Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے محدود CSS سپورٹ حاصل ہے۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس دوران، مسلسل تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے رینڈر کریں گے۔
کارن سٹور میں مستقل اولیگوساکرائڈز کے پیچیدہ تجزیہ کے لیے نئے امیونولوجیکل اور ماس سپیکٹرو میٹرک طریقے جو AFEX کے ساتھ پہلے سے تیار کیے گئے ہیں۔Lignocellulosic بایوماس جیواشم ایندھن کا ایک پائیدار متبادل ہے اور خوراک، فیڈ، ایندھن اور کیمیکلز جیسی مصنوعات کی تیاری کے لیے بائیو ٹیکنالوجیز تیار کرنے کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا ہے۔ان ٹیکنالوجیز کی کلید پودوں کے خلیوں کی دیواروں میں موجود پیچیدہ کاربوہائیڈریٹس کو گلوکوز، زائلوز اور عربینوز جیسی سادہ شکروں میں تبدیل کرنے کے لیے لاگت سے مسابقتی عمل کی ترقی ہے۔چونکہ lignocellulosic بایوماس بہت ضدی ہے، اس کو مطلوبہ مصنوعات کے امتزاج میں تھرمو کیمیکل علاج (مثال کے طور پر، امونیا فائبر ایکسفولیئشن (AFEX)، dilute acids (DA)، ionic liquids (IL)) اور حیاتیاتی علاج (جیسے، enzymatic hydrolysis اور microbial fermentation) کا نشانہ بنایا جانا چاہیے۔.تاہم، جب کمرشل فنگل انزائمز کو ہائیڈولیسس کے عمل میں استعمال کیا جاتا ہے، تو بننے والی گھلنشیل شکروں میں سے صرف 75-85% مونوساکرائیڈز ہیں، اور بقیہ 15-25% حل پذیر، انٹریکٹ ایبل اولیگوساکرائیڈز ہیں، جو مائکروجنزموں کے لیے ہمیشہ دستیاب نہیں ہوتے ہیں۔اس سے پہلے، ہم نے کاربن اور ڈائیٹومیسیئس زمین کی علیحدگی اور سائز کے اخراج کی کرومیٹوگرافی کے امتزاج کا استعمال کرتے ہوئے حل پذیر ضدی اولیگوساکرائڈز کو کامیابی کے ساتھ الگ تھلگ اور صاف کیا ہے، اور ان کے انزائم روکنے والی خصوصیات کی بھی چھان بین کی ہے۔ہم نے پایا ہے کہ اعلی درجے کی پولیمرائزیشن (DP) میتھلیٹڈ یورونک ایسڈ کے متبادل پر مشتمل اولیگوساکرائڈز کو کم ڈی پی اور غیر جانبدار اولیگوساکرائڈز کے مقابلے تجارتی انزائم مرکب کے ساتھ عمل کرنا زیادہ مشکل ہے۔یہاں ہم کئی اضافی طریقوں کے استعمال کی اطلاع دیتے ہیں، بشمول پودوں کے خلیوں کی دیواروں اور انزیمیٹک ہائیڈروالیسیٹس، میٹرکس کی مدد سے لیزر ڈیسورپشن آئنائزیشن، ٹائم آف فلائٹ ماس سپیکٹرو میٹری میں گلائکن بانڈز کی خصوصیت کے لیے مخصوص مونوکلونل اینٹی باڈیز (mAbs) کا استعمال کرتے ہوئے گلائکن پروفائلنگ۔.MALDI-TOF-MS) منفی آئنوں کے ثانوی زوال کے بعد سپیکٹروسکوپی کے ذریعے حاصل کردہ ساختی معلوماتی تشخیصی چوٹیوں کا استعمال کرتا ہے، گیس کرومیٹریگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری (GC-MS) کے ساتھ اور بغیر اخذ کردہ اولیگوساکرائیڈ بانڈز کی خصوصیت کے لیے۔oligosaccharides (DP 4-20) کے چھوٹے سائز کی وجہ سے، ان مالیکیولز کو mAb بائنڈنگ اور خصوصیت کے لیے استعمال کرنا مشکل ہے۔اس مسئلے پر قابو پانے کے لیے، ہم نے بائیوٹن کنجگیشن پر مبنی اولیگوساکرائیڈ امبیلائزیشن کا ایک نیا طریقہ لاگو کیا جس نے مائیکرو پلیٹ کی سطح پر کم ڈی پی میں گھلنشیل اولیگوساکرائیڈز کی اکثریت کو کامیابی کے ساتھ لیبل لگایا، جسے پھر مخصوص لیگیشن تجزیہ کے لیے اعلی تھرو پٹ ایم اے بی سسٹم میں استعمال کیا گیا۔یہ نیا طریقہ مستقبل میں مزید اعلی درجے کی ہائی تھرو پٹ گلائکوم اسیس کی ترقی میں سہولت فراہم کرے گا جس کا استعمال تشخیصی مقاصد کے لیے بائیو مارکر میں موجود اولیگوساکرائڈز کو الگ تھلگ کرنے اور ان کی خصوصیت کے لیے کیا جا سکتا ہے۔
Lignocellulosic بایوماس، جو کہ زرعی، جنگلات، گھاس اور لکڑی کے مواد پر مشتمل ہے، بایو پر مبنی مصنوعات کی تیاری کے لیے ایک ممکنہ فیڈ اسٹاک ہے، جس میں خوراک، فیڈ، ایندھن اور اعلیٰ قیمت والی مصنوعات تیار کرنے کے لیے کیمیائی پیشگی شامل ہیں۔پودوں کے خلیوں کی دیواروں میں موجود کاربوہائیڈریٹس (جیسے سیلولوز اور ہیمی سیلولوز) کو کیمیکل پروسیسنگ اور بائیو ٹرانسفارمیشن (جیسے انزیمیٹک ہائیڈولیسس اور مائکروبیل ابال) کے ذریعے مونوساکرائڈز میں ڈیپولیمرائز کیا جاتا ہے۔عام پری ٹریٹمنٹس میں امونیا فائبر ایکسپینشن (AFEX)، dilute acid (DA)، ionic liquid (IL)، اور steam explosion (SE) شامل ہیں، جو پودوں کے خلیوں کی دیواروں کو کھول کر lignocellulose کی پیداوار کو کم کرنے کے لیے کیمیکلز اور حرارت کے امتزاج کا استعمال کرتے ہیں۔مادے کی ضد، 5. انزیمیٹک ہائیڈولیسس تجارتی فعال کاربوہائیڈریٹ پر مشتمل انزائمز (CAZymes) اور مائکروبیل فرمینٹیشن کا استعمال کرتے ہوئے ایک اعلی ٹھوس بوجھ پر کیا جاتا ہے تاکہ بائیو بیسڈ ایندھن اور کیمیکلز پیدا کرنے کے لیے ٹرانسجینک خمیر یا بیکٹیریا کا استعمال کیا جا سکے۔
تجارتی خامروں میں CAZymes خامروں کے ایک پیچیدہ مرکب پر مشتمل ہوتے ہیں جو ہم آہنگی سے پیچیدہ کاربوہائیڈریٹ-شوگر بانڈز کو مونوساکرائیڈز 2,7 بنانے کے لیے توڑ دیتے ہیں۔جیسا کہ ہم نے پہلے اطلاع دی ہے، کاربوہائیڈریٹس کے ساتھ لگنن کے خوشبودار پولیمر کا پیچیدہ نیٹ ورک انہیں انتہائی پیچیدہ بناتا ہے، جو شوگر کی نامکمل تبدیلی کا باعث بنتا ہے، 15-25% جنسی اولیگوساکرائڈز جمع ہوتے ہیں جو پریٹریٹڈ بائیو ماس کے انزیمیٹک ہائیڈولیسس کے دوران پیدا نہیں ہوتے ہیں۔یہ مختلف بائیو ماس پریٹریٹمنٹ طریقوں کے ساتھ ایک عام مسئلہ ہے۔اس رکاوٹ کی کچھ وجوہات میں ہائیڈرولیسس کے دوران انزائم کی روک تھام، یا پودوں کے بایوماس میں شوگر بانڈز کو توڑنے کے لیے ضروری ضروری خامروں کی عدم موجودگی یا کم سطح شامل ہیں۔شکر کی ساخت اور ساختی خصوصیات کو سمجھنا، جیسے oligosaccharides میں شوگر بانڈز، ہمیں ہائیڈرولیسس کے دوران شوگر کی تبدیلی کو بہتر بنانے میں مدد کرے گا، جس سے بائیو ٹیکنالوجی کے عمل کو پیٹرولیم سے ماخوذ مصنوعات کے ساتھ لاگت کا مقابلہ کرنا ہوگا۔
کاربوہائیڈریٹس کی ساخت کا تعین کرنا مشکل ہے اور اس کے لیے مائع کرومیٹوگرافی (LC)11,12، جوہری مقناطیسی گونج اسپیکٹروسکوپی (NMR)13، کیپلیری الیکٹروفورسس (CE) 14,15,16 اور ماس اسپیکٹرومیٹری (MS)17 جیسے طریقوں کے امتزاج کی ضرورت ہے۔، اٹھارہ۔ایم ایس کے طریقے جیسے کہ لیزر ڈیسورپشن کے ساتھ ٹائم آف فلائٹ ماس سپیکٹرومیٹری اور میٹرکس (MALDI-TOF-MS) کا استعمال کرتے ہوئے آئنائزیشن کاربوہائیڈریٹ کی ساخت کی شناخت کے لیے ایک ورسٹائل طریقہ ہے۔حال ہی میں، collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS of sodium ion addcts oligosaccharide اٹیچمنٹ پوزیشنز، anomeric configurations، sequences، اور برانچنگ پوزیشنز 20, 21 سے متعلقہ فنگر پرنٹس کی شناخت کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے۔
Glycan تجزیہ کاربوہائیڈریٹ بانڈز کی گہرائی سے شناخت کے لیے ایک بہترین ذریعہ ہے۔یہ طریقہ کاربوہائیڈریٹ کے پیچیدہ ربط کو سمجھنے کے لیے تحقیقات کے طور پر سیل وال گلائکن لگانے کے لیے ہدایت کردہ مونوکلونل اینٹی باڈیز (mAbs) کا استعمال کرتا ہے۔دنیا بھر میں 250 سے زیادہ ایم اے بیز دستیاب ہیں، جو مختلف لکیری اور برانچڈ اولیگوساکرائیڈز کے خلاف مختلف saccharides24 استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیے گئے ہیں۔پودوں کے خلیے کی دیوار کی ساخت، ساخت اور ترمیم کو نمایاں کرنے کے لیے کئی ایم اے بیز کا وسیع پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے، کیونکہ پودوں کے خلیے کی قسم، اعضاء، عمر، نشوونما کے مرحلے، اور نشوونما کے ماحول25,26 کے لحاظ سے اہم فرق موجود ہیں۔ابھی حال ہی میں، یہ طریقہ پودوں اور جانوروں کے نظاموں میں ویسیکل کی آبادی اور گلائکن ٹرانسپورٹ میں ان کے متعلقہ کرداروں کو سمجھنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے جیسا کہ ذیلی سیل مارکر، ترقی کے مراحل، یا ماحولیاتی محرکات، اور انزیمیٹک سرگرمی کا تعین کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔گلائکانز اور زائلان کے کچھ مختلف ڈھانچے جن کی نشاندہی کی گئی ہے ان میں پیکٹین (P)، زائلان (X)، منان (M)، xyloglucans (XylG)، مخلوط بانڈ گلوکینز (MLG)، arabinoxylan (ArbX)، galactomannan (GalG)، glucuronic acid-arabinoxylan (Arabinooxylan) اور glucuronic acid-arabinoxylan (Arabinooxylan)
تاہم، ان تمام تحقیقی کوششوں کے باوجود، صرف چند مطالعات نے ہائی سالڈس لوڈ (HSL) ہائیڈرولیسس کے دوران oligosaccharide کے جمع ہونے کی نوعیت پر توجہ مرکوز کی ہے، بشمول oligosaccharide ریلیز، hydrolysis کے دوران oligomeric چین کی لمبائی میں تبدیلی، مختلف کم DP پولیمر، اور ان کے منحنی خطوط۔تقسیم 30,31,32۔دریں اثنا، اگرچہ گلائکن کا تجزیہ گلائکن کی ساخت کے جامع تجزیہ کے لیے ایک مفید ٹول ثابت ہوا ہے، لیکن اینٹی باڈی طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے پانی میں گھلنشیل کم ڈی پی اولیگوساکرائیڈز کا اندازہ لگانا مشکل ہے۔5-10 kDa سے کم مالیکیولر وزن والے چھوٹے DP oligosaccharides ELISA پلیٹس 33, 34 سے منسلک نہیں ہوتے ہیں اور اینٹی باڈی کے اضافے سے پہلے دھل جاتے ہیں۔
یہاں، پہلی بار، ہم مونوکلونل اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے ایوڈن لیپت پلیٹوں پر ایک ایلیسا پرکھ کا مظاہرہ کرتے ہیں، جس میں حل پذیر ریفریکٹری اولیگوساکرائڈز کے لیے ایک قدمی بایوٹینیلیشن طریقہ کار کو گلائیکوم تجزیہ کے ساتھ ملایا جاتا ہے۔Glycome تجزیہ کے لیے ہمارے نقطہ نظر کو MALDI-TOF-MS اور GC-MS پر مبنی تکمیلی oligosaccharide روابط کے تجزیے کے ذریعے Trimethylsilyl (TMS) ہائیڈولائزڈ شوگر کمپوزیشن سے اخذ کیا گیا تھا۔اس اختراعی نقطہ نظر کو مستقبل میں ایک ہائی تھرو پٹ طریقہ کے طور پر تیار کیا جا سکتا ہے اور بائیو میڈیکل ریسرچ میں وسیع تر اطلاق تلاش کیا جا سکتا ہے۔
انزائمز اور اینٹی باڈیز کی ترجمہ کے بعد کی تبدیلیاں، جیسے گلائکوسیلیشن، ان کی حیاتیاتی سرگرمی کو متاثر کرتی ہیں۔مثال کے طور پر، سیرم پروٹین کے گلائکوسیلیشن میں تبدیلیاں سوزش گٹھیا میں اہم کردار ادا کرتی ہیں، اور گلائکوسیلیشن میں تبدیلیوں کو تشخیصی مارکر کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔لٹریچر میں مختلف قسم کے گلائیکینز کے آسانی سے مختلف بیماریوں میں ظاہر ہونے کی اطلاع دی گئی ہے، بشمول معدے اور جگر کی دائمی سوزش کی بیماریاں، وائرل انفیکشن، ڈمبگرنتی، چھاتی، اور پروسٹیٹ کینسر38,39,40۔اینٹی باڈی پر مبنی گلیکان ELISA طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے گلائکین کی ساخت کو سمجھنا پیچیدہ MS طریقوں کے استعمال کے بغیر بیماری کی تشخیص میں اضافی اعتماد فراہم کرے گا۔
ہمارے پچھلے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ ضدی oligosaccharides pretreatment اور enzymatic hydrolysis (شکل 1) کے بعد غیر ہائیڈولائزڈ رہے۔ہمارے پہلے شائع شدہ کام میں، ہم نے AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8 سے oligosaccharides کو الگ تھلگ کرنے کے لیے ایک فعال چارکول ٹھوس فیز نکالنے کا طریقہ تیار کیا۔ابتدائی نکالنے اور علیحدگی کے بعد، oligosaccharides کو سائز کے اخراج کرومیٹوگرافی (SEC) کے ذریعے مزید تقسیم کیا گیا اور سالماتی وزن کی ترتیب میں جمع کیا گیا۔شوگر کی ساخت کے تجزیہ کے ذریعہ مختلف پریٹریٹمنٹس سے جاری شوگر مونومر اور اولیگومر کا تجزیہ کیا گیا۔علاج کے مختلف طریقوں سے حاصل کردہ شوگر اولیگومر کے مواد کا موازنہ کرتے وقت، ضدی oligosaccharides کی موجودگی بائیو ماس کو مونوساکرائیڈز میں تبدیل کرنے میں ایک عام مسئلہ ہے اور چینی کی پیداوار میں کم از کم 10-15% اور یہاں تک کہ 18% تک کمی کا باعث بن سکتی ہے۔USیہ طریقہ oligosaccharide فریکشنز کی مزید بڑے پیمانے پر پیداوار کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔اس کام میں oligosaccharides کی خصوصیت کے لیے تجرباتی مواد کے طور پر مختلف مالیکیولر وزن کے ساتھ نتیجے میں آنے والے ACH اور اس کے بعد کے حصے استعمال کیے گئے۔
پری ٹریٹمنٹ اور انزیمیٹک ہائیڈولیسس کے بعد، مستقل اولیگوساکرائڈز غیر ہائیڈولائزڈ رہے۔یہاں (A) ایک oligosaccharide علیحدگی کا طریقہ ہے جس میں oligosaccharides کو AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) سے ایکٹیویٹڈ کاربن اور diatomaceous ارتھ کے پیکڈ بیڈ کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کیا جاتا ہے۔(B) oligosaccharides کو الگ کرنے کا طریقہ۔oligosaccharides کو سائز کے اخراج کرومیٹوگرافی (SEC) کے ذریعے مزید الگ کیا گیا تھا۔(C) Saccharide monomers اور oligomers جو مختلف pretreatments سے جاری ہوتے ہیں (پتلا ہوا تیزاب: DA، ionic liquid: IL اور AFEX)۔انزیمیٹک ہائیڈولیسس حالات: 25% (w/w) کی زیادہ ٹھوس لوڈنگ (تقریباً 8% glucan لوڈنگ)، 96 گھنٹے ہائیڈرولیسس، 20 mg/g کمرشل انزائم لوڈنگ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 تناسب) اور (D) شوگر اور شوگرز سے جاری ہونے والی شوگرز، 200000000000000000000000000000000000000000000000000000000 گرام EX پری ٹریٹڈ کارن سٹور (ACS)۔
Glycan تجزیہ ٹھوس بایوماس کی باقیات سے الگ تھلگ عرقوں میں glycans کے جامع ساختی تجزیہ کے لیے ایک مفید ذریعہ ثابت ہوا ہے۔تاہم، اس روایتی طریقہ41 کو استعمال کرتے ہوئے پانی میں گھلنشیل سیکرائیڈز کو کم پیش کیا جاتا ہے کیونکہ کم مالیکیولر ویٹ اولیگوساکرائڈز کا ELISA پلیٹوں پر متحرک ہونا مشکل ہوتا ہے اور اینٹی باڈی کے اضافے سے پہلے ان کو دھو دیا جاتا ہے۔لہذا، اینٹی باڈی بائنڈنگ اور خصوصیت کے لیے، ایک قدمی بایوٹینیلیشن کا طریقہ استعمال کیا گیا تاکہ avidin-coated ELISA پلیٹوں پر گھلنشیل، غیر موافق اولیگوساکرائڈز کو کوٹ کیا جا سکے۔اس طریقہ کا تجربہ ہمارے پہلے تیار کردہ ACSH اور اس کے مالیکیولر وزن (یا پولیمرائزیشن کی ڈگری، DP) کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔کاربوہائیڈریٹ (تصویر 2) کے کم کرنے والے سرے میں بایوٹین-LC-ہائیڈرازائڈ شامل کرکے اولیگوساکرائڈ بائنڈنگ وابستگی کو بڑھانے کے لیے ایک قدمی بایوٹینیلیشن کا استعمال کیا گیا۔حل میں، کم کرنے والے سرے پر hemiacetal گروپ بائیوٹن-LC-hydrazide کے hydrazide گروپ کے ساتھ ایک ہائیڈرازون بانڈ بنانے کے لیے رد عمل ظاہر کرتا ہے۔کم کرنے والے ایجنٹ NaCNBH3 کی موجودگی میں، ہائیڈرازون بانڈ ایک مستحکم بایوٹینیلیٹڈ اینڈ پروڈکٹ تک کم ہو جاتا ہے۔شوگر کو کم کرنے والے سرے میں ترمیم کے ساتھ، کم ڈی پی اولیگوساکرائڈز کا ELISA پلیٹوں پر پابند ہونا ممکن ہو گیا، اور ہمارے مطالعے میں یہ گلائکن ٹارگٹڈ ایم اے بی ایس کا استعمال کرتے ہوئے ایوڈین لیپت پلیٹوں پر کیا گیا۔
بایوٹینیلیٹڈ اولیگوساکرائڈز کے لیے ELISA پر مبنی مونوکلونل اینٹی باڈیز کی اسکریننگ۔یہاں (A) oligosaccharides کی مشترکہ بایوٹینیلیشن اور اس کے بعد ELISA اسکریننگ NeutrAvidin لیپت پلیٹوں پر گلائکن ٹارگٹڈ mAbs کے ساتھ اور (B) رد عمل کی مصنوعات کے بایوٹینیلیشن کے لیے ایک قدمی طریقہ کار کو ظاہر کرتی ہے۔
oligosaccharide-conjugated antibodies کے ساتھ Avidin-coated پلیٹوں کو پھر پرائمری اور سیکنڈری اینٹی باڈیز میں شامل کیا گیا اور ہلکے اور وقت کے لحاظ سے حساس میڈیم میں دھویا گیا۔اینٹی باڈی بائنڈنگ مکمل ہونے کے بعد، پلیٹ کو انکیوبیٹ کرنے کے لیے TMB سبسٹریٹ شامل کریں۔سلفیورک ایسڈ کے ساتھ رد عمل کو بالآخر روک دیا گیا۔اینٹی باڈی سے مخصوص کراس لنکنگ کا پتہ لگانے کے لئے ہر اینٹی باڈی کی پابند طاقت کا تعین کرنے کے لئے ایلیسا ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے انکیوبیٹڈ پلیٹوں کا تجزیہ کیا گیا۔تجربے کی تفصیلات اور پیرامیٹرز کے لیے، متعلقہ سیکشن "مواد اور طریقے" دیکھیں۔
ہم ACSH میں موجود حل پذیر oligosaccharides کے ساتھ ساتھ lignocellulosic hydrolysates سے الگ تھلگ خام اور پیوریفائیڈ oligosaccharides کی خصوصیات کے ذریعے مخصوص ایپلی کیشنز کے لیے اس نئے تیار کردہ طریقہ کی افادیت کا مظاہرہ کرتے ہیں۔جیسا کہ شکل 3 میں دکھایا گیا ہے، ACSH میں بائیوسیلیٹڈ گلائکوم پرکھ کے طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے سب سے زیادہ عام ایپیٹوپ کے متبادل زائلان کی نشاندہی کی گئی ہے جو عام طور پر یورونک (U) یا میتھیلورونک (MeU) اور پیکٹک عربینوگالیکٹانس ہیں۔ان میں سے زیادہ تر غیر ہائیڈرولائزڈ سالڈز (UHS) 43 کے گلائکین کے تجزیہ پر ہمارے پچھلے مطالعے میں بھی پائے گئے تھے۔
ایک مونوکلونل اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے ریکلسیٹرینٹ اولیگوساکرائڈ ایپیٹوپس کا پتہ لگانا جو سیل وال گلائکن کی طرف جاتا ہے۔"غیر جانبدار" فریکشن ACN فریکشن ہے اور "تیزابی" فریکشن FA فریکشن ہے۔ہیٹ میپ پر روشن سرخ رنگ اعلی درجے کے مواد کی نشاندہی کرتے ہیں، اور روشن بلیوز خالی پس منظر کی نشاندہی کرتے ہیں۔پیمانے پر رنگین قدریں فارمولیشنز N=2 کے لیے خام OD قدروں پر مبنی ہیں۔اینٹی باڈیز کے ذریعہ پہچانے جانے والے اہم ایپیٹوپس دائیں طرف دکھائے گئے ہیں۔
ان غیر سیلولوز ڈھانچے کو آزمائشی تجارتی انزائم مرکب میں سب سے زیادہ عام سیلولیز اور ہیمسیلولیسز کے ذریعے کلیو نہیں کیا جا سکتا، جس میں سب سے زیادہ استعمال ہونے والے تجارتی خامروں کو شامل کیا جاتا ہے۔لہذا، ان کے ہائیڈرولیسس کے لئے نئے معاون خامروں کی ضرورت ہے۔ضروری غیر سیلولوز آلات کے خامروں کے بغیر، یہ غیر سیلولوز بانڈز مونوساکرائڈز میں مکمل تبدیلی کو روکتے ہیں، یہاں تک کہ اگر ان کے پیرنٹ شوگر پولیمر بڑے پیمانے پر چھوٹے چھوٹے ٹکڑوں میں ہائیڈولائز کیے گئے ہوں اور تجارتی انزائم مرکب کا استعمال کرتے ہوئے تحلیل کیے جائیں۔
سگنل کی تقسیم اور اس کی بائنڈنگ طاقت کے مزید مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ بائنڈنگ ایپیٹوپس ہائی ڈی پی شوگر فریکشنز (A, B, C, DP 20+ تک) میں کم ڈی پی فریکشنز (D, E, F, DP) dimers میں کم تھے) (تصویر 1)۔غیر سیلولوز ایپیٹوپس میں غیر جانبدار ٹکڑوں کے مقابلے تیزاب کے ٹکڑے زیادہ عام ہیں۔یہ مظاہر ہمارے پچھلے مطالعے میں مشاہدہ کیے گئے پیٹرن سے مطابقت رکھتے ہیں، جہاں ہائی ڈی پی اور ایسڈ موئیٹیز انزیمیٹک ہائیڈولیسس کے لیے زیادہ مزاحم تھے۔لہذا، غیر سیلولوز گلائکن ایپیٹوپس اور U اور MeU متبادل کی موجودگی oligosaccharides کے استحکام میں بہت زیادہ حصہ ڈال سکتی ہے۔واضح رہے کہ کم DP oligosaccharides کے لیے پابند اور پتہ لگانے کی کارکردگی مشکل ہو سکتی ہے، خاص طور پر اگر ایپیٹوپ ایک dimeric یا trimeric oligosaccharide ہو۔اس کا تجربہ مختلف لمبائیوں کے کمرشل اولیگوساکرائڈز کا استعمال کرتے ہوئے کیا جا سکتا ہے، ہر ایک میں صرف ایک ایپیٹوپ ہوتا ہے جو ایک مخصوص ایم اے بی سے منسلک ہوتا ہے۔
اس طرح، ساخت سے متعلق مخصوص اینٹی باڈیز کے استعمال سے بعض قسم کے ریکلیٹرینٹ بانڈز کا انکشاف ہوا۔استعمال شدہ اینٹی باڈی کی قسم، مناسب ligation پیٹرن، اور اس سے پیدا ہونے والے سگنل کی طاقت (زیادہ سے زیادہ اور کم از کم) پر منحصر ہے، نئے انزائمز کی شناخت کی جا سکتی ہے اور مزید مکمل گلائکو کنورژن کے لیے انزائم مرکب میں نیم مقدار میں شامل کیے جا سکتے ہیں۔مثال کے طور پر ACSH oligosaccharides کے تجزیہ کو لے کر، ہم ہر بایوماس مواد کے لیے glycan بانڈز کا ڈیٹا بیس بنا سکتے ہیں۔یہاں یہ واضح رہے کہ اینٹی باڈیز کی مختلف وابستگی کو مدنظر رکھا جانا چاہیے، اور اگر ان کا تعلق معلوم نہ ہو، تو یہ مختلف اینٹی باڈیز کے سگنلز کا موازنہ کرتے وقت کچھ مشکلات پیدا کرے گا۔اس کے علاوہ، گلیکن بانڈز کا موازنہ ایک ہی اینٹی باڈی کے نمونوں کے درمیان بہترین کام کر سکتا ہے۔ان ضدی بانڈز کو پھر CAZyme ڈیٹا بیس سے جوڑا جا سکتا ہے، جس سے ہم انزائمز کی شناخت کر سکتے ہیں، امیدوار انزائمز کا انتخاب کر سکتے ہیں اور بانڈ توڑنے والے انزائمز کے لیے ٹیسٹ کر سکتے ہیں، یا بائیو ریفائنریز میں استعمال کے لیے ان انزائمز کو ظاہر کرنے کے لیے مائکروبیل سسٹم تیار کر سکتے ہیں۔
اس بات کا جائزہ لینے کے لیے کہ کس طرح امیونولوجیکل طریقے lignocellulosic hydrolysates میں موجود کم مالیکیولر ویٹ oligosaccharides کی خصوصیت کے لیے متبادل طریقوں کی تکمیل کرتے ہیں، ہم نے MALDI (تصویر 4، S1-S8) اور اسی پینل پر GC-MS کی بنیاد پر TMS سے ماخوذ سیکرائڈز کا تجزیہ کیا (تصویر 5)۔MALDI کا استعمال اس بات کا موازنہ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے کہ آیا oligosaccharide مالیکیولز کی بڑے پیمانے پر تقسیم مطلوبہ ساخت سے میل کھاتی ہے۔انجیر پر۔4 غیر جانبدار اجزاء ACN-A اور ACN-B کا MC دکھاتا ہے۔ACN-A تجزیہ نے DP 4–8 (تصویر 4) سے لے کر DP 22 (تصویر S1) تک پینٹوز شکر کی ایک رینج کی تصدیق کی، جس کا وزن MeU-xylan oligosaccharides سے مطابقت رکھتا ہے۔ACN-B تجزیہ نے DP 8-15 کے ساتھ پینٹوز اور گلوکوکسیلان سیریز کی تصدیق کی۔اضافی مواد جیسے کہ Figure S3 میں، FA-C امیڈک موئیٹی ماس ڈسٹری بیوشن کے نقشے 8-15 کے DP کے ساتھ (Me)U متبادل پینٹوز شکروں کی ایک رینج دکھاتے ہیں جو ELISA پر مبنی mAb اسکریننگ میں پائے جانے والے متبادل زائلان سے مطابقت رکھتے ہیں۔ایپیٹوپس مستقل ہیں۔
ACS میں موجود گھلنشیل نان کمپلائنٹ oligosaccharides کا MALDI-MS سپیکٹرم۔یہاں، (A) ACN-A کم وزن کے رینج والے حصے جن میں میتھلیٹیڈ یورونک ایسڈ (DP 4-8) کی جگہ گلوکوروکسلان اولیگوساکرائڈز اور (B) ACN-B xylan اور میتھلیٹڈ یورونک ایسڈ oligosaccharides کو glucuroxylan (DP 8-15) کے ساتھ تبدیل کیا گیا ہے۔
ریفریکٹری oligosaccharides کے گلائکن باقیات کی ساخت کا تجزیہ۔یہاں (A) GC-MS تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ مختلف oligosaccharide فریکشنز کی TMS saccharide کی ترکیب۔(B) oligosaccharides میں موجود مختلف TMS سے ماخوذ شکر کی ساخت۔ACN - acetonitrile فریکشن جس میں نیوٹرل oligosaccharides ہوتے ہیں اور FA - فیرولک ایسڈ فریکشن جس میں ایسڈ oligosaccharides ہوتا ہے۔
اولیگوساکرائیڈ فریکشن کے LC-MS تجزیہ سے ایک اور دلچسپ نتیجہ اخذ کیا گیا، جیسا کہ شکل S9 میں دکھایا گیا ہے (طریقے الیکٹرانک ضمنی مواد میں دیکھے جا سکتے ہیں)۔ACN-B فریکشن کے ligation کے دوران ہیکسوز اور -OAc گروپس کے ٹکڑے بار بار دیکھے گئے۔یہ کھوج نہ صرف گلائکوم اور مالڈی ٹوف تجزیہ میں مشاہدہ شدہ ٹکڑے کی تصدیق کرتی ہے، بلکہ پریٹریٹڈ lignocellulosic بایوماس میں ممکنہ کاربوہائیڈریٹ مشتقات کے بارے میں نئی ​​معلومات بھی فراہم کرتی ہے۔
ہم نے ٹی ایم ایس شوگر ڈیریویٹائزیشن کا استعمال کرتے ہوئے اولیگوساکرائڈ فریکشن کی شوگر کی ترکیب کا بھی تجزیہ کیا۔GC-MS کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے oligosaccharide فریکشن (تصویر 5) میں عصبی (غیر مشتق) اور تیزابی شکر (GluA اور GalA) کی ترکیب کا تعین کیا۔Glucuronic ایسڈ تیزابیت والے اجزاء C اور D میں پایا جاتا ہے، جب کہ galacturonic ایسڈ تیزابی اجزاء A اور B میں پایا جاتا ہے، یہ دونوں تیزابی شکر کے ہائی ڈی پی اجزاء ہیں۔یہ نتائج نہ صرف ہمارے ELISA اور MALDI ڈیٹا کی تصدیق کرتے ہیں بلکہ oligosaccharide کے جمع ہونے کے ہمارے پچھلے مطالعات سے بھی مطابقت رکھتے ہیں۔لہذا، ہم سمجھتے ہیں کہ oligosaccharides کے بائیوٹینیلیشن اور اس کے بعد ELISA اسکریننگ کا استعمال کرتے ہوئے جدید امیونولوجیکل طریقے مختلف حیاتیاتی نمونوں میں گھلنشیل ریکلسیٹرینٹ oligosaccharides کا پتہ لگانے کے لیے کافی ہیں۔
چونکہ ELISA پر مبنی mAb اسکریننگ کے طریقوں کو کئی مختلف طریقوں سے توثیق کیا گیا ہے، اس لیے ہم اس نئے مقداری طریقہ کی صلاحیت کو مزید دریافت کرنا چاہتے تھے۔دو تجارتی oligosaccharides، xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) اور 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX)، سیل وال گلائکن کو نشانہ بنانے والے ایک نئے ایم اے بی اپروچ کا استعمال کرتے ہوئے خریدے اور جانچے گئے۔شکل 6 بایوٹینیلیٹڈ بائنڈنگ سگنل اور اولیگوساکرائڈ ارتکاز کے لاگ ارتکاز کے درمیان ایک لکیری ارتباط کو ظاہر کرتا ہے، ممکنہ لینگموئیر جذب ماڈل کی تجویز کرتا ہے۔mAbs میں، CCRC-M137، CCRC-M138، CCRC-M147، CCRC-M148، اور CCRC-M151 XHE کے ساتھ منسلک ہیں، اور CCRC-M108، CCRC-M109، اور LM11 کا تعلق A2XX سے 1 سے 10 منٹ تک ہے۔تجربے کے دوران اینٹی باڈیز کی محدود دستیابی کی وجہ سے، ہر اولیگوساکرائڈ ارتکاز کے ساتھ محدود تجربات کیے گئے۔یہاں یہ بات ذہن نشین کر لینی چاہیے کہ کچھ اینٹی باڈیز ایک ہی اولیگوساکرائیڈ پر سبسٹریٹ کے طور پر بہت مختلف رد عمل کا اظہار کرتی ہیں، غالباً اس لیے کہ وہ قدرے مختلف ایپیٹوپس سے منسلک ہوتے ہیں اور ان میں بہت مختلف پابند وابستگی ہو سکتی ہے۔جب نئے ایم اے بی اپروچ کو حقیقی نمونوں پر لاگو کیا جائے گا تو درست ایپیٹوپ شناخت کے طریقہ کار اور مضمرات بہت زیادہ پیچیدہ ہوں گے۔
دو تجارتی اولیگوساکرائڈس کا استعمال مختلف گلیکن کو نشانہ بنانے والے ایم اے بی کی کھوج کی حد کا تعین کرنے کے لئے کیا گیا تھا۔یہاں، oligosaccharide ارتکاز کے لاگ ارتکاز کے ساتھ لکیری ارتباط (A) mAb کے ساتھ XHE اور mAb کے ساتھ A2XX کے لیے Langmuir ادسورپشن پیٹرن کی نشاندہی کرتا ہے۔متعلقہ ایپیٹوپس پرکھ میں سبسٹریٹس کے طور پر استعمال ہونے والے تجارتی oligosaccharides کے ڈھانچے کی نشاندہی کرتے ہیں۔
گلائکن ٹارگٹڈ مونوکلونل اینٹی باڈیز (گلائکوکومک تجزیہ یا ایلیسا پر مبنی ایم اے بی اسکریننگ) کا استعمال زیادہ تر بڑے سیل وال گلائکینز کی گہرائی سے خصوصیت کے لیے ایک طاقتور ٹول ہے جو پودوں کا بایوماس بناتے ہیں۔تاہم، کلاسیکی گلائکن تجزیہ صرف بڑے سیل وال گلائکین کی خصوصیت کرتا ہے، کیونکہ زیادہ تر اولیگوساکرائڈز ELISA پلیٹوں پر موثر طریقے سے متحرک نہیں ہوتے ہیں۔اس تحقیق میں، AFEX-pretreated کارن سٹور کو اعلی ٹھوس مواد پر انزائمی طور پر ہائیڈولائز کیا گیا تھا۔شوگر کے تجزیے کا استعمال ہائیڈولائیزیٹ میں ریکلسیٹرینٹ سیل وال کاربوہائیڈریٹس کی ساخت کا تعین کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔تاہم، ہائیڈروالیسیٹس میں چھوٹے oligosaccharides کے mAb تجزیہ کو کم سمجھا جاتا ہے، اور ELISA پلیٹوں پر oligosaccharides کو مؤثر طریقے سے متحرک کرنے کے لیے اضافی ٹولز کی ضرورت ہوتی ہے۔
ہم یہاں oligosaccharide biotinylation کو ملا کر ایم اے بی اسکریننگ کے لیے ایک نیا اور موثر oligosaccharide immobilization طریقہ بتاتے ہیں جس کے بعد ELISA اسکریننگ NeutrAvidin™ لیپت پلیٹوں پر کی جاتی ہے۔متحرک بایوٹینیلیٹڈ اولیگوساکرائڈس نے اینٹی باڈی کے لئے کافی وابستگی کا مظاہرہ کیا تاکہ ریکیٹرینٹ اولیگوساکرائڈس کی تیز رفتار اور موثر شناخت کو ممکن بنایا جاسکے۔ماس اسپیکٹومیٹری پر مبنی ان ضدی اولیگوساکرائڈز کی ساخت کے تجزیے نے امیونو اسکریننگ کے اس نئے نقطہ نظر کے نتائج کی تصدیق کی۔اس طرح، یہ مطالعات یہ ظاہر کرتے ہیں کہ گلیکن ٹارگٹڈ مونوکلونل اینٹی باڈیز کے ساتھ oligosaccharide biotinylation اور ELISA اسکریننگ کا امتزاج oligosaccharides میں کراس لنکس کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے اور oligosaccharides کی ساخت کو نمایاں کرنے والے دیگر بائیو کیمیکل مطالعات میں بڑے پیمانے پر لاگو کیا جا سکتا ہے۔
یہ بایوٹین پر مبنی گلائکن پروفائلنگ کا طریقہ پہلی رپورٹ ہے جو پلانٹ کے بایوماس میں گھلنشیل اولیگوساکرائڈز کے ریکلسیٹرینٹ کاربوہائیڈریٹ بانڈز کی تحقیقات کرنے کے قابل ہے۔اس سے یہ سمجھنے میں مدد ملتی ہے کہ جب بائیو فیول کی پیداوار کی بات آتی ہے تو بائیو ماس کے کچھ حصے اتنے ضدی کیوں ہوتے ہیں۔یہ طریقہ glycome تجزیہ کے طریقوں میں ایک اہم خلا کو پُر کرتا ہے اور اس کے اطلاق کو پودوں کے oligosaccharides سے آگے سبسٹریٹس کی وسیع رینج تک پھیلا دیتا ہے۔مستقبل میں، ہم بائیوٹینیلیشن کے لیے روبوٹکس استعمال کر سکتے ہیں اور ELISA کا استعمال کرتے ہوئے نمونوں کے ہائی تھرو پٹ تجزیہ کے لیے جو طریقہ ہم نے تیار کیا ہے اسے استعمال کر سکتے ہیں۔
پائنیر 33A14 ہائبرڈ بیجوں سے اگائے گئے کارن اسٹرا (CS) کو 2010 میں رے، کولوراڈو کے کریمر فارمز سے کاٹا گیا تھا۔زمیندار کی اجازت سے اس بایوماس کو تحقیق کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ نمونے کمرے کے درجہ حرارت میں زپ لاک بیگ میں خشک <6% نمی کے ساتھ محفوظ کیے گئے تھے۔ نمونے کمرے کے درجہ حرارت میں زپ لاک بیگ میں خشک <6% نمی کے ساتھ محفوظ کیے گئے تھے۔ Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. نمونے کو کمرے کے درجہ حرارت پر زپ شدہ تھیلوں میں <6% نمی پر خشک رکھا گیا تھا۔样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%۔ نمونے زپر بیگ میں کمرے کے درجہ حرارت پر نمی <6% کے ساتھ محفوظ کیے جاتے ہیں۔مطالعہ مقامی اور قومی رہنما خطوط کی تعمیل کرتا ہے۔ساختی تجزیہ NREL پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔اس مرکب میں 31.4% گلوکن، 18.7% زائلان، 3.3% عربین، 1.2% گیلیکٹن، 2.2% ایسٹیل، 14.3% لگنن، 1.7% پروٹین اور 13.4% راکھ پائی گئی۔
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) Novozymes (Franklinton, NC, USA) سے cellulase, β-glucosidase اور Cellic® HTec2 (157 mg پروٹین/ml, lot VHN00001) کا ایک پیچیدہ مرکب ہے۔ملٹی فیکٹ پیکٹینیس® (72 ملی گرام پروٹین/ایم ایل)، پیکٹین ڈیگریجنگ انزائمز کا ایک پیچیدہ مرکب، ڈوپونٹ انڈسٹریل بائیو سائنسز (پالو آلٹو، سی اے، یو ایس اے) کے ذریعے عطیہ کیا گیا تھا۔Kjeldahl نائٹروجن تجزیہ (AOAC طریقہ 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کے مواد کا تخمینہ لگا کر (اور نان پروٹین نائٹروجن کی شراکت کو گھٹا کر) انزائم پروٹین کی تعداد کا تعین کیا گیا تھا۔Diatomaceous Earth 545 EMD ملی پور (Billerica، MA) سے خریدا گیا تھا۔ایکٹیویٹڈ کاربن (DARCO، 100 میش گرینولز)، Avicel (PH-101)، beech xylan، اور دیگر تمام کیمیکلز Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) سے خریدے گئے تھے۔
AFEX پریٹریٹمنٹ GLBRC (بایوماس کنورژن ریسرچ لیبارٹری، MSU، Lansing، MI، USA) میں کیا گیا۔پری ٹریٹمنٹ 140 ° C پر 15 منٹ کے لیے کیا گیا۔ایک سٹینلیس سٹیل بینچ ٹاپ بیچ ری ایکٹر (Parr Instruments Company) میں 60% (w/w) لوڈنگ پر اینہائیڈروس امونیا اور بائیو ماس کے 1:1 کے تناسب پر 46 رہائش کا وقت۔اس میں 30 منٹ لگے۔ری ایکٹر کو 140 ° C پر لایا گیا اور امونیا کو تیزی سے خارج کیا گیا، جس سے بایوماس تیزی سے کمرے کے درجہ حرارت پر واپس آ گیا۔AFEX پری ٹریٹڈ کارن سٹور (ACS) کی ساخت غیر علاج شدہ کارن سٹور (UT-CS) کی طرح تھی۔
ہائی ٹھوس ACSH 25% (w/w) (تقریباً 8% dextran لوڈنگ) oligosaccharides کی بڑے پیمانے پر پیداوار کے لیے ابتدائی مواد کے طور پر تیار کیا گیا تھا۔ACS کا انزیمیٹک ہائیڈولیسس ایک تجارتی انزائم مرکب کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا جس میں Cellic® Ctec2 10 mg پروٹین/g glucan (pretreated biomass میں)، Htec2 (Novozimes، Franklinton, NC)، 5 mg پروٹین/g glucan، اور Multifect Pectinase (Gencor Inc, USA) شامل ہیں۔)۔)، 5 ملی گرام پروٹین/جی ڈیکسٹران۔انزیمیٹک ہائیڈولیسس 5-لیٹر بائیوریکٹر میں 3 لیٹر، پی ایچ 4.8، 50 ° C اور 250 rpm کے کام کرنے والے حجم کے ساتھ کیا گیا تھا۔96 گھنٹے تک ہائیڈولیسس کے بعد، ہائیڈرولائزیٹ کو 6000 rpm پر 30 منٹ کے لیے سینٹرفیوگریشن کے ذریعے اور پھر 14000 rpm پر 30 منٹ کے لیے غیر ہائیڈرولائزڈ ٹھوس کو ہٹانے کے لیے جمع کیا گیا۔اس کے بعد ہائیڈرولائزیٹ کو 0.22 ملی میٹر فلٹر بیکر کے ذریعے جراثیم سے پاک فلٹریشن کا نشانہ بنایا گیا۔فلٹر شدہ ہائیڈولائزیٹ کو جراثیم سے پاک بوتلوں میں 4 ° C پر محفوظ کیا جاتا تھا اور پھر کاربن پر تقسیم کیا جاتا تھا۔
این آر ای ایل لیبارٹری تجزیہ کے طریقہ کار کے مطابق ایکسٹریکٹ پر مبنی بائیو ماس کے نمونوں کی ساخت کا تجزیہ: کمپوزیشن تجزیہ کے لیے نمونوں کی تیاری (NREL/TP-510-42620) اور بایوماس میں ساختی کاربوہائیڈریٹ اور لگنن کا تعین (NREL/TP-510) - 4718۔
ہائیڈولائزیٹ اسٹریم کا اولیگوساکرائڈ تجزیہ آٹوکلیو پر مبنی ایسڈ ہائیڈولیسس طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے 2 ملی لیٹر پیمانے پر کیا گیا تھا۔ہائیڈرولائزیٹ کے نمونے کو 10 ملی لیٹر اسکرو کیپ کلچر ٹیوب میں 69.7 µl 72% سلفیورک ایسڈ کے ساتھ مکس کریں اور 121 ° C پر بینچ ٹاپ پر 1 گھنٹہ تک انکیوبیٹ کریں، برف پر ٹھنڈا کریں اور ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (HPLC) شیشی میں فلٹر کریں۔oligosaccharides کے ارتکاز کا تعین غیر ہائیڈولائزڈ نمونے میں monosaccharides کے ارتکاز کو تیزاب ہائیڈولائزڈ نمونے میں شوگر کے کل ارتکاز سے گھٹا کر کیا گیا تھا۔
ایسڈ ہائیڈولائزڈ بائیو ماس میں گلوکوز، زائلوز اور عربینوز کی تعداد کا تجزیہ بائیو ریڈ امینیکس HPX-87H کالم پر آٹو سیمپلر، کالم ہیٹر، آئسوکریٹک پمپ، اور ریفریکٹیو انڈیکس ڈیٹیکٹر سے لیس شیمادزو HPLC سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔کالم کو 50 ° C پر برقرار رکھا گیا تھا اور پانی میں 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 کے ساتھ خارج کیا گیا تھا۔بہاؤ
ہائیڈرولائزیٹ سپرنٹنٹ کو مونومر اور اولیگوساکرائڈ مواد کے لئے پتلا اور تجزیہ کیا گیا تھا۔انزیمیٹک ہائیڈولیسس کے بعد حاصل ہونے والی مونومیرک شکروں کا تجزیہ HPLC نے بائیو ریڈ (Hercules, CA) Aminex HPX-87P کالم اور ایک ایش گارڈ کالم سے کیا تھا۔کالم کا درجہ حرارت 80 ° C پر برقرار رکھا گیا تھا، پانی کو موبائل فیز کے طور پر 0.6 ملی لیٹر فی منٹ کے بہاؤ کی شرح کے ساتھ استعمال کیا گیا تھا۔Oligosaccharides کا تعین ریف میں بیان کردہ طریقوں کے مطابق 121 ° C پر پتلا تیزاب میں ہائیڈولیسس کے ذریعے کیا گیا تھا۔41، 48، 49۔
پہلے بیان کردہ طریقہ کار 27، 43، 50، 51 کا استعمال کرتے ہوئے سیکرائڈ تجزیہ خام، AFEX سے پہلے سے علاج شدہ اور تمام غیر ہائیڈرولائزڈ بایوماس باقیات (بشمول سیریل سیل وال ایکسٹریکٹس کی تیاری اور ان کی ایم اے بی اسکریننگ) پر کیا گیا تھا۔گلائکوم کے تجزیہ کے لیے، پودوں کے خلیوں کی دیوار کے مواد کی الکحل میں حل نہ ہونے والی باقیات کو بائیو ماس کی باقیات سے تیار کیا جاتا ہے اور تیزی سے جارحانہ ری ایجنٹس جیسے امونیم آکسالیٹ (50 mM)، سوڈیم کاربونیٹ (50 mM اور 0.5% w/v)، CON کے ساتھ سیریل نکالنے کا نشانہ بنایا جاتا ہے۔(1M اور 4M، دونوں 1% w/v سوڈیم بوروہائیڈرائڈ کے ساتھ) اور ایسڈ کلورائٹ جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے52,53۔اس کے بعد نچوڑوں کو سیل وال گلائکن کی طرف ہدایت کردہ mAb50s کے ایک پیچیدہ پینل کے خلاف ELISA کا نشانہ بنایا گیا ، اور mAb بائنڈنگ رد عمل کو ہیٹ میپ کے طور پر پیش کیا گیا۔ایم اے بی ایس پلانٹ سیل وال گلائکن کو نشانہ بنانے والے لیبارٹری اسٹاک (سی سی آر سی، جے آئی ایم اور میک سیریز) سے خریدے گئے تھے۔
اولیگوساکرائڈز کا ایک قدمی بایوٹینیلیشن۔بایوٹین-LC-hydrazide کے ساتھ کاربوہائیڈریٹ کا جوڑ درج ذیل طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) کو dimethyl سلفوکسائیڈ (DMSO, 70 μl) میں 1 منٹ کے لیے 65° C. پر زوردار ہلچل اور گرم کرکے تحلیل کیا گیا۔گلیشیل ایسٹک ایسڈ (30 µl) شامل کیا گیا اور اس مرکب کو سوڈیم سیانوبورہائیڈرائڈ (6.4 ملی گرام/100 µmol) پر ڈالا گیا اور تقریباً 1 منٹ تک 65° C. پر گرم کرنے کے بعد مکمل طور پر تحلیل ہوگیا۔پھر، 5 سے 8 μl تک رد عمل کا مرکب خشک اولیگوساکرائیڈ (1-100 nmol) میں شامل کیا گیا تاکہ کم کرنے والے سرے پر لیبل کا 10 گنا یا اس سے زیادہ داڑھ حاصل کیا جا سکے۔رد عمل 65 ° C پر 2 گھنٹے کے لئے کیا گیا تھا ، جس کے بعد نمونے فوری طور پر صاف کردیئے گئے تھے۔بغیر کسی کمی کے لیبلنگ کے تجربات میں کوئی سوڈیم سیانوبورہائیڈرائڈ استعمال نہیں کیا گیا تھا، اور نمونوں کو 2.5 گھنٹے تک 65° C. پر رد عمل ظاہر کیا گیا تھا۔
بائیوٹینیلیٹڈ اولیگوساکرائڈس کے نمونوں کی ایلیسا کوٹنگ اور دھونا۔25 μl بایوٹینیلیٹڈ نمونے (ہر مرتکز نمونے کا 100 μl 5 ملی لیٹر 0.1 M Tris بفر سلوشن (TBS) میں پتلا ہوا) ایوڈین لیپت پلیٹ کے ہر کنویں میں شامل کیا گیا۔کنٹرول کنوؤں کو 0.1 M TBS میں 10 μg/ml کے ارتکاز میں 50 μl بایوٹین کے ساتھ لیپت کیا گیا تھا۔ڈیونائزڈ پانی کو خالی پیمائش کے لیے کوٹنگ کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا۔گولی اندھیرے میں کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے تک سیکی گئی تھی۔پروگرام نمبر کا استعمال کرتے ہوئے پلیٹ کو 0.1% سکمڈ دودھ کے ساتھ 0.1 M TBS میں 3 بار دھوئے۔گرینیئر فلیٹ 3A کے لیے 11۔
بنیادی اینٹی باڈیز کا اضافہ اور دھونا۔ہر کنویں میں 40 µl بنیادی اینٹی باڈی شامل کریں۔اندھیرے میں کمرے کے درجہ حرارت پر مائکروپلیٹ کو 1 گھنٹہ تک سینکیں۔اس کے بعد گرینیئر فلیٹ 3A کے لیے واش پروگرام #11 کا استعمال کرتے ہوئے پلیٹوں کو 0.1% دودھ کے ساتھ 0.1M TBS میں 3 بار دھویا گیا۔
ثانوی اینٹی باڈی شامل کریں اور دھو لیں۔ہر کنویں میں 50 µl ماؤس/چوہا سیکنڈری اینٹی باڈی (0.1 M TBS میں 0.1% دودھ میں 1:5000 پتلا) شامل کریں۔اندھیرے میں کمرے کے درجہ حرارت پر مائکروپلیٹ کو 1 گھنٹہ تک سینکیں۔اس کے بعد گرینیئر فلیٹ 5A پلیٹ واش پروگرام #12 کا استعمال کرتے ہوئے مائکرو پلیٹس کو 0.1 M TBS میں 0.1% دودھ سے 5 بار دھویا گیا۔
سبسٹریٹ شامل کرنا۔بیس سبسٹریٹ میں 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) شامل کریں (2 قطرے بفر، 3 قطرے TMB، 2 قطرے ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ کے 15 ملی لیٹر ڈیونائزڈ پانی میں شامل کرکے)۔TMB سبسٹریٹ تیار کریں۔اور استعمال سے پہلے بھنور)۔مائکروپلیٹ کو کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک سینکیں۔اندھیرے میں.
مرحلہ مکمل کریں اور گولی پڑھیں۔ہر کنویں میں 50 µl 1 N سلفرک ایسڈ شامل کریں اور ELISA ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے 450 سے 655 nm تک جذب کو ریکارڈ کریں۔
ڈیونائزڈ پانی میں ان تجزیہ کاروں کے 1 ملی گرام/ملی لیٹر حل تیار کریں: arabinose، rhamnose، fucose، xylose، galacturonic acid (GalA)، glucuronic acid (GlcA)، mannose، گلوکوز، galactose، lactose، N-acetylmanosamine (mantyNAllucosamine)،(glcNAc)، N-acetylgalactosamine (galNAc)، inositol (اندرونی معیار)۔جدول 1 میں دکھائے گئے 1 ملی گرام/ملی لیٹر چینی کے محلول کو شامل کرکے دو معیارات تیار کیے گئے تھے۔ نمونے منجمد کیے جاتے ہیں اور -80 ° C پر لائو فلائز کیے جاتے ہیں جب تک کہ تمام پانی ختم نہ ہو جائے (عام طور پر تقریباً 12-18 گھنٹے)۔
ایک تجزیاتی توازن پر کیپ ٹیوبوں کو سکرو کرنے کے لیے 100–500 µg نمونہ شامل کریں۔شامل کردہ رقم کو ریکارڈ کریں۔نمونے کو سالوینٹس کے مخصوص ارتکاز میں تحلیل کرنا اور اسے ٹیوب میں مائع الکوٹ کے طور پر شامل کرنا بہتر ہے۔ہر نمونہ ٹیوب کے لیے اندرونی معیار کے طور پر 20 μl 1 mg/ml inositol استعمال کریں۔نمونے میں داخلی معیار کی مقدار معیاری ٹیوب میں شامل کردہ داخلی معیار کی مقدار کے برابر ہونی چاہیے۔
ایک سکرو کیپ شیشی میں 8 ملی لیٹر اینہائیڈروس میتھانول شامل کریں۔پھر 3 N. میتھانولک HCl محلول کے 4 ملی لیٹر، کوپڈ اور ہلائیں۔اس عمل میں پانی استعمال نہیں ہوتا۔
اولیگوساکرائیڈ کے نمونوں اور معیاری TMS ٹیوبوں میں 500 µl 1 M HCl میتھانول محلول شامل کریں۔تھرمل بلاک میں نمونے راتوں رات (168 گھنٹے) 80 ° C پر لگائے گئے تھے۔میتھانولیسس پروڈکٹ کو کمرے کے درجہ حرارت پر خشک کرنے والی کئی گنا استعمال کرتے ہوئے خشک کریں۔200 μl MeOH شامل کریں اور دوبارہ خشک کریں۔یہ عمل دو بار دہرایا جاتا ہے۔نمونے میں 200 µl میتھانول، 100 µl پائریڈائن اور 100 µl ایسیٹک اینہائیڈرائڈ شامل کریں اور اچھی طرح مکس کریں۔نمونے کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک لگائے گئے تھے۔اور خشک.200 μl میتھانول شامل کریں اور دوبارہ خشک کریں۔
200 µl Tri-Sil شامل کریں اور 20 منٹ تک کیپ شدہ ٹیوب کو گرم کریں۔80 ° C، پھر کمرے کے درجہ حرارت پر ٹھنڈا کیا جاتا ہے۔نمونے کو تقریباً 50 µl کے حجم تک مزید خشک کرنے کے لیے کئی گنا خشک کرنے کا استعمال کریں۔یہ نوٹ کرنا ضروری ہے کہ ہم نے نمونوں کو مکمل طور پر خشک نہیں ہونے دیا۔
2 ملی لیٹر ہیکسین شامل کریں اور بھنور کے ذریعے اچھی طرح مکس کریں۔شیشے کی اون کو 5-3/4 انچ قطر کے پائپیٹ کے اوپر ڈال کر پاسچر پائپٹس (5-8 ملی میٹر) کے ٹپس کو شیشے کی اون کے ٹکڑے سے بھریں۔نمونے 2 منٹ کے لیے 3000 جی پر سینٹرفیوج کیے گئے۔کوئی بھی اگھلنشیل اوشیشوں کو تیز کیا جاتا ہے۔نمونے کو 100-150 μl تک خشک کریں۔تقریباً 1 μl کا حجم GC-MS میں 80 ° C کے ابتدائی درجہ حرارت اور 2.0 منٹ کے ابتدائی وقت پر لگایا گیا تھا (ٹیبل 2)۔