як эпитопро дар бар мегирад, ки ба мАб-и мушаххас мепайвандад.
Ҳамин тариқ, истифодаи антителоҳои сохтории мушаххас намудҳои муайяни вомбаргҳои саркашро ошкор карданд.Вобаста аз намуди антитело истифодашаванда, шакли мувофиқи ligation ва қувваи сигнале, ки он истеҳсол мекунад (аз ҳама ва камтарин), ферментҳои навро метавон муайян кард ва ба омехтаи фермент барои табдили пурраи гликоконверсиатсия илова кард.Бо назардошти таҳлили олигосахаридҳои ACSH, мо метавонем барои ҳар як маводи биомасса базаи алоқаҳои гликаниро эҷод кунем.Дар ин чо бояд кайд кард, ки наздикии гуногунии антителохоро ба назар гирифтан лозим аст ва агар наздикии онхо номаълум бошад, ин хангоми мукоисаи сигналхои антителохои гуногун душворихои муайяне ба вучуд меоварад.Илова бар ин, муқоисаи пайвандҳои гликан метавонад дар байни намунаҳо барои як антитело беҳтар кор кунад.Пас аз он ин пайвандҳои якравро ба пойгоҳи додаҳои CAZyme пайваст кардан мумкин аст, ки аз он мо метавонем ферментҳоро муайян кунем, ферментҳои номзадро интихоб кунем ва ферментҳои шикастани пайвандҳоро санҷем ё системаҳои микробҳоро барои ифода кардани ин ферментҳо барои истифода дар биорефиназияҳо таҳия кунем44.
Барои арзёбии он, ки чӣ тавр усулҳои иммунологӣ усулҳои алтернативии тавсифи олигосахаридҳои вазни пасти молекулавӣ дар гидролизатҳои лигноселлулосиро пурра мекунанд, мо MALDI (расми 4, S1-S8) ва таҳлили сахаридҳои ҳосилшудаи TMS-ро дар асоси GC-MS дар ҳамон панел (расми 5) oligosaccharide анҷом додем.MALDI барои муқоиса истифода мешавад, ки оё тақсимоти оммавии молекулаҳои олигосахаридҳо ба сохтори пешбинишуда мувофиқат мекунанд.Дар расм.4 MC-и ҷузъҳои нейтралии ACN-A ва ACN-B -ро нишон медиҳад.Таҳлили ACN-A як қатор қандҳои пентозаро аз DP 4-8 (расми 4) то DP 22 (расми S1) тасдиқ кард, ки вазнҳои онҳо ба олигосахаридҳои MeU-ксилан мувофиқат мекунанд.Таҳлили ACN-B силсилаи пентоз ва глюкоксиланро бо DP 8-15 тасдиқ кард.Дар маводи иловагӣ ба монанди расми S3, харитаҳои тақсимоти массаи кислотаи FA-C як қатор қандҳои пентозаи ивазшудаи (Me)U-ро бо DP аз 8-15 нишон медиҳанд, ки бо ксиланҳои ивазшавандае, ки дар скрининги mAb дар асоси ELISA пайдо шудаанд, мувофиқат мекунанд.Эпитопҳо мувофиқанд.
MALDI-MS спектри олигосахаридҳои ҳалшавандаи мутобиқатнашаванда, ки дар ACS мавҷуданд.Дар ин ҷо, (A) ACN-A фраксияҳои диапазони камвазн доранд, ки дорои кислотаи метилонидашуда (DP 4-8) олигосахаридҳои глюкуроксилан ва (B) ACN-B ксилан ва олигосахаридҳои кислотаи метилонидашуда бо глюкуроксилан (DP 8-15) иваз карда шудаанд.
Таҳлили таркиби боқимондаи гликани олигосахаридҳои ба оташ тобовар.Дар ин ҷо (A) таркиби сахариди TMS аз фраксияҳои гуногуни олигосахаридҳо, ки бо истифода аз таҳлили GC-MS ба даст оварда шудаанд.(B) Сохторҳои қандҳои гуногуни аз TMS ҳосилшуда дар олигосахаридҳо мавҷуданд.ACN - фраксияи ацетонитрилии дорои олигосахаридҳои нейтралӣ ва FA - фраксияи кислотаи ферулӣ, ки олигосахаридҳои кислота доранд.
Хулосаи дигари ҷолиб аз таҳлили LC-MS фраксияи олигосахаридҳо, тавре ки дар расми S9 нишон дода шудааст, бароварда шуд (усулҳоро дар маводи иловагии электронӣ дидан мумкин аст).Ҳангоми пайваст кардани фраксияи ACN-B пораҳои гурӯҳҳои гексоза ва -OAc борҳо мушоҳида карда шуданд.Ин бозёфт на танҳо фрагментатсияро, ки дар таҳлили гликом ва MALDI-TOF мушоҳида мешавад, тасдиқ мекунад, балки инчунин маълумоти навро дар бораи ҳосилаҳои эҳтимолии карбогидратҳо дар биомассаи қаблан коркардшудаи лигноселлюлозӣ медиҳад.
Мо инчунин таркиби қанди фраксияи олигосахаридро бо истифода аз ҳосилкунии шакар TMS таҳлил кардем.Бо истифода аз GC-MS мо таркиби қандҳои асабӣ (ғайри ҳосилшуда) ва кислотаи қанд (GluA ва GalA) дар фраксияи олигосахаридҳоро муайян кардем (расми 5).Кислотаи глюкурон дар ҷузъҳои кислотаи C ва D мавҷуд аст, дар ҳоле ки кислотаи галактурон дар ҷузъҳои кислотаи А ва В мавҷуд аст, ки ҳардуи онҳо ҷузъҳои баланди DP-и қанди кислота мебошанд.Ин натиҷаҳо на танҳо маълумоти ELISA ва MALDI-и моро тасдиқ мекунанд, балки инчунин ба таҳқиқоти қаблии мо оид ба ҷамъшавии олигосахаридҳо мувофиқанд.Аз ин рӯ, мо боварӣ дорем, ки усулҳои муосири иммунологӣ бо истифода аз биотинилизатсияи олигосахаридҳо ва скрининги минбаъдаи ELISA барои ошкор кардани олигосахаридҳои ҳалшавандаи рекалцитрант дар намунаҳои гуногуни биологӣ кофӣ мебошанд.
Азбаски усулҳои скрининги mAb дар асоси ELISA бо якчанд усулҳои гуногун тасдиқ карда шудаанд, мо мехостем минбаъд потенсиали ин усули нави миқдорӣро таҳқиқ кунем.Ду олигосахариди тиҷоратӣ, олигосахариди ксилогексасахарид (XHE) ва 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX) бо истифода аз равиши нави mAb, ки ба гликани девори ҳуҷайра нигаронида шудааст, харидорӣ ва озмуда шуданд.Дар расми 6 таносуби хаттии байни сигнали ҳатмии биотинӣ ва консентратсияи логи консентратсияи олигосахаридҳо нишон дода шудааст, ки модели эҳтимолии адсорбсияи Лангмюрро пешниҳод мекунад.Дар байни mAbҳо, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ва CCRC-M151 бо XHE алоқаманданд ва CCRC-M108, CCRC-M109 ва LM11 бо A2XXnm дар доираи на10 то на10 мутақобила доранд.Аз сабаби маҳдуд будани мавҷудияти антитело дар давоми таҷриба, таҷрибаҳои маҳдуд бо ҳар як консентратсияи олигосахаридҳо гузаронида шуданд.Дар ин ҷо бояд қайд кард, ки баъзе антителоҳо ба як олигосахарид ҳамчун субстрат хеле гуногун муносибат мекунанд, эҳтимолан аз он сабаб, ки онҳо ба эпитопҳои каме гуногун пайваст мешаванд ва метавонанд наздикии хеле гуногун дошта бошанд.Механизмҳо ва оқибатҳои мушаххаскунии дақиқи эпитопҳо ҳангоми татбиқи равиши нави mAb ба намунаҳои воқеӣ хеле мураккабтар хоҳанд шуд.
Ду олигосахаридҳои тиҷоратӣ барои муайян кардани диапазони муайянкунии мАбҳои гуногуни гликанӣ истифода шуданд.Дар ин ҷо, таносуби хатӣ бо консентратсияи логи консентратсияи олигосахаридҳо намунаҳои адсорбсияи Лангмюрро барои (A) XHE бо mAb ва (B) A2XX бо mAb нишон медиҳанд.Эпитопҳои мувофиқ сохторҳои олигосахаридҳои тиҷоратиро нишон медиҳанд, ки ҳамчун субстрат дар таҳлил истифода мешаванд.
Истифодаи антителоҳои моноклоналии ба гликан нигаронидашуда (таҳлили гликокомӣ ё скрининги mAb дар асоси ELISA) як воситаи пурқувват барои тавсифи амиқи аксари гликанҳои асосии девори ҳуҷайра, ки биомассаи растанӣ мебошанд.Бо вуҷуди ин, таҳлили классикии гликан танҳо гликанҳои калонтари девори ҳуҷайраро тавсиф мекунад, зеро аксари олигосахаридҳо дар плитаҳои ELISA ба таври муассир иммобилизатсия намешаванд.Дар ин тадқиқот, ҷуворимакка бо AFEX пеш аз коркардшуда бо миқдори зиёди моддаҳои сахт ба таври ферментативӣ гидролиз карда шуд.Таҳлили қанд барои муайян кардани таркиби карбогидратҳои девори ҳуҷайра дар гидролизат истифода шуд.Бо вуҷуди ин, таҳлили mAb-и олигосахаридҳои хурдтар дар гидролизатҳо нодида гирифта мешавад ва барои ба таври муассир immobilizing олигосахаридҳо дар плитаҳои ELISA асбобҳои иловагӣ лозиманд.
Мо дар ин ҷо як усули нав ва самараноки иммобилизатсияи олигосахаридҳоро барои скрининги mAb тавассути омезиши биотинилизатсияи олигосахаридҳо ва пас аз скрининги ELISA дар плитаҳои пӯшидаи NeutrAvidin ™ гузориш медиҳем.Олигосахаридҳои иммобилизатсияшудаи биотинилшуда ба антитело наздикии кофӣ нишон доданд, то имкон диҳад, ки олигосахаридҳои рекалцитрант зуд ва самаранок муайян карда шаванд.Таҳлили таркиби ин олигосахаридҳои якрав дар асоси масс-спектрометрия натиҷаҳои ин равиши навро ба иммуноскринг тасдиқ кард.Ҳамин тариқ, ин тадқиқотҳо нишон медиҳанд, ки омезиши биотинилизатсияи олигосахаридҳо ва скрининги ELISA бо антиденаҳои моноклоналии ба гликан мақсаднок барои муайян кардани пайвандҳо дар олигосахаридҳо истифода мешаванд ва метавонанд дар дигар таҳқиқоти биохимиявӣ, ки сохтори олигосахаридҳоро тавсиф мекунанд, васеъ истифода шаванд.
Ин усули профилактикаи гликан ба биотин асосёфта аввалин гузоришест, ки қодир аст пайвандҳои карбогидратҳои беэътиноии олигосахаридҳои ҳалшавандаро дар биомассаи растанӣ таҳқиқ кунад.Ин барои фаҳмидани он, ки чаро баъзе қисмҳои биомасса ҳангоми истеҳсоли сӯзишвории биологӣ ин қадар якраванд.Ин усул холигии муҳимро дар усулҳои таҳлили гликом пур мекунад ва татбиқи онро ба доираи васеътари субстратҳо берун аз олигосахаридҳои растанӣ васеъ мекунад.Дар оянда, мо метавонем робототехникаро барои биотинилизатсия истифода барем ва усули таҳиякардаамонро барои таҳлили баландсуръати намунаҳо бо истифода аз ELISA истифода барем.
Кохи ҷуворимакка (CS), ки аз тухмиҳои гибридии Pioneer 33A14 парвариш карда шудааст, дар соли 2010 аз Фермаҳои Крамер дар Рей, Колорадо ҷамъоварӣ карда шуд.Бо ичозати сохиби замин ин биомассаро барои тадкикот истифода бурдан мумкин аст. Намунаҳо дар халтаҳои қуфл дар ҳарорати хонагӣ бо намии хушк <6% нигоҳ дошта шуданд. Намунаҳо дар халтаҳои қуфл дар ҳарорати хонагӣ бо намии хушк <6% нигоҳ дошта шуданд. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае. Намунаҳо хушк дар <6% намӣ дар халтаҳои зипердор дар ҳарорати хонагӣ нигоҳ дошта шуданд.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией барои комнатной ҳароратие бо влажностью < 6%. Намунаҳо дар халтаҳои зипер дар ҳарорати хонагӣ бо намӣ <6% нигоҳ дошта мешаванд.Таҳқиқот ба дастурҳои маҳаллӣ ва миллӣ мувофиқат кард.Таҳлили таркибӣ бо истифода аз протоколи NREL анҷом дода шуд.Маълум шуд, ки дар таркиб 31,4% глюкан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% сафеда ва 13,4% хокистар мавҷуд аст.
Cellic® CTec2 (138 мг протеин/мл, лот VCNI 0001) омехтаи мураккаби целлюлаза, β-глюкозидаза ва Cellic® HTec2 (157 мг протеин/мл, лот VHN00001) аз Novozymes (Franklinton, NC, ИМА) мебошад.Multifect Pectinase® (72 мг протеин/мл), омехтаи мураккаби ферментҳои таназзулкунандаи пектин, аз ҷониби DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ИМА) тақдим шудааст.Консентратсияи протеинҳои ферментҳо тавассути ҳисоб кардани таркиби сафедаҳо (ва тарҳ кардани саҳми нитрогени ғайрипротеин) бо истифода аз таҳлили нитрогени Kjeldahl (методи AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ИМА) муайян карда шуданд.Замини диатомии 545 аз EMD Millipore (Billerica, MA) харида шудааст.Карбон фаъол (DARCO, 100 гранулҳои mesh), Avicel (PH-101), ксилан бук ва ҳама дигар кимиёвӣ аз Sigma-Oldrich (Сент-Луис, МО) харида шудаанд.
Табобати пешакии AFEX дар GLBRC (Лабораторияи тадқиқоти конверсионии биомасса, MSU, Lansing, MI, ИМА) анҷом дода шуд.Пеш аз табобат дар 140 ° C. барои 15 дақиқа гузаронида шуд.46 вақти иқомат дар таносуби 1:1 аммиаки обӣ ба биомасса дар 60% (в/в) боркунӣ дар реактори партияи аз пӯлоди зангногир (Parr Instruments Company).30 дақиқа вақт гирифт.Реакторро ба 140°С расонданд ва аммиакро зуд озод карданд, ки ин имкон дод, ки биомасса зуд ба ҳарорати хонагӣ баргардад.Таркиби печи ҷуворимаккаи қаблан коркардшудаи AFEX (ACS) ба таркиби ҷуворимаккаи коркарднашуда (UT-CS) монанд буд.
Маводи сахти баланди ACSH 25% (w/w) (тақрибан 8% боркунии декстран) ҳамчун маводи ибтидоӣ барои истеҳсоли миқёси калони олигосахаридҳо омода карда шуд.Гидролизи ферментативии ACS бо истифода аз омехтаи ферментҳои тиҷоратӣ, аз ҷумла Cellic® Ctec2 10 мг протеин/г глюкан (дар биомассаи пешакӣ коркардшуда), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг протеин/г глюкан ва Multifect Pectinase (Genecor Inc, ИМА) гузаронида шуд.).), 5 мг протеин/г декстран.Гидролизи ферментативӣ дар биореактори 5 литрӣ бо ҳаҷми кории 3 литр, рН 4,8, 50°С ва 250 чархзанӣ гузаронида шуд.Пас аз гидролиз дар давоми 96 соат, гидролизат бо центрифуга дар 6000 чархзанӣ барои 30 дақиқа ва сипас дар 14000 чархзанӣ барои 30 дақиқа барои хориҷ кардани моддаҳои сахти гидролизнашуда ҷамъоварӣ карда шуд.Пас аз он, гидролизат тавассути шишаи филтри 0,22 мм ба филтратсияи безарар гузаронида шуд.Гидролизати филтршуда дар шишаҳои стерилизатсияшуда дар ҳарорати 4 ° C нигоҳ дошта шуд ва сипас ба карбон тақсим карда шуд.
Таҳлили таркиби намунаҳои биомассаи экстрактӣ тибқи тартиби таҳлили лаборатории NREL: омода кардани намунаҳо барои таҳлили таркиб (NREL/TP-510-42620) ва муайян кардани карбогидратҳои сохторӣ ва лигнин дар биомасса (NREL/TP-510 – 42618)47.
Таҳлили олигосахаридҳои ҷараёни гидролизат дар миқёси 2 мл бо истифода аз усули гидролизи кислотаи автоклавӣ гузаронида шуд.Намунаи гидролизатро бо 69,7 мкл кислотаи сулфати 72% дар найчаи парвариши винтдори 10 мл омехта кунед ва 1 соат дар болои мизи корӣ дар ҳарорати 121 °C инкубатсия кунед, дар ях хунук кунед ва ба шишаи хроматографияи моеъи баландсифат (HPLC) филтр кунед.Консентратсияи олигосахаридҳо бо роҳи тарҳ кардани консентратсияи моносахаридҳо дар намунаи гидролизнашуда аз консентратсияи умумии шакар дар намунаи бо кислотаи гидролизшуда муайян карда шуд.
Консентратсияи глюкоза, ксилоза ва арабиноза дар биомассаи гидролизшудаи кислота бо истифода аз системаи Shimadzu HPLC муҷаҳҳаз бо намунаи автоматӣ, гармкунаки сутун, насоси изократикӣ ва детектори шохиси шикаста дар сутуни Bio-Rad Aminex HPX-87H таҳлил карда шуд.Сутун дар 50°С нигоҳ дошта шуд ва бо 0,6 мл/дақ 5 мм H2SO4 дар об элюта карда шуд.ҷараён.
Гидролизати супернатант обшуда ва барои таркиби мономер ва олигосахаридҳо таҳлил карда шуд.Қанди мономерии пас аз гидролизи ферментӣ ба даст овардашуда аз ҷониби HPLC, ки бо сутуни Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ва сутуни муҳофизаткунандаи хокистар муҷаҳҳаз шудааст, таҳлил карда шуд.Ҳарорати сутун дар 80 ° C нигоҳ дошта шуд, об ҳамчун марҳилаи мобилӣ бо суръати 0,6 мл / дақиқа истифода шуд.Олигосахаридҳо бо роҳи гидролиз дар кислотаи моеъ дар 121°C мувофиқи усулҳои дар refs тавсифшуда муайян карда шуданд.41, 48, 49.
Таҳлили сахаридҳо дар ашёи хом, AFEX пешакӣ коркардшуда ва ҳама пасмондаҳои биомассаи гидролизнашуда (аз ҷумла истеҳсоли иқтибосҳои девори ҳуҷайраҳои силсилавӣ ва скрининги mAb онҳо) бо истифода аз расмиёти қаблан тавсифшуда 27, 43, 50, 51 гузаронида шуд.Барои таҳлили гликом, пасмондаҳои бо спирт ҳалнашавандаи маводи девори ҳуҷайраи растанӣ аз пасмондаҳои биомасса омода карда мешаванд ва ба истихроҷи пайдарпай бо реагентҳои торафт хашмгин ба монанди оксалати аммоний (50 мМ), карбонати натрий (50 мм ва 0,5% в/в), КОН.(1М ва 4М, ҳарду бо 1% боргидриди натрий) ва хлорити кислота, тавре ки қаблан тавсиф шудааст52,53.Пас аз он истихроҷҳо ба ELISA бар зидди панели мураккаби mAb50s, ки ба гликани девори ҳуҷайра равона карда шудаанд, гузаронида шуданд ва реаксияҳои пайвастшавии mAb ҳамчун харитаи гармӣ пешниҳод карда шуданд.mAbs, ки ба гликани девори ҳуҷайраи растанӣ нигаронида шудаанд, аз захираҳои лабораторӣ (силсилаи CCRC, JIM ва MAC) харида шуданд.
Биотинизатсияи як қадами олигосахаридҳо.Конъюгацияи карбогидратҳо бо биотин-LC-гидразид бо истифода аз тартиби зерин анҷом дода шуд.Биотин-ЛК-гидразид (4,6 мг/12 мкмоль) дар диметилсулфоксиди (DMSO, 70 мкл) тавассути омехтаи шадид ва гармкунӣ дар 65°С барои 1 дақиқа гудохта шуд.Кислотаи сиркоии пиряхӣ (30 мкл) илова карда шуд ва омехта ба цианоборогидриди натрий (6,4 мг/100 мкмоль) рехта шуд ва пас аз гарм кардани 65°С тақрибан 1 дақиқа пурра гудохта шуд.Сипас, аз 5 то 8 мкл омехтаи реаксия ба олигосахариди хушкшуда (1-100 нмол) илова карда шуд, то 10 маротиба ё бештар аз молярии тамғаро аз нуги коҳишдиҳанда ба даст орад.Реаксия дар 65°С барои 2 соат гузаронида шуд ва баъд аз он намунаҳо фавран тоза карда шуданд.Дар таҷрибаҳои тамғагузорӣ бидуни коҳиш цианоборогидриди натрий истифода нашудааст ва намунаҳо дар 65°С дар давоми 2,5 соат реаксия карда шуданд.
Пӯшидани ELISA ва шустани намунаҳои олигосахаридҳои биотинилшуда.25 мкл намунаҳои биотинӣ (100 мкл аз ҳар як намунаи консентратшуда дар 5 мл маҳлули буферии 0,1 М Tris (TBS) маҳлул карда шудаанд) ба ҳар як чоҳи лавҳаи бо авидин пӯшонидашуда илова карда шуданд.Чоҳҳои назоратӣ бо 50 мкл биотин дар консентратсияи 10 мкг/мл дар 0,1 M TBS пӯшонида шуданд.Оби деионизатсияшуда ҳамчун рӯйпӯш барои андозагирии холӣ истифода мешуд.Таблет барои 2 соат дар ҳарорати хонагӣ дар торикӣ инкубатсия карда шуд.Табақро 3 маротиба бо шири 0,1%-и равған дар 0,1 M TBS бо истифода аз барномаи №.11 барои Grenier flat 3A.
Илова ва шустани антителоҳои ибтидоӣ.Ба ҳар як чоҳ 40 мкл антителоҳои ибтидоӣ илова кунед.Микропластаро барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ дар торикӣ инкубатсия кунед.Пас аз он табақҳо 3 маротиба бо шири 0,1% дар 0,1M TBS бо истифода аз барномаи шустани №11 барои Grenier Flat 3A шуста шуданд.
Антителоҳои дуюмдараҷаро илова кунед ва бишӯед.Ба ҳар як чоҳ 50 мкл антитело дуюмдараҷаи муш/каламуш илова кунед (1:5000 дар 0,1% шир дар 0,1 M TBS омехта карда шудааст).Микропластаро барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ дар торикӣ инкубатсия кунед.Пас аз он микропластаҳо 5 маротиба бо шири 0,1% дар 0,1 М TBS бо истифода аз барномаи шустушӯи табақи Grenier Flat 5A №12 шуста шуданд.
Илова кардани субстрат.Ба субстрати асосӣ 50 мкл 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (TMB) илова кунед (бо илова кардани 2 қатра буфер, 3 қатра TMB, 2 қатра пероксиди гидроген ба 15 мл оби деионизатсияшуда).Заминаи TMB-ро омода кунед.ва гирдоби пеш аз истифода).Микроплитаро дар ҳарорати хонагӣ барои 30 дақиқа инкубатор кунед.Дар торикй.
Қадамро анҷом диҳед ва планшетро хонед.Ба ҳар як чоҳ 50 мкл кислотаи сулфати 1 Н илова кунед ва абсорбенсро аз 450 то 655 нм бо истифода аз хонандаи ELISA сабт кунед.
1 мг/мл маҳлулҳои ин таҳлилҳоро дар оби деионизатсияшуда тайёр кунед: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, кислотаи галактурон (ГалА), кислотаи глюкурон (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманнозамин (манНАклюкосамин), N-acetylmannosamine.(glcNAc), N-acetylgalaktosamine (galNAc), инозитол (стандарти дохилӣ).Ду стандарт бо илова кардани маҳлулҳои қанди 1 мг/мл, ки дар ҷадвали 1 нишон дода шудаанд, омода карда шуданд. Намунаҳо дар -80° С ях карда, лиофилизатсия карда мешаванд, то он даме, ки тамоми об хориҷ карда шавад (одатан тақрибан 12-18 соат).
100-500 мкг намунаро ба қубурҳои сарпӯш дар тавозуни таҳлилӣ илова кунед.Маблағи иловашударо сабт кунед.Беҳтар аст, ки намунаро дар консентратсияи мушаххаси ҳалкунанда ҳал кунед ва онро ба қубур ҳамчун аликвоти моеъ илова кунед.20 мкл 1 мг/мл инозитолро ҳамчун стандарти дохилӣ барои ҳар як найчаи намуна истифода баред.Миқдори стандарти дохилии ба намуна иловашуда бояд ба андозаи стандарти дохилии ба найчаи стандартӣ иловашуда баробар бошад.
Ба шишаи сарпӯши буранда 8 мл метанолро илова кунед.Баъд 4 мл махлули 3 Н.-и метанолик HCl cap карда, ба ларза андохта мешавад.Дар ин раванд об истифода намешавад.
Ба намунаҳои олигосахаридҳо ва қубурҳои стандартии TMS 500 мкл маҳлули метаноли 1 М HCl илова кунед.Намунаҳо шабона (168 соат) дар 80°С дар блоки гармидиҳӣ инкубатсия карда шуданд.Маҳсулоти метанолизро дар ҳарорати хонагӣ бо истифода аз коллекторҳои хушккунӣ хушк кунед.200 мкл MeOH илова кунед ва боз хушк кунед.Ин раванд ду маротиба такрор карда мешавад.Ба намуна 200 мкл метанол, 100 мкл пиридин ва 100 мкл ангидриди уксус илова кунед ва хуб омехта кунед.Намунаҳо дар ҳарорати хонагӣ барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуданд.ва хушк.200 мкл метанол илова кунед ва боз хушк кунед.
200 мкл Tri-Sil илова кунед ва найчаи сарпӯшро барои 20 дақиқа гарм кунед.80 ° C, сипас ба ҳарорати хонагӣ хунук карда мешавад.Барои минбаъд хушк кардани намуна ба ҳаҷми тақрибан 50 мкл аз коллекторҳои хушккунӣ истифода баред.Бояд гуфт, ки мо ба пурра хушк шудани намунахо рох надодем.
2 мл гексан илова кунед ва бо гардиш хуб омехта кунед.Нӯги пипеткаҳои Пастерро (5-8 мм) бо як порчаи пашми шишагӣ бо гузоштани пашми шишагӣ ба болои пипеткаи диаметри 5-3/4 дюйм пур кунед.Намунаҳо дар 3000 г барои 2 дақиқа центрифуга карда шуданд.Ҳама гуна пасмондаҳои ҳалнашаванда боришот мешаванд.Намунаро то 100-150 мкл хушк кунед.Ҳаҷми тақрибан 1 мкл ба GC-MS дар ҳарорати ибтидоии 80 °C ва вақти ибтидоии 2,0 дақиқа ворид карда шуд (Ҷадвали 2).