Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये मर्यादित CSS सपोर्ट आहे.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही साइटला शैली आणि JavaScript शिवाय रेंडर करू.
कॉर्न स्टोव्हरमधील पर्सिस्टंट ऑलिगोसॅकराइड्सच्या जटिल विश्लेषणासाठी नवीन इम्यूनोलॉजिकल आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक पद्धती AFEX सह प्रीट्रीटेड.लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास हा जीवाश्म इंधनासाठी एक टिकाऊ पर्याय आहे आणि अन्न, खाद्य, इंधन आणि रसायने यासारख्या उत्पादनांच्या निर्मितीसाठी जैव तंत्रज्ञान विकसित करण्यासाठी मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाते.या तंत्रज्ञानाची गुरुकिल्ली म्हणजे वनस्पतींच्या पेशींच्या भिंतींमध्ये असलेल्या जटिल कार्बोहायड्रेट्सचे ग्लुकोज, झायलोज आणि अॅराबिनोज सारख्या साध्या शर्करामध्ये रूपांतरित करण्यासाठी खर्च-स्पर्धात्मक प्रक्रिया विकसित करणे.लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास खूप हट्टी असल्यामुळे, त्याला थर्मोकेमिकल उपचार (उदा., अमोनिया फायबर एक्सफोलिएशन (AFEX), सौम्य ऍसिडस् (DA), आयनिक द्रवपदार्थ (IL)) आणि जैविक उपचार (उदा. एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिस आणि मायक्रोबियल किण्वन) च्या अधीन असणे आवश्यक आहे..तथापि, जेव्हा हायड्रोलिसिस प्रक्रियेत व्यावसायिक बुरशीजन्य एन्झाईम्सचा वापर केला जातो, तेव्हा तयार झालेल्या विरघळणार्‍या शर्करापैकी केवळ 75-85% मोनोसॅकेराइड्स असतात आणि उर्वरित 15-25% विद्रव्य, असह्य ऑलिगोसॅकराइड असतात, जे सूक्ष्मजीवांना नेहमीच उपलब्ध नसतात.यापूर्वी, आम्ही कार्बन आणि डायटोमॅशिअस पृथ्वीचे पृथक्करण आणि आकार बहिष्कार क्रोमॅटोग्राफीच्या संयोजनाचा वापर करून विरघळणारे हट्टी ऑलिगोसॅकराइड यशस्वीरित्या वेगळे आणि शुद्ध केले आहेत आणि त्यांच्या एन्झाईम प्रतिबंधक गुणधर्मांची तपासणी देखील केली आहे.आम्‍हाला आढळले आहे की पॉलिमरायझेशन (डीपी) मेथिलेटेड युरोनिक अॅसिड प्रतिस्‍थापन असलेले ऑलिगोसॅकराइड कमी डीपी आणि न्यूट्रल ऑलिगोसॅकराइड्सपेक्षा व्यावसायिक एन्झाइम मिश्रणासह प्रक्रिया करणे अधिक कठीण आहे.येथे आम्ही अनेक अतिरिक्त पद्धतींचा वापर केल्याचा अहवाल देतो, ज्यामध्ये वनस्पतींच्या पेशींच्या भिंती आणि एन्झाईमॅटिक हायड्रोलायसेट्स, मॅट्रिक्स-सहाय्यित लेसर डिसॉर्प्शन आयनीकरण, वेळ-ऑफ-फ्लाइट मास-स्पेक्ट्रोमेट्री यामधील ग्लायकन बॉन्ड्सचे वैशिष्ट्य करण्यासाठी वनस्पती बायोमास ग्लाइकन्ससाठी विशिष्ट मोनोक्लोनल ऍन्टीबॉडीज (mAbs) वापरून ग्लाइकन प्रोफाइलिंगचा समावेश आहे..MALDI-TOF-MS) नकारात्मक आयन, गॅस क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) च्या दुय्यम क्षय नंतर स्पेक्ट्रोस्कोपीद्वारे प्राप्त केलेल्या संरचना-माहितीपूर्ण निदान शिखरांचा वापर करते.oligosaccharides (DP 4-20) लहान आकारामुळे, हे रेणू mAb बंधनकारक आणि वैशिष्ट्यीकरणासाठी वापरणे कठीण आहे.या समस्येवर मात करण्यासाठी, आम्ही एक नवीन बायोटिन संयुग्मन-आधारित ऑलिगोसॅकराइड इमोबिलायझेशन पद्धत लागू केली ज्याने मायक्रोप्लेट पृष्ठभागावर बहुसंख्य कमी DP विरघळणारे ऑलिगोसॅकराइड यशस्वीरित्या लेबल केले, जे नंतर विशिष्ट बंधन विश्लेषणासाठी उच्च थ्रूपुट mAb प्रणालीमध्ये वापरले गेले.ही नवीन पद्धत भविष्यात अधिक प्रगत उच्च थ्रुपुट ग्लायकोम ऍसेसच्या विकासास सुलभ करेल ज्याचा उपयोग बायोमार्करमध्ये उपस्थित असलेल्या ऑलिगोसॅकराइड्सचे निदान करण्याच्या उद्देशाने वेगळे करण्यासाठी आणि वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी केला जाऊ शकतो.
लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास, कृषी, वनीकरण, गवत आणि वृक्षाच्छादित साहित्याचा बनलेला, उच्च मूल्याची उत्पादने तयार करण्यासाठी अन्न, खाद्य, इंधन आणि रासायनिक पूर्वसूचकांसह जैव-आधारित उत्पादनांच्या उत्पादनासाठी संभाव्य फीडस्टॉक आहे1.वनस्पतींच्या पेशींच्या भिंतींमध्ये असलेले कार्बोहायड्रेट्स (जसे की सेल्युलोज आणि हेमिसेल्युलोज) रासायनिक प्रक्रिया आणि बायोट्रान्सफॉर्मेशन (जसे की एन्झाइमॅटिक हायड्रोलिसिस आणि मायक्रोबियल किण्वन) द्वारे मोनोसॅकेराइड्समध्ये डिपॉलिमराइज केले जातात.सामान्य पूर्व-उपचारांमध्ये अमोनिया फायबर विस्तार (AFEX), सौम्य ऍसिड (DA), आयनिक द्रव (IL) आणि वाफेचा स्फोट (SE) यांचा समावेश होतो, जे वनस्पतींच्या पेशींच्या भिंती उघडून लिग्नोसेल्युलोज उत्पादन कमी करण्यासाठी रसायने आणि उष्णता यांचे मिश्रण वापरतात.पदार्थाचा हट्टीपणा, 5. जैव-आधारित इंधन आणि रसायने तयार करण्यासाठी ट्रान्सजेनिक यीस्ट किंवा बॅक्टेरिया वापरून व्यावसायिक सक्रिय कार्बोहायड्रेट-युक्त एंझाइम्स (CAZymes) आणि सूक्ष्मजीव किण्वन वापरून उच्च घन पदार्थांच्या भारावर एन्झाइमॅटिक हायड्रोलिसिस केले जाते 6.
व्यावसायिक एंझाइममधील CAZymes हे एन्झाइमच्या जटिल मिश्रणाने बनलेले असतात जे एकत्रितपणे जटिल कार्बोहायड्रेट-साखर बंधांना मोनोसॅकराइड्स 2,7 बनवतात.आम्ही आधी नोंदवल्याप्रमाणे, कार्बोहायड्रेट्ससह लिग्निनच्या सुगंधी पॉलिमरचे जटिल नेटवर्क त्यांना अत्यंत गुंतागुंतीचे बनवते, ज्यामुळे साखरेचे अपूर्ण रूपांतरण होते, 15-25% सेक्स ऑलिगोसॅकराइड्स जमा होतात जे प्रीट्रीटेड बायोमासच्या एन्झाइमॅटिक हायड्रोलिसिस दरम्यान तयार होत नाहीत.विविध बायोमास प्रीट्रीटमेंट पद्धतींमध्ये ही एक सामान्य समस्या आहे.या अडथळ्याच्या काही कारणांमध्ये हायड्रोलिसिस दरम्यान एन्झाइमचा प्रतिबंध किंवा वनस्पती बायोमासमध्ये साखरेचे बंधन तोडण्यासाठी आवश्यक असलेल्या अत्यावश्यक एंजाइमची अनुपस्थिती किंवा कमी पातळी यांचा समावेश होतो.साखरेची रचना आणि संरचनात्मक वैशिष्ट्ये समजून घेणे, जसे की oligosaccharides मधील साखर बंध, आम्हाला हायड्रोलिसिस दरम्यान साखरेचे रूपांतरण सुधारण्यास मदत करेल, ज्यामुळे जैवतंत्रज्ञान प्रक्रिया पेट्रोलियम-व्युत्पन्न उत्पादनांशी स्पर्धात्मक बनतील.
कार्बोहायड्रेट्सची रचना निश्चित करणे आव्हानात्मक आहे आणि त्यासाठी द्रव क्रोमॅटोग्राफी (LC)11,12, न्यूक्लियर मॅग्नेटिक रेझोनान्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (NMR)13, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसीस (CE) 14,15,16 आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS)17 सारख्या पद्धतींचे संयोजन आवश्यक आहे., अठरा.मॅट्रिक्स (MALDI-TOF-MS) वापरून लेसर डिसॉर्प्शनसह टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री आणि आयनीकरण यासारख्या एमएस पद्धती कार्बोहायड्रेट संरचना ओळखण्यासाठी एक बहुमुखी पद्धत आहे.अलीकडे, सोडियम आयन अॅडक्ट्सचे कोलिजन-इंड्यूस्ड डिसोसिएशन (सीआयडी) टँडम एमएस ऑलिगोसॅकराइड संलग्नक पोझिशन्स, एनोमेरिक कॉन्फिगरेशन्स, सीक्वेन्स आणि ब्रँचिंग पोझिशन्स 20, 21 यांच्याशी संबंधित फिंगरप्रिंट ओळखण्यासाठी मोठ्या प्रमाणावर वापरले गेले आहे.
कार्बोहायड्रेट बंधांची सखोल ओळख करण्यासाठी ग्लायकन विश्लेषण हे एक उत्कृष्ट साधन आहे.ही पद्धत जटिल कार्बोहायड्रेट लिंकेजेस समजून घेण्यासाठी प्रोब म्हणून सेल वॉल ग्लाइकन रोपण करण्यासाठी निर्देशित मोनोक्लोनल अँटीबॉडीज (mAbs) वापरते.250 पेक्षा जास्त mAbs जगभरात उपलब्ध आहेत, विविध सॅकराइड्स 24 वापरून विविध रेखीय आणि ब्रँच केलेल्या ऑलिगोसॅकराइड्सच्या विरूद्ध डिझाइन केलेले आहेत.वनस्पती पेशींच्या भिंतीची रचना, रचना आणि बदल दर्शवण्यासाठी अनेक mAbs मोठ्या प्रमाणावर वापरले गेले आहेत, कारण वनस्पती पेशी प्रकार, अवयव, वय, विकासाची अवस्था आणि वाढीचे वातावरण 25,26 यावर अवलंबून लक्षणीय फरक आहेत.अगदी अलीकडे, या पद्धतीचा उपयोग वनस्पती आणि प्राणी प्रणालींमधील वेसिकल लोकसंख्या आणि ग्लायकन वाहतुकीमधील त्यांच्या संबंधित भूमिका समजून घेण्यासाठी आणि सबसेल्युलर मार्कर, विकासाच्या टप्प्या किंवा पर्यावरणीय उत्तेजनांद्वारे निर्धारित करण्यासाठी आणि एन्झाइमॅटिक क्रियाकलाप निर्धारित करण्यासाठी वापरला जातो.ओळखल्या गेलेल्या ग्लाइकन्स आणि झायलान्सच्या काही भिन्न रचनांमध्ये पेक्टिन (पी), xylan (X), मन्नान (M), xyloglucans (XylG), मिश्र बाँड ग्लुकान्स (MLG), arabinoxylan (ArbX), गॅलेक्टोमनन (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (Arabinoxylan) (GArabinooxylan) आणि glucuronic acid-Arabinoxylan (Arabinooxylan)
तथापि, या सर्व संशोधनाच्या प्रयत्नांना न जुमानता, केवळ काही अभ्यासांनी हाय सॉलिड्स लोड (HSL) हायड्रोलिसिस दरम्यान ऑलिगोसॅकराइड जमा होण्याच्या स्वरूपावर लक्ष केंद्रित केले आहे, ज्यामध्ये ऑलिगोसॅकराइड सोडणे, हायड्रोलिसिस दरम्यान ऑलिगोमेरिक साखळी लांबीचे बदल, विविध कमी DP पॉलिमर आणि त्यांचे वक्र यांचा समावेश आहे.वितरण 30,31,32.दरम्यान, ग्लायकन विश्लेषण हे ग्लायकन संरचनेच्या सर्वसमावेशक विश्लेषणासाठी उपयुक्त साधन असल्याचे सिद्ध झाले असले तरी, प्रतिपिंड पद्धती वापरून पाण्यात विरघळणारे कमी डीपी ऑलिगोसॅकराइड्सचे मूल्यांकन करणे कठीण आहे.5-10 kDa पेक्षा कमी आण्विक वजन असलेले छोटे DP oligosaccharides 33, 34 ELISA प्लेट्सशी बांधले जात नाहीत आणि प्रतिपिंड जोडण्यापूर्वी धुऊन जातात.
येथे, प्रथमच, आम्ही मोनोक्लोनल अँटीबॉडीज वापरून एव्हिडिन-लेपित प्लेट्सवर एलिसा परख प्रदर्शित करतो, ग्लायकोम विश्लेषणासह विरघळणारे रेफ्रेक्ट्री ऑलिगोसॅकराइड्ससाठी एक-चरण बायोटिनाइलेशन प्रक्रिया एकत्र करून.ग्लायकोम विश्लेषणाचा आमचा दृष्टीकोन MALDI-TOF-MS आणि GC-MS द्वारे ट्रायमेथिलसिलिल (TMS) हायड्रोलायझ्ड साखर रचनांचे व्युत्पन्न वापरून पूरक ऑलिगोसाकराइड लिंकेजच्या विश्लेषणाद्वारे प्रमाणित केले गेले.हा अभिनव दृष्टीकोन भविष्यात उच्च-थ्रूपुट पद्धत म्हणून विकसित केला जाऊ शकतो आणि बायोमेडिकल संशोधनात व्यापक उपयोग शोधू शकतो35.
एन्झाईम्स आणि अँटीबॉडीजचे भाषांतरानंतरचे बदल, जसे की ग्लायकोसिलेशन, 36 त्यांच्या जैविक क्रियाकलापांवर परिणाम करतात.उदाहरणार्थ, सीरम प्रोटीनच्या ग्लायकोसिलेशनमधील बदल दाहक संधिवात मध्ये महत्वाची भूमिका बजावतात आणि ग्लायकोसिलेशनमधील बदल निदान चिन्हक म्हणून वापरले जातात37.गॅस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रॅक्ट आणि यकृत, व्हायरल इन्फेक्शन्स, डिम्बग्रंथि, स्तन आणि प्रोस्टेट कर्करोग 38,39,40 यासह विविध रोगांमध्ये विविध ग्लाइकन्स सहजपणे दिसून येतात.अँटीबॉडी-आधारित ग्लाइकन ELISA पद्धती वापरून ग्लायकॅन्सची रचना समजून घेतल्याने जटिल MS पद्धतींचा वापर न करता रोग निदानामध्ये अतिरिक्त आत्मविश्वास मिळेल.
आमच्या मागील अभ्यासात असे दिसून आले आहे की हट्टी ऑलिगोसॅकराइड्स प्रीट्रीटमेंट आणि एन्झाईमॅटिक हायड्रोलिसिस (आकृती 1) नंतर हायड्रोलायझ्ड राहिले.आमच्या पूर्वी प्रकाशित केलेल्या कामात, आम्ही AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टोव्हर हायड्रोलायझेट (ACSH)8 पासून ऑलिगोसॅकराइड्स वेगळे करण्यासाठी सक्रिय चारकोल सॉलिड-फेज एक्स्ट्रॅक्शन पद्धत विकसित केली आहे.प्रारंभिक निष्कर्षण आणि पृथक्करणानंतर, ऑलिगोसॅकराइड्सचे आकार अपवर्जन क्रोमॅटोग्राफी (SEC) द्वारे विभक्त केले गेले आणि आण्विक वजनाच्या क्रमाने गोळा केले गेले.विविध प्रीट्रीटमेंट्समधून सोडलेल्या शुगर मोनोमर्स आणि ऑलिगोमर्सचे साखर रचना विश्लेषणाद्वारे विश्लेषण केले गेले.विविध प्रीट्रीटमेंट पद्धतींद्वारे मिळवलेल्या साखर ऑलिगोमर्सच्या सामग्रीची तुलना करताना, जिद्दी ऑलिगोसॅकराइड्सची उपस्थिती ही बायोमासचे मोनोसॅकराइड्समध्ये रूपांतर करण्यात एक सामान्य समस्या आहे आणि यामुळे साखरेचे उत्पन्न कमीतकमी 10-15% आणि अगदी 18% पर्यंत कमी होऊ शकते.यूएस.ऑलिगोसॅकराइड अपूर्णांकांच्या पुढील मोठ्या प्रमाणात उत्पादनासाठी ही पद्धत वापरली जाते.या कामात oligosaccharides च्या वैशिष्ट्यांसाठी प्रायोगिक सामग्री म्हणून परिणामी ACH आणि त्याचे विविध आण्विक वजन असलेले अपूर्णांक वापरले गेले.
प्रीट्रीटमेंट आणि एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिसनंतर, सतत ऑलिगोसॅकराइड्स हायड्रोलायझ्ड राहिले.येथे (A) एक ऑलिगोसॅकराइड पृथक्करण पद्धत आहे ज्यामध्ये सक्रिय कार्बन आणि डायटोमेशियस पृथ्वीच्या पॅक बेडचा वापर करून AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टोव्हर हायड्रोलायझेट (ACSH) पासून oligosaccharides वेगळे केले जातात;(ब) ऑलिगोसॅकराइड वेगळे करण्याची पद्धत.oligosaccharides पुढे आकार बहिष्कार क्रोमॅटोग्राफी (SEC) द्वारे वेगळे केले गेले;(C) सॅकराइड मोनोमर्स आणि ऑलिगोमर्स विविध प्रीट्रीटमेंट्समधून सोडले जातात (पातळ केलेले ऍसिड: DA, आयनिक द्रव: IL आणि AFEX).एन्झाईमॅटिक हायड्रोलिसिस स्थिती: 25% (w/w) उच्च घन लोडिंग (अंदाजे 8% ग्लुकन लोडिंग), 96 तास हायड्रोलिसिस, 20 mg/g व्यावसायिक एंझाइम लोडिंग (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 गुणोत्तर) आणि (डी) साखर आणि मोनोसेरोसॉमरोसेएएफ, मोनोसेल्यूमरोसेएएफ मधून सोडले गेले. EX प्री-ट्रीटेड कॉर्न स्टोव्हर (ACS).
ग्लायकॅन विश्लेषण हे घन बायोमास अवशेषांपासून विलग केलेल्या अर्कांमधील ग्लायकन्सच्या सर्वसमावेशक संरचनात्मक विश्लेषणासाठी उपयुक्त साधन असल्याचे सिद्ध झाले आहे.तथापि, या पारंपारिक पद्धतीचा वापर करून पाण्यात विरघळणारे सॅकराइड्स कमी प्रमाणात दाखवले जातात41 कारण कमी आण्विक वजन असलेल्या ऑलिगोसॅकराइड्सला एलिसा प्लेट्सवर स्थिर करणे कठीण असते आणि प्रतिपिंड जोडण्यापूर्वी ते धुऊन जातात.म्हणून, प्रतिपिंड बंधनकारक आणि वैशिष्ट्यीकरणासाठी, एव्हिडिन-लेपित ELISA प्लेट्सवर विरघळणारे, गैर-अनुपालक ऑलिगोसॅकराइड्स कोट करण्यासाठी एक-चरण बायोटिनाइलेशन पद्धत वापरली गेली.या पद्धतीची चाचणी आमच्या पूर्वी उत्पादित ACSH आणि त्याच्या आण्विक वजनावर आधारित अंश (किंवा पॉलिमरायझेशनची डिग्री, DP) वापरून केली गेली.कार्बोहायड्रेट (चित्र 2) च्या रिड्युसिंग एंडमध्ये बायोटिन-एलसी-हायड्राझाइड जोडून ऑलिगोसॅकराइड बंधनकारक आत्मीयता वाढवण्यासाठी वन-स्टेप बायोटिनिलेशनचा वापर केला गेला.सोल्युशनमध्ये, रिड्युसिंग एंडवर हेमियासेटल ग्रुप बायोटिन-एलसी-हायड्रॅझाइडच्या हायड्रॅझाइड ग्रुपशी प्रतिक्रिया देऊन हायड्रॉझोन बॉण्ड तयार करतो.रिड्यूसिंग एजंट NaCNBH3 च्या उपस्थितीत, हायड्रॉझोन बाँड स्थिर बायोटिनिलेटेड एंड प्रॉडक्टमध्ये कमी केला जातो.शुगर रिड्युसिंग एंडच्या बदलामुळे, एलिसा प्लेट्सवर लो डीपी ऑलिगोसॅकराइड्सचे बंधन शक्य झाले आणि आमच्या अभ्यासात हे ग्लायकन-लक्ष्यित एमएबीएस वापरून एव्हिडिन-कोटेड प्लेट्सवर केले गेले.
बायोटिनिलेटेड ऑलिगोसॅकराइड्ससाठी एलिसा वर आधारित मोनोक्लोनल अँटीबॉडीजची तपासणी.येथे (A) ऑलिगोसॅकराइड्सचे एकत्रित बायोटिनाइलेशन आणि त्यानंतरचे ELISA स्क्रीनिंग न्यूट्रॅव्हिडिन लेपित प्लेट्सवर ग्लायकन-लक्ष्यित mAbs सह आणि (B) प्रतिक्रिया उत्पादनांच्या बायोटिनाइलेशनसाठी एक-चरण प्रक्रिया दर्शविते.
ऑलिगोसेकराइड-संयुग्मित प्रतिपिंडांसह एव्हिडिन-लेपित प्लेट्स नंतर प्राथमिक आणि दुय्यम प्रतिपिंडांमध्ये जोडल्या गेल्या आणि प्रकाश- आणि वेळ-संवेदनशील माध्यमात धुतल्या गेल्या.अँटीबॉडी बंधन पूर्ण झाल्यानंतर, प्लेट इनक्यूबेट करण्यासाठी TMB सब्सट्रेट घाला.सल्फ्यूरिक ऍसिडसह प्रतिक्रिया शेवटी थांबविली गेली.अँटीबॉडी-विशिष्ट क्रॉस-लिंकिंग शोधण्यासाठी प्रत्येक अँटीबॉडीची बंधनकारक शक्ती निर्धारित करण्यासाठी एलिसा रीडर वापरून उष्मायन केलेल्या प्लेट्सचे विश्लेषण केले गेले.प्रयोगाच्या तपशील आणि मापदंडांसाठी, संबंधित विभाग "सामग्री आणि पद्धती" पहा.
आम्ही ACSH मध्ये उपस्थित विरघळणारे ऑलिगोसॅकराइड तसेच लिग्नोसेल्युलोसिक हायड्रोलायसेट्सपासून वेगळे केलेल्या क्रूड आणि शुद्ध ऑलिगोसाकराइड अपूर्णांकांमध्ये वैशिष्ट्यीकृत करून विशिष्ट अनुप्रयोगांसाठी या नवीन विकसित पद्धतीची उपयुक्तता प्रदर्शित करतो.आकृती 3 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, बायोएसिलेटेड ग्लायकोम परख पद्धती वापरून ACSH मध्ये ओळखले जाणारे सर्वात सामान्य एपिटोप-बदली केलेले xylans सामान्यतः युरोनिक (U) किंवा मेथिलुरोनिक (MeU) आणि पेक्टिक अरेबिनोगॅलॅक्टन्स असतात.नॉन-हायड्रोलायझ्ड सॉलिड्स (यूएचएस) 43 च्या ग्लायकन्सच्या विश्लेषणावरील आमच्या मागील अभ्यासात त्यापैकी बहुतेक आढळले होते.
सेल वॉल ग्लाइकनला निर्देशित केलेल्या मोनोक्लोनल अँटीबॉडीचा वापर करून रीकलसिट्रंट ऑलिगोसेकराइड एपिटॉप्स शोधणे."तटस्थ" अपूर्णांक हा ACN अंश आहे आणि "आम्लीय" अंश हा FA अंश आहे.हीटमॅपवरील उजळ लाल रंग उच्च एपिटोप सामग्री दर्शवतात आणि उजळ निळे रिक्त पार्श्वभूमी दर्शवतात.स्केलवरील रंग मूल्ये फॉर्म्युलेशन N=2 साठी कच्च्या OD मूल्यांवर आधारित आहेत.ऍन्टीबॉडीजद्वारे ओळखले जाणारे मुख्य एपिटोप्स उजवीकडे दर्शविले आहेत.
या नॉन-सेल्युलोज रचना तपासल्या गेलेल्या व्यावसायिक एंझाइम मिश्रणातील सर्वात सामान्य सेल्युलेसेस आणि हेमिसेल्युलेसेसद्वारे क्लीव्ह केल्या जाऊ शकत नाहीत, ज्यामध्ये सर्वात सामान्यपणे वापरल्या जाणार्‍या व्यावसायिक एन्झाइमचा समावेश आहे.म्हणून, त्यांच्या हायड्रोलिसिससाठी नवीन सहायक एंजाइम आवश्यक आहेत.आवश्यक नॉन-सेल्युलोज ऍक्सेसरी एन्झाईम्सशिवाय, हे नॉन-सेल्युलोज बॉन्ड्स मोनोसॅकराइड्समध्ये पूर्ण रूपांतर होण्यास प्रतिबंध करतात, जरी त्यांचे मूळ साखर पॉलिमर मोठ्या प्रमाणात लहान तुकड्यांमध्ये हायड्रोलायझ केले गेले आणि व्यावसायिक एन्झाइम मिश्रणाचा वापर करून विरघळले.
सिग्नल वितरण आणि त्याच्या बंधनकारक शक्तीच्या पुढील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की उच्च डीपी साखर अपूर्णांकांमध्ये (A, B, C, DP 20+ पर्यंत) कमी डीपी अपूर्णांक (D, E, F, DP) डायमरमध्ये (Fig. 1) मध्ये बंधनकारक एपिटॉप्स कमी होते.ऍसिडचे तुकडे तटस्थ तुकड्यांपेक्षा नॉन-सेल्युलोज एपिटॉप्समध्ये अधिक सामान्य असतात.या घटना आमच्या मागील अभ्यासात आढळलेल्या नमुन्याशी सुसंगत आहेत, जेथे उच्च डीपी आणि ऍसिड मोएटीज एन्झाईमॅटिक हायड्रोलिसिसला अधिक प्रतिरोधक होते.म्हणून, नॉन-सेल्युलोज ग्लाइकन एपिटॉप्स आणि U आणि MeU प्रतिस्थापनांची उपस्थिती ऑलिगोसॅकराइड्सच्या स्थिरतेमध्ये मोठ्या प्रमाणात योगदान देऊ शकते.हे लक्षात घ्यावे की कमी डीपी ऑलिगोसॅकराइडसाठी बंधनकारक आणि शोधण्याची कार्यक्षमता समस्याप्रधान असू शकते, विशेषत: जर एपिटोप डायमेरिक किंवा ट्रायमेरिक ऑलिगोसॅकराइड असेल.वेगवेगळ्या लांबीच्या व्यावसायिक ऑलिगोसॅकराइड्सचा वापर करून याची चाचणी केली जाऊ शकते, प्रत्येकामध्ये विशिष्ट mAb ला जोडणारा एकच भाग असतो.
अशाप्रकारे, रचना-विशिष्ट प्रतिपिंडांच्या वापरामुळे विशिष्ट प्रकारचे रिकॅलिट्रंट बॉन्ड्स दिसून आले.वापरलेल्या प्रतिपिंडाचा प्रकार, योग्य बांधणीचा पॅटर्न आणि त्यातून निर्माण होणाऱ्या सिग्नलची ताकद (सर्वात जास्त आणि कमी प्रमाणात) यावर अवलंबून, नवीन एन्झाईम ओळखले जाऊ शकतात आणि अधिक संपूर्ण ग्लायकोकन्व्हर्जनसाठी एन्झाईम मिश्रणात अर्ध-परिमाणात जोडले जाऊ शकतात.उदाहरण म्हणून ACSH oligosaccharides चे विश्लेषण घेतल्यास, आम्ही प्रत्येक बायोमास सामग्रीसाठी ग्लाइकन बाँडचा डेटाबेस तयार करू शकतो.येथे हे लक्षात घेतले पाहिजे की प्रतिपिंडांची भिन्न आत्मीयता लक्षात घेतली पाहिजे आणि जर त्यांची आत्मीयता अज्ञात असेल तर भिन्न प्रतिपिंडांच्या संकेतांची तुलना करताना काही अडचणी निर्माण होतील.याव्यतिरिक्त, ग्लायकन बाँडची तुलना समान प्रतिपिंडासाठी नमुन्यांमध्ये सर्वोत्तम कार्य करू शकते.हे हट्टी बॉण्ड्स नंतर CAZyme डेटाबेसशी जोडले जाऊ शकतात, ज्यावरून आपण एन्झाइम ओळखू शकतो, उमेदवार एन्झाइम निवडू शकतो आणि बॉन्ड-ब्रेकिंग एन्झाईम्सची चाचणी घेऊ शकतो किंवा बायोरिफायनरीजमध्ये वापरण्यासाठी हे एन्झाईम व्यक्त करण्यासाठी मायक्रोबियल सिस्टम विकसित करू शकतो.
लिग्नोसेल्युलोसिक हायड्रोलायसेट्समध्ये कमी आण्विक वजन असलेल्या ऑलिगोसॅकराइड्सचे वैशिष्ट्य दर्शवण्यासाठी इम्यूनोलॉजिकल पद्धती पर्यायी पद्धती कशा पूरक आहेत याचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही MALDI (Fig. 4, S1-S8) आणि त्याच पॅनेलवरील GC-MS वर आधारित TMS-व्युत्पन्न सॅकराइड्सचे विश्लेषण केले.ऑलिगोसॅकराइड रेणूंचे वस्तुमान वितरण अपेक्षित संरचनेशी जुळते की नाही याची तुलना करण्यासाठी MALDI चा वापर केला जातो.अंजीर वर.4 ACN-A आणि ACN-B या तटस्थ घटकांचे MC दाखवते.ACN-A विश्लेषणाने DP 4-8 (Fig. 4) पासून DP 22 (Fig. S1) पर्यंतच्या पेंटोज शर्करांच्या श्रेणीची पुष्टी केली, ज्यांचे वजन MeU-xylan oligosaccharides शी संबंधित आहे.ACN-B विश्लेषणाने DP 8-15 सह पेंटोज आणि ग्लुकोक्सीलान मालिका पुष्टी केली.Figure S3 सारख्या पूरक सामग्रीमध्ये, FA-C ऍसिडिक मोएटी वस्तुमान वितरण नकाशे (Me)U प्रतिस्थापित पेंटोज शर्करा 8-15 च्या DP सह दर्शवितात जे ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंगमध्ये आढळलेल्या प्रतिस्थापित xylans शी सुसंगत आहेत.एपिटोप्स सुसंगत आहेत.
ACS मध्ये उपस्थित विरघळणारे नॉन-कॉम्प्लायंट ऑलिगोसॅकराइड्सचे MALDI-MS स्पेक्ट्रम.येथे, (A) ACN-A कमी वजन श्रेणीतील अपूर्णांक ज्यामध्ये मेथिलेटेड युरोनिक ऍसिड (DP 4-8) ग्लुकोरोक्झिलान ऑलिगोसॅकराइड्स आणि (B) ACN-B xylan आणि methylated uronic ऍसिड ऑलिगोसॅकराइड्स ग्लुकोरोक्झिलन (DP 8-15) सह बदलले आहेत.
रेफ्रेक्ट्री ऑलिगोसॅकराइड्सच्या ग्लाइकन अवशेषांच्या रचनेचे विश्लेषण.येथे (A) GC-MS विश्लेषण वापरून प्राप्त केलेल्या विविध ऑलिगोसॅकराइड अपूर्णांकांची TMS सॅकराइड रचना.(ब) ऑलिगोसॅकराइड्समध्ये उपस्थित असलेल्या विविध TMS-व्युत्पन्न शर्करांची रचना.ACN – acetonitrile अंश ज्यामध्ये न्यूट्रल oligosaccharides असतात आणि FA – ऍसिड ऑलिगोसॅकराइड्स असलेले फेरुलिक ऍसिड अपूर्णांक.
आकृती S9 (इलेक्ट्रॉनिक पूरक सामग्रीमध्ये पद्धती पाहिल्या जाऊ शकतात) मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, ऑलिगोसेकराइड अंशाच्या LC-MS विश्लेषणातून आणखी एक मनोरंजक निष्कर्ष काढण्यात आला.ACN-B अंशाच्या बंधनादरम्यान हेक्सोज आणि -OAc गटांचे तुकडे वारंवार दिसून आले.हा शोध केवळ ग्लायकोम आणि MALDI-TOF विश्लेषणामध्ये आढळलेल्या विखंडनाची पुष्टी करत नाही तर प्रीट्रीटेड लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमासमधील संभाव्य कार्बोहायड्रेट डेरिव्हेटिव्हबद्दल नवीन माहिती देखील प्रदान करतो.
आम्ही TMS साखर डेरिव्हेटायझेशन वापरून ऑलिगोसॅकराइड अंशाच्या साखर रचनेचे विश्लेषण देखील केले.GC-MS वापरून, आम्ही ऑलिगोसेकराइड अंश (चित्र 5) मध्ये न्यूरल (नॉन-डेरिव्हेटिव्ह) आणि आम्लयुक्त शर्करा (GluA आणि GalA) ची रचना निर्धारित केली.ग्लुकुरोनिक आम्ल हे आम्लीय घटक C आणि D मध्ये आढळते, तर गॅलेक्‍युरोनिक आम्ल हे आम्लीय घटक A आणि B मध्ये आढळते, हे दोन्ही आम्लयुक्त साखरेचे उच्च DP घटक आहेत.हे परिणाम केवळ आमच्या ELISA आणि MALDI डेटाची पुष्टी करत नाहीत तर oligosaccharide जमा करण्याच्या आमच्या मागील अभ्यासाशी सुसंगत आहेत.म्हणून, आमचा विश्वास आहे की ऑलिगोसॅकराइड्सचे बायोटिनाइलेशन आणि त्यानंतरच्या एलिसा स्क्रीनिंगचा वापर करून आधुनिक इम्यूनोलॉजिकल पद्धती विविध जैविक नमुन्यांमधील विरघळणारे रीकलसिट्रंट ऑलिगोसॅकराइड शोधण्यासाठी पुरेसे आहेत.
ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग पद्धती अनेक वेगवेगळ्या पद्धतींद्वारे प्रमाणित केल्या गेल्या असल्याने, आम्हाला या नवीन परिमाणात्मक पद्धतीची क्षमता आणखी एक्सप्लोर करायची होती.दोन व्यावसायिक oligosaccharides, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) आणि 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), सेल वॉल ग्लाइकन लक्ष्यित नवीन mAb दृष्टिकोन वापरून खरेदी आणि चाचणी केली गेली.आकृती 6 बायोटिनिलेटेड बाइंडिंग सिग्नल आणि ऑलिगोसॅकराइड एकाग्रतेच्या लॉग एकाग्रता दरम्यान एक रेषीय सहसंबंध दर्शविते, संभाव्य लँगमुइर शोषण मॉडेल सुचवते.mAbs मध्ये, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, आणि CCRC-M151 XHE शी सहसंबंधित आहेत, आणि CCRC-M108, CCRC-M109, आणि LM11 हे 01 ते 01 मीटरपेक्षा जास्त अंतरापर्यंत A2XX सहसंबंधित आहेत.प्रयोगादरम्यान प्रतिपिंडांच्या मर्यादित उपलब्धतेमुळे, प्रत्येक ऑलिगोसाकराइड एकाग्रतेसह मर्यादित प्रयोग केले गेले.येथे हे लक्षात घेतले पाहिजे की काही अँटीबॉडीज समान ऑलिगोसॅकराइडला सब्सट्रेट म्हणून अगदी वेगळ्या पद्धतीने प्रतिक्रिया देतात, बहुधा कारण ते थोड्या वेगळ्या एपिटोप्सशी बांधलेले असतात आणि त्यांच्यात खूप भिन्न बंधनकारक संबंध असू शकतात.जेव्हा नवीन mAb दृष्टीकोन वास्तविक नमुन्यांवर लागू केला जातो तेव्हा अचूक एपिटोप ओळखण्याची यंत्रणा आणि परिणाम अधिक जटिल होतील.
विविध ग्लाइकन-लक्ष्यीकरण mAbs ची शोध श्रेणी निर्धारित करण्यासाठी दोन व्यावसायिक ऑलिगोसॅकराइड वापरण्यात आले.येथे, ऑलिगोसेकराइड एकाग्रतेच्या लॉग एकाग्रतेसह रेखीय सहसंबंध (A) एमएबीसह XHE आणि एमएबीसह (B) A2XX साठी लँगमुइर शोषण नमुने दर्शवतात.संबंधित एपिटोप्स परखमध्ये सब्सट्रेट्स म्हणून वापरल्या जाणार्‍या व्यावसायिक ऑलिगोसॅकराइड्सची रचना दर्शवतात.
ग्लाइकन-लक्ष्यित मोनोक्लोनल ऍन्टीबॉडीजचा वापर (ग्लायकोकॉमिक विश्लेषण किंवा ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग) हे वनस्पती बायोमास बनवणार्‍या बहुतेक प्रमुख सेल वॉल ग्लाइकन्सचे सखोल वर्णन करण्यासाठी एक शक्तिशाली साधन आहे.तथापि, शास्त्रीय ग्लाइकन विश्लेषण केवळ मोठ्या सेल वॉल ग्लाइकन्सचे वैशिष्ट्य दर्शवते, कारण बहुतेक ऑलिगोसॅकराइड्स ELISA प्लेट्सवर कार्यक्षमतेने स्थिर नसतात.या अभ्यासात, AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टोव्हर उच्च घन पदार्थांच्या सामग्रीवर एन्झाइमॅटिकली हायड्रोलायझ केले गेले.हायड्रोलायझेटमध्ये रिकॅलिट्रंट सेल वॉल कार्बोहायड्रेट्सची रचना निर्धारित करण्यासाठी साखर विश्लेषणाचा वापर केला गेला.तथापि, hydrolysates मध्ये लहान oligosaccharides च्या mAb विश्लेषणाला कमी लेखले जाते, आणि ELISA प्लेट्सवर oligosaccharides प्रभावीपणे स्थिर करण्यासाठी अतिरिक्त साधने आवश्यक आहेत.
न्यूट्रॅव्हिडिन™ कोटेड प्लेट्सवर एलिसा स्क्रीनिंग त्यानंतर ऑलिगोसॅकराइड बायोटिनाइलेशन एकत्र करून mAb स्क्रीनिंगसाठी आम्ही एक नवीन आणि कार्यक्षम ऑलिगोसॅकराइड इमोबिलायझेशन पद्धतीचा अहवाल देत आहोत.अचल बायोटिनाइलेटेड ऑलिगोसॅकराइड्सने प्रतिपिंडासाठी पुरेशी आत्मीयता दर्शविली ज्यामुळे रीकॅलिट्रंट ऑलिगोसॅकराइड्सचा जलद आणि कार्यक्षम शोध सक्षम होतो.मास स्पेक्ट्रोमेट्रीवर आधारित या हट्टी ऑलिगोसॅकराइड्सच्या रचनेच्या विश्लेषणाने इम्युनोस्क्रीनिंगच्या या नवीन दृष्टिकोनाच्या परिणामांची पुष्टी केली.अशाप्रकारे, हे अभ्यास दर्शवितात की ग्लायकन-लक्ष्यित मोनोक्लोनल ऍन्टीबॉडीजसह ऑलिगोसॅकराइड बायोटिनाइलेशन आणि एलिसा स्क्रीनिंगचे संयोजन ऑलिगोसॅकराइड्समधील क्रॉसलिंक्स शोधण्यासाठी वापरले जाऊ शकते आणि ऑलिगोसॅकराइड्सच्या संरचनेचे वैशिष्ट्य असलेल्या इतर जैवरासायनिक अभ्यासांमध्ये मोठ्या प्रमाणावर लागू केले जाऊ शकते.
ही बायोटिन-आधारित ग्लाइकन प्रोफाइलिंग पद्धत वनस्पती बायोमासमध्ये विरघळणारे ऑलिगोसॅकराइड्सच्या रीकलसिट्रंट कार्बोहायड्रेट बंधांची तपासणी करण्यास सक्षम असलेला पहिला अहवाल आहे.जैवइंधन उत्पादनाच्या बाबतीत बायोमासचे काही भाग इतके हट्टी का आहेत हे समजण्यास मदत होते.ही पद्धत ग्लायकोम विश्लेषण पद्धतींमधील एक महत्त्वाची पोकळी भरून काढते आणि वनस्पती ऑलिगोसॅकराइड्सच्या पलीकडे असलेल्या थरांच्या विस्तृत श्रेणीपर्यंत त्याचा वापर वाढवते.भविष्यात, आम्ही बायोटिनाइलेशनसाठी रोबोटिक्स वापरू शकतो आणि ELISA वापरून नमुन्यांच्या उच्च-थ्रूपुट विश्लेषणासाठी आम्ही विकसित केलेली पद्धत वापरू शकतो.
पायोनियर 33A14 संकरित बियाण्यांपासून उगवलेल्या कॉर्न स्ट्रॉ (CS) ची कापणी 2010 मध्ये रे, कोलोरॅडो येथील क्रेमर फार्म्समधून करण्यात आली.जमीन मालकाच्या परवानगीने या बायोमासचा वापर संशोधनासाठी करता येईल. खोलीच्या तापमानात झिप-लॉक बॅगमध्ये नमुने कोरड्या < 6% आर्द्रतेमध्ये साठवले गेले. खोलीच्या तापमानात झिप-लॉक बॅगमध्ये नमुने कोरड्या < 6% आर्द्रतेमध्ये साठवले गेले. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. खोलीच्या तपमानावर झिपर्ड बॅगमध्ये <6% आर्द्रतेवर नमुने कोरडे ठेवले गेले.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. 6% पेक्षा कमी आर्द्रता असलेल्या खोलीच्या तपमानावर जिपर बॅगमध्ये नमुने साठवले जातात.अभ्यास स्थानिक आणि राष्ट्रीय मार्गदर्शक तत्त्वांचे पालन करतो.NREL प्रोटोकॉल वापरून रचनात्मक विश्लेषण केले गेले.या रचनामध्ये 31.4% ग्लुकन, 18.7% xylan, 3.3% अरेबिनन, 1.2% गॅलॅक्टन, 2.2% एसिटाइल, 14.3% लिग्निन, 1.7% प्रथिने आणि 13. 4% राख असल्याचे आढळून आले.
Cellic® CTec2 (138 mg प्रोटीन/ml, lot VCNI 0001) हे नोव्होझीम्स (फ्रँकलिंटन, NC, USA) मधील सेल्युलेस, β-ग्लुकोसिडेस आणि Cellic® HTec2 (157 mg प्रोटीन/ml, lot VHN00001) यांचे जटिल मिश्रण आहे.मल्टिफेक्ट पेक्टिनेस® (72 mg प्रोटीन/mL), पेक्टिन डिग्रेजिंग एन्झाइमचे एक जटिल मिश्रण, ड्यूपॉन्ट इंडस्ट्रियल बायोसायन्सेस (पालो अल्टो, सीए, यूएसए) द्वारे दान केले गेले.एंझाइम प्रथिने एकाग्रता प्रथिने सामग्रीचा अंदाज घेऊन (आणि नॉन-प्रोटीन नायट्रोजनचे योगदान वजा करून) Kjeldahl नायट्रोजन विश्लेषण (AOAC पद्धत 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) वापरून निर्धारित केली गेली.Diatomaceous Earth 545 EMD मिलीपोर (Billerica, MA) कडून खरेदी केले गेले.सक्रिय कार्बन (DARCO, 100 मेश ग्रॅन्युल्स), Avicel (PH-101), बीच xylan, आणि इतर सर्व रसायने सिग्मा-अल्ड्रिच (सेंट लुईस, MO) कडून खरेदी केली गेली.
AFEX प्रीट्रीटमेंट GLBRC (बायोमास रूपांतरण संशोधन प्रयोगशाळा, MSU, Lansing, MI, USA) येथे करण्यात आली.पूर्व-उपचार 140 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 15 मिनिटांसाठी केले गेले.स्टेनलेस स्टील बेंचटॉप बॅच अणुभट्टी (पार इन्स्ट्रुमेंट्स कंपनी) मध्ये 60% (w/w) लोडिंगमध्ये निर्जल अमोनिया आणि बायोमासच्या 1:1 गुणोत्तरावर 46 निवास वेळ.यास 30 मिनिटे लागली.अणुभट्टी 140°C वर आणली गेली आणि अमोनिया झपाट्याने सोडला गेला, ज्यामुळे बायोमास त्वरीत खोलीच्या तपमानावर परत येऊ शकतो.AFEX प्री-ट्रीटेड कॉर्न स्टोव्हर (ACS) ची रचना उपचार न केलेल्या कॉर्न स्टोव्हर (UT-CS) सारखीच होती.
उच्च घन पदार्थ ACSH 25% (w/w) (अंदाजे 8% डेक्सट्रान लोडिंग) ऑलिगोसॅकराइड्सच्या मोठ्या प्रमाणात उत्पादनासाठी प्रारंभिक सामग्री म्हणून तयार केले गेले.Cellic® Ctec2 10 mg प्रोटीन/g glucan (प्रीट्रीटेड बायोमासमध्ये), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg प्रोटीन/g glucan, आणि Multifect Pectinase (Gencor Inc, USA) यासह व्यावसायिक एन्झाइम मिश्रणाचा वापर करून ACS चे एन्झाइमॅटिक हायड्रोलिसिस केले गेले.).), 5 मिग्रॅ प्रथिने/जी डेक्सट्रान.एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिस 5-लिटर बायोरिएक्टरमध्ये 3 लिटर, pH 4.8, 50°C आणि 250 rpm च्या कार्यरत व्हॉल्यूमसह केले गेले.96 तासांच्या हायड्रोलिसिसनंतर, हायड्रोलायझेट 30 मिनिटांसाठी 6000 rpm वर सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे आणि नंतर 14000 rpm वर 30 मिनिटांसाठी unhydrolysed घन पदार्थ काढून टाकण्यासाठी संकलित केले गेले.त्यानंतर 0.22 मिमी फिल्टर बीकरद्वारे हायड्रोलायझेट निर्जंतुकीकरण केले गेले.फिल्टर केलेले हायड्रोलायझेट निर्जंतुक बाटल्यांमध्ये 4° से. तापमानात साठवले गेले आणि नंतर कार्बनवर विभक्त केले गेले.
NREL प्रयोगशाळेच्या विश्लेषण प्रक्रियेनुसार अर्क-आधारित बायोमास नमुन्यांच्या रचनेचे विश्लेषण: रचना विश्लेषणासाठी नमुने तयार करणे (NREL/TP-510-42620) आणि बायोमासमधील संरचनात्मक कार्बोहायड्रेट्स आणि लिग्निनचे निर्धारण (NREL/TP-510) – 4718.
ऑटोक्लेव्ह-आधारित ऍसिड हायड्रोलिसिस पद्धतीचा वापर करून हायड्रोलायझेट प्रवाहाचे ऑलिगोसॅकराइड विश्लेषण 2 मिली स्केलवर केले गेले.10 मिली स्क्रू कॅप कल्चर ट्यूबमध्ये 69.7 μl 72% सल्फ्यूरिक ऍसिडसह हायड्रोलायझेट नमुना मिसळा आणि 121 डिग्री सेल्सिअस तापमानावर बेंचटॉपवर 1 तास उबवा, बर्फावर थंड करा आणि उच्च कार्यक्षमता लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (HPLC) कुपीमध्ये फिल्टर करा.ऑलिगोसॅकराइड्सची एकाग्रता नॉन-हायड्रोलायझ्ड नमुन्यातील मोनोसॅकराइड्सची एकाग्रता ऍसिड-हायड्रोलायझ्ड नमुन्यातील एकूण साखर एकाग्रतेमधून वजा करून निर्धारित केली जाते.
अॅसिड हायड्रोलाइज्ड बायोमासमधील ग्लुकोज, झायलोज आणि अॅराबिनोज सांद्रतेचे विश्लेषण बायो-रॅड अमिनेक्स HPX-87H स्तंभावरील ऑटोसॅम्पलर, कॉलम हीटर, आयसोक्रेटिक पंप आणि रिफ्रॅक्टिव्ह इंडेक्स डिटेक्टरसह सुसज्ज असलेल्या शिमाडझू HPLC प्रणालीचा वापर करून केले गेले.स्तंभ 50°C वर राखला गेला आणि पाण्यात 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 सह एल्युट केला गेला.प्रवाह
मोनोमर आणि ऑलिगोसेकराइड सामग्रीसाठी हायड्रोलायझेट सुपरनॅटंट पातळ केले गेले आणि त्याचे विश्लेषण केले गेले.एंजाइमॅटिक हायड्रोलिसिसनंतर मिळालेल्या मोनोमेरिक साखरेचे विश्लेषण बायो-रॅड (हर्क्यूलस, CA) अमिनेक्स HPX-87P स्तंभ आणि राख गार्ड स्तंभासह HPLC द्वारे केले गेले.स्तंभाचे तापमान 80°C वर राखले गेले, 0.6 ml/min च्या प्रवाह दरासह पाण्याचा मोबाइल फेज म्हणून वापर केला गेला.रेफमध्ये वर्णन केलेल्या पद्धतींनुसार ऑलिगोसॅकराइड्स 121 डिग्री सेल्सिअस तापमानात सौम्य ऍसिडमध्ये हायड्रोलिसिसद्वारे निर्धारित केले गेले.४१, ४८, ४९.
पूर्वी वर्णन केलेल्या 27, 43, 50, 51 पद्धती वापरून कच्च्या, AFEX पूर्व-उपचार केलेले आणि सर्व नॉन-हायड्रोलायझ्ड बायोमास अवशेषांवर (सीरियल सेल वॉल अर्क आणि त्यांच्या mAb स्क्रीनिंगसह) सॅकराइड विश्लेषण केले गेले.ग्लायकोम विश्लेषणासाठी, बायोमासच्या अवशेषांपासून वनस्पती पेशींच्या भिंतींच्या सामग्रीचे अल्कोहोल-अघुलनशील अवशेष तयार केले जातात आणि अमोनियम ऑक्सलेट (50 एमएम), सोडियम कार्बोनेट (50 मिमी आणि 0.5% w/v), CON सारख्या वाढत्या आक्रमक अभिकर्मकांसह अनुक्रमांक काढले जातात.(1M आणि 4M, दोन्ही 1% w/v सोडियम बोरोहायड्राइडसह) आणि आधी वर्णन केल्याप्रमाणे ऍसिड क्लोराईट 52,53.अर्क नंतर सेल वॉल ग्लाइकनकडे निर्देशित केलेल्या mAb50s च्या जटिल पॅनेलच्या विरूद्ध ELISA च्या अधीन केले गेले आणि mAb बंधनकारक प्रतिक्रिया हीट नकाशा म्हणून सादर केल्या गेल्या.प्लांट सेल वॉल ग्लाइकन लक्ष्यित करणारे mAbs प्रयोगशाळेतील स्टॉक्समधून (CCRC, JIM आणि MAC मालिका) खरेदी केले गेले.
ऑलिगोसॅकराइड्सचे वन-स्टेप बायोटिनाइलेशन.बायोटिन-एलसी-हायड्रॅझाइडसह कार्बोहायड्रेट्सचे संयोजन खालील प्रक्रिया वापरून केले गेले.बायोटिन-एलसी-हायड्रॅझाइड (4.6 mg/12 μmol) डायमिथाइल सल्फॉक्साइड (DMSO, 70 μl) मध्ये विरघळवून 1 मिनिटासाठी 65° C. वर जोरदार ढवळून आणि गरम करून.ग्लेशियल ऍसिटिक ऍसिड (30 μl) जोडले गेले आणि मिश्रण सोडियम सायनोबोरोहायड्राइड (6.4 mg/100 μmol) वर ओतले गेले आणि सुमारे 1 मिनिट 65° C वर गरम केल्यानंतर पूर्णपणे विरघळले.नंतर, 5 ते 8 μl पर्यंत प्रतिक्रिया मिश्रण वाळलेल्या ऑलिगोसॅकराइडमध्ये (1-100 nmol) जोडले गेले जेणेकरून लेबलच्या 10 पट किंवा त्याहून अधिक दाढ कमी होण्याच्या टोकावर प्राप्त होईल.प्रतिक्रिया 2 तासांसाठी 65 डिग्री सेल्सिअस तापमानात केली गेली, त्यानंतर नमुने त्वरित शुद्ध केले गेले.लेबलिंग प्रयोगांमध्ये कमी केल्याशिवाय सोडियम सायनोबोरोहायड्राइडचा वापर केला गेला नाही, आणि नमुने 2.5 तासांसाठी 65° C वर प्रतिक्रिया देण्यात आले.
बायोटिनिलेटेड ऑलिगोसॅकराइड्सचे नमुने एलिसा कोटिंग आणि धुणे.25 μl बायोटिनिलेटेड नमुने (प्रत्येक केंद्रित नमुन्याचे 100 μl 0.1 एम ट्रिस बफर सोल्यूशन (टीबीएस) च्या 5 मिली मध्ये पातळ केलेले) एव्हिडिन-लेपित प्लेटच्या प्रत्येक विहिरीत जोडले गेले.नियंत्रण विहिरी 0.1 M TBS मध्ये 10 μg/ml च्या एकाग्रतेमध्ये 50 μl बायोटिनने लेपित केल्या होत्या.डिआयोनाइज्ड पाण्याचा वापर रिक्त मोजमापांसाठी कोटिंग म्हणून केला गेला.अंधारात खोलीच्या तपमानावर टॅब्लेट 2 तास उष्मायन केले गेले.प्रोग्राम क्र. वापरून ०.१ एम टीबीएसमध्ये ०.१% स्किम्ड दुधाने प्लेट ३ वेळा धुवा.ग्रेनियर फ्लॅट 3A साठी 11.
प्राथमिक ऍन्टीबॉडीज जोडणे आणि धुणे.प्रत्येक विहिरीला 40 μl प्राथमिक प्रतिपिंड जोडा.अंधारात खोलीच्या तपमानावर 1 तास मायक्रोप्लेट उबवा.त्यानंतर ग्रेनियर फ्लॅट 3A साठी वॉश प्रोग्राम #11 वापरून प्लेट्स 0.1% दुधाने 0.1M TBS मध्ये 3 वेळा धुतल्या गेल्या.
दुय्यम प्रतिपिंड जोडा आणि धुवा.प्रत्येक विहिरीला 50 μl उंदीर/उंदीर दुय्यम प्रतिपिंड (0.1 M TBS मध्ये 0.1% दुधात 1:5000 पातळ केलेले) घाला.अंधारात खोलीच्या तपमानावर 1 तास मायक्रोप्लेट उबवा.त्यानंतर ग्रेनियर फ्लॅट 5A प्लेट वॉश प्रोग्राम #12 वापरून मायक्रोप्लेट्स 0.1 M TBS मध्ये 0.1% दुधाने 5 वेळा धुतल्या गेल्या.
सब्सट्रेट जोडणे.बेस सब्सट्रेटमध्ये 50 µl 3,3′,5,5′-टेट्रामेथिलबेन्झिडाइन (TMB) घाला (बफरचे 2 थेंब, टीएमबीचे 3 थेंब, हायड्रोजन पेरोक्साइडचे 2 थेंब 15 मिली डीआयोनाइज्ड पाण्यात टाकून).टीएमबी सब्सट्रेट तयार करा.आणि वापरण्यापूर्वी भोवरा).30 मिनिटांसाठी खोलीच्या तपमानावर मायक्रोप्लेट उबवा.अंधारात.
चरण पूर्ण करा आणि टॅब्लेट वाचा.प्रत्येक विहिरीला 50 μl 1 N सल्फ्यूरिक ऍसिड घाला आणि ELISA रीडर वापरून 450 ते 655 nm शोषक रेकॉर्ड करा.
विआयनीकृत पाण्यात या विश्लेषकांचे 1 mg/ml द्रावण तयार करा: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (mantyNAglucosamine),(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (अंतर्गत मानक).तक्ता 1 मध्ये दर्शविलेले 1 mg/mL साखरेचे द्रावण जोडून दोन मानके तयार केली गेली. सर्व पाणी काढून टाकेपर्यंत नमुने गोठवले जातात आणि -80° C वर लायफिलाइझ केले जातात (सामान्यतः 12-18 तास).
विश्लेषणात्मक शिल्लक वर कॅप ट्यूब स्क्रू करण्यासाठी 100-500 µg नमुना जोडा.जोडलेल्या रकमेची नोंद करा.सॉल्व्हेंटच्या विशिष्ट एकाग्रतेमध्ये नमुना विसर्जित करणे आणि ते द्रव अलिकट म्हणून ट्यूबमध्ये जोडणे चांगले.प्रत्येक नमुना ट्यूबसाठी अंतर्गत मानक म्हणून 20 μl 1 mg/ml inositol वापरा.नमुन्यात जोडलेल्या अंतर्गत मानकाचे प्रमाण मानक ट्यूबमध्ये जोडलेल्या अंतर्गत मानकांच्या प्रमाणासारखेच असणे आवश्यक आहे.
स्क्रू कॅपच्या कुपीमध्ये 8 मिली निर्जल मिथेनॉल घाला.नंतर 3 N. मिथेनॉलिक HCl द्रावणाचे 4 मि.ली., कॅप केलेले आणि हलवले.या प्रक्रियेत पाण्याचा वापर होत नाही.
ऑलिगोसेकराइड नमुने आणि मानक TMS ट्यूबमध्ये 500 μl 1 M HCl मिथेनॉल द्रावण जोडा.थर्मल ब्लॉकमध्ये नमुने रात्रभर (168 तास) 80 डिग्री सेल्सिअस तापमानात उबवले गेले.खोलीच्या तपमानावर मेथॅनोलिसिस उत्पादन कोरडे मेनिफोल्ड वापरून वाळवा.200 μl MeOH जोडा आणि पुन्हा कोरडे करा.ही प्रक्रिया दोनदा पुनरावृत्ती होते.नमुन्यात 200 µl मिथेनॉल, 100 µl पायरीडाइन आणि 100 µl एसिटिक एनहाइड्राइड घाला आणि चांगले मिसळा.नमुने खोलीच्या तपमानावर 30 मिनिटांसाठी उष्मायन केले गेले.आणि वाळलेल्या.200 μl मिथेनॉल घाला आणि पुन्हा कोरडे करा.
200 μl ट्राय-सिल घाला आणि 20 मिनिटे गरम करा.80 डिग्री सेल्सिअस, नंतर खोलीच्या तापमानाला थंड केले जाते.अंदाजे 50 μl च्या व्हॉल्यूमपर्यंत नमुना आणखी सुकविण्यासाठी कोरडे मॅनिफोल्ड वापरा.हे लक्षात घेणे महत्त्वाचे आहे की आम्ही नमुने पूर्णपणे कोरडे होऊ दिले नाहीत.
2 मिली हेक्सेन घाला आणि व्हर्टेक्सिंग करून चांगले मिसळा.5-3/4 इंच व्यासाच्या पिपेटच्या वर काचेचे लोकर घालून पाश्चर पिपेट्स (5-8 मिमी) च्या टिपा काचेच्या लोकरच्या तुकड्याने भरा.नमुने 2 मिनिटांसाठी 3000 ग्रॅमवर ​​सेंट्रीफ्यूज केले गेले.कोणतेही अघुलनशील अवशेष अवक्षेपित होतात.नमुना 100-150 μl पर्यंत वाळवा.अंदाजे 1 μl ची मात्रा GC-MS मध्ये 80 °C च्या सुरुवातीच्या तापमानात आणि 2.0 मिनिटांच्या सुरुवातीच्या वेळेत इंजेक्ट करण्यात आली (टेबल 2).