Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Нови имунолошки и масеноспектрометриски методи за комплексна анализа на перзистентни олигосахариди во пченкарен штук претходно третиран со AFEX. Лигноцелулозната биомаса е одржлива алтернатива на фосилните горива и е широко користена за развој на биотехнологии за производство на производи како што се храна, добиточна храна, горива и хемикалии. Клучот за овие технологии е развојот на конкурентни процеси во однос на цената за претворање на сложените јаглехидрати присутни во клеточните ѕидови на растенијата во едноставни шеќери како што се гликоза, ксилоза и арабиноза. Бидејќи лигноцелулозната биомаса е многу тврдоглава, таа мора да биде подложена на термохемиски третмани (на пр., ексфолијација на амонијак со влакна (AFEX), разредени киселини (DA), јонски течности (IL)) и биолошки третмани (на пр., ензимска хидролиза и микробна ферментација) во комбинација за да се добие посакуваниот производ. . Меѓутоа, кога во процесот на хидролиза се користат комерцијални габични ензими, само 75-85% од формираните растворливи шеќери се моносахариди, а преостанатите 15-25% се растворливи, неконтролирани олигосахариди, кои не се секогаш достапни за микроорганизмите. Претходно, успешно изолиравме и прочистивме растворливи тврдоглави олигосахариди користејќи комбинација од хроматографија за сепарација и исклучување на големината со јаглерод и дијатомејска земја, а исто така ги испитавме и нивните ензимски инхибиторни својства. Откривме дека олигосахаридите што содржат супституции на метилирана уронска киселина со повисок степен на полимеризација (DP) се потешки за обработка со комерцијални ензимски мешавини отколку ниско DP и неутралните олигосахариди. Овде го објавуваме користењето на неколку дополнителни методи, вклучувајќи профилирање на гликани со употреба на моноклонални антитела (mAbs) специфични за гликаните од растителната биомаса за карактеризирање на гликанските врски во клеточните ѕидови на растенијата и ензимските хидролизати, јонизација со ласерска десорпција со помош на матрица, масена спектрометрија со време на лет. . MALDI-TOF-MS) користи дијагностички врвови со информативна структура добиени со спектроскопија по секундарно распаѓање на негативни јони, гасна хроматографија и масена спектрометрија (GC-MS) за карактеризирање на олигосахаридните врски со и без дериватизација. Поради малата големина на олигосахаридите (DP 4–20), овие молекули се тешки за употреба за врзување и карактеризација на mAb. За да го надминеме овој проблем, применивме нов метод на имобилизација на олигосахариди базиран на биотин конјугација, кој успешно ги обележа повеќето олигосахариди растворливи со низок DP на површината на микроплочката, што потоа беше искористено во систем со висок проток на mAb за специфична анализа на лигација. Овој нов метод ќе го олесни развојот на понапредни анализи на гликом со висок проток во иднина, кои можат да се користат за изолирање и карактеризирање на олигосахариди присутни во биомаркерите за дијагностички цели.
Лигноцелулозната биомаса, составена од земјоделски, шумски, тревни и дрвенести материјали, е потенцијална суровина за производство на био-базирани производи, вклучувајќи храна, добиточна храна, гориво и хемиски прекурсори за производство на производи со повисока вредност1. Јаглехидратите (како што се целулоза и хемицелулоза) присутни во клеточните ѕидови на растенијата се деполимеризираат во моносахариди преку хемиска обработка и биотрансформација (како што се ензимска хидролиза и микробна ферментација). Вообичаените претходни третмани вклучуваат експанзија на амонијак влакна (AFEX), разредена киселина (DA), јонска течност (IL) и експлозија на пареа (SE), кои користат комбинација од хемикалии и топлина за да го намалат производството на лигноцелулоза со отворање на клеточните ѕидови на растенијата3,4. тврдоглавост на материјата, 5. Ензимската хидролиза се изведува при големо оптоварување со цврсти материи со користење на комерцијални активни ензими што содржат јаглехидрати (CAZymes) и микробна ферментација со користење на трансгени квасци или бактерии за производство на био-базирани горива и хемикалии6.
CAZyмите во комерцијалните ензими се составени од комплексна мешавина од ензими кои синергистички ги раскинуваат сложените врски јаглехидрати-шеќер за да формираат моносахариди2,7. Како што објавивме претходно, комплексната мрежа на ароматични полимери на лигнин со јаглехидрати ги прави многу неподносливи, што доведува до нецелосна конверзија на шеќер, акумулирајќи 15-25% од половите олигосахариди кои не се произведуваат за време на ензимската хидролиза на претходно третираната биомаса. Ова е чест проблем со различните методи на претходна обработка на биомасата. Некои причини за ова тесно грло вклучуваат инхибиција на ензимите за време на хидролизата или отсуство или ниски нивоа на есенцијални есенцијални ензими кои се потребни за раскинување на шеќерните врски во растителната биомаса. Разбирањето на составот и структурните карактеристики на шеќерите, како што се шеќерните врски во олигосахаридите, ќе ни помогне да ја подобриме конверзијата на шеќер за време на хидролизата, правејќи ги биотехнолошките процеси конкурентни во однос на трошоците со производите добиени од нафта.
Одредувањето на структурата на јаглехидратите е предизвикувачко и бара комбинација од методи како што се течна хроматографија (LC)11,12, спектроскопија на нуклеарна магнетна резонанца (NMR)13, капиларна електрофореза (CE)14,15,16 и масена спектрометрија (MS)17. , осумнаесет. MS методите како што се масена спектрометрија со време на лет со ласерска десорпција и јонизација со употреба на матрица (MALDI-TOF-MS) се разновиден метод за идентификување на структури на јаглехидрати. Неодамна, тандемската MS со дисоцијација предизвикана од судир (CID) на адукти на натриум јони е најшироко користена за идентификување на отпечатоци од прсти што одговараат на позициите на прицврстување на олигосахариди, аномерните конфигурации, секвенците и позициите на разгранување 20, 21.
Гликанската анализа е одлична алатка за длабинска идентификација на јаглехидратните врски22. Овој метод користи моноклонални антитела (mAbs) насочени кон гликанот на растителниот клеточен ѕид како сонди за разбирање на сложените јаглехидратни врски. Повеќе од 250 mAbs се достапни низ целиот свет, дизајнирани против разни линеарни и разгранети олигосахариди користејќи различни сахариди24. Неколку mAbs се широко користени за карактеризирање на структурата, составот и модификациите на растителниот клеточен ѕид, бидејќи постојат значителни разлики во зависност од типот на растителна клетка, органот, возраста, фазата на развој и средината на раст25,26. Во поново време, овој метод се користи за разбирање на популациите на везикули во растителните и животинските системи и нивните соодветни улоги во транспортот на гликани, како што се утврдени со субцелуларни маркери, фази на развој или стимули од животната средина, и за одредување на ензимската активност. Некои од различните структури на гликани и ксилани што се идентификувани вклучуваат пектин (P), ксилан (X), манан (M), ксилоглукани (XylG), глукани со мешани врски (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманан (GalG), глукуронска киселина-арабиноксилан (GArbX) и арабино-галактан (ArbG)29.
Сепак, и покрај сите овие истражувачки напори, само неколку студии се фокусираа на природата на акумулацијата на олигосахариди за време на хидролизата со високо оптоварување со цврсти материи (HSL), вклучувајќи ослободување на олигосахариди, промени во должината на олигомерните ланци за време на хидролизата, разни полимери со низок DP и нивните криви дистрибуции 30,31,32. Во меѓувреме, иако анализата на гликанот се покажа како корисна алатка за сеопфатна анализа на структурата на гликанот, тешко е да се евалуираат растворливите во вода олигосахариди со низок DP со користење на методи на антитела. Помалите DP олигосахариди со молекуларна тежина помала од 5-10 kDa не се врзуваат за ELISA плочите 33, 34 и се измиваат пред додавањето на антителата.
Тука, за прв пат, демонстрираме ELISA тест на плочи обложени со авидин со употреба на моноклонални антитела, комбинирајќи постапка на биотинилација во еден чекор за растворливи рефракторни олигосахариди со анализа на гликом. Нашиот пристап кон анализата на гликом беше потврден со анализа базирана на MALDI-TOF-MS и GC-MS на комплементарни олигосахаридни врски со употреба на триметилсилил (TMS) дериватизација на хидролизирани шеќерни состави. Овој иновативен пристап може да се развие како метод со висок проток во иднина и да најде поширока примена во биомедицинските истражувања35.
Пост-транслационите модификации на ензимите и антителата, како што е гликозилацијата,36 влијаат на нивната биолошка активност. На пример, промените во гликозилацијата на серумските протеини играат важна улога кај воспалителниот артритис, а промените во гликозилацијата се користат како дијагностички маркери37. Во литературата е објавено дека разни гликани лесно се појавуваат кај различни болести, вклучувајќи хронични воспалителни заболувања на гастроинтестиналниот тракт и црниот дроб, вирусни инфекции, рак на јајници, дојка и простата38,39,40. Разбирањето на структурата на гликаните со употреба на ELISA методи на гликани базирани на антитела ќе обезбеди дополнителна доверба во дијагностицирањето на болестите без употреба на сложени методи на МС.
Нашата претходна студија покажа дека тврдокорните олигосахариди остануваат нехидролизирани по претходната обработка и ензимската хидролиза (Слика 1). Во нашата претходно објавена работа, развивме метод на екстракција во цврста фаза со активен јаглен за да изолираме олигосахариди од претходно третиран хидролизат од пченка (ACSH)8 со AFEX. По почетната екстракција и сепарација, олигосахаридите беа дополнително фракционирани со хроматографија со исклучување на големината (SEC) и собрани по редослед на молекуларна тежина. Мономерите на шеќер и олигомерите ослободени од различни претходни третмани беа анализирани со анализа на составот на шеќерот. При споредување на содржината на олигомерите на шеќер добиени со различни методи на претходна обработка, присуството на тврдокорни олигосахариди е чест проблем при конверзијата на биомасата во моносахариди и може да доведе до намалување на приносот на шеќер од најмалку 10-15%, па дури и до 18%. САД. Овој метод се користи за понатамошно производство на фракции на олигосахариди во голем обем. Добиениот ACH и неговите последователни фракции со различни молекуларни тежини беа користени како експериментален материјал за карактеризација на олигосахаридите во оваа работа.
По претходна обработка и ензимска хидролиза, перзистентните олигосахариди останаа нехидролизирани. Овде (А) е прикажан метод на сепарација на олигосахариди во кој олигосахаридите се изолираат од хидролизат на пченкарен шпајз (ACSH) претходно третиран со AFEX користејќи спакуван слој од активен јаглен и дијатомејска земја; (Б) Метод за сепарација на олигосахариди. Олигосахаридите беа дополнително одвоени со хроматографија со исклучување на големината (SEC); (В) Мономери и олигомери на сахариди ослободени од различни претходни обработки (разредена киселина: DA, јонска течност: IL и AFEX). Услови на ензимска хидролиза: високо оптоварување со цврсти материи од 25% (w/w) (приближно 8% оптоварување со глукан), хидролиза од 96 часа, оптоварување со комерцијален ензим од 20 mg/g (однос Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) и (Г) Мономери и олигомери на шеќер на гликоза, ксилоза и арабиноза ослободени од претходно третиран пченкарен шпајз (ACS) со AFEX.
Гликанската анализа се покажа како корисна алатка за сеопфатна структурна анализа на гликаните во екстракти изолирани од цврсти остатоци од биомаса. Сепак, сахаридите растворливи во вода се недоволно застапени со користење на овој традиционален метод41 бидејќи олигосахаридите со мала молекуларна тежина тешко се имобилизираат на ELISA плочи и се измиваат пред додавање на антитела. Затоа, за врзување и карактеризација на антитела, беше користен едночекорен метод на биотинилација за премачкување на растворливи, некомплијантни олигосахариди на ELISA плочи обложени со авидин. Овој метод беше тестиран со користење на нашиот претходно произведен ACSH и фракција базирана на неговата молекуларна тежина (или степен на полимеризација, DP). Едночекорната биотинилација беше користена за зголемување на афинитетот на врзување на олигосахариди со додавање на биотин-LC-хидразид на редуцирачкиот крај на јаглехидратот (Сл. 2). Во раствор, хемиацеталната група на редуцирачкиот крај реагира со хидразидната група на биотин-LC-хидразид за да формира хидразонска врска. Во присуство на редуцирачкиот агенс NaCNBH3, хидразонската врска се редуцира до стабилен биотинилиран краен производ. Со модификацијата на крајот за намалување на шеќерот, стана можно врзување на олигосахариди со низок DP за ELISA плочи, а во нашата студија ова беше направено на плочи обложени со авидин користејќи гликански-таргетирани mAbs.
Скрининг на моноклонални антитела врз основа на ELISA за биотинилирани олигосахариди. Овде (А) комбинирана биотинилација на олигосахариди и последователно ELISA скрининг со mAbs насочени кон гликан на плочи обложени со NeutrAvidin и (Б) е прикажана едночекорна постапка за биотинилација на реакциските продукти.
Потоа, плочи обложени со авидин со антитела конјугирани со олигосахарид беа додадени на примарните и секундарните антитела и измиени во медиум чувствителен на светлина и време. Откако врзувањето на антителата ќе биде завршено, додадете TMB супстрат за да ја инкубирате плочата. Реакцијата конечно беше запрена со сулфурна киселина. Инкубираните плочи беа анализирани со помош на ELISA читач за да се одреди јачината на врзување на секое антитело за да се открие вкрстено поврзување специфично за антителата. За детали и параметри на експериментот, видете го соодветниот дел „Материјали и методи“.
Ја демонстрираме корисноста на овој новоразвиен метод за специфични апликации со карактеризирање на растворливите олигосахариди присутни во ACSH, како и во сурови и прочистени фракции на олигосахариди изолирани од лигноцелулозни хидролизати. Како што е прикажано на Слика 3, најчестите епитоп-супституирани ксилани идентификувани во ACSH со користење на методи за анализа на биоацилиран гликом се обично уронски (U) или метилуронски (MeU) и пектински арабиногалактани. Повеќето од нив беа пронајдени и во нашата претходна студија за анализа на гликани на нехидролизирани цврсти материи (UHS)43.
Детекција на резистентни олигосахаридни епитопи со употреба на моноклонално антитело насочено кон гликанот на клеточниот ѕид. „Неутралната“ фракција е ACN фракцијата, а „киселата“ фракција е FA фракцијата. Посветлите црвени на топлинската мапа означуваат поголема содржина на епитопи, а посветлите сини означуваат празна позадина. Вредностите на бојата на скалата се базираат на сурови вредности на OD за формулациите N=2. Главните епитопи препознаени од антителата се прикажани од десно.
Овие нецелулозни структури не можеа да се разложат од најчестите целулази и хемицелулази во тестираната комерцијална мешавина од ензими, која ги вклучува најчесто користените комерцијални ензими. Затоа, потребни се нови помошни ензими за нивна хидролиза. Без потребните нецелулозни помошни ензими, овие нецелулозни врски спречуваат целосна конверзија во моносахариди, дури и ако нивните матични шеќерни полимери се екстензивно хидролизирани во пократки фрагменти и растворени со користење на комерцијални мешавини од ензими.
Понатамошното проучување на дистрибуцијата на сигналот и неговата јачина на врзување покажа дека епитопите на врзување биле пониски кај шеќерните фракции со висок DP (A, B, C, DP до 20+) отколку кај фракциите со низок DP (D, E, F, DP) кај димерите (Сл. 1). Киселинските фрагменти се почести кај нецелулозните епитопи отколку кај неутралните фрагменти. Овие феномени се во согласност со моделот забележан во нашата претходна студија, каде што високиот DP и киселинските делови биле поотпорни на ензимска хидролиза. Затоа, присуството на нецелулозни гликански епитопи и супституциите на U и MeU може во голема мера да придонесе за стабилноста на олигосахаридите. Треба да се напомене дека ефикасноста на врзување и детекција може да биде проблематична за олигосахаридите со низок DP, особено ако епитопот е димерен или тримерен олигосахарид. Ова може да се тестира со користење на комерцијални олигосахариди со различни должини, од кои секој содржи само еден епитоп што се врзува за специфичен mAb.
Така, употребата на антитела специфични за структурата откри одредени видови на отпорни врски. Во зависност од видот на употребеното антитело, соодветниот модел на лигација и јачината на сигналот што го произведува (најчесто и најмалку застапено), може да се идентификуваат нови ензими и полуквантитативно да се додадат во ензимската мешавина за поцелосна гликоконверзија. Земајќи ја анализата на ACSH олигосахаридите како пример, можеме да создадеме база на податоци за гликански врски за секој материјал од биомаса. Треба да се напомене дека треба да се земе предвид различниот афинитет на антителата, а ако нивниот афинитет е непознат, ова ќе создаде одредени тешкотии при споредување на сигналите на различни антитела. Покрај тоа, споредбата на гликанските врски може најдобро да функционира помеѓу примероците за истото антитело. Овие тврдоглави врски потоа можат да се поврзат со базата на податоци CAZyme, од која можеме да идентификуваме ензими, да избереме кандидат ензими и да тестираме ензими што ги прекинуваат врските или да развиеме микробни системи за да ги експресираме овие ензими за употреба во биорафинерии44.
За да се оцени како имунолошките методи ги надополнуваат алтернативните методи за карактеризирање на олигосахариди со ниска молекуларна тежина присутни во лигноцелулозни хидролизати, извршивме MALDI (сл. 4, S1-S8) и анализа на сахариди добиени од TMS врз основа на GC-MS на истиот панел (сл. 5) олигосахариден дел. MALDI се користи за да се спореди дали распределбата на масата на молекулите на олигосахаридите се совпаѓа со наменетата структура. На сл. 4 е прикажана MC на неутралните компоненти ACN-A и ACN-B. ACN-A анализата потврди опсег на пентозни шеќери кои се движат од DP 4-8 (сл. 4) до DP 22 (сл. S1), чии тежини одговараат на MeU-ксилан олигосахариди. ACN-B анализата ги потврди сериите на пентоза и глукоксилан со DP 8-15. Во дополнителниот материјал како што е Слика S3, мапите на распределба на масата на киселиот дел од FA-C покажуваат опсег на (Me)U супституирани пентозни шеќери со DP од 8-15 што се конзистентни со супституираните ксилани пронајдени во ELISA-базиран скрининг на mAb. Епитопите се конзистентни.
MALDI-MS спектар на растворливи некомплијантни олигосахариди присутни во ACS. Овде, (A) ACN-A фракции со низок тежински опсег што содржат метилирана уронска киселина (DP 4-8) супституирани глукуроксилан олигосахариди и (B) ACN-B ксилан и метилирани уронски киселински олигосахариди супституирани со глукуроксилан (DP 8-15).
Анализа на составот на гликанскиот остаток на рефракторни олигосахариди. Овде (A) TMS сахариден состав на различни олигосахаридни фракции добиени со употреба на GC-MS анализа. (B) Структури на различни TMS-добиени шеќери присутни во олигосахаридите. ACN – ацетонитрилна фракција што содржи неутрални олигосахариди и FA – ферулинска киселинска фракција што содржи кисели олигосахариди.
Друг интересен заклучок беше извлечен од LC-MS анализата на олигосахаридната фракција, како што е прикажано на Слика S9 (методите може да се видат во електронскиот дополнителен материјал). Фрагменти од хексоза и -OAc групи беа постојано забележани за време на лигацијата на ACN-B фракцијата. Ова откритие не само што ја потврдува фрагментацијата забележана во гликомската и MALDI-TOF анализата, туку дава и нови информации за потенцијалните деривати на јаглехидрати во претходно третираната лигноцелулозна биомаса.
Исто така, го анализиравме составот на шеќерот во олигосахаридната фракција користејќи TMS дериватизација на шеќер. Користејќи GC-MS, го определивме составот на неврални (недеривативни) и кисели шеќери (GluA и GalA) во олигосахаридната фракција (Сл. 5). Глукуронската киселина се наоѓа во киселите компоненти C и D, додека галактуронската киселина се наоѓа во киселите компоненти A и B, кои се компоненти со висок DP на киселите шеќери. Овие резултати не само што ги потврдуваат нашите ELISA и MALDI податоци, туку се и во согласност со нашите претходни студии за акумулација на олигосахариди. Затоа, веруваме дека современите имунолошки методи што користат биотинилација на олигосахариди и последователно ELISA скрининг се доволни за откривање на растворливи отпорни олигосахариди во различни биолошки примероци.
Бидејќи методите за скрининг на mAb базирани на ELISA се валидирани со неколку различни методи, сакавме понатаму да го истражиме потенцијалот на овој нов квантитативен метод. Два комерцијални олигосахариди, ксилохексасахариден олигосахарид (XHE) и 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX), беа купени и тестирани со користење на нов пристап на mAb насочен кон гликанот на клеточниот ѕид. Слика 6 покажува линеарна корелација помеѓу биотинилираниот сигнал за врзување и логаритамската концентрација на концентрацијата на олигосахарид, што сугерира можен модел на адсорпција на Лангмјур. Меѓу mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 и CCRC-M151 корелираа со XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 и LM11 корелираа со A2XX во опсег од 1 nm до 100 нано. Поради ограничената достапност на антитела за време на експериментот, беа извршени ограничени експерименти со секоја концентрација на олигосахарид. Треба да се напомене дека некои антитела реагираат многу различно на истиот олигосахарид како супстрат, веројатно затоа што се врзуваат за малку различни епитопи и можат да имаат многу различен афинитет на врзување. Механизмите и импликациите за точна идентификација на епитопите ќе бидат многу посложени кога новиот пристап на mAb ќе се примени на вистински примероци.
Два комерцијални олигосахариди беа користени за да се одреди опсегот на детекција на различни mAbs насочени кон гликанот. Тука, линеарните корелации со логаритамската концентрација на концентрацијата на олигосахариди укажуваат на модели на адсорпција на Лангмур за (A) XHE со mAb и (B) A2XX со mAb. Соодветните епитопи ги означуваат структурите на комерцијалните олигосахариди што се користат како супстрати во анализата.
Употребата на моноклонални антитела насочени кон гликани (гликокомична анализа или скрининг на mAb базиран на ELISA) е моќна алатка за длабинска карактеризација на повеќето од главните гликани на клеточниот ѕид што ја сочинуваат растителната биомаса. Сепак, класичната анализа на гликани карактеризира само поголеми гликани на клеточниот ѕид, бидејќи повеќето олигосахариди не се ефикасно имобилизирани на ELISA плочи. Во оваа студија, претходно третираната со AFEX пченкарна пченка беше ензимски хидролизирана при висока содржина на цврсти материи. Анализата на шеќер беше користена за да се утврди составот на отпорни јаглехидрати на клеточниот ѕид во хидролизатот. Сепак, анализата на mAb на помали олигосахариди во хидролизати е потценета и потребни се дополнителни алатки за ефикасна имобилизација на олигосахаридите на ELISA плочите.
Овде известуваме за нов и ефикасен метод на имобилизација на олигосахариди за скрининг на mAb со комбинирање на биотинилација на олигосахариди проследена со ELISA скрининг на плочи обложени со NeutrAvidin™. Имобилизираните биотинилирани олигосахариди покажаа доволен афинитет за антителото за да овозможат брзо и ефикасно откривање на резистентни олигосахариди. Анализата на составот на овие тврдоглави олигосахариди врз основа на масена спектрометрија ги потврди резултатите од овој нов пристап кон имуноскрининг. Така, овие студии покажуваат дека комбинацијата на биотинилација на олигосахариди и ELISA скрининг со моноклонални антитела насочени кон гликан може да се користи за откривање на вкрстени врски во олигосахариди и може широко да се примени во други биохемиски студии што ја карактеризираат структурата на олигосахаридите.
Овој метод на профилирање на гликани базиран на биотин е првиот извештај способен да ги испита отпорните јаглехидратни врски на растворливите олигосахариди во растителната биомаса. Ова помага да се разбере зошто некои делови од биомасата се толку тврдоглави кога станува збор за производство на биогориво. Овој метод пополнува важна празнина во методите за анализа на гликоми и ја проширува неговата примена на поширок опсег на супстрати надвор од растителните олигосахариди. Во иднина, може да користиме роботика за биотинилација и да го користиме методот што го развивме за анализа со висок проток на примероци со користење на ELISA.
Пченкарната слама (CS) одгледувана од хибридни семиња Pioneer 33A14 беше собрана во 2010 година од фармите Крамер во Реј, Колорадо. Со дозвола од сопственикот на земјиштето, оваа биомаса може да се користи за истражување. Примероците се чуваа на суво место со влажност < 6% во кеси со патент-затворач на собна температура. Примероците се чуваа на суво место со влажност < 6% во кеси со патент-затворач на собна температура. Образцы храниль сухими при влажности < 6% во пакетах со застежкой-молнией при комнатной температура. Примероците се чуваа на суво место при влажност <6% во кеси со патент на собна температура.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах со застежкой-молнией при комнатной температура со влажностью < 6%. Примероците се чуваат во патент кеси на собна температура со влажност < 6%.Студијата беше во согласност со локалните и националните упатства. Анализата на составот беше извршена со користење на протоколот NREL. Утврдено е дека составот содржи 31,4% глукан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% протеини и 13,4% пепел.
Cellic® CTec2 (138 mg протеини/ml, серија VCNI 0001) е комплексна мешавина од целулаза, β-глукозидаза и Cellic® HTec2 (157 mg протеини/ml, серија VHN00001) од Novozymes (Франклинтон, Северна Каролина, САД)). Multifect Pectinase® (72 mg протеини/mL), комплексна мешавина од ензими што го разградуваат пектинот, беше донирана од DuPont Industrial Biosciences (Пало Алто, Калифорнија, САД). Концентрациите на ензимските протеини беа одредени со проценка на содржината на протеини (и одземање на придонесот на непротеински азот) со користење на анализа на азот на Кјелдал (AOAC метод 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Итака, Њујорк, САД). Дијатомејска земја 545 беше купена од EMD Millipore (Билерика, Масачусетс). Активиран јаглен (DARCO, гранули од 100 mesh), Avicel (PH-101), буков ксилан и сите други хемикалии беа купени од Sigma-Aldrich (Сент Луис, Мисури).
Претретманот со AFEX беше извршен во GLBRC (Лабораторија за истражување на конверзија на биомаса, MSU, Lansing, MI, САД). Претретманот беше извршен на 140°C во текот на 15 минути. Време на престој при сооднос 1:1 на безводен амонијак и биомаса при оптоварување од 60% (w/w) во реактор од не'рѓосувачки челик (Parr Instruments Company). Траеше 30 минути. Реакторот беше загреан на 140°C и амонијакот брзо се ослободи, овозможувајќи биомасата брзо да се врати на собна температура. Составот на претходно третираниот пченкарен сад (ACS) со AFEX беше сличен на оној на нетретираниот пченкарен сад (UT-CS).
ACSH со висока содржина на цврсти материи 25% (w/w) (приближно 8% декстран) беше подготвен како почетен материјал за производство на олигосахариди во голем обем. Ензимската хидролиза на ACS беше извршена со користење на комерцијална мешавина од ензими, вклучувајќи Cellic® Ctec2 10 mg протеин/g глукан (во претходно третирана биомаса), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg протеин/g глукан и Multifect Pectinase (Genencor Inc, САД). ), 5 mg протеин/g декстран. Ензимската хидролиза беше извршена во 5-литарски биореактор со работен волумен од 3 литри, pH 4,8, 50°C и 250 вртежи во минута. По хидролиза од 96 часа, хидролизатот беше собран со центрифугирање на 6000 вртежи во минута за 30 минути, а потоа на 14000 вртежи во минута за 30 минути за да се отстранат нехидролизираните цврсти материи. Потоа хидролизатот беше подложен на стерилна филтрација низ филтер-чаша од 0,22 mm. Филтрираниот хидролизат беше складиран во стерилни шишиња на 4°C, а потоа фракциониран на јаглен.
Анализа на составот на примероци од биомаса базирани на екстракт според процедурите за лабораториска анализа на NREL: подготовка на примероци за анализа на составот (NREL/TP-510-42620) и одредување на структурни јаглехидрати и лигнин во биомасата (NREL/TP-510 – 42618)47.
Олигосахаридната анализа на хидролизатниот поток беше извршена на скала од 2 ml со користење на метод на кисела хидролиза базиран на автоклав. Измешајте го хидролизатниот примерок со 69,7 µl 72% сулфурна киселина во епрувета за култура со завртувачки капак од 10 ml и инкубирајте 1 час на работна маса на 121 °C, оладете на мраз и филтрирајте во шишенце со високо-перформансна течна хроматографија (HPLC). Концентрацијата на олигосахариди беше определена со одземање на концентрацијата на моносахариди во нехидролизираниот примерок од вкупната концентрација на шеќер во киселински хидролизираниот примерок.
Концентрациите на гликоза, ксилоза и арабиноза во киселински хидролизираната биомаса беа анализирани со помош на Shimadzu HPLC систем опремен со автосемплер, грејач на колона, изократска пумпа и детектор за индекс на прекршување на колона Bio-Rad Aminex HPX-87H. Колоната беше одржувана на 50°C и елуирана со 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 во вода.
Супернатантот на хидролизатот беше разреден и анализиран за содржина на мономер и олигосахарид. Мономерните шеќери добиени по ензимска хидролиза беа анализирани со HPLC опремена со колона Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P и колона за заштита од пепел. Температурата на колоната се одржуваше на 80°C, водата се користеше како мобилна фаза со брзина на проток од 0,6 ml/min. Олигосахаридите беа одредени со хидролиза во разредена киселина на 121°C според методите опишани во реф. 41, 48, 49.
Анализата на сахариди беше извршена на сурови, претходно третирани со AFEX и сите нехидролизирани остатоци од биомаса (вклучувајќи производство на сериски екстракти од клеточниот ѕид и нивно скрининг на mAb) со користење на претходно опишаните процедури 27, 43, 50, 51. За анализа на гликом, остатоци од материјал од клеточен ѕид на растенијата кои не се растворливи во алкохол се подготвуваат од остатоци од биомаса и се подложени на сериска екстракција со сè поагресивни реагенси како што се амониум оксалат (50 mM), натриум карбонат (50 mM и 0,5% w/v), CON. (1M и 4M, двата со 1% w/v натриум борохидрид) и кисел хлорит како што е претходно опишано 52,53. Екстрактите потоа беа подложени на ELISA наспроти комплексен панел од mAb50 насочен кон гликанот на клеточниот ѕид, а реакциите на врзување на mAb беа претставени како топлинска мапа. mAb кои го таргетираат гликанот на клеточниот ѕид на растенијата беа купени од лабораториски залихи (CCRC, JIM и MAC серии).
Едностепена биотинилација на олигосахариди. Конјугацијата на јаглехидратите со биотин-LC-хидразид беше извршена со користење на следната постапка. Биотин-LC-хидразид (4,6 mg/12 μmol) беше растворен во диметил сулфоксид (DMSO, 70 μl) со енергично мешање и загревање на 65°C во тек на 1 минута. Додадена е глацијална оцетна киселина (30 μl) и смесата беше истурена врз натриум цијаноборохидрид (6,4 mg/100 μmol) и целосно растворена по загревање на 65°C во тек на околу 1 минута. Потоа, од 5 до 8 μl од реакционата смеса беше додадена на исушениот олигосахарид (1-100 nmol) за да се добие 10-кратен или повеќе моларен вишок на ознаката над редуцирачкиот крај. Реакцијата беше спроведена на 65°C во тек на 2 часа, по што примероците беа веднаш прочистени. Во експериментите за етикетирање без редукција не е користен натриум цијаноборохидрид, а примероците реагирале на 65°C во тек на 2,5 часа.
ELISA обложување и миење на примероци од биотинилирани олигосахариди. 25 μl биотинилирани примероци (100 μl од секој концентриран примерок разреден во 5 ml 0,1 M Tris пуферски раствор (TBS)) беа додадени во секоја бунарница од плочата обложена со авидин. Контролните бунари беа обложени со 50 μl биотин со концентрација од 10 μg/ml во 0,1 M TBS. Дејонизирана вода беше употребена како облога за слепи мерења. Таблетата беше инкубирана 2 часа на собна температура во темница. Измијте ја плочата 3 пати со 0,1% обезмастено млеко во 0,1 M TBS користејќи ја програмата бр. 11 за Grenier flat 3A.
Додавање и миење на примарни антитела. Додадете 40 µl примарни антитела во секоја бунарче. Инкубирајте ја микроплочата 1 час на собна температура во темно. Потоа плочите беа измиени 3 пати со 0,1% млеко во 0,1M TBS користејќи ја програмата за миење бр. 11 за Grenier Flat 3A.
Додадете секундарно антитело и измијте. Додадете 50 µl секундарно антитело од глушец/стаорец (разредено 1:5000 во 0,1% млеко во 0,1 M TBS) во секоја бунарница. Инкубирајте ја микроплочката 1 час на собна температура во темно. Потоа микроплочките беа измиени 5 пати со 0,1% млеко во 0,1 M TBS користејќи ја програмата за миење плочи Grenier Flat 5A бр. 12.
Додавање на супстрат. Додадете 50 µl 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (TMB) на основниот супстрат (со додавање на 2 капки пуфер, 3 капки TMB, 2 капки водород пероксид во 15 ml дејонизирана вода). Подгответе го TMB супстратот и промешајте пред употреба. Инкубирајте ја микроплочката на собна температура 30 минути. Во темно.
Завршете го чекорот и прочитајте ја таблетата. Додадете 50 µl 1 N сулфурна киселина во секоја бунарче и запишете ја апсорпцијата од 450 до 655 nm користејќи ELISA читач.
Подгответе раствори од 1 mg/ml од овие аналити во дејонизирана вода: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактуронска киселина (GalA), глукуронска киселина (GlcA), маноза, гликоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманозамин (manNAc), N-ацетилглукозамин (glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (внатрешен стандард). Два стандарда се подготвени со додавање на растворите од 1 mg/mL шеќер прикажани во Табела 1. Мострите се замрзнуваат и лиофилизираат на -80°C додека не се отстрани целата вода (обично околу 12-18 часа).
Додадете 100–500 µg примерок во епрувети со капаче на аналитичка вага. Запишете ја додадената количина. Најдобро е примерокот да се раствори во специфична концентрација на растворувач и да се додаде во епруветата како течен аликвот. Користете 20 µl инозитол од 1 mg/ml како внатрешен стандард за секоја епрувета со примерок. Количината на внатрешен стандард додадена во примерокот мора да биде иста како и количината на внатрешен стандард додадена во стандардната епрувета.
Додадете 8 ml безводен метанол во шишенце со капаче на завртување. Потоа додадете 4 ml раствор од 3 N метанолен HCl, затворете го и протресете. Во овој процес не се користи вода.
Додадете 500 µl раствор на метанол од 1 M HCl во примероците од олигосахарид и стандардните TMS епрувети. Примероците беа инкубирани преку ноќ (168 часа) на 80°C во термички блок. Исушете го производот од метанолиза на собна температура со помош на сушач. Додадете 200 µl MeOH и повторно исушете. Овој процес се повторува двапати. Додадете 200 µl метанол, 100 µl пиридин и 100 µl оцетен анхидрид во примерокот и добро измешајте. Примероците беа инкубирани на собна температура 30 минути и исушени. Додадете 200 µl метанол и повторно исушете.
Додадете 200 µl Tri-Sil и загрејте ја епруветата со капаче 20 минути. 80°C, а потоа оладете ја на собна температура. Користете сушачки колектор за дополнително сушење на примерокот до волумен од приближно 50 µl. Важно е да се напомене дека не им дозволивме на примероците целосно да се исушат.
Додадете 2 ml хексан и добро измешајте со вртложење. Наполнете ги врвовите на Пастеровите пипети (5-8 mm) со парче стаклена волна со вметнување на стаклената волна врз пипета со дијаметар од 5-3/4 инчи. Примероците беа центрифугирани на 3000 g во тек на 2 минути. Сите нерастворливи остатоци се таложат. Исушете го примерокот до 100-150 µl. Волумен од приближно 1 μl беше инјектиран во GC-MS на почетна температура од 80 °C и почетно време од 2,0 минути (Табела 2).