Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कॉम्पॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). यादरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टाईल्स आणि जावास्क्रिप्टशिवाय प्रस्तुत करू.
AFEX ने पूर्व-प्रक्रिया केलेल्या मक्याच्या पेंढ्यामधील टिकून राहणाऱ्या ओलिगोसॅकराइड्सच्या जटिल विश्लेषणासाठी नवीन इम्युनोलॉजिकल आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक पद्धती. लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास हा जीवाश्म इंधनांना एक शाश्वत पर्याय आहे आणि अन्न, पशुखाद्य, इंधन आणि रसायने यांसारख्या उत्पादनांच्या निर्मितीसाठी जैवतंत्रज्ञान विकसित करण्याकरिता याचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जातो. या तंत्रज्ञानाची गुरुकिल्ली म्हणजे वनस्पतींच्या पेशीभित्तींमध्ये असलेल्या जटिल कर्बोदकांचे ग्लुकोज, झायलोज आणि अरॅबिनोज यांसारख्या साध्या शर्करांमध्ये रूपांतर करण्यासाठी किफायतशीर प्रक्रिया विकसित करणे. लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास अत्यंत चिवट असल्यामुळे, इच्छित उत्पादन मिळवण्यासाठी त्यावर थर्मोकेमिकल प्रक्रिया (उदा., अमोनिया फायबर एक्सफोलिएशन (AFEX), सौम्य आम्ल (DA), आयोनिक लिक्विड्स (IL)) आणि जैविक प्रक्रिया (उदा., एन्झायमॅटिक हायड्रोलिसिस आणि सूक्ष्मजैविक किण्वन) एकत्रितपणे करणे आवश्यक असते. तथापि, जेव्हा जलविघटन प्रक्रियेत व्यावसायिक बुरशीजन्य एन्झाइम्स वापरले जातात, तेव्हा तयार होणाऱ्या विद्राव्य शर्करांपैकी केवळ ७५-८५% मोनोसॅकॅराइड्स असतात, आणि उर्वरित १५-२५% विद्राव्य, प्रक्रिया न होणारे ओलिगोसॅकॅराइड्स असतात, जे सूक्ष्मजीवांना नेहमीच उपलब्ध नसतात. यापूर्वी, आम्ही कार्बन आणि डायटोमेशियस अर्थ विलगीकरण आणि साइज एक्सक्लूजन क्रोमॅटोग्राफीच्या संयोजनाचा वापर करून विद्राव्य, प्रक्रिया न होणारे ओलिगोसॅकॅराइड्स यशस्वीरित्या वेगळे करून शुद्ध केले आहेत, आणि त्यांच्या एन्झाइम प्रतिबंधक गुणधर्मांचाही अभ्यास केला आहे. आम्हाला असे आढळले आहे की, कमी डीपी (DP) आणि न्यूट्रल ओलिगोसॅकॅराइड्सच्या तुलनेत, उच्च डीपी (DP) असलेले मिथाइलेटेड युरोनिक ॲसिड प्रतिस्थापन असलेले ओलिगोसॅकॅराइड्स व्यावसायिक एन्झाइम मिश्रणांद्वारे प्रक्रिया करण्यास अधिक कठीण असतात. येथे आम्ही अनेक अतिरिक्त पद्धतींचा वापर सादर करत आहोत, ज्यात वनस्पती पेशीभित्ती आणि एन्झाइमॅटिक हायड्रोलायसेट्समधील ग्लायकॅन बंधांचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी वनस्पती बायोमास ग्लायकॅन्ससाठी विशिष्ट असलेल्या मोनोक्लोनल अँटीबॉडीज (mAbs) वापरून ग्लायकॅन प्रोफाइलिंग, मॅट्रिक्स-असिस्टेड लेझर डिसॉर्प्शन आयनायझेशन, टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास-स्पेक्ट्रोमेट्री यांचा समावेश आहे. MALDI-TOF-MS हे, डेरिव्हटायझेशनसह आणि त्याशिवाय ओलिगोसॅकराइड बंधांचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी, निगेटिव्ह आयनांच्या दुय्यम क्षयानंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी, गॅस क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) द्वारे मिळवलेल्या संरचना-माहितीपूर्ण निदानात्मक शिखरांचा वापर करते. ओलिगोसॅकराइड्सच्या लहान आकारामुळे (DP ४-२०), हे रेणू mAb बंधन आणि वैशिष्ट्यीकरणासाठी वापरणे कठीण आहे. या समस्येवर मात करण्यासाठी, आम्ही एक नवीन बायोटिन कॉन्जुगेशन-आधारित ओलिगोसॅकराइड स्थिरीकरण पद्धत वापरली, ज्याने कमी DP असलेल्या बहुतांश विद्राव्य ओलिगोसॅकराइड्सना मायक्रोप्लेटच्या पृष्ठभागावर यशस्वीरित्या लेबल केले, ज्याचा उपयोग नंतर विशिष्ट लायगेशन विश्लेषणासाठी एका हाय-थ्रूपुट mAb प्रणालीमध्ये केला गेला. ही नवीन पद्धत भविष्यात अधिक प्रगत हाय-थ्रूपुट ग्लायकोम चाचण्यांच्या विकासास चालना देईल, ज्यांचा उपयोग निदानात्मक हेतूंसाठी बायोमार्करमध्ये उपस्थित असलेल्या ओलिगोसॅकराइड्सना वेगळे करण्यासाठी आणि त्यांचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी केला जाऊ शकतो.
शेती, वनीकरण, गवत आणि लाकडी पदार्थांपासून बनलेला लिग्नोसेल्युलोजिक बायोमास, अन्न, पशुखाद्य, इंधन आणि उच्च-मूल्य उत्पादने तयार करण्यासाठी रासायनिक पूर्वसूचकांसह जैव-आधारित उत्पादनांच्या निर्मितीसाठी एक संभाव्य कच्चा माल आहे¹. वनस्पतींच्या पेशीभित्तींमध्ये असलेले कर्बोदके (जसे की सेल्युलोज आणि हेमिसेल्युलोज) रासायनिक प्रक्रिया आणि जैव-रूपांतरण (जसे की एंजाइमेटिक हायड्रोलिसिस आणि सूक्ष्मजैविक किण्वन) द्वारे मोनोसॅकराइड्समध्ये विघटित केले जातात. सामान्य पूर्व-उपचारांमध्ये अमोनिया फायबर एक्सपान्शन (AFEX), सौम्य आम्ल (DA), आयनिक लिक्विड (IL), आणि स्टीम एक्सप्लोजन (SE) यांचा समावेश होतो, जे वनस्पतींच्या पेशीभित्ती उघडून लिग्नोसेल्युलोजचे उत्पादन कमी करण्यासाठी रसायने आणि उष्णतेचे मिश्रण वापरतात³,⁴. पदार्थांचा कठीणपणा,⁵. जैव-आधारित इंधन आणि रसायने तयार करण्यासाठी व्यावसायिक सक्रिय कर्बोदक-युक्त एंजाइम्स (CAZymes) वापरून उच्च घन भारावर एंजाइमेटिक हायड्रोलिसिस केले जाते आणि जनुकीय सुधारित यीस्ट किंवा जीवाणू वापरून सूक्ष्मजैविक किण्वन केले जाते⁶.
व्यावसायिक एन्झाइम्समधील सीएझेडाइम्स (CAZymes) हे एन्झाइम्सच्या एका जटिल मिश्रणाने बनलेले असतात, जे सहक्रियात्मकरित्या जटिल कार्बोहायड्रेट-शर्करा बंध तोडून मोनोसॅकॅराइड्स तयार करतात²,⁷. आम्ही पूर्वी नमूद केल्याप्रमाणे, लिग्निनच्या कार्बोहायड्रेट्ससोबतच्या सुगंधी पॉलिमरचे जटिल जाळे त्यांना अत्यंत अवघड बनवते, ज्यामुळे शर्करेचे रूपांतरण अपूर्ण राहते आणि पूर्व-उपचारित बायोमासच्या एन्झायमॅटिक हायड्रोलिसिस दरम्यान तयार न झालेले १५-२५% सेक्स ओलिगोसॅकॅराइड्स जमा होतात. ही विविध बायोमास पूर्व-उपचार पद्धतींमधील एक सामान्य समस्या आहे. या समस्येच्या काही कारणांमध्ये हायड्रोलिसिस दरम्यान एन्झाइमचा अवरोध, किंवा वनस्पती बायोमासमधील शर्करा बंध तोडण्यासाठी आवश्यक असलेल्या अत्यावश्यक एन्झाइम्सची अनुपस्थिती किंवा कमी पातळी यांचा समावेश आहे. ओलिगोसॅकॅराइड्समधील शर्करा बंधांसारख्या शर्करांच्या रचना आणि संरचनात्मक वैशिष्ट्यांची माहिती घेतल्यास, आपल्याला हायड्रोलिसिस दरम्यान शर्करा रूपांतरण सुधारण्यास मदत होईल, ज्यामुळे जैवतंत्रज्ञान प्रक्रिया पेट्रोलियम-आधारित उत्पादनांशी किफायतशीर बनतील.
कर्बोदकांची रचना निश्चित करणे आव्हानात्मक आहे आणि त्यासाठी लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (LC)11,12, न्यूक्लियर मॅग्नेटिक रेझोनन्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (NMR)13, कॅपिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस (CE)14,15,16 आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS)17,18 यांसारख्या पद्धतींचे संयोजन आवश्यक आहे. लेझर डिसॉर्प्शन आणि मॅट्रिक्स वापरून आयनीकरण (MALDI-TOF-MS) सह टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री सारख्या MS पद्धती कर्बोदकांच्या रचना ओळखण्यासाठी एक बहुपयोगी पद्धत आहे. अलीकडे, ओलिगोसॅकराइड जोडणीची ठिकाणे, ॲनोमेरिक संरचना, क्रम आणि शाखांची ठिकाणे 20, 21 यांच्याशी संबंधित फिंगरप्रिंट्स ओळखण्यासाठी सोडियम आयन ॲडक्ट्सच्या कोलिजन-इंड्युस्ड डिसोसिएशन (CID) टँडम MS चा सर्वाधिक वापर केला गेला आहे.
कर्बोदक बंधांच्या सखोल ओळखीसाठी ग्लायकॅन विश्लेषण हे एक उत्कृष्ट साधन आहे²². ही पद्धत जटिल कर्बोदक बंध समजून घेण्यासाठी वनस्पती पेशीभित्ती ग्लायकॅनला लक्ष्य करणाऱ्या मोनोक्लोनल अँटीबॉडीज (mAbs) चा प्रोब म्हणून वापर करते. जगभरात २५० हून अधिक mAbs उपलब्ध आहेत, ज्या विविध सॅकॅराइड्सचा वापर करून विविध रेखीय आणि शाखीय ओलिगोसॅकॅराइड्सच्या विरोधात तयार केल्या आहेत²⁴. वनस्पती पेशीभित्तीची रचना, संरचना आणि बदल यांचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी अनेक mAbs चा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला गेला आहे, कारण वनस्पती पेशींचा प्रकार, अवयव, वय, विकासाचा टप्पा आणि वाढीचे वातावरण यानुसार त्यात लक्षणीय फरक आढळतात²⁵,²⁶. अलीकडे, ही पद्धत वनस्पती आणि प्राणी प्रणालींमधील व्हेसिकलची संख्या आणि उपपेशीय मार्कर, विकासाचे टप्पे किंवा पर्यावरणीय उत्तेजनांद्वारे निर्धारित केल्यानुसार ग्लायकॅन वहनातील त्यांच्या संबंधित भूमिका समजून घेण्यासाठी, तसेच एन्झाइमॅटिक क्रियाकलाप निश्चित करण्यासाठी वापरली गेली आहे. ओळखल्या गेलेल्या ग्लायकॅन्स आणि झायलॅन्सच्या काही वेगवेगळ्या संरचनांमध्ये पेक्टिन (P), झायलॅन (X), मॅनॅन (M), झायलोग्लुकॅन्स (XylG), मिश्र बंध ग्लुकॅन्स (MLG), अरॅबिनोझायलॅन (ArbX), गॅलॅक्टोमॅनॅन (GalG), ग्लुक्युरोनिक ॲसिड-अरॅबिनोझायलॅन (GArbX) आणि अरॅबिनो-गॅलॅक्टन (ArbG)29 यांचा समावेश आहे.
तथापि, या सर्व संशोधन प्रयत्नांनंतरही, उच्च घन भार (HSL) जलविश्लेषणादरम्यान ओलिगोसॅकराइड संचयनाच्या स्वरूपावर केवळ काही अभ्यासांनी लक्ष केंद्रित केले आहे, ज्यामध्ये ओलिगोसॅकराइड मुक्ती, जलविश्लेषणादरम्यान ओलिगोमेरिक साखळीच्या लांबीतील बदल, विविध कमी DP पॉलिमर आणि त्यांचे वितरण वक्र यांचा समावेश आहे ३०,३१,३२. दरम्यान, ग्लायकॅन संरचनेच्या सर्वसमावेशक विश्लेषणासाठी ग्लायकॅन विश्लेषण हे एक उपयुक्त साधन सिद्ध झाले असले तरी, अँटीबॉडी पद्धती वापरून पाण्यात विरघळणाऱ्या कमी DP ओलिगोसॅकराइड्सचे मूल्यांकन करणे कठीण आहे. ५-१० kDa पेक्षा कमी आण्विक वजन असलेले कमी DP ओलिगोसॅकराइड्स ELISA प्लेट्सना बांधले जात नाहीत ३३, ३४ आणि अँटीबॉडी टाकण्यापूर्वी ते धुऊन टाकले जातात.
येथे, आम्ही प्रथमच, विद्राव्य दुर्दम्य ओलिगोसॅकराइड्ससाठी एक-चरण बायोटिनिलेशन प्रक्रियेला ग्लायकोम विश्लेषणासोबत एकत्रित करून, मोनोक्लोनल अँटीबॉडीज वापरून ॲव्हिडिन-लेपित प्लेट्सवर एक ELISA चाचणी सादर करत आहोत. हायड्रोलाइज्ड साखर रचनांच्या ट्रायमेथिलसिलिल (TMS) डेरिव्हटायझेशनचा वापर करून पूरक ओलिगोसॅकराइड बंधांच्या MALDI-TOF-MS आणि GC-MS आधारित विश्लेषणाद्वारे आमच्या ग्लायकोम विश्लेषण पद्धतीची पडताळणी करण्यात आली. ही नाविन्यपूर्ण पद्धत भविष्यात एक उच्च-थ्रुपुट पद्धत म्हणून विकसित केली जाऊ शकते आणि बायोमेडिकल संशोधनात तिचा व्यापक वापर होऊ शकतो35.
एन्झाइम्स आणि अँटीबॉडीजमधील पोस्ट-ट्रान्सलेशनल बदल, जसे की ग्लायकोसिलेशन,३६ त्यांच्या जैविक क्रियेवर परिणाम करतात. उदाहरणार्थ, सीरम प्रथिनांच्या ग्लायकोसिलेशनमधील बदल दाहक संधिवातामध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावतात आणि ग्लायकोसिलेशनमधील बदल निदानात्मक मार्कर म्हणून वापरले जातात३७. विविध ग्लायकॅन्स विविध रोगांमध्ये सहजपणे आढळतात असे साहित्यात नोंदवले गेले आहे, ज्यात जठरांत्र मार्ग आणि यकृताचे जुनाट दाहक रोग, विषाणूजन्य संसर्ग, अंडाशय, स्तन आणि प्रोस्टेट कर्करोग यांचा समावेश आहे३८,३९,४०. अँटीबॉडी-आधारित ग्लायकॅन ELISA पद्धती वापरून ग्लायकॅन्सची रचना समजून घेतल्यास, क्लिष्ट MS पद्धतींशिवाय रोगाच्या निदानावर अधिक विश्वास बसेल.
आमच्या मागील अभ्यासात असे दिसून आले की, पूर्व-प्रक्रिया आणि एन्झायमॅटिक जलविश्लेषणानंतरही काही हट्टी ओलिगोसॅकराइड्सचे जलविश्लेषण होत नाही (आकृती १). आमच्या पूर्वी प्रकाशित झालेल्या कामात, आम्ही AFEX-पूर्व-प्रक्रिया केलेल्या मक्याच्या पेंढ्याच्या जलविश्लेषणातून (ACSH) ओलिगोसॅकराइड्स वेगळे करण्यासाठी एक सक्रिय कोळशाची घन-अवस्था निष्कर्षण पद्धत विकसित केली आहे. प्रारंभिक निष्कर्षण आणि विलगीकरणानंतर, ओलिगोसॅकराइड्सचे पुढे साइज एक्सक्लूजन क्रोमॅटोग्राफी (SEC) द्वारे अंशांकन केले गेले आणि त्यांना रेणूभाराच्या क्रमाने गोळा केले गेले. विविध पूर्व-प्रक्रियांमधून मुक्त झालेल्या शर्करा मोनोमर्स आणि ओलिगोमर्सचे शर्करा रचना विश्लेषणाद्वारे विश्लेषण केले गेले. विविध पूर्व-प्रक्रिया पद्धतींद्वारे प्राप्त झालेल्या शर्करा ओलिगोमर्सच्या प्रमाणाची तुलना केल्यावर, बायोमासचे मोनोसॅकराइड्समध्ये रूपांतर करताना हट्टी ओलिगोसॅकराइड्सची उपस्थिती ही एक सामान्य समस्या असल्याचे दिसून येते आणि यामुळे शर्करेच्या उत्पादनात किमान १०-१५% आणि अगदी १८% पर्यंत घट होऊ शकते. ही पद्धत ओलिगोसॅकराइड अंशांच्या पुढील मोठ्या प्रमाणावरील उत्पादनासाठी वापरली जाते. या कामात ओलिगोसॅकराइड्सच्या वैशिष्ट्यीकरणासाठी, परिणामी ACH आणि त्याचे वेगवेगळ्या रेणूभारांचे पुढील अंश प्रायोगिक सामग्री म्हणून वापरले गेले.
पूर्व-प्रक्रिया आणि एन्झायमेटिक जलविघटनानंतर, टिकून राहिलेले ओलिगोसॅकॅराइड्स अजलविघटित राहिले. येथे (A) ओलिगोसॅकॅराइड वेगळे करण्याची एक पद्धत आहे, ज्यामध्ये सक्रिय कार्बन आणि डायटोमेशियस अर्थच्या पॅक्ड बेडचा वापर करून AFEX-पूर्व-प्रक्रिया केलेल्या कॉर्न स्टॉवर हायड्रोलायसेट (ACSH) पासून ओलिगोसॅकॅराइड्स वेगळे केले जातात; (B) ओलिगोसॅकॅराइड्स वेगळे करण्याची पद्धत. ओलिगोसॅकॅराइड्स पुढे साइज एक्सक्लूजन क्रोमॅटोग्राफी (SEC) द्वारे वेगळे केले गेले; (C) विविध पूर्व-प्रक्रियांमधून (सौम्य आम्ल: DA, आयनिक द्रव: IL आणि AFEX) मुक्त झालेले सॅकॅराइड मोनोमर्स आणि ओलिगोमर्स. एंझायमॅटिक हायड्रोलिसिसच्या अटी: 25% (w/w) चे उच्च घन पदार्थांचे लोडिंग (अंदाजे 8% ग्लुकॅन लोडिंग), 96 तासांचे हायड्रोलिसिस, 20 mg/g व्यावसायिक एंझाइम लोडिंग (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 गुणोत्तर) आणि (D) AFEX पूर्व-उपचारित कॉर्न स्टॉवर (ACS) मधून मुक्त झालेले ग्लुकोज, झायलोज आणि अरॅबिनोजचे शुगर मोनोमर्स आणि ओलिगोमर्स.
घन बायोमास अवशेषांमधून वेगळे केलेल्या अर्कांमधील ग्लायकॅन्सच्या सर्वसमावेशक संरचनात्मक विश्लेषणासाठी ग्लायकॅन विश्लेषण हे एक उपयुक्त साधन सिद्ध झाले आहे. तथापि, या पारंपरिक पद्धतीचा वापर करून पाण्यात विरघळणारे सॅकॅराइड्स कमी प्रमाणात दर्शविले जातात⁴¹, कारण कमी आण्विक वजनाचे ओलिगोसॅकॅराइड्स ELISA प्लेट्सवर स्थिर करणे कठीण असते आणि अँटीबॉडी टाकण्यापूर्वी ते धुऊन जातात. म्हणून, अँटीबॉडी बंधन आणि वैशिष्ट्यीकरणासाठी, अ‍ॅव्हिडिन-लेपित ELISA प्लेट्सवर विरघळणारे, नॉन-कॉम्प्लायंट ओलिगोसॅकॅराइड्स लेपित करण्यासाठी एक-चरण बायोटिनिलेशन पद्धत वापरली गेली. ही पद्धत आमच्या पूर्वी उत्पादित केलेल्या ACSH आणि त्याच्या आण्विक वजनावर (किंवा पॉलिमरायझेशनची पदवी, DP) आधारित एका अंशाचा वापर करून तपासली गेली. कार्बोहायड्रेटच्या रिड्यूसिंग टोकाला बायोटिन-LC-हायड्राझाइड जोडून ओलिगोसॅकॅराइड बंधन क्षमता वाढवण्यासाठी एक-चरण बायोटिनिलेशनचा वापर केला गेला (आकृती २). द्रावणात, रिड्यूसिंग टोकावरील हेमिॲसिटल गट बायोटिन-LC-हायड्राझाइडच्या हायड्राझाइड गटाशी अभिक्रिया करून हायड्राझोन बंध तयार करतो. NaCNBH3 या रिड्यूसिंग एजंटच्या उपस्थितीत, हायड्राझोन बंधाचे एका स्थिर बायोटिनिलेटेड अंतिम उत्पादनात रूपांतर होते. शुगर रिड्यूसिंग एंडमध्ये बदल केल्यामुळे, कमी DP असलेल्या ओलिगोसॅकॅराइड्सचे ELISA प्लेट्सशी बंधन शक्य झाले, आणि आमच्या अभ्यासात हे ग्लायकॅन-टार्गेटेड mAbs वापरून ॲव्हिडिन-कोटेड प्लेट्सवर करण्यात आले.
बायोटिनिलेटेड ओलिगोसॅकराइड्ससाठी ELISA आधारित मोनोक्लोनल अँटीबॉडीजची तपासणी. येथे (A) ओलिगोसॅकराइड्सचे एकत्रित बायोटिनिलेशन आणि त्यानंतर न्यूट्रएव्हिडिन लेपित प्लेट्सवर ग्लायकॅन-लक्ष्यित mAbs सह ELISA तपासणी आणि (B) प्रतिक्रिया उत्पादनांच्या बायोटिनिलेशनसाठी एक-चरण प्रक्रिया दर्शवते.
नंतर, ओलिगोसॅकराइड-संयुग्मित अँटीबॉडीज असलेल्या ॲव्हिडिन-लेपित प्लेट्समध्ये प्राथमिक आणि दुय्यम अँटीबॉडीज टाकण्यात आल्या आणि त्यांना प्रकाश व वेळ-संवेदनशील माध्यमात धुतले गेले. अँटीबॉडीचे बंधन पूर्ण झाल्यावर, प्लेटला इनक्युबेट करण्यासाठी TMB सबस्ट्रेट टाकण्यात आले. शेवटी, सल्फ्यूरिक ॲसिड वापरून ही अभिक्रिया थांबवण्यात आली. अँटीबॉडी-विशिष्ट क्रॉस-लिंकिंग शोधण्यासाठी प्रत्येक अँटीबॉडीच्या बंधनाची शक्ती निश्चित करण्याकरिता, इनक्युबेट केलेल्या प्लेट्सचे ELISA रीडर वापरून विश्लेषण करण्यात आले. प्रयोगाचे तपशील आणि पॅरामीटर्ससाठी, संबंधित विभाग “साहित्य आणि पद्धती” पहा.
ACSH मध्ये तसेच लिग्नोसेल्युलोसिक हायड्रोलायसेट्समधून वेगळे केलेल्या कच्च्या आणि शुद्ध केलेल्या ओलिगोसॅकराइड अंशांमध्ये असलेल्या विद्राव्य ओलिगोसॅकराइड्सचे वैशिष्ट्यीकरण करून, आम्ही विशिष्ट अनुप्रयोगांसाठी या नव्याने विकसित केलेल्या पद्धतीची उपयुक्तता दाखवतो. आकृती ३ मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, बायोअसायलेटेड ग्लायकोम अ‍ॅसे पद्धती वापरून ACSH मध्ये ओळखले जाणारे सर्वात सामान्य एपिटोप-प्रतिस्थापित झायलॅन्स सहसा युरोनिक (U) किंवा मिथाइलयुरोनिक (MeU) आणि पेक्टिक अ‍ॅराबिनोगॅलॅक्टॅन्स असतात. त्यापैकी बहुतेक आमच्या नॉन-हायड्रोलाइज्ड सॉलिड्स (UHS)४३ च्या ग्लायकॅन्सच्या विश्लेषणावरील मागील अभ्यासातही आढळले होते.
पेशीभित्ती ग्लायकॅनला लक्ष्य करणाऱ्या मोनोक्लोनल अँटीबॉडीचा वापर करून प्रतिरोधक ओलिगोसॅकराइड एपिटोप्सचे शोधन. “तटस्थ” अंश हा ACN अंश आहे आणि “आम्लीय” अंश हा FA अंश आहे. हीटमॅपवरील अधिक गडद लाल रंग उच्च एपिटोप सामग्री दर्शवतात, आणि अधिक गडद निळे रंग रिक्त पार्श्वभूमी दर्शवतात. स्केलवरील रंगांची मूल्ये N=2 फॉर्म्युलेशनसाठीच्या मूळ OD मूल्यांवर आधारित आहेत. अँटीबॉडीजद्वारे ओळखले जाणारे मुख्य एपिटोप्स उजवीकडे दर्शविले आहेत.
चाचणी केलेल्या व्यावसायिक एन्झाइम मिश्रणातील, ज्यात सर्वाधिक वापरल्या जाणाऱ्या व्यावसायिक एन्झाइम्सचा समावेश आहे, सर्वात सामान्य सेल्युलेसेस आणि हेमिसेल्युलेसेसद्वारे या नॉन-सेल्युलोज संरचनांचे विघटन होऊ शकले नाही. त्यामुळे, त्यांच्या जलविघटनासाठी नवीन सहायक एन्झाइम्सची आवश्यकता आहे. आवश्यक नॉन-सेल्युलोज सहायक एन्झाइम्सशिवाय, जरी त्यांचे मूळ शर्करा पॉलिमर व्यावसायिक एन्झाइम मिश्रणांचा वापर करून लहान तुकड्यांमध्ये मोठ्या प्रमाणावर जलविघटित करून विरघळवले गेले असले तरी, हे नॉन-सेल्युलोज बंध मोनोसॅकॅराइड्समध्ये पूर्ण रूपांतरणास प्रतिबंध करतात.
सिग्नल वितरण आणि त्याच्या बंधन शक्तीच्या पुढील अभ्यासात असे दिसून आले की, कमी DP अंशांच्या (D, E, F, डायमर्समधील DP) तुलनेत उच्च DP शर्करा अंशांमध्ये (A, B, C, DP २०+ पर्यंत) बंधनकारक एपिटोप्स कमी होते (आकृती १). नॉन-सेल्युलोज एपिटोप्समध्ये तटस्थ तुकड्यांपेक्षा आम्ल तुकडे अधिक सामान्य आहेत. ही घटना आमच्या मागील अभ्यासात आढळलेल्या पद्धतीशी सुसंगत आहे, जिथे उच्च DP आणि आम्ल घटक एन्झायमॅटिक हायड्रोलिसिसला अधिक प्रतिरोधक होते. म्हणून, नॉन-सेल्युलोज ग्लायकॅन एपिटोप्स आणि U व MeU प्रतिस्थापनांची उपस्थिती ओलिगोसॅकॅराइड्सच्या स्थिरतेमध्ये मोठे योगदान देऊ शकते. हे लक्षात घेतले पाहिजे की कमी DP ओलिगोसॅकॅराइड्ससाठी बंधन आणि शोध कार्यक्षमता समस्याप्रधान असू शकते, विशेषतः जर एपिटोप डायमेरिक किंवा ट्रायमेरिक ओलिगोसॅकॅराइड असेल. हे वेगवेगळ्या लांबीच्या व्यावसायिक ओलिगोसॅकॅराइड्सचा वापर करून तपासले जाऊ शकते, ज्यापैकी प्रत्येकामध्ये फक्त एकच एपिटोप असतो जो एका विशिष्ट mAb शी बांधला जातो.
अशाप्रकारे, संरचना-विशिष्ट प्रतिपिंडांच्या वापरामुळे काही प्रकारचे प्रतिरोधक बंध उघड झाले. वापरलेल्या प्रतिपिंडाचा प्रकार, योग्य लायगेशन पॅटर्न आणि त्यातून निर्माण होणाऱ्या सिग्नलची तीव्रता (सर्वाधिक आणि सर्वात कमी प्रमाणात) यावर अवलंबून, नवीन एन्झाइम्स ओळखले जाऊ शकतात आणि अधिक संपूर्ण ग्लायकोकन्व्हर्जनसाठी एन्झाइम मिश्रणात अर्ध-परिमाणात्मकपणे जोडले जाऊ शकतात. ACSH ओलिगोसॅकॅराइड्सच्या विश्लेषणाचे उदाहरण घेतल्यास, आपण प्रत्येक बायोमास पदार्थासाठी ग्लायकॅन बंधांचा डेटाबेस तयार करू शकतो. येथे हे लक्षात घेतले पाहिजे की प्रतिपिंडांची भिन्न आसक्ती विचारात घेतली पाहिजे, आणि जर त्यांची आसक्ती अज्ञात असेल, तर वेगवेगळ्या प्रतिपिंडांच्या सिग्नलची तुलना करताना काही अडचणी निर्माण होतील. याव्यतिरिक्त, एकाच प्रतिपिंडासाठी नमुन्यांमध्ये ग्लायकॅन बंधांची तुलना सर्वोत्तम काम करू शकते. हे प्रतिरोधक बंध नंतर CAZyme डेटाबेसशी जोडले जाऊ शकतात, ज्यामधून आपण एन्झाइम्स ओळखू शकतो, संभाव्य एन्झाइम्स निवडू शकतो आणि बंध-तोडणाऱ्या एन्झाइम्सची चाचणी करू शकतो, किंवा बायो-रिफायनरीमध्ये वापरासाठी हे एन्झाइम्स व्यक्त करण्यासाठी सूक्ष्मजैविक प्रणाली विकसित करू शकतो.
लिग्नोसेल्युलोसिक हायड्रोलायसेट्समध्ये असलेल्या कमी आण्विक वजनाच्या ओलिगोसॅकराइड्सचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी रोगप्रतिकारक पद्धती पर्यायी पद्धतींना कशा पूरक ठरतात याचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही त्याच पॅनेलवरील (आकृती ५) ओलिगोसॅकराइड भागावर MALDI (आकृती ४, S1-S8) आणि GC-MS वर आधारित TMS-व्युत्पन्न सॅकराइड्सचे विश्लेषण केले. ओलिगोसॅकराइड रेणूंचे वस्तुमान वितरण अपेक्षित संरचनेशी जुळते की नाही याची तुलना करण्यासाठी MALDI चा वापर केला जातो. आकृती ४ मध्ये तटस्थ घटक ACN-A आणि ACN-B यांचे MC दर्शविले आहे. ACN-A विश्लेषणाने DP ४-८ (आकृती ४) ते DP २२ (आकृती S1) पर्यंतच्या पेंटोज शर्करांच्या श्रेणीची पुष्टी केली, ज्यांचे वजन MeU-झायलॅन ओलिगोसॅकराइड्सशी जुळते. ACN-B विश्लेषणाने DP ८-१५ सह पेंटोज आणि ग्लुकोझायलॅन श्रेणीची पुष्टी केली. आकृती S3 सारख्या पूरक सामग्रीमध्ये, FA-C आम्लधर्मी घटकांच्या वस्तुमान वितरण नकाशांमध्ये 8-15 च्या DP सह (Me)U प्रतिस्थापित पेंटोज शर्करांची श्रेणी दिसून येते, जी ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंगमध्ये आढळलेल्या प्रतिस्थापित झायलॅन्सशी सुसंगत आहे. एपिटोप्स सुसंगत आहेत.
ACS मध्ये असलेल्या विद्राव्य नॉन-कॉम्प्लायंट ओलिगोसॅकराइड्सचा MALDI-MS स्पेक्ट्रम. येथे, (A) मिथाइलेटेड युरोनिक ऍसिड (DP 4-8) प्रतिस्थापित ग्लुकुरोझायलॅन ओलिगोसॅकराइड्स असलेले ACN-A कमी वजन श्रेणीतील अंश आणि (B) ग्लुकुरोझायलॅनने (DP 8-15) प्रतिस्थापित केलेले ACN-B झायलॅन आणि मिथाइलेटेड युरोनिक ऍसिड ओलिगोसॅकराइड्स.
दुर्मीळ ओलिगोसॅकॅराइड्सच्या ग्लायकॅन अवशेषांच्या रचनेचे विश्लेषण. येथे (A) GC-MS विश्लेषणाचा वापर करून मिळवलेल्या विविध ओलिगोसॅकॅराइड अंशांची TMS सॅकॅराइड रचना. (B) ओलिगोसॅकॅराइड्समध्ये असलेल्या विविध TMS-व्युत्पन्न शर्करांच्या संरचना. ACN – उदासीन ओलिगोसॅकॅराइड्स असलेला ॲसिटोनायट्राइल अंश आणि FA – आम्लधर्मी ओलिगोसॅकॅराइड्स असलेला फेरुलिक ॲसिड अंश.
ओलिगोसॅकराइड अंशाच्या LC-MS विश्लेषणातून आणखी एक मनोरंजक निष्कर्ष काढण्यात आला, जसे की आकृती S9 मध्ये दाखवले आहे (पद्धती इलेक्ट्रॉनिक पूरक सामग्रीमध्ये पाहता येतील). ACN-B अंशाच्या लायगेशन दरम्यान हेक्सोज आणि -OAc गटांचे तुकडे वारंवार आढळून आले. हा शोध केवळ ग्लायकोम आणि MALDI-TOF विश्लेषणात आढळलेल्या विखंडनाची पुष्टीच करत नाही, तर पूर्व-उपचारित लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमासमधील संभाव्य कार्बोहायड्रेट डेरिव्हेटिव्हबद्दल नवीन माहिती देखील प्रदान करतो.
आम्ही TMS शुगर डेरिव्हटायझेशन वापरून ओलिगोसॅकराइड फ्रॅक्शनच्या शर्करा रचनेचे विश्लेषणही केले. GC-MS वापरून, आम्ही ओलिगोसॅकराइड फ्रॅक्शनमधील न्यूट्रल (नॉन-डेरिव्हेटिव्ह) आणि आम्लधर्मी शर्करा (GluA आणि GalA) यांची रचना निश्चित केली (आकृती ५). ग्लुक्युरोनिक आम्ल आम्लधर्मी घटक C आणि D मध्ये आढळते, तर गॅलॅक्ट्युरोनिक आम्ल आम्लधर्मी घटक A आणि B मध्ये आढळते, आणि हे दोन्ही आम्लधर्मी शर्करांचे उच्च DP घटक आहेत. हे परिणाम केवळ आमच्या ELISA आणि MALDI डेटाची पुष्टी करत नाहीत, तर ओलिगोसॅकराइड संचयनावरील आमच्या पूर्वीच्या अभ्यासांशीही सुसंगत आहेत. म्हणून, आमचा विश्वास आहे की ओलिगोसॅकराइड्सचे बायोटिनिलेशन आणि त्यानंतरची ELISA स्क्रीनिंग वापरणाऱ्या आधुनिक इम्युनोलॉजिकल पद्धती विविध जैविक नमुन्यांमधील विद्राव्य आणि विघटनास प्रतिरोधक ओलिगोसॅकराइड्स शोधण्यासाठी पुरेशा आहेत.
ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग पद्धती अनेक वेगवेगळ्या पद्धतींनी प्रमाणित केल्या गेल्या असल्याने, आम्हाला या नवीन परिमाणात्मक पद्धतीची क्षमता अधिक जाणून घ्यायची होती. दोन व्यावसायिक ओलिगोसॅकराइड्स, झायलोहेक्सासॅकराइड ओलिगोसॅकराइड (XHE) आणि २३-α-एल-अराबिनोफ्युरानोसिल-झायलोट्रायोस (A2XX), खरेदी केले गेले आणि पेशीभित्ती ग्लायकॅनला लक्ष्य करणाऱ्या एका नवीन mAb दृष्टिकोनाचा वापर करून त्यांची चाचणी केली गेली. आकृती ६ मध्ये बायोटिनिलेटेड बंधन सिग्नल आणि ओलिगोसॅकराइड सांद्रतेच्या लॉग सांद्रतेमध्ये एक रेषीय सहसंबंध दिसून येतो, जो संभाव्य लँगमुइर अधिशोषण मॉडेल सुचवतो. mAbs पैकी, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, आणि CCRC-M151 हे XHE शी, तर CCRC-M108, CCRC-M109, आणि LM11 हे A2XX शी १ nm ते १०० नॅनोच्या श्रेणीमध्ये सहसंबंधित होते. प्रयोगादरम्यान अँटीबॉडीजची मर्यादित उपलब्धता असल्यामुळे, प्रत्येक ओलिगोसॅकराइड सांद्रतेसह मर्यादित प्रयोग केले गेले. येथे हे लक्षात घेतले पाहिजे की, काही अँटीबॉडीज सब्सट्रेट म्हणून एकाच ओलिगोसॅकराइडला खूप वेगळ्या प्रकारे प्रतिक्रिया देतात, कारण त्या कदाचित किंचित भिन्न एपिटोप्सना बांधल्या जातात आणि त्यांची बंधन क्षमता खूप भिन्न असू शकते. जेव्हा नवीन एमएबी पद्धत वास्तविक नमुन्यांवर लागू केली जाईल, तेव्हा अचूक एपिटोप ओळखण्याची यंत्रणा आणि त्याचे परिणाम अधिक गुंतागुंतीचे असतील.
विविध ग्लायकॅन-लक्ष्यित एमएबीच्या (mAbs) शोध श्रेणीचे निर्धारण करण्यासाठी दोन व्यावसायिक ओलिगोसॅकराइड्सचा वापर करण्यात आला. येथे, ओलिगोसॅकराइडच्या सांद्रतेच्या लॉग सांद्रतेसोबतचे रेषीय सहसंबंध (A) एमएबीसह XHE साठी आणि (B) एमएबीसह A2XX साठी लँगमुइर अधिशोषण नमुने दर्शवतात. संबंधित एपिटोप्स, चाचणीमध्ये सब्सट्रेट म्हणून वापरलेल्या व्यावसायिक ओलिगोसॅकराइड्सची संरचना दर्शवतात.
ग्लायकॅन-लक्ष्यित मोनोक्लोनल अँटीबॉडीजचा (ग्लायकोमिक विश्लेषण किंवा ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग) वापर, वनस्पतींच्या बायोमासमध्ये असलेल्या बहुतेक प्रमुख पेशीभित्ती ग्लायकॅन्सच्या सखोल वैशिष्ट्यीकरणासाठी एक शक्तिशाली साधन आहे. तथापि, पारंपरिक ग्लायकॅन विश्लेषण केवळ मोठ्या पेशीभित्ती ग्लायकॅन्सचे वैशिष्ट्यीकरण करते, कारण बहुतेक ओलिगोसॅकॅराइड्स ELISA प्लेट्सवर कार्यक्षमतेने स्थिर केले जात नाहीत. या अभ्यासात, AFEX-पूर्व-उपचारित मक्याच्या पेंढ्याचे उच्च घन पदार्थांच्या प्रमाणात एन्झाइमॅटिक पद्धतीने जलविश्लेषण करण्यात आले. जलविश्लेषण केलेल्या द्रावणातील विघटन न होणाऱ्या पेशीभित्ती कर्बोदकांचे घटक निश्चित करण्यासाठी शर्करा विश्लेषणाचा वापर करण्यात आला. तथापि, जलविश्लेषण केलेल्या द्रावणातील लहान ओलिगोसॅकॅराइड्सचे mAb विश्लेषण कमी लेखले जाते आणि ELISA प्लेट्सवर ओलिगोसॅकॅराइड्स प्रभावीपणे स्थिर करण्यासाठी अतिरिक्त साधनांची आवश्यकता आहे.
आम्ही येथे NeutrAvidin™ लेपित प्लेट्सवर ओलिगोसॅकराइड बायोटिनिलेशन आणि त्यानंतर ELISA स्क्रीनिंग यांचे संयोजन करून, mAb स्क्रीनिंगसाठी एक नवीन आणि कार्यक्षम ओलिगोसॅकराइड स्थिरीकरण पद्धत सादर करत आहोत. स्थिरीकृत बायोटिनिलेटेड ओलिगोसॅकराइड्सनी अँटीबॉडीसाठी पुरेशी आसक्ती दर्शविली, ज्यामुळे हट्टी ओलिगोसॅकराइड्सचे जलद आणि कार्यक्षम शोध घेणे शक्य झाले. मास स्पेक्ट्रोमेट्रीवर आधारित या हट्टी ओलिगोसॅकराइड्सच्या रचनेच्या विश्लेषणाने इम्युनोस्क्रीनिंगच्या या नवीन पद्धतीच्या परिणामांची पुष्टी केली. अशाप्रकारे, हे अभ्यास दर्शवतात की ओलिगोसॅकराइड बायोटिनिलेशन आणि ग्लायकॅन-लक्ष्यित मोनोक्लोनल अँटीबॉडीजसह ELISA स्क्रीनिंग यांचे संयोजन ओलिगोसॅकराइड्समधील क्रॉसलिंक्स शोधण्यासाठी वापरले जाऊ शकते आणि ओलिगोसॅकराइड्सच्या संरचनेचे वैशिष्ट्य दर्शविणाऱ्या इतर जैवरासायनिक अभ्यासांमध्ये याचा व्यापकपणे उपयोग केला जाऊ शकतो.
ही बायोटिन-आधारित ग्लायकॅन प्रोफाइलिंग पद्धत, वनस्पती बायोमासमधील विद्राव्य ओलिगोसॅकॅराइड्सच्या प्रतिरोधक कार्बोहायड्रेट बंधांचा अभ्यास करण्यास सक्षम असलेला पहिला अहवाल आहे. यामुळे जैवइंधन उत्पादनाच्या बाबतीत बायोमासचे काही भाग इतके हट्टी का असतात, हे समजण्यास मदत होते. ही पद्धत ग्लायकोम विश्लेषण पद्धतींमधील एक महत्त्वाची उणीव भरून काढते आणि वनस्पती ओलिगोसॅकॅराइड्सच्या पलीकडे जाऊन अधिक व्यापक सब्सट्रेट्सपर्यंत तिचा वापर वाढवते. भविष्यात, आपण बायोटिनिलेशनसाठी रोबोटिक्सचा वापर करू शकतो आणि ELISA वापरून नमुन्यांच्या हाय-थ्रूपुट विश्लेषणासाठी आपण विकसित केलेल्या पद्धतीचा उपयोग करू शकतो.
कोलोरॅडोमधील रे येथील क्रेमर फार्म्समधून २०१० साली पायनियर ३३ए१४ संकरित बियांपासून उगवलेल्या मक्याचा पेंढा (CS) काढण्यात आला. जमीनमालकाच्या परवानगीने, या बायोमासचा वापर संशोधनासाठी केला जाऊ शकतो. नमुने खोलीच्या तापमानात, झिप-लॉक पिशव्यांमध्ये (आर्द्रता ६% पेक्षा कमी) कोरड्या स्थितीत साठवण्यात आले. नमुने खोलीच्या तापमानात, झिप-लॉक पिशव्यांमध्ये (आर्द्रता ६% पेक्षा कमी) कोरड्या स्थितीत साठवण्यात आले. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. नमुने खोलीच्या तापमानाला, झिप असलेल्या पिशव्यांमध्ये, ६% पेक्षा कमी आर्द्रतेमध्ये कोरड्या स्थितीत साठवले गेले.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. नमुने झिपर बॅगमध्ये खोलीच्या तापमानावर आणि ६% पेक्षा कमी आर्द्रतेमध्ये साठवले जातात.हा अभ्यास स्थानिक आणि राष्ट्रीय मार्गदर्शक तत्त्वांचे पालन करून करण्यात आला. NREL प्रोटोकॉलचा वापर करून घटकांचे विश्लेषण करण्यात आले. या घटकांमध्ये ३१.४% ग्लुकॅन, १८.७% झायलॅन, ३.३% अरॅबिनॅन, १.२% गॅलॅक्टॅन, २.२% ॲसिटिल, १४.३% लिग्निन, १.७% प्रथिने आणि १३.४% राख असल्याचे आढळले.
सेलिक® सीटेक२ (१३८ मिग्रॅ प्रथिन/मिली, लॉट व्हीसीएनआय ०००१) हे नोव्होझाइम्स (फ्रँकलिनटन, एनसी, यूएसए) कडून मिळालेले सेल्युलेज, बीटा-ग्लुकोसिडेज आणि सेलिक® एचटेक२ (१५७ मिग्रॅ प्रथिन/मिली, लॉट व्हीएचएन००००१) यांचे एक जटिल मिश्रण आहे. मल्टिफेक्ट पेक्टिनेज® (७२ मिग्रॅ प्रथिन/मिली), जे पेक्टिनचे विघटन करणाऱ्या एन्झाइम्सचे एक जटिल मिश्रण आहे, ते ड्युपॉन्ट इंडस्ट्रियल बायोसायन्सेस (पालो अल्टो, सीए, यूएसए) कडून दान करण्यात आले. एन्झाइम प्रथिनांची सांद्रता, केल्डाहल नायट्रोजन विश्लेषण (एओएसी पद्धत २००१.११, डेअरी वन कोऑपरेटिव्ह इंक., इथाका, एनवाय, यूएसए) वापरून प्रथिनांच्या प्रमाणाचा अंदाज घेऊन (आणि प्रथिनांव्यतिरिक्त नायट्रोजनचे योगदान वजा करून) निश्चित करण्यात आली. डायटोमेशियस अर्थ ५४५ ईएमडी मिलिपोर (बिल्लेरिका, एमए) कडून खरेदी करण्यात आले. सक्रिय कार्बन (डार्को, 100 मेश ग्रॅन्युल्स), अव्हिसेल (पीएच-101), बीच झायलॅन आणि इतर सर्व रसायने सिग्मा-अल्ड्रिच (सेंट लुईस, एमओ) कडून खरेदी करण्यात आली.
AFEX पूर्व-प्रक्रिया GLBRC (बायोमास कन्व्हर्जन रिसर्च लॅबोरेटरी, MSU, लान्सिंग, MI, USA) येथे करण्यात आली. ही पूर्व-प्रक्रिया स्टेनलेस स्टीलच्या बेंचटॉप बॅच रिॲक्टरमध्ये (पार इन्स्ट्रुमेंट्स कंपनी) 140°C तापमानावर 15 मिनिटांसाठी करण्यात आली. निर्जल अमोनिया आणि बायोमास यांचे 1:1 गुणोत्तर आणि 60% (w/w) लोडिंग असताना, यास 30 मिनिटे लागली. रिॲक्टरचे तापमान 140°C पर्यंत आणले गेले आणि अमोनिया वेगाने बाहेर सोडण्यात आला, ज्यामुळे बायोमासला खोलीच्या तापमानावर लवकर परत येण्यास मदत झाली. AFEX पूर्व-प्रक्रिया केलेल्या मक्याच्या पेंढ्याची (ACS) रचना, प्रक्रिया न केलेल्या मक्याच्या पेंढ्यासारखीच (UT-CS) होती.
ओलिगोसॅकॅराइड्सच्या मोठ्या प्रमाणावरील उत्पादनासाठी प्रारंभिक साहित्य म्हणून उच्च घन पदार्थ असलेले २५% (वजन/वजन) ACSH (अंदाजे ८% डेक्स्ट्रॅन लोडिंग) तयार करण्यात आले. ACS चे एन्झायमॅटिक हायड्रोलिसिस एका व्यावसायिक एन्झाइम मिश्रणाचा वापर करून करण्यात आले, ज्यामध्ये सेलिक® Ctec2 (१० मिग्रॅ प्रथिन/ग्रॅम ग्लुकॅन, पूर्व-प्रक्रिया केलेल्या बायोमासमध्ये), Htec2 (नोव्होझाइम्स, फ्रँकलिनटन, NC), ५ मिग्रॅ प्रथिन/ग्रॅम ग्लुकॅन, आणि मल्टीफेक्ट पेक्टिनेज (जेनेनकोर इंक, USA), ५ मिग्रॅ प्रथिन/ग्रॅम डेक्स्ट्रॅन यांचा समावेश होता. एन्झायमॅटिक हायड्रोलिसिस ५-लिटरच्या बायोरिॲक्टरमध्ये ३ लिटर कार्यरत आकारमान, pH ४.८, ५०°C आणि २५० rpm वर करण्यात आले. ९६ तासांच्या हायड्रोलिसिसनंतर, हायड्रोलिसिस न झालेले घन पदार्थ काढून टाकण्यासाठी हायड्रोलायझेटला ३० मिनिटांसाठी ६००० rpm वर आणि नंतर ३० मिनिटांसाठी १४००० rpm वर सेंट्रीफ्युगेशन करून गोळा करण्यात आले. त्यानंतर हायड्रोलायझेटला ०.२२ मिमी फिल्टर बीकरमधून निर्जंतुक गाळणी करण्यात आली. गाळलेले हायड्रोलायझेट निर्जंतुक बाटल्यांमध्ये ४° से. तापमानावर साठवण्यात आले आणि नंतर कार्बनवर त्याचे अंशांकन करण्यात आले.
NREL प्रयोगशाळा विश्लेषण प्रक्रियांनुसार अर्क-आधारित बायोमास नमुन्यांच्या रचनेचे विश्लेषण: रचना विश्लेषणासाठी नमुने तयार करणे (NREL/TP-510-42620) आणि बायोमासमध्ये संरचनात्मक कार्बोहायड्रेट्स आणि लिग्निनचे निर्धारण (NREL/TP-510 – 42618)47.
ऑटोक्लेव्ह-आधारित आम्ल जलीय अपघटन पद्धतीचा वापर करून, जलीय अपघटित प्रवाहाचे ओलिगोसॅकराइड विश्लेषण २ मिली प्रमाणावर करण्यात आले. जलीय अपघटित नमुना १० मिलीच्या स्क्रू-कॅप कल्चर ट्यूबमध्ये ६९.७ मायक्रोलिटर ७२% सल्फ्यूरिक आम्लासोबत मिसळा आणि बेंचटॉपवर १२१°C तापमानावर १ तास उबवा, बर्फावर थंड करा आणि हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (HPLC) व्हायलमध्ये गाळा. आम्लाने जलीय अपघटित केलेल्या नमुन्यातील एकूण साखरेच्या सांद्रतेमधून जलीय अपघटित न झालेल्या नमुन्यातील मोनोसॅकराइड्सची सांद्रता वजा करून ओलिगोसॅकराइड्सची सांद्रता निश्चित करण्यात आली.
बायो-रॅड अमिनेक्स HPX-87H कॉलमवर, ऑटोसेम्पलर, कॉलम हीटर, आयसोक्रॅटिक पंप आणि रिफ्रॅक्टिव्ह इंडेक्स डिटेक्टरने सुसज्ज असलेल्या शिमाद्झू HPLC प्रणालीचा वापर करून आम्ल-जलविश्लेषण केलेल्या बायोमासमधील ग्लुकोज, झायलोज आणि अरॅबिनोजच्या सांद्रतेचे विश्लेषण करण्यात आले. कॉलमचे तापमान 50°C वर ठेवण्यात आले होते आणि पाण्यात 5 mM H2SO4 च्या 0.6 मिली/मिनिट प्रवाहाने त्याचे प्रक्षालन करण्यात आले.
हायड्रोलायझेट सुपरनॅटंट विरल करून त्यातील मोनोमर आणि ओलिगोसॅकराइड घटकांचे विश्लेषण करण्यात आले. एन्झायमॅटिक हायड्रोलिसिसनंतर मिळालेल्या मोनोमेरिक शर्करांचे विश्लेषण बायो-रॅड (हर्क्युलस, सीए) अमिनेक्स HPX-87P कॉलम आणि ॲश गार्ड कॉलम असलेल्या HPLC द्वारे करण्यात आले. कॉलमचे तापमान ८०°C वर ठेवण्यात आले होते आणि मोबाइल फेज म्हणून पाण्याचा वापर ०.६ मिली/मिनिटच्या प्रवाह दराने करण्यात आला. संदर्भ ४१, ४८, ४९ मध्ये वर्णन केलेल्या पद्धतींनुसार, १२१°C तापमानावर सौम्य आम्लामध्ये हायड्रोलिसिस करून ओलिगोसॅकराइड्स निश्चित करण्यात आले.
पूर्वी वर्णन केलेल्या कार्यपद्धती २७, ४३, ५०, ५१ वापरून कच्च्या, AFEX पूर्व-उपचारित आणि सर्व नॉन-हायड्रोलाइज्ड बायोमास अवशेषांवर (ज्यात सेल वॉल अर्कांचे उत्पादन आणि त्यांचे mAb स्क्रीनिंग समाविष्ट आहे) सॅकराइड विश्लेषण केले गेले. ग्लायकोम विश्लेषणासाठी, वनस्पती सेल वॉल सामग्रीचे अल्कोहोल-अविद्राव्य अवशेष बायोमास अवशेषांपासून तयार केले जातात आणि पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे ५२,५३, अमोनियम ऑक्झॅलेट (५० mM), सोडियम कार्बोनेट (५० mM आणि ०.५% w/v), CON. (१M आणि ४M, दोन्ही १% w/v सोडियम बोरोहायड्राइडसह) आणि ॲसिड क्लोराइट यांसारख्या वाढत्या तीव्रतेच्या अभिकर्मकांसह त्यांचे अनुक्रमिक निष्कर्षण केले जाते. त्यानंतर हे अर्क सेल वॉल ग्लायकॅनला लक्ष्य करणाऱ्या mAb50s च्या जटिल पॅनेलविरुद्ध ELISA साठी वापरले गेले आणि mAb बंधन प्रतिक्रिया हीट मॅप म्हणून सादर केल्या गेल्या. वनस्पती सेल वॉल ग्लायकॅनला लक्ष्य करणारे mAbs प्रयोगशाळेच्या साठ्यातून (CCRC, JIM आणि MAC मालिका) खरेदी केले गेले.
ओलिगोसॅकॅराइड्सचे एक-चरण बायोटिनिलेशन. कार्बोहायड्रेट्सचे बायोटिन-एलसी-हायड्राझाइडसोबतचे संयुग्मन खालील प्रक्रियेचा वापर करून करण्यात आले. बायोटिन-एलसी-हायड्राझाइड (४.६ मिग्रॅ/१२ मायक्रोमोल) डायमिथाइल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ, ७० मायक्रोलिटर) मध्ये जोरदार ढवळून आणि ६५° से. तापमानावर १ मिनिट गरम करून विरघळवण्यात आले. ग्लेशियल ऍसिटिक ऍसिड (३० मायक्रोलिटर) टाकण्यात आले आणि हे मिश्रण सोडियम सायनोबोरहायड्राइड (६.४ मिग्रॅ/१०० मायक्रोमोल) वर ओतण्यात आले व ६५° से. तापमानावर सुमारे १ मिनिट गरम करून पूर्णपणे विरघळवण्यात आले. त्यानंतर, रिड्यूसिंग एंडच्या तुलनेत लेबलचा १०-पट किंवा त्याहून अधिक मोलर अतिरिक्त साठा मिळवण्यासाठी, अभिक्रिया मिश्रणाचे ५ ते ८ मायक्रोलिटर वाळलेल्या ओलिगोसॅकॅराइडमध्ये (१-१०० नॅनोमोल) टाकण्यात आले. ही अभिक्रिया ६५° से. तापमानावर २ तास चालवण्यात आली, ज्यानंतर नमुने त्वरित शुद्ध करण्यात आले. रिडक्शनशिवाय केलेल्या लेबलिंग प्रयोगांमध्ये सोडियम सायनोबोरहायड्राइडचा वापर केला गेला नाही आणि नमुन्यांवर 65° से. तापमानावर 2.5 तास अभिक्रिया करण्यात आली.
बायोटिनिलेटेड ओलिगोसॅकराइड्सच्या नमुन्यांचे ELISA कोटिंग आणि धुणे. 25 μl बायोटिनिलेटेड नमुने (प्रत्येक संहत नमुन्याचे 100 μl, 5 ml 0.1 M ट्रिस बफर द्रावणात (TBS) विरघळवून) अ‍ॅव्हिडिन-कोटेड प्लेटच्या प्रत्येक वेलमध्ये टाकण्यात आले. कंट्रोल वेल्सना 0.1 M TBS मध्ये 10 μg/ml सांद्रतेच्या बायोटिनच्या 50 μl ने कोट करण्यात आले. ब्लँक मापनांसाठी कोटिंग म्हणून डीआयनाइज्ड पाण्याचा वापर करण्यात आला. टॅब्लेटला खोलीच्या तापमानावर अंधारात 2 तास इनक्युबेट करण्यात आले. ग्रेनियर फ्लॅट 3A साठी प्रोग्राम क्र. 11 वापरून 0.1 M TBS मधील 0.1% स्किम्ड मिल्कने प्लेट 3 वेळा धुवा.
प्राथमिक अँटीबॉडीज टाकणे आणि धुणे. प्रत्येक वेलमध्ये ४० µl प्राथमिक अँटीबॉडी टाका. मायक्रोप्लेटला खोलीच्या तापमानावर अंधारात १ तास इनक्युबेट करा. त्यानंतर, ग्रेनियर फ्लॅट ३ए साठी वॉश प्रोग्राम #११ वापरून, प्लेट्स ०.१M TBS मधील ०.१% दुधाने ३ वेळा धुतल्या गेल्या.
सेकंडरी अँटीबॉडी टाका आणि धुवा. प्रत्येक वेलमध्ये ५० µl माऊस/रॅट सेकंडरी अँटीबॉडी (०.१ M TBS मधील ०.१% दुधात १:५००० प्रमाणात विरल केलेली) टाका. मायक्रोप्लेटला खोलीच्या तापमानावर अंधारात १ तास इनक्युबेट करा. त्यानंतर, ग्रेनियर फ्लॅट ५ए प्लेट वॉश प्रोग्राम #१२ वापरून मायक्रोप्लेट्स ०.१ M TBS मधील ०.१% दुधाने ५ वेळा धुतल्या गेल्या.
सबस्ट्रेट घालणे. मूळ सबस्ट्रेटमध्ये (१५ मिली निर्आयनित पाण्यात बफरचे २ थेंब, TMB चे ३ थेंब आणि हायड्रोजन पेरॉक्साइडचे २ थेंब घालून) ५० µl ३,३′,५,५′-टेट्रामेथिलबेंझिडिन (TMB) घाला. TMB सबस्ट्रेट तयार करा आणि वापरण्यापूर्वी व्हॉर्टेक्स करा. मायक्रोप्लेटला खोलीच्या तापमानावर ३० मिनिटांसाठी अंधारात इनक्युबेट करा.
पायरी पूर्ण करा आणि टॅब्लेट वाचा. प्रत्येक वेलमध्ये 50 µl 1 N सल्फ्यूरिक ऍसिड टाका आणि ELISA रीडर वापरून 450 ते 655 nm पर्यंतचे ऍबसॉर्बन्स नोंदवा.
आयनीकृत पाण्यात या विश्लेषकांची १ मिग्रॅ/मिलि द्रावणे तयार करा: अरॅबिनोज, रॅम्नोज, फ्युकोज, झायलोज, गॅलॅक्ट्युरोनिक ॲसिड (GalA), ग्लुक्युरोनिक ॲसिड (GlcA), मॅनोज, ग्लुकोज, गॅलॅक्टोज, लॅक्टोज, एन-ॲसिटिलमॅनोसॅमिन (manNAc), एन-ॲसिटिलग्लुकोसॅमिन (glcNAc), एन-ॲसिटिलगॅलॅक्टोसॅमिन (galNAc), इनोसिटॉल (अंतर्गत मानक). तक्ता १ मध्ये दर्शविलेली १ मिग्रॅ/मिलि साखरेची द्रावणे घालून दोन मानके तयार करण्यात आली. नमुने गोठवले जातात आणि -८०° से. तापमानावर सर्व पाणी निघून जाईपर्यंत (साधारणपणे १२-१८ तास) लायोफिलाइझ केले जातात.
विश्लेषणात्मक तराजूवरील स्क्रू कॅप ट्यूबमध्ये १००-५०० µg नमुना टाका. टाकलेल्या प्रमाणाची नोंद करा. नमुना एका विशिष्ट सांद्रतेच्या द्रावकात विरघळवून तो ट्यूबमध्ये द्रव स्वरूपात टाकणे सर्वोत्तम आहे. प्रत्येक नमुना ट्यूबसाठी अंतर्गत मानक म्हणून १ mg/ml इनोसिटॉलचे २० µl वापरा. ​​नमुन्यामध्ये टाकलेल्या अंतर्गत मानकाचे प्रमाण, मानक ट्यूबमध्ये टाकलेल्या अंतर्गत मानकाच्या प्रमाणाएवढेच असले पाहिजे.
स्क्रू कॅप असलेल्या कुपीमध्ये ८ मिली निर्जल मिथेनॉल घाला. त्यानंतर ४ मिली ३ एन मिथेनॉलिक एचसीएल द्रावण घालून, कुपीला झाकण लावून हलवा. या प्रक्रियेत पाण्याचा वापर केला जात नाही.
ओलिगोसॅकराइड नमुन्यांमध्ये आणि मानक TMS ट्यूबमध्ये 500 µl 1 M HCl मिथेनॉल द्रावण घाला. नमुने थर्मल ब्लॉकमध्ये 80° से. तापमानावर रात्रभर (168 तास) उबवले गेले. ड्रायिंग मॅनिफोल्ड वापरून मिथेनॉलिसिस उत्पादन खोलीच्या तापमानावर सुकवा. 200 µl मिथेनॉल घाला आणि पुन्हा सुकवा. ही प्रक्रिया दोनदा पुनरावृत्त केली जाते. नमुन्यामध्ये 200 µl मिथेनॉल, 100 µl पायरीडीन आणि 100 µl ऍसिटिक ॲनहायड्राइड घाला आणि चांगले मिसळा. नमुने खोलीच्या तापमानावर 30 मिनिटांसाठी उबवले गेले आणि सुकवले गेले. 200 µl मिथेनॉल घाला आणि पुन्हा सुकवा.
२०० µl ट्राय-सिल घालून झाकण लावलेली नळी ८०°C तापमानावर २० मिनिटे तापवा, त्यानंतर खोलीच्या तापमानापर्यंत थंड करा. नमुना आणखी सुकवून त्याचे आकारमान अंदाजे ५० µl पर्यंत आणण्यासाठी ड्रायिंग मॅनिफोल्डचा वापर करा. हे लक्षात घेणे महत्त्वाचे आहे की आम्ही नमुने पूर्णपणे सुकू दिले नाहीत.
२ मिली हेक्झेन घालून व्हॉर्टेक्सिंगद्वारे चांगले मिसळा. ५-३/४ इंच व्यासाच्या पिपेटवर ग्लास वूलचा तुकडा ठेवून पाश्चर पिपेटची (५-८ मिमी) टोके भरा. नमुने ३००० g वर २ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले. कोणताही अविद्राव्य अवशेष अवक्षेपित होतो. नमुना १००-१५० µl पर्यंत कोरडा करा. अंदाजे १ μl आकारमान ८० °C च्या प्रारंभिक तापमानावर आणि २.० मिनिटांच्या प्रारंभिक वेळेवर GC-MS मध्ये इंजेक्ट केले गेले (तक्ता २).