Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Nové imunologické a hmotnostně spektrometrické metody pro komplexní analýzu persistentních oligosacharidů v kukuřičném stonku předem ošetřeném AFEXem.Lignocelulózová biomasa je udržitelnou alternativou k fosilním palivům a široce se používá k vývoji biotechnologií pro výrobu produktů, jako jsou potraviny, krmiva, paliva a chemikálie.Klíčem k těmto technologiím je vývoj nákladově konkurenceschopných procesů pro přeměnu komplexních sacharidů přítomných ve stěnách rostlinných buněk na jednoduché cukry, jako je glukóza, xylóza a arabinóza.Protože lignocelulózová biomasa je velmi houževnatá, musí být podrobena termochemickým úpravám (např. exfoliace amoniakových vláken (AFEX), zředěné kyseliny (DA), iontové kapaliny (IL)) a biologickým úpravám (např. enzymatická hydrolýza a mikrobiální fermentace), aby se získal požadovaný produkt..Když se však v procesu hydrolýzy použijí komerční houbové enzymy, pouze 75-85 % vytvořených rozpustných cukrů jsou monosacharidy a zbývajících 15-25 % jsou rozpustné, nepoddajné oligosacharidy, které nejsou vždy dostupné mikroorganismům.Dříve jsme úspěšně izolovali a purifikovali rozpustné tvrdohlavé oligosacharidy pomocí kombinace separace uhlíku a křemeliny a gelové chromatografie a také jsme zkoumali jejich inhibiční vlastnosti na enzymy.Zjistili jsme, že oligosacharidy obsahující vyšší stupeň polymerace (DP) methylované substituce uronové kyseliny jsou obtížněji zpracovatelné komerčními enzymovými směsmi než oligosacharidy s nízkým DP a neutrální oligosacharidy.Zde uvádíme použití několika dalších metod, včetně profilování glykanů pomocí monoklonálních protilátek (mAb) specifických pro glykany rostlinné biomasy k charakterizaci glykanových vazeb v rostlinných buněčných stěnách a enzymatických hydrolyzátech, ionizaci laserovou desorpcí za pomoci matrice, hmotnostní spektrometrii s časem letu..MALDI-TOF-MS) využívá strukturně informativní diagnostické píky získané spektroskopií po sekundárním rozpadu záporných iontů, plynovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií (GC-MS) k charakterizaci oligosacharidových vazeb s derivatizací a bez ní.Vzhledem k malé velikosti oligosacharidů (DP 4–20) je obtížné tyto molekuly použít pro vazbu a charakterizaci mAb.K překonání tohoto problému jsme použili novou metodu imobilizace oligosacharidů na bázi biotinové konjugace, která úspěšně označila většinu rozpustných oligosacharidů s nízkým DP na povrchu mikrodestičky, která byla poté použita ve vysoce výkonném systému mAb pro specifickou ligační analýzu.Tato nová metoda v budoucnu usnadní vývoj pokročilejších vysoce výkonných glykomových testů, které lze použít k izolaci a charakterizaci oligosacharidů přítomných v biomarkerech pro diagnostické účely.
Lignocelulózová biomasa, složená ze zemědělských, lesnických, travních a dřevitých materiálů, je potenciální surovinou pro výrobu biologických produktů, včetně potravin, krmiv, paliv a chemických prekurzorů pro výrobu produktů s vyšší hodnotou1.Sacharidy (jako je celulóza a hemicelulóza) přítomné ve stěnách rostlinných buněk jsou depolymerizovány na monosacharidy chemickým zpracováním a biotransformací (jako je enzymatická hydrolýza a mikrobiální fermentace).Mezi běžné předúpravy patří expanze amoniakových vláken (AFEX), zředěná kyselina (DA), iontová kapalina (IL) a exploze páry (SE), které využívají kombinaci chemikálií a tepla ke snížení produkce lignocelulózy otevřením stěn rostlinných buněk3,4.tvrdohlavost hmoty, 5. Enzymatická hydrolýza se provádí při vysokém zatížení pevnými látkami pomocí komerčních aktivních enzymů obsahujících sacharidy (CAZymes) a mikrobiální fermentace pomocí transgenních kvasinek nebo bakterií k výrobě biopaliv a chemikálií 6 .
CAZymy v komerčních enzymech jsou složeny z komplexní směsi enzymů, které synergicky štěpí komplexní vazby sacharid-cukr za vzniku monosacharidů2,7.Jak jsme uvedli dříve, složitá síť aromatických polymerů ligninu se sacharidy je činí vysoce nepoddajnými, což vede k neúplné přeměně cukrů a hromadí 15–25 % pohlavních oligosacharidů, které nevznikají během enzymatické hydrolýzy předupravené biomasy.To je běžný problém různých metod předúpravy biomasy.Některé důvody pro toto úzké hrdlo zahrnují inhibici enzymů během hydrolýzy nebo nepřítomnost nebo nízké hladiny nezbytných esenciálních enzymů, které jsou nutné k přerušení vazeb cukru v rostlinné biomase.Pochopení složení a strukturních charakteristik cukrů, jako jsou cukerné vazby v oligosacharidech, nám pomůže zlepšit konverzi cukru během hydrolýzy, díky čemuž budou biotechnologické procesy cenově konkurenceschopné s produkty získanými z ropy.
Stanovení struktury sacharidů je náročné a vyžaduje kombinaci metod, jako je kapalinová chromatografie (LC)11,12, nukleární magnetická rezonanční spektroskopie (NMR)13, kapilární elektroforéza (CE)14,15,16 a hmotnostní spektrometrie (MS)17.,osmnáct.MS metody, jako je hmotnostní spektrometrie s časem letu s laserovou desorpcí a ionizací pomocí matrice (MALDI-TOF-MS), jsou univerzální metodou pro identifikaci sacharidových struktur.V poslední době se k identifikaci otisků odpovídajících polohám připojení oligosacharidů, anomerním konfiguracím, sekvencím a pozicím větvení20,21 nejrozšířeněji používá tandemová MS aduktů sodíkových iontů Collision-Induced Disociation (CID).
Glykanová analýza je vynikajícím nástrojem pro hloubkovou identifikaci sacharidových vazeb22.Tato metoda používá monoklonální protilátky (mAb) zaměřené na glykan rostlinné buněčné stěny jako sondy pro pochopení komplexních sacharidových vazeb.Na celém světě je k dispozici více než 250 mAb navržených proti různým lineárním a rozvětveným oligosacharidům s použitím různých sacharidů24.Několik mAb bylo široce používáno k charakterizaci struktury, složení a modifikací rostlinné buněčné stěny, protože existují významné rozdíly v závislosti na typu rostlinné buňky, orgánu, věku, vývojovém stádiu a růstovém prostředí25,26.Nedávno byla tato metoda použita k pochopení populací vezikul v rostlinných a živočišných systémech a jejich příslušných rolí v transportu glykanu, jak je určeno subcelulárními markery, vývojovými stádii nebo environmentálními stimuly, a ke stanovení enzymatické aktivity.Některé z různých struktur glykanů a xylanů, které byly identifikovány, zahrnují pektin (P), xylan (X), manan (M), xyloglukany (XylG), glukany se smíšenou vazbou (MLG), arabinoxylan (ArbX), galaktomannan (GalG), kyselina glukuronová-arabinoxylan (GArbX) a2arabino-2arabino.
Navzdory všem těmto výzkumným snahám se však pouze několik studií zaměřilo na povahu akumulace oligosacharidů během hydrolýzy s vysokým obsahem pevných látek (HSL), včetně uvolňování oligosacharidů, změn délky oligomerních řetězců během hydrolýzy, různých polymerů s nízkým DP a jejich křivek.distribuce 30,31,32.Mezitím, ačkoli se analýza glykanu ukázala jako užitečný nástroj pro komplexní analýzu glykanové struktury, je obtížné hodnotit ve vodě rozpustné oligosacharidy s nízkým DP pomocí protilátkových metod.Menší DP oligosacharidy s molekulovou hmotností menší než 5-10 kDa se nevážou na ELISA destičky 33, 34 a jsou vymyty před přidáním protilátky.
Zde poprvé demonstrujeme test ELISA na destičkách potažených avidinem s použitím monoklonálních protilátek, kombinující jednokrokový biotinylační postup pro rozpustné refrakterní oligosacharidy s analýzou glykomu.Náš přístup k analýze glykomu byl ověřen analýzou komplementárních oligosacharidových vazeb na bázi MALDI-TOF-MS a GC-MS pomocí trimethylsilyl (TMS) derivatizace hydrolyzovaných cukerných kompozic.Tento inovativní přístup lze v budoucnu vyvinout jako vysoce výkonnou metodu a nalézt širší uplatnění v biomedicínském výzkumu35.
Posttranslační modifikace enzymů a protilátek, jako je glykosylace,36 ovlivňují jejich biologickou aktivitu.Například změny v glykosylaci sérových proteinů hrají důležitou roli u zánětlivé artritidy a změny v glykosylaci se používají jako diagnostické markery37.V literatuře bylo popsáno, že se různé glykany snadno objevují u různých onemocnění, včetně chronických zánětlivých onemocnění gastrointestinálního traktu a jater, virových infekcí, rakoviny vaječníků, prsu a prostaty38,39,40.Pochopení struktury glykanů pomocí metod glykanové ELISA na bázi protilátek poskytne další důvěru v diagnostiku onemocnění bez použití složitých metod MS.
Naše předchozí studie ukázala, že tvrdohlavé oligosacharidy zůstaly nehydrolyzované po předběžné úpravě a enzymatické hydrolýze (obrázek 1).V naší dříve publikované práci jsme vyvinuli metodu extrakce na pevné fázi aktivním uhlím k izolaci oligosacharidů z hydrolyzátu kukuřičných stonků (ACSH)8 předem upraveného AFEX.Po počáteční extrakci a separaci byly oligosacharidy dále frakcionovány vylučovací chromatografií (SEC) a shromážděny v pořadí podle molekulové hmotnosti.Cukrové monomery a oligomery uvolněné z různých předúprav byly analyzovány analýzou složení cukru.Při porovnávání obsahu cukerných oligomerů získaných různými metodami předúpravy je přítomnost tvrdohlavých oligosacharidů častým problémem při přeměně biomasy na monosacharidy a může vést ke snížení výtěžku cukru minimálně o 10-15 % a dokonce až o 18 %.NÁS.Tato metoda se používá pro další velkovýrobu oligosacharidových frakcí.Výsledný ACH a jeho následné frakce s různými molekulovými hmotnostmi byly použity jako experimentální materiál pro charakterizaci oligosacharidů v této práci.
Po předběžném zpracování a enzymatické hydrolýze zůstaly persistentní oligosacharidy nehydrolyzované.Zde (A) je metoda separace oligosacharidů, ve které jsou oligosacharidy izolovány z hydrolyzátu kukuřičných stonků (ACSH) předem zpracovaného AFEX pomocí náplně z aktivního uhlí a křemeliny;(B) Metoda separace oligosacharidů.Oligosacharidy byly dále separovány vylučovací chromatografií (SEC);(C) Sacharidové monomery a oligomery uvolněné z různých předúprav (zředěná kyselina: DA, iontová kapalina: IL a AFEX).Podmínky enzymatické hydrolýzy: vysoký obsah pevných látek 25 % (w/w) (přibližně 8 % obsah glukanu), 96 hodin hydrolýza, 20 mg/g komerčního enzymu (poměr Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) a (D) Cukrové monomery a oligomery glukózy, xylózy a arabinózy (předem kukuřičné soli AFEX uvolňované z AFEX Stovertree SACSAFEX).
Glykanová analýza se ukázala jako užitečný nástroj pro komplexní strukturní analýzu glykanů v extraktech izolovaných ze zbytků pevné biomasy.Ve vodě rozpustné sacharidy jsou však při použití této tradiční metody nedostatečně zastoupeny41, protože oligosacharidy s nízkou molekulovou hmotností se obtížně imobilizují na destičkách ELISA a jsou před přidáním protilátky vymyty.Proto byla pro vazbu a charakterizaci protilátky použita jednokroková biotinylační metoda k potažení rozpustných, nevyhovujících oligosacharidů na avidinem potažené ELISA destičky.Tato metoda byla testována za použití našeho dříve vyrobeného ACSH a frakce založené na její molekulové hmotnosti (nebo stupni polymerace, DP).Jednokroková biotinylace byla použita ke zvýšení vazebné afinity oligosacharidů přidáním biotin-LC-hydrazidu k redukujícímu konci sacharidu (obr. 2).V roztoku hemiacetalová skupina na redukujícím konci reaguje s hydrazidovou skupinou biotin-LC-hydrazidu za vzniku hydrazonové vazby.V přítomnosti redukčního činidla NaCNBH3 se hydrazonová vazba redukuje na stabilní biotinylovaný konečný produkt.S modifikací konce redukujícího cukr bylo možné navázání oligosacharidů s nízkým DP na destičky ELISA a v naší studii to bylo provedeno na destičkách potažených avidinem s použitím mAb cílených na glykan.
Screening monoklonálních protilátek na základě ELISA na biotinylované oligosacharidy.Zde (A) kombinovaná biotinylace oligosacharidů a následný screening ELISA s glykanem cílenými mAb na destičkách potažených NeutrAvidinem a (B) ukazuje jednokrokový postup biotinylace reakčních produktů.
Destičky potažené avidinem s protilátkami konjugovanými s oligosacharidy byly poté přidány k primárním a sekundárním protilátkám a promyty v médiu citlivém na světlo a čas.Po dokončení vazby protilátky přidejte substrát TMB pro inkubaci destičky.Reakce byla nakonec zastavena kyselinou sírovou.Inkubované destičky byly analyzovány pomocí čtečky ELISA, aby se stanovila vazebná síla každé protilátky, aby se detekovalo zesítění specifické pro protilátku.Podrobnosti a parametry experimentu naleznete v odpovídající části „Materiály a metody“.
Využitelnost této nově vyvinuté metody pro specifické aplikace demonstrujeme charakterizací rozpustných oligosacharidů přítomných v ACSH i v surových a purifikovaných oligosacharidových frakcích izolovaných z lignocelulózových hydrolyzátů.Jak je znázorněno na obrázku 3, nejběžnější xylany substituované epitopem identifikované v ACSH pomocí metod stanovení bioacylovaného glykomu jsou obvykle uronové (U) nebo methyluronové (MeU) a pektické arabinogalaktany.Většina z nich byla také nalezena v naší předchozí studii o analýze glykanů nehydrolyzovaných pevných látek (UHS)43.
Detekce odolných oligosacharidových epitopů pomocí monoklonální protilátky zaměřené na glykan buněčné stěny.„Neutrální“ frakce je frakce ACN a „kyselá“ frakce je frakce FA.Jasnější červené na teplotní mapě znamenají vyšší obsah epitopu a světlejší modré značí prázdné pozadí.Hodnoty barev na stupnici jsou založeny na hrubých hodnotách OD pro formulace N=2.Hlavní epitopy rozpoznávané protilátkami jsou zobrazeny vpravo.
Tyto necelulózové struktury nemohly být štěpeny nejběžnějšími celulasami a hemicelulasami v testované komerční enzymové směsi, která zahrnuje nejběžněji používané komerční enzymy.Pro jejich hydrolýzu jsou proto zapotřebí nové pomocné enzymy.Bez nezbytných necelulózových pomocných enzymů tyto necelulózové vazby zabraňují úplné konverzi na monosacharidy, i když jsou jejich mateřské cukerné polymery extenzivně hydrolyzovány na kratší fragmenty a rozpuštěny za použití komerčních enzymových směsí.
Další studium distribuce signálu a jeho vazebné síly ukázalo, že vazebné epitopy byly nižší ve frakcích cukru s vysokým DP (A, B, C, DP do 20+) než ve frakcích s nízkým DP (D, E, F, DP) v dimerech) (obr. 1).Kyselé fragmenty jsou běžnější v necelulózových epitopech než neutrální fragmenty.Tyto jevy jsou v souladu se vzorem pozorovaným v naší předchozí studii, kde vysoké DP a kyselé skupiny byly odolnější vůči enzymatické hydrolýze.Proto přítomnost necelulózových glykanových epitopů a substitucí U a MeU může značně přispět ke stabilitě oligosacharidů.Je třeba poznamenat, že účinnost vazby a detekce může být problematická pro oligosacharidy s nízkým DP, zvláště pokud je epitopem dimerní nebo trimerní oligosacharid.To lze testovat pomocí komerčních oligosacharidů různých délek, z nichž každý obsahuje pouze jeden epitop, který se váže na specifickou mAb.
Použití strukturně specifických protilátek tedy odhalilo určité typy nepoddajných vazeb.V závislosti na typu použité protilátky, vhodném schématu ligace a síle signálu, který produkuje (nejčastější a nejméně hojný), lze identifikovat nové enzymy a semikvantitativně je přidat do směsi enzymů pro úplnější glykokonverzi.Vezmeme-li jako příklad analýzu ACSH oligosacharidů, můžeme vytvořit databázi glykanových vazeb pro každý materiál biomasy.Zde je třeba poznamenat, že je třeba vzít v úvahu rozdílnou afinitu protilátek, a pokud je jejich afinita neznámá, způsobí to určité potíže při porovnávání signálů různých protilátek.Kromě toho může srovnání glykanových vazeb nejlépe fungovat mezi vzorky pro stejnou protilátku.Tyto neústupné vazby lze poté propojit s databází CAZyme, ze které můžeme identifikovat enzymy, vybrat kandidátské enzymy a testovat enzymy narušující vazbu nebo vyvinout mikrobiální systémy pro expresi těchto enzymů pro použití v biorafinériích44.
Abychom vyhodnotili, jak imunologické metody doplňují alternativní metody pro charakterizaci nízkomolekulárních oligosacharidů přítomných v lignocelulózových hydrolyzátech, provedli jsme MALDI (obr. 4, S1-S8) a analýzu sacharidů odvozených z TMS na základě GC-MS na stejném panelu (obr. 5) oligosacharidové části.MALDI se používá k porovnání, zda hmotnostní distribuce molekul oligosacharidů odpovídá zamýšlené struktuře.Na Obr.4 ukazuje MC neutrálních složek ACN-A a ACN-B.Analýza ACN-A potvrdila řadu pentózových cukrů v rozmezí od DP 4–8 (obr. 4) do DP 22 (obr. S1), jejichž hmotnosti odpovídají MeU-xylanovým oligosacharidům.Analýza ACN-B potvrdila pentózovou a glukoxylanovou sérii s DP 8-15.V doplňkovém materiálu, jako je obrázek S3, mapy distribuce hmotnosti kyselé části FA-C ukazují rozsah (Me)U substituovaných pentózových cukrů s DP 8-15, které jsou konzistentní se substituovanými xylany nalezenými ve screeningu mAb na bázi ELISA.Epitopy jsou konzistentní.
MALDI-MS spektrum rozpustných nevyhovujících oligosacharidů přítomných v ACS.Zde (A) ACN-A frakce s nízkou hmotností obsahující methylovanou uronovou kyselinou (DP 4-8) substituované glukuroxylanové oligosacharidy a (B) ACN-B xylan a oligosacharidy methylované uronové kyseliny substituované glukuroxylanem (DP 8-15).
Analýza složení glykanového zbytku refrakterních oligosacharidů.Zde (A) TMS sacharidové složení různých oligosacharidových frakcí získané pomocí GC-MS analýzy.(B) Struktury různých cukrů odvozených od TMS přítomných v oligosacharidech.ACN – acetonitrilová frakce obsahující neutrální oligosacharidy a FA – frakce kyseliny ferulové obsahující kyselé oligosacharidy.
Další zajímavý závěr byl vyvozen z LC-MS analýzy oligosacharidové frakce, jak je ukázáno na obrázku S9 (metody lze vidět v elektronickém doplňkovém materiálu).Během ligace frakce ACN-B byly opakovaně pozorovány fragmenty hexózových a -OAc skupin.Toto zjištění nejen potvrzuje fragmentaci pozorovanou v analýze glykomu a MALDI-TOF, ale také poskytuje nové informace o potenciálních sacharidových derivátech v předupravené lignocelulózové biomase.
Také jsme analyzovali cukerné složení oligosacharidové frakce pomocí derivatizace TMS cukru.Pomocí GC-MS jsme stanovili složení neurálních (nederivátových) a kyselých cukrů (GluA a GalA) v oligosacharidové frakci (obr. 5).Kyselina glukuronová se nachází v kyselých složkách C a D, zatímco kyselina galakturonová se nachází v kyselých složkách A a B, přičemž obě jsou složkami kyselých cukrů s vysokým DP.Tyto výsledky nejen potvrzují naše údaje ELISA a MALDI, ale jsou také v souladu s našimi předchozími studiemi akumulace oligosacharidů.Proto se domníváme, že moderní imunologické metody využívající biotinylaci oligosacharidů a následný screening ELISA jsou dostatečné pro detekci rozpustných rekalcitrantních oligosacharidů v různých biologických vzorcích.
Protože screeningové metody mAb založené na ELISA byly ověřeny několika různými metodami, chtěli jsme dále prozkoumat potenciál této nové kvantitativní metody.Dva komerční oligosacharidy, xylohexasacharidový oligosacharid (XHE) a 23-a-L-arabinofuranosyl-xylotrióza (A2XX), byly zakoupeny a testovány pomocí nového přístupu mAb zaměřeného na glykan buněčné stěny.Obrázek 6 ukazuje lineární korelaci mezi biotinylovaným vazebným signálem a logaritmickou koncentrací koncentrace oligosacharidů, což naznačuje možný Langmuirův adsorpční model.Mezi mAb korelovaly CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 a CCRC-M151 s XHE a CCRC-M108, CCRC-M109 a LM11 korelovaly s A2XX v rozsahu 11001 nmVzhledem k omezené dostupnosti protilátek během experimentu byly provedeny omezené experimenty s každou koncentrací oligosacharidu.Zde je třeba poznamenat, že některé protilátky reagují velmi odlišně na stejný oligosacharid jako substrát, pravděpodobně proto, že se vážou na mírně odlišné epitopy a mohou mít velmi odlišné vazebné afinity.Mechanismy a důsledky přesné identifikace epitopu budou mnohem složitější, když se nový přístup mAb použije na skutečné vzorky.
Ke stanovení rozsahu detekce různých mAb zacílených na glykan byly použity dva komerční oligosacharidy.Zde lineární korelace s log koncentrace oligosacharidové koncentrace ukazují Langmuirovy adsorpční profily pro (A) XHE s mAb a (B) A2XX s mAb.Odpovídající epitopy označují struktury komerčních oligosacharidů použitých jako substráty v testu.
Použití monoklonálních protilátek cílených na glykan (glykokomická analýza nebo mAb screening založený na ELISA) je mocným nástrojem pro hloubkovou charakterizaci většiny hlavních glykanů buněčné stěny, které tvoří rostlinnou biomasu.Klasická glykanová analýza však charakterizuje pouze glykany větší buněčné stěny, protože většina oligosacharidů není účinně imobilizována na destičkách ELISA.V této studii byly kukuřičné stonky předem upravené AFEX enzymaticky hydrolyzovány při vysokém obsahu pevných látek.Pro stanovení složení sacharidů nepoddajných buněčných stěn v hydrolyzátu byla použita analýza cukru.Analýza mAb menších oligosacharidů v hydrolyzátech je však podceňována a pro účinnou imobilizaci oligosacharidů na destičkách ELISA jsou zapotřebí další nástroje.
Uvádíme zde nový a účinný způsob imobilizace oligosacharidů pro screening mAb kombinací biotinylace oligosacharidů s následným screeningem ELISA na destičkách potažených NeutrAvidinem™.Imobilizované biotinylované oligosacharidy vykazovaly dostatečnou afinitu pro protilátku, aby umožnily rychlou a účinnou detekci vzdorujících oligosacharidů.Analýza složení těchto nepoddajných oligosacharidů založená na hmotnostní spektrometrii potvrdila výsledky tohoto nového přístupu k imunoscreeningu.Tyto studie tedy demonstrují, že kombinace biotinylace oligosacharidů a ELISA screeningu s monoklonálními protilátkami cílenými na glykan může být použita k detekci zesítění v oligosacharidech a může být široce aplikována v jiných biochemických studiích charakterizujících strukturu oligosacharidů.
Tato metoda profilování glykanu založená na biotinu je první zprávou schopnou zkoumat nepoddajné sacharidové vazby rozpustných oligosacharidů v rostlinné biomase.To pomáhá pochopit, proč jsou některé části biomasy tak tvrdohlavé, pokud jde o výrobu biopaliv.Tato metoda vyplňuje důležitou mezeru v metodách analýzy glykomu a rozšiřuje její použití na širší škálu substrátů mimo rostlinné oligosacharidy.V budoucnu možná využijeme robotiku pro biotinylaci a využijeme námi vyvinutou metodu pro vysoce výkonnou analýzu vzorků pomocí ELISA.
Kukuřičná sláma (CS) vypěstovaná z hybridních semen Pioneer 33A14 byla sklizena v roce 2010 z Kramer Farms v Ray, Colorado.Se svolením vlastníka pozemku lze tuto biomasu využít k výzkumu. Vzorky byly skladovány suché < 6 % vlhkosti v sáčcích na zip při pokojové teplotě. Vzorky byly skladovány suché < 6 % vlhkosti v sáčcích na zip při pokojové teplotě. Образцы хранились сухими при влажности < 6 % v пакетах с застежкой-молнией прейтранеку Vzorky byly skladovány v suchu při <6% vlhkosti v sáčcích se zipem při teplotě místnosti.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре <6%. с влажно Vzorky jsou skladovány v sáčcích na zip při pokojové teplotě s vlhkostí < 6 %.Studie byla v souladu s místními a národními směrnicemi.Kompoziční analýza byla provedena pomocí protokolu NREL.Bylo zjištěno, že kompozice obsahuje 31,4 % glukanu, 18,7 % xylanu, 3,3 % arabinanu, 1,2 % galaktanu, 2,2 % acetylu, 14,3 % ligninu, 1,7 % proteinu a 13,4 % popela.
Cellic® CTec2 (138 mg proteinu/ml, šarže VCNI 0001) je komplexní směs celulázy, β-glukosidázy a Cellic® HTec2 (157 mg proteinu/ml, šarže VHN00001) od Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg proteinu/ml), komplexní směs enzymů degradujících pektin, byla darována společností DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Koncentrace enzymových proteinů byly stanoveny odhadem obsahu proteinu (a odečtením příspěvku neproteinového dusíku) pomocí Kjeldahlovy dusíkové analýzy (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Křemelina 545 byla zakoupena od EMD Millipore (Billerica, MA).Aktivní uhlí (DARCO, 100 mesh granule), Avicel (PH-101), bukový xylan a všechny ostatní chemikálie byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Předúprava AFEX byla provedena v GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Předúprava byla prováděna při 140 °C po dobu 15 minut.46 doba zdržení v poměru 1:1 bezvodého amoniaku k biomase při 60 % (hmotn./hmotn.) plnění v nerezovém stolním vsádkovém reaktoru (Parr Instruments Company).Trvalo to 30 minut.Reaktor byl přiveden na 140 °C a amoniak se rychle uvolnil, což umožnilo biomase rychle se vrátit na teplotu místnosti.Složení kukuřičných stonků předupravených AFEX (ACS) bylo podobné jako u neošetřených stonků kukuřičných (UT-CS).
Jako výchozí materiál pro výrobu oligosacharidů ve velkém měřítku byl připraven ACSH s vysokým obsahem pevných látek 25 % (hmotn./hmotn.) (přibližně 8 % dextranu).Enzymatická hydrolýza ACS byla provedena za použití komerční enzymové směsi zahrnující Cellic® Ctec2 10 mg proteinu/g glukanu (v předupravené biomase), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteinu/g glukanu a Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg proteinu/g dextranu.Enzymatická hydrolýza byla prováděna v 5-litrovém bioreaktoru s pracovním objemem 3 litry, pH 4,8, 50 °C a 250 ot./min.Po hydrolýze po dobu 96 hodin byl hydrolyzát shromážděn odstředěním při 6000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut a poté při 14000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut, aby se odstranily nehydrolyzované pevné látky.Hydrolyzát byl poté podroben sterilní filtraci přes 0,22 mm filtrační kádinku.Filtrovaný hydrolyzát se skladoval ve sterilních lahvích při 4 °C a potom se frakcionoval na uhlí.
Analýza složení vzorků biomasy na bázi extraktu podle postupů laboratorní analýzy NREL: příprava vzorků pro analýzu složení (NREL/TP-510-42620) a stanovení strukturních sacharidů a ligninu v biomase (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosacharidová analýza proudu hydrolyzátu byla provedena v měřítku 2 ml za použití metody kyselé hydrolýzy na bázi autoklávu.Smíchejte vzorek hydrolyzátu s 69,7 µl 72% kyseliny sírové v 10ml kultivační zkumavce se šroubovacím uzávěrem a inkubujte 1 hodinu na pracovním stole při 121 °C, ochlaďte na ledu a přefiltrujte do lahvičky pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC).Koncentrace oligosacharidů byla stanovena odečtením koncentrace monosacharidů v nehydrolyzovaném vzorku od celkové koncentrace cukru ve vzorku hydrolyzovaném kyselinou.
Koncentrace glukózy, xylózy a arabinózy v biomase hydrolyzované kyselinou byly analyzovány pomocí systému Shimadzu HPLC vybaveného automatickým vzorkovačem, ohřívačem kolony, izokratickou pumpou a detektorem indexu lomu na koloně Bio-Rad Aminex HPX-87H.Kolona byla udržována při 50 °C a eluována 0,6 ml/min 5 mM H2S04 ve vodě.tok.
Supernatant hydrolyzátu byl zředěn a analyzován na obsah monomeru a oligosacharidu.Monomerní cukry získané po enzymatické hydrolýze byly analyzovány pomocí HPLC vybavené kolonou Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P a kolonou chránící popel.Teplota kolony byla udržována na 80 °C, jako mobilní fáze byla použita voda s průtokem 0,6 ml/min.Oligosacharidy byly stanoveny hydrolýzou ve zředěné kyselině při 121 °C podle metod popsaných v odkazech.41, 48, 49.
Analýza sacharidů byla provedena na surových, AFEX předem zpracovaných a všech nehydrolyzovaných zbytcích biomasy (včetně produkce sériových extraktů buněčných stěn a jejich screeningu mAb) za použití dříve popsaných postupů 27, 43, 50, 51.Pro analýzu glykomu se ze zbytků biomasy připraví v alkoholu nerozpustné zbytky materiálu rostlinné buněčné stěny a podrobí se sériové extrakci stále agresivnějšími činidly, jako je šťavelan amonný (50 mM), uhličitan sodný (50 mM a 0,5 % w/v), CON.(1M a 4M, oba s 1 % w/v borohydridu sodného) a kyselý chloritan, jak bylo popsáno dříve52,53.Extrakty byly poté podrobeny testu ELISA proti komplexnímu panelu mAb50 zaměřených na glykan buněčné stěny a vazebné reakce mAb byly prezentovány jako tepelná mapa.mAb zacílené na glykan rostlinné buněčné stěny byly zakoupeny z laboratorních zásob (řady CCRC, JIM a MAC).
Jednostupňová biotinylace oligosacharidů.Konjugace sacharidů s biotin-LC-hydrazidem byla provedena za použití následujícího postupu.Biotin-LC-hydrazid (4,6 mg/12 μmol) byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO, 70 μl) za intenzivního míchání a zahřívání na 65 °C po dobu 1 minuty.Byla přidána ledová kyselina octová (30 ul) a směs byla nalita na kyanoborohydrid sodný (6,4 mg/100 umol) a zcela rozpuštěna po zahřívání na 65 °C po dobu asi 1 minuty.Poté bylo k vysušenému oligosacharidu přidáno 5 až 8 ul reakční směsi (1-100 nmol), aby se získal 10násobný nebo více molární přebytek značky nad redukujícím koncem.Reakce byla prováděna při 65 °C po dobu 2 hodin, poté byly vzorky okamžitě purifikovány.V experimentech značení nebyl použit žádný kyanoborohydrid sodný bez redukce a vzorky se nechaly reagovat při 65 °C po dobu 2,5 hodiny.
ELISA potahování a promývání vzorků biotinylovaných oligosacharidů.Do každé jamky destičky potažené avidinem bylo přidáno 25 μl biotinylovaných vzorků (100 μl každého koncentrovaného vzorku zředěného v 5 ml 0,1 M roztoku Tris pufru (TBS)).Kontrolní jamky byly potaženy 50 ul biotinu v koncentraci 10 ug/ml v 0,1 M TBS.Deionizovaná voda byla použita jako povlak pro slepá měření.Tableta byla inkubována po dobu 2 hodin při teplotě místnosti ve tmě.Promyjte destičku 3x 0,1% odstředěným mlékem v 0,1M TBS pomocí programu č.11 pro Grenier flat 3A.
Přidávání a promývání primárních protilátek.Do každé jamky přidejte 40 µl primární protilátky.Inkubujte mikrodestičku po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě ve tmě.Destičky byly poté třikrát promyty 0,1% mlékem v 0,1M TBS za použití promývacího programu #11 pro Grenier Flat 3A.
Přidejte sekundární protilátku a promyjte.Přidejte 50 ul myší/krysí sekundární protilátky (zředěné 1:5000 v 0,1% mléce v 0,1 M TBS) do každé jamky.Inkubujte mikrodestičku po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě ve tmě.Mikrodestičky byly poté 5krát promyty 0,1% mlékem v 0,1 M TBS pomocí programu Grenier Flat 5A promývacího programu #12.
Přidání substrátu.K základnímu substrátu přidejte 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidinu (TMB) (přidáním 2 kapek pufru, 3 kapek TMB, 2 kapek peroxidu vodíku do 15 ml deionizované vody).Připravte substrát TMB.a před použitím vortexujte).Inkubujte mikrodestičku při pokojové teplotě po dobu 30 minut.Ve tmě.
Dokončete krok a přečtěte si tablet.Přidejte 50 µl 1N kyseliny sírové do každé jamky a zaznamenejte absorbanci od 450 do 655 nm pomocí čtečky ELISA.
Připravte 1 mg/ml roztoky těchto analytů v deionizované vodě: arabinóza, rhamnóza, fukóza, xylóza, kyselina galakturonová (GalA), kyselina glukuronová (GlcA), manóza, glukóza, galaktóza, laktóza, N-acetylmanosamin (manNAc), N-acetylglukosamin.(glcNAc), N-acetylgalaktosamin (galNAc), inositol (vnitřní standard).Dva standardy byly připraveny přidáním 1 mg/ml cukerných roztoků uvedených v tabulce 1. Vzorky se zmrazily a lyofilizovaly při -80 °C, dokud nebyla odstraněna veškerá voda (obvykle asi 12-18 hodin).
Přidejte 100–500 µg vzorku do zkumavek se šroubovacím uzávěrem na analytických vahách.Zaznamenejte přidané množství.Nejlepší je rozpustit vzorek ve specifické koncentraci rozpouštědla a přidat jej do zkumavky jako kapalný alikvot.Použijte 20 µl 1 mg/ml inositolu jako vnitřní standard pro každou zkumavku se vzorkem.Množství vnitřního standardu přidaného do vzorku musí být stejné jako množství vnitřního standardu přidaného do zkumavky se standardem.
Přidejte 8 ml bezvodého methanolu do lahvičky se šroubovacím uzávěrem.Potom 4 ml 3N methanolického roztoku HCl, uzavře se a protřepe.Tento proces nepoužívá vodu.
Přidejte 500 ul 1 M roztoku HCl v methanolu ke vzorkům oligosacharidů a standardním TMS zkumavkám.Vzorky byly inkubovány přes noc (168 hodin) při 80 °C v tepelném bloku.Produkt methanolýzy se suší při teplotě místnosti pomocí sušícího potrubí.Přidejte 200 ul MeOH a znovu vysušte.Tento proces se opakuje dvakrát.Ke vzorku přidejte 200 µl methanolu, 100 µl pyridinu a 100 µl acetanhydridu a dobře promíchejte.Vzorky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 30 minut.a sušené.Přidejte 200 ul methanolu a znovu vysušte.
Přidejte 200 µl Tri-Sil a zahřívejte uzavřenou zkumavku po dobu 20 minut.80 °C, poté ochlazena na pokojovou teplotu.Použijte sušicí potrubí k dalšímu vysušení vzorku na objem přibližně 50 µl.Je důležité si uvědomit, že jsme nenechali vzorky úplně vyschnout.
Přidejte 2 ml hexanu a dobře promíchejte vortexováním.Naplňte špičky Pasteurových pipet (5-8 mm) kouskem skelné vaty vložením skelné vaty na pipetu o průměru 5-3/4 palce.Vzorky byly centrifugovány při 3000 g po dobu 2 minut.Případné nerozpustné zbytky se vysrážejí.Vysušte vzorek na 100-150 µl.Objem přibližně 1 μl byl vstříknut do GC-MS při počáteční teplotě 80 °C a počáteční době 2,0 minuty (tabulka 2).