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Nuovi metodi immunologici e di spettrometria di massa per l'analisi complessa di oligosaccaridi persistenti nella paglia di mais pretrattata con AFEX. La biomassa lignocellulosica è un'alternativa sostenibile ai combustibili fossili ed è ampiamente utilizzata per sviluppare biotecnologie per la produzione di prodotti quali alimenti, mangimi, combustibili e prodotti chimici. La chiave di queste tecnologie risiede nello sviluppo di processi economicamente competitivi per la conversione dei carboidrati complessi presenti nelle pareti cellulari delle piante in zuccheri semplici come glucosio, xilosio e arabinosio. Poiché la biomassa lignocellulosica è molto resistente, deve essere sottoposta a trattamenti termochimici (ad esempio, esfoliazione delle fibre con ammoniaca (AFEX), acidi diluiti (DA), liquidi ionici (IL)) e trattamenti biologici (ad esempio, idrolisi enzimatica e fermentazione microbica) in combinazione per ottenere il prodotto desiderato. Tuttavia, quando si utilizzano enzimi fungini commerciali nel processo di idrolisi, solo il 75-85% degli zuccheri solubili formati sono monosaccaridi, mentre il restante 15-25% è costituito da oligosaccaridi solubili e difficili da trattare, che non sono sempre disponibili per i microrganismi. In precedenza, abbiamo isolato e purificato con successo oligosaccaridi solubili difficili da trattare utilizzando una combinazione di separazione su carbone attivo e terra diatomacea e cromatografia a esclusione dimensionale, e ne abbiamo anche studiato le proprietà di inibizione enzimatica. Abbiamo scoperto che gli oligosaccaridi contenenti sostituzioni di acido uronico metilato con un grado di polimerizzazione (DP) più elevato sono più difficili da processare con miscele enzimatiche commerciali rispetto agli oligosaccaridi a basso DP e neutri. In questo studio, riportiamo l'utilizzo di diversi metodi aggiuntivi, tra cui la profilazione dei glicani mediante anticorpi monoclonali (mAb) specifici per i glicani della biomassa vegetale per caratterizzare i legami glicanici nelle pareti cellulari vegetali e negli idrolizzati enzimatici, la desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF-MS) e la spettrometria di massa a tempo di volo (MALDI-TOF-MS). La MALDI-TOF-MS utilizza picchi diagnostici informativi sulla struttura ottenuti mediante spettroscopia dopo decadimento secondario di ioni negativi, cromatografia gassosa e spettrometria di massa (GC-MS) per caratterizzare i legami oligosaccaridici con e senza derivatizzazione. A causa delle piccole dimensioni degli oligosaccaridi (DP 4-20), queste molecole sono difficili da utilizzare per il legame e la caratterizzazione con mAb. Per superare questo problema, abbiamo applicato un nuovo metodo di immobilizzazione degli oligosaccaridi basato sulla coniugazione con biotina che ha etichettato con successo la maggior parte degli oligosaccaridi solubili a basso DP sulla superficie della micropiastra, che è stata poi utilizzata in un sistema mAb ad alta produttività per l'analisi di ligazione specifica. Questo nuovo metodo faciliterà in futuro lo sviluppo di test glicomici ad alta produttività più avanzati, che potranno essere utilizzati per isolare e caratterizzare gli oligosaccaridi presenti nei biomarcatori a fini diagnostici.
La biomassa lignocellulosica, composta da materiali agricoli, forestali, erbacei e legnosi, è una potenziale materia prima per la produzione di prodotti di origine biologica, tra cui alimenti, mangimi, combustibili e precursori chimici per la produzione di prodotti di maggior valore1. I carboidrati (come cellulosa ed emicellulosa) presenti nelle pareti cellulari delle piante vengono depolimerizzati in monosaccaridi mediante processi chimici e biotrasformazione (come l'idrolisi enzimatica e la fermentazione microbica). I pretrattamenti comuni includono l'espansione delle fibre con ammoniaca (AFEX), l'acido diluito (DA), il liquido ionico (IL) e l'esplosione a vapore (SE), che utilizzano una combinazione di sostanze chimiche e calore per ridurre la produzione di lignocellulosa aprendo le pareti cellulari delle piante3,4. L'idrolisi enzimatica viene effettuata ad un elevato carico di solidi utilizzando enzimi commerciali attivi contenenti carboidrati (CAZymes) e la fermentazione microbica utilizzando lieviti o batteri transgenici per produrre combustibili e prodotti chimici di origine biologica6.
I CAZymes presenti negli enzimi commerciali sono composti da una complessa miscela di enzimi che scindono sinergicamente i complessi legami carboidrato-zucchero per formare monosaccaridi2,7. Come riportato in precedenza, la complessa rete di polimeri aromatici della lignina con i carboidrati li rende altamente difficili da scindere, il che porta a una conversione incompleta degli zuccheri, con un accumulo del 15-25% di oligosaccaridi che non vengono prodotti durante l'idrolisi enzimatica della biomassa pretrattata. Questo è un problema comune a diversi metodi di pretrattamento della biomassa. Alcune delle cause di questo collo di bottiglia includono l'inibizione enzimatica durante l'idrolisi, o l'assenza o i bassi livelli di enzimi essenziali necessari per rompere i legami zuccherini nella biomassa vegetale. Comprendere la composizione e le caratteristiche strutturali degli zuccheri, come i legami zuccherini negli oligosaccaridi, ci aiuterà a migliorare la conversione degli zuccheri durante l'idrolisi, rendendo i processi biotecnologici economicamente competitivi rispetto ai prodotti derivati ​​dal petrolio.
Determinare la struttura dei carboidrati è una sfida e richiede una combinazione di metodi come la cromatografia liquida (LC)11,12, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)13, l'elettroforesi capillare (CE)14,15,16 e la spettrometria di massa (MS)17. ,diciotto. I metodi MS come la spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento laser e ionizzazione utilizzando una matrice (MALDI-TOF-MS) sono un metodo versatile per identificare le strutture dei carboidrati. Recentemente, la spettrometria di massa tandem con dissociazione indotta da collisione (CID) di addotti di ioni sodio è stata ampiamente utilizzata per identificare impronte digitali corrispondenti alle posizioni di attacco degli oligosaccaridi, configurazioni anomeriche, sequenze e posizioni di ramificazione 20, 21.
L'analisi dei glicani è un eccellente strumento per l'identificazione approfondita dei legami dei carboidrati22. Questo metodo utilizza anticorpi monoclonali (mAb) diretti contro i glicani della parete cellulare vegetale come sonde per comprendere i complessi legami dei carboidrati. Sono disponibili in tutto il mondo oltre 250 mAb, progettati contro vari oligosaccaridi lineari e ramificati utilizzando diversi saccaridi24. Diversi mAb sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare la struttura, la composizione e le modifiche della parete cellulare vegetale, poiché esistono differenze significative a seconda del tipo di cellula vegetale, dell'organo, dell'età, dello stadio di sviluppo e dell'ambiente di crescita25,26. Più recentemente, questo metodo è stato utilizzato per comprendere le popolazioni di vescicole nei sistemi vegetali e animali e i loro rispettivi ruoli nel trasporto dei glicani, determinati da marcatori subcellulari, stadi di sviluppo o stimoli ambientali, e per determinare l'attività enzimatica. Alcune delle diverse strutture di glicani e xilani che sono state identificate includono pectina (P), xilano (X), mannano (M), xiloglucani (XylG), glucani a legame misto (MLG), arabinoxilano (ArbX), galattomannano (GalG), acido glucuronico-arabinoxilano (GArbX) e arabinogalattano (ArbG)29.
Tuttavia, nonostante tutti questi sforzi di ricerca, solo pochi studi si sono concentrati sulla natura dell'accumulo di oligosaccaridi durante l'idrolisi ad alto carico di solidi (HSL), compreso il rilascio di oligosaccaridi, le variazioni della lunghezza della catena oligomerica durante l'idrolisi, vari polimeri a basso DP e le loro curve di distribuzione 30,31,32. Nel frattempo, sebbene l'analisi dei glicani si sia dimostrata uno strumento utile per un'analisi completa della struttura dei glicani, è difficile valutare gli oligosaccaridi idrosolubili a basso DP utilizzando metodi anticorpali. Gli oligosaccaridi a DP più piccoli con un peso molecolare inferiore a 5-10 kDa non si legano alle piastre ELISA 33, 34 e vengono lavati via prima dell'aggiunta dell'anticorpo.
Qui, per la prima volta, dimostriamo un test ELISA su piastre rivestite di avidina utilizzando anticorpi monoclonali, combinando una procedura di biotinilazione in un unico passaggio per oligosaccaridi refrattari solubili con l'analisi del glicoma. Il nostro approccio all'analisi del glicoma è stato convalidato mediante analisi basata su MALDI-TOF-MS e GC-MS di legami oligosaccaridici complementari utilizzando la derivatizzazione con trimetilsilile (TMS) di composizioni di zuccheri idrolizzati. Questo approccio innovativo può essere sviluppato in futuro come metodo ad alto rendimento e trovare un'applicazione più ampia nella ricerca biomedica35.
Le modifiche post-traduzionali di enzimi e anticorpi, come la glicosilazione,36 influenzano la loro attività biologica. Ad esempio, le modifiche nella glicosilazione delle proteine ​​sieriche svolgono un ruolo importante nell'artrite infiammatoria e vengono utilizzate come marcatori diagnostici37. In letteratura è stato riportato che diversi glicani compaiono facilmente in una varietà di malattie, tra cui malattie infiammatorie croniche del tratto gastrointestinale e del fegato, infezioni virali, tumori ovarici, mammari e prostatici38,39,40. La comprensione della struttura dei glicani mediante metodi ELISA basati su anticorpi fornirà maggiore sicurezza nella diagnosi delle malattie senza l'uso di complessi metodi di spettrometria di massa.
Il nostro studio precedente ha dimostrato che gli oligosaccaridi ostinati rimanevano non idrolizzati dopo il pretrattamento e l'idrolisi enzimatica (Figura 1). Nel nostro lavoro precedentemente pubblicato, abbiamo sviluppato un metodo di estrazione in fase solida con carbone attivo per isolare gli oligosaccaridi dall'idrolizzato di stocchi di mais pretrattato con AFEX (ACSH)8. Dopo l'estrazione e la separazione iniziali, gli oligosaccaridi sono stati ulteriormente frazionati mediante cromatografia a esclusione dimensionale (SEC) e raccolti in ordine di peso molecolare. I monomeri e gli oligomeri di zucchero rilasciati da vari pretrattamenti sono stati analizzati mediante analisi della composizione degli zuccheri. Confrontando il contenuto di oligomeri di zucchero ottenuti con vari metodi di pretrattamento, la presenza di oligosaccaridi ostinati è un problema comune nella conversione della biomassa in monosaccaridi e può portare a una riduzione della resa di zucchero di almeno il 10-15% e persino fino al 18%. Questo metodo viene utilizzato per la successiva produzione su larga scala di frazioni di oligosaccaridi. L'ACH risultante e le sue successive frazioni con diversi pesi molecolari sono state utilizzate come materiale sperimentale per la caratterizzazione degli oligosaccaridi in questo lavoro.
Dopo il pretrattamento e l'idrolisi enzimatica, gli oligosaccaridi persistenti sono rimasti non idrolizzati. Qui (A) è un metodo di separazione degli oligosaccaridi in cui gli oligosaccaridi vengono isolati dall'idrolizzato di stocchi di mais pretrattato con AFEX (ACSH) utilizzando un letto impaccato di carbone attivo e terra diatomacea; (B) Metodo per la separazione degli oligosaccaridi. Gli oligosaccaridi sono stati ulteriormente separati mediante cromatografia a esclusione dimensionale (SEC); (C) Monomeri e oligomeri di saccaridi rilasciati da vari pretrattamenti (acido diluito: DA, liquido ionico: IL e AFEX). Condizioni di idrolisi enzimatica: elevato carico di solidi del 25% (p/p) (circa l'8% di carico di glucano), 96 ore di idrolisi, 20 mg/g di carico enzimatico commerciale (rapporto Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) e (D) Monomeri e oligomeri di zucchero di glucosio, xilosio e arabinosio rilasciati dalla paglia di mais pretrattata AFEX (ACS).
L'analisi dei glicani si è dimostrata uno strumento utile per un'analisi strutturale completa dei glicani negli estratti isolati da residui di biomassa solida. Tuttavia, i saccaridi idrosolubili sono sottorappresentati con questo metodo tradizionale41 perché gli oligosaccaridi a basso peso molecolare sono difficili da immobilizzare sulle piastre ELISA e vengono rimossi mediante lavaggio prima dell'aggiunta dell'anticorpo. Pertanto, per il legame e la caratterizzazione dell'anticorpo, è stato utilizzato un metodo di biotinilazione in un'unica fase per rivestire gli oligosaccaridi solubili e non conformi su piastre ELISA rivestite di avidina. Questo metodo è stato testato utilizzando il nostro ACSH precedentemente prodotto e una frazione basata sul suo peso molecolare (o grado di polimerizzazione, DP). La biotinilazione in un'unica fase è stata utilizzata per aumentare l'affinità di legame dell'oligosaccaride aggiungendo biotina-LC-idrazide all'estremità riducente del carboidrato (Fig. 2). In soluzione, il gruppo emiacetalico all'estremità riducente reagisce con il gruppo idrazidico della biotina-LC-idrazide per formare un legame idrazonico. In presenza dell'agente riducente NaCNBH3, il legame idrazonico viene ridotto a un prodotto finale biotinilato stabile. Con la modifica dell'estremità riducente dello zucchero, è diventato possibile il legame di oligosaccaridi a basso DP alle piastre ELISA, e nel nostro studio ciò è stato fatto su piastre rivestite di avidina utilizzando anticorpi monoclonali mirati ai glicani.
Screening di anticorpi monoclonali basato su ELISA per oligosaccaridi biotinilati. Qui (A) viene combinata la biotinilazione degli oligosaccaridi e il successivo screening ELISA con mAb mirati ai glicani su piastre rivestite con NeutrAvidin e (B) viene mostrata una procedura in un solo passaggio per la biotinilazione dei prodotti di reazione.
Le piastre rivestite di avidina con anticorpi coniugati con oligosaccaridi sono state quindi addizionate con anticorpi primari e secondari e lavate in un mezzo fotosensibile e tempo-sensibile. Dopo il completamento del legame degli anticorpi, è stato aggiunto il substrato TMB per incubare la piastra. La reazione è stata infine interrotta con acido solforico. Le piastre incubate sono state analizzate utilizzando un lettore ELISA per determinare la forza di legame di ciascun anticorpo e rilevare il cross-linking anticorpo-specifico. Per i dettagli e i parametri dell'esperimento, consultare la sezione corrispondente "Materiali e Metodi".
Dimostriamo l'utilità di questo metodo di recente sviluppo per applicazioni specifiche caratterizzando gli oligosaccaridi solubili presenti nell'ACSH, così come nelle frazioni oligosaccaridiche grezze e purificate isolate da idrolizzati lignocellulosici. Come mostrato nella Figura 3, gli xilani con sostituzione epitopica più comuni identificati nell'ACSH utilizzando metodi di analisi del glicoma bioacilato sono solitamente arabinogalattani uronici (U) o metiluronici (MeU) e pectici. La maggior parte di essi è stata riscontrata anche nel nostro precedente studio sull'analisi dei glicani di solidi non idrolizzati (UHS)43.
Rilevamento di epitopi oligosaccaridici recalcitranti mediante un anticorpo monoclonale diretto contro il glicano della parete cellulare. La frazione "neutra" è la frazione ACN e la frazione "acida" è la frazione FA. I rossi più brillanti sulla mappa di calore indicano un contenuto di epitopi più elevato, mentre i blu più brillanti indicano uno sfondo vuoto. I valori di colore sulla scala si basano sui valori OD grezzi per le formulazioni N=2. I principali epitopi riconosciuti dagli anticorpi sono mostrati a destra.
Queste strutture non cellulosiche non potevano essere scisse dalle cellulasi e dalle emicellulasi più comuni presenti nella miscela enzimatica commerciale testata, che include gli enzimi commerciali più comunemente utilizzati. Pertanto, sono necessari nuovi enzimi ausiliari per la loro idrolisi. Senza i necessari enzimi accessori non cellulosici, questi legami non cellulosici impediscono la completa conversione in monosaccaridi, anche se i loro polimeri di zucchero di origine vengono ampiamente idrolizzati in frammenti più corti e disciolti utilizzando miscele enzimatiche commerciali.
Ulteriori studi sulla distribuzione del segnale e sulla sua forza di legame hanno mostrato che gli epitopi di legame erano meno presenti nelle frazioni di zuccheri ad alto DP (A, B, C, DP fino a 20+) rispetto alle frazioni a basso DP (D, E, F, DP nei dimeri) (Fig. 1). I frammenti acidi sono più comuni negli epitopi non cellulosici rispetto ai frammenti neutri. Questi fenomeni sono coerenti con il modello osservato nel nostro studio precedente, in cui le porzioni ad alto DP e acide erano più resistenti all'idrolisi enzimatica. Pertanto, la presenza di epitopi glicanici non cellulosici e di sostituzioni U e MeU può contribuire notevolmente alla stabilità degli oligosaccaridi. Va notato che l'efficienza di legame e di rilevamento può essere problematica per gli oligosaccaridi a basso DP, soprattutto se l'epitopo è un oligosaccaride dimerico o trimerico. Questo può essere testato utilizzando oligosaccaridi commerciali di diverse lunghezze, ciascuno contenente un solo epitopo che si lega a uno specifico mAb.
Pertanto, l'uso di anticorpi specifici per la struttura ha rivelato alcuni tipi di legami recalcitranti. A seconda del tipo di anticorpo utilizzato, del modello di ligazione appropriato e dell'intensità del segnale prodotto (più o meno abbondante), è possibile identificare nuovi enzimi e aggiungerli in modo semi-quantitativo alla miscela enzimatica per una glicoconversione più completa. Prendendo come esempio l'analisi degli oligosaccaridi ACSH, possiamo creare un database di legami glicanici per ciascun materiale di biomassa. Va notato che è necessario tenere conto della diversa affinità degli anticorpi e, se la loro affinità è sconosciuta, ciò creerà alcune difficoltà nel confronto dei segnali di anticorpi diversi. Inoltre, il confronto dei legami glicanici potrebbe funzionare meglio tra campioni per lo stesso anticorpo. Questi legami ostinati possono quindi essere collegati al database CAZyme, dal quale possiamo identificare enzimi, selezionare enzimi candidati e testare enzimi in grado di rompere i legami, oppure sviluppare sistemi microbici per esprimere questi enzimi da utilizzare nelle bioraffinerie44.
Per valutare come i metodi immunologici integrino i metodi alternativi per la caratterizzazione degli oligosaccaridi a basso peso molecolare presenti negli idrolizzati lignocellulosici, abbiamo eseguito l'analisi MALDI (Fig. 4, S1-S8) e l'analisi dei saccaridi derivati ​​da TMS basata su GC-MS sullo stesso pannello (Fig. 5) della parte oligosaccaridica. La MALDI viene utilizzata per confrontare se la distribuzione di massa delle molecole di oligosaccaridi corrisponde alla struttura prevista. La Fig. 4 mostra la MC dei componenti neutri ACN-A e ACN-B. L'analisi di ACN-A ha confermato una gamma di zuccheri pentosi che vanno da DP 4-8 (Fig. 4) a DP 22 (Fig. S1), i cui pesi corrispondono agli oligosaccaridi MeU-xilano. L'analisi di ACN-B ha confermato la serie dei pentosi e del glucoxilano con DP 8-15. Nel materiale supplementare, come la Figura S3, le mappe di distribuzione di massa della porzione acida FA-C mostrano una gamma di zuccheri pentosi sostituiti con (Me)U con un DP di 8-15 che sono coerenti con gli xilani sostituiti trovati nello screening di mAb basato su ELISA. Gli epitopi sono coerenti.
Spettro MALDI-MS degli oligosaccaridi solubili non conformi presenti nell'ACS. Qui, (A) frazioni ACN-A a basso peso molecolare contenenti oligosaccaridi di glucurossilano sostituiti con acido uronico metilato (DP 4-8) e (B) xilano ACN-B e oligosaccaridi di acido uronico metilato sostituiti con glucurossilano (DP 8-15).
Analisi della composizione del residuo glicanico degli oligosaccaridi refrattari. Qui (A) Composizione saccaridica TMS di varie frazioni oligosaccaridiche ottenute mediante analisi GC-MS. (B) Strutture di vari zuccheri derivati ​​da TMS presenti negli oligosaccaridi. ACN – frazione di acetonitrile contenente oligosaccaridi neutri e FA – frazione di acido ferulico contenente oligosaccaridi acidi.
Un'altra interessante conclusione è stata tratta dall'analisi LC-MS della frazione oligosaccaridica, come mostrato nella Figura S9 (i metodi sono consultabili nel materiale supplementare elettronico). Frammenti di esosi e gruppi -OAc sono stati ripetutamente osservati durante la ligazione della frazione ACN-B. Questo risultato non solo conferma la frammentazione osservata nell'analisi del glicoma e MALDI-TOF, ma fornisce anche nuove informazioni sui potenziali derivati ​​dei carboidrati nella biomassa lignocellulosica pretrattata.
Abbiamo inoltre analizzato la composizione zuccherina della frazione oligosaccaridica mediante derivatizzazione con TMS. Utilizzando la GC-MS, abbiamo determinato la composizione degli zuccheri neutri (non derivati) e acidi (GluA e GalA) nella frazione oligosaccaridica (Fig. 5). L'acido glucuronico si trova nei componenti acidi C e D, mentre l'acido galatturonico si trova nei componenti acidi A e B, entrambi componenti ad alto DP degli zuccheri acidi. Questi risultati non solo confermano i nostri dati ELISA e MALDI, ma sono anche coerenti con i nostri precedenti studi sull'accumulo di oligosaccaridi. Pertanto, riteniamo che i moderni metodi immunologici che utilizzano la biotinilazione degli oligosaccaridi e il successivo screening ELISA siano sufficienti per rilevare oligosaccaridi recalcitranti solubili in vari campioni biologici.
Poiché i metodi di screening con mAb basati su ELISA sono stati validati con diverse metodologie, abbiamo voluto esplorare ulteriormente il potenziale di questo nuovo metodo quantitativo. Due oligosaccaridi commerciali, l'oligosaccaride xiloesasaccaride (XHE) e il 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosio (A2XX), sono stati acquistati e testati utilizzando un nuovo approccio con mAb mirato al glicano della parete cellulare. La Figura 6 mostra una correlazione lineare tra il segnale di legame biotinilato e il logaritmo della concentrazione di oligosaccaride, suggerendo un possibile modello di adsorbimento di Langmuir. Tra i mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 e CCRC-M151 hanno mostrato correlazione con XHE, mentre CCRC-M108, CCRC-M109 e LM11 hanno mostrato correlazione con A2XX in un intervallo da 1 nm a 100 nano. A causa della disponibilità limitata di anticorpi durante l'esperimento, sono stati eseguiti solo un numero limitato di esperimenti per ciascuna concentrazione di oligosaccaride. È opportuno notare che alcuni anticorpi reagiscono in modo molto diverso allo stesso oligosaccaride come substrato, presumibilmente perché si legano a epitopi leggermente diversi e possono avere affinità di legame molto diverse. I meccanismi e le implicazioni dell'identificazione accurata degli epitopi saranno molto più complessi quando il nuovo approccio con anticorpi monoclonali verrà applicato a campioni reali.
Sono stati utilizzati due oligosaccaridi commerciali per determinare l'intervallo di rilevamento di vari mAb mirati ai glicani. Qui, le correlazioni lineari con il logaritmo della concentrazione di oligosaccaridi indicano i modelli di adsorbimento di Langmuir per (A) XHE con mAb e (B) A2XX con mAb. Gli epitopi corrispondenti indicano le strutture degli oligosaccaridi commerciali utilizzati come substrati nel test.
L'utilizzo di anticorpi monoclonali mirati ai glicani (analisi glicocomica o screening con mAb basato su ELISA) è uno strumento potente per la caratterizzazione approfondita della maggior parte dei principali glicani della parete cellulare che costituiscono la biomassa vegetale. Tuttavia, l'analisi glicanica classica caratterizza solo i glicani più grandi della parete cellulare, poiché la maggior parte degli oligosaccaridi non viene immobilizzata in modo efficiente sulle piastre ELISA. In questo studio, la paglia di mais pretrattata con AFEX è stata idrolizzata enzimaticamente ad un elevato contenuto di solidi. L'analisi degli zuccheri è stata utilizzata per determinare la composizione dei carboidrati recalcitranti della parete cellulare nell'idrolizzato. Tuttavia, l'analisi con mAb degli oligosaccaridi più piccoli negli idrolizzati è sottovalutata e sono necessari ulteriori strumenti per immobilizzare efficacemente gli oligosaccaridi sulle piastre ELISA.
In questo studio presentiamo un metodo innovativo ed efficiente per l'immobilizzazione di oligosaccaridi per lo screening di anticorpi monoclonali, combinando la biotinilazione degli oligosaccaridi con lo screening ELISA su piastre rivestite con NeutrAvidin™. Gli oligosaccaridi biotinilati immobilizzati hanno mostrato un'affinità sufficiente per l'anticorpo, consentendo un rilevamento rapido ed efficiente anche degli oligosaccaridi più difficili da rilevare. L'analisi della composizione di questi oligosaccaridi resistenti, effettuata mediante spettrometria di massa, ha confermato i risultati di questo nuovo approccio all'immunoscreening. Pertanto, questi studi dimostrano che la combinazione di biotinilazione degli oligosaccaridi e screening ELISA con anticorpi monoclonali mirati ai glicani può essere utilizzata per rilevare i legami crociati negli oligosaccaridi e può essere ampiamente applicata in altri studi biochimici volti a caratterizzare la struttura degli oligosaccaridi.
Questo metodo di profilazione dei glicani basato sulla biotina è il primo in grado di studiare i legami carboidratici recalcitranti degli oligosaccaridi solubili nella biomassa vegetale. Ciò contribuisce a comprendere perché alcune parti della biomassa siano così difficili da trasformare in biocarburanti. Questo metodo colma un'importante lacuna nei metodi di analisi del glicoma ed estende la sua applicazione a una gamma più ampia di substrati, oltre agli oligosaccaridi vegetali. In futuro, potremmo utilizzare la robotica per la biotinilazione e impiegare il metodo sviluppato per l'analisi ad alta produttività dei campioni tramite ELISA.
La paglia di mais (CS), coltivata a partire da semi ibridi Pioneer 33A14, è stata raccolta nel 2010 presso l'azienda agricola Kramer Farms di Ray, in Colorado. Con il permesso del proprietario terriero, questa biomassa può essere utilizzata per la ricerca. I campioni sono stati conservati in ambiente asciutto, con un contenuto di umidità inferiore al 6%, in sacchetti con chiusura a zip e a temperatura ambiente. I campioni sono stati conservati in ambiente asciutto, con un contenuto di umidità inferiore al 6%, in sacchetti con chiusura a zip e a temperatura ambiente. La formazione di succhi di frutta si è congelata con una temperatura < 6% nelle confezioni a temperatura ambiente. I campioni sono stati conservati in ambiente asciutto, con un'umidità inferiore al 6%, in sacchetti con chiusura a zip e a temperatura ambiente.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.Migliori risultati < 6% La temperatura della confezione è elevata con temperatura ambiente < 6%. I campioni vengono conservati in sacchetti con chiusura a zip a temperatura ambiente con umidità inferiore al 6%.Lo studio è stato condotto in conformità con le linee guida locali e nazionali. L'analisi della composizione è stata eseguita utilizzando il protocollo NREL. È emerso che il campione conteneva il 31,4% di glucano, il 18,7% di xilano, il 3,3% di arabinano, l'1,2% di galattano, il 2,2% di acetile, il 14,3% di lignina, l'1,7% di proteine ​​e il 13,4% di ceneri.
Cellic® CTec2 (138 mg di proteina/ml, lotto VCNI 0001) è una miscela complessa di cellulasi, β-glucosidasi e Cellic® HTec2 (157 mg di proteina/ml, lotto VHN00001) di Novozymes (Franklinton, NC, USA). Multifect Pectinase® (72 mg di proteina/ml), una miscela complessa di enzimi che degradano la pectina, è stata donata da DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Le concentrazioni proteiche degli enzimi sono state determinate stimando il contenuto proteico (e sottraendo il contributo dell'azoto non proteico) mediante analisi dell'azoto Kjeldahl (metodo AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). La terra diatomacea 545 è stata acquistata da EMD Millipore (Billerica, MA). Il carbone attivo (DARCO, granuli da 100 mesh), l'Avicel (PH-101), lo xilano di faggio e tutti gli altri prodotti chimici sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Il pretrattamento AFEX è stato eseguito presso il GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Il pretrattamento è stato effettuato a 140 °C per 15 minuti. Il tempo di permanenza è stato di 46 minuti con un rapporto 1:1 di ammoniaca anidra rispetto alla biomassa, con un carico del 60% (p/p), in un reattore batch da banco in acciaio inossidabile (Parr Instruments Company). Il reattore è stato portato a 140 °C e l'ammoniaca è stata rilasciata rapidamente, consentendo alla biomassa di tornare velocemente a temperatura ambiente. La composizione della paglia di mais pretrattata con AFEX (ACS) era simile a quella della paglia di mais non trattata (UT-CS).
ACSH ad alto contenuto di solidi 25% (p/p) (circa l'8% di carico di destrano) è stato preparato come materiale di partenza per la produzione su larga scala di oligosaccaridi. L'idrolisi enzimatica dell'ACS è stata eseguita utilizzando una miscela enzimatica commerciale comprendente Cellic® Ctec2 10 mg di proteina/g di glucano (in biomassa pretrattata), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg di proteina/g di glucano e Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg di proteina/g di destrano. L'idrolisi enzimatica è stata condotta in un bioreattore da 5 litri con un volume di lavoro di 3 litri, pH 4,8, 50 °C e 250 rpm. Dopo 96 ore di idrolisi, l'idrolizzato è stato raccolto mediante centrifugazione a 6000 rpm per 30 minuti e poi a 14000 rpm per 30 minuti per rimuovere i solidi non idrolizzati. L'idrolizzato è stato quindi sottoposto a filtrazione sterile attraverso un becher filtrante da 0,22 mm. L'idrolizzato filtrato è stato conservato in bottiglie sterili a 4 °C e successivamente frazionato su carbone attivo.
Analisi della composizione di campioni di biomassa a base di estratti secondo le procedure di analisi di laboratorio NREL: preparazione dei campioni per l'analisi della composizione (NREL/TP-510-42620) e determinazione dei carboidrati strutturali e della lignina nella biomassa (NREL/TP-510-42618)47.
L'analisi degli oligosaccaridi del flusso di idrolizzato è stata eseguita su una scala di 2 ml utilizzando un metodo di idrolisi acida in autoclave. Mescolare il campione di idrolizzato con 69,7 µl di acido solforico al 72% in una provetta da coltura da 10 ml con tappo a vite e incubare per 1 ora a 121 °C su un banco di lavoro, raffreddare su ghiaccio e filtrare in una fiala per cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). La concentrazione di oligosaccaridi è stata determinata sottraendo la concentrazione di monosaccaridi nel campione non idrolizzato dalla concentrazione totale di zuccheri nel campione idrolizzato con acido.
Le concentrazioni di glucosio, xilosio e arabinosio nella biomassa idrolizzata con acido sono state analizzate utilizzando un sistema HPLC Shimadzu dotato di autocampionatore, riscaldatore di colonna, pompa isocratica e rivelatore a indice di rifrazione su una colonna Bio-Rad Aminex HPX-87H. La colonna è stata mantenuta a 50 °C ed eluita con un flusso di 0,6 ml/min di H2SO4 5 mM in acqua.
Il surnatante dell'idrolizzato è stato diluito e analizzato per il contenuto di monomeri e oligosaccaridi. Gli zuccheri monomerici ottenuti dopo idrolisi enzimatica sono stati analizzati mediante HPLC equipaggiata con una colonna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P e una colonna di protezione per le ceneri. La temperatura della colonna è stata mantenuta a 80 °C, l'acqua è stata utilizzata come fase mobile con una portata di 0,6 ml/min. Gli oligosaccaridi sono stati determinati mediante idrolisi in acido diluito a 121 °C secondo i metodi descritti nei riferimenti 41, 48, 49.
L'analisi dei saccaridi è stata eseguita su residui di biomassa grezzi, pretrattati con AFEX e non idrolizzati (inclusa la produzione di estratti seriali della parete cellulare e il loro screening con mAb) utilizzando procedure precedentemente descritte 27, 43, 50, 51. Per l'analisi del glicoma, i residui insolubili in alcol del materiale della parete cellulare vegetale sono preparati dai residui di biomassa e sottoposti a estrazione seriale con reagenti sempre più aggressivi come ossalato di ammonio (50 mM), carbonato di sodio (50 mM e 0,5% p/v), CON. (1M e 4M, entrambi con 1% p/v di boroidruro di sodio) e clorito acido come precedentemente descritto52,53. Gli estratti sono stati quindi sottoposti a ELISA contro un pannello complesso di mAb50 diretti al glicano della parete cellulare e le reazioni di legame dei mAb sono state presentate come una mappa di calore. I mAb mirati al glicano della parete cellulare vegetale sono stati acquistati da stock di laboratorio (serie CCRC, JIM e MAC).
Biotinilazione in un solo passaggio di oligosaccaridi. La coniugazione dei carboidrati con biotina-LC-idrazide è stata effettuata utilizzando la seguente procedura. La biotina-LC-idrazide (4,6 mg/12 μmol) è stata disciolta in dimetilsolfossido (DMSO, 70 μl) mediante agitazione vigorosa e riscaldamento a 65 °C per 1 minuto. Sono stati aggiunti 30 μl di acido acetico glaciale e la miscela è stata versata su cianoboroidruro di sodio (6,4 mg/100 μmol) e completamente disciolta dopo riscaldamento a 65 °C per circa 1 minuto. Quindi, da 5 a 8 μl della miscela di reazione sono stati aggiunti all'oligosaccaride essiccato (1-100 nmol) per ottenere un eccesso molare di marcatore pari o superiore a 10 volte rispetto all'estremità riducente. La reazione è stata condotta a 65 °C per 2 ore, dopodiché i campioni sono stati immediatamente purificati. Negli esperimenti di marcatura senza riduzione non è stato utilizzato cianoboroidruro di sodio e i campioni sono stati fatti reagire a 65 °C per 2,5 ore.
Rivestimento e lavaggio di campioni di oligosaccaridi biotinilati mediante ELISA. 25 μl di campioni biotinilati (100 μl di ciascun campione concentrato diluiti in 5 ml di soluzione tampone Tris 0,1 M (TBS)) sono stati aggiunti a ciascun pozzetto della piastra rivestita di avidina. I pozzetti di controllo sono stati rivestiti con 50 μl di biotina a una concentrazione di 10 μg/ml in TBS 0,1 M. Acqua deionizzata è stata utilizzata come rivestimento per le misurazioni del bianco. La piastra è stata incubata per 2 ore a temperatura ambiente al buio. Lavare la piastra 3 volte con latte scremato allo 0,1% in TBS 0,1 M utilizzando il programma n. 11 per Grenier flat 3A.
Aggiunta e lavaggio degli anticorpi primari. Aggiungere 40 µl di anticorpo primario a ciascun pozzetto. Incubare la micropiastra per 1 ora a temperatura ambiente al buio. Le piastre sono state quindi lavate 3 volte con latte allo 0,1% in TBS 0,1 M utilizzando il programma di lavaggio n. 11 per Grenier Flat 3A.
Aggiungere l'anticorpo secondario e lavare. Aggiungere 50 µl di anticorpo secondario di topo/ratto (diluito 1:5000 in latte allo 0,1% in TBS 0,1 M) a ciascun pozzetto. Incubare la micropiastra per 1 ora a temperatura ambiente al buio. Le micropiastre sono state quindi lavate 5 volte con latte allo 0,1% in TBS 0,1 M utilizzando il programma di lavaggio per piastre Grenier Flat 5A n. 12.
Aggiunta del substrato. Aggiungere 50 µl di 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) al substrato di base (aggiungendo 2 gocce di tampone, 3 gocce di TMB, 2 gocce di perossido di idrogeno a 15 ml di acqua deionizzata). Preparare il substrato TMB. (e agitare con vortex prima dell'uso). Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Al buio.
Completare il passaggio e leggere la compressa. Aggiungere 50 µl di acido solforico 1 N a ciascun pozzetto e registrare l'assorbanza da 450 a 655 nm utilizzando un lettore ELISA.
Preparare soluzioni da 1 mg/ml di questi analiti in acqua deionizzata: arabinosio, ramnosio, fucosio, xilosio, acido galatturonico (GalA), acido glucuronico (GlcA), mannosio, glucosio, galattosio, lattosio, N-acetilmannosamina (manNAc), N-acetilglucosamina (glcNAc), N-acetilgalattosamina (galNAc), inositolo (standard interno). Sono stati preparati due standard aggiungendo le soluzioni di zucchero da 1 mg/ml indicate nella Tabella 1. I campioni vengono congelati e liofilizzati a -80 °C fino alla completa rimozione dell'acqua (generalmente circa 12-18 ore).
Aggiungere 100–500 µg di campione a provette con tappo a vite su una bilancia analitica. Annotare la quantità aggiunta. È preferibile sciogliere il campione in una specifica concentrazione di solvente e aggiungerlo alla provetta come aliquota liquida. Utilizzare 20 µl di inositolo 1 mg/ml come standard interno per ciascuna provetta del campione. La quantità di standard interno aggiunta al campione deve essere uguale alla quantità di standard interno aggiunta alla provetta dello standard.
Aggiungere 8 ml di metanolo anidro a una fiala con tappo a vite. Quindi aggiungere 4 ml di soluzione di HCl metanolico 3 N, chiudere con il tappo e agitare. Questo procedimento non richiede l'uso di acqua.
Aggiungere 500 µl di soluzione di HCl 1 M in metanolo ai campioni di oligosaccaridi e alle provette TMS standard. I campioni sono stati incubati per una notte (168 ore) a 80 °C in un blocco termico. Asciugare il prodotto di metanolisi a temperatura ambiente utilizzando un collettore di essiccazione. Aggiungere 200 µl di MeOH e asciugare nuovamente. Questo processo viene ripetuto due volte. Aggiungere 200 µl di metanolo, 100 µl di piridina e 100 µl di anidride acetica al campione e mescolare bene. I campioni sono stati incubati a temperatura ambiente per 30 minuti e asciugati. Aggiungere 200 µl di metanolo e asciugare nuovamente.
Aggiungere 200 µl di Tri-Sil e riscaldare la provetta chiusa per 20 minuti a 80 °C, quindi raffreddare a temperatura ambiente. Utilizzare un collettore di essiccazione per asciugare ulteriormente il campione fino a un volume di circa 50 µl. È importante notare che non abbiamo lasciato asciugare completamente i campioni.
Aggiungere 2 ml di esano e mescolare bene mediante vortex. Riempire le punte delle pipette Pasteur (5-8 mm) con un pezzo di lana di vetro inserendola sopra una pipetta di 5-3/4 pollici di diametro. I campioni sono stati centrifugati a 3000 g per 2 minuti. Eventuali residui insolubili sono stati precipitati. Asciugare il campione fino a un volume di 100-150 µl. Un volume di circa 1 µl è stato iniettato nel GC-MS a una temperatura iniziale di 80 °C e un tempo iniziale di 2,0 minuti (Tabella 2).