Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Nauji imunologiniai ir masės spektrometriniai metodai, skirti sudėtingai patvarių oligosacharidų analizei kukurūzų krosnyje, apdorotoje AFEX.Lignoceliuliozės biomasė yra tvari alternatyva iškastiniam kurui ir plačiai naudojama kuriant biotechnologijas gaminant tokius produktus kaip maistas, pašarai, kuras ir cheminės medžiagos.Šių technologijų pagrindas yra ekonomiškų procesų, skirtų augalų ląstelių sienelėse esantiems sudėtingiems angliavandeniams paversti paprastais cukrumi, tokiais kaip gliukozė, ksiloze ir arabinozė, kūrimas.Kadangi lignoceliuliozinė biomasė yra labai užsispyrusi, ją reikia apdoroti termochemiškai (pvz., amoniako pluošto šveitimas (AFEX), skiestomis rūgštimis (DA), joniniais skysčiais (IL)) ir biologiškai apdoroti (pvz., fermentine hidrolize ir mikrobų fermentacija), kad būtų gautas norimas produktas..Tačiau kai hidrolizės procese naudojami komerciniai grybų fermentai, tik 75-85% susidarančių tirpių cukrų yra monosacharidai, o likę 15-25% yra tirpūs, sunkiai įveikiami oligosacharidai, kurie ne visada yra prieinami mikroorganizmams.Anksčiau mes sėkmingai išskyrėme ir išgryninome tirpius užsispyrusius oligosacharidus, naudodami anglies ir diatomito atskyrimo ir dydžio išskyrimo chromatografijos derinį, taip pat ištyrėme jų fermentų slopinimo savybes.Mes nustatėme, kad oligosacharidus, turinčius aukštesnio polimerizacijos laipsnio (DP) metilintos urono rūgšties pakaitų, yra sunkiau apdoroti naudojant komercinius fermentų mišinius nei mažo DP ir neutralius oligosacharidus.Čia mes pranešame apie kelių papildomų metodų naudojimą, įskaitant glikano profiliavimą naudojant monokloninius antikūnus (mAb), būdingus augalų biomasės glikanams, kad būtų galima apibūdinti glikano ryšius augalų ląstelių sienelėse ir fermentinius hidrolizatus, matricos padedamą lazerinės desorbcijos jonizaciją, skrydžio laiko masės spektrometriją..MALDI-TOF-MS) naudoja struktūrą informatyvias diagnostines smailes, gautas spektroskopijos būdu po antrinio neigiamų jonų skilimo, dujų chromatografijos ir masės spektrometrijos (GC-MS), kad apibūdintų oligosacharidinius ryšius su derivatizacija ir be jo.Dėl mažo oligosacharidų dydžio (DP 4–20) šias molekules sunku naudoti mAb surišimui ir apibūdinimui.Norėdami išspręsti šią problemą, pritaikėme naują biotino konjugacija pagrįstą oligosacharidų imobilizacijos metodą, kuris sėkmingai pažymėjo daugumą mažai DP tirpių oligosacharidų ant mikroplokštelės paviršiaus, kuris vėliau buvo naudojamas didelio našumo mAb sistemoje specifinei ligavimo analizei.Šis naujas metodas padės ateityje sukurti pažangesnius didelio našumo glikomos tyrimus, kurie gali būti naudojami diagnostikos tikslais biomarkeriuose esantiems oligosacharidus išskirti ir apibūdinti.
Lignoceliuliozės biomasė, sudaryta iš žemės ūkio, miškininkystės, žolės ir medienos medžiagų, yra potenciali žaliava gaminant biologinius produktus, įskaitant maistą, pašarus, kurą ir cheminius pirmtakus, kad būtų galima gaminti didesnės vertės produktus1.Angliavandeniai (pvz., celiuliozė ir hemiceliuliozė), esantys augalų ląstelių sienelėse, cheminio apdorojimo ir biotransformacijos (pvz., fermentinės hidrolizės ir mikrobinės fermentacijos) būdu depolimerizuojami į monosacharidus.Įprastas išankstinis apdorojimas apima amoniako pluošto plėtimąsi (AFEX), praskiestą rūgštį (DA), joninį skystį (IL) ir garų sprogimą (SE), naudojant cheminių medžiagų ir šilumos derinį, siekiant sumažinti lignoceliuliozės gamybą atidarant augalų ląstelių sieneles3,4.medžiagos užsispyrimas, 5. Fermentinė hidrolizė atliekama esant didelei kietųjų dalelių apkrovai, naudojant komercinius aktyvius angliavandenių turinčius fermentus (CAZymes) ir mikrobinę fermentaciją naudojant transgenines mieles arba bakterijas, kad būtų gaminamas biologinis kuras ir cheminės medžiagos 6 .
Komerciniuose fermentuose esantys CAZymes yra sudaryti iš sudėtingo fermentų mišinio, kuris sinergiškai skaido sudėtingus angliavandenių ir cukraus ryšius, kad susidarytų monosacharidus2,7.Kaip pranešėme anksčiau, sudėtingas aromatinių lignino polimerų tinklas su angliavandeniais daro juos labai sunkiai įveikiamus, o tai lemia nepilną cukraus konversiją, sukaupiant 15–25% lytinių oligosacharidų, kurie nesusidaro fermentinės iš anksto apdorotos biomasės hidrolizės metu.Tai dažna problema naudojant įvairius pirminio biomasės apdorojimo metodus.Kai kurios šios kliūties priežastys yra fermentų slopinimas hidrolizės metu arba pagrindinių pagrindinių fermentų, reikalingų augalų biomasėje cukraus ryšiams nutraukti, nebuvimas arba mažas jų kiekis.Cukraus sudėties ir struktūrinių savybių supratimas, pvz., cukraus jungtys oligosachariduose, padės mums pagerinti cukraus konversiją hidrolizės metu, todėl biotechnologiniai procesai bus ekonomiški konkurencingi su naftos produktais.
Nustatyti angliavandenių struktūrą yra sudėtinga, todėl reikia derinti tokius metodus kaip skysčių chromatografija (LC)11,12, branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopija (BMR)13, kapiliarinė elektroforezė (CE)14,15,16 ir masės spektrometrija (MS)17., aštuoniolika.MS metodai, tokie kaip skrydžio laiko masės spektrometrija su lazerine desorbcija ir jonizacija naudojant matricą (MALDI-TOF-MS), yra universalus angliavandenių struktūrų nustatymo metodas.Pastaruoju metu natrio jonų aduktų susidūrimo sukeltos disociacijos (CID) tandemas MS buvo plačiausiai naudojamas pirštų atspaudams, atitinkantiems oligosacharidų prisitvirtinimo vietas, anomerines konfigūracijas, sekas ir šakojimosi pozicijas identifikuoti 20, 21 .
Glikano analizė yra puiki priemonė nuodugniai identifikuoti angliavandenių ryšius22.Šis metodas naudoja monokloninius antikūnus (mAb), nukreiptus į augalų ląstelės sienelės glikaną, kaip zondus, kad suprastų sudėtingus angliavandenių ryšius.Visame pasaulyje yra daugiau nei 250 mAb, sukurtų prieš įvairius linijinius ir šakotus oligosacharidus, naudojant įvairius sacharidus24.Kai kurie mAb buvo plačiai naudojami apibūdinti augalų ląstelės sienelės struktūrą, sudėtį ir modifikacijas, nes yra reikšmingų skirtumų, priklausomai nuo augalų ląstelės tipo, organo, amžiaus, vystymosi stadijos ir augimo aplinkos25, 26.Visai neseniai šis metodas buvo naudojamas suprasti pūslelių populiacijas augalų ir gyvūnų sistemose ir jų atitinkamą vaidmenį glikano transporte, kurį nustato tarpląsteliniai žymenys, vystymosi stadijos arba aplinkos dirgikliai, ir nustatyti fermentinį aktyvumą.Kai kurios skirtingos glikanų ir ksilanų struktūros, kurios buvo nustatytos, yra pektinas (P), ksilanas (X), mananas (M), ksilogliukanai (XylG), mišrių jungčių gliukanai (MLG), arabinoksilanas (ArbX), galaktomannanas (GalG) , gliukurono rūgštis-arabinoksilanas (GArb-G) ir araboksilanas2 (GArb-G).
Tačiau, nepaisant visų šių tyrimų pastangų, tik keli tyrimai buvo skirti oligosacharidų kaupimosi pobūdžiui didelės kietųjų dalelių apkrovos (HSL) hidrolizės metu, įskaitant oligosacharidų išsiskyrimą, oligomerinės grandinės ilgio pokyčius hidrolizės metu, įvairius mažo DP polimerus ir jų kreives.paskirstymai 30,31,32.Tuo tarpu, nors glikano analizė pasirodė esanti naudinga priemonė išsamiai glikano struktūros analizei, sunku įvertinti vandenyje tirpius mažo DP oligosacharidus naudojant antikūnų metodus.Mažesni DP oligosacharidai, kurių molekulinė masė mažesnė nei 5-10 kDa, neprisijungia prie ELISA plokštelių 33, 34 ir prieš pridedant antikūnus yra nuplaunami.
Čia pirmą kartą demonstruojame ELISA tyrimą ant avidinu padengtų plokštelių, naudojant monokloninius antikūnus, derinant tirpių ugniai atsparių oligosacharidų vienos pakopos biotinilinimo procedūrą su glikomo analize.Mūsų požiūris į glikomų analizę buvo patvirtintas MALDI-TOF-MS ir GC-MS pagrįsta papildomų oligosacharidų jungčių analize, naudojant hidrolizuoto cukraus kompozicijų trimetilsililą (TMS).Šis naujoviškas metodas ateityje gali būti sukurtas kaip didelio našumo metodas ir plačiau pritaikytas biomedicinos tyrimuose35.
Potransliacinės fermentų ir antikūnų modifikacijos, tokios kaip glikozilinimas36, turi įtakos jų biologiniam aktyvumui.Pavyzdžiui, serumo baltymų glikozilinimo pokyčiai vaidina svarbų vaidmenį sergant uždegiminiu artritu, o glikozilinimo pokyčiai naudojami kaip diagnostiniai žymenys37.Literatūroje pranešta, kad įvairūs glikanai lengvai atsiranda sergant įvairiomis ligomis, įskaitant lėtines uždegimines virškinimo trakto ir kepenų ligas, virusines infekcijas, kiaušidžių, krūties ir prostatos vėžį38, 39, 40.Glikanų struktūros supratimas naudojant antikūnų glikanų ELISA metodus suteiks papildomo pasitikėjimo diagnozuojant ligą nenaudojant sudėtingų IS metodų.
Mūsų ankstesnis tyrimas parodė, kad užsispyrę oligosacharidai liko nehidrolizuoti po išankstinio apdorojimo ir fermentinės hidrolizės (1 pav.).Anksčiau paskelbtame darbe sukūrėme aktyvuotos anglies kietosios fazės ekstrahavimo metodą, skirtą oligosacharidus išskirti iš AFEX iš anksto apdoroto kukurūzų krosnies hidrolizato (ACSH)8.Po pradinio ekstrahavimo ir atskyrimo oligosacharidai buvo toliau frakcionuojami naudojant dydžio išskyrimo chromatografiją (SEC) ir surinkti pagal molekulinę masę.Cukraus monomerai ir oligomerai, išsiskyrę po įvairių išankstinių apdorojimų, buvo analizuojami cukraus sudėties analize.Lyginant cukraus oligomerų, gautų įvairiais išankstinio apdorojimo metodais, kiekį, užsispyrusių oligosacharidų buvimas yra dažna biomasės pavertimo monosacharidais problema, dėl kurios cukraus išeiga gali sumažėti bent 10-15% ir net iki 18%.JAV.Šis metodas naudojamas tolesniam didelio masto oligosacharidų frakcijų gamybai.Gautas ACH ir jo paskesnės frakcijos, turinčios skirtingą molekulinę masę, buvo naudojamos kaip eksperimentinė medžiaga oligosacharidams apibūdinti šiame darbe.
Po išankstinio apdorojimo ir fermentinės hidrolizės patvarūs oligosacharidai liko nehidrolizuoti.Čia (A) yra oligosacharidų atskyrimo metodas, kai oligosacharidai išskiriami iš AFEX iš anksto apdoroto kukurūzų krosnies hidrolizato (ACSH), naudojant aktyvintos anglies ir diatomito žemę;(B) Oligosacharidų atskyrimo metodas.Oligosacharidai buvo toliau atskirti naudojant dydžio išskyrimo chromatografiją (SEC);(C) Sacharidų monomerai ir oligomerai, išsiskiriantys iš įvairių išankstinių apdorojimų (praskiesta rūgštis: DA, joninis skystis: IL ir AFEX).Fermentinės hidrolizės sąlygos: didelė kietųjų medžiagų įkrova 25 % (m/m) (apie 8 % gliukano įkrova), 96 valandų hidrolizė, 20 mg/g komercinio fermento įkrova (santykis Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) ir (D) Cukraus monomerai ir oligomerai (iš anksto išskiriami iš kortikozės acetato ir arafetrozės, xafecilozės AC) S).
Glikano analizė pasirodė esanti naudinga priemonė išsamiai struktūrinei glikanų analizei ekstraktuose, išskirtuose iš kietų biomasės likučių.Tačiau naudojant šį tradicinį metodą vandenyje tirpūs sacharidai yra nepakankamai atstovaujami41, nes mažos molekulinės masės oligosacharidus sunku imobilizuoti ELISA plokštelėse ir prieš pridedant antikūnus jie išplaunami.Todėl antikūnų surišimui ir apibūdinimui buvo naudojamas vieno etapo biotinilinimo metodas, skirtas padengti tirpius, reikalavimų neatitinkančius oligosacharidus ant avidinu padengtų ELISA plokštelių.Šis metodas buvo išbandytas naudojant mūsų anksčiau pagamintą ACSH ir frakciją pagal jo molekulinę masę (arba polimerizacijos laipsnį, DP).Vienpakopis biotinilinimas buvo naudojamas oligosacharidų surišimo afinitetui padidinti, į redukcinį angliavandenio galą pridedant biotino-LC-hidrazido (2 pav.).Tirpale hemiacetalio grupė redukuojančiame gale reaguoja su biotino-LC-hidrazido hidrazido grupe ir sudaro hidrazono jungtį.Esant reduktoriui NaCNBH3, hidrazono jungtis redukuojama iki stabilaus biotinilinto galutinio produkto.Pakeitus cukrų redukuojančią galą, mažo DP oligosacharidų prisijungimas prie ELISA plokštelių tapo įmanomas, o mūsų tyrime tai buvo padaryta ant avidinu padengtų plokštelių, naudojant glikaną nukreiptus mAb.
Monokloninių antikūnų patikra, pagrįsta ELISA biotinilinti oligosacharidai.Čia (A) kombinuotas oligosacharidų biotinilinimas ir vėlesnis ELISA atranka su glikanu nukreiptais mAb NeutrAvidin padengtose plokštelėse ir (B) rodoma vienos pakopos reakcijos produktų biotinilinimo procedūra.
Po to prie pirminių ir antrinių antikūnų buvo pridėtos avidinu padengtos plokštelės su oligosacharidais konjuguotais antikūnais ir plaunamos šviesai ir laikui jautrioje terpėje.Pasibaigus antikūnų surišimui, įpilkite TMB substrato, kad inkubuotumėte plokštelę.Galiausiai reakcija buvo sustabdyta sieros rūgštimi.Inkubuotos plokštelės buvo analizuojamos naudojant ELISA skaitytuvą, siekiant nustatyti kiekvieno antikūno surišimo stiprumą, kad būtų galima nustatyti specifinį antikūnų kryžminį ryšį.Išsamią informaciją ir eksperimento parametrus rasite atitinkamame skyriuje „Medžiagos ir metodai“.
Mes parodome šio naujai sukurto metodo naudingumą specifiniams tikslams, apibūdindami tirpius oligosacharidus, esančius ACSH, taip pat neapdorotose ir išgrynintose oligosacharidų frakcijose, išskirtose iš lignoceliuliozės hidrolizatų.Kaip parodyta 3 paveiksle, dažniausiai epitopais pakeisti ksilanai, nustatyti ACSH naudojant bioacilintos glikomos tyrimo metodus, paprastai yra urono (U) arba metilurono (MeU) ir pektino arabinogalaktana.Dauguma jų taip pat buvo rasta mūsų ankstesniame tyrime dėl nehidrolizuotų kietųjų medžiagų (UHS) glikanų analizės43.
Nepaklusnių oligosacharidų epitopų aptikimas naudojant monokloninį antikūną, nukreiptą į ląstelės sienelės glikaną.„Neutrali“ frakcija yra ACN frakcija, o „rūgštinė“ frakcija yra FA frakcija.Ryškesnės raudonos spalvos šilumos žemėlapyje rodo didesnį epitopų kiekį, o ryškesnės mėlynos – tuščią foną.Spalvų reikšmės skalėje yra pagrįstos neapdorotomis OD vertėmis formulėms N=2.Pagrindiniai epitopai, kuriuos atpažįsta antikūnai, parodyti dešinėje.
Šių neceliuliozinių struktūrų negalėjo suskaidyti labiausiai paplitusios celiulazės ir hemiceliulazės išbandytame komerciniame fermentų mišinyje, kuriame yra dažniausiai naudojami komerciniai fermentai.Todėl jų hidrolizei reikalingi nauji pagalbiniai fermentai.Be reikalingų neceliuliozės pagalbinių fermentų, šie neceliuliozės ryšiai neleidžia visiškai virsti monosacharidus, net jei jų pirminiai cukraus polimerai yra plačiai hidrolizuojami į trumpesnius fragmentus ir ištirpinami naudojant komercinius fermentų mišinius.
Tolesnis signalo pasiskirstymo ir jo surišimo stiprumo tyrimas parodė, kad didelio DP cukraus frakcijose (A, B, C, DP iki 20+) surišimo epitopai buvo mažesni nei mažo DP frakcijose (D, E, F, DP) dimeruose) (1 pav.).Rūgščių fragmentai dažniau pasitaiko ne celiuliozės epitopuose nei neutralūs fragmentai.Šie reiškiniai atitinka ankstesniame tyrime pastebėtą modelį, kai didelės DP ir rūgšties dalys buvo atsparesnės fermentinei hidrolizei.Todėl ne celiuliozės glikano epitopų buvimas ir U bei MeU pakaitalai gali labai prisidėti prie oligosacharidų stabilumo.Reikėtų pažymėti, kad surišimo ir aptikimo efektyvumas gali būti problemiškas mažo DP oligosacharidams, ypač jei epitopas yra dimerinis arba trimerinis oligosacharidas.Tai gali būti išbandyta naudojant komercinius skirtingo ilgio oligosacharidus, kurių kiekvienas turi tik vieną epitopą, kuris jungiasi prie specifinio mAb.
Taigi, naudojant struktūrai specifinius antikūnus, atskleidė tam tikrų tipų nepalankius ryšius.Priklausomai nuo naudojamo antikūno tipo, tinkamo surišimo modelio ir jo sukuriamo signalo stiprumo (labiausiai ir mažiausiai), galima identifikuoti naujus fermentus ir pusiau kiekybiškai pridėti į fermentų mišinį, kad būtų užtikrinta pilnesnė glikokonversija.Kaip pavyzdį paimdami ACSH oligosacharidų analizę, galime sukurti kiekvienos biomasės medžiagos glikano ryšių duomenų bazę.Čia reikėtų pažymėti, kad reikia atsižvelgti į skirtingą antikūnų afinitetą, o jei jų giminingumas nežinomas, tai sukels tam tikrų sunkumų lyginant skirtingų antikūnų signalus.Be to, glikano jungčių palyginimas gali būti geriausias tarp to paties antikūno mėginių.Tada šie užsispyrę ryšiai gali būti susieti su CAZyme duomenų baze, iš kurios galime identifikuoti fermentus, pasirinkti fermentus kandidatus ir išbandyti ryšius nutraukiančius fermentus arba sukurti mikrobų sistemas, skirtas išreikšti šiuos fermentus, skirtus naudoti biorafinavimo gamyklose44.
Norėdami įvertinti, kaip imunologiniai metodai papildo alternatyvius mažos molekulinės masės oligosacharidų, esančių lignoceliuliozės hidrolizatuose, charakterizavimo metodus, atlikome MALDI (4 pav., S1-S8) ir TMS gautų sacharidų analizę remiantis GC-MS toje pačioje skydelio (5 pav.) oligosacharidų dalyje.MALDI naudojamas norint palyginti, ar oligosacharidų molekulių masės pasiskirstymas atitinka numatytą struktūrą.Ant pav.4 parodytas neutralių komponentų ACN-A ir ACN-B MC.ACN-A analizė patvirtino pentozės cukrų diapazoną nuo DP 4–8 (4 pav.) iki DP 22 (S1 pav.), kurių svoris atitinka MeU-ksilano oligosacharidus.ACN-B analizė patvirtino pentozės ir gliukoksilano serijas su DP 8-15.Papildomoje medžiagoje, pvz., S3 paveiksle, FA-C rūgščių fragmentų masės pasiskirstymo žemėlapiai rodo (Me) U pakeistų pentozės cukrų, kurių DP yra 8–15, diapazoną, atitinkantį pakeistus ksilanus, rastus atliekant ELISA pagrįstą mAb atranką.Epitopai yra nuoseklūs.
MALDI-MS spektras tirpių reikalavimų neatitinkančių oligosacharidų, esančių ACS.Čia (A) ACN-A mažo svorio diapazono frakcijos, turinčios metilintos urono rūgšties (DP 4-8) pakeistų gliukuroksilano oligosacharidų ir (B) ACN-B ksilano ir metilintos urono rūgšties oligosacharidų, pakeistų gliukuroksilanu (DP 8-15).
Ugniai atsparių oligosacharidų glikano liekanų sudėties analizė.Čia (A) įvairių oligosacharidų frakcijų TMS sacharidų sudėtis, gauta naudojant GC-MS analizę.(B) Įvairių iš TMS gautų cukrų, esančių oligosachariduose, struktūros.ACN – acetonitrilo frakcija, turinti neutralių oligosacharidų ir FA – ferulo rūgšties frakcija, turinti rūgščių oligosacharidų.
Kita įdomi išvada buvo padaryta iš oligosacharidų frakcijos LC-MS analizės, kaip parodyta S9 paveiksle (metodus galima pamatyti elektroninėje papildomoje medžiagoje).Perrišant ACN-B frakciją, pakartotinai buvo stebimi heksozės ir -OAc grupių fragmentai.Šis atradimas ne tik patvirtina suskaidymą, pastebėtą glikomos ir MALDI-TOF analizėje, bet ir suteikia naujos informacijos apie galimus angliavandenių darinius iš anksto apdorotoje lignoceliuliozinėje biomasėje.
Mes taip pat išanalizavome oligosacharidų frakcijos cukraus sudėtį, naudodami TMS cukraus darinį.Naudodami GC-MS, nustatėme neuroninių (nedarinių) ir rūgštinių cukrų (GluA ir GalA) sudėtį oligosacharidų frakcijoje (5 pav.).Gliukurono rūgštis randama rūgštiniuose komponentuose C ir D, o galakturono rūgšties yra rūgštiniuose komponentuose A ir B, kurie abu yra rūgštinių cukrų komponentai, kurių DP yra didelis.Šie rezultatai ne tik patvirtina mūsų ELISA ir MALDI duomenis, bet ir atitinka mūsų ankstesnius oligosacharidų kaupimosi tyrimus.Todėl manome, kad šiuolaikinių imunologinių metodų, naudojant oligosacharidų biotinilinimą ir vėlesnį ELISA atranką, pakanka, kad būtų galima aptikti tirpius nepaklusnius oligosacharidus įvairiuose biologiniuose mėginiuose.
Kadangi ELISA pagrįsti mAb atrankos metodai buvo patvirtinti keliais skirtingais metodais, norėjome toliau tirti šio naujo kiekybinio metodo galimybes.Du komerciniai oligosacharidai, ksiloheksasacharido oligosacharidas (XHE) ir 23-α-L-arabinofuranozil-ksilotriozė (A2XX), buvo įsigyti ir išbandyti naudojant naują mAb metodą, nukreiptą į ląstelės sienelės glikaną.6 paveiksle parodyta tiesinė koreliacija tarp biotinilinto surišimo signalo ir oligosacharidų koncentracijos logaritminės koncentracijos, o tai rodo galimą Langmuir adsorbcijos modelį.Tarp mAb CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ir CCRC-M151 koreliavo su XHE, o CCRC-M108, CCRC-M109 ir LM11 koreliavo su A2XX nuo 100 nm diapazone.Dėl riboto antikūnų prieinamumo eksperimento metu buvo atlikti riboti eksperimentai su kiekviena oligosacharido koncentracija.Reikėtų pažymėti, kad kai kurie antikūnai labai skirtingai reaguoja į tą patį oligosacharidą kaip substratą, tikriausiai todėl, kad jie jungiasi prie šiek tiek skirtingų epitopų ir gali turėti labai skirtingą surišimo afinitetą.Tikslaus epitopo identifikavimo mechanizmai ir pasekmės bus daug sudėtingesnės, kai naujas mAb metodas bus taikomas tikriems mėginiams.
Įvairių glikaną nukreipiančių mAb aptikimo diapazonui nustatyti buvo naudojami du komerciniai oligosacharidai.Čia linijinės koreliacijos su oligosacharidų koncentracijos logaritmine koncentracija rodo Langmuir adsorbcijos modelius (A) XHE su mAb ir (B) A2XX su mAb.Atitinkami epitopai rodo komercinių oligosacharidų, naudojamų kaip substratai tyrime, struktūras.
Į glikaną nukreiptų monokloninių antikūnų naudojimas (glikokominė analizė arba ELISA pagrįsta mAb atranka) yra galingas įrankis, leidžiantis nuodugniai apibūdinti daugumą pagrindinių ląstelių sienelių glikanų, sudarančių augalų biomasę.Tačiau klasikinė glikanų analizė apibūdina tik didesnius ląstelių sienelių glikanus, nes dauguma oligosacharidų nėra efektyviai imobilizuojami ELISA plokštelėse.Šiame tyrime AFEX iš anksto apdorota kukurūzų viryklė buvo fermentiškai hidrolizuota esant dideliam kietųjų medžiagų kiekiui.Cukraus analizė buvo naudojama norint nustatyti nepalankių ląstelių sienelių angliavandenių sudėtį hidrolizate.Tačiau mažesnių oligosacharidų hidrolizatuose mAb analizė yra nepakankamai įvertinta, todėl reikia papildomų priemonių, kad būtų galima veiksmingai imobilizuoti oligosacharidus ELISA plokštelėse.
Čia pateikiame naują ir veiksmingą oligosacharidų imobilizacijos metodą, skirtą mAb atrankai, derinant oligosacharidų biotinilinimą, po kurio atliekamas ELISA atranka NeutrAvidin™ dengtose plokštelėse.Imobilizuoti biotinilinti oligosacharidai parodė pakankamą afinitetą antikūnui, kad būtų galima greitai ir efektyviai aptikti nepaklusnius oligosacharidus.Šių užsispyrusių oligosacharidų sudėties analizė, pagrįsta masės spektrometrija, patvirtino šio naujo požiūrio į imunologinį patikrinimą rezultatus.Taigi šie tyrimai rodo, kad oligosacharidų biotinilinimo ir ELISA atrankos derinys su į glikaną nukreiptais monokloniniais antikūnais gali būti naudojamas oligosacharidų kryžminiams ryšiams aptikti ir gali būti plačiai taikomas kituose biocheminiuose tyrimuose, apibūdinančiuose oligosacharidų struktūrą.
Šis biotino pagrindu pagamintas glikano profiliavimo metodas yra pirmoji ataskaita, galinti ištirti tirpių oligosacharidų angliavandenių ryšius augalų biomasėje.Tai padeda suprasti, kodėl kai kurios biomasės dalys yra tokios užsispyrusios, kai kalbama apie biokuro gamybą.Šis metodas užpildo svarbią spragą glikomos analizės metoduose ir išplečia jo taikymą platesniam substratų spektrui, ne tik augalų oligosacharidams.Ateityje galime naudoti robotiką biotinilinti ir naudoti metodą, kurį sukūrėme didelio našumo mėginių analizei naudojant ELISA.
Kukurūzų šiaudai (CS), išauginti iš Pioneer 33A14 hibridinių sėklų, buvo nuimti 2010 m. iš Kramer Farms Ray mieste, Kolorado valstijoje.Gavus žemės savininko leidimą, ši biomasė gali būti naudojama tyrimams. Mėginiai buvo laikomi sausai < 6% drėgmės maišeliuose su užtrauktuku kambario temperatūroje. Mėginiai buvo laikomi sausai < 6% drėgmės maišeliuose su užtrauktuku kambario temperatūroje. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Mėginiai buvo laikomi sausi, esant <6% drėgmei, maišeliuose su užtrauktuku kambario temperatūroje.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6 % Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Mėginiai laikomi maišeliuose su užtrauktuku kambario temperatūroje, kai drėgmė < 6%.Tyrimas atitiko vietines ir nacionalines gaires.Kompozicijos analizė atlikta naudojant NREL protokolą.Nustatyta, kad kompozicijoje yra 31,4 % gliukano, 18,7 % ksilano, 3,3 % arabinano, 1,2 % galaktano, 2,2 % acetilo, 14,3 % lignino, 1,7 % baltymų ir 13,4 % pelenų.
Cellic® CTec2 (138 mg baltymo/ml, VCNI 0001 partija) yra sudėtingas celiuliozės, β-gliukozidazės ir Cellic® HTec2 (157 mg baltymo/ml, partija VHN00001) iš Novozymes (Franklinton, NC, JAV) mišinys.„Multifect Pectinase®“ (72 mg baltymų / ml), sudėtingą pektiną skaidančių fermentų mišinį, padovanojo „DuPont Industrial Biosciences“ (Palo Alto, CA, JAV).Fermentų baltymų koncentracijos buvo nustatytos įvertinus baltymų kiekį (ir atėmus nebaltyminio azoto indėlį), naudojant Kjeldahl azoto analizę (AOAC metodas 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, JAV).Diatomitinė žemė 545 buvo įsigyta iš EMD Millipore (Billerica, MA).Aktyvuota anglis (DARCO, 100 akių granulės), Avicel (PH-101), buko ksilanas ir visos kitos cheminės medžiagos buvo perkamos iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Išankstinis apdorojimas AFEX buvo atliktas GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, JAV).Išankstinis apdorojimas buvo atliktas 140 °C temperatūroje 15 minučių.46 buvimo laikas bevandenio amoniako ir biomasės santykiu 1:1 esant 60 % (m/m) įkrovimui nerūdijančio plieno staliniame reaktoriuje (Parr Instruments Company).Tai užtruko 30 minučių.Reaktorius buvo pašildytas iki 140 °C ir greitai išsiskyrė amoniakas, leidžiantis biomasei greitai grįžti į kambario temperatūrą.AFEX iš anksto apdorotos kukurūzų krosnelės (ACS) sudėtis buvo panaši į neapdorotų kukurūzų krosnelės (UT-CS) sudėtį.
Didelės kietosios medžiagos ACSH 25 % (m/m) (apie 8 % dekstrano įkrova) buvo paruoštas kaip pradinė medžiaga didelio masto oligosacharidų gamybai.Fermentinė ACS hidrolizė buvo atlikta naudojant komercinį fermentų mišinį, įskaitant Cellic® Ctec2 10 mg baltymų / g gliukano (iš anksto apdorotoje biomasėje), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg baltymo / g gliukano ir Multifect Pectinase (Genencor Inc, JAV).).), 5 mg baltymų/g dekstrano.Fermentinė hidrolizė buvo atlikta 5 litrų talpos bioreaktoriuje, kurio darbinis tūris 3 litrai, pH 4,8, 50°C ir 250 aps./min.Po 96 valandų hidrolizės hidrolizatas buvo surenkamas centrifuguojant 6000 aps./min 30 minučių, o po to 14000 aps./min. greičiu 30 minučių, kad būtų pašalintos nehidrolizuotos kietosios medžiagos.Tada hidrolizatas buvo steriliai filtruojamas per 0,22 mm filtravimo stiklinę.Filtruotas hidrolizatas buvo laikomas steriliuose buteliuose 4 °C temperatūroje ir po to frakcionuojamas ant anglies.
Ekstrakto biomasės mėginių sudėties analizė pagal NREL laboratorinės analizės procedūras: mėginių paruošimas sudėties analizei (NREL/TP-510-42620) ir struktūrinių angliavandenių bei lignino nustatymas biomasėje (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hidrolizato srauto oligosacharidinė analizė buvo atlikta 2 ml skalėje, naudojant autoklavo rūgšties hidrolizės metodą.Hidrolizato mėginį sumaišykite su 69,7 µl 72% sieros rūgšties 10 ml užsukamu dangteliu auginimo mėgintuvėlyje ir 1 valandą inkubuokite ant stalo 121 °C temperatūroje, atvėsinkite ant ledo ir filtruokite į didelio efektyvumo skysčių chromatografijos (HPLC) buteliuką.Oligosacharidų koncentracija buvo nustatyta iš bendros cukraus koncentracijos rūgštimi hidrolizuotame mėginyje atėmus monosacharidų koncentraciją nehidrolizuotame mėginyje.
Gliukozės, ksilozės ir arabinozės koncentracijos rūgštimi hidrolizuotoje biomasėje buvo analizuojamos naudojant Shimadzu HPLC sistemą su automatiniu mėginių ėmikliu, kolonėlės šildytuvu, izokratiniu siurbliu ir lūžio rodiklio detektoriumi Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonėlėje.Kolonėlė buvo palaikoma 50 °C temperatūroje ir eliuuojama 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 vandenyje.srautas.
Hidrolizato supernatantas buvo praskiestas ir analizuojamas monomero ir oligosacharidų kiekis.Monomeriniai cukrūs, gauti po fermentinės hidrolizės, buvo analizuojami HPLC su Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonėlė ir pelenų apsaugos kolonėlė.Kolonėlės temperatūra buvo palaikoma 80 °C, kaip judrioji fazė buvo naudojamas vanduo, kurio srautas buvo 0,6 ml/min.Oligosacharidai buvo nustatyti hidrolizės būdu praskiestoje rūgštyje 121 ° C temperatūroje pagal metodus, aprašytus nuorodoje.41, 48, 49.
Sacharidų analizė buvo atlikta naudojant neapdorotas, iš anksto apdorotas AFEX ir visas nehidrolizuotas biomasės liekanas (įskaitant serijinių ląstelių sienelių ekstraktų gamybą ir jų mAb atranką), naudojant anksčiau aprašytas procedūras 27, 43, 50, 51.Glikomo analizei iš biomasės likučių paruošiamos alkoholyje netirpios augalų ląstelių sienelių medžiagos likučiai ir nuosekliai ekstrahuojami vis agresyvesniais reagentais, tokiais kaip amonio oksalatas (50 mM), natrio karbonatas (50 mM ir 0,5 % m/t), CON.(1 M ir 4 M, abu su 1 % m/t natrio borohidridu) ir rūgšties chloritas, kaip aprašyta anksčiau52,53.Tada ekstraktai buvo tiriami ELISA prieš sudėtingą mAb50 grupę, nukreiptą į ląstelės sienelės glikaną, ir mAb surišimo reakcijos buvo pateiktos kaip šilumos žemėlapis.mAb, nukreipti į augalų ląstelių sienelės glikaną, buvo įsigyti iš laboratorijų atsargų (CCRC, JIM ir MAC serijos).
Vienpakopis oligosacharidų biotinilinimas.Angliavandenių konjugacija su biotin-LC-hidrazidu buvo atlikta naudojant šią procedūrą.Biotino-LC-hidrazidas (4,6 mg/12 μmol) buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO, 70 μl) intensyviai maišant ir kaitinant 65 °C temperatūroje 1 min.Pridedama ledinės acto rūgšties (30 µl), mišinys supilamas į natrio cianoborhidridą (6,4 mg/100 µmol) ir visiškai ištirpo po kaitinimo 65 °C temperatūroje apie 1 minutę.Tada į išdžiovintą oligosacharidą (1-100 nmol) buvo pridėta nuo 5 iki 8 μl reakcijos mišinio, kad būtų gautas 10 ar daugiau molinis etiketės perteklius redukuojančiame gale.Reakcija buvo vykdoma 65 ° C temperatūroje 2 valandas, po to mėginiai buvo nedelsiant išvalyti.Ženklinimo eksperimentuose be redukavimo nebuvo naudojamas natrio cianoborhidridas, o mėginiai buvo reaguoti 65 °C temperatūroje 2,5 valandos.
Biotiniluotų oligosacharidų mėginių padengimas ELISA ir plovimas.Į kiekvieną avidinu padengtos plokštelės šulinėlį įpilta 25 μl biotiniluotų mėginių (100 μl kiekvieno koncentruoto mėginio, praskiesto 5 ml 0,1 M Tris buferinio tirpalo (TBS)).Kontroliniai šulinėliai buvo padengti 50 μl biotino, kurio koncentracija 10 μg/ml 0,1 M TBS.Dejonizuotas vanduo buvo naudojamas kaip danga tuščiiesiems matavimams.Tabletė buvo inkubuojama 2 valandas kambario temperatūroje tamsoje.Plokštelę 3 kartus nuplaukite 0,1% nugriebto pieno tirpalu 0,1 M TBS, naudodami programą Nr.11 už Grenier butą 3A.
Pirminių antikūnų papildymas ir plovimas.Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 40 µl pirminio antikūno.Mikroplokštelę inkubuokite 1 valandą kambario temperatūroje tamsoje.Tada plokštelės buvo plaunamos 3 kartus 0,1 % pieno tirpalu 0,1 M TBS, naudojant plovimo programą Nr. 11, skirtą Grenier Flat 3A.
Įpilkite antrinio antikūno ir nuplaukite.Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 µl pelės/žiurkės antrinio antikūno (atskiesto 1:5000 0,1 % pieno 0,1 M TBS).Mikroplokštelę inkubuokite 1 valandą kambario temperatūroje tamsoje.Tada mikroplokštelės 5 kartus plaunamos 0,1 % pieno tirpalu 0,1 M TBS, naudojant Grenier Flat 5A plokštelių plovimo programą Nr. 12.
Substrato pridėjimas.Į pagrindinį substratą įpilkite 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidino (TMB) (į 15 ml dejonizuoto vandens įlašinkite 2 lašus buferio, 3 lašus TMB, 2 lašus vandenilio peroksido).Paruoškite TMB substratą.ir prieš naudojimą suplakite).Mikroplokštelę inkubuokite kambario temperatūroje 30 minučių.Tamsoje.
Užbaikite veiksmą ir perskaitykite planšetinį kompiuterį.Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 µl 1 N sieros rūgšties ir ELISA skaitytuvu užregistruokite absorbciją nuo 450 iki 655 nm.
Paruoškite 1 mg/ml šių analičių tirpalus dejonizuotame vandenyje: arabinozės, ramnozės, fukozės, ksilozės, galakturono rūgšties (GalA), gliukurono rūgšties (GlcA), manozės, gliukozės, galaktozės, laktozės, N-acetilmannozamino (manNAc), N-acetilgliukozamino.(glcNAc), N-acetilgalaktozaminas (galNAc), inozitolis (vidinis standartas).Du etalonai buvo paruošti pridedant 1 mg/ml cukraus tirpalų, parodytų 1 lentelėje. Mėginiai užšaldomi ir liofilizuojami -80°C temperatūroje, kol pasišalina visas vanduo (paprastai apie 12-18 valandų).
100–500 µg mėginio įpilkite į mėgintuvėlius su užsukamu dangteliu ant analitinių svarstyklių.Užrašykite pridėtą sumą.Geriausia mėginį ištirpinti tam tikros koncentracijos tirpiklyje ir įpilti į mėgintuvėlį kaip skystą alikvotinę dalį.Kaip vidinį standartą kiekvienam mėgintuvėliui naudokite 20 µl 1 mg/ml inozitolio.Į mėginį įdėto vidinio etalono kiekis turi būti toks pat, kaip ir į etaloninį mėgintuvėlį įdėto vidinio etalono kiekis.
Į buteliuką su užsukamu dangteliu įpilkite 8 ml bevandenio metanolio.Tada 4 ml 3 N metanolinio HCl tirpalo, uždengtas dangteliu ir sukratytas.Šiam procesui vanduo nenaudojamas.
Į oligosacharidų mėginius ir standartinius TMS mėgintuvėlius įpilkite 500 µl 1 M HCl metanolio tirpalo.Mėginiai buvo inkubuojami per naktį (168 valandas) 80 °C temperatūroje terminiame bloke.Metanolizės produktą išdžiovinkite kambario temperatūroje, naudodami džiovinimo kolektorių.Įpilkite 200 µl MeOH ir vėl išdžiovinkite.Šis procesas kartojamas du kartus.Į mėginį įpilama 200 µl metanolio, 100 µl piridino ir 100 µl acto rūgšties anhidrido ir gerai išmaišoma.Mėginiai buvo inkubuojami kambario temperatūroje 30 minučių.ir džiovinti.Įpilkite 200 µl metanolio ir vėl išdžiovinkite.
Įpilkite 200 µl Tri-Sil ir kaitinkite uždengtą mėgintuvėlį 20 minučių.80°C, po to atvėsinamas iki kambario temperatūros.Džiovinimo kolektoriumi toliau išdžiovinkite mėginį iki maždaug 50 µl tūrio.Svarbu pažymėti, kad mes neleidome mėginiams visiškai išdžiūti.
Įpilkite 2 ml heksano ir gerai išmaišykite maišydami.Užpildykite Pasteur pipečių (5–8 mm) antgalius stiklo vatos gabalėliu, įkišdami stiklo vatą ant 5–3/4 colio skersmens pipetės.Mėginiai centrifuguojami 3000 g 2 minutes.Bet kokios netirpios liekanos nusodinamos.Išdžiovinkite mėginį iki 100–150 µl.Į GC-MS buvo įšvirkštas maždaug 1 μl tūris, esant pradinei 80 °C temperatūrai ir 2,0 minučių pradiniam laikui (2 lentelė).