Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nove imunološke i masene spektrometrijske metode za kompleksnu analizu perzistentnih oligosaharida u kukuruznoj peći prethodno tretiranoj AFEX-om.Lignocelulozna biomasa je održiva alternativa fosilnim gorivima i široko se koristi za razvoj biotehnologije za proizvodnju proizvoda kao što su hrana, hrana za životinje, goriva i hemikalije.Ključ za ove tehnologije je razvoj troškovno konkurentnih procesa za pretvaranje složenih ugljikohidrata prisutnih u zidovima biljnih stanica u jednostavne šećere kao što su glukoza, ksiloza i arabinoza.Budući da je lignocelulozna biomasa vrlo tvrdoglava, mora se podvrgnuti termohemijskim tretmanima (npr. piling amonijačnim vlaknima (AFEX), razrijeđenim kiselinama (DA), jonskim tekućinama (IL)) i biološkim tretmanima (npr. enzimska hidroliza i mikrobna fermentacija) u kombinaciji kako bi se dobio željeni proizvod..Međutim, kada se komercijalni gljivični enzimi koriste u procesu hidrolize, samo 75-85% formiranih rastvorljivih šećera su monosaharidi, a preostalih 15-25% su rastvorljivi, neuhvatljivi oligosaharidi, koji nisu uvek dostupni mikroorganizmima.Prethodno smo uspješno izolirali i pročistili topljive tvrdokorne oligosaharide koristeći kombinaciju odvajanja ugljika i dijatomejske zemlje i hromatografije isključivanja veličine, a također smo istražili njihova svojstva inhibicije enzima.Otkrili smo da je oligosaharide koji sadrže viši stepen polimerizacije (DP) metilirane uronske kiseline teže obraditi komercijalnim mješavinama enzima nego oligosaharide s niskim DP i neutralne oligosaharide.Ovdje izvještavamo o upotrebi nekoliko dodatnih metoda, uključujući profiliranje glikana korištenjem monoklonskih antitijela (mAbs) specifičnih za glikane biljne biomase za karakterizaciju glikanskih veza u zidovima biljnih stanica i enzimskih hidrolizata, ionizaciju laserske desorpcije uz pomoć matriksa, masenu spektrometriju vremena leta..MALDI-TOF-MS) koristi strukturno informativne dijagnostičke pikove dobijene spektroskopijom nakon sekundarnog raspada negativnih jona, gasnom hromatografijom i masenom spektrometrijom (GC-MS) za karakterizaciju oligosaharidnih veza sa i bez derivatizacije.Zbog male veličine oligosaharida (DP 4–20), ove molekule je teško koristiti za vezivanje i karakterizaciju mAb.Da bismo prevazišli ovaj problem, primenili smo novu metodu imobilizacije oligosaharida zasnovanu na konjugaciji biotina koja je uspešno označila većinu oligosaharida sa niskim DP rastvorljivim na površini mikroploče, koja je zatim korišćena u visokopropusnom mAb sistemu za specifičnu analizu ligacije.Ova nova metoda će olakšati razvoj naprednijih testova glikoma visoke propusnosti u budućnosti koji se mogu koristiti za izolaciju i karakterizaciju oligosaharida prisutnih u biomarkerima u dijagnostičke svrhe.
Lignocelulozna biomasa, sastavljena od poljoprivrednih, šumarskih, travnatih i drvenih materijala, potencijalna je sirovina za proizvodnju bioloških proizvoda, uključujući hranu, hranu za životinje, gorivo i hemijske prekursore za proizvodnju proizvoda veće vrijednosti1.Ugljikohidrati (kao što su celuloza i hemiceluloza) prisutni u zidovima biljnih stanica se depolimeriziraju u monosaharide kemijskom obradom i biotransformacijom (kao što je enzimska hidroliza i mikrobna fermentacija).Uobičajeni predtretmani uključuju ekspanziju vlakana amonijaka (AFEX), razrijeđenu kiselinu (DA), jonsku tekućinu (IL) i eksploziju pare (SE), koji koriste kombinaciju kemikalija i topline za smanjenje proizvodnje lignoceluloze otvaranjem zidova biljnih stanica3,4.tvrdoglavost materije, 5. Enzimska hidroliza se provodi pri velikom opterećenju čvrstim tvarima korištenjem komercijalnih enzima koji sadrže aktivne ugljikohidrate (CAZymes) i mikrobnom fermentacijom korištenjem transgenih kvasaca ili bakterija za proizvodnju goriva i kemikalija na bazi biologije 6 .
CAZimi u komercijalnim enzimima se sastoje od složene mješavine enzima koji sinergistički cijepaju složene veze ugljikohidrat-šećer da bi formirali monosaharide2,7.Kao što smo ranije izvijestili, složena mreža aromatičnih polimera lignina sa ugljikohidratima ih čini vrlo nesposobnim, što dovodi do nepotpune konverzije šećera, akumuliranja 15-25% polnih oligosaharida koji se ne proizvode tokom enzimske hidrolize prethodno tretirane biomase.Ovo je čest problem kod različitih metoda prethodnog tretmana biomase.Neki razlozi za ovo usko grlo uključuju inhibiciju enzima tokom hidrolize, ili nedostatak ili nizak nivo esencijalnih enzima koji su potrebni za razbijanje veza šećera u biljnoj biomasi.Razumijevanje sastava i strukturnih karakteristika šećera, kao što su šećerne veze u oligosaharidima, pomoći će nam da poboljšamo konverziju šećera tokom hidrolize, čineći biotehnološke procese cjenovno konkurentnim proizvodima dobivenim iz nafte.
Određivanje strukture ugljenih hidrata je izazovno i zahteva kombinaciju metoda kao što su tečna hromatografija (LC)11,12, spektroskopija nuklearne magnetne rezonance (NMR)13, kapilarna elektroforeza (CE)14,15,16 i masena spektrometrija (MS)17.,osamnaest.MS metode kao što je vremenska spektrometrija mase sa laserskom desorpcijom i jonizacijom pomoću matrice (MALDI-TOF-MS) su raznovrsna metoda za identifikaciju struktura ugljikohidrata.Nedavno je tandemski MS adukata natrijum jona najčešće korišten za identifikaciju otisaka prstiju koji odgovaraju pozicijama vezivanja oligosaharida, anomernim konfiguracijama, sekvencama i pozicijama grananja 20,21.
Glikanska analiza je odličan alat za dubinsku identifikaciju ugljikohidratnih veza22.Ova metoda koristi monoklonska antitijela (mAbs) usmjerena na glikan stanične stijenke biljaka kao sonde za razumijevanje složenih veza ugljikohidrata.Više od 250 mAbs je dostupno širom svijeta, dizajniranih protiv različitih linearnih i razgranatih oligosaharida koristeći različite saharide24.Nekoliko mAb se široko koristi za karakterizaciju strukture, sastava i modifikacija biljnog ćelijskog zida, jer postoje značajne razlike u zavisnosti od tipa biljne ćelije, organa, starosti, razvojne faze i okruženja rasta25,26.U skorije vrijeme, ova metoda je korištena za razumijevanje populacija vezikula u biljnim i životinjskim sistemima i njihove odgovarajuće uloge u transportu glikana kako je određeno subćelijskim markerima, razvojnim fazama ili stimulansima iz okoline, te za određivanje enzimske aktivnosti.Neke od različitih struktura glikana i ksilana koje su identificirane uključuju pektin (P), ksilan (X), manan (M), ksiloglukane (XylG), glukane s miješanom vezom (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomanan (GalG), glukuronsku kiselinu-arabinoksilan (arabinoksilan) i arabinoksilan (arabinoksilan) (arabinoksilan)
Međutim, uprkos svim ovim istraživačkim naporima, samo nekoliko studija se fokusiralo na prirodu akumulacije oligosaharida tokom hidrolize sa visokim opterećenjem čvrstih materija (HSL), uključujući oslobađanje oligosaharida, promene dužine oligomernog lanca tokom hidrolize, različite polimere sa niskim DP i njihove krive.distribucije 30,31,32.U međuvremenu, iako se analiza glikana pokazala korisnim alatom za sveobuhvatnu analizu strukture glikana, teško je procijeniti vodotopive oligosaharide s niskim DP koristeći metode antitijela.Manji DP oligosaharidi sa molekulskom težinom manjom od 5-10 kDa ne vezuju se za ELISA ploče 33, 34 i ispiru se prije dodavanja antitijela.
Ovdje, po prvi put, demonstriramo ELISA test na pločama obloženim avidinom koristeći monoklonska antitijela, kombinujući postupak biotinilacije u jednom koraku za rastvorljive vatrostalne oligosaharide sa analizom glikoma.Naš pristup analizi glikoma je potvrđen MALDI-TOF-MS i GC-MS analizom komplementarnih oligosaharidnih veza koristeći trimetilsilil (TMS) derivatizaciju hidrolizovanih kompozicija šećera.Ovaj inovativni pristup može se razviti kao metoda visoke propusnosti u budućnosti i naći širu primjenu u biomedicinskim istraživanjima35.
Posttranslacijske modifikacije enzima i antitijela, kao što je glikozilacija,36 utiču na njihovu biološku aktivnost.Na primjer, promjene u glikozilaciji serumskih proteina igraju važnu ulogu u inflamatornom artritisu, a promjene u glikozilaciji se koriste kao dijagnostički markeri37.U literaturi je prijavljeno da se različiti glikani lako pojavljuju u raznim bolestima, uključujući kronične upalne bolesti gastrointestinalnog trakta i jetre, virusne infekcije, rak jajnika, dojke i prostate38,39,40.Razumijevanje strukture glikana korištenjem glikanskih ELISA metoda zasnovanih na antitijelima pružit će dodatno povjerenje u dijagnozu bolesti bez upotrebe složenih MS metoda.
Naša prethodna studija je pokazala da su tvrdokorni oligosaharidi ostali nehidrolizirani nakon prethodnog tretmana i enzimske hidrolize (slika 1).U našem prethodno objavljenom radu razvili smo metodu ekstrakcije u čvrstoj fazi aktivnog uglja za izolaciju oligosaharida iz AFEX-om prethodno tretiranog hidrolizata kukuruznog stovera (ACSH)8.Nakon inicijalne ekstrakcije i odvajanja, oligosaharidi su dalje frakcionisani hromatografijom isključenja po veličini (SEC) i sakupljeni prema molekularnoj težini.Šećerni monomeri i oligomeri oslobođeni iz različitih predtretmana analizirani su analizom sastava šećera.Kada se poredi sadržaj šećernih oligomera dobijenih različitim metodama predtretmana, prisustvo tvrdokornih oligosaharida je čest problem u konverziji biomase u monosaharide i može dovesti do smanjenja prinosa šećera od najmanje 10-15% pa čak i do 18%.US.Ova metoda se koristi za daljnju proizvodnju frakcija oligosaharida velikih razmjera.Rezultirajući ACH i njegove naknadne frakcije različite molekulske težine korišteni su kao eksperimentalni materijal za karakterizaciju oligosaharida u ovom radu.
Nakon prethodnog tretmana i enzimske hidrolize, uporni oligosaharidi su ostali nehidrolizirani.Ovdje (A) je metoda odvajanja oligosaharida u kojoj se oligosaharidi izoluju iz AFEX-om prethodno obrađenog hidrolizata kukuruznog stovera (ACSH) koristeći nabijeni sloj od aktivnog ugljena i dijatomejske zemlje;(B) Metoda za odvajanje oligosaharida.Oligosaharidi su dalje razdvojeni hromatografijom isključivanja veličine (SEC);(C) Saharidni monomeri i oligomeri oslobođeni iz različitih predtretmana (razrijeđena kiselina: DA, jonska tekućina: IL i AFEX).Uslovi enzimske hidrolize: visoko opterećenje čvrstim supstancama od 25% (w/w) (približno 8% punjenje glukanom), 96 sati hidroliza, komercijalno punjenje enzima od 20 mg/g (omjer Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) i (D) Šećerni monomeri i oligomeri, oligomeri iz stomara i glukoze koji se oslobađaju od koroksa pre-a. S).
Analiza glikana se pokazala korisnim alatom za sveobuhvatnu strukturnu analizu glikana u ekstraktima izolovanim iz čvrstih ostataka biomase.Međutim, saharidi rastvorljivi u vodi nedovoljno su zastupljeni upotrebom ove tradicionalne metode41 jer je oligosaharide male molekularne težine teško imobilizirati na ELISA pločama i ispiru se prije dodavanja antitijela.Stoga je za vezivanje i karakterizaciju antitijela korištena metoda biotinilacije u jednom koraku za oblaganje rastvorljivih, neusklađenih oligosaharida na ELISA pločama obloženim avidinom.Ova metoda je testirana korištenjem našeg prethodno proizvedenog ACSH i frakcije na osnovu njegove molekularne težine (ili stepena polimerizacije, DP).Biotinilacija u jednom koraku je korištena za povećanje afiniteta vezivanja oligosaharida dodavanjem biotin-LC-hidrazida na redukcijski kraj ugljikohidrata (slika 2).U rastvoru, hemiacetalna grupa na redukcionom kraju reaguje sa hidrazidnom grupom biotin-LC-hidrazida da bi formirala hidrazonsku vezu.U prisustvu redukcionog agensa NaCNBH3, hidrazonska veza se redukuje u stabilan biotinilirani krajnji proizvod.Sa modifikacijom kraja koji redukuje šećer, postalo je moguće vezivanje oligosaharida sa niskim DP za ELISA ploče, au našoj studiji to je učinjeno na pločama obloženim avidinom korištenjem mAb ciljanih na glikan.
Skrining monoklonskih antitela zasnovan na ELISA testu za biotinilirane oligosaharide.Ovdje (A) kombinovana biotinilacija oligosaharida i naknadni ELISA skrining sa mAbs ciljanim na glikan na pločama obloženim NeutrAvidinom i (B) pokazuje postupak u jednom koraku za biotinilaciju produkta reakcije.
Avidinom obložene ploče sa antitijelima konjugiranim s oligosaharidom su zatim dodane primarnim i sekundarnim antitijelima i isprane u mediju osjetljivom na svjetlost i vrijeme.Nakon što je vezivanje antitela završeno, dodajte TMB supstrat da inkubirate ploču.Reakcija je konačno zaustavljena sumpornom kiselinom.Inkubirane ploče su analizirane korišćenjem ELISA čitača da bi se odredila snaga vezivanja svakog antitela da bi se otkrilo unakrsno povezivanje specifično za antitelo.Za detalje i parametre eksperimenta, pogledajte odgovarajući odjeljak “Materijali i metode”.
Mi demonstriramo korisnost ove novorazvijene metode za specifične primjene karakterizacijom rastvorljivih oligosaharida prisutnih u ACSH, kao i u sirovim i pročišćenim frakcijama oligosaharida izolovanim iz lignoceluloznih hidrolizata.Kao što je prikazano na slici 3, najčešći ksilani supstituirani epitopom identificirani u ACSH korištenjem metoda analize bioaciliranog glikoma su obično uronski (U) ili metiluronski (MeU) i pektični arabinogalaktani.Većina njih pronađena je i u našoj prethodnoj studiji o analizi glikana nehidroliziranih čvrstih tvari (UHS)43.
Detekcija neposlušnih oligosaharidnih epitopa korištenjem monoklonskog antitijela usmjerenog na glikan ćelijskog zida.“Neutralna” frakcija je ACN frakcija, a “kisela” frakcija je FA frakcija.Svjetlije crvene boje na toplotnoj mapi označavaju veći sadržaj epitopa, a svjetlije plave označavaju praznu pozadinu.Vrijednosti boje na skali su bazirane na sirovim vrijednostima OD za formulacije N=2.Glavni epitopi koje antitijela prepoznaju prikazani su na desnoj strani.
Ove necelulozne strukture nisu mogle biti rascijepljene najčešćim celulazama i hemicelulazama u testiranoj komercijalnoj mješavini enzima, koja uključuje najčešće korištene komercijalne enzime.Stoga su za njihovu hidrolizu potrebni novi pomoćni enzimi.Bez neophodnih neceluloznih pomoćnih enzima, ove necelulozne veze sprečavaju potpunu konverziju u monosaharide, čak i ako su njihovi osnovni polimeri šećera u velikoj meri hidrolizovani u kraće fragmente i rastvoreni korišćenjem komercijalnih mešavina enzima.
Dalja studija distribucije signala i njegove snage vezivanja pokazala je da su epitopi bili niži u frakcijama šećera sa visokim DP (A, B, C, DP do 20+) nego u frakcijama sa niskim DP (D, E, F, DP) u dimerima) (slika 1).Kiseli fragmenti su češći u neceluloznim epitopima nego neutralni fragmenti.Ovi fenomeni su u skladu s obrascem koji je uočen u našoj prethodnoj studiji, gdje su visoki DP i kiseli dijelovi bili otporniji na enzimsku hidrolizu.Stoga, prisustvo neceluloznih glikanskih epitopa i U i MeU supstitucija može uvelike doprinijeti stabilnosti oligosaharida.Treba napomenuti da efikasnost vezivanja i detekcije može biti problematična za oligosaharide sa niskim DP, posebno ako je epitop dimerni ili trimerni oligosaharid.Ovo se može testirati korištenjem komercijalnih oligosaharida različite dužine, od kojih svaki sadrži samo jedan epitop koji se veže za specifično mAb.
Stoga je korištenje strukturno specifičnih antitijela otkrilo određene vrste neposlušnih veza.Ovisno o vrsti korištenog antitijela, odgovarajućem obrascu ligacije i jačini signala koje proizvodi (najviše ili najmanje), novi enzimi se mogu identificirati i dodati polukvantitativno u mješavinu enzima za potpuniju glikokonverziju.Uzimajući analizu ACSH oligosaharida kao primjer, možemo kreirati bazu podataka glikanskih veza za svaki materijal biomase.Ovdje treba napomenuti da treba uzeti u obzir različit afinitet antitijela, a ako je njihov afinitet nepoznat, to će stvoriti određene poteškoće pri upoređivanju signala različitih antitijela.Osim toga, poređenje glikanskih veza može najbolje funkcionirati između uzoraka za isto antitijelo.Ove tvrdoglave veze se zatim mogu povezati s bazom podataka CAZyme, iz koje možemo identificirati enzime, odabrati enzime kandidate i testirati enzime za razbijanje veze, ili razviti mikrobne sisteme za ekspresiju ovih enzima za upotrebu u biorafinerijama44.
Da bismo procijenili kako imunološke metode nadopunjuju alternativne metode za karakterizaciju oligosaharida niske molekularne težine prisutnih u lignoceluloznim hidrolizatima, izvršili smo MALDI (slika 4, S1-S8) i analizu saharida dobijenih iz TMS-a na osnovu GC-MS na istom panelu (slika 5) dijela oligosaharida.MALDI se koristi za poređenje da li distribucija mase molekula oligosaharida odgovara predviđenoj strukturi.Na sl.4 prikazuje MC neutralnih komponenti ACN-A i ACN-B.ACN-A analiza je potvrdila raspon šećera pentoze u rasponu od DP 4–8 (slika 4) do DP 22 (slika S1), čije težine odgovaraju MeU-ksilan oligosaharidima.ACN-B analiza je potvrdila seriju pentoze i glukoksilana sa DP 8-15.U dodatnom materijalu kao što je Slika S3, mape distribucije mase kiselog dijela FA-C pokazuju raspon (Me)U supstituiranih pentoznih šećera sa DP od 8-15 koji su u skladu sa supstituiranim ksilanima pronađenim u ELISA-baziranom skriningu mAb.Epitopi su konzistentni.
MALDI-MS spektar rastvorljivih neusklađenih oligosaharida prisutnih u ACS.Ovdje su (A) ACN-A frakcije niske težine koje sadrže metiliranu uronsku kiselinu (DP 4-8) supstituirane glukuroksilan oligosaharide i (B) ACN-B ksilan i oligosaharide metilirane uronske kiseline supstituirane sa glukuroksilanom (DP 8-15).
Analiza sastava glikanskog ostatka vatrostalnih oligosaharida.Ovdje (A) TMS saharidni sastav različitih frakcija oligosaharida dobijen GC-MS analizom.(B) Strukture različitih šećera dobijenih iz TMS-a prisutnih u oligosaharidima.ACN – acetonitrilna frakcija koja sadrži neutralne oligosaharide i FA – frakcija ferulne kiseline koja sadrži kisele oligosaharide.
Još jedan zanimljiv zaključak izvučen je iz LC-MS analize frakcije oligosaharida, kao što je prikazano na slici S9 (metode se mogu vidjeti u elektronskom dodatnom materijalu).Fragmenti heksoze i -OAc grupa su više puta uočeni tokom ligacije ACN-B frakcije.Ovaj nalaz ne samo da potvrđuje fragmentaciju uočenu u analizi glikoma i MALDI-TOF, već također pruža nove informacije o potencijalnim derivatima ugljikohidrata u prethodno tretiranoj lignoceluloznoj biomasi.
Također smo analizirali sastav šećera frakcije oligosaharida koristeći TMS derivatizaciju šećera.Koristeći GC-MS, odredili smo sastav neuralnih (nederivativnih) i kiselih šećera (GluA i GalA) u frakciji oligosaharida (slika 5).Glukuronska kiselina se nalazi u kiselim komponentama C i D, dok se galakturonska kiselina nalazi u kiselim komponentama A i B, a obje su komponente kiselih šećera s visokim DP.Ovi rezultati ne samo da potvrđuju naše ELISA i MALDI podatke, već su i u skladu s našim prethodnim studijama akumulacije oligosaharida.Stoga vjerujemo da su moderne imunološke metode koje koriste biotinilaciju oligosaharida i naknadni ELISA skrining dovoljne za otkrivanje rastvorljivih neposlušnih oligosaharida u različitim biološkim uzorcima.
Budući da su metode skrininga mAb zasnovane na ELISA-i potvrđene s nekoliko različitih metoda, željeli smo dalje istražiti potencijal ove nove kvantitativne metode.Dva komercijalna oligosaharida, ksiloheksasaharidni oligosaharid (XHE) i 23-α-L-arabinofuranozil-ksilotrioza (A2XX), su kupljena i testirana korištenjem novog mAb pristupa koji cilja na glikan ćelijskog zida.Slika 6 prikazuje linearnu korelaciju između biotiniliranog signala vezivanja i log koncentracije koncentracije oligosaharida, sugerirajući mogući Langmuir adsorpcijski model.Među mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 i CCRC-M151 korelirali su sa XHE, a CCRC-M108, CCRC-M109 i LM11 su korelirali sa A2XX u rasponu od 10nm.Zbog ograničene dostupnosti antitijela tokom eksperimenta, ograničeni eksperimenti su izvedeni sa svakom koncentracijom oligosaharida.Ovdje treba napomenuti da neka antitijela vrlo različito reaguju na isti oligosaharid kao supstrat, vjerovatno zato što se vežu za malo različite epitope i mogu imati vrlo različite afinitete vezivanja.Mehanizmi i implikacije tačne identifikacije epitopa biće mnogo složeniji kada se novi pristup mAb primeni na stvarne uzorke.
Dva komercijalna oligosaharida su korištena za određivanje raspona detekcije različitih mAbs ciljanih na glikan.Ovdje linearne korelacije sa log koncentracije koncentracije oligosaharida ukazuju na Langmuirove obrasce adsorpcije za (A) XHE sa mAb i (B) A2XX sa mAb.Odgovarajući epitopi ukazuju na strukture komercijalnih oligosaharida koji se koriste kao supstrati u testu.
Upotreba monoklonskih antitijela ciljanih na glikan (glikokomična analiza ili ELISA-bazirani mAb skrining) je moćan alat za dubinsku karakterizaciju većine glavnih glikana stanične stijenke koji čine biljnu biomasu.Međutim, klasična analiza glikana karakterizira samo veće glikane stanične stijenke, jer većina oligosaharida nije efikasno imobilizirana na ELISA pločama.U ovoj studiji, AFEX-om prethodno obrađeni kukuruzni štednjak je enzimski hidrolizovan uz visok sadržaj čvrstih materija.Analiza šećera korišćena je za određivanje sastava ugljikohidrata staničnog zida u hidrolizatu.Međutim, mAb analiza manjih oligosaharida u hidrolizatima je potcijenjena i potrebni su dodatni alati za efikasnu imobilizaciju oligosaharida na ELISA pločama.
Ovdje izvještavamo o novom i efikasnom metodu imobilizacije oligosaharida za skrining mAb kombinacijom biotinilacije oligosaharida nakon čega slijedi ELISA skrining na NeutrAvidin™ obloženim pločama.Imobilizirani biotinilirani oligosaharidi pokazali su dovoljan afinitet za antitijelo da omogući brzo i efikasno otkrivanje neposlušnih oligosaharida.Analiza sastava ovih tvrdoglavih oligosaharida na osnovu masene spektrometrije potvrdila je rezultate ovog novog pristupa imunoskriningu.Stoga, ove studije pokazuju da se kombinacija biotinilacije oligosaharida i ELISA skrininga s monoklonskim antitijelima usmjerenim na glikan može koristiti za otkrivanje umrežavanja u oligosaharidima i može se široko primjenjivati ​​u drugim biohemijskim studijama koje karakteriziraju strukturu oligosaharida.
Ova metoda profiliranja glikana zasnovana na biotinu je prvi izvještaj koji može istražiti neposlušne ugljikohidratne veze topivih oligosaharida u biljnoj biomasi.Ovo pomaže razumjeti zašto su neki dijelovi biomase tako tvrdoglavi kada je u pitanju proizvodnja biogoriva.Ova metoda popunjava važnu prazninu u metodama analize glikoma i proširuje svoju primjenu na širi raspon supstrata izvan biljnih oligosaharida.U budućnosti možemo koristiti robotiku za biotinilaciju i koristiti metodu koju smo razvili za analizu uzoraka visoke propusnosti pomoću ELISA-e.
Kukuruzna slama (CS) uzgojena iz Pioneer 33A14 hibridnog sjemena požnjevena je 2010. godine sa Kramer Farms u Rayu, Colorado.Uz dozvolu vlasnika zemljišta, ova biomasa se može koristiti za istraživanja. Uzorci su pohranjeni na suhom < 6% vlage u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi. Uzorci su pohranjeni na suhom < 6% vlage u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi. Obrazcy hranilisʹsâ suhim pri vlažnosti < 6% u paketima sa zastežkoj-molniej pri sobnoj temperaturi. Uzorci su pohranjeni na suhom pri <6% vlažnosti u vrećama sa patentnim zatvaračem na sobnoj temperaturi.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Obrazcy hranât v paketah s zastežkoj-molniej pri sobnoj temperaturi s vlažnostom < 6%. Uzorci se čuvaju u vrećicama sa patent zatvaračem na sobnoj temperaturi sa vlažnošću < 6%.Studija je bila u skladu s lokalnim i nacionalnim smjernicama.Kompozicijska analiza je izvršena korištenjem NREL protokola.Utvrđeno je da sastav sadrži 31,4% glukana, 18,7% ksilana, 3,3% arabinana, 1,2% galaktana, 2,2% acetila, 14,3% lignina, 1,7% proteina i 13,4% pepela.
Cellic® CTec2 (138 mg proteina/ml, serija VCNI 0001) je složena mješavina celulaze, β-glukozidaze i Cellic® HTec2 (157 mg proteina/ml, serija VHN00001) iz Novozymesa (Franklinton, NC, SAD)).Multifect Pectinase® (72 mg proteina/mL), složena mješavina enzima koji razgrađuju pektin, donirala je DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, Kalifornija, SAD).Koncentracije proteina enzima određene su procjenom sadržaja proteina (i oduzimanjem doprinosa neproteinskog azota) korištenjem Kjeldahlove analize dušika (AOAC metoda 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatomejska zemlja 545 je kupljena od EMD Millipore (Billerica, MA).Aktivni ugljen (DARCO, 100 mesh granula), Avicel (PH-101), bukov ksilan i sve ostale hemikalije kupljene su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX predtretman je obavljen u GLBRC (Laboratorija za istraživanje pretvorbe biomase, MSU, Lansing, MI, SAD).Predtretman je izveden na 140°C tokom 15 minuta.46 vrijeme zadržavanja u omjeru bezvodnog amonijaka i biomase 1:1 pri 60% (w/w) utovaru u batch reaktoru od nehrđajućeg čelika (Parr Instruments Company).Trebalo je 30 minuta.Reaktor je doveden na 140°C i amonijak je brzo oslobođen, omogućavajući biomasi da se brzo vrati na sobnu temperaturu.Sastav AFEX pretretiranog kukuruza za kuhanje (ACS) bio je sličan onome kod netretiranog kukuruza za kuhanje (UT-CS).
ACSH 25% (w/w) sa visokim sadržajem čvrstih materija (približno 8% punjenja dekstrana) pripremljen je kao početni materijal za proizvodnju oligosaharida velikih razmera.Enzimska hidroliza ACS-a izvedena je korištenjem komercijalne enzimske mješavine uključujući Cellic® Ctec2 10 mg proteina/g glukana (u prethodno tretiranoj biomasi), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteina/g glukana i Multifect Pectinase (Genencor Inc, SAD).).), 5 mg proteina/g dekstrana.Enzimska hidroliza je izvedena u bioreaktoru od 5 litara radnog volumena 3 litre, pH 4,8, 50°C i 250 o/min.Nakon hidrolize u trajanju od 96 sati, hidrolizat je sakupljen centrifugiranjem na 6000 rpm tokom 30 minuta, a zatim na 14000 rpm tokom 30 minuta da bi se uklonile nehidrolizovane čvrste supstance.Hidrolizat je zatim podvrgnut sterilnoj filtraciji kroz filtersku čašu od 0,22 mm.Filtrirani hidrolizat je pohranjen u sterilnim bocama na 4°C i zatim frakcionisan na ugljeniku.
Analiza sastava uzoraka biomase na bazi ekstrakta prema NREL procedurama laboratorijske analize: priprema uzoraka za analizu sastava (NREL/TP-510-42620) i određivanje strukturnih ugljikohidrata i lignina u biomasi (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analiza oligosaharida struje hidrolizata izvedena je na skali od 2 ml koristeći metodu kisele hidrolize u autoklavu.Pomiješajte uzorak hidrolizata sa 69,7 µl 72% sumporne kiseline u epruveti za kulturu od 10 ml s poklopcem na navoj i inkubirajte 1 h na radnoj površini na 121 °C, ohladite na ledu i filtrirajte u bočicu za tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC).Koncentracija oligosaharida određena je oduzimanjem koncentracije monosaharida u nehidroliziranom uzorku od ukupne koncentracije šećera u kiselinom hidroliziranom uzorku.
Koncentracije glukoze, ksiloze i arabinoze u biomasi hidrolizovanoj kiselinom analizirane su korišćenjem Shimadzu HPLC sistema opremljenog autosamplerom, grejačem kolone, izokratskom pumpom i detektorom indeksa prelamanja na koloni Bio-Rad Aminex HPX-87H.Kolona je održavana na 50°C i eluirana sa 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 u vodi.protok.
Supernatant hidrolizata je razrijeđen i analiziran na sadržaj monomera i oligosaharida.Monomerni šećeri dobijeni enzimskom hidrolizom analizirani su HPLC-om opremljenim Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonom i kolonom za zaštitu od pepela.Temperatura kolone je održavana na 80°C, a kao mobilna faza korišćena je voda sa brzinom protoka od 0,6 ml/min.Oligosaharidi su određeni hidrolizom u razrijeđenoj kiselini na 121°C prema metodama opisanim u ref.41, 48, 49.
Analiza saharida je izvršena na sirovim, AFEX prethodno tretiranim i svim nehidrolizovanim ostacima biomase (uključujući proizvodnju serijskih ekstrakata ćelijskog zida i njihovo mAb skrining) korišćenjem prethodno opisanih procedura 27, 43, 50, 51 .Za analizu glikoma, u alkoholu netopivi ostaci materijala biljne ćelijske stijenke pripremaju se od ostataka biomase i podvrgavaju serijskoj ekstrakciji sa sve agresivnijim reagensima kao što su amonijum oksalat (50 mM), natrijum karbonat (50 mM i 0,5% w/v), CON.(1M i 4M, oba sa 1% w/v natrijum borhidrida) i kiseli hlorit kao što je prethodno opisano52,53.Ekstrakti su zatim podvrgnuti ELISA testu protiv kompleksnog panela mAb50 usmjerenih na glikan ćelijskog zida, a reakcije vezivanja mAb su predstavljene kao toplotna mapa.mAbs koji ciljaju glikan biljnih stanica kupljeni su iz laboratorijskih zaliha (CCRC, JIM i MAC serije).
Biotinilacija oligosaharida u jednom koraku.Konjugacija ugljikohidrata sa biotin-LC-hidrazidom izvedena je prema sljedećem postupku.Biotin-LC-hidrazid (4,6 mg/12 μmol) je otopljen u dimetil sulfoksidu (DMSO, 70 μl) snažnim mešanjem i zagrevanjem na 65°C tokom 1 min.Dodana je glacijalna sirćetna kiselina (30 µl) i smjesa je izlivena na natrijum cijanoborhidrid (6,4 mg/100 µmol) i potpuno otopljena nakon zagrijavanja na 65°C oko 1 minute.Zatim je osušenom oligosaharidu (1-100 nmol) dodano od 5 do 8 μl reakcione smjese da bi se dobio 10-struki ili više molarni višak oznake preko reducirajućeg kraja.Reakcija je izvedena na 65°C tokom 2 h, nakon čega su uzorci odmah pročišćeni.U eksperimentima označavanja nije korišten natrijum cijanoborhidrid bez redukcije, a uzorci su reagirali na 65°C 2,5 sata.
ELISA oblaganje i ispiranje uzoraka biotiniliranih oligosaharida.25 μl biotiniliranih uzoraka (100 μl svakog koncentriranog uzorka razrijeđenog u 5 ml 0,1 M Tris puferskog rastvora (TBS)) je dodano u svaku jažicu ploče obložene avidinom.Kontrolne jažice su obložene sa 50 μl biotina u koncentraciji od 10 μg/ml u 0,1 M TBS.Deionizirana voda je korištena kao premaz za slijepa mjerenja.Tableta je inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi u mraku.Operite ploču 3 puta sa 0,1% obranog mleka u 0,1 M TBS koristeći program br.11 za Grenier stan 3A.
Dodavanje i ispiranje primarnih antitijela.Dodajte 40 µl primarnog antitijela u svaku jažicu.Inkubirajte mikroploču 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku.Ploče su zatim oprane 3 puta sa 0,1% mleka u 0,1M TBS koristeći program ispiranja #11 za Grenier Flat 3A.
Dodajte sekundarno antitijelo i isperite.Dodajte 50 µl sekundarnog antitijela miša/pacova (razrijeđenog 1:5000 u 0,1% mlijeka u 0,1 M TBS) u svaku jažicu.Inkubirajte mikroploču 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku.Mikroploče su zatim isprane 5 puta sa 0,1% mlijeka u 0,1 M TBS koristeći Grenier Flat 5A program ispiranja ploča #12.
Dodavanje supstrata.Dodajte 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) u bazni supstrat (dodatkom 2 kapi pufera, 3 kapi TMB, 2 kapi vodikovog peroksida u 15 ml dejonizovane vode).Pripremite TMB podlogu.i vorteks prije upotrebe).Inkubirajte mikroploču na sobnoj temperaturi 30 minuta.Po mraku.
Dovršite korak i pročitajte tablet.Dodajte 50 µl 1 N sumporne kiseline u svaku jažicu i zabilježite apsorbanciju od 450 do 655 nm pomoću ELISA čitača.
Pripremite 1 mg/ml rastvore ovih analita u dejonizovanoj vodi: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksiloza, galakturonska kiselina (GalA), glukuronska kiselina (GlcA), manoza, glukoza, galaktoza, laktoza, N-acetilmannozamin (manNAc)(glcNAc), N-acetilgalaktozamin (galNAc), inozitol (interni standard).Dva standarda su pripremljena dodavanjem rastvora šećera od 1 mg/mL prikazanog u tabeli 1. Uzorci su zamrznuti i liofilizovani na -80°C dok se sva voda ne ukloni (obično oko 12-18 sati).
Dodajte 100–500 µg uzorka u epruvete sa navojnim poklopcem na analitičkoj vagi.Zabilježite dodanu količinu.Najbolje je rastvoriti uzorak u određenoj koncentraciji rastvarača i dodati ga u epruvetu kao tečni alikvot.Koristite 20 µl inozitola od 1 mg/ml kao interni standard za svaku epruvetu za uzorke.Količina internog standarda dodanog uzorku mora biti ista kao i količina internog standarda dodanog u standardnu ​​epruvetu.
Dodajte 8 ml bezvodnog metanola u bočicu sa zatvaračem.Zatim 4 ml 3 N. metanolnog rastvora HCl, začepiti i protresti.Ovaj proces ne koristi vodu.
Dodajte 500 µl 1 M otopine HCl metanola u uzorke oligosaharida i standardne TMS epruvete.Uzorci su inkubirani preko noći (168 sati) na 80°C u termalnom bloku.Osušite proizvod metanolize na sobnoj temperaturi koristeći razdjelnik za sušenje.Dodajte 200 µl MeOH i ponovo osušite.Ovaj proces se ponavlja dva puta.U uzorak dodajte 200 µl metanola, 100 µl piridina i 100 µl anhidrida sirćetne kiseline i dobro promiješajte.Uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi 30 minuta.i osušeni.Dodati 200 µl metanola i ponovo osušiti.
Dodajte 200 µl Tri-Sila i zagrijavajte epruvetu sa poklopcem 20 minuta.80°C, zatim ohlađen na sobnu temperaturu.Koristite razdjelnik za sušenje da dodatno osušite uzorak do zapremine od približno 50 µl.Važno je napomenuti da nismo dozvolili da se uzorci potpuno osuše.
Dodajte 2 ml heksana i dobro promiješajte miješanjem.Napunite vrhove Pasteurovih pipeta (5-8 mm) komadom staklene vune umetanjem staklene vune na vrh pipete prečnika 5-3/4 inča.Uzorci su centrifugirani na 3000 g 2 minute.Svi nerastvorljivi ostaci se talože.Osušite uzorak na 100-150 µl.Zapremina od približno 1 μl je ubrizgana u GC-MS na početnoj temperaturi od 80 °C i početnom vremenu od 2,0 minuta (Tablica 2).