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एएफईएक्स के साथ पूर्व-उपचारित मकई स्टोवर में लगातार ऑलिगोसेकेराइड के जटिल विश्लेषण के लिए नई प्रतिरक्षाविज्ञानी और मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधियां।लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास जीवाश्म ईंधन का एक स्थायी विकल्प है और भोजन, चारा, ईंधन और रसायनों जैसे उत्पादों के उत्पादन के लिए जैव प्रौद्योगिकी विकसित करने के लिए इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।इन प्रौद्योगिकियों की कुंजी पौधों की कोशिका दीवारों में मौजूद जटिल कार्बोहाइड्रेट को ग्लूकोज, ज़ाइलोज़ और अरेबिनोज़ जैसे सरल शर्करा में परिवर्तित करने के लिए लागत-प्रतिस्पर्धी प्रक्रियाओं का विकास है।क्योंकि लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास बहुत जिद्दी होता है, इसलिए वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए इसे थर्मोकेमिकल उपचार (उदाहरण के लिए, अमोनिया फाइबर एक्सफोलिएशन (एएफईएक्स), पतला एसिड (डीए), आयनिक तरल पदार्थ (आईएल)) और जैविक उपचार (उदाहरण के लिए, एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस और माइक्रोबियल किण्वन) के संयोजन में किया जाना चाहिए।.हालाँकि, जब वाणिज्यिक फंगल एंजाइमों का उपयोग हाइड्रोलिसिस प्रक्रिया में किया जाता है, तो बनने वाले घुलनशील शर्करा में से केवल 75-85% मोनोसेकेराइड होते हैं, और शेष 15-25% घुलनशील, असाध्य ऑलिगोसेकेराइड होते हैं, जो हमेशा सूक्ष्मजीवों के लिए उपलब्ध नहीं होते हैं।पहले, हमने कार्बन और डायटोमेसियस पृथ्वी पृथक्करण और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के संयोजन का उपयोग करके घुलनशील जिद्दी ओलिगोसेकेराइड को सफलतापूर्वक अलग और शुद्ध किया है, और उनके एंजाइम अवरोधक गुणों की भी जांच की है।हमने पाया है कि उच्च स्तर के पोलीमराइजेशन (डीपी) मिथाइलेटेड यूरोनिक एसिड प्रतिस्थापन वाले ऑलिगोसेकेराइड को कम डीपी और तटस्थ ऑलिगोसेकेराइड की तुलना में वाणिज्यिक एंजाइम मिश्रणों के साथ संसाधित करना अधिक कठिन होता है।यहां हम कई अतिरिक्त तरीकों के उपयोग की रिपोर्ट करते हैं, जिसमें पौधों की कोशिका दीवारों और एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसेट्स में ग्लाइकेन बॉन्ड को चिह्नित करने के लिए बायोमास ग्लाइकेन के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) का उपयोग करके ग्लाइकेन प्रोफाइलिंग, मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्शन आयनीकरण, टाइम-ऑफ-फ़्लाइट मास-स्पेक्ट्रोमेट्री शामिल है।.MALDI-TOF-MS) व्युत्पन्नकरण के साथ और बिना ऑलिगोसेकेराइड बांड को चिह्नित करने के लिए नकारात्मक आयनों, गैस क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) के माध्यमिक क्षय के बाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त संरचना-सूचनात्मक नैदानिक ​​​​चोटियों का उपयोग करता है।ऑलिगोसेकेराइड्स (DP 4–20) के छोटे आकार के कारण, इन अणुओं को mAb बाइंडिंग और लक्षण वर्णन के लिए उपयोग करना मुश्किल है।इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने एक नई बायोटिन संयुग्मन-आधारित ऑलिगोसेकेराइड स्थिरीकरण विधि लागू की, जिसने माइक्रोप्लेट सतह पर कम डीपी घुलनशील ऑलिगोसेकेराइड के बहुमत को सफलतापूर्वक लेबल किया, जिसे तब विशिष्ट लिगेशन विश्लेषण के लिए उच्च थ्रूपुट एमएबी प्रणाली में उपयोग किया गया था।यह नई विधि भविष्य में अधिक उन्नत उच्च थ्रूपुट ग्लाइकोम परख के विकास की सुविधा प्रदान करेगी जिसका उपयोग नैदानिक ​​​​उद्देश्यों के लिए बायोमार्कर में मौजूद ओलिगोसेकेराइड को अलग करने और चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है।
कृषि, वानिकी, घास और लकड़ी की सामग्री से बना लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास, उच्च मूल्य वाले उत्पादों का उत्पादन करने के लिए भोजन, चारा, ईंधन और रासायनिक अग्रदूतों सहित जैव-आधारित उत्पादों के उत्पादन के लिए एक संभावित फीडस्टॉक है।पौधों की कोशिका दीवारों में मौजूद कार्बोहाइड्रेट (जैसे सेल्युलोज और हेमिकेलुलोज) को रासायनिक प्रसंस्करण और बायोट्रांसफॉर्मेशन (जैसे एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस और माइक्रोबियल किण्वन) द्वारा मोनोसेकेराइड में डीपोलाइमराइज़ किया जाता है।सामान्य पूर्व-उपचार में अमोनिया फाइबर विस्तार (एएफईएक्स), पतला एसिड (डीए), आयनिक तरल (आईएल), और भाप विस्फोट (एसई) शामिल हैं, जो पौधों की कोशिका दीवारों को खोलकर लिग्नोसेल्यूलोज उत्पादन को कम करने के लिए रसायनों और गर्मी के संयोजन का उपयोग करते हैं।पदार्थ का हठ, 5. जैव-आधारित ईंधन और रसायनों का उत्पादन करने के लिए वाणिज्यिक सक्रिय कार्बोहाइड्रेट युक्त एंजाइमों (CAZymes) और ट्रांसजेनिक यीस्ट या बैक्टीरिया का उपयोग करके माइक्रोबियल किण्वन का उपयोग करके उच्च ठोस भार पर एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस किया जाता है।
वाणिज्यिक एंजाइमों में CAZymes एंजाइमों के एक जटिल मिश्रण से बने होते हैं जो मोनोसेकेराइड2,7 बनाने के लिए जटिल कार्बोहाइड्रेट-चीनी बांड को सहक्रियात्मक रूप से तोड़ते हैं।जैसा कि हमने पहले बताया था, कार्बोहाइड्रेट के साथ लिग्निन के सुगंधित पॉलिमर का जटिल नेटवर्क उन्हें अत्यधिक असहनीय बनाता है, जिससे अपूर्ण चीनी रूपांतरण होता है, जिससे 15-25% सेक्स ऑलिगोसेकेराइड जमा हो जाते हैं जो पूर्व-उपचारित बायोमास के एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस के दौरान उत्पन्न नहीं होते हैं।यह विभिन्न बायोमास पूर्व-उपचार विधियों के साथ एक आम समस्या है।इस अड़चन के कुछ कारणों में हाइड्रोलिसिस के दौरान एंजाइम अवरोध, या आवश्यक आवश्यक एंजाइमों की अनुपस्थिति या निम्न स्तर शामिल हैं जो पौधों के बायोमास में चीनी बंधन को तोड़ने के लिए आवश्यक हैं।शर्करा की संरचना और संरचनात्मक विशेषताओं को समझने से, जैसे कि ऑलिगोसेकेराइड में चीनी बांड, हमें हाइड्रोलिसिस के दौरान चीनी रूपांतरण में सुधार करने में मदद मिलेगी, जिससे जैव-तकनीकी प्रक्रियाओं को पेट्रोलियम-व्युत्पन्न उत्पादों के साथ लागत-प्रतिस्पर्धी बनाया जा सकेगा।
कार्बोहाइड्रेट की संरचना का निर्धारण करना चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी)11,12, परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर)13, केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई)14,15,16 और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)17 जैसी विधियों के संयोजन की आवश्यकता होती है।,अठारह।मैट्रिक्स (MALDI-TOF-MS) का उपयोग करके लेजर डिसोर्प्शन और आयनीकरण के साथ टाइम-ऑफ-फ़्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसी एमएस विधियां कार्बोहाइड्रेट संरचनाओं की पहचान करने के लिए एक बहुमुखी विधि हैं।हाल ही में, सोडियम आयन एडक्ट्स के टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) अग्रानुक्रम एमएस का उपयोग ओलिगोसेकेराइड अनुलग्नक पदों, एनोमेरिक कॉन्फ़िगरेशन, अनुक्रम और शाखा पदों 20, 21 के अनुरूप उंगलियों के निशान की पहचान करने के लिए सबसे व्यापक रूप से किया गया है।
कार्बोहाइड्रेट बांड22 की गहन पहचान के लिए ग्लाइकेन विश्लेषण एक उत्कृष्ट उपकरण है।यह विधि जटिल कार्बोहाइड्रेट लिंकेज को समझने के लिए जांच के रूप में कोशिका दीवार ग्लाइकेन को लगाने के लिए निर्देशित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) का उपयोग करती है।दुनिया भर में 250 से अधिक mAbs उपलब्ध हैं, जिन्हें विभिन्न सैकराइड्स24 का उपयोग करके विभिन्न रैखिक और शाखित ऑलिगोसैकेराइड के विरुद्ध डिज़ाइन किया गया है।पादप कोशिका दीवार की संरचना, संरचना और संशोधनों को चिह्नित करने के लिए कई mAbs का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, क्योंकि पादप कोशिका प्रकार, अंग, आयु, विकासात्मक चरण और विकास वातावरण के आधार पर महत्वपूर्ण अंतर हैं।25,26।हाल ही में, इस पद्धति का उपयोग पौधों और पशु प्रणालियों में पुटिकाओं की आबादी और उपकोशिकीय मार्करों, विकासात्मक चरणों या पर्यावरणीय उत्तेजनाओं द्वारा निर्धारित ग्लाइकेन परिवहन में उनकी संबंधित भूमिकाओं को समझने और एंजाइमी गतिविधि को निर्धारित करने के लिए किया गया है।ग्लाइकेन और जाइलन की कुछ अलग-अलग संरचनाओं की पहचान की गई है जिनमें पेक्टिन (पी), जाइलन (एक्स), मन्नान (एम), जाइलोग्लुकेन्स (एक्सएलजी), मिश्रित बांड ग्लूकेन्स (एमएलजी), अरेबिनोक्सिलन (एआरबीएक्स), गैलेक्टोमैनन (गैलजी), ग्लुकुरोनिक एसिड-अरबिनोक्सिलन (जीएआरबीएक्स) और अरेबिनो-गैलेक्टन (एआरबीजी)29 शामिल हैं।
हालाँकि, इन सभी शोध प्रयासों के बावजूद, केवल कुछ अध्ययनों ने उच्च ठोस भार (एचएसएल) हाइड्रोलिसिस के दौरान ऑलिगोसेकेराइड संचय की प्रकृति पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसमें ऑलिगोसेकेराइड रिलीज, हाइड्रोलिसिस के दौरान ऑलिगोमेरिक श्रृंखला की लंबाई में परिवर्तन, विभिन्न कम डीपी पॉलिमर और उनके वक्र शामिल हैं।वितरण 30,31,32.इस बीच, हालांकि ग्लाइकेन संरचना के व्यापक विश्लेषण के लिए ग्लाइकेन विश्लेषण एक उपयोगी उपकरण साबित हुआ है, लेकिन एंटीबॉडी विधियों का उपयोग करके पानी में घुलनशील कम डीपी ओलिगोसेकेराइड का मूल्यांकन करना मुश्किल है।5-10 केडीए से कम आणविक भार वाले छोटे डीपी ऑलिगोसेकेराइड एलिसा प्लेट 33, 34 से नहीं जुड़ते हैं और एंटीबॉडी जोड़ने से पहले धो दिए जाते हैं।
यहां, पहली बार, हम मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके एविडिन-लेपित प्लेटों पर एलिसा परख प्रदर्शित करते हैं, जिसमें ग्लाइकोम विश्लेषण के साथ घुलनशील दुर्दम्य ऑलिगोसेकेराइड के लिए एक-चरण बायोटिनाइलेशन प्रक्रिया का संयोजन होता है।ग्लाइकोम विश्लेषण के लिए हमारा दृष्टिकोण MALDI-TOF-MS और GC-MS द्वारा हाइड्रोलाइज्ड चीनी रचनाओं के ट्राइमेथिलसिलिल (टीएमएस) व्युत्पन्नकरण का उपयोग करके पूरक ऑलिगोसेकेराइड लिंकेज के आधारित विश्लेषण द्वारा मान्य किया गया था।इस अभिनव दृष्टिकोण को भविष्य में एक उच्च-थ्रूपुट विधि के रूप में विकसित किया जा सकता है और बायोमेडिकल अनुसंधान35 में व्यापक अनुप्रयोग पाया जा सकता है।
एंजाइमों और एंटीबॉडी के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन, जैसे ग्लाइकोसिलेशन,36 उनकी जैविक गतिविधि को प्रभावित करते हैं।उदाहरण के लिए, सीरम प्रोटीन के ग्लाइकोसिलेशन में परिवर्तन सूजन संबंधी गठिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और ग्लाइकोसिलेशन में परिवर्तन को नैदानिक ​​​​मार्कर37 के रूप में उपयोग किया जाता है।साहित्य में बताया गया है कि विभिन्न ग्लाइकेन विभिन्न प्रकार की बीमारियों में आसानी से प्रकट होते हैं, जिनमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट और यकृत की पुरानी सूजन संबंधी बीमारियां, वायरल संक्रमण, डिम्बग्रंथि, स्तन और प्रोस्टेट कैंसर 38,39,40 शामिल हैं।एंटीबॉडी-आधारित ग्लाइकेन एलिसा विधियों का उपयोग करके ग्लाइकेन की संरचना को समझना जटिल एमएस विधियों के उपयोग के बिना रोग निदान में अतिरिक्त आत्मविश्वास प्रदान करेगा।
हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि जिद्दी ओलिगोसेकेराइड प्रीट्रीटमेंट और एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस (चित्रा 1) के बाद अनहाइड्रोलाइज्ड रहे।हमारे पहले प्रकाशित काम में, हमने AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टोवर हाइड्रोलाइज़ेट (ACSH)8 से ऑलिगोसेकेराइड को अलग करने के लिए एक सक्रिय चारकोल ठोस-चरण निष्कर्षण विधि विकसित की।प्रारंभिक निष्कर्षण और पृथक्करण के बाद, ऑलिगोसैकेराइड्स को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा और अधिक विभाजित किया गया और आणविक भार के क्रम में एकत्र किया गया।विभिन्न प्रीट्रीटमेंट से जारी चीनी मोनोमर्स और ऑलिगोमर्स का चीनी संरचना विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया।विभिन्न पूर्व-उपचार विधियों द्वारा प्राप्त चीनी ऑलिगोमर्स की सामग्री की तुलना करते समय, जिद्दी ऑलिगोसेकेराइड की उपस्थिति बायोमास को मोनोसेकेराइड में बदलने में एक आम समस्या है और इससे चीनी की उपज में कम से कम 10-15% और यहां तक ​​कि 18% तक की कमी हो सकती है।हम।इस विधि का उपयोग ऑलिगोसेकेराइड अंशों के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए किया जाता है।परिणामी ACH और उसके बाद के विभिन्न आणविक भार वाले अंशों का उपयोग इस कार्य में ऑलिगोसेकेराइड के लक्षण वर्णन के लिए प्रयोगात्मक सामग्री के रूप में किया गया था।
पूर्व-उपचार और एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस के बाद, लगातार ऑलिगोसेकेराइड्स अनहाइड्रोलाइज़्ड रहे।यहां (ए) एक ऑलिगोसेकेराइड पृथक्करण विधि है जिसमें ऑलिगोसेकेराइड्स को सक्रिय कार्बन और डायटोमेसियस पृथ्वी के पैक्ड बेड का उपयोग करके AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टॉवर हाइड्रोलाइज़ेट (ACSH) से अलग किया जाता है;(बी) ऑलिगोसेकेराइड को अलग करने की विधि।ऑलिगोसैकेराइड्स को आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा अलग किया गया;(सी) सैकेराइड मोनोमर्स और ऑलिगोमर्स विभिन्न प्रीट्रीटमेंट (पतला एसिड: डीए, आयनिक तरल: आईएल और एएफईएक्स) से जारी किए गए।एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस की स्थिति: 25% (w/w) (लगभग 8% ग्लूकेन लोडिंग), 96 घंटे हाइड्रोलिसिस, 20 मिलीग्राम/जी वाणिज्यिक एंजाइम लोडिंग (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 अनुपात) और (D) AFEX प्री-ट्रीटेड कॉर्न स्टोवर (ACS) से जारी ग्लूकोज, ज़ाइलोज़ और अरेबिनोज़ के चीनी मोनोमर्स और ऑलिगोमर्स की उच्च ठोस लोडिंग।
ठोस बायोमास अवशेषों से पृथक अर्क में ग्लाइकेन के व्यापक संरचनात्मक विश्लेषण के लिए ग्लाइकेन विश्लेषण एक उपयोगी उपकरण साबित हुआ है।हालाँकि, इस पारंपरिक विधि 41 का उपयोग करके पानी में घुलनशील सैकराइड्स को कम दर्शाया जाता है क्योंकि कम आणविक भार वाले ऑलिगोसैकेराइड्स को एलिसा प्लेटों पर स्थिर करना मुश्किल होता है और एंटीबॉडी जोड़ने से पहले धोया जाता है।इसलिए, एंटीबॉडी बंधन और लक्षण वर्णन के लिए, एविडिन-लेपित एलिसा प्लेटों पर घुलनशील, गैर-अनुपालक ऑलिगोसेकेराइड को कोट करने के लिए एक-चरणीय बायोटिनाइलेशन विधि का उपयोग किया गया था।इस विधि का परीक्षण हमारे पहले उत्पादित एसीएसएच और उसके आणविक भार (या पोलीमराइजेशन की डिग्री, डीपी) के आधार पर एक अंश का उपयोग करके किया गया था।कार्बोहाइड्रेट के घटते सिरे में बायोटिन-एलसी-हाइड्राज़ाइड जोड़कर ऑलिगोसेकेराइड बाइंडिंग एफ़िनिटी को बढ़ाने के लिए वन-स्टेप बायोटिनाइलेशन का उपयोग किया गया था (चित्र 2)।समाधान में, कम करने वाले सिरे पर हेमिसिएटल समूह बायोटिन-एलसी-हाइड्राजाइड के हाइड्राजाइड समूह के साथ प्रतिक्रिया करके हाइड्रोजोन बंधन बनाता है।कम करने वाले एजेंट NaCNBH3 की उपस्थिति में, हाइड्रोज़ोन बंधन एक स्थिर बायोटिनाइलेटेड अंतिम उत्पाद में कम हो जाता है।शर्करा कम करने वाले सिरे के संशोधन के साथ, कम डीपी ऑलिगोसेकेराइड को एलिसा प्लेटों से बांधना संभव हो गया, और हमारे अध्ययन में यह ग्लाइकेन-लक्षित एमएबीएस का उपयोग करके एविडिन-लेपित प्लेटों पर किया गया था।
बायोटिनाइलेटेड ऑलिगोसेकेराइड के लिए एलिसा पर आधारित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की स्क्रीनिंग।यहां (ए) ऑलिगोसैकेराइड्स का संयुक्त बायोटिनाइलेशन और उसके बाद न्यूट्राविडिन लेपित प्लेटों पर ग्लाइकेन-लक्षित एमएबीएस के साथ एलिसा स्क्रीनिंग और (बी) प्रतिक्रिया उत्पादों के बायोटिनाइलेशन के लिए एक-चरणीय प्रक्रिया दिखाता है।
ऑलिगोसेकेराइड-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ एविडिन-लेपित प्लेटों को प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी में जोड़ा गया और एक हल्के और समय-संवेदनशील माध्यम में धोया गया।एंटीबॉडी बाइंडिंग पूरी होने के बाद, प्लेट को इनक्यूबेट करने के लिए टीएमबी सब्सट्रेट जोड़ें।अंततः सल्फ्यूरिक एसिड के साथ प्रतिक्रिया रोक दी गई।एंटीबॉडी-विशिष्ट क्रॉस-लिंकिंग का पता लगाने के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी की बाध्यकारी ताकत निर्धारित करने के लिए एलिसा रीडर का उपयोग करके इनक्यूबेटेड प्लेटों का विश्लेषण किया गया था।प्रयोग के विवरण और मापदंडों के लिए, संबंधित अनुभाग "सामग्री और विधियाँ" देखें।
हम एसीएसएच में मौजूद घुलनशील ऑलिगोसेकेराइड के साथ-साथ लिग्नोसेल्यूलोसिक हाइड्रोलिसेट्स से अलग किए गए कच्चे और शुद्ध ऑलिगोसेकेराइड अंशों को चिह्नित करके विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इस नई विकसित विधि की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं।जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, बायोएसिलेटेड ग्लाइकोम परख विधियों का उपयोग करके एसीएसएच में पहचाने जाने वाले सबसे आम एपिटोप-प्रतिस्थापित जाइलन आमतौर पर यूरोनिक (यू) या मिथाइल्यूरोनिक (एमईयू) और पेक्टिक अरेबिनोग्लैक्टन हैं।उनमें से अधिकांश गैर-हाइड्रोलाइज्ड ठोस पदार्थों (यूएचएस)43 के ग्लाइकेन के विश्लेषण पर हमारे पिछले अध्ययन में भी पाए गए थे।
कोशिका दीवार ग्लाइकेन को निर्देशित एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके पुनर्गणना ऑलिगोसेकेराइड एपिटोप्स का पता लगाना।"तटस्थ" अंश ACN अंश है और "अम्लीय" अंश FA अंश है।हीटमैप पर चमकीले लाल रंग उच्च एपिटोप सामग्री को दर्शाते हैं, और चमकीले नीले रंग एक खाली पृष्ठभूमि को दर्शाते हैं।पैमाने पर रंग मान फॉर्मूलेशन N=2 के लिए कच्चे OD मानों पर आधारित होते हैं।एंटीबॉडीज़ द्वारा पहचाने गए मुख्य एपिटोप्स को दाईं ओर दिखाया गया है।
इन गैर-सेलूलोज़ संरचनाओं को परीक्षण किए गए वाणिज्यिक एंजाइम मिश्रण में सबसे आम सेल्यूलेज़ और हेमिकेल्यूलेज़ द्वारा साफ़ नहीं किया जा सका, जिसमें सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक एंजाइम शामिल हैं।इसलिए, उनके हाइड्रोलिसिस के लिए नए सहायक एंजाइमों की आवश्यकता होती है।आवश्यक गैर-सेल्यूलोज सहायक एंजाइमों के बिना, ये गैर-सेल्यूलोज बांड मोनोसेकेराइड में पूर्ण रूपांतरण को रोकते हैं, भले ही उनके मूल चीनी पॉलिमर को बड़े पैमाने पर छोटे टुकड़ों में हाइड्रोलाइज किया जाता है और वाणिज्यिक एंजाइम मिश्रण का उपयोग करके भंग कर दिया जाता है।
सिग्नल वितरण और इसकी बाइंडिंग ताकत के आगे के अध्ययन से पता चला है कि बाइंडिंग एपिटोप्स उच्च डीपी चीनी अंशों (ए, बी, सी, डीपी 20+ तक) में कम डीपी अंशों (डी, ई, एफ, डीपी) की तुलना में डिमर्स में कम थे (छवि 1)।तटस्थ टुकड़ों की तुलना में एसिड के टुकड़े गैर-सेलूलोज़ एपिटोप्स में अधिक आम हैं।ये घटनाएं हमारे पिछले अध्ययन में देखे गए पैटर्न के अनुरूप हैं, जहां उच्च डीपी और एसिड मोएट एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस के प्रति अधिक प्रतिरोधी थे।इसलिए, गैर-सेलूलोज़ ग्लाइकेन एपिटोप्स और यू और एमईयू प्रतिस्थापन की उपस्थिति ऑलिगोसेकेराइड की स्थिरता में काफी योगदान कर सकती है।यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कम डीपी ऑलिगोसेकेराइड के लिए बाइंडिंग और डिटेक्शन दक्षता समस्याग्रस्त हो सकती है, खासकर यदि एपिटोप एक डिमेरिक या ट्राइमेरिक ऑलिगोसेकेराइड है।इसका परीक्षण अलग-अलग लंबाई के वाणिज्यिक ऑलिगोसेकेराइड का उपयोग करके किया जा सकता है, प्रत्येक में केवल एक एपिटोप होता है जो एक विशिष्ट एमएबी से बांधता है।
इस प्रकार, संरचना-विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग से कुछ प्रकार के अड़ियल बंधन का पता चला।उपयोग किए गए एंटीबॉडी के प्रकार, उपयुक्त बंधाव पैटर्न और इसके द्वारा उत्पन्न सिग्नल की ताकत (सबसे अधिक और सबसे कम प्रचुर मात्रा में) के आधार पर, नए एंजाइमों की पहचान की जा सकती है और अधिक पूर्ण ग्लाइकोकनवर्जन के लिए एंजाइम मिश्रण में अर्ध-मात्रात्मक रूप से जोड़ा जा सकता है।एक उदाहरण के रूप में ACSH ऑलिगोसैकेराइड्स के विश्लेषण को लेते हुए, हम प्रत्येक बायोमास सामग्री के लिए ग्लाइकेन बॉन्ड का एक डेटाबेस बना सकते हैं।यहां यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एंटीबॉडी की विभिन्न आत्मीयता को ध्यान में रखा जाना चाहिए, और यदि उनकी आत्मीयता अज्ञात है, तो यह विभिन्न एंटीबॉडी के संकेतों की तुलना करते समय कुछ कठिनाइयां पैदा करेगा।इसके अलावा, एक ही एंटीबॉडी के नमूनों के बीच ग्लाइकेन बांड की तुलना सबसे अच्छा काम कर सकती है।फिर इन जिद्दी बांडों को CAZyme डेटाबेस से जोड़ा जा सकता है, जिससे हम एंजाइमों की पहचान कर सकते हैं, उम्मीदवार एंजाइमों का चयन कर सकते हैं और बंधन-तोड़ने वाले एंजाइमों का परीक्षण कर सकते हैं, या बायोरिफाइनरीज़44 में उपयोग के लिए इन एंजाइमों को व्यक्त करने के लिए माइक्रोबियल सिस्टम विकसित कर सकते हैं।
यह मूल्यांकन करने के लिए कि कैसे प्रतिरक्षाविज्ञानी विधियाँ लिग्नोसेल्युलोसिक हाइड्रोलिसेट्स में मौजूद कम आणविक भार वाले ऑलिगोसेकेराइड्स को चिह्नित करने के लिए वैकल्पिक तरीकों को पूरक करती हैं, हमने MALDI (चित्र 4, S1-S8) का प्रदर्शन किया और उसी पैनल पर GC-MS पर आधारित TMS-व्युत्पन्न सैकराइड्स का विश्लेषण किया (चित्र 5) ऑलिगोसेकेराइड भाग।MALDI का उपयोग यह तुलना करने के लिए किया जाता है कि ऑलिगोसेकेराइड अणुओं का द्रव्यमान वितरण इच्छित संरचना से मेल खाता है या नहीं।अंजीर पर.4 तटस्थ घटकों एसीएन-ए और एसीएन-बी का एमसी दिखाता है।ACN-A विश्लेषण ने DP 4–8 (चित्र 4) से लेकर DP 22 (चित्र S1) तक पेंटोस शर्करा की एक श्रृंखला की पुष्टि की, जिसका वजन MeU-xylan oligosaccharides के अनुरूप है।एसीएन-बी विश्लेषण ने डीपी 8-15 के साथ पेंटोस और ग्लूकोक्सिलन श्रृंखला की पुष्टि की।चित्रा एस 3 जैसी पूरक सामग्री में, एफए-सी अम्लीय मात्रा द्रव्यमान वितरण मानचित्र 8-15 की डीपी के साथ (मी) यू प्रतिस्थापित पेंटोस शर्करा की एक श्रृंखला दिखाते हैं जो एलिसा-आधारित एमएबी स्क्रीनिंग में पाए गए प्रतिस्थापित जाइलन के अनुरूप हैं।प्रसंग सुसंगत हैं।
ACS में मौजूद घुलनशील गैर-अनुपालक ऑलिगोसेकेराइड का MALDI-MS स्पेक्ट्रम।यहां, (ए) एसीएन-ए मिथाइलेटेड यूरोनिक एसिड (डीपी 4-8) युक्त कम वजन वाले अंशों को ग्लुकुरोक्सिलन ऑलिगोसेकेराइड्स और (बी) एसीएन-बी जाइलन और मिथाइलेटेड यूरोनिक एसिड ऑलिगोसेकेराइड्स को ग्लुकुरॉक्सिलन (डीपी 8-15) के साथ प्रतिस्थापित किया गया है।
दुर्दम्य ऑलिगोसेकेराइड के ग्लाइकेन अवशेषों की संरचना का विश्लेषण।यहां (ए) जीसी-एमएस विश्लेषण का उपयोग करके प्राप्त विभिन्न ऑलिगोसेकेराइड अंशों की टीएमएस सैकराइड संरचना।(बी) ऑलिगोसेकेराइड में मौजूद विभिन्न टीएमएस-व्युत्पन्न शर्करा की संरचनाएं।एसीएन - एसीटोनिट्राइल अंश जिसमें तटस्थ ऑलिगोसेकेराइड होता है और एफए - फेरुलिक एसिड अंश जिसमें एसिड ऑलिगोसेकेराइड होता है।
ऑलिगोसेकेराइड अंश के एलसी-एमएस विश्लेषण से एक और दिलचस्प निष्कर्ष निकाला गया, जैसा कि चित्र S9 में दिखाया गया है (विधियों को इलेक्ट्रॉनिक पूरक सामग्री में देखा जा सकता है)।ACN-B अंश के बंधाव के दौरान हेक्सोज़ और -OAc समूहों के टुकड़े बार-बार देखे गए।यह खोज न केवल ग्लाइकोम और MALDI-TOF विश्लेषण में देखे गए विखंडन की पुष्टि करती है, बल्कि पूर्व-उपचारित लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास में संभावित कार्बोहाइड्रेट डेरिवेटिव के बारे में नई जानकारी भी प्रदान करती है।
हमने टीएमएस चीनी व्युत्पत्ति का उपयोग करके ऑलिगोसेकेराइड अंश की चीनी संरचना का भी विश्लेषण किया।जीसी-एमएस का उपयोग करके, हमने ऑलिगोसेकेराइड अंश (चित्र 5) में तंत्रिका (गैर-व्युत्पन्न) और अम्लीय शर्करा (ग्लूए और गैला) की संरचना निर्धारित की।ग्लुकुरोनिक एसिड अम्लीय घटकों सी और डी में पाया जाता है, जबकि गैलेक्टुरोनिक एसिड अम्लीय घटकों ए और बी में पाया जाता है, जो दोनों अम्लीय शर्करा के उच्च डीपी घटक हैं।ये परिणाम न केवल हमारे ELISA और MALDI डेटा की पुष्टि करते हैं, बल्कि ऑलिगोसेकेराइड संचय के हमारे पिछले अध्ययनों के अनुरूप भी हैं।इसलिए, हमारा मानना ​​है कि ऑलिगोसेकेराइड के बायोटिनाइलेशन और बाद में एलिसा स्क्रीनिंग का उपयोग करने वाली आधुनिक प्रतिरक्षाविज्ञानी विधियां विभिन्न जैविक नमूनों में घुलनशील पुनर्गणना ऑलिगोसेकेराइड का पता लगाने के लिए पर्याप्त हैं।
चूंकि एलिसा-आधारित एमएबी स्क्रीनिंग विधियों को कई अलग-अलग तरीकों से मान्य किया गया है, हम इस नई मात्रात्मक विधि की क्षमता का और पता लगाना चाहते थे।दो वाणिज्यिक ऑलिगोसेकेराइड, ज़ाइलोहेक्सासैकेराइड ऑलिगोसेकेराइड (XHE) और 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), सेल दीवार ग्लाइकेन को लक्षित करने वाले एक नए mAb दृष्टिकोण का उपयोग करके खरीदे और परीक्षण किए गए थे।चित्र 6 बायोटिनाइलेटेड बाइंडिंग सिग्नल और ओलिगोसेकेराइड सांद्रता के लॉग एकाग्रता के बीच एक रैखिक सहसंबंध दिखाता है, जो एक संभावित लैंगमुइर सोखना मॉडल का सुझाव देता है।mAbs में, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, और CCRC-M151 XHE के साथ सहसंबद्ध हैं, और CCRC-M108, CCRC-M109, और LM11 1 एनएम से 100 नैनो की रेंज में A2XX के साथ सहसंबद्ध हैं।प्रयोग के दौरान एंटीबॉडी की सीमित उपलब्धता के कारण, प्रत्येक ऑलिगोसेकेराइड सांद्रता के साथ सीमित प्रयोग किए गए।यहां यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ एंटीबॉडी एक सब्सट्रेट के रूप में एक ही ऑलिगोसेकेराइड पर बहुत अलग तरह से प्रतिक्रिया करते हैं, शायद इसलिए क्योंकि वे थोड़े अलग एपिटोप से बंधते हैं और उनमें बहुत अलग बाध्यकारी समानताएं हो सकती हैं।जब नया mAb दृष्टिकोण वास्तविक नमूनों पर लागू किया जाता है, तो सटीक एपिटोप पहचान के तंत्र और निहितार्थ बहुत अधिक जटिल होंगे।
विभिन्न ग्लाइकेन-लक्ष्यित mAbs की पहचान सीमा निर्धारित करने के लिए दो वाणिज्यिक ऑलिगोसेकेराइड का उपयोग किया गया था।यहां, ऑलिगोसेकेराइड सांद्रता के लॉग सांद्रण के साथ रैखिक सहसंबंध (ए) एमएबी के साथ एक्सएचई और एमएबी के साथ (बी) ए2XX के लिए लैंगमुइर सोखने के पैटर्न को दर्शाते हैं।संबंधित एपिटोप्स परख में सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक ऑलिगोसेकेराइड की संरचनाओं को इंगित करते हैं।
ग्लाइकेन-लक्षित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (ग्लाइकोकोमिक विश्लेषण या एलिसा-आधारित एमएबी स्क्रीनिंग) का उपयोग पौधों के बायोमास बनाने वाले अधिकांश प्रमुख कोशिका दीवार ग्लाइकेन के गहन लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।हालाँकि, शास्त्रीय ग्लाइकेन विश्लेषण केवल बड़ी कोशिका दीवार ग्लाइकेन की विशेषता बताता है, क्योंकि अधिकांश ऑलिगोसेकेराइड एलिसा प्लेटों पर कुशलता से स्थिर नहीं होते हैं।इस अध्ययन में, AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टोवर को उच्च ठोस सामग्री पर एंजाइमेटिक रूप से हाइड्रोलाइज्ड किया गया था।हाइड्रोलाइज़ेट में अड़ियल कोशिका दीवार कार्बोहाइड्रेट की संरचना निर्धारित करने के लिए चीनी विश्लेषण का उपयोग किया गया था।हालाँकि, हाइड्रोलिसेट्स में छोटे ऑलिगोसेकेराइड के mAb विश्लेषण को कम करके आंका गया है, और एलिसा प्लेटों पर ऑलिगोसेकेराइड को प्रभावी ढंग से स्थिर करने के लिए अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता होती है।
हम यहां ऑलिगोसैकेराइड बायोटिनाइलेशन के संयोजन द्वारा mAb स्क्रीनिंग के लिए एक उपन्यास और कुशल ऑलिगोसैकेराइड स्थिरीकरण विधि की रिपोर्ट करते हैं, जिसके बाद न्यूट्राविडिन™ लेपित प्लेटों पर एलिसा स्क्रीनिंग होती है।स्थिर बायोटिनाइलेटेड ऑलिगोसेकेराइड्स ने एंटीबॉडी के लिए पर्याप्त समानता दिखाई, जिससे अड़ियल ऑलिगोसेकेराइड्स का तेजी से और कुशल पता लगाया जा सके।मास स्पेक्ट्रोमेट्री के आधार पर इन जिद्दी ऑलिगोसेकेराइड्स की संरचना के विश्लेषण ने इम्यूनोस्क्रीनिंग के इस नए दृष्टिकोण के परिणामों की पुष्टि की।इस प्रकार, इन अध्ययनों से पता चलता है कि ग्लाइकेन-लक्षित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ ऑलिगोसेकेराइड बायोटिनाइलेशन और एलिसा स्क्रीनिंग के संयोजन का उपयोग ऑलिगोसेकेराइड में क्रॉसलिंक का पता लगाने के लिए किया जा सकता है और ऑलिगोसेकेराइड की संरचना को चिह्नित करने वाले अन्य जैव रासायनिक अध्ययनों में व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
यह बायोटिन-आधारित ग्लाइकेन प्रोफाइलिंग विधि पहली रिपोर्ट है जो पौधों के बायोमास में घुलनशील ऑलिगोसेकेराइड के अड़ियल कार्बोहाइड्रेट बांड की जांच करने में सक्षम है।इससे यह समझने में मदद मिलती है कि जब जैव ईंधन उत्पादन की बात आती है तो बायोमास के कुछ हिस्से इतने जिद्दी क्यों होते हैं।यह विधि ग्लाइकोम विश्लेषण विधियों में एक महत्वपूर्ण अंतर को भरती है और इसके अनुप्रयोग को पादप ओलिगोसेकेराइड से परे सब्सट्रेट की एक विस्तृत श्रृंखला तक बढ़ाती है।भविष्य में, हम बायोटिनाइलेशन के लिए रोबोटिक्स का उपयोग कर सकते हैं और एलिसा का उपयोग करके नमूनों के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए हमने जो विधि विकसित की है उसका उपयोग कर सकते हैं।
पायनियर 33ए14 हाइब्रिड बीजों से उगाए गए मकई के भूसे (सीएस) की कटाई 2010 में रे, कोलोराडो में क्रेमर फार्म से की गई थी।भूमि मालिक की अनुमति से इस बायोमास का उपयोग अनुसंधान के लिए किया जा सकता है। नमूनों को कमरे के तापमान में ज़िप-लॉक बैग में <6% नमी के साथ सूखा संग्रहित किया गया था। नमूनों को कमरे के तापमान में ज़िप-लॉक बैग में <6% नमी के साथ सूखा संग्रहित किया गया था। Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молние मैं एक निश्चित समय पर काम कर रहा हूँ। नमूनों को कमरे के तापमान पर ज़िपर वाले बैग में <6% आर्द्रता पर सूखा संग्रहीत किया गया था।样品在室温下以干燥<6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Оразцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью <6%. नमूनों को जिपर बैग में कमरे के तापमान पर नमी <6% के साथ संग्रहित किया जाता है।अध्ययन स्थानीय और राष्ट्रीय दिशानिर्देशों का अनुपालन करता है।एनआरईएल प्रोटोकॉल का उपयोग करके संरचनागत विश्लेषण किया गया था।संरचना में 31.4% ग्लूकेन, 18.7% ज़ाइलान, 3.3% अरेबिनन, 1.2% गैलेक्टन, 2.2% एसिटाइल, 14.3% लिग्निन, 1.7% प्रोटीन और 13. 4% राख पाया गया।
सेलिक® सीटेक2 (138 मिलीग्राम प्रोटीन/एमएल, लॉट वीसीएनआई 0001) नोवोजाइम्स (फ्रैंकलिन्टन, एनसी, यूएसए) से सेल्यूलेज, β-ग्लूकोसिडेज़ और सेलिक® एचटेक2 (157 मिलीग्राम प्रोटीन/एमएल, लॉट वीएचएन0001) का एक जटिल मिश्रण है।मल्टीफ़ेक्ट पेक्टिनेज़® (72 मिलीग्राम प्रोटीन/एमएल), पेक्टिन डिग्रेडिंग एंजाइमों का एक जटिल मिश्रण, ड्यूपॉन्ट इंडस्ट्रियल बायोसाइंसेज (पालो ऑल्टो, सीए, यूएसए) द्वारा दान किया गया था।केजेल्डहल नाइट्रोजन विश्लेषण (एओएसी विधि 2001.11, डेयरी वन कोऑपरेटिव इंक, इथाका, एनवाई, यूएसए) का उपयोग करके प्रोटीन सामग्री का अनुमान लगाकर (और गैर-प्रोटीन नाइट्रोजन के योगदान को घटाकर) एंजाइम प्रोटीन सांद्रता निर्धारित की गई थी।डायटोमेसियस अर्थ 545 ईएमडी मिलिपोर (बिलेरिका, एमए) से खरीदा गया था।सक्रिय कार्बन (DARCO, 100 मेश ग्रैन्यूल), एविसेल (PH-101), बीच ज़ाइलान, और अन्य सभी रसायन सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, MO) से खरीदे गए थे।
एएफईएक्स प्रीट्रीटमेंट जीएलबीआरसी (बायोमास रूपांतरण अनुसंधान प्रयोगशाला, एमएसयू, लांसिंग, एमआई, यूएसए) में किया गया था।15 मिनट के लिए 140 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-उपचार किया गया।स्टेनलेस स्टील बेंचटॉप बैच रिएक्टर (पार्र इंस्ट्रूमेंट्स कंपनी) में 60% (w/w) लोडिंग पर निर्जल अमोनिया और बायोमास के 1:1 अनुपात पर 46 निवास समय।इसमें 30 मिनट लगे.रिएक्टर को 140 डिग्री सेल्सियस पर लाया गया और अमोनिया तेजी से छोड़ा गया, जिससे बायोमास जल्दी से कमरे के तापमान पर वापस आ गया।AFEX प्री-ट्रीटेड कॉर्न स्टोवर (ACS) की संरचना अनुपचारित कॉर्न स्टोवर (UT-CS) के समान थी।
उच्च ठोस ACSH 25% (w/w) (लगभग 8% डेक्सट्रान लोडिंग) को ऑलिगोसेकेराइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में तैयार किया गया था।एसीएस की एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस सेलिक® सीटेक2 10 मिलीग्राम प्रोटीन/जी ग्लूकन (प्रीट्रीटेड बायोमास में), एचटेक2 (नोवोजाइम्स, फ्रैंकलिन्टन, एनसी), 5 मिलीग्राम प्रोटीन/जी ग्लूकन और मल्टीफेक्ट पेक्टिनेज (जेनेंकोर इंक, यूएसए) सहित एक वाणिज्यिक एंजाइम मिश्रण का उपयोग करके किया गया था।).), 5 मिलीग्राम प्रोटीन/जी डेक्सट्रान।एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस को 5-लीटर बायोरिएक्टर में 3 लीटर, पीएच 4.8, 50 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम की कार्यशील मात्रा के साथ किया गया था।96 घंटों तक हाइड्रोलिसिस के बाद, हाइड्रोलाइज़ेट को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 30 मिनट के लिए 6000 आरपीएम पर और फिर 30 मिनट के लिए 14000 आरपीएम पर इकट्ठा किया गया ताकि अनहाइड्रोलाइज्ड ठोस पदार्थों को हटाया जा सके।फिर हाइड्रोलाइज़ेट को 0.22 मिमी फिल्टर बीकर के माध्यम से बाँझ निस्पंदन के अधीन किया गया।फ़िल्टर किए गए हाइड्रोलाइज़ेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ बोतलों में संग्रहित किया गया और फिर कार्बन पर विभाजित किया गया।
एनआरईएल प्रयोगशाला विश्लेषण प्रक्रियाओं के अनुसार अर्क-आधारित बायोमास नमूनों की संरचना का विश्लेषण: संरचना विश्लेषण (एनआरईएल/टीपी-510-42620) के लिए नमूने तैयार करना और बायोमास में संरचनात्मक कार्बोहाइड्रेट और लिग्निन का निर्धारण (एनआरईएल/टीपी-510 - 42618)47।
हाइड्रोलाइज़ेट स्ट्रीम का ओलिगोसेकेराइड विश्लेषण एक आटोक्लेव-आधारित एसिड हाइड्रोलिसिस विधि का उपयोग करके 2 मिलीलीटर पैमाने पर किया गया था।10 मिलीलीटर स्क्रू कैप कल्चर ट्यूब में 72% सल्फ्यूरिक एसिड के 69.7 μl के साथ हाइड्रोलाइज़ेट नमूना मिलाएं और 121 डिग्री सेल्सियस पर एक बेंचटॉप पर 1 घंटे के लिए सेते हैं, बर्फ पर ठंडा करें और एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) शीशी में फ़िल्टर करें।ऑलिगोसेकेराइड की सांद्रता एसिड-हाइड्रोलाइज्ड नमूने में कुल चीनी सांद्रता से गैर-हाइड्रोलाइज्ड नमूने में मोनोसैकेराइड की सांद्रता को घटाकर निर्धारित की गई थी।
एसिड हाइड्रोलाइज्ड बायोमास में ग्लूकोज, जाइलोज और अरेबिनोज सांद्रता का विश्लेषण बायो-रेड एमिनेक्स एचपीएक्स-87एच कॉलम पर एक ऑटोसैंपलर, कॉलम हीटर, आइसोक्रेटिक पंप और अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टर से लैस शिमदज़ू एचपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके किया गया था।स्तंभ को 50 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था और पानी में 0.6 मिली/मिनट 5 एमएम एच2एसओ4 के साथ मिलाया गया था।प्रवाह।
हाइड्रोलाइज़ेट सतह पर तैरनेवाला को पतला किया गया और मोनोमर और ऑलिगोसेकेराइड सामग्री के लिए विश्लेषण किया गया।एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस के बाद प्राप्त मोनोमेरिक शर्करा का विश्लेषण बायो-रेड (हरक्यूलिस, सीए) एमिनेक्स एचपीएक्स-87पी कॉलम और एक ऐश गार्ड कॉलम से सुसज्जित एचपीएलसी द्वारा किया गया था।स्तंभ का तापमान 80 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था, पानी का उपयोग 0.6 मिली/मिनट की प्रवाह दर के साथ मोबाइल चरण के रूप में किया गया था।रेफरी में वर्णित विधियों के अनुसार 121 डिग्री सेल्सियस पर तनु एसिड में हाइड्रोलिसिस द्वारा ओलिगोसेकेराइड का निर्धारण किया गया था।41, 48, 49.
पहले वर्णित प्रक्रियाओं 27, 43, 50, 51 का उपयोग करके कच्चे, एएफईएक्स पूर्व-उपचारित और सभी गैर-हाइड्रोलाइज्ड बायोमास अवशेषों (सीरियल सेल दीवार अर्क के उत्पादन और उनकी एमएबी स्क्रीनिंग सहित) पर सैकराइड विश्लेषण किया गया था।ग्लाइकोम विश्लेषण के लिए, पौधे की कोशिका दीवार सामग्री के अल्कोहल-अघुलनशील अवशेषों को बायोमास अवशेषों से तैयार किया जाता है और अमोनियम ऑक्सालेट (50 मिमी), सोडियम कार्बोनेट (50 मिमी और 0.5% w/v), CON जैसे तेजी से आक्रामक अभिकर्मकों के साथ क्रमिक निष्कर्षण के अधीन किया जाता है।(1एम और 4एम, दोनों 1% w/v सोडियम बोरोहाइड्राइड के साथ) और एसिड क्लोराइट जैसा कि पहले बताया गया है52,53।फिर अर्क को सेल दीवार ग्लाइकेन की ओर निर्देशित mAb50s के एक जटिल पैनल के खिलाफ एलिसा के अधीन किया गया, और mAb बाइंडिंग प्रतिक्रियाओं को हीट मैप के रूप में प्रस्तुत किया गया।प्लांट सेल वॉल ग्लाइकेन को लक्षित करने वाले mAbs प्रयोगशाला स्टॉक (CCRC, JIM और MAC श्रृंखला) से खरीदे गए थे।
ऑलिगोसेकेराइड्स का एक-चरणीय बायोटिनाइलेशन।बायोटिन-एलसी-हाइड्रेज़ाइड के साथ कार्बोहाइड्रेट का संयुग्मन निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग करके किया गया था।बायोटिन-एलसी-हाइड्राज़ाइड (4.6 मिलीग्राम/12 μmol) को डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ, 70 μl) में जोरदार सरगर्मी और 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके घोल दिया गया था।ग्लेशियल एसिटिक एसिड (30 µl) मिलाया गया और मिश्रण को सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड (6.4 mg/100 µmol) पर डाला गया और लगभग 1 मिनट तक 65° C पर गर्म करने के बाद पूरी तरह से घुल गया।फिर, प्रतिक्रिया मिश्रण के 5 से 8 μl को सूखे ऑलिगोसेकेराइड (1-100 एनएमओएल) में जोड़ा गया ताकि कम करने वाले सिरे पर लेबल का 10 गुना या अधिक मोलर अतिरिक्त प्राप्त किया जा सके।प्रतिक्रिया 2 घंटे के लिए 65°C पर की गई, जिसके बाद नमूनों को तुरंत शुद्ध किया गया।लेबलिंग प्रयोगों में कटौती के बिना किसी भी सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड का उपयोग नहीं किया गया था, और नमूनों को 2.5 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया दी गई थी।
बायोटिनाइलेटेड ऑलिगोसेकेराइड के नमूनों की एलिसा कोटिंग और धुलाई।बायोटिनाइलेटेड नमूनों के 25 μl (प्रत्येक केंद्रित नमूने के 100 μl को 0.1 एम ट्रिस बफर समाधान (टीबीएस) के 5 मिलीलीटर में पतला) एविडिन-लेपित प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था।नियंत्रण कुओं को 0.1 एम टीबीएस में 10 μg/ml की सांद्रता पर 50 μl बायोटिन के साथ लेपित किया गया था।खाली माप के लिए विआयनीकृत पानी का उपयोग कोटिंग के रूप में किया जाता था।टैबलेट को कमरे के तापमान पर 2 घंटे तक अंधेरे में रखा गया।प्रोग्राम नंबर का उपयोग करके प्लेट को 0.1% स्किम्ड दूध से 0.1 एम टीबीएस में 3 बार धोएं।ग्रेनियर फ्लैट 3ए के लिए 11।
प्राथमिक एंटीबॉडी का जोड़ और धुलाई।प्रत्येक कुएं में 40 μl प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें।कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माइक्रोप्लेट को अंधेरे में इनक्यूबेट करें।ग्रेनियर फ्लैट 3ए के लिए वॉश प्रोग्राम #11 का उपयोग करके प्लेटों को 0.1एम टीबीएस में 0.1% दूध से 3 बार धोया गया।
द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें और धो लें।प्रत्येक कुएं में 50 μl माउस/चूहा द्वितीयक एंटीबॉडी (0.1% दूध में 0.1 एम टीबीएस में पतला 1:5000) जोड़ें।कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माइक्रोप्लेट को अंधेरे में इनक्यूबेट करें।ग्रेनियर फ्लैट 5ए प्लेट वॉश प्रोग्राम #12 का उपयोग करके माइक्रोप्लेट्स को 0.1 एम टीबीएस में 0.1% दूध के साथ 5 बार धोया गया।
एक सब्सट्रेट जोड़ना.बेस सब्सट्रेट में 3,3′,5,5′-टेट्रामेथिलबेन्ज़िडाइन (टीएमबी) के 50 μl जोड़ें (15 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में बफर की 2 बूंदें, टीएमबी की 3 बूंदें, हाइड्रोजन पेरोक्साइड की 2 बूंदें जोड़कर)।टीएमबी सब्सट्रेट तैयार करें।और उपयोग से पहले भंवर)।माइक्रोप्लेट को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।अंधेरे में।
चरण पूरा करें और टेबलेट पढ़ें.प्रत्येक कुएं में 1 एन सल्फ्यूरिक एसिड के 50 μl जोड़ें और एलिसा रीडर का उपयोग करके 450 से 655 एनएम तक अवशोषण रिकॉर्ड करें।
विआयनीकृत पानी में इन एनालिटिक्स के 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर घोल तैयार करें: अरेबिनोज, रैम्नोज, फ्यूकोज, जाइलोज, गैलेक्टुरोनिक एसिड (गैला), ग्लुकुरोनिक एसिड (जीएलसीए), मैनोज, ग्लूकोज, गैलेक्टोज, लैक्टोज, एन-एसिटाइलमैनोसामाइन (मैनएनएसी), एन-एसिटाइलग्लुकोसामाइन।(glcNAc), N-एसिटाइलगैलेक्टोसामाइन (galNAc), इनोसिटोल (आंतरिक मानक)।तालिका 1 में दिखाए गए 1 मिलीग्राम/एमएल चीनी समाधान को जोड़कर दो मानक तैयार किए गए थे। नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए और लियोफिलाइज़ किया जाता है, जब तक कि सारा पानी निकल न जाए (आमतौर पर लगभग 12-18 घंटे)।
एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर कैप ट्यूबों को पेंच करने के लिए 100-500 µg नमूना जोड़ें।जोड़ी गई राशि रिकॉर्ड करें.नमूने को विलायक की एक विशिष्ट सांद्रता में घोलना और इसे तरल एलिकोट के रूप में ट्यूब में जोड़ना सबसे अच्छा है।प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए आंतरिक मानक के रूप में 1 मिलीग्राम/एमएल इनोसिटोल के 20 μl का उपयोग करें।नमूने में जोड़े गए आंतरिक मानक की मात्रा मानक ट्यूब में जोड़े गए आंतरिक मानक की मात्रा के समान होनी चाहिए।
एक स्क्रू कैप शीशी में 8 मिलीलीटर निर्जल मेथनॉल मिलाएं।फिर 3 एन मेथेनॉलिक एचसीएल घोल के 4 मिलीलीटर को ढककर हिलाएं।इस प्रक्रिया में पानी का उपयोग नहीं होता है।
ऑलिगोसेकेराइड नमूनों और मानक टीएमएस ट्यूबों में 1 एम एचसीएल मेथनॉल समाधान के 500 μl जोड़ें।नमूनों को एक थर्मल ब्लॉक में 80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (168 घंटे) रखा गया।मेथेनोलिसिस उत्पाद को सुखाने वाले मैनिफोल्ड का उपयोग करके कमरे के तापमान पर सुखाएं।200 μl MeOH डालें और फिर से सुखाएँ।यह प्रक्रिया दो बार दोहराई जाती है.नमूने में 200 μl मेथनॉल, 100 μl पाइरीडीन और 100 μl एसिटिक एनहाइड्राइड मिलाएं और अच्छी तरह मिलाएं।नमूनों को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया।और सूख गया.200 μl मेथनॉल डालें और फिर से सुखाएँ।
ट्राई-सिल के 200 μl जोड़ें और 20 मिनट के लिए कैप्ड ट्यूब को गर्म करें।80°C, फिर कमरे के तापमान तक ठंडा किया गया।नमूने को लगभग 50 μl की मात्रा तक सुखाने के लिए सुखाने वाले मैनिफोल्ड का उपयोग करें।यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमने नमूनों को पूरी तरह सूखने नहीं दिया।
2 मिलीलीटर हेक्सेन डालें और घुमाकर अच्छी तरह मिलाएँ।5-3/4 इंच व्यास वाले पिपेट के ऊपर ग्लास वूल डालकर पाश्चर पिपेट (5-8 मिमी) के सिरे को ग्लास वूल के टुकड़े से भरें।नमूनों को 2 मिनट के लिए 3000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।कोई भी अघुलनशील अवशेष अवक्षेपित हो जाता है।नमूने को 100-150 μl तक सुखा लें।लगभग 1 μl की मात्रा को 80 डिग्री सेल्सियस के प्रारंभिक तापमान और 2.0 मिनट के प्रारंभिक समय (तालिका 2) पर जीसी-एमएस में इंजेक्ट किया गया था।