Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Нови имунолошки и масовни спектрометриски методи за комплексна анализа на перзистентни олигосахариди во пченка, претходно третирана со AFEX.Лигноцелулозната биомаса е одржлива алтернатива на фосилните горива и широко се користи за развој на биотехнологии за производство на производи како што се храна, добиточна храна, горива и хемикалии.Клучот за овие технологии е развојот на економични процеси за конвертирање на сложените јаглехидрати присутни во ѕидовите на растителните клетки во едноставни шеќери како што се гликоза, ксилоза и арабиноза.Бидејќи лигноцелулозната биомаса е многу тврдоглава, таа мора да биде подложена на термохемиски третмани (на пример, ексфолијација на влакна од амонијак (AFEX), разредени киселини (DA), јонски течности (IL)) и биолошки третмани (на пример, ензимска хидролиза и микробна ферментација) во комбинација за да се добие саканиот производ..Меѓутоа, кога се користат комерцијални габични ензими во процесот на хидролиза, само 75-85% од формираните растворливи шеќери се моносахариди, а останатите 15-25% се растворливи, нерешливи олигосахариди, кои не се секогаш достапни за микроорганизмите.Претходно, успешно ги изолиравме и прочистивме растворливите тврдоглави олигосахариди користејќи комбинација на сепарација на јаглерод и дијатомејска земја и хроматографија со исклучување на големината, а исто така ги истраживме нивните ензимски инхибиторни својства.Откривме дека олигосахаридите кои содржат повисок степен на полимеризација (DP) замена на метилирана уронска киселина се потешки за обработка со комерцијални ензимски мешавини отколку ниско DP и неутрални олигосахариди.Овде ја известуваме употребата на неколку дополнителни методи, вклучително и профилирање на гликан со користење на моноклонални антитела (mAbs) специфични за гликаните од растителна биомаса за карактеризирање на гликанските врски во ѕидовите на растителните клетки и ензимските хидролизати, јонизацијата со ласерска десорпција со помош на матрица, мас-спектрометрија на време на летот..MALDI-TOF-MS) користи структура-информативни дијагностички врвови добиени со спектроскопија по секундарно распаѓање на негативните јони, гасна хроматографија и масена спектрометрија (GC-MS) за карактеризирање на олигосахаридни врски со и без дериватизација.Поради малата големина на олигосахаридите (DP 4-20), овие молекули тешко се користат за врзување и карактеризација на mAb.За да го надминеме овој проблем, применивме нов метод за имобилизација на олигосахариди базиран на конјугација на биотин кој успешно го означи поголемиот дел од олигосахаридите растворливи со ниска DP на површината на микроплочката, што потоа се користеше во системот mAb со висока пропусност за специфична анализа на лигатура.Овој нов метод ќе го олесни развојот на понапредни анализи на гликом со висока пропусна моќ во иднина што може да се користат за изолирање и карактеризирање на олигосахаридите присутни во биомаркерите за дијагностички цели.
Лигноцелулозната биомаса, составена од земјоделски, шумарски, тревни и дрвени материјали, е потенцијална суровина за производство на био-базирани производи, вклучувајќи храна, добиточна храна, гориво и хемиски прекурсори за производство на производи со повисока вредност1.Јаглехидратите (како што се целулоза и хемицелулоза) присутни во ѕидовите на растителните клетки се деполимеризираат во моносахариди со хемиска обработка и биотрансформација (како што се ензимска хидролиза и микробна ферментација).Вообичаените предтретмани вклучуваат експанзија на амонијак влакна (AFEX), разредена киселина (DA), јонска течност (IL) и експлозија на пареа (SE), кои користат комбинација од хемикалии и топлина за да го намалат производството на лигноцелулоза со отворање на ѕидовите на растителните клетки3,4.тврдоглавост на материјата, 5. Ензимската хидролиза се изведува при големо оптоварување со цврсти материи со користење на комерцијални активни ензими што содржат јаглени хидрати (CAZymes) и микробна ферментација со помош на трансгенски квасци или бактерии за производство на горива и хемикалии базирани на био 6 .
CAZ-имите во комерцијалните ензими се составени од сложена мешавина на ензими кои синергистички ги расцепуваат сложените врски меѓу јаглени хидрати и шеќер за да формираат моносахариди2,7.Како што објавивме претходно, сложената мрежа на ароматични полимери на лигнин со јаглехидрати ги прави многу нерешливи, што доведува до нецелосна конверзија на шеќерот, акумулирајќи 15-25% од половите олигосахариди кои не се произведуваат при ензимска хидролиза на претходно третираната биомаса.Ова е чест проблем со различните методи за предтретман на биомаса.Некои причини за ова тесно грло вклучуваат ензимска инхибиција за време на хидролиза или отсуство или ниски нивоа на есенцијални есенцијални ензими кои се потребни за да се скршат шеќерните врски во растителната биомаса.Разбирањето на составот и структурните карактеристики на шеќерите, како што се шеќерните врски во олигосахаридите, ќе ни помогне да ја подобриме конверзијата на шеќерот за време на хидролизата, со што биотехнолошките процеси ќе бидат конкурентни на цените на производите добиени од нафта.
Одредувањето на структурата на јаглехидратите е предизвик и бара комбинација на методи како што се течна хроматографија (LC) 11,12, спектроскопија на нуклеарна магнетна резонанца (NMR)13, капиларна електрофореза (CE)14,15,16 и масена спектрометрија (MS)17., осумнаесет.MS методите како масена спектрометрија на време на летот со ласерска десорпција и јонизација со помош на матрица (MALDI-TOF-MS) се разноврсна метода за идентификација на структури на јаглени хидрати.Неодамна, тандемот MS на натриум-јонски адукти со дисоцијација предизвикана од судир (CID) беше најшироко користен за да се идентификуваат отпечатоците што одговараат на позициите на прицврстување на олигосахаридите, аномерните конфигурации, секвенците и позициите на разгранување 20, 21.
Гликанската анализа е одлична алатка за длабинска идентификација на јаглехидратните врски22.Овој метод користи моноклонални антитела (mAbs) насочени кон гликанот на клеточниот ѕид на растенијата како сонди за да се разберат сложените јагленохидратни врски.Повеќе од 250 mAbs се достапни ширум светот, дизајнирани против различни линеарни и разгранети олигосахариди кои користат различни сахариди24.Неколку mAbs се широко користени за карактеризирање на структурата, составот и модификациите на растителниот клеточен ѕид, бидејќи постојат значителни разлики во зависност од типот на растителните клетки, органот, возраста, фазата на развој и средината на растот25,26.Во поново време, овој метод се користи за да се разберат популациите на везикулите во растителните и животинските системи и нивните соодветни улоги во транспортот на гликан како што е определено со субклеточни маркери, развојни фази или стимулации од околината, и за одредување на ензимската активност.Некои од различните структури на гликани и ксилани кои се идентификувани вклучуваат пектин (P), ксилан (X), манан (M), ксилоглукани (XylG), глукани со мешани врски (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманан (GalG), глукуронска киселина-арабиноксилан (РБГА) арабиноксилан (РБА) арабиноксилан (РБА) 9Арбоксилан (РБА) 9Арбаноксилан.
Сепак, и покрај сите овие истражувачки напори, само неколку студии се фокусираа на природата на акумулацијата на олигосахаридите за време на хидролиза со високо оптоварување со цврсти материи (HSL), вклучувајќи ослободување на олигосахариди, промени во должината на олигомерниот синџир за време на хидролизата, различни полимери со ниска DP и нивните криви.распределби 30,31,32.Во меѓувреме, иако анализата на гликан се покажа како корисна алатка за сеопфатна анализа на структурата на гликанот, тешко е да се проценат олигосахаридите со низок DP растворливи во вода користејќи методи на антитела.Помалите ДП олигосахариди со молекуларна тежина помала од 5-10 kDa не се врзуваат за ELISA плочите 33, 34 и се измиваат пред додавање на антитела.
Овде, за прв пат, демонстрираме анализа на ELISA на плочи обложени со авидин користејќи моноклонални антитела, комбинирајќи постапка на биотинилација во еден чекор за растворливи огноотпорни олигосахариди со анализа на гликом.Нашиот пристап кон анализата на гликом беше потврден со анализа заснована на MALDI-TOF-MS и GC-MS на комплементарни олигосахаридни врски користејќи дериватизација на триметилсилил (TMS) на хидролизирани шеќерни композиции.Овој иновативен пристап во иднина може да се развие како метод со висока пропусност и да најде поширока примена во биомедицинските истражувања35.
Пост-транслациските модификации на ензимите и антителата, како што е гликозилацијата,36 влијаат на нивната биолошка активност.На пример, промените во гликозилацијата на серумските протеини играат важна улога во воспалителниот артритис, а промените во гликозилацијата се користат како дијагностички маркери37.Во литературата е забележано дека различни гликани лесно се појавуваат кај различни болести, вклучувајќи хронични инфламаторни заболувања на гастроинтестиналниот тракт и црниот дроб, вирусни инфекции, рак на јајниците, дојката и простатата38,39,40.Разбирањето на структурата на гликаните со помош на методите на гликан ELISA базирани на антитела ќе обезбеди дополнителна доверба во дијагнозата на болеста без употреба на сложени методи на МС.
Нашата претходна студија покажа дека тврдоглавите олигосахариди остануваат нехидролизирани по предтретман и ензимска хидролиза (Слика 1).Во нашата претходно објавена работа, развивме метод на екстракција во цврста фаза со активен јаглен за да се изолираат олигосахаридите од AFEX-претретираниот пченкарен хидролизат (ACSH)8.По првичната екстракција и сепарација, олигосахаридите беа дополнително фракционирани со хроматографија со исклучување на големината (SEC) и собрани по редослед на молекуларна тежина.Шеќерните мономери и олигомери ослободени од различни предтретмани беа анализирани со анализа на составот на шеќер.Кога се споредува содржината на шеќерните олигомери добиени со различни методи на предтретман, присуството на тврдоглави олигосахариди е чест проблем при конверзијата на биомасата во моносахариди и може да доведе до намалување на приносот на шеќер од најмалку 10-15%, па дури и до 18%.САД.Овој метод се користи за понатамошно големо производство на фракции на олигосахариди.Добиениот ACH и неговите последователни фракции со различна молекуларна тежина беа користени како експериментален материјал за карактеризација на олигосахаридите во оваа работа.
По предтретман и ензимска хидролиза, перзистентните олигосахариди останале нехидролизирани.Овде (A) е метод на сепарација на олигосахариди во кој олигосахаридите се изолирани од AFEX претходно третиран хидролиза на пченка (ACSH) со користење на спакуван слој од активен јаглен и земја од дијатомеј;(Б) Метод за сепарација на олигосахариди.Олигосахаридите беа дополнително одвоени со хроматографија со исклучување на големината (SEC);(В) сахаридни мономери и олигомери ослободени од различни предтретмани (разредена киселина: DA, јонска течност: IL и AFEX).Услови за ензимска хидролиза: високо оптоварување со цврсти материи од 25% (w/w) (приближно 8% оптоварување со глукан), 96 часа хидролиза, 20 mg/g комерцијално ензимско оптоварување (сооднос Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) и (D) мономери на шеќер и ослободени оликоаранозатреил корози и олигоаранози-короза-Х. над (ACS).
Анализата на гликан се покажа како корисна алатка за сеопфатна структурна анализа на гликаните во екстракти изолирани од остатоци од цврста биомаса.Сепак, сахаридите растворливи во вода се недоволно застапени со користење на овој традиционален метод41 бидејќи олигосахаридите со мала молекуларна тежина тешко се имобилизираат на ELISA плочите и се измиваат пред додавање на антитела.Затоа, за врзување и карактеризација на антителата, беше користен метод на биотинилација во еден чекор за обложување на растворливи, неусогласени олигосахариди на ELISA плочи обложени со авидин.Овој метод беше тестиран со користење на нашиот претходно произведен ACSH и фракција врз основа на неговата молекуларна тежина (или степен на полимеризација, DP).Биотинилација во еден чекор беше искористена за да се зголеми афинитетот за врзување на олигосахаридите со додавање на биотин-LC-хидразид на редукцискиот крај на јаглехидратите (сл. 2).Во растворот, хемиацеталната група на редукциониот крај реагира со хидразидната група на биотин-LC-хидразид за да формира хидразонска врска.Во присуство на редукционото средство NaCNBH3, хидразонската врска се редуцира до стабилен биотинилиран краен производ.Со модификацијата на крајот за намалување на шеќерот, стана возможно врзувањето на олигосахаридите со ниска DP за ELISA плочите, а во нашата студија тоа беше направено на плочи обложени со авидин користејќи mAbs насочени кон гликан.
Скрининг на моноклонални антитела врз основа на ELISA за биотинилирани олигосахариди.Овде (А) комбинирана биотинилација на олигосахариди и последователен ELISA скрининг со гликан-таргетирани mAbs на плочи обложени со NeutrAvidin и (Б) покажува постапка во еден чекор за биотинилација на реакционите производи.
Плочите обложени со авидин со антитела конјугирани со олигосахари беа додадени на примарните и секундарните антитела и беа измиени во медиум чувствителен на светлина и време.Откако ќе заврши врзувањето на антителата, додадете TMB супстрат за да се инкубира плочата.Реакцијата конечно беше прекината со сулфурна киселина.Инкубираните плочи беа анализирани со помош на читач ELISA за да се одреди јачината на врзување на секое антитело за да се открие вкрстено поврзување специфично за антителата.За детали и параметри на експериментот, видете го соодветниот дел „Материјали и методи“.
Ја демонстрираме корисноста на овој ново развиен метод за специфични апликации со карактеризирање на растворливите олигосахариди присутни во ACSH, како и во сурови и прочистени фракции на олигосахариди изолирани од лигноцелулозни хидролизати.Како што е прикажано на Слика 3, најчестите ксилани супституирани со епитоп идентификувани во ACSH користејќи методи за анализа на биоацилиран гликом обично се уронски (U) или метилуронски (MeU) и пектички арабиногалактани.Повеќето од нив беа пронајдени и во нашата претходна студија за анализа на гликани на нехидролизирани цврсти материи (UHS)43.
Откривање на непослушни олигосахаридни епитопи со помош на моноклонално антитело насочено кон гликанот на клеточниот ѕид.„Неутралната“ фракција е фракцијата ACN, а „киселата“ фракција е фракцијата FA.Посветлата црвена боја на мапата за топлина укажува на поголема содржина на епитоп, а посветлата сина боја означува празна позадина.Вредностите на бојата на скалата се засноваат на необработени OD вредности за формулации N=2.Главните епитопи препознаени од антителата се прикажани десно.
Овие нецелулозни структури не може да се расцепат со најчестите целулази и хемицелулази во тестираната комерцијална ензимска смеса, која ги вклучува најчесто користените комерцијални ензими.Затоа, потребни се нови помошни ензими за нивна хидролиза.Без потребните дополнителни нецелулозни ензими, овие нецелулозни врски спречуваат целосна конверзија во моносахариди, дури и ако нивните матични полимери на шеќер се интензивно хидролизирани во пократки фрагменти и растворени со помош на комерцијални ензимски мешавини.
Понатамошното проучување на дистрибуцијата на сигналот и неговата сила на врзување покажа дека врзувачките епитопи се пониски кај фракциите на шеќер со висока ДП (A, B, C, DP до 20+) отколку кај фракциите со ниска DP (D, E, F, DP) кај димерите) (сл. 1).Киселинските фрагменти се почести во нецелулозни епитопи отколку неутралните фрагменти.Овие феномени се конзистентни со моделот забележан во нашата претходна студија, каде деловите со висока DP и киселина беа поотпорни на ензимска хидролиза.Затоа, присуството на нецелулозни гликански епитопи и U и MeU супституции може многу да придонесат за стабилноста на олигосахаридите.Треба да се забележи дека ефикасноста на врзувањето и откривањето може да биде проблематична за ниско DP олигосахариди, особено ако епитопот е димерен или тримерен олигосахарид.Ова може да се тестира со користење на комерцијални олигосахариди со различна должина, секој од нив содржи само еден епитоп кој се врзува за специфичен mAb.
Така, употребата на антитела специфични за структурата откри одредени типови на непослушни врски.Во зависност од видот на употребеното антитело, соодветната шема на лигатура и јачината на сигналот што го произведува (најмногу и најмалку изобилство), може да се идентификуваат нови ензими и да се додадат полуквантитативно во ензимската смеса за поцелосна гликоконверзија.Земајќи ја анализата на ACSH олигосахаридите како пример, можеме да создадеме база на податоци за гликански врски за секој материјал од биомаса.Овде треба да се забележи дека треба да се земе предвид различниот афинитет на антителата, а доколку нивниот афинитет е непознат, тоа ќе создаде одредени тешкотии при споредување на сигналите на различни антитела.Покрај тоа, споредбата на гликанските врски може најдобро да функционира помеѓу примероците за истото антитело.Овие тврдоглави врски потоа може да се поврзат со базата на податоци на CAZyme, од која можеме да идентификуваме ензими, да избереме ензими кандидати и да тестираме за ензими кои ја раскинуваат врската или да развиеме микробни системи за изразување на овие ензими за употреба во биорафинериите44.
За да оцениме како имунолошките методи ги надополнуваат алтернативните методи за карактеризирање на олигосахариди со мала молекуларна тежина присутни во лигноцелулозни хидролизати, извршивме MALDI (сл. 4, S1-S8) и анализа на сахариди добиени од TMS базирани на GC-MS на истиот панел (сл. 5) олигосахариден дел.MALDI се користи за да се спореди дали масовната дистрибуција на молекулите на олигосахаридите се совпаѓа со планираната структура.На сл.4 го прикажува MC на неутралните компоненти ACN-A и ACN-B.Анализата ACN-A потврди опсег на пентозни шеќери кои се движат од DP 4-8 (сл. 4) до DP 22 (сл. S1), чии тежини одговараат на MeU-ксилан олигосахариди.ACN-B анализата ги потврди сериите на пентоза и глукоксилан со DP 8-15.Во дополнителен материјал како што е Слика S3, мапите за дистрибуција на масата на киселиот дел од FA-C покажуваат опсег на (Me)U супституирани пентозни шеќери со DP од 8-15 кои се конзистентни со супституираните ксилани пронајдени во скринингот на mAb базиран на ELISA.Епитопите се конзистентни.
MALDI-MS спектар на растворливи некомпатибилни олигосахариди присутни во ACS.Овде, (А) ACN-A фракции со низок опсег на тежина кои содржат метилирана уронска киселина (DP 4-8) супституирани глукуроксилан олигосахариди и (B) ACN-B ксилан и метилирана уронска киселина олигосахариди супституирани со глукуроксилан (DP 8-15).
Анализа на составот на гликанскиот остаток на огноотпорните олигосахариди.Еве (А) TMS сахариден состав на различни фракции на олигосахариди добиени со GC-MS анализа.(Б) Структури на различни шеќери добиени од TMS присутни во олигосахаридите.ACN – ацетонитрилна фракција која содржи неутрални олигосахариди и FA – фракција на ферулинска киселина која содржи киселински олигосахариди.
Друг интересен заклучок беше извлечен од LC-MS анализата на фракцијата на олигосахаридот, како што е прикажано на слика S9 (методите може да се видат во електронскиот дополнителен материјал).Фрагменти од хексоза и -OAc групи беа постојано забележани за време на лигатурата на фракцијата ACN-B.Ова откритие не само што ја потврдува фрагментацијата забележана во анализата на гликом и MALDI-TOF, туку дава и нови информации за потенцијалните деривати на јаглени хидрати во претходно третираната лигноцелулозна биомаса.
Ние, исто така, го анализиравме шеќерниот состав на фракцијата на олигосахаридот користејќи дериватизација на шеќерот TMS.Со помош на GC-MS, го утврдивме составот на нервните (не-деривативни) и киселите шеќери (GluA и GalA) во фракцијата на олигосахаридот (сл. 5).Глукуронската киселина се наоѓа во киселинските компоненти Ц и Д, додека галактуронската киселина се наоѓа во киселинските компоненти А и Б, кои и двете се компоненти со висока ДП на киселите шеќери.Овие резултати не само што ги потврдуваат нашите податоци за ELISA и MALDI, туку се конзистентни и со нашите претходни студии за акумулација на олигосахариди.Затоа, ние веруваме дека современите имунолошки методи кои користат биотинилација на олигосахариди и последователен скрининг на ELISA се доволни за откривање на растворливи непослушни олигосахариди во различни биолошки примероци.
Бидејќи методите за скрининг на mAb базирани на ELISA се потврдени со неколку различни методи, сакавме дополнително да го истражиме потенцијалот на овој нов квантитативен метод.Два комерцијални олигосахариди, ксилохексасахарид олигосахарид (XHE) и 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX), беа купени и тестирани со користење на нов пристап mAb насочен кон гликанот на клеточниот ѕид.Слика 6 покажува линеарна корелација помеѓу биотинилираниот сврзувачки сигнал и лог концентрацијата на концентрацијата на олигосахариди, што укажува на можен модел на адсорпција на Лангмуир.Помеѓу mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 и CCRC-M151 се во корелација со XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 и LM11 во корелација со A2XX nm во опсег од 11.Поради ограничената достапност на антитела за време на експериментот, беа извршени ограничени експерименти со секоја концентрација на олигосахариди.Овде треба да се забележи дека некои антитела реагираат многу различно на истиот олигосахарид како супстрат, веројатно затоа што се врзуваат за малку различни епитопи и можат да имаат многу различни врзувачки афинитети.Механизмите и импликациите на точната идентификација на епитопот ќе бидат многу посложени кога новиот пристап mAb ќе се примени на вистински примероци.
Два комерцијални олигосахариди беа користени за да се одреди опсегот на откривање на различни mAbs кои таргетираат гликан.Овде, линеарните корелации со лог концентрацијата на концентрацијата на олигосахаридите укажуваат на моделите на адсорпција на Лангмуир за (A) XHE со mAb и (B) A2XX со mAb.Соодветните епитопи укажуваат на структурите на комерцијалните олигосахариди кои се користат како супстрати во анализата.
Употребата на моноклонални антитела насочени кон гликан (гликокомична анализа или скрининг на mAb базирана на ELISA) е моќна алатка за длабинска карактеризација на повеќето од главните гликани на клеточниот ѕид што ја сочинуваат растителната биомаса.Сепак, класичната гликанска анализа ги карактеризира само поголемите гликани на клеточниот ѕид, бидејќи повеќето олигосахариди не се ефикасно имобилизирани на ELISA плочите.Во оваа студија, пченката претходно третирана со AFEX беше ензимски хидролизирана со висока содржина на цврсти материи.Анализата на шеќер беше искористена за да се одреди составот на јаглехидратите на непослушните клеточни ѕидови во хидролизатот.Сепак, mAb анализата на помалите олигосахариди во хидролизатите е потценета и потребни се дополнителни алатки за ефикасно да се имобилизираат олигосахаридите на ELISA плочите.
Овде известуваме за нов и ефикасен метод за имобилизација на олигосахариди за скрининг на mAb со комбинирање на олигосахаридна биотинилација проследена со ELISA скрининг на плочи обложени со NeutrAvidin™.Имобилизираните биотинилирани олигосахариди покажаа доволен афинитет за антителото за да се овозможи брзо и ефикасно откривање на непослушните олигосахариди.Анализата на составот на овие тврдоглави олигосахариди врз основа на масена спектрометрија ги потврди резултатите од овој нов пристап за имуноскрининг.Така, овие студии покажуваат дека комбинацијата на биотинилација на олигосахариди и скрининг ELISA со моноклонални антитела насочени кон гликан може да се користи за откривање на вкрстени врски во олигосахаридите и може широко да се примени во други биохемиски студии кои ја карактеризираат структурата на олигосахаридите.
Овој метод на профилирање на гликан базиран на биотин е првиот извештај способен да ги истражи непопустливите јаглехидратни врски на растворливите олигосахариди во растителната биомаса.Ова помага да се разбере зошто некои делови од биомасата се толку тврдоглави кога станува збор за производство на биогориво.Овој метод пополнува важна празнина во методите за анализа на гликом и ја проширува својата примена на поширок опсег на супстрати надвор од растителните олигосахариди.Во иднина, може да користиме роботика за биотинилација и да го користиме методот што го развивме за анализа на примероци со висока пропусност со помош на ELISA.
Пченкарната слама (CS) одгледувана од хибридните семиња Pioneer 33A14 беше собрана во 2010 година од Крамер фармите во Реј, Колорадо.Со дозвола на сопственикот на земјиштето, оваа биомаса може да се користи за истражување. Примероците беа складирани на суви <6% влага во кеси со патент на собна температура. Примероците беа складирани на суви <6% влага во кеси со патент на собна температура. Образцы храниль сухими при влажности < 6% во пакетах со застежкой-молнией при комнатной температура. Примероците се чуваат суви на <6% влажност во кеси со патент на собна температура.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах со застежкой-молнией при комнатной температура со влажностью < 6%. Примероците се чуваат во патент кеси на собна температура со влажност < 6%.Студијата беше во согласност со локалните и националните упатства.Анализата на составот е направена со помош на протоколот NREL.Утврдено е дека составот содржи 31,4% глукан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% протеини и 13,4% пепел.
Cellic® CTec2 (138 mg протеин/ml, многу VCNI 0001) е комплексна мешавина од целулаза, β-глукозидаза и Cellic® HTec2 (157 mg протеин/ml, многу VHN00001) од Novozymes (Франклинтон, NC, САД)).Multifect Pectinase® (72 mg протеин/mL), комплексна мешавина на ензими за деградирање на пектин, беше донирана од DuPont Industrial Biosciences (Пало Алто, Калифорнија, САД).Концентрациите на ензимскиот протеин беа одредени со проценка на содржината на протеини (и одземање на придонесот на непротеинскиот азот) со помош на анализа на азот Кјелдал (AOAC метод 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, САД).Дијатомејска земја 545 беше купена од EMD Millipore (Billerica, MA).Активиран јаглерод (DARCO, гранули од 100 mesh), Avicel (PH-101), буков ксилан и сите други хемикалии беа купени од Сигма-Олдрич (Сент Луис, MO).
Предтретманот AFEX беше изведен во GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Пред-третманот беше спроведен на 140 ° C за 15 минути.46 време на престој во однос 1:1 на безводен амонијак и биомаса при полнење од 60% (w/w) во сериски реактор на маса од нерѓосувачки челик (Parr Instruments Company).Беа потребни 30 минути.Реакторот беше доведен до 140 ° C и амонијакот беше брзо ослободен, овозможувајќи и на биомасата брзо да се врати на собна температура.Составот на AFEX предтретираниот шприц со пченка (ACS) беше сличен на оној на нетретиран пченка (UT-CS).
ACSH со висока содржина на цврсти материи 25% (w/w) (приближно 8% оптоварување на декстран) беше подготвен како почетен материјал за производство на олигосахариди во големи размери.Ензимската хидролиза на ACS беше изведена со користење на комерцијална ензимска смеса вклучувајќи Cellic® Ctec2 10 mg протеин/g глукан (во претходно третирана биомаса), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg протеин/g глукан и Multifect Pectinase (Genencor Inc, САД).).), 5 mg протеин/g декстран.Ензимската хидролиза беше спроведена во 5-литарски биореактор со работен волумен од 3 литри, pH 4,8, 50°C и 250 вртежи во минута.По хидролиза во тек на 96 часа, хидролизатот беше собран со центрифугирање на 6000 вртежи во минута за 30 минути, а потоа на 14000 вртежи во минута за 30 минути за да се отстранат нехидролизираните цврсти материи.Хидролизатот потоа беше подложен на стерилна филтрација преку филтер чаша од 0,22 mm.Филтрираниот хидролизат се чуваше во стерилни шишиња на 4°C, а потоа се фракционираше на јаглерод.
Анализа на составот на примероци од биомаса базирани на екстракт според процедурите за лабораториска анализа на NREL: подготовка на примероци за анализа на составот (NREL/TP-510-42620) и определување на структурни јаглехидрати и лигнин во биомаса (NREL/TP-510 – 42618)47.
Анализата на олигосахаридите на протокот на хидролизатот беше изведена на скала од 2 ml користејќи метод на киселинска хидролиза базирана на автоклав.Измешајте го примерокот од хидролизатот со 69,7 µl 72% сулфурна киселина во туба за култура од 10 ml и инкубирајте 1 час на клупа на 121 °C, изладете се на мраз и филтрирајте во вијала со течна хроматографија со високи перформанси (HPLC).Концентрацијата на олигосахаридите беше одредена со одземање на концентрацијата на моносахариди во нехидролизираниот примерок од вкупната концентрација на шеќер во киселински хидролизираниот примерок.
Концентрациите на гликоза, ксилоза и арабиноза во киселинската хидролизирана биомаса беа анализирани со користење на систем Shimadzu HPLC опремен со автосемплер, грејач на колони, изократска пумпа и детектор со индекс на рефракција на колона Bio-Rad Aminex HPX-87H.Колоната се одржуваше на 50°C и елуирана со 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 во вода.проток.
Супернатантот на хидролизатот беше разреден и анализиран за содржината на мономери и олигосахариди.Мономерните шеќери добиени по ензимска хидролиза беа анализирани со HPLC опремена со колона Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P и колона за заштита од пепел.Температурата на колоната се одржуваше на 80°C, како мобилна фаза се користеше вода со брзина на проток од 0,6 ml/min.Олигосахаридите беа одредени со хидролиза во разредена киселина на 121°C според методите опишани во реф.41, 48, 49.
Анализата на сахаридите беше изведена на сурови, претходно третирани со AFEX и сите нехидролизирани остатоци од биомаса (вклучувајќи производство на сериски екстракти од клеточниот ѕид и нивно скрининг на mAb) користејќи претходно опишани процедури 27, 43, 50, 51.За анализа на гликом, нерастворливите во алкохол остатоци од материјалот на растителниот клеточен ѕид се подготвуваат од остатоци од биомаса и се подложени на сериска екстракција со сè поагресивни реагенси како што се амониум оксалат (50 mM), натриум карбонат (50 mM и 0,5% w/v), CON.(1M и 4M, и двете со 1% w/v натриум борохидрид) и киселински хлорит како што е претходно опишано52,53.Екстрактите потоа беа подложени на ELISA против комплексен панел од mAb50 насочени кон гликанот на клеточниот ѕид, а реакциите на врзување на mAb беа претставени како топлинска карта.mAbs кои го таргетираат гликанот на растителниот клеточен ѕид беа купени од лабораториски резерви (CCRC, JIM и MAC серии).
Едностепена биотинилација на олигосахариди.Конјугацијата на јаглехидратите со биотин-LC-хидразид беше извршена со следнава постапка.Биотин-LC-хидразид (4,6 mg/12 μmol) беше растворен во диметил сулфоксид (DMSO, 70 μl) со енергично мешање и загревање на 65 ° C за 1 мин.Беше додадена глацијална оцетна киселина (30 µl) и смесата беше истурена на натриум цијаноборохидрид (6,4 mg/100 µmol) и целосно растворена по загревање на 65 ° C околу 1 минута.Потоа, од 5 до 8 μl од реакционата смеса се додадени во исушениот олигосахарид (1-100 nmol) за да се добие 10-кратен или повеќе моларен вишок на етикетата над редукциониот крај.Реакцијата беше спроведена на 65 ° C за 2 часа, по што примероците беа веднаш прочистени.Не беше користен натриум цијаноборохидрид во експериментите за означување без редукција, а примероците беа реагирани на 65 ° C за 2,5 часа.
ELISA обложување и миење на примероци од биотинилирани олигосахариди.25 μl биотинилирани примероци (100 μl од секој концентриран примерок разреден во 5 ml од 0,1 М Tris пуфер раствор (TBS)) беа додадени во секој бунар на плочата обложена со авидин.Контролните бунари беа обложени со 50 μl биотин во концентрација од 10 μg/ml во 0,1 M TBS.Дејонизираната вода се користеше како облога за бланко мерења.Таблетата се инкубираше 2 часа на собна температура во темница.Измијте ја плочата 3 пати со 0,1% обезмастено млеко во 0,1 M TBS користејќи програма бр.11 за станот Грениер 3А.
Додавање и миење на примарни антитела.Додадете 40 µl примарно антитело во секоја буна.Инкубирајте ја микроплочката 1 час на собна температура во темница.Плочите потоа беа измиени 3 пати со 0,1% млеко во 0,1 M TBS користејќи програма за миење #11 за Grenier Flat 3A.
Додадете секундарни антитела и измијте.Додадете 50 µl секундарно антитело од глушец/стаорец (разредено 1:5000 во 0,1% млеко во 0,1 M TBS) во секоја буна.Инкубирајте ја микроплочката 1 час на собна температура во темница.Микроплочите потоа беа измиени 5 пати со 0,1% млеко во 0,1 M TBS со помош на програмата за миење чинии Grenier Flat 5A #12.
Додавање на подлога.Додадете 50 µl 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB) на основната подлога (со додавање 2 капки пуфер, 3 капки TMB, 2 капки водород пероксид на 15 ml дејонизирана вода).Подгответе ја TMB подлогата.и вител пред употреба).Инкубирајте ја микроплочката на собна температура 30 минути.Во темница.
Завршете го чекорот и прочитајте го таблетот.Додадете 50 µl 1 N сулфурна киселина во секоја бунар и запишете ја апсорпцијата од 450 до 655 nm со помош на читач ELISA.
Подгответе 1 mg/ml раствори од овие аналити во дејонизирана вода: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактуронска киселина (GalA), глукуронска киселина (GlcA), маноза, гликоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманозамин (manNAc.(glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (внатрешен стандард).Беа подготвени два стандарда со додавање на раствори од шеќер од 1 mg/mL прикажани во Табела 1. Примероците се замрзнуваат и лиофилизираат на -80°C додека не се отстрани целата вода (обично околу 12-18 часа).
Додадете 100–500 µg примерок во цевките со капаче за заврткање на аналитичка вага.Запишете ја додадената сума.Најдобро е примерокот да се раствори во одредена концентрација на растворувач и да се додаде во епруветата како течен дел.Користете 20 µl од 1 mg/ml инозитол како внатрешен стандард за секоја епрувета за примерок.Количината на внатрешен стандард додадена на мострата мора да биде иста со количината на внатрешен стандард додаден во стандардната цевка.
Додадете 8 ml безводен метанол во вијалата со заврткана капа.Потоа 4 ml од 3 N. метанолен HCl раствор, капак и протресен.Овој процес не користи вода.
Додадете 500 µl 1 M HCl раствор на метанол во примероците на олигосахариди и стандардните TMS цевки.Примероците се инкубираат преку ноќ (168 часа) на 80°C во термички блок.Исушете го производот за метанолиза на собна температура со помош на колектор за сушење.Додадете 200 µl MeOH и повторно исушете.Овој процес се повторува двапати.Додадете 200 µl метанол, 100 µl пиридин и 100 µl оцетен анхидрид во мострата и добро измешајте.Примероците се инкубираат на собна температура 30 минути.и се суши.Додадете 200 µl метанол и повторно исушете.
Додадете 200 µl Tri-Sil и загрејте ја капакот на цевката 20 минути.80°C, а потоа се лади на собна температура.Користете колектор за сушење за дополнително сушење на примерокот до волумен од приближно 50 µl.Важно е да се напомене дека не дозволивме примероците целосно да се исушат.
Додадете 2 ml хексан и добро измешајте со вртлог.Наполнете ги врвовите на пипетите Пастер (5-8 мм) со парче стаклена волна така што ќе ја вметнете стаклената волна на врвот на пипета со дијаметар од 5-3/4 инчи.Примероците беа центрифугирани на 3000 g за 2 минути.Сите нерастворливи остатоци се таложат.Исушете го примерокот на 100-150 µl.Волумен од приближно 1 μl беше инјектиран во GC-MS на почетна температура од 80 °C и почетно време од 2,0 минути (Табела 2).