Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Нове имунолошке и масене спектрометријске методе за комплексну анализу перзистентних олигосахарида у кукурузној пећи претходно третираној АФЕКС-ом.Лигноцелулозна биомаса је одржива алтернатива фосилним горивима и широко се користи за развој биотехнологије за производњу производа као што су храна, храна за животиње, горива и хемикалије.Кључ за ове технологије је развој конкурентних процеса за претварање сложених угљених хидрата присутних у зидовима биљних ћелија у једноставне шећере као што су глукоза, ксилоза и арабиноза.Пошто је лигноцелулозна биомаса веома тврдоглава, мора се подвргнути термохемијским третманима (нпр. пилинг амонијачним влакнима (АФЕКС), разблаженим киселинама (ДА), јонским течностима (ИЛ)) и биолошким третманима (нпр. ензимска хидролиза и микробна ферментација) у комбинацији да би се добио жељени производ..Међутим, када се комерцијални гљивични ензими користе у процесу хидролизе, само 75-85% растворљивих шећера који настају су моносахариди, а преосталих 15-25% су растворљиви, неухватљиви олигосахариди, који нису увек доступни микроорганизмима.Претходно смо успешно изоловали и пречистили растворљиве тврдокорне олигосахариде користећи комбинацију одвајања угљеника и дијатомејске земље и хроматографије искључивања величине, а такође смо истражили њихова својства инхибитора ензима.Открили смо да је олигосахариде који садрже виши степен полимеризације (ДП) супституције метиловане уронске киселине теже обрадити комерцијалним мешавинама ензима него олигосахариде са ниским ДП и неутралне олигосахариде.Овде извештавамо о употреби неколико додатних метода, укључујући профилисање гликана коришћењем моноклонских антитела (мАбс) специфичних за гликане биљне биомасе за карактеризацију гликанских веза у зидовима биљних ћелија и ензимских хидролизата, јонизацију ласерске десорпције уз помоћ матрикса, масену спектрометрију времена лета..МАЛДИ-ТОФ-МС) користи структурно-информативне дијагностичке пикове добијене спектроскопијом након секундарног распада негативних јона, гасном хроматографијом и масеном спектрометријом (ГЦ-МС) за карактеризацију олигосахаридних веза са и без дериватизације.Због мале величине олигосахарида (ДП 4–20), ове молекуле је тешко користити за везивање и карактеризацију мАб.Да бисмо превазишли овај проблем, применили смо нову методу имобилизације олигосахарида засновану на коњугацији биотина која је успешно означила већину олигосахарида са ниским ДП растворљивим на површини микроплоче, која је затим коришћена у систему мАб високог протока за анализу специфичне лигације.Ова нова метода ће олакшати развој напреднијих тестова гликома високе пропусности у будућности који се могу користити за изоловање и карактеризацију олигосахарида присутних у биомаркерима у дијагностичке сврхе.
Лигноцелулозна биомаса, састављена од пољопривредних, шумарских, травнатих и дрвених материјала, потенцијална је сировина за производњу био-производа, укључујући храну, храну за животиње, гориво и хемијске прекурсоре за производњу производа веће вредности1.Угљени хидрати (као што су целулоза и хемицелулоза) присутни у зидовима биљних ћелија се деполимеризују у моносахариде хемијском обрадом и биотрансформацијом (као што је ензимска хидролиза и микробна ферментација).Уобичајени предтретмани укључују експанзију амонијачних влакана (АФЕКС), разблажену киселину (ДА), јонску течност (ИЛ) и експлозију паре (СЕ), који користе комбинацију хемикалија и топлоте за смањење производње лигноцелулозе отварањем зидова биљних ћелија3,4.тврдоглавост материје, 5. Ензимска хидролиза се спроводи при великом оптерећењу чврстим материјама коришћењем комерцијалних ензима који садрже активне угљене хидрате (ЦАЗимес) и микробном ферментацијом коришћењем трансгених квасаца или бактерија за производњу горива и хемикалија на био-базираним 6 .
ЦАЗими ​​у комерцијалним ензимима се састоје од сложене мешавине ензима који синергистички цепају сложене везе угљени хидрат-шећер да би формирали моносахариде2,7.Као што смо раније известили, сложена мрежа ароматичних полимера лигнина са угљеним хидратима их чини веома неухватљивим, што доводи до непотпуне конверзије шећера, акумулирајући 15-25% полних олигосахарида који се не производе током ензимске хидролизе претходно третиране биомасе.Ово је чест проблем са различитим методама претходног третмана биомасе.Неки разлози за ово уско грло укључују инхибицију ензима током хидролизе, или одсуство или низак ниво есенцијалних ензима који су потребни за разбијање веза шећера у биљној биомаси.Разумевање састава и структурних карактеристика шећера, као што су шећерне везе у олигосахаридима, помоћи ће нам да побољшамо конверзију шећера током хидролизе, чинећи биотехнолошке процесе ценовно конкурентним производима добијеним од нафте.
Одређивање структуре угљених хидрата је изазовно и захтева комбинацију метода као што су течна хроматографија (ЛЦ)11,12, спектроскопија нуклеарне магнетне резонанце (НМР)13, капиларна електрофореза (ЦЕ)14,15,16 и масена спектрометрија (МС)17.,осамнаест.МС методе као што је временска спектрометрија масе са ласерском десорпцијом и јонизацијом помоћу матрице (МАЛДИ-ТОФ-МС) су свестран метод за идентификацију структура угљених хидрата.Недавно је тандемски МС адуката натријум јона најшире коришћен за идентификацију отисака прстију који одговарају позицијама везивања олигосахарида, аномерним конфигурацијама, секвенцама и позицијама гранања 20, 21 .
Анализа гликана је одличан алат за дубинску идентификацију веза угљених хидрата22.Ова метода користи моноклонска антитела (мАбс) усмерена на гликан ћелијског зида биљке као сонде за разумевање сложених веза угљених хидрата.Више од 250 мАбс је доступно широм света, дизајнираних против различитих линеарних и разгранатих олигосахарида користећи различите сахариде24.Неколико мАбс се широко користи за карактеризацију структуре, састава и модификација биљног ћелијског зида, пошто постоје значајне разлике у зависности од типа биљне ћелије, органа, старости, развојне фазе и средине раста25,26.У скорије време, ова метода је коришћена за разумевање популација везикула у биљним и животињским системима и њихових одговарајућих улога у транспорту гликана као што је одређено субћелијским маркерима, развојним фазама или стимулусима из средине, и за одређивање ензимске активности.Неке од различитих структура гликана и ксилана које су идентификоване укључују пектин (П), ксилан (Кс), манан (М), ксилоглукане (КсилГ), глукане са мешаном везом (МЛГ), арабиноксилан (АрбКс), галактоманан (ГалГ), глукуронску киселину-арабиноксилан (арабиноксилан) и арабиноксилан (арабиноксилан) (арабиноксилан).
Међутим, упркос свим овим истраживачким напорима, само неколико студија се фокусирало на природу акумулације олигосахарида током хидролизе са високим оптерећењем чврстих материја (ХСЛ), укључујући ослобађање олигосахарида, промене дужине олигомерног ланца током хидролизе, различите полимере са ниским ДП и њихове криве.дистрибуције 30,31,32.У међувремену, иако се анализа гликана показала као користан алат за свеобухватну анализу структуре гликана, тешко је проценити олигосахариде са ниским ДП растворљивим у води коришћењем метода антитела.Мањи ДП олигосахариди са молекулском тежином мањом од 5-10 кДа се ​​не везују за ЕЛИСА плоче 33, 34 и испиру се пре додавања антитела.
Овде, по први пут, демонстрирамо ЕЛИСА тест на плочама обложеним авидином користећи моноклонска антитела, комбинујући процедуру биотинилације у једном кораку за растворљиве ватросталне олигосахариде са анализом гликома.Наш приступ анализи гликома је потврђен МАЛДИ-ТОФ-МС и ГЦ-МС анализом комплементарних олигосахаридних веза коришћењем триметилсилил (ТМС) дериватизације хидролизованих композиција шећера.Овај иновативни приступ може се развити као метода високе пропусности у будућности и наћи ширу примену у биомедицинским истраживањима35.
Посттранслационе модификације ензима и антитела, као што је гликозилација,36 утичу на њихову биолошку активност.На пример, промене у гликозилацији серумских протеина играју важну улогу у инфламаторном артритису, а промене у гликозилацији се користе као дијагностички маркери37.У литератури је пријављено да се различити гликани лако појављују у разним болестима, укључујући хроничне инфламаторне болести гастроинтестиналног тракта и јетре, вирусне инфекције, рак јајника, дојке и простате38,39,40.Разумевање структуре гликана коришћењем гликанских ЕЛИСА метода заснованих на антителима ће обезбедити додатно поверење у дијагнозу болести без употребе сложених МС метода.
Наша претходна студија је показала да су тврдоглави олигосахариди остали нехидролизовани након претходног третмана и ензимске хидролизе (Слика 1).У нашем претходно објављеном раду, развили смо методу екстракције у чврстој фази активног угља за изоловање олигосахарида из АФЕКС-ом претходно третираног хидролизата кукурузног стовера (АЦСХ)8.После иницијалне екстракције и одвајања, олигосахариди су даље фракционисани хроматографијом за искључивање по величини (СЕЦ) и сакупљени по редоследу молекулске тежине.Шећерни мономери и олигомери ослобођени из различитих предтретмана анализирани су анализом састава шећера.Када се пореди садржај шећерних олигомера добијених различитим методама претходног третмана, присуство тврдокорних олигосахарида је чест проблем у конверзији биомасе у моносахариде и може довести до смањења приноса шећера од најмање 10-15% па чак и до 18%.УС.Овај метод се користи за даљу производњу фракција олигосахарида великих размера.Добијени АЦХ и његове накнадне фракције различите молекулске тежине коришћене су као експериментални материјал за карактеризацију олигосахарида у овом раду.
Након претходног третмана и ензимске хидролизе, упорни олигосахариди су остали нехидролизовани.Овде (А) је метода одвајања олигосахарида у којој се олигосахариди изолују из АФЕКС-предтретираног хидролизата кукурузног стовера (АЦСХ) коришћењем напуњеног слоја од активног угља и дијатомејске земље;(Б) Метода за одвајање олигосахарида.Олигосахариди су даље раздвојени хроматографијом искључивања величине (СЕЦ);(Ц) Сахаридни мономери и олигомери ослобођени из различитих предтретмана (разређена киселина: ДА, јонска течност: ИЛ и АФЕКС).Услови ензимске хидролизе: високо оптерећење чврстим супстанцама од 25% (в/в) (приближно 8% пуњење глуканом), 96 сати хидролиза, комерцијално пуњење ензима од 20 мг/г (однос Цтец2:Хтец2:МП-2:1:1) и (Д) мономери шећера и олигомери, олигомери из стомаранксиловера који се ослобађају од глукозе пре-корЕКС-а С).
Анализа гликана се показала као користан алат за свеобухватну структурну анализу гликана у екстрактима изолованим из остатака чврсте биомасе.Међутим, сахариди растворљиви у води су недовољно заступљени коришћењем ове традиционалне методе41 јер је олигосахариде мале молекуларне тежине тешко имобилисати на ЕЛИСА плочама и испиру се пре додавања антитела.Због тога, за везивање и карактеризацију антитела, коришћена је метода биотинилације у једном кораку за облагање растворљивих, неусаглашених олигосахарида на ЕЛИСА плочама обложеним авидином.Овај метод је тестиран коришћењем нашег претходно произведеног АЦСХ и фракције засноване на његовој молекуларној тежини (или степену полимеризације, ДП).Биотинилација у једном кораку је коришћена за повећање афинитета везивања олигосахарида додавањем биотин-ЛЦ-хидразида на редукциони крај угљених хидрата (слика 2).У раствору, хемиацетална група на редукционом крају реагује са хидразидном групом биотин-ЛЦ-хидразида да би се формирала хидразонска веза.У присуству редукционог агенса НаЦНБХ3, хидразонска веза се редукује до стабилног биотинилованог крајњег производа.Са модификацијом краја за смањење шећера, везивање олигосахарида са ниским ДП за ЕЛИСА плоче постало је могуће, а у нашој студији то је урађено на плочама обложеним авидином коришћењем мАб циљаних на гликан.
Скрининг моноклонских антитела на основу ЕЛИСА за биотиниловане олигосахариде.Овде (А) комбинована биотинилација олигосахарида и накнадни ЕЛИСА скрининг са мАбс циљаним на гликан на плочама обложеним НеутрАвидином и (Б) показује процедуру у једном кораку за биотинилацију реакционих производа.
Плоче обложене авидином са антителима коњугованим олигосахаридом су затим додате примарним и секундарним антителима и испране у медијуму осетљивом на светлост и време.Након што је везивање антитела завршено, додајте ТМБ супстрат да бисте инкубирали плочу.Реакција је коначно заустављена сумпорном киселином.Инкубиране плоче су анализиране коришћењем ЕЛИСА читача да би се одредила снага везивања сваког антитела да би се открило унакрсно повезивање специфично за антитело.За детаље и параметре експеримента, погледајте одговарајући одељак „Материјали и методе“.
Показали смо корисност ове новоразвијене методе за специфичне примене карактеризацијом растворљивих олигосахарида присутних у АЦСХ, као и у сировим и пречишћеним фракцијама олигосахарида изолованим из лигноцелулозних хидролизата.Као што је приказано на слици 3, најчешћи ксилани супституисани епитопом идентификовани у АЦСХ применом метода анализе биоацилираног гликома су обично уронски (У) или метилуронски (МеУ) и пектични арабиногалактани.Већина њих је пронађена и у нашој претходној студији о анализи гликана нехидролизованих чврстих материја (УХС)43.
Детекција непослушних олигосахаридних епитопа коришћењем моноклонског антитела усмереног на гликан ћелијског зида.„Неутрална“ фракција је АЦН фракција, а „кисела“ фракција је ФА фракција.Светлије црвене боје на топлотној мапи указују на већи садржај епитопа, а светлије плаве означавају празну позадину.Вредности боје на скали су засноване на сировим вредностима ОД за формулације Н=2.Главни епитопи које антитела препознају приказани су на десној страни.
Ове нецелулозне структуре нису могле да се цепају најчешћим целулазама и хемицелулазама у тестираној комерцијалној смеши ензима, која укључује најчешће коришћене комерцијалне ензиме.Због тога су за њихову хидролизу потребни нови помоћни ензими.Без неопходних нецелулозних помоћних ензима, ове нецелулозне везе спречавају потпуну конверзију у моносахариде, чак и ако су њихови основни полимери шећера у великој мери хидролизовани у краће фрагменте и растворени коришћењем комерцијалних смеша ензима.
Даље проучавање дистрибуције сигнала и његове снаге везивања показало је да су епитопи везивања нижи у фракцијама шећера са високим ДП (А, Б, Ц, ДП до 20+) него у фракцијама са ниским ДП (Д, Е, Ф, ДП) у димерима) (Слика 1).Фрагменти киселине су чешћи у нецелулозним епитопима него неутрални фрагменти.Ови феномени су у складу са обрасцем уоченим у нашој претходној студији, где су високи ДП и кисели делови били отпорнији на ензимску хидролизу.Стога, присуство нецелулозних гликанских епитопа и У и МеУ супституција може у великој мери допринети стабилности олигосахарида.Треба напоменути да ефикасност везивања и детекције може бити проблематична за олигосахариде са ниским ДП, посебно ако је епитоп димерни или тримерни олигосахарид.Ово се може тестирати коришћењем комерцијалних олигосахарида различитих дужина, од којих сваки садржи само један епитоп који се везује за специфично мАб.
Дакле, употреба структурно специфичних антитела открила је одређене врсте непослушних веза.У зависности од типа коришћеног антитела, одговарајућег обрасца лигације и јачине сигнала који производи (највише или најмање), нови ензими се могу идентификовати и додати полуквантитативно у смешу ензима за потпунију гликоконверзију.Узимајући анализу АЦСХ олигосахарида као пример, можемо креирати базу података гликанских веза за сваки материјал биомасе.Овде треба напоменути да треба узети у обзир различит афинитет антитела, а ако је њихов афинитет непознат, то ће створити одређене потешкоће приликом поређења сигнала различитих антитела.Поред тога, поређење гликанских веза може најбоље функционисати између узорака за исто антитело.Ове тврдоглаве везе се затим могу повезати са базом података ЦАЗиме, из које можемо идентификовати ензиме, одабрати ензиме кандидате и тестирати ензиме за разбијање везе, или развити микробне системе за експресију ових ензима за употребу у биорафинеријама44.
Да бисмо проценили како имунолошке методе допуњују алтернативне методе за карактеризацију олигосахарида мале молекулске тежине присутних у лигноцелулозним хидролизатима, урадили смо МАЛДИ (Слика 4, С1-С8) и анализу сахарида добијених из ТМС-а на основу ГЦ-МС на истом панелу (Слика 5) делу олигосахарида.МАЛДИ се користи за упоређивање да ли дистрибуција масе молекула олигосахарида одговара предвиђеној структури.На сл.4 приказује МЦ неутралних компоненти АЦН-А и АЦН-Б.АЦН-А анализа је потврдила опсег шећера пентозе у распону од ДП 4–8 (слика 4) до ДП 22 (слика С1), чије тежине одговарају МеУ-ксилан олигосахаридима.АЦН-Б анализа је потврдила серију пентозе и глукоксилана са ДП 8-15.У додатном материјалу као што је Слика С3, мапе дистрибуције масе киселог дела ФА-Ц показују опсег (Ме)У супституисаних пентозних шећера са ДП од 8-15 који су у складу са супституисаним ксиланима пронађеним у ЕЛИСА-базираном скринингу мАб.Епитопи су конзистентни.
МАЛДИ-МС спектар растворљивих неусаглашених олигосахарида присутних у АЦС.Овде, (А) АЦН-А фракције ниске тежине које садрже метиловану уронску киселину (ДП 4-8) супституисане глукуроксилан олигосахариде и (Б) АЦН-Б ксилан и олигосахариде метиловане уронске киселине супституисане са глукуроксиланом (ДП 8-15).
Анализа састава гликанског остатка ватросталних олигосахарида.Овде (А) ТМС састав сахарида различитих фракција олигосахарида добијен коришћењем ГЦ-МС анализе.(Б) Структуре различитих шећера добијених из ТМС-а присутних у олигосахаридима.АЦН – ацетонитрилна фракција која садржи неутралне олигосахариде и ФА – фракција ферулне киселине која садржи киселе олигосахариде.
Још један занимљив закључак извучен је из ЛЦ-МС анализе фракције олигосахарида, као што је приказано на слици С9 (методе се могу видети у електронском додатном материјалу).Фрагменти хексозе и -ОАц група су више пута примећени током везивања АЦН-Б фракције.Овај налаз не само да потврђује фрагментацију уочену у анализи гликома и МАЛДИ-ТОФ, већ такође пружа нове информације о потенцијалним дериватима угљених хидрата у претходно третираној лигноцелулозној биомаси.
Такође смо анализирали састав шећера фракције олигосахарида користећи ТМС дериватизацију шећера.Коришћењем ГЦ-МС одредили смо састав неуралних (недеривативних) и киселих шећера (ГлуА и ГалА) у фракцији олигосахарида (слика 5).Глукуронска киселина се налази у киселим компонентама Ц и Д, док се галактуронска киселина налази у киселим компонентама А и Б, од којих су обе компоненте са високим ДП киселих шећера.Ови резултати не само да потврђују наше ЕЛИСА и МАЛДИ податке, већ су и у складу са нашим претходним студијама акумулације олигосахарида.Стога верујемо да су савремене имунолошке методе које користе биотинилацију олигосахарида и накнадни ЕЛИСА скрининг довољне да открију растворљиве непоколебљиве олигосахариде у различитим биолошким узорцима.
Пошто су методе скрининга мАб засноване на ЕЛИСА тестиране са неколико различитих метода, желели смо даље да истражимо потенцијал ове нове квантитативне методе.Два комерцијална олигосахарида, ксилохексасахаридни олигосахарид (КСХЕ) и 23-α-Л-арабинофуранозил-ксилотриоза (А2КСКС), су купљена и тестирана коришћењем новог мАб приступа који циља на гликан ћелијског зида.Слика 6 приказује линеарну корелацију између биотинилованог везујућег сигнала и лог концентрације концентрације олигосахарида, што сугерише могући Лангмуир адсорпциони модел.Међу мАбс, ЦЦРЦ-М137, ЦЦРЦ-М138, ЦЦРЦ-М147, ЦЦРЦ-М148 и ЦЦРЦ-М151 су у корелацији са КСХЕ, а ЦЦРЦ-М108, ЦЦРЦ-М109 и ЛМ11 у корелацији са А2КСКС у распону од 10нм.Због ограничене доступности антитела током експеримента, ограничени експерименти су изведени са сваком концентрацијом олигосахарида.Овде треба напоменути да нека антитела веома различито реагују на исти олигосахарид као супстрат, вероватно зато што се везују за мало различите епитопе и могу имати веома различите афинитете везивања.Механизми и импликације тачне идентификације епитопа биће много сложенији када се нови приступ мАб примени на стварне узорке.
Два комерцијална олигосахарида су коришћена за одређивање опсега детекције различитих мАбс циљаних на гликан.Овде, линеарне корелације са лог концентрацијом концентрације олигосахарида указују на Лангмуирове обрасце адсорпције за (А) КСХЕ са мАб и (Б) А2КСКС са мАб.Одговарајући епитопи указују на структуре комерцијалних олигосахарида који се користе као супстрати у тесту.
Употреба моноклонских антитела циљаних на гликан (гликокомична анализа или скрининг мАб заснован на ЕЛИСА) је моћно средство за дубинску карактеризацију већине главних гликана ћелијског зида који чине биљну биомасу.Међутим, класична анализа гликана карактерише само веће гликане ћелијског зида, пошто већина олигосахарида није ефикасно имобилизована на ЕЛИСА плочама.У овој студији, АФЕКС-ом претходно обрађени кукурузни штедњак је ензимски хидролизован са високим садржајем чврстих материја.Анализа шећера је коришћена за одређивање састава неповерљивих угљених хидрата ћелијског зида у хидролизату.Међутим, мАб анализа мањих олигосахарида у хидролизатима је потцењена и потребни су додатни алати за ефикасну имобилизацију олигосахарида на ЕЛИСА плочама.
Овде извештавамо о новом и ефикасном методу имобилизације олигосахарида за скрининг мАб комбиновањем биотинилације олигосахарида након чега следи ЕЛИСА скрининг на НеутрАвидин™ обложеним плочама.Имобилизовани биотиниловани олигосахариди су показали довољан афинитет за антитело да омогући брзо и ефикасно откривање непослушних олигосахарида.Анализа састава ових тврдоглавих олигосахарида на основу масене спектрометрије потврдила је резултате овог новог приступа имуноскринингу.Дакле, ове студије показују да се комбинација биотинилације олигосахарида и ЕЛИСА скрининга са моноклонским антителима усмереним на гликан може користити за откривање унакрсних веза у олигосахаридима и може се широко применити у другим биохемијским студијама које карактеришу структуру олигосахарида.
Ова метода профилисања гликана заснована на биотину је први извештај који може да истражи непослушне угљенохидратне везе растворљивих олигосахарида у биљној биомаси.Ово помаже да се разуме зашто су неки делови биомасе тако тврдоглави када је у питању производња биогорива.Ова метода попуњава важну празнину у методама анализе гликома и проширује своју примену на шири спектар супстрата изван биљних олигосахарида.У будућности можемо користити роботику за биотинилацију и користити методу коју смо развили за анализу узорака високе пропусности помоћу ЕЛИСА.
Кукурузна слама (ЦС) узгајана из Пионеер 33А14 хибридног семена је пожњевена 2010. године са фарми Крамер у Реју, Колорадо.Уз дозволу власника земљишта, ова биомаса се може користити за истраживања. Узорци су чувани на сувом < 6% влаге у врећама са затварачем на собној температури. Узорци су чувани на сувом < 6% влаге у врећама са затварачем на собној температури. Образци хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкој-молниеј при комнатној температури. Узорци су чувани суви на <6% влажности у врећама са патентним затварачем на собној температури.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образци хранат в пакетах с застежкој-молниеј при комнатној температури с влажностьу < 6%. Узорци се чувају у врећама са патент затварачем на собној температури са влажношћу < 6%.Студија је била у складу са локалним и националним смерницама.Композициона анализа је извршена коришћењем НРЕЛ протокола.Утврђено је да композиција садржи 31,4% глукана, 18,7% ксилана, 3,3% арабинана, 1,2% галактана, 2,2% ацетила, 14,3% лигнина, 1,7% протеина и 13,4% пепела.
Целлиц® ЦТец2 (138 мг протеина/мл, серија ВЦНИ 0001) је сложена мешавина целулазе, β-глукозидазе и Целлиц® ХТец2 (157 мг протеина/мл, серија ВХН00001) из Новозимеса (Франклинтон, НЦ, САД)).Мултифецт Пецтинасе® (72 мг протеина/мЛ), сложена мешавина ензима који разграђују пектин, донирала је ДуПонт Индустриал Биосциенцес (Пало Алто, Калифорнија, САД).Концентрације протеина ензима одређене су проценом садржаја протеина (и одузимањем доприноса непротеинског азота) коришћењем Кјелдахлове анализе азота (АОАЦ метода 2001.11, Даири Оне Цооперативе Инц., Итхаца, НИ, УСА).Диатомејска земља 545 је купљена од ЕМД Миллипоре (Биллерица, МА).Активни угаљ (ДАРЦО, 100 месх гранула), Авицел (ПХ-101), буков ксилан и све остале хемикалије купљене су од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО).
АФЕКС предтретман је изведен у ГЛБРЦ (Лабораторија за истраживање биомасе, МСУ, Лансинг, МИ, САД).Претходни третман је изведен на 140°Ц током 15 минута.46 време задржавања у 1:1 односу анхидрованог амонијака према биомаси при 60% (в/в) утовару у батцх реактору од нерђајућег челика (Парр Инструментс Цомпани).Требало је 30 минута.Реактор је доведен на 140°Ц и амонијак је брзо ослобођен, омогућавајући биомаси да се брзо врати на собну температуру.Састав АФЕКС претретираног кукурузног шпорета (АЦС) био је сличан оном код нетретираног кукурузног шпорета (УТ-ЦС).
АЦСХ са високим садржајем чврстих материја 25% (в/в) (приближно 8% пуњења декстрана) је припремљен као почетни материјал за производњу олигосахарида великих размера.Ензимска хидролиза АЦС је изведена коришћењем комерцијалне мешавине ензима укључујући Целлиц® Цтец2 10 мг протеина/г глукана (у претходно третираној биомаси), Хтец2 (Новозимес, Франклинтон, НЦ), 5 мг протеина/г глукана и Мултифецт Пецтинасе (Гененцор Инц, САД).).), 5 мг протеина/г декстрана.Ензимска хидролиза је спроведена у биореактору од 5 литара радне запремине 3 литра, пХ 4,8, 50°Ц и 250 о/мин.После хидролизе током 96 сати, хидролизат је сакупљен центрифугирањем на 6000 рпм током 30 минута, а затим на 14000 рпм током 30 минута да би се уклониле нехидролизоване чврсте супстанце.Хидролизат је затим подвргнут стерилној филтрацији кроз филтерску чашу од 0,22 мм.Филтрирани хидролизат је чуван у стерилним боцама на 4°Ц и затим фракционисан на угљенику.
Анализа састава узорака биомасе на бази екстракта према НРЕЛ процедурама лабораторијске анализе: припрема узорака за анализу састава (НРЕЛ/ТП-510-42620) и одређивање структурних угљених хидрата и лигнина у биомаси (НРЕЛ/ТП-510 – 42618)47.
Анализа тока хидролизата олигосахарида је изведена на скали од 2 мл коришћењем методе киселе хидролизе у аутоклаву.Помешајте узорак хидролизата са 69,7 µл 72% сумпорне киселине у епрувети за културу од 10 мл са навојним поклопцем и инкубирајте 1 х на столу на 121 °Ц, охладите на леду и филтрирајте у бочицу за течну хроматографију високих перформанси (ХПЛЦ).Концентрација олигосахарида одређена је одузимањем концентрације моносахарида у нехидролизованом узорку од укупне концентрације шећера у киселином хидролизованом узорку.
Концентрације глукозе, ксилозе и арабинозе у биомаси хидролизованој киселином су анализиране коришћењем Схимадзу ХПЛЦ система опремљеног аутосамплером, грејачем колоне, изократском пумпом и детектором индекса преламања на колони Био-Рад Аминек ХПКС-87Х.Колона је одржавана на 50°Ц и елуирана са 0,6 мл/мин 5 мМ Х2СО4 у води.ток.
Супернатант хидролизата је разблажен и анализиран на садржај мономера и олигосахарида.Мономерни шећери добијени након ензимске хидролизе анализирани су помоћу ХПЛЦ опремљене Био-Рад (Херцулес, ЦА) Аминек ХПКС-87П колоном и колоном за заштиту од пепела.Температура колоне је одржавана на 80°Ц, вода је коришћена као мобилна фаза са брзином протока од 0,6 мл/мин.Олигосахариди су одређени хидролизом у разблаженој киселини на 121°Ц према методама описаним у реф.41, 48, 49.
Анализа сахарида је обављена на сировим, АФЕКС претходно третираним и свим нехидролизованим остацима биомасе (укључујући производњу серијских екстраката ћелијског зида и њихов скрининг мАб) коришћењем претходно описаних процедура 27, 43, 50, 51 .За анализу гликома, у алкохолу нерастворљиви остаци материјала за зидове биљних ћелија се припремају од остатака биомасе и подвргавају серијској екстракцији са све агресивнијим реагенсима као што су амонијум оксалат (50 мМ), натријум карбонат (50 мМ и 0,5% в/в), ЦОН.(1М и 4М, оба са 1% в/в натријум борохидрида) и кисели хлорит као што је претходно описано52,53.Екстракти су затим подвргнути ЕЛИСА тесту против комплексног панела мАб50 усмерених на гликан ћелијског зида, а реакције везивања мАб су представљене као топлотна мапа.мАбс који циљају гликан биљних ћелија купљени су из лабораторијских залиха (ЦЦРЦ, ЈИМ и МАЦ серије).
Биотинилација олигосахарида у једном кораку.Коњугација угљених хидрата са биотин-ЛЦ-хидразидом изведена је према следећем поступку.Биотин-ЛЦ-хидразид (4,6 мг/12 μмол) је растворен у диметил сулфоксиду (ДМСО, 70 μл) снажним мешањем и загревањем на 65°Ц током 1 мин.Додата је глацијална сирћетна киселина (30 ул) и смеша је изливена на натријум цијаноборохидрид (6,4 мг/100 умол) и потпуно растворена након загревања на 65°Ц током око 1 минута.Затим, од 5 до 8 μл реакционе смеше је додато у осушени олигосахарид (1-100 нмол) да би се добио 10-струки или више моларни вишак етикете преко редукционог краја.Реакција је изведена на 65°Ц током 2 х, након чега су узорци одмах пречишћени.Није коришћен натријум цијаноборхидрид у експериментима обележавања без редукције, а узорци су реаговани на 65°Ц током 2,5 сата.
ЕЛИСА облагање и испирање узорака биотинилованих олигосахарида.25 μл биотинилованих узорака (100 μл сваког концентрованог узорка разблаженог у 5 мл 0,1 М Трис пуферског раствора (ТБС)) је додато у сваки бунар плоче обложене авидином.Контролни бунари су обложени са 50 μл биотина у концентрацији од 10 μг/мл у 0,1 М ТБС.Дејонизована вода је коришћена као премаз за празна мерења.Таблета је инкубирана 2 сата на собној температури у мраку.Оперите плочу 3 пута са 0,1% обраног млека у 0,1 М ТБС користећи програм бр.11 за Грениер стан 3А.
Додавање и испирање примарних антитела.Додајте 40 µл примарног антитела у сваки бунар.Инкубирајте микроплочу 1 сат на собној температури у мраку.Плоче су затим испране 3 пута са 0,1% млека у 0,1М ТБС користећи програм испирања #11 за Грениер Флат 3А.
Додајте секундарно антитело и оперите.Додајте 50 µл секундарног антитела миша/пацова (разблаженог 1:5000 у 0,1% млека у 0,1 М ТБС) у сваки бунар.Инкубирајте микроплочу 1 сат на собној температури у мраку.Микроплоче су затим испране 5 пута са 0,1% млека у 0,1 М ТБС користећи Грениер Флат 5А програм испирања плоча #12.
Додавање супстрата.Додати 50 µл 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (ТМБ) у базни супстрат (додавањем 2 капи пуфера, 3 капи ТМБ, 2 капи водоник пероксида у 15 мл дејонизоване воде).Припремите ТМБ супстрат.и вортекс пре употребе).Инкубирајте микроплочу на собној температури 30 минута.У мраку.
Довршите корак и прочитајте таблет.Додајте 50 µл 1 Н сумпорне киселине у сваки бунар и забележите апсорбанцију од 450 до 655 нм помоћу ЕЛИСА читача.
Припремите 1 мг/мл растворе ових аналита у дејонизованој води: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактуронска киселина (ГалА), глукуронска киселина (ГлцА), маноза, глукоза, галактоза, лактоза, Н-ацетилманнозамин (манНАилглукозамин), Н-ацетилманозамин (манНАц).(глцНАц), Н-ацетилгалактозамин (галНАц), инозитол (интерни стандард).Два стандарда су припремљена додавањем раствора шећера од 1 мг/мЛ приказаног у табели 1. Узорци су замрзнути и лиофилизовани на -80°Ц док се сва вода не уклони (обично око 12-18 сати).
Додајте 100–500 µг узорка у епрувете са поклопцем са навојем на аналитичкој ваги.Забележите додату количину.Најбоље је растворити узорак у одређеној концентрацији растварача и додати га у епрувету као течни аликвот.Користите 20 µл инозитола од 1 мг/мл као интерни стандард за сваку епрувету за узорак.Количина интерног стандарда додатог узорку мора бити иста као и количина интерног стандарда додатог у стандардну епрувету.
Додати 8 мл анхидрованог метанола у бочицу са навојним поклопцем.Затим 4 мл 3 Н. метанолног раствора ХЦл, затворен и протресен.Овај процес не користи воду.
Додати 500 µл 1 М раствора ХЦл метанола у узорке олигосахарида и стандардне ТМС епрувете.Узорци су инкубирани преко ноћи (168 сати) на 80°Ц у термо блоку.Осушити производ метанолизе на собној температури помоћу колектора за сушење.Додати 200 µл МеОХ и поново осушити.Овај процес се понавља два пута.У узорак додати 200 µл метанола, 100 µл пиридина и 100 µл анхидрида сирћетне киселине и добро промешати.Узорци су инкубирани на собној температури 30 минута.и осушени.Додати 200 µл метанола и поново осушити.
Додајте 200 µл Три-Сил и загревајте епрувету са поклопцем 20 минута.80°Ц, затим охлађен на собну температуру.Користите разводник за сушење да додатно осушите узорак до запремине од приближно 50 µл.Важно је напоменути да нисмо дозволили да се узорци потпуно осуше.
Додати 2 мл хексана и добро промешати мешањем.Напуните врхове Пастерових пипета (5-8 мм) комадом стаклене вуне уметањем стаклене вуне на пипету пречника 5-3/4 инча.Узорци су центрифугирани на 3000 г током 2 минута.Сви нерастворљиви остаци се таложе.Осушите узорак до 100-150 µл.Запремина од приближно 1 μл је убризгана у ГЦ-МС на почетној температури од 80 °Ц и почетном времену од 2,0 минута (табела 2).