Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй. Хамгийн сайн туршлагын тулд бид танд шинэчлэгдсэн хөтчийг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох). Энэ хооронд бид сайтыг хэв маяг болон JavaScriptгүйгээр үзүүлэх болно.
AFEX-ээр урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зууханд тэсвэртэй олигосахаридын цогц шинжилгээ хийх шинэ дархлаа судлалын болон массын спектрометрийн аргууд. Лигноцеллюлоз биомасс нь чулуужсан түлшний тогтвортой хувилбар бөгөөд хоол хүнс, тэжээл, түлш, химийн бодис зэрэг бүтээгдэхүүн үйлдвэрлэх биотехнологийг хөгжүүлэхэд өргөн хэрэглэгддэг. Эдгээр технологийн гол түлхүүр нь ургамлын эсийн хананд байдаг нарийн төвөгтэй нүүрс усыг глюкоз, ксилоз, арабиноз зэрэг энгийн элсэн чихэр болгон хувиргах өртөг өндөртэй өрсөлдөхүйц процессыг хөгжүүлэх явдал юм. Лигноцеллюлоз биомасс нь маш зөрүүд тул хүссэн бүтээгдэхүүнийг авахын тулд термохимийн боловсруулалт (жишээлбэл, аммиакийн ширхэгийн гуужуулалт (AFEX), шингэрүүлсэн хүчил (DA), ионы шингэн (IL)) болон биологийн боловсруулалт (жишээлбэл, ферментийн гидролиз ба микробын исгэх)-ийг хослуулан хийх шаардлагатай. Гэсэн хэдий ч гидролизийн процесст арилжааны мөөгөнцрийн ферментийг ашиглах үед үүссэн уусдаг сахарын зөвхөн 75-85% нь моносахарид бөгөөд үлдсэн 15-25% нь уусдаг, тэсвэрлэх чадваргүй олигосахарид бөгөөд бичил биетэнд үргэлж хүртээмжтэй байдаггүй. Өмнө нь бид нүүрстөрөгч ба диатомын шороон ялгах болон хэмжээг хасах хроматографийн хослолыг ашиглан уусдаг зөрүүд олигосахаридуудыг амжилттай ялгаж, цэвэршүүлж, мөн тэдгээрийн ферментийн дарангуйлах шинж чанарыг судалсан. Бид өндөр түвшний полимержилт (DP) метилжүүлсэн уроны хүчлийн орлуулалт агуулсан олигосахаридуудыг бага DP болон төвийг сахисан олигосахаридуудаас арилжааны ферментийн хольцоор боловсруулахад илүү хэцүү болохыг тогтоосон. Энд бид ургамлын эсийн хананд гликаны холбоог тодорхойлохын тулд ургамлын биомассын гликануудад өвөрмөц моноклональ эсрэгбие (mAbs) ашиглан гликаны профайл үүсгэх, матрицын тусламжтайгаар лазер десорбцийн ионжуулалт, нислэгийн хугацааны масс-спектрометр зэрэг хэд хэдэн нэмэлт аргыг ашигласан талаар мэдээлж байна. . MALDI-TOF-MS) нь сөрөг ионуудын хоёрдогч задралын дараа спектроскопи, хийн хроматографи болон масс спектрометр (GC-MS) ашиглан олж авсан бүтцийн мэдээлэл бүхий оношлогооны оргилуудыг ашиглан деривативжуулалттай болон деривативжуулалтгүйгээр олигосахаридын холбоог тодорхойлдог. Олигосахаридын хэмжээ бага (DP 4–20) тул эдгээр молекулууд нь mAb холболт болон шинж чанарыг тодорхойлоход ашиглахад хэцүү байдаг. Энэ асуудлыг даван туулахын тулд бид биотин коньюгацид суурилсан олигосахаридын хөдөлгөөнгүйжүүлэлтийн шинэ аргыг хэрэглэсэн бөгөөд энэ нь микро хавтангийн гадаргуу дээрх бага DP уусдаг олигосахаридын дийлэнх хэсгийг амжилттай тэмдэглэсэн бөгөөд дараа нь өндөр хүчин чадалтай mAb системд тусгай холболтын шинжилгээнд ашигласан. Энэхүү шинэ арга нь ирээдүйд биомаркеруудад байдаг олигосахаридуудыг ялгаж, тодорхойлоход ашиглаж болох илүү дэвшилтэт өндөр хүчин чадалтай гликомын шинжилгээг боловсруулахад дөхөм болно.
Хөдөө аж ахуй, ойн аж ахуй, өвс, модлог материалаас бүрдсэн лигноцеллюлоз биомасс нь өндөр үнэ цэнэтэй бүтээгдэхүүн үйлдвэрлэхийн тулд хүнс, тэжээл, түлш, химийн урьдал бодис зэрэг био-суурьтай бүтээгдэхүүн үйлдвэрлэх боломжит түүхий эд юм. Ургамлын эсийн хананд агуулагдах нүүрс ус (целлюлоз, гемицеллюлоз гэх мэт)-ийг химийн боловсруулалт болон биотрансформаци (ферментийн гидролиз, бичил биетний исгэх гэх мэт)-ээр моносахарид болгон деполимержүүлдэг. Нийтлэг урьдчилсан боловсруулалтад аммиакийн ширхэгийн тэлэлт (AFEX), шингэрүүлсэн хүчил (DA), ионы шингэн (IL), уурын дэлбэрэлт (SE) орно. Эдгээр нь ургамлын эсийн ханыг нээх замаар лигноцеллюлозын үйлдвэрлэлийг бууруулахын тулд химийн бодис болон дулааныг хослуулан ашигладаг. 3,4. Бодисын зөрүүд байдал, 5. Ферментийн гидролизийг арилжааны идэвхтэй нүүрс ус агуулсан ферментүүд (CAZymes) ашиглан хатуу бодисын өндөр ачаалалтайгаар, трансген мөөгөнцөр эсвэл бактерийг ашиглан бичил биетний исгэх замаар био-суурьтай түлш, химийн бодис үйлдвэрлэх 6-г ашиглан явуулдаг.
Арилжааны ферментүүдийн CAZymes нь моносахарид үүсгэхийн тулд нарийн төвөгтэй нүүрс ус-чихрийн холбоог синергетик байдлаар задалдаг ферментүүдийн нарийн төвөгтэй холимогоос бүрддэг2,7. Өмнө нь мэдээлсэнчлэн, лигниний нүүрс устай үнэрт полимерүүдийн нарийн төвөгтэй сүлжээ нь тэдгээрийг маш ихээр тайлах боломжгүй болгодог бөгөөд энэ нь элсэн чихрийн бүрэн бус хувиралд хүргэдэг бөгөөд урьдчилан боловсруулсан биомассын ферментийн гидролизийн үед үүсдэггүй бэлгийн олигосахаридын 15-25%-ийг хуримтлуулдаг. Энэ нь биомассын урьдчилан боловсруулах янз бүрийн аргуудын нийтлэг асуудал юм. Энэхүү саад тотгорын зарим шалтгаанд гидролизийн үед ферментийг дарангуйлах, эсвэл ургамлын биомассын чихрийн холбоог таслахад шаардлагатай чухал чухал ферментүүдийн байхгүй эсвэл бага түвшин орно. Олигосахаридын чихрийн холбоо гэх мэт элсэн чихрийн найрлага, бүтцийн шинж чанарыг ойлгох нь гидролизийн үед элсэн чихрийн хувиргалтыг сайжруулж, биотехнологийн процессыг газрын тосноос гаргаж авсан бүтээгдэхүүнтэй өрсөлдөх чадвартай болгоход тусална.
Нүүрс усны бүтцийг тодорхойлох нь хэцүү бөгөөд шингэн хроматографи (LC)11,12, цөмийн соронзон резонансын спектроскопи (NMR)13, хялгасан судасны электрофорез (CE)14,15,16 болон массын спектрометр (MS)17 зэрэг аргуудыг хослуулан хэрэглэхийг шаарддаг. ,18. Лазер десорбци болон матриц (MALDI-TOF-MS) ашиглан ионжуулалттай нислэгийн хугацааны массын спектрометр зэрэг MS аргууд нь нүүрс усны бүтцийг тодорхойлох олон талын арга юм. Саяхан натрийн ионы нэмэлтүүдийн мөргөлдөөнөөс үүдэлтэй диссоциаци (CID) тандем MS-ийг олигосахаридын холболтын байрлал, аномер тохиргоо, дараалал, салаалсан байрлалд харгалзах хурууны хээг тодорхойлоход хамгийн өргөн ашиглаж байна 20, 21.
Гликаны шинжилгээ нь нүүрс усны холбоог гүнзгий тодорхойлох маш сайн хэрэгсэл юм22. Энэ арга нь ургамлын эсийн ханын гликанд чиглэсэн моноклональ эсрэгбие (mAbs)-ийг нарийн төвөгтэй нүүрс усны холбоог ойлгохын тулд зонд болгон ашигладаг. Дэлхий даяар 250 гаруй mAbs байдаг бөгөөд янз бүрийн сахаридуудыг ашиглан янз бүрийн шугаман болон салаалсан олигосахаридын эсрэг бүтээгдсэн байдаг24. Ургамлын эсийн төрөл, эрхтэн, нас, хөгжлийн үе шат, өсөлтийн орчноос хамааран мэдэгдэхүйц ялгаа байдаг тул ургамлын эсийн ханын бүтэц, найрлага, өөрчлөлтийг тодорхойлоход хэд хэдэн mAbs-ийг өргөн ашигладаг25,26. Саяхан энэ аргыг ургамал, амьтны систем дэх цэврүүний популяци болон тэдгээрийн эсийн дэд маркер, хөгжлийн үе шат эсвэл хүрээлэн буй орчны өдөөлтөөр тодорхойлогддог гликаны тээвэрлэлт дэх тус тусын үүргийг ойлгох, ферментийн идэвхийг тодорхойлоход ашиглаж байна. Гликан ба ксиланы тодорхойлсон өөр өөр бүтцийн заримд пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюкан (XylG), холимог холбоот глюкан (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкуроны хүчил-арабиноксилан (GArbX) болон арабино-галактан (ArbG)29 орно.
Гэсэн хэдий ч эдгээр бүх судалгааны хүчин чармайлтыг үл харгалзан цөөн хэдэн судалгаагаар өндөр хатуу бодисын ачаалал (HSL) гидролизийн үед олигосахаридын хуримтлалын шинж чанарт анхаарлаа хандуулсан бөгөөд үүнд олигосахаридын ялгаралт, гидролизийн үед олигомерийн гинжин хэлхээний уртын өөрчлөлт, янз бүрийн бага DP полимерүүд болон тэдгээрийн муруйнууд багтсан болно. тархалт 30,31,32. Үүний зэрэгцээ, гликаны шинжилгээ нь гликаны бүтцийг цогцоор нь шинжлэхэд хэрэгтэй хэрэгсэл болох нь батлагдсан боловч усанд уусдаг бага DP олигосахаридуудыг эсрэгбиеийн аргаар үнэлэхэд хэцүү байдаг. 5-10 кДа-аас бага молекул жинтэй жижиг DP олигосахаридууд нь ELISA хавтан 33, 34-тэй холбогддоггүй бөгөөд эсрэгбие нэмэхээс өмнө угаагдаж арилдаг.
Энд бид анх удаа моноклональ эсрэгбие ашиглан авидин бүрсэн хавтан дээр ELISA шинжилгээг үзүүлж, уусдаг галд тэсвэртэй олигосахаридын нэг үе шаттай биотинилжуулалтын процедурыг гликомын шинжилгээтэй хослуулсан. Гликомын шинжилгээнд хандах бидний хандлагыг гидролизжүүлсэн чихрийн найрлагыг триметилсилил (TMS) дериватив ашиглан нэмэлт олигосахаридын холбоог MALDI-TOF-MS болон GC-MS дээр суурилсан шинжилгээгээр баталгаажуулсан. Энэхүү шинэлэг аргыг ирээдүйд өндөр хүчин чадалтай арга болгон хөгжүүлж, биоанагаахын судалгаанд өргөн хүрээнд ашиглах боломжтой35.
Гликозилжилт зэрэг фермент ба эсрэгбиеийн орчуулгын дараах өөрчлөлтүүд нь36 нь тэдгээрийн биологийн идэвхжилд нөлөөлдөг. Жишээлбэл, сийвэнгийн уургийн гликозилжилтийн өөрчлөлт нь үрэвслийн үе мөчний үрэвсэлд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг бөгөөд гликозилжилтийн өөрчлөлтийг оношлогооны маркер болгон ашигладаг37. Хоол боловсруулах зам болон элэгний архаг үрэвсэлт өвчин, вирусын халдвар, өндгөвч, хөх, түрүү булчирхайн хорт хавдар зэрэг янз бүрийн өвчинд янз бүрийн гликанууд амархан илэрдэг болохыг уран зохиолд мэдээлсэн38,39,40. Эсрэгбие дээр суурилсан гликан ELISA аргыг ашиглан гликаны бүтцийг ойлгох нь нарийн төвөгтэй MS аргыг ашиглахгүйгээр өвчний оношлогоонд нэмэлт итгэл үнэмшил өгөх болно.
Өмнөх судалгаагаар зөрүүд олигосахаридууд нь урьдчилан боловсруулалт болон ферментийн гидролизын дараа гидролизгүй хэвээр байгааг харуулсан (Зураг 1). Өмнө нь нийтэлсэн бүтээлдээ бид AFEX-ээр урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зуухны гидролизатаас (ACSH)8 олигосахаридуудыг ялгаж авахын тулд идэвхжүүлсэн нүүрсний хатуу фазын олборлолтын аргыг боловсруулсан. Анхны олборлолт болон ялгах дараа олигосахаридуудыг хэмжээг хасах хроматографи (SEC)-ээр цаашид фракцчилж, молекулын жингийн дарааллаар цуглуулсан. Төрөл бүрийн урьдчилан боловсруулалтаас ялгарсан чихрийн мономер ба олигомеруудыг чихрийн найрлагын шинжилгээгээр шинжилсэн. Төрөл бүрийн урьдчилан боловсруулалтын аргаар гаргаж авсан чихрийн олигомеруудын агууламжийг харьцуулахдаа зөрүүд олигосахарид байгаа нь биомассыг моносахарид болгон хувиргахад түгээмэл тохиолддог асуудал бөгөөд чихрийн гарцыг дор хаяж 10-15%, тэр ч байтугай 18% хүртэл бууруулахад хүргэдэг. АНУ. Энэ аргыг олигосахаридын фракцийг цаашид томоохон хэмжээгээр үйлдвэрлэхэд ашигладаг. Үүссэн ACH болон түүний дараагийн өөр өөр молекул жинтэй фракцуудыг энэхүү ажилд олигосахаридын шинж чанарыг тодорхойлох туршилтын материал болгон ашигласан.
Урьдчилан боловсруулалт болон ферментийн гидролизын дараа тогтвортой олигосахаридууд гидролизгүй хэвээр үлджээ. Энд (A) нь идэвхжүүлсэн нүүрс болон диатомын шороон давхаргыг ашиглан AFEX-ээр урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зуухны гидролизатаас (ACSH) олигосахаридуудыг ялгах олигосахарид ялгах арга юм; (B) Олигосахаридуудыг ялгах арга. Олигосахаридуудыг хэмжээг хасах хроматографи (SEC) ашиглан цаашид ялгасан; (C) Төрөл бүрийн урьдчилсан боловсруулалтаас ялгарсан сахаридын мономер ба олигомерууд (шингэрүүлсэн хүчил: DA, ионы шингэн: IL ба AFEX). Ферментийн гидролизийн нөхцөл: 25% (w/w) хатуу бодисын өндөр ачаалал (ойролцоогоор 8% глюканы ачаалал), 96 цагийн гидролиз, 20 мг/г арилжааны ферментийн ачаалал (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 харьцаа) болон (D) AFEX урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зуухнаас (ACS) ялгарсан глюкоз, ксилоз, арабинозын чихрийн мономер ба олигомерууд.
Гликаны шинжилгээ нь хатуу биомассын үлдэгдлээс тусгаарлагдсан ханд дахь гликаны цогц бүтцийн шинжилгээнд хэрэгтэй хэрэгсэл болох нь батлагдсан. Гэсэн хэдий ч энэхүү уламжлалт аргыг41 ашиглан усанд уусдаг сахаридууд хангалтгүй төлөөлөлтэй байна, учир нь бага молекул жинтэй олигосахаридууд нь ELISA хавтан дээр хөдөлгөөнгүй болоход хэцүү бөгөөд эсрэгбие нэмэхээс өмнө угааж цэвэрлэдэг. Тиймээс эсрэгбие холбох, шинж чанарыг тодорхойлохын тулд авидинаар бүрсэн ELISA хавтан дээр уусдаг, нийцэхгүй олигосахаридуудыг бүрэхийн тулд нэг үе шаттай биотинилжуулалтын аргыг ашигласан. Энэ аргыг өмнө нь үйлдвэрлэсэн ACSH болон түүний молекул жин (эсвэл полимержилтийн зэрэг, DP) дээр үндэслэсэн фракцыг ашиглан туршсан. Нэг үе шаттай биотинилжуулалтыг нүүрс усны бууруулагч төгсгөлд биотин-LC-гидразид нэмж олигосахаридын холболтын хамаарлыг нэмэгдүүлэхэд ашигласан (Зураг 2). Уусмалд бууруулагч төгсгөлд байрлах гемиацетал бүлэг нь биотин-LC-гидразидын гидразидын бүлэгтэй урвалд орж гидразоны холбоо үүсгэдэг. NaCNBH3 бууруулагч бодис байгаа үед гидразон холбоо нь тогтвортой биотинжүүлсэн эцсийн бүтээгдэхүүн болж буурдаг. Элсэн чихэр бууруулагч төгсгөлийг өөрчилснөөр бага DP олигосахаридуудыг ELISA ялтсуудтай холбох боломжтой болсон бөгөөд бидний судалгаагаар үүнийг гликан чиглэсэн mAbs ашиглан авидин бүрсэн ялтсууд дээр хийсэн.
Биотинжүүлсэн олигосахаридын ELISA дээр суурилсан моноклональ эсрэгбиеийн скрининг. Энд (A) олигосахаридын биотинжүүлэлтийн хосолсон арга ба дараа нь НейтрАвидин бүрсэн хавтан дээр гликан чиглэсэн mAbs ашиглан ELISA скрининг хийх ба (B) нь урвалын бүтээгдэхүүнийг биотинжүүлэлтийн нэг үе шаттай процедурыг харуулж байна.
Олигосахаридтай холбогдсон эсрэгбие бүхий авидинаар бүрсэн хавтангуудыг анхдагч ба хоёрдогч эсрэгбие дээр нэмж, гэрэл болон цаг хугацааны мэдрэмжтэй орчинд угаасан. Эсрэгбиеийн холболт дууссаны дараа хавтанг өсгөвөрлөхийн тулд TMB субстратыг нэмнэ. Урвалыг эцэст нь хүхрийн хүчилээр зогсоосон. Инкубацийн хавтангуудыг ELISA уншигч ашиглан шинжилж, эсрэгбие тус бүрийн холболтын бат бөх чанарыг тодорхойлж, эсрэгбие-өвөрмөц хөндлөн холбоосыг илрүүлсэн. Туршилтын дэлгэрэнгүй мэдээлэл болон параметрүүдийг харгалзах "Материал ба аргууд" хэсгээс үзнэ үү.
Бид ACSH-д агуулагдах уусдаг олигосахаридууд болон лигноцеллюлозын гидролизатаас ялгаж авсан түүхий болон цэвэршүүлсэн олигосахаридын фракцуудыг тодорхойлсноор энэхүү шинээр боловсруулсан аргын тодорхой хэрэглээнд үзүүлэх ашиг тусыг харуулж байна. Зураг 3-т үзүүлсэнчлэн, биоацилжуулсан гликомын шинжилгээний аргыг ашиглан ACSH-д тодорхойлсон хамгийн түгээмэл эпитопоор орлуулсан ксиланууд нь ихэвчлэн уроник (U) эсвэл метилуроник (MeU) болон пектик арабиногалактанууд юм. Тэдгээрийн ихэнх нь гидролизгүй хатуу бодисын (UHS) гликануудын шинжилгээний талаарх бидний өмнөх судалгаанд мөн илэрсэн.43
Эсийн ханын гликан руу чиглэсэн моноклональ эсрэгбие ашиглан идэвхгүй олигосахаридын эпитопуудыг илрүүлэх. "Саармаг" фракц нь ACN фракц, "хүчиллэг" фракц нь FA фракц юм. Дулааны зураг дээрх тод улаан өнгө нь эпитопын өндөр агууламжийг, тод цэнхэр өнгө нь хоосон дэвсгэрийг илтгэнэ. Хуваарийн өнгөний утга нь N=2 найрлага дахь түүхий OD утга дээр үндэслэсэн болно. Эсрэгбиеийн таних гол эпитопуудыг баруун талд харуулав.
Эдгээр целлюлоз бус бүтцийг хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг арилжааны ферментүүдийг багтаасан туршилтын арилжааны ферментийн холимог дахь хамгийн түгээмэл целлюлаза ба гемицеллюлазаар задалж чадаагүй. Тиймээс тэдгээрийн гидролизд шинэ туслах ферментүүд шаардлагатай. Шаардлагатай целлюлоз бус нэмэлт ферментүүдгүйгээр эдгээр целлюлоз бус холбоо нь эх чихрийн полимерүүдийг богино хэлтэрхий болгон гидролизд оруулж, арилжааны ферментийн холимог ашиглан уусгасан ч гэсэн моносахарид болж бүрэн хувирахаас сэргийлдэг.
Дохионы тархалт болон түүний холболтын бат бэхийн цаашдын судалгаагаар өндөр DP чихрийн фракцуудад (A, B, C, DP хүртэл 20+) холболтын эпитопууд нь димер дэх бага DP фракцуудаас (D, E, F, DP) бага байсан болохыг харуулсан (Зураг 1). Хүчлийн хэлтэрхий нь целлюлозын бус эпитопуудад төвийг сахисан хэлтэрхийтэй харьцуулахад илүү түгээмэл байдаг. Эдгээр үзэгдэл нь бидний өмнөх судалгаанд ажиглагдсан хэв маягтай нийцэж байгаа бөгөөд өндөр DP болон хүчиллэг хэсгүүд нь ферментийн гидролизд илүү тэсвэртэй байсан. Тиймээс целлюлозын бус гликаны эпитопууд болон U ба MeU орлуулалтууд байгаа нь олигосахаридын тогтвортой байдалд ихээхэн хувь нэмэр оруулдаг. Бага DP олигосахаридын хувьд, ялангуяа эпитоп нь димер эсвэл тример олигосахарид бол холболт болон илрүүлэлтийн үр ашиг нь асуудалтай байж болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй. Үүнийг янз бүрийн урттай арилжааны олигосахаридуудыг ашиглан туршиж үзэх боломжтой бөгөөд тус бүр нь тодорхой mAb-тай холбогддог зөвхөн нэг эпитоп агуулдаг.
Тиймээс бүтцийн өвөрмөц эсрэгбиеийг ашиглах нь тодорхой төрлийн эсэргүүцэлгүй холбоог илрүүлсэн. Ашиглаж буй эсрэгбиеийн төрөл, тохирох холбоосын хэв маяг, түүний үүсгэдэг дохионы хүчнээс (хамгийн их ба хамгийн бага) хамааран шинэ ферментүүдийг тодорхойлж, илүү бүрэн гликоконверцийн тулд ферментийн холимогт хагас тоон үзүүлэлтээр нэмж болно. Жишээ болгон ACSH олигосахаридын шинжилгээг авч үзвэл бид биомассын материал бүрийн гликан холбооны мэдээллийн санг үүсгэж болно. Энд эсрэгбиеийн өөр өөр хамаарлыг харгалзан үзэх ёстой бөгөөд хэрэв тэдгээрийн хамаарал тодорхойгүй бол энэ нь өөр өөр эсрэгбиеийн дохиог харьцуулах үед тодорхой бэрхшээл учруулна гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. Нэмж дурдахад, ижил эсрэгбиеийн дээжүүдийн хооронд гликан холбоог харьцуулах нь хамгийн сайн ажиллаж магадгүй юм. Эдгээр зөрүүд холбоог дараа нь CAZyme мэдээллийн сантай холбож болох бөгөөд үүнээс бид ферментийг тодорхойлж, нэр дэвшигч ферментүүдийг сонгож, холбоо таслагч ферментүүдийг туршиж үзэх эсвэл эдгээр ферментийг био боловсруулах үйлдвэрт ашиглах зорилгоор илэрхийлэх бичил биетний системийг боловсруулж болно44.
Лигноцеллюлозын гидролизатад агуулагдах бага молекул жинтэй олигосахаридыг тодорхойлох өөр аргуудыг дархлаа судлалын аргууд хэрхэн нөхөж байгааг үнэлэхийн тулд бид MALDI (Зураг 4, S1-S8) болон GC-MS дээр суурилсан TMS-ээс гаралтай сахаридын шинжилгээг ижил самбар (Зураг 5) олигосахаридын хэсэгт хийсэн. MALDI-г олигосахаридын молекулуудын массын тархалт нь төлөвлөсөн бүтэцтэй тохирч байгаа эсэхийг харьцуулахын тулд ашигладаг. Зураг 4-т ACN-A ба ACN-B төвийг сахисан бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн MC-г харуулав. ACN-A шинжилгээгээр DP 4-8 (Зураг 4)-ээс DP 22 (Зураг S1) хүртэлх пентозын сахарын хүрээг баталгаажуулсан бөгөөд тэдгээрийн жин нь MeU-ксилан олигосахаридтай тохирч байна. ACN-B шинжилгээгээр DP 8-15-тай пентоз ба глюкоксилан цувралыг баталгаажуулсан. Зураг S3 гэх мэт нэмэлт материалд FA-C хүчиллэг хэсгийн массын тархалтын зураглал нь ELISA дээр суурилсан mAb скринингээр олдсон орлуулсан ксилануудтай нийцэж байгаа 8-15 DP бүхий (Me)U орлуулсан пентозын сахарын хүрээг харуулж байна. Эпитопууд нь нийцтэй байна.
ACS-д агуулагддаг уусдаг, нийцдэггүй олигосахаридын MALDI-MS спектр. Энд, (A) Метилжүүлсэн уроны хүчил (DP 4-8) орлуулсан глюкуроксилан олигосахарид агуулсан ACN-A бага жингийн хүрээний фракцууд болон (B) Глюкуроксиланаар орлуулсан ACN-B ксилан ба метилжүүлсэн уроны хүчлийн олигосахаридууд (DP 8-15).
Галд тэсвэртэй олигосахаридын гликаны үлдэгдлийн найрлагын шинжилгээ. Энд (A) GC-MS шинжилгээг ашиглан гаргаж авсан янз бүрийн олигосахаридын фракцуудын TMS сахаридын найрлага. (B) Олигосахаридуудад агуулагддаг янз бүрийн TMS-ээс гаралтай чихрийн бүтэц. ACN – төвийг сахисан олигосахарид агуулсан ацетонитрил фракц ба FA – хүчил олигосахарид агуулсан ферул хүчлийн фракц.
Зураг S9-т үзүүлсэн шиг олигосахаридын фракцийн LC-MS шинжилгээнээс өөр нэгэн сонирхолтой дүгнэлт гарсан (аргачлалыг электрон нэмэлт материалаас харж болно). ACN-B фракцийг холбох явцад гексоз ба -OAc бүлгийн хэлтэрхийг дахин дахин ажигласан. Энэхүү олдвор нь гликом болон MALDI-TOF шинжилгээнд ажиглагдсан хуваагдлыг баталгаажуулаад зогсохгүй урьдчилан боловсруулсан лигноцеллюлозын биомасс дахь нүүрс усны деривативын талаарх шинэ мэдээллийг өгч байна.
Бид мөн TMS чихрийн деривативжуулалтыг ашиглан олигосахаридын фракцийн чихрийн найрлагыг шинжилсэн. GC-MS ашиглан бид олигосахаридын фракц дахь мэдрэлийн (дериватив бус) болон хүчиллэг сахар (GluA ба GalA)-ийн найрлагыг тодорхойлсон (Зураг 5). Глюкуроны хүчил нь хүчиллэг бүрэлдэхүүн хэсгүүд болох C ба D-д байдаг бол галактуроны хүчил нь хүчиллэг сахарын өндөр DP бүрэлдэхүүн хэсгүүд болох A ба B-д байдаг. Эдгээр үр дүн нь бидний ELISA болон MALDI өгөгдлийг баталгаажуулаад зогсохгүй олигосахаридын хуримтлалын талаарх өмнөх судалгаатай нийцэж байна. Тиймээс олигосахаридын биотинилжуулалт болон дараагийн ELISA скринингийг ашиглан орчин үеийн дархлаа судлалын аргууд нь янз бүрийн биологийн дээжинд уусдаг үлдэгдэл олигосахаридуудыг илрүүлэхэд хангалттай гэж бид үзэж байна.
ELISA дээр суурилсан mAb скрининг аргуудыг хэд хэдэн өөр аргаар баталгаажуулсан тул бид энэхүү шинэ тоон аргын боломжийг цаашид судлахыг хүссэн. Ксилогексасахарид олигосахарид (XHE) болон 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоз (A2XX) гэсэн хоёр арилжааны олигосахаридийг худалдан авч, эсийн ханын гликаныг чиглүүлсэн шинэ mAb аргыг ашиглан туршсан. Зураг 6-д биотинилжүүлсэн холболтын дохио болон олигосахаридын логарифмын концентрацийн хоорондох шугаман хамаарлыг харуулсан бөгөөд энэ нь Лангмюрийн адсорбцийн загвар байж болохыг харуулж байна. mAbs-ийн дотроос CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, CCRC-M151 нь XHE-тэй, CCRC-M108, CCRC-M109, LM11 нь 1 нм-ээс 100 нано хүртэлх хугацаанд A2XX-тэй хамааралтай байв. Туршилтын үеэр эсрэгбие хязгаарлагдмал байсан тул олигосахаридын концентраци бүрээр хязгаарлагдмал туршилт хийсэн. Зарим эсрэгбие нь ижил олигосахаридтай субстрат хэлбэрээр маш өөрөөр хариу үйлдэл үзүүлдэг болохыг энд тэмдэглэх нь зүйтэй бөгөөд энэ нь тэдгээр нь арай өөр эпитопуудтай холбогддог бөгөөд маш өөр холбох чадвартай байж болохтой холбоотой байж болох юм. Шинэ mAb аргыг бодит дээжинд хэрэглэхэд эпитопыг нарийн тодорхойлох механизм ба үр дагавар нь илүү төвөгтэй байх болно.
Гликан чиглэсэн янз бүрийн mAb-ийн илрүүлэх хүрээг тодорхойлохын тулд хоёр арилжааны олигосахарид ашигласан. Энд олигосахаридын концентрацийн логарифм концентрацитай шугаман хамаарал нь (A) mAb бүхий XHE болон (B) mAb бүхий A2XX-ийн Лангмюрийн адсорбцийн хэв маягийг харуулж байна. Харгалзах эпитопууд нь шинжилгээнд субстрат болгон ашигласан арилжааны олигосахаридын бүтцийг заана.
Гликан чиглэсэн моноклональ эсрэгбие (гликокомик шинжилгээ эсвэл ELISA дээр суурилсан mAb скрининг) ашиглах нь ургамлын биомассыг бүрдүүлдэг эсийн ханын гликануудын ихэнхийг гүнзгийрүүлэн тодорхойлох хүчирхэг хэрэгсэл юм. Гэсэн хэдий ч сонгодог гликаны шинжилгээ нь зөвхөн том эсийн ханын гликануудыг тодорхойлдог, учир нь ихэнх олигосахаридууд ELISA хавтан дээр үр дүнтэй хөдөлгөөнгүй болдоггүй. Энэхүү судалгаанд AFEX-ээр урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зуухыг өндөр хатуу бодисын агууламжтай ферментийн аргаар гидролизд оруулсан. Гидролизат дахь эсийн ханын нүүрс усны найрлагыг тодорхойлохын тулд элсэн чихрийн шинжилгээг ашигласан. Гэсэн хэдий ч гидролизат дахь жижиг олигосахаридын mAb шинжилгээг дутуу үнэлж байгаа бөгөөд ELISA хавтан дээрх олигосахаридуудыг үр дүнтэй хөдөлгөөнгүй болгохын тулд нэмэлт хэрэгсэл шаардлагатай байна.
Бид энд NeutrAvidin™ бүрсэн хавтан дээр олигосахаридын биотинилжилтийг хослуулан дараа нь ELISA шинжилгээг ашиглан mAb скрининг хийх шинэлэг бөгөөд үр дүнтэй олигосахаридыг иммобилизацийн аргыг танилцуулж байна. Иммобилизацилагдсан биотинилжүүлсэн олигосахаридууд нь эсрэгбиед хангалттай хамааралтай болохыг харуулсан бөгөөд энэ нь эсэргүүцэгч олигосахаридуудыг хурдан бөгөөд үр дүнтэй илрүүлэх боломжийг олгодог. Массын спектрометр дээр үндэслэн эдгээр зөрүүд олигосахаридын найрлагын шинжилгээ нь дархлааны скрининг хийх энэхүү шинэ аргын үр дүнг баталгаажуулсан. Тиймээс эдгээр судалгаагаар олигосахаридын биотинилжилт ба ELISA шинжилгээг гликан чиглэсэн моноклональ эсрэгбиетэй хослуулан олигосахаридын хөндлөн холбоосыг илрүүлэхэд ашиглаж болох бөгөөд олигосахаридын бүтцийг тодорхойлдог бусад биохимийн судалгаанд өргөнөөр ашиглаж болохыг харуулж байна.
Энэхүү биотин дээр суурилсан гликаны профайлын арга нь ургамлын биомасс дахь уусдаг олигосахаридын үл тоомсорлодог нүүрс усны холбоог судлах чадвартай анхны тайлан юм. Энэ нь биомассын зарим хэсэг нь био түлш үйлдвэрлэхэд яагаад ийм зөрүүд байдгийг ойлгоход тусалдаг. Энэ арга нь гликомын шинжилгээний аргуудын чухал цоорхойг нөхөж, ургамлын олигосахаридаас гадна илүү өргөн хүрээний субстратад хэрэглэх боломжийг өргөжүүлдэг. Ирээдүйд бид биотинилжуулалтад робот техникийг ашиглаж, ELISA ашиглан дээжийн өндөр хүчин чадалтай шинжилгээнд зориулж боловсруулсан аргыг ашиглаж болно.
Pioneer 33A14 эрлийз үрнээс ургуулсан эрдэнэ шишийн сүрлийг (CS) 2010 онд Колорадо мужийн Рэй хотын Крамер фермээс хурааж авсан. Газар эзэмшигчийн зөвшөөрлөөр энэхүү биомассыг судалгаанд ашиглаж болно. Дээжийг өрөөний температурт хуурай, 6%-иас бага чийгшилтэй, зип түгжээтэй уутанд хадгалсан. Дээжийг өрөөний температурт хуурай, 6%-иас бага чийгшилтэй, зип түгжээтэй уутанд хадгалсан. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Дээжийг өрөөний температурт, цахилгаантай уутанд хийж, <6%-ийн чийгшилтэй хуурайгаар хадгалсан.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Дээжийг цахилгаантай уутанд хийж, өрөөний температурт, чийгшил < 6% -иар хадгална.Судалгаа нь орон нутгийн болон үндэсний удирдамжийг дагаж мөрдсөн. Найрлагын шинжилгээг NREL протоколыг ашиглан хийсэн. Найрлагад 31.4% глюкан, 18.7% ксилан, 3.3% арабинан, 1.2% галактан, 2.2% ацетил, 14.3% лигнин, 1.7% уураг, 13.4% үнс агуулагдаж байсан.
Cellic® CTec2 (138 мг уураг/мл, багц VCNI 0001) нь Novozymes (Франклинтон, Хойд Каролина, АНУ)-ын целлюлаза, β-глюкозидаза болон Cellic® HTec2 (157 мг уураг/мл, багц VHN00001)-ийн цогц холимог юм. Пектин задалдаг ферментийн цогц холимог болох Multifect Pectinase® (72 мг уураг/мл)-ийг DuPont Industrial Biosciences (Пало Алто, Калифорни, АНУ) хандивласан. Ферментийн уургийн концентрацийг Kjeldahl азотын шинжилгээг ашиглан уургийн агууламжийг тооцоолох (мөн уургийн бус азотын хувь нэмрийг хасах) замаар тодорхойлсон (AOAC арга 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, АНУ). Диатомийн шороон 545-г EMD Millipore (Billerica, MA)-аас худалдаж авсан. Идэвхжүүлсэн нүүрс (DARCO, 100 торон мөхлөг), Avicel (PH-101), beech ксилан болон бусад бүх химийн бодисыг Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)-аас худалдаж авсан.
AFEX урьдчилсан боловсруулалтыг GLBRC (Биомасс хувиргах судалгааны лаборатори, MSU, Лансинг, MI, АНУ)-д хийсэн. Урьдчилсан боловсруулалтыг 140°C-д 15 минутын турш явуулсан. Усгүй аммиакийг биомасстай 60% (w/w) ачаалалтайгаар 1:1 харьцаатайгаар 46 минут байлгасан. Энэ нь 30 минут үргэлжилсэн. Реакторыг 140°C хүртэл халааж, аммиакийг хурдан ялгаруулж, биомассыг өрөөний температурт хурдан буцаах боломжийг олгосон. AFEX урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зуухны (ACS) найрлага нь боловсруулаагүй эрдэнэ шишийн зуухны (UT-CS) найрлагатай төстэй байв.
Олигосахаридыг их хэмжээгээр үйлдвэрлэх эхлэлийн материал болгон өндөр хатуу бодис болох ACSH 25% (w/w) (ойролцоогоор 8% декстраны ачаалалтай) бэлтгэсэн. ACS-ийн ферментийн гидролизийг Cellic® Ctec2 10 мг уураг/г глюкан (урьдчилан боловсруулсан биомасс дотор), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг уураг/г глюкан, Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) зэрэг арилжааны ферментийн холимог ашиглан гүйцэтгэсэн. Ферментийн гидролизийг 3 литрийн ажлын эзэлхүүнтэй, рН 4.8, 50°C, 250 эрг/мин бүхий 5 литрийн биореакторт хийсэн. 96 цагийн турш гидролиз хийсний дараа гидролизжүүлсэн хатуу бодисыг зайлуулахын тулд гидролизжүүлсэн хатуу бодисыг 6000 эрг/мин-д 30 минутын турш, дараа нь 14000 эрг/мин-д 30 минутын турш центрифугээр цуглуулсан. Дараа нь гидролизатыг 0.22 мм-ийн шүүлтүүртэй шилэн саванд ариутгасан шүүлтүүрт оруулсан. Шүүгдсэн гидролизатыг 4°C-д ариутгасан шилэнд хадгалж, дараа нь нүүрстөрөгч дээр фракцчилсан.
NREL лабораторийн шинжилгээний журмын дагуу ханд дээр суурилсан биомассын дээжийн найрлагыг шинжлэх: найрлагын шинжилгээнд зориулж дээж бэлтгэх (NREL/TP-510-42620) болон биомасс дахь бүтцийн нүүрс ус болон лигнинийг тодорхойлох (NREL/TP-510 – 42618)47.
Гидролизатын урсгалын олигосахаридын шинжилгээг автоклавт суурилсан хүчил гидролизийн аргаар 2 мл-ийн масштабаар гүйцэтгэсэн. Гидролизатын дээжийг 10 мл-ийн шураг тагтай өсгөврийн хоолойд 69.7 мкл 72% хүхрийн хүчилтэй хольж, 121 °C-д 1 цаг ширээн дээр өсгөвөрлөж, мөсөн дээр хөргөөд өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийн (HPLC) шилэнд шүүнэ. Олигосахаридын концентрацийг гидролизгүй дээж дэх моносахаридын концентрацийг хүчил-гидролизжүүлсэн дээж дэх нийт чихрийн концентрацаас хасаж тодорхойлсон.
Хүчил гидролизжүүлсэн биомасс дахь глюкоз, ксилоз, арабинозын концентрацийг Bio-Rad Aminex HPX-87H баганад авто дээж авагч, баганын халаагч, изократ насос, хугарлын илтгэгч мэдрэгч бүхий Shimadzu HPLC системийг ашиглан шинжилсэн. Баганыг 50°C-д байлгаж, 0.6 мл/мин 5 мМ H2SO4-ийг усны урсгалаар элюцидсэн.
Гидролизатын дээд давхаргыг шингэлж, мономер болон олигосахаридын агууламжийг шинжилсэн. Ферментийн гидролизийн дараа гаргаж авсан мономер элсэн чихрийг Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P багана болон үнсний хамгаалалтын багана бүхий HPLC-ээр шинжилсэн. Баганын температурыг 80°C-д байлгаж, усыг хөдөлгөөнт фаз болгон 0.6 мл/мин урсгалын хурдтайгаар ашигласан. Олигосахаридуудыг 41, 48, 49-р лавлагаанд тайлбарласан аргуудын дагуу 121°C-д шингэрүүлсэн хүчилд гидролизоор тодорхойлсон.
Сахаридын шинжилгээг түүхий, AFEX урьдчилан боловсруулсан болон гидролизжүүлээгүй бүх биомассын үлдэгдэл дээр (цуврал эсийн ханын ханд үйлдвэрлэх болон тэдгээрийн mAb скринингийг оролцуулан) өмнө нь тайлбарласан 27, 43, 50, 51 процедурыг ашиглан хийсэн. Гликомын шинжилгээнд ургамлын эсийн ханын материалын спиртэнд уусдаггүй үлдэгдлийг биомассын үлдэгдлээс бэлтгэж, аммонийн оксалат (50 мМ), натрийн карбонат (50 мМ ба 0.5% w/v), CON (1M ба 4M, хоёулаа 1% w/v натрийн борогидридтай) болон хүчил хлорит зэрэг улам бүр түрэмгий урвалжуудаар өмнө нь тайлбарласны дагуу цуврал хандлахад оруулдаг52,53. Дараа нь хандыг эсийн ханын гликан руу чиглэсэн mAb50-ийн цогц самбар дээр ELISA-д хамруулж, mAb холболтын урвалыг дулааны зураглал болгон үзүүлэв. Ургамлын эсийн ханын гликан руу чиглэсэн mAb-ийг лабораторийн нөөцөөс (CCRC, JIM ба MAC цуврал) худалдаж авсан.
Олигосахаридын нэг үе шаттай биотинилжилт. Нүүрс усыг биотин-LC-гидразидтай нэгтгэх ажлыг дараах аргаар гүйцэтгэсэн. Биотин-LC-гидразид (4.6 мг/12 мкмоль)-ийг диметил сульфоксид (DMSO, 70 мкл)-д хүчтэй хутгаж, 65°C-д 1 минутын турш халааж уусгасан. Мөсөн цууны хүчил (30 мкл) нэмж, хольцыг натрийн цианоборогидрид (6.4 мг/100 мкмоль) дээр цутгаж, 65°C-д 1 минут орчим халаасны дараа бүрэн уусгасан. Дараа нь урвалын хольцын 5-8 мкл-ийг хатаасан олигосахарид (1-100 нмоль) дээр нэмж, шошгоны илүүдэл бууруулагч үзүүрээс 10 дахин их буюу түүнээс дээш молийн илүүдэл гаргаж авсан. Урвалыг 65°C-д 2 цагийн турш явуулсан бөгөөд үүний дараа дээжийг нэн даруй цэвэршүүлсэн. Шошгололтын туршилтанд натрийн цианоборогидридыг бууруулалтгүйгээр ашиглаагүй бөгөөд дээжийг 65°C-д 2.5 цагийн турш урвалд оруулсан.
Биотинжүүлсэн олигосахаридын дээжийг ELISA аргаар бүрэх ба угаах. Авидин бүрсэн хавтангийн нүх бүрт 25 мкл биотинжүүлсэн дээж (5 мл 0.1 М Трис буфер уусмалд (TBS) шингэлсэн төвлөрсөн дээж тус бүрээс 100 мкл) нэмсэн. Хяналтын нүхийг 0.1 М TBS-д 10 мкг/мл концентрацитай 50 мкл биотиноор бүрсэн. Хоосон хэмжилт хийхэд бүрхүүл болгон деионжуулсан ус ашигласан. Шахмалыг өрөөний температурт харанхуй газар 2 цагийн турш инкубацлав. Grenier flat 3A-ийн 11-р програмыг ашиглан хавтанг 0.1 М TBS-д 0.1% тослоггүй сүүгээр 3 удаа угаана.
Анхдагч эсрэгбие нэмэх ба угаах. Худаг бүрт 40 µл анхдагч эсрэгбие нэмнэ. Микроплантыг өрөөний температурт харанхуйд 1 цагийн турш өсгөвөрлөнө. Дараа нь Grenier Flat 3A-ийн 11-р угаах програмыг ашиглан хавтангуудыг 0.1 мл аяганд 0.1% сүүгээр 3 удаа угаана.
Хоёрдогч эсрэгбие нэмээд угаана. Нүх бүрт 50 мкл хулгана/хархны хоёрдогч эсрэгбие (0.1 мл аяганд 0.1% сүүнд 1:5000 харьцаагаар шингэлсэн) нэмнэ. Микроплантыг өрөөний температурт харанхуй газар 1 цаг өсгөвөрлөнө. Дараа нь микроплантуудыг Grenier Flat 5A хавтан угаах програм #12 ашиглан 0.1% сүүгээр 0.1 мл аяганд 5 удаа угаана.
Субстрат нэмэх. Үндсэн субстратад 50 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB) нэмнэ (15 мл ионгүйжүүлсэн усанд 2 дусал буфер, 3 дусал TMB, 2 дусал устөрөгчийн хэт исэл нэмнэ). TMB субстратыг бэлтгэнэ. Хэрэглэхийн өмнө хутгана). Микроплантыг өрөөний температурт 30 минут инкубацлана. Харанхуй газар.
Алхамыг гүйцээгээд таблетыг уншина уу. Худаг бүрт 50 µл 1 Н хүхрийн хүчил нэмж, ELISA уншигч ашиглан 450-655 нм-ийн шингээлтийг тэмдэглэнэ үү.
Эдгээр аналитын 1 мг/мл уусмалыг ионгүйжүүлсэн усанд бэлтгэнэ: арабиноз, рамноз, фукоз, ксилоз, галактуроны хүчил (GalA), глюкуроны хүчил (GlcA), манноз, глюкоз, галактоз, лактоза, N-ацетилманнозамин (manNAc), N-ацетилглюкозамин. (glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (дотоод стандарт). Хүснэгт 1-т үзүүлсэн 1 мг/мл чихрийн уусмалыг нэмж хоёр стандартыг бэлтгэсэн. Дээжийг бүх усыг нь авах хүртэл (ихэвчлэн 12-18 цаг орчим) -80°C-д хөлдөөж, лиофилжүүлнэ.
Шинжилгээний жинлүүр дээр таглаатай хоолойд 100–500 мкг дээж нэмнэ. Нэмсэн хэмжээг тэмдэглэнэ үү. Дээжийг тодорхой концентрацитай уусгагчид уусгаад, шингэн хэсэг болгон хоолойд нэмэх нь хамгийн сайн арга юм. Дээжийн хоолой бүрт 20 мкл 1 мг/мл инозитолыг дотоод стандарт болгон ашиглана. Дээжид нэмсэн дотоод стандартын хэмжээ нь стандарт хоолойд нэмсэн дотоод стандартын хэмжээтэй ижил байх ёстой.
Шураг таглаатай шилэнд 8 мл усгүй метанол нэмнэ. Дараа нь 4 мл 3 Н метанолын HCl уусмал хийж, таглаад сэгсэрнэ. Энэ процесст ус ашиглахгүй.
Олигосахаридын дээж болон стандарт TMS хоолойд 500 мкл 1 М HCl метанолын уусмал нэмнэ. Дээжийг 80°C-д дулааны блокт шөнөжин (168 цаг) инкубацлав. Метанолизийн бүтээгдэхүүнийг өрөөний температурт хатаах коллектор ашиглан хатаана. 200 мкл MeOH нэмээд дахин хатаана. Энэ процессыг хоёр удаа давтана. Дээжид 200 мкл метанол, 100 мкл пиридин, 100 мкл цууны ангидрид нэмээд сайтар холино. Дээжийг өрөөний температурт 30 минут инкубацлаад хатаана. 200 мкл метанол нэмээд дахин хатаана.
200 мкл Три-Сил нэмээд таглаатай хоолойг 20 минут халаана. 80°C температурт, дараа нь өрөөний температурт хөргөнө. Хатаах коллектор ашиглан дээжийг ойролцоогоор 50 мкл эзэлхүүнтэй болтол нь хатаана. Бид дээжийг бүрэн хатаахыг зөвшөөрөөгүй гэдгийг анхаарах нь чухал юм.
2 мл гексан нэмээд хутгаж сайтар холино. Пастерийн пипеткийн (5-8 мм) үзүүрийг шилэн хөвөнг 5-3/4 инчийн диаметртэй пипетк дээр хийж шилэн хөвөнгөөр ​​дүүргэнэ. Дээжийг 3000 г-д 2 минутын турш центрифугээр түлхэнэ. Уусдаггүй үлдэгдэл тунадасждаг. Дээжийг 100-150 мкл хүртэл хатаана. Ойролцоогоор 1 мкл эзэлхүүнийг GC-MS-д 80 °C анхны температурт, 2.0 минутын хугацаанд тарьсан (Хүснэгт 2).