Дзякуй за наведванне Nature.com.Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем візуалізаваць сайт без стыляў і JavaScript.
Новыя імуналагічныя і мас-спектраметрычныя метады для комплекснага аналізу ўстойлівых алігацукрыдаў у кукурузнай печы, папярэдне апрацаванай AFEX.Лігнацэлюлозная біямаса з'яўляецца ўстойлівай альтэрнатывай выкапнёвым відам паліва і шырока выкарыстоўваецца для распрацоўкі біятэхналогій для вытворчасці прадуктаў харчавання, кармоў, паліва і хімічных рэчываў.Ключ да гэтых тэхналогій - распрацоўка эканамічна канкурэнтаздольных працэсаў пераўтварэння складаных вугляводаў, якія прысутнічаюць у клеткавых сценках раслін, у простыя цукру, такія як глюкоза, ксілоза і арабіноза.Паколькі лігнацэлюлозная біямаса вельмі ўстойлівая, яе трэба падвяргаць тэрмахімічнай апрацоўцы (напрыклад, адслаенне валакна аміякам (AFEX), разведзенымі кіслотамі (DA), іённымі вадкасцямі (IL)) і біялагічнай апрацоўцы (напрыклад, ферментатыўнаму гідролізу і мікробнай ферментацыі) у спалучэнні для атрымання патрэбнага прадукту..Аднак, калі камерцыйныя грыбковыя ферменты выкарыстоўваюцца ў працэсе гідролізу, толькі 75-85% растваральных цукроў, якія ўтвараюцца, з'яўляюцца монацукрыдамі, а астатнія 15-25% - растваральнымі, цяжкавырашальнымі алігацукрыдамі, якія не заўсёды даступныя для мікраарганізмаў.Раней мы паспяхова вылучылі і ачысцілі растваральныя ўстойлівыя алігацукрыды з дапамогай камбінацыі падзелу вугляроду і дыятомавай зямлі і эксклюзійнай храматаграфіі, а таксама даследавалі іх інгібіруючыя ўласцівасці ферментаў.Мы выявілі, што алігацукрыды, якія змяшчаюць метыляваныя замены уронавай кіслаты з больш высокай ступенню полімерызацыі (DP), цяжэй апрацоўваць камерцыйнымі сумесямі ферментаў, чым нізкі DP і нейтральныя алігацукрыды.Тут мы паведамляем аб выкарыстанні некалькіх дадатковых метадаў, у тым ліку прафілявання гліканаў з выкарыстаннем моноклональных антыцелаў (mAbs), спецыфічных для гліканаў расліннай біямасы, для характарыстыкі гліканавых сувязяў у клеткавых сценках раслін і ферментатыўных гідралізатах, іанізацыі лазернай дэсорбцыі з дапамогай матрыцы, часпралётнай мас-спектраметрыі..MALDI-TOF-MS) выкарыстоўвае структурна-інфарматыўныя дыягнастычныя пікі, атрыманыя з дапамогай спектраскапіі пасля другаснага распаду адмоўных іёнаў, газавай храматаграфіі і мас-спектраметрыі (ГХ-МС) для характарыстыкі алігацукрыдных сувязяў з дэрыватызацыяй і без яе.З-за малога памеру алігацукрыдаў (DP 4–20) гэтыя малекулы цяжка выкарыстоўваць для звязвання і характарыстыкі мАТ.Каб пераадолець гэтую праблему, мы ўжылі новы метад імабілізацыі алігацукрыдаў, заснаваны на кан'югацыі біятыну, які паспяхова пазначыў большасць растваральных алігацукрыдаў з нізкім утрыманнем DP на паверхні мікрапланшэтаў, якія затым выкарыстоўваліся ў сістэме mAb з высокай прапускной здольнасцю для аналізу спецыфічнага перавязвання.Гэты новы метад будзе садзейнічаць распрацоўцы больш прасунутых высокапрадукцыйных аналізаў глікомы ў будучыні, якія можна будзе выкарыстоўваць для ізаляцыі і характарыстыкі алігацукрыдаў, якія прысутнічаюць у біямаркерах, у дыягнастычных мэтах.
Лігнацэлюлозная біямаса, якая складаецца з сельскагаспадарчых, лясных, травяністых і драўняных матэрыялаў, з'яўляецца патэнцыйнай сыравінай для вытворчасці біяпрадуктаў, у тым ліку прадуктаў харчавання, кармоў, паліва і хімічных прэкурсораў для вытворчасці больш каштоўнай прадукцыі1.Вугляводы (такія як цэлюлоза і геміцэлюлоза), якія прысутнічаюць у клеткавых сценках раслін, дэпалімерызуюцца ў монацукрыды шляхам хімічнай апрацоўкі і біятрансфармацыі (напрыклад, ферментатыўнага гідролізу і мікробнай ферментацыі).Агульныя метады папярэдняй апрацоўкі ўключаюць пашырэнне валокнаў аміяку (AFEX), разбаўленую кіслату (DA), іённую вадкасць (IL) і паравы выбух (SE), якія выкарыстоўваюць камбінацыю хімікатаў і цяпла для памяншэння выпрацоўкі лігнацэлюлозы шляхам адкрыцця сценак раслінных клетак3,4.упартасць рэчывы, 5. Ферментатыўны гідроліз ажыццяўляецца пры высокай нагрузцы цвёрдых рэчываў з выкарыстаннем камерцыйных актыўных вугляводаў, якія змяшчаюць ферменты (CAZymes) і мікробнай ферментацыі з выкарыстаннем трансгенных дрожджаў або бактэрый для вытворчасці біялагічнага паліва і хімічных рэчываў 6 .
CAZymes у камерцыйных ферментах складаюцца са складанай сумесі ферментаў, якія сінэргічны расшчапляюць складаныя вугляводна-цукарныя сувязі з адукацыяй монацукрыдаў2,7.Як мы паведамлялі раней, складаная сетка араматычных палімераў лігніну з вугляводамі робіць іх вельмі цяжкімі, што прыводзіць да няпоўнага ператварэння цукру, назапашваючы 15-25% палавых алігацукрыдаў, якія не ўтвараюцца ў працэсе ферментатыўнага гідролізу папярэдне апрацаванай біямасы.Гэта частая праблема розных метадаў папярэдняй апрацоўкі біямасы.Некаторыя прычыны гэтага вузкага месца ўключаюць інгібіраванне ферментаў падчас гідролізу або адсутнасць або нізкі ўзровень неабходных неабходных ферментаў, неабходных для разрыву цукровых сувязяў у расліннай біямасе.Разуменне складу і структурных характарыстык цукроў, такіх як цукровыя сувязі ў алігацукрыдах, дапаможа нам палепшыць пераўтварэнне цукру падчас гідролізу, робячы біятэхналагічныя працэсы эканамічна канкурэнтаздольнымі з прадуктамі, атрыманымі з нафты.
Вызначэнне структуры вугляводаў з'яўляецца складанай задачай і патрабуе спалучэння такіх метадаў, як вадкасная храматаграфія (LC)11,12, спектраскапія ядзернага магнітнага рэзанансу (ЯМР)13, капілярны электрафарэз (CE)14,15,16 і мас-спектраметрыя (MS)17.,васямнаццаць.Такія метады МС, як часпралётная мас-спектраметрыя з лазернай дэсорбцыяй і іянізацыяй з выкарыстаннем матрыцы (MALDI-TOF-MS), з'яўляюцца універсальным метадам ідэнтыфікацыі вугляводных структур.У апошні час тандэмная МС аддуктаў іёнаў натрыю, выкліканая сутыкненнем (CID), найбольш шырока выкарыстоўваецца для ідэнтыфікацыі адбіткаў пальцаў, якія адпавядаюць месцам прымацавання алігацукрыдаў, анамерным канфігурацыям, паслядоўнасцям і месцам разгалінавання 20, 21.
Аналіз гліканаў - выдатны інструмент для паглыбленай ідэнтыфікацыі вугляводных сувязяў22.Гэты метад выкарыстоўвае моноклональные антыцелы (mAbs), накіраваныя на глікан клеткавай сценкі раслін, у якасці зондаў, каб зразумець складаныя вугляводныя сувязі.Ва ўсім свеце даступна больш за 250 мАТ, распрацаваных супраць розных лінейных і разгалінаваных алігацукрыдаў з выкарыстаннем розных сахарыдаў24.Некалькі mAb шырока выкарыстоўваліся для характарыстыкі структуры, складу і мадыфікацый клетачнай сценкі расліны, паколькі існуюць значныя адрозненні ў залежнасці ад тыпу клеткі расліны, органа, узросту, стадыі развіцця і асяроддзя росту25,26.Зусім нядаўна гэты метад быў выкарыстаны для разумення папуляцый бурбалак у сістэмах раслін і жывёл і іх адпаведнай ролі ў транспарціроўцы гліканаў, што вызначаецца субклеткавымі маркерамі, стадыямі развіцця або стымуламі навакольнага асяроддзя, а таксама для вызначэння ферментатыўнай актыўнасці.Некаторыя з розных структур гліканаў і ксіланаў, якія былі выяўлены, уключаюць пекцін (P), ксілан (X), манан (M), ксілаглюканы (XylG), глюканы са змешанай сувяззю (MLG), арабінаксілан (ArbX), галактаманнан (GalG), глюкуронавая кіслата-арабінаксілан (GArbX) і арабіна-галактан (ArbG)29.
Аднак, нягледзячы на ​​ўсе гэтыя даследчыя намаганні, толькі некалькі даследаванняў былі сканцэнтраваны на прыродзе назапашвання алігацукрыдаў падчас гідролізу з высокай загрузкай цвёрдых рэчываў (HSL), уключаючы вызваленне алігацукрыдаў, змены даўжыні алігамерных ланцугоў падчас гідролізу, розныя палімеры з нізкім DP і іх крывыя.размеркавання 30,31,32.Між тым, хоць аналіз гліканаў апынуўся карысным інструментам для комплекснага аналізу структуры гліканаў, цяжка ацаніць вадараспушчальныя алігацукрыды з нізкім DP з дапамогай метадаў антыцелаў.Меншыя алігацукрыды DP з малекулярнай масай менш за 5-10 кДа не звязваюцца з пласцінамі ELISA 33, 34 і вымываюцца перад даданнем антыцелаў.
Тут мы ўпершыню дэманструем аналіз ELISA на пласцінах, пакрытых авідынам, з выкарыстаннем моноклональных антыцелаў, спалучаючы аднаэтапную працэдуру біятынілявання растваральных тугаплаўкіх алігацукрыдаў з аналізам глікому.Наш падыход да аналізу глікомы быў пацверджаны аналізам на аснове MALDI-TOF-MS і GC-MS дадатковых алігацукрыдных сувязяў з выкарыстаннем трыметылсілільнай (TMS) дэрыватызацыі гідралізаваных цукровых кампазіцый.Гэты інавацыйны падыход можа быць распрацаваны як высокапрадукцыйны метад у будучыні і знайсці больш шырокае прымяненне ў біямедыцынскіх даследаваннях35.
Посттрансляцыйныя мадыфікацыі ферментаў і антыцелаў, такія як гліказіляванне,36 уплываюць на іх біялагічную актыўнасць.Напрыклад, змены ў гликозилировании сыроватачных бялкоў гуляюць важную ролю пры запаленчых артрытах, і змены ў гликозилировании выкарыстоўваюцца ў якасці дыягнастычных маркераў37.У літаратуры паведамляецца, што розныя гліканы лёгка з'яўляюцца пры розных захворваннях, уключаючы хранічныя запаленчыя захворванні страўнікава-кішачнага гасцінца і печані, вірусныя інфекцыі, рак яечнікаў, малочнай залозы і прастаты38,39,40.Разуменне структуры гліканаў з выкарыстаннем метадаў ELISA на аснове гліканаў на аснове антыцелаў дасць дадатковую ўпэўненасць у дыягностыцы захворвання без выкарыстання складаных метадаў РС.
Наша папярэдняе даследаванне паказала, што ўстойлівыя алігацукрыды заставаліся негідралізаванымі пасля папярэдняй апрацоўкі і ферментатыўнага гідролізу (малюнак 1).У нашай раней апублікаванай працы мы распрацавалі цвёрдафазны метад экстракцыі актываваным вуглём для вылучэння алігацукрыдаў з гідралізату кукурузнага печы, апрацаванага AFEX (ACSH)8.Пасля першапачатковай экстракцыі і падзелу алігацукрыды былі дадаткова фракцыянаваны з дапамогай эксклюзійнай храматаграфіі (SEC) і сабраны ў парадку малекулярнай масы.Манамеры цукру і алігамеры, якія выдзяляюцца ў выніку розных папярэдніх апрацовак, былі прааналізаваны з дапамогай аналізу складу цукру.Пры параўнанні ўтрымання алігамераў цукру, атрыманых рознымі метадамі папярэдняй апрацоўкі, прысутнасць устойлівых алігацукрыдаў з'яўляецца агульнай праблемай пры пераўтварэнні біямасы ў монацукрыды і можа прывесці да зніжэння выхаду цукру як мінімум на 10-15% і нават да 18%.ЗША.Гэты метад выкарыстоўваецца для далейшага буйнасерыйнага вытворчасці фракцый алігацукрыдаў.Атрыманы ACH і яго наступныя фракцыі з рознай малекулярнай масай выкарыстоўваліся ў якасці эксперыментальнага матэрыялу для характарыстыкі алігацукрыдаў у гэтай працы.
Пасля папярэдняй апрацоўкі і ферментатыўнага гідролізу ўстойлівыя алігацукрыды заставаліся негидролизованными.Тут (A) метад падзелу алігацукрыдаў, пры якім алігацукрыды вылучаюць з папярэдне апрацаванага AFEX гідралізату кукурузнага печы (ACSH) з выкарыстаннем пласта з актываванага вугалю і дыатамавай зямлі;(B) Метад падзелу алігацукрыдаў.Алігацукрыды былі дадаткова падзеленыя з дапамогай эксклюзійнай храматаграфіі (SEC);(C) Сахаридные мономеры і алігамеры, якія выдзяляюцца з розных папярэдніх апрацовак (разведзеная кіслата: DA, іённая вадкасць: IL і AFEX).Умовы ферментатыўнага гідролізу: высокая загрузка цвёрдых рэчываў 25% (маса/маса) (прыблізна 8% загрузка глюкана), 96 гадзін гідролізу, камерцыйная загрузка фермента 20 мг/г (суадносіны Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) і (D) манамеры цукру і алігамеры глюкозы, ксілозы і арабінозы, якія вылучаюцца з кукурузнай печы, папярэдне апрацаванай AFEX ( ACS).
Аналіз гліканаў апынуўся карысным інструментам для комплекснага структурнага аналізу гліканаў у экстрактах, вылучаных з цвёрдых рэшткаў біямасы.Аднак водарастваральныя сахарыды недастаткова прадстаўлены пры выкарыстанні гэтага традыцыйнага метаду41, таму што нізкамалекулярныя алігацукрыды цяжка абезрухоміць на пласцінах для ELISA і вымываюцца перад даданнем антыцелаў.Такім чынам, для звязвання і характарыстыкі антыцелаў быў выкарыстаны аднаэтапны метад біятынілявання для пакрыцця растваральных, неадпаведных алігацукрыдаў на пласцінах для аналізу ELISA, пакрытых авідынам.Гэты метад быў пратэставаны з выкарыстаннем раней вырабленага ACSH і фракцыі, заснаванай на яго малекулярнай масе (або ступені полімерызацыі, DP).Аднаступеньчатая біятыніляванне выкарыстоўвалася для павышэння сродства звязвання алігацукрыдаў шляхам дадання біятын-LC-гідразіду да аднаўляючага канца вугляводаў (мал. 2).У растворы паўацэтальная група на аднаўленчым канцы рэагуе з гідразіднай групай біятын-LC-гідразіду з адукацыяй гідразонавай сувязі.У прысутнасці аднаўляльніка NaCNBH3 гідразонавая сувязь аднаўляецца да стабільнага біятыніляванага канчатковага прадукту.З мадыфікацыяй канца, які зніжае цукар, стала магчымым звязванне алігацукрыдаў з нізкім DP з пласцінамі для ELISA, і ў нашым даследаванні гэта было зроблена на пласцінах, пакрытых авідынам, з выкарыстаннем моноклональных антител, накіраваных на глікан.
Скрынінг моноклональных антыцелаў на аснове ІФА на биотинилированные алігацукрыды.Тут (A) камбінаванае біятыніляванне алігацукрыдаў і наступны ІФА-скрынінг з глікан-мішэнню mAb на пласцінах, пакрытых NeutrAvidin, і (B) паказвае аднаэтапную працэдуру біятынілявання прадуктаў рэакцыі.
Затым пакрытыя авідынам пласціны з кан'югаванымі з алігацукрыдамі антыцеламі дадаваліся да першасных і другасных антыцелаў і прамываліся ў асяроддзі, адчувальным да святла і часу.Пасля завяршэння звязвання антыцелаў дадайце субстрат TMB для інкубацыі пласціны.Канчаткова рэакцыю спынілі сернай кіслатой.Інкубаваныя пласціны аналізавалі з дапамогай рыдэра ELISA для вызначэння сілы звязвання кожнага антыцела для выяўлення спецыфічнага для антыцелаў перакрыжаванага сшывання.Падрабязнасці і параметры эксперыменту гл. у адпаведным раздзеле «Матэрыялы і метады».
Мы дэманструем карыснасць гэтага нядаўна распрацаванага метаду для канкрэтных прыкладанняў, характарызуючы растваральныя алігацукрыды, якія прысутнічаюць у ACSH, а таксама ў сырых і вычышчаных фракцыях алігацукрыдаў, вылучаных з лігнацэлюлозных гідралізатаў.Як паказана на малюнку 3, найбольш распаўсюджанымі эпітоп-замешчанымі ксіланамі, ідэнтыфікаванымі ў ACSH з дапамогай метадаў аналізу біяацыляванага глікома, звычайна з'яўляюцца уронавыя (U) або метилуроновые (MeU) і пекцінавыя арабінагалактаны.Большасць з іх таксама былі знойдзены ў нашым папярэднім даследаванні па аналізе гликанов негидролизованных цвёрдых рэчываў (UHS)43.
Выяўленне непакорлівых алігацукрыдных эпітопаў з выкарыстаннем моноклональных антыцелаў, накіраваных на глікан клеткавай сценкі.«Нейтральная» фракцыя - гэта фракцыя ACN, а «кіслотная» фракцыя - гэта фракцыя FA.Больш яркія чырвоныя на цеплавой карце паказваюць на больш высокае ўтрыманне эпітопаў, а больш яркія сінія - на пусты фон.Значэнні колеру на шкале заснаваныя на неапрацаваных значэннях OD для складаў N=2.Асноўныя эпітопы, распазнаныя антыцеламі, паказаны справа.
Гэтыя нецэлюлозныя структуры не могуць быць расшчаплены найбольш распаўсюджанымі целлюлазамі і геміцэлюлазамі ў праверанай камерцыйнай сумесі ферментаў, якая ўключае найбольш часта выкарыстоўваюцца камерцыйныя ферменты.Таму для іх гідролізу патрабуюцца новыя дапаможныя ферменты.Без неабходных нецэлюлозных дадатковых ферментаў гэтыя нецэлюлозныя сувязі прадухіляюць поўнае ператварэнне ў монацукрыды, нават калі іх зыходныя цукровыя палімеры інтэнсіўна гідралізуюцца на больш кароткія фрагменты і раствараюцца з дапамогай камерцыйных сумесяў ферментаў.
Далейшае вывучэнне размеркавання сігналу і яго сілы звязвання паказала, што эпітопы звязвання былі ніжэй у фракцыях цукру з высокім DP (A, B, C, DP да 20+), чым у фракцыях з нізкім DP (D, E, F, DP) у дымерах) (мал. 1).Кіслотныя фрагменты часцей сустракаюцца ў нецэлюлозных эпітопах, чым нейтральныя фрагменты.Гэтыя з'явы адпавядаюць карціне, назіранай у нашым папярэднім даследаванні, дзе высокая DP і кіслотныя часткі былі больш устойлівымі да ферментатыўнага гідролізу.Такім чынам, наяўнасць нецэлюлозных гліканавых эпітопаў і замен U і MeU можа ўнесці вялікі ўклад у стабільнасць алігацукрыдаў.Варта адзначыць, што эфектыўнасць звязвання і выяўлення можа быць праблематычнай для алігацукрыдаў з нізкім DP, асабліва калі эпітоп з'яўляецца дымерным або трымерным алігацукрыдам.Гэта можа быць праверана з выкарыстаннем камерцыйных алігацукрыдаў рознай даўжыні, кожны з якіх змяшчае толькі адзін эпітоп, які звязваецца з пэўным mAb.
Такім чынам, выкарыстанне структурна-спецыфічных антыцелаў выявіла пэўныя тыпы непакорлівых сувязяў.У залежнасці ад тыпу выкарыстоўваных антыцелаў, адпаведнай схемы перавязкі і сілы сігналу, які ён стварае (большая і найменшая колькасць), новыя ферменты могуць быць ідэнтыфікаваны і паўколькасна дададзены ў сумесь ферментаў для больш поўнай глікаканверсіі.На прыкладзе аналізу алігацукрыдаў ACSH мы можам стварыць базу дадзеных гліканавых сувязяў для кожнага матэрыялу біямасы.Тут варта адзначыць, што варта ўлічваць рознае сродство антыцелаў, і калі іх сродство невядома, гэта створыць пэўныя цяжкасці пры параўнанні сігналаў розных антыцелаў.Акрамя таго, параўнанне гліканавых сувязяў можа лепш за ўсё працаваць паміж узорамі для адных і тых жа антыцелаў.Затым гэтыя ўпартыя сувязі можна звязаць з базай дадзеных CAZyme, з якой мы можам ідэнтыфікаваць ферменты, выбраць ферменты-кандыдаты і праверыць ферменты, якія разрываюць сувязі, або распрацаваць мікробныя сістэмы для экспрэсіі гэтых ферментаў для выкарыстання ў біярафінарных заводах44.
Каб ацаніць, як імуналагічныя метады дапаўняюць альтэрнатыўныя метады для характарыстыкі нізкамалекулярных алігацукрыдаў, якія прысутнічаюць у лигноцеллюлозных гідралізат, мы правялі MALDI (мал. 4, S1-S8) і аналіз атрыманых з ТМС цукрыдаў на аснове ГХ-МС на той жа панэлі (мал. 5) алігацукрыднай часткі.MALDI выкарыстоўваецца для параўнання таго, ці адпавядае размеркаванне масы малекул алігацукрыдаў меркаванай структуры.На мал.4 паказаны МК нейтральных кампанентаў ACN-A і ACN-B.Аналіз ACN-A пацвердзіў шэраг пентозных цукроў ад DP 4–8 (мал. 4) да DP 22 (мал. S1), вага якіх адпавядае алігацукрыдам MeU-ксілану.Аналіз ACN-B пацвердзіў серыі пентозы і глюкаксілану з DP 8-15.У дадатковых матэрыялах, такіх як малюнак S3, карты размеркавання па масе кіслотных частак FA-C паказваюць шэраг пентозных цукроў, замешчаных (Me)U, з DP 8-15, якія адпавядаюць замешчаным ксіланам, выяўленым пры скрынінгу mAb на аснове ELISA.Эпітопы паслядоўныя.
Спектр MALDI-MS растваральных неадпаведных алігацукрыдаў, якія прысутнічаюць у ACS.Тут (A) фракцыі нізкага дыяпазону масы ACN-A, якія змяшчаюць метилированные алігацукрыды уронавай кіслаты (DP 4-8), замешчаныя глюкуроксиланам, і (B) ксілан ACN-B і алігацукрыды метилированной уроновой кіслаты, замешчаныя глюкуроксиланам (DP 8-15).
Аналіз складу гликанового астатку тугаплаўкіх алігацукрыдаў.Тут (A) TMS сахаридный склад розных фракцый алігацукрыдаў, атрыманы з дапамогай ГХ-МС аналізу.(B) Структуры розных цукроў, атрыманых з TMS, якія прысутнічаюць у алігацукрыдах.ACN - фракцыя ацетонитрила, якая змяшчае нейтральныя алігацукрыды і FA - фракцыя феруловой кіслаты, якая змяшчае кіслыя алігацукрыды.
Яшчэ адна цікавая выснова была зроблена з дапамогай ВХ-МС аналізу фракцыі алігацукрыдаў, як паказана на малюнку S9 (метады можна ўбачыць у электронным дадатковым матэрыяле).Фрагменты груп гексозы і -OAc неаднаразова назіраліся падчас перавязкі фракцыі ACN-B.Гэта адкрыццё не толькі пацвярджае фрагментацыю, назіраную ў аналізе глікомы і MALDI-TOF, але таксама дае новую інфармацыю аб патэнцыйных вытворных вугляводаў у папярэдне апрацаванай лігнацэлюлознай біямасе.
Мы таксама прааналізавалі склад цукру фракцыі алігацукрыдаў з выкарыстаннем дэрыватызацыі цукру TMS.Выкарыстоўваючы ГХ-МС, мы вызначылі склад нервовых (невытворных) і кіслых цукроў (GluA і GalA) у фракцыі алігацукрыдаў (мал. 5).Глюкуроновая кіслата змяшчаецца ў кіслых кампанентах C і D, у той час як галактуроновая кіслата змяшчаецца ў кіслых кампанентах A і B, абодва з якіх з'яўляюцца кампанентамі кіслых цукроў з высокім утрыманнем DP.Гэтыя вынікі не толькі пацвярджаюць нашы дадзеныя ELISA і MALDI, але таксама адпавядаюць нашым папярэднім даследаванням назапашвання алігацукрыдаў.Такім чынам, мы лічым, што сучасных імуналагічных метадаў з выкарыстаннем биотинилирования алігацукрыдаў і наступнага скрынінга ІФА дастаткова для выяўлення растваральных непакорлівых алігацукрыдаў у розных біялагічных узорах.
Паколькі метады скрынінга mAb на аснове ELISA былі правераны некалькімі рознымі метадамі, мы хацелі далей вывучыць патэнцыял гэтага новага колькаснага метаду.Два камерцыйныя алігацукрыды, ксілагексасахарыд-алігацукрыд (XHE) і 23-α-L-арабінафураназіл-ксілатрыоза (A2XX), былі набыты і пратэставаны з выкарыстаннем новага падыходу mAb, нацэленага на глікан клеткавай сценкі.Малюнак 6 паказвае лінейную карэляцыю паміж біятыніляваным сігналам звязвання і логарымам канцэнтрацыі канцэнтрацыі алігацукрыдаў, што сведчыць аб магчымай мадэлі адсорбцыі Ленгмюра.Сярод mAb CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 і CCRC-M151 карэлююць з XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 і LM11 карэлююць з A2XX у дыяпазоне ад 1 нм да 100 нана.З-за абмежаванай даступнасці антыцелаў падчас эксперыменту былі праведзены абмежаваныя эксперыменты з кожнай канцэнтрацыяй алігацукрыдаў.Тут варта адзначыць, што некаторыя антыцелы вельмі па-рознаму рэагуюць на адзін і той жа алігацукрыд у якасці субстрата, імаверна таму, што яны звязваюцца з трохі рознымі эпітопамі і могуць мець вельмі рознае сродства да звязвання.Механізмы і наступствы дакладнай ідэнтыфікацыі эпітопаў будуць нашмат больш складанымі, калі новы падыход mAb прымяняецца да рэальных узораў.
Два камерцыйныя алігацукрыды былі выкарыстаны для вызначэння дыяпазону выяўлення розных моноклональных антител, нацэленых на глікан.Тут лінейныя карэляцыі з логарифмічнай канцэнтрацыяй канцэнтрацыі алігацукрыдаў паказваюць схемы адсорбцыі Ленгмюра для (A) XHE з mAb і (B) A2XX з mAb.Адпаведныя эпітопы паказваюць структуры камерцыйных алігацукрыдаў, якія выкарыстоўваюцца ў якасці субстратаў у аналізе.
Выкарыстанне моноклональных антыцелаў, нацэленых на глікан (аналіз глікакомы або скрынінг mAb на аснове ELISA), з'яўляецца магутным інструментам для паглыбленай характарыстыкі большасці асноўных гліканаў клеткавай сценкі, якія складаюць раслінную біямасу.Аднак класічны аналіз гліканаў характарызуе толькі больш буйныя гліканы клеткавай сценкі, паколькі большасць алігацукрыдаў неэфектыўна імабілізуюцца на пласцінах для аналізу ELISA.У гэтым даследаванні папярэдне апрацаваная AFEX кукурузная печ была падвергнута ферментатыўнаму гідралізу пры высокім утрыманні цвёрдых рэчываў.Аналіз цукру быў выкарыстаны для вызначэння складу непакорлівых вугляводаў клеткавай сценкі ў гідралізат.Аднак аналіз mAb меншых алігацукрыдаў у гідралізатах недаацэнены, і для эфектыўнай імабілізацыі алігацукрыдаў на пласцінах для аналізу ELISA неабходныя дадатковыя прылады.
Мы паведамляем тут пра новы і эфектыўны метад імабілізацыі алігацукрыдаў для скрынінга mAb шляхам камбінавання біятынілявання алігацукрыдаў з наступным скрынінгам ELISA на пласцінах, пакрытых NeutrAvidin™.Імабілізаваныя біятыніляваныя алігацукрыды прадэманстравалі дастатковую сродства да антыцелаў, каб зрабіць магчымым хуткае і эфектыўнае выяўленне непакорлівых алігацукрыдаў.Аналіз складу гэтых устойлівых алігацукрыдаў на аснове мас-спектраметрыі пацвердзіў вынікі гэтага новага падыходу да імунаскрынінгу.Такім чынам, гэтыя даследаванні дэманструюць, што камбінацыя біятынілявання алігацукрыдаў і ІФА-скрынінгу з моноклональными антыцеламі, арыентаванымі на глікан, можа быць выкарыстана для выяўлення папярочных сувязяў у алігацукрыдах і можа быць шырока прыменена ў іншых біяхімічных даследаваннях, якія характарызуюць структуру алігацукрыдаў.
Гэты метад прафілявання гліканаў на аснове біятыну - першая справаздача, якая дазваляе даследаваць непакорлівыя вугляводныя сувязі растваральных алігацукрыдаў у расліннай біямасе.Гэта дапамагае зразумець, чаму некаторыя часткі біямасы такія ўпартыя, калі справа даходзіць да вытворчасці біяпаліва.Гэты метад запаўняе важны прабел у метадах аналізу глікому і пашырае яго прымяненне на больш шырокі спектр субстратаў, акрамя раслінных алігацукрыдаў.У будучыні мы можам выкарыстоўваць робататэхніку для біятынілявання і выкарыстоўваць распрацаваны намі метад для высокапрадукцыйнага аналізу ўзораў з дапамогай ELISA.
Кукурузная салома (CS), вырашчаная з насення гібрыдаў Pioneer 33A14, была сабрана ў 2010 годзе на фермах Kramer у Рэі, штат Каларада.З дазволу землеўладальніка гэтую біямасу можна выкарыстоўваць для даследаванняў. Узоры захоўваліся ў сухім выглядзе <6% вільготнасці ў мяшках на маланкі пры пакаёвай тэмпературы. Узоры захоўваліся ў сухім выглядзе <6% вільготнасці ў мяшках на маланкі пры пакаёвай тэмпературы. Абразцы захоўваліся сухімі пры вільготнасці < 6% у пакетах з засцежкай-молнией пры пакаёвай тэмпературы. Узоры захоўвалі сухімі пры вільготнасці <6% у пакетах на маланкі пры пакаёвай тэмпературы.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Абразцы хранят у пакетах з засцежкай-молнием пры пакаёвай тэмпературы з вільготнасцю < 6%. Пробы захоўваюцца ў пакетах на маланкі пры пакаёвай тэмпературы і вільготнасці <6%.Даследаванне адпавядала мясцовым і нацыянальным рэкамендацыям.Аналіз складу праводзіўся з выкарыстаннем пратаколу NREL.У кампазіцыі выяўлена 31,4% глюкана, 18,7% ксілану, 3,3% арабінану, 1,2% галактана, 2,2% ацэтылу, 14,3% лігніну, 1,7% бялку і 13,4% попелу.
Cellic® CTec2 (138 мг бялку/мл, партыя VCNI 0001) - гэта складаная сумесь целлюлазы, β-глюкозидазы і Cellic® HTec2 (157 мг бялку/мл, партыя VHN00001) ад Novozymes (Франклінтан, Паўночная Караліна, ЗША)).Multifect Pectinase® (72 мг бялку/мл), складаная сумесь ферментаў, якія разбураюць пекцін, была перададзена DuPont Industrial Biosciences (Пала-Альта, Каліфорнія, ЗША).Канцэнтрацыі бялку ў ферментах вызначалі шляхам ацэнкі ўтрымання бялку (і аднімання ўкладу небялковага азоту) з выкарыстаннем аналізу азоту па К'ельдалю (метад AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ітака, Нью-Ёрк, ЗША).Дыатамавая зямля 545 была набыта ў EMD Millipore (Billerica, MA).Актываваны вугаль (DARCO, гранулы 100 меш), Avicel (PH-101), букавы ксілан і ўсе іншыя хімікаты былі набыты ў Sigma-Aldrich (Сэнт-Луіс, Місуры).
Папярэдняя апрацоўка AFEX была праведзена ў GLBRC (Даследчая лабараторыя па пераўтварэнні біямасы, МДУ, Лансінг, Мічыган, ЗША).Папярэднюю апрацоўку праводзілі пры 140°С на працягу 15 хвілін.46 час знаходжання пры суадносінах бязводнага аміяку да біямасы 1:1 пры загрузцы 60% (мас./мас.) у настольным рэактары перыядычнага дзеяння з нержавеючай сталі (Parr Instruments Company).Гэта заняло 30 хвілін.Тэмпература рэактара была даведзена да 140°C, і аміяк хутка выдзяляўся, дазваляючы біямасе хутка вярнуцца да пакаёвай тэмпературы.Склад папярэдне апрацаванай кукурузы AFEX (ACS) быў аналагічны складу неапрацаванай кукурузы (UT-CS).
ACSH з высокім утрыманнем цвёрдых рэчываў 25% (мас./мас.) (прыкладна 8% загрузка дэкстрану) быў падрыхтаваны ў якасці зыходнага матэрыялу для буйнамаштабнай вытворчасці алігацукрыдаў.Ферментатыўны гідроліз ACS праводзіўся з выкарыстаннем камерцыйнай сумесі ферментаў, уключаючы Cellic® Ctec2 10 мг бялку/г глюкана (у папярэдне апрацаванай біямасе), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг бялку/г глюкана і Multifect Pectinase (Genencor Inc, ЗША).).), 5 мг бялку / г декстрана.Ферментатыўны гідроліз праводзілі ў 5-літровым біярэактары працоўным аб'ёмам 3 л, pH 4,8, 50 ° С і 250 абаротаў у хвіліну.Пасля гідролізу на працягу 96 гадзін гідралізат збіралі цэнтрыфугаваннем пры 6000 абаротаў у хвіліну на працягу 30 хвілін, а затым пры 14000 абаротаў у хвіліну на працягу 30 хвілін для выдалення негидролизованных цвёрдых рэчываў.Затым гідралізат падвяргалі стэрыльнай фільтрацыі праз шклянку фільтра 0,22 мм.Адфільтраваны гідралізат захоўвалі ў стэрыльных флаконах пры 4°С і затым фракцыянавалі на вугляроды.
Аналіз складу проб біямасы на аснове экстрактаў у адпаведнасці з працэдурамі лабараторнага аналізу NREL: падрыхтоўка проб для аналізу складу (NREL/TP-510-42620) і вызначэнне структурных вугляводаў і лігніну ў біямасе (NREL/TP-510 – 42618)47.
Аналіз алігацукрыдаў патоку гідралізат праводзілі ў маштабе 2 мл з выкарыстаннем метаду кіслотнага гідролізу ў аўтаклаве.Змяшайце ўзор гідралізату з 69,7 мкл 72% сернай кіслаты ў культуральнай прабірцы з закручвальнай вечкам на 10 мл і інкубуйце 1 гадзіну на стале пры 121 °C, астудзіце на лёдзе і адфільтруйце ў прабірку для высокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі (ВЭЖХ).Канцэнтрацыю алігацукрыдаў вызначалі шляхам аднімання канцэнтрацыі монацукрыдаў у негидролизованном узоры з агульнай канцэнтрацыі цукру ў кіслотна-гидролизованном узоры.
Канцэнтрацыі глюкозы, ксілозы і арабінозы ў кіслотна-гідралізаванай біямасе былі прааналізаваны з дапамогай сістэмы ВЭЖХ Shimadzu, абсталяванай аўтасамплерам, награвальнікам калонкі, ізакратычнай помпай і дэтэктарам паказчыка праламлення на калонцы Bio-Rad Aminex HPX-87H.Калонку падтрымлівалі пры 50°C і элюировали 0,6 мл/мін 5 мм H2SO4 у вадзе.паток.
Супернатант гідралізат разбаўлялі і аналізавалі на ўтрыманне мономеров і алігацукрыдаў.Манамерныя цукру, атрыманыя пасля ферментатыўнага гідролізу, аналізавалі метадам ВЭЖХ, абсталяваным калонкай Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P і калонкай для абароны ад попелу.Тэмпературу калонкі падтрымлівалі на ўзроўні 80°С, у якасці рухомай фазы выкарыстоўвалі ваду з расходам 0,6 мл/мін.Алігацукрыды вызначалі гідролізам ў разведзенай кіслаце пры 121 ° С па методыцы, апісанай у л.41, 48, 49.
Аналіз сахарыдаў праводзіўся на сырых, папярэдне апрацаваных AFEX і ўсіх негідралізаваных рэштках біямасы (уключаючы вытворчасць серыйных экстрактаў клеткавых сценак і іх скрынінг mAb) з выкарыстаннем раней апісаных працэдур 27, 43, 50, 51.Для аналізу глікомы нерастваральныя ў спірце рэшткі матэрыялу клеткавых сценак раслін рыхтуюць з рэшткаў біямасы і падвяргаюць паслядоўнай экстракцыі з усё больш агрэсіўнымі рэагентамі, такімі як оксалат амонія (50 мМ), карбанат натрыю (50 мМ і 0,5% мас./аб.), CON.(1М і 4М, абодва з 1% мас./аб. борогидрида натрыю) і кіслы хлорыт, як апісана раней52,53.Затым экстракты падвяргалі ELISA супраць складанай панэлі mAb50, накіраваных на глікан клеткавай сценкі, і рэакцыі звязвання mAb прадстаўлялі ў выглядзе цеплавой карты.МАТ, накіраваныя на глікан клеткавай сценкі раслін, былі набыты з лабараторных запасаў (серыі CCRC, JIM і MAC).
Одноэтапное биотинилирование алігацукрыдаў.Кан'югацыі вугляводаў з біятын-LC-гидразидом праводзілі з дапамогай наступнай працэдуры.Біятын-LC-гідразід (4,6 мг/12 мкмоль) раствараюць у диметилсульфоксиде (ДМСО, 70 мкл) інтэнсіўным мяшаннем і награваннем пры 65°С на працягу 1 хвіліны.Дадавалі ледзяную воцатную кіслату (30 мкл) і сумесь вылівалі на цианоборгидрид натрыю (6,4 мг/100 мкмоль) і цалкам растваралі пасля награвання пры 65°C на працягу прыблізна 1 хвіліны.Затым ад 5 да 8 мкл рэакцыйнай сумесі дадаюць да высушанага алігацукрыду (1-100 нмоль), каб атрымаць 10-кратны або больш малярны лішак пазнакі над аднаўленчым канцом.Рэакцыю праводзілі пры 65 ° С на працягу 2 ч, пасля чаго ўзоры неадкладна ачышчалі.Цыянаборгідрыд натрыю не выкарыстоўваўся ў эксперыментах па маркіроўцы без аднаўлення, і ўзоры рэагавалі пры 65°C на працягу 2,5 гадзін.
ІФА-пакрыццё і прамыванне ўзораў біятыніляваных алігацукрыдаў.25 мкл біятыніляваных узораў (100 мкл кожнага канцэнтраванага ўзору, разведзенага ў 5 мл 0,1 М буфернага раствора Трыс (TBS)) дадавалі ў кожную лунку пласціны, пакрытай авідынам.Кантрольныя лункі пакрывалі 50 мкл біятыну ў канцэнтрацыі 10 мкг/мл у 0,1 М TBS.Дэіянізаваную ваду выкарыстоўвалі ў якасці пакрыцця для пустых вымярэнняў.Планшэт інкубавалі 2 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы ў цемры.Прамыйце талерку 3 разы 0,1% абястлушчаным малаком у 0,1 М TBS з дапамогай праграмы №.11 для Grenier flat 3A.
Даданне і адмыванне першасных антыцелаў.Дадайце 40 мкл першасных антыцелаў у кожную лунку.Інкубуйце мікрапланшэт 1 гадзіну пры пакаёвай тэмпературы ў цемры.Затым пласціны прамывалі 3 разы 0,1% малаком у 0,1М TBS з выкарыстаннем праграмы мыцця №11 для Grenier Flat 3A.
Дадайце другасныя антыцелы і прамыйце.Дадайце 50 мкл мышыных/пацучыных другасных антыцелаў (разведзеных 1:5000 у 0,1% малака ў 0,1 М TBS) у кожную лунку.Інкубуйце мікрапланшэт 1 гадзіну пры пакаёвай тэмпературы ў цемры.Затым мікрапланшэты прамывалі 5 разоў 0,1% малаком у 0,1 М TBS з выкарыстаннем праграмы мыцця пласцін Grenier Flat 5A №12.
Даданне падкладкі.Дадайце 50 мкл 3,3',5,5'-тэтраметылбензідыну (ТМВ) у асноўны субстрат (шляхам дадання 2 кропель буфера, 3 кропель ТМБ, 2 кропель перакісу вадароду ў 15 мл дэіянізаванай вады).Падрыхтуйце субстрат TMB.і змяшайце перад выкарыстаннем).Інкубуйце мікрапланшэт пры пакаёвай тэмпературы на працягу 30 хвілін.У цемры.
Выканайце крок і прачытайце таблічку.Дадайце 50 мкл 1N сернай кіслаты ў кожную лунку і запішыце абсорбцыю ад 450 да 655 нм з дапамогай рыдэра ELISA.
Прыгатуйце 1 мг/мл раствораў гэтых аналітаў у дэіянізаванай вадзе: арабіноза, рамноза, фукоза, ксілоза, галактуроновая кіслата (GalA), глюкуроновая кіслата (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацэтылманназамін (manNAc), N-ацэтылглюказамін.(glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (ўнутраны стандарт).Два стандарту былі падрыхтаваны шляхам дадання 1 мг/мл раствораў цукру, паказаных у табліцы 1. Узоры замарожваюць і лиофилизируют пры -80°C, пакуль не будзе выдалена ўся вада (звычайна каля 12-18 гадзін).
Дадайце 100–500 мкг пробы ў прабіркі з закручваецца вечкам на аналітычных вагах.Запішыце дададзеную суму.Лепш за ўсё растварыць пробу ў пэўнай канцэнтрацыі растваральніка і дадаць яе ў прабірку ў выглядзе вадкасці.Выкарыстоўвайце 20 мкл 1 мг/мл іназіту ў якасці ўнутранага стандарту для кожнай прабіркі з узорам.Колькасць унутранага стандарту, дададзенага да ўзору, павінна быць такой жа, як колькасць унутранага стандарту, дададзенага ў стандартную прабірку.
Дадайце 8 мл бязводнага метанолу ў флакон з закручваецца вечкам.Затым 4 мл 3 н. метанольнага раствора HCl, зачыняюць вечкам і боўтаюць.Гэты працэс не выкарыстоўвае ваду.
Дадайце 500 мкл 1 М раствора метанолу HCl да ўзораў алігацукрыдаў і стандартных прабірак TMS.Узоры інкубавалі на працягу ночы (168 гадзін) пры 80°C у термоблоке.Высушыце прадукт метанолізу пры пакаёвай тэмпературы з дапамогай сушыльнага калектара.Дадайце 200 мкл MeOH і зноў высушыце.Гэты працэс паўтараецца двойчы.Да пробы дадайце 200 мкл метанолу, 100 мкл пірыдзіну і 100 мкл воцатнага ангідрыду і добра змяшайце.Узоры інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы на працягу 30 хвілін.і сушаць.Дадайце 200 мкл метанолу і зноў высушыце.
Дадайце 200 мкл Tri-Sil і награвайце прабірку з вечкам на 20 хвілін.80°C, затым астуджаюць да пакаёвай тэмпературы.Выкарыстоўвайце сушыльны калектар, каб дадаткова высушыць узор да аб'ёму прыблізна 50 мкл.Важна адзначыць, што мы не давалі узорам цалкам высахнуць.
Дадайце 2 мл гексану і добра змяшайце на вортексе.Напоўніце кончыкі піпетак Пастэра (5-8 мм) кавалачкам шклаваты, уставіўшы шклавату на піпетку дыяметрам 5-3/4 цалі.Узоры центрифугировали пры 3000 g на працягу 2 хвілін.Любыя нерастваральныя рэшткі выпадаюць у асадак.Высушыце ўзор да 100-150 мкл.Аб'ём прыкладна 1 мкл ўводзілі ў GC-MS пры пачатковай тэмпературы 80 °C і пачатковым часе 2,0 хвіліны (табліца 2).