Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። የሚጠቀሙበት የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የCSS ድጋፍ አለው። ለተሻለ ተሞክሮ፣ የዘመነ አሳሽ እንዲጠቀሙ እንመክራለን (ወይም በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር ውስጥ የተኳኋኝነት ሁነታን እንዲያሰናክሉ)። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ፣ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናቀርባለን።
በ AFEX ቅድመ-ህክምና በተደረገላቸው የበቆሎ ምድጃ ውስጥ ያሉ ዘላቂ ኦሊጎሳካራይድ ውስብስብ ትንተናዎችን ለማካሄድ አዳዲስ የበሽታ መከላከያ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪክ ዘዴዎች። ሊኖሴሉሎሲክ ባዮማስ ለቅሪተ አካል ነዳጆች ዘላቂ አማራጭ ሲሆን እንደ ምግብ፣ መኖ፣ ነዳጆች እና ኬሚካሎች ያሉ ምርቶችን ለማምረት ባዮቴክኖሎጂዎችን ለማዘጋጀት በስፋት ጥቅም ላይ ይውላል። የእነዚህ ቴክኖሎጂዎች ቁልፍ በእፅዋት ሴል ግድግዳዎች ውስጥ የሚገኙትን ውስብስብ ካርቦሃይድሬት እንደ ግሉኮስ፣ ክሲሎዝ እና አራቢኖዝ ያሉ ቀላል ስኳርዎችን ለመቀየር ወጪ ቆጣቢ ሂደቶችን ማዘጋጀት ነው። ሊኖሴሉሎሲክ ባዮማስ በጣም ግትር ስለሆነ የተፈለገውን ምርት ለማግኘት በጥምረት ለቴርሞኬሚካል ሕክምናዎች (ለምሳሌ የአሞኒያ ፋይበር ኤክስፎሊሽን (AFEX)፣ ዲሉቲቭ አሲዶች (DA)፣ አዮኒክ ፈሳሾች (IL)) እና ባዮሎጂካል ሕክምናዎች (ለምሳሌ፣ ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ እና ማይክሮባይል ፍላት) መገዛት አለበት። ሆኖም ግን፣ የንግድ የፈንገስ ኢንዛይሞች በሃይድሮሊሲስ ሂደት ውስጥ ጥቅም ላይ ሲውሉ፣ ከተፈጠሩት የሚሟሟ ስኳር ውስጥ 75-85% የሚሆኑት ሞኖሳካራይድ ሲሆኑ የተቀሩት 15-25% ደግሞ የሚሟሟ፣ የማይታከሙ ኦሊጎሳካራይድ ናቸው፣ እነዚህም ሁልጊዜ ለማይክሮባዮኖች አይገኙም። ቀደም ሲል፣ የካርቦን እና የዲያቶማሴስ ምድር መለያየት እና የመጠን ማግለል ክሮማቶግራፊን በማጣመር የሚሟሟ ግትር የሆኑ ኦሊጎሳካራዶችን በተሳካ ሁኔታ ለይተን እና አጽድተናል፣ እንዲሁም የኢንዛይም መከላከያ ባህሪያቸውን መርምረናል። ከፍተኛ ደረጃ ያለው ፖሊመሪዜሽን (DP) ሜቲላይትድ ዩሮኒክ አሲድ ምትክዎችን የያዙ ኦሊጎሳካራዶች ከዝቅተኛ ዲፒ እና ገለልተኛ ኦሊጎሳካራዶች ይልቅ በንግድ ኢንዛይም ውህዶች ለማስኬድ የበለጠ አስቸጋሪ እንደሆኑ ደርሰንበታል። እዚህ ላይ በእፅዋት ሴል ግድግዳዎች እና ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሳቶች ውስጥ የግሊካን ቦንዶችን ለመለየት ለእፅዋት ባዮማስ ግሊካንስ የተወሰኑ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላትን (mAbs) በመጠቀም የግሊካን ፕሮፋይልን ጨምሮ በርካታ ተጨማሪ ዘዴዎችን መጠቀምን ሪፖርት እናደርጋለን፣ ይህም በእፅዋት ሴል ግድግዳዎች እና ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሳቶች ውስጥ የግሊካን ቦንዶችን ለመለየት፣ ማትሪክስ-አሲስትድ ሌዘር ዲሶርፕሽን አዮኒዜሽን፣ የጊዜ-ኦፍ-ፍላይት ማሴስትሮሜትሪ። MALDI-TOF-MS) ከሁለተኛ ደረጃ መበስበስ በኋላ በስፔክትሮስኮፒ የተገኙ መዋቅራዊ-መረጃ ሰጪ የምርመራ ጫፎችን ይጠቀማል፣ የጋዝ ክሮማቶግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (GC-MS) ከዲሪቫትላይዜሽን ጋር እና ያለሱ የኦሊጎሳካራይድ ቦንዶችን ለመለየት። አነስተኛ መጠን ያላቸው ኦሊጎሳክሳክራይድ (DP 4–20) በመኖራቸው፣ እነዚህ ሞለኪውሎች ለ mAb ትስስር እና ባህሪ ለመጠቀም አስቸጋሪ ናቸው። ይህንን ችግር ለማሸነፍ፣ አብዛኛዎቹን ዝቅተኛ DP የሚሟሟ ኦሊጎሳክሳክራይድ በማይክሮፕሌት ወለል ላይ በተሳካ ሁኔታ የተመዘገበ አዲስ ባዮቲን ኮንጁጅሽን ላይ የተመሠረተ ኦሊጎሳክሳክራይድ ኢሞቢላይዜሽን ዘዴን ተግባራዊ አድርገናል፣ ይህም ከዚያ በኋላ ለተለየ የመለጠጥ ትንተና በከፍተኛ የመተላለፊያ mAb ስርዓት ውስጥ ጥቅም ላይ ውሏል። ይህ አዲስ ዘዴ ለወደፊቱ ለምርመራ ዓላማዎች በባዮማርከሮች ውስጥ የሚገኙትን ኦሊጎሳክሳክራይድዎችን ለመለየት እና ለመለየት የሚያገለግሉ የበለጠ የላቀ የከፍተኛ የመተላለፊያ ግላይኮም ምርመራዎችን ለማዘጋጀት ያመቻቻል።
ሊኖሴሉሎሲክ ባዮማስ፣ ከግብርና፣ ከደን፣ ከሣር እና ከእንጨት በተሠሩ ቁሳቁሶች የተዋቀረ፣ ከፍተኛ ዋጋ ያላቸውን ምርቶች ለማምረት ምግብ፣ መኖ፣ ነዳጅ እና የኬሚካል ቅድመ-ቅጦችን ጨምሮ ባዮ-ተኮር ምርቶችን ለማምረት የሚያስችል የመኖ ክምችት ነው። በእፅዋት ሴል ግድግዳዎች ውስጥ የሚገኙት ካርቦሃይድሬቶች (እንደ ሴሉሎስ እና ሄሚሴሉሎስ ያሉ) በኬሚካል ማቀነባበሪያ እና ባዮትራንስፎርሜሽን (እንደ ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ እና ማይክሮባይት ፍላት) ወደ ሞኖሳካራይድ ይቀየራሉ። የተለመዱ ቅድመ-ህክምናዎች የአሞኒያ ፋይበር መስፋፋት (AFEX)፣ ዲሊት አሲድ (DA)፣ አዮኒክ ፈሳሽ (IL) እና የእንፋሎት ፍንዳታ (SE) ያካትታሉ፣ እነዚህም የእፅዋት ሴል ግድግዳዎችን በመክፈት የሊኖሴሉሎስ ምርትን ለመቀነስ የኬሚካሎች እና የሙቀት ጥምረት ይጠቀማሉ3,4. የቁስ ግትርነት፣ 5. ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ የሚከናወነው ከፍተኛ ጠጣር ጭነት ባለው የንግድ ንቁ ካርቦሃይድሬት የያዙ ኢንዛይሞችን (CAZymes) እና ባዮ-ተኮር ነዳጆችን እና ኬሚካሎችን ለማምረት ትራንስጀኒክ እርሾዎችን ወይም ባክቴሪያዎችን በመጠቀም ማይክሮባላዊ ፍላት ነው።
በንግድ ኢንዛይሞች ውስጥ ያሉ CAZymes ውስብስብ ካርቦሃይድሬት-የስኳር ትስስርን በማጣመር ሞኖሳካሪዶች2,7 እንዲፈጠሩ የሚያደርጉ ውስብስብ የኢንዛይሞች ድብልቅ ናቸው። ቀደም ብለን እንደዘገብነው፣ የሊኒን እና የካርቦሃይድሬት አሮማቲክ ፖሊመሮች ውስብስብ አውታረ መረብ በጣም የማይበገሩ ያደርጋቸዋል፣ ይህም ወደ ያልተሟላ የስኳር ልወጣ ይመራል፣ ይህም አስቀድሞ የታከመው ባዮማስ ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ በሚፈጠርበት ጊዜ የማይመረቱ 15-25% የሚሆኑ የወሲብ ኦሊጎሳካሪዶችን ያከማቻል። ይህ በተለያዩ የባዮማስ ቅድመ-ህክምና ዘዴዎች የተለመደ ችግር ነው። ለዚህ ችግር አንዳንድ ምክንያቶች በሃይድሮሊሲስ ወቅት የኢንዛይም እገዳ ወይም በእፅዋት ባዮማስ ውስጥ የስኳር ትስስርን ለመስበር የሚያስፈልጉ አስፈላጊ አስፈላጊ ኢንዛይሞች አለመኖር ወይም ዝቅተኛ ደረጃዎችን ያካትታሉ። እንደ ኦሊጎሳካሪዶች ውስጥ ያሉ የስኳር ትስስር ያሉ የስኳር ስብጥር እና መዋቅራዊ ባህሪያትን መረዳት በሃይድሮሊሲስ ወቅት የስኳር ልወጣን ለማሻሻል ይረዳናል፣ ይህም ባዮቴክኖሎጂያዊ ሂደቶች ከፔትሮሊየም የተገኙ ምርቶች ጋር ተመጣጣኝ ዋጋ ያስከፍላሉ።
የካርቦሃይድሬትን አወቃቀር መወሰን ፈታኝ ሲሆን እንደ ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ (LC)11,12፣ የኑክሌር ማግኔቲክ ሬዞናንስ ስፔክትሮስኮፒ (NMR)13፣ ካፊላሪ ኤሌክትሮፎረሲስ (CE)14,15,16 እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (MS)17 ያሉ ዘዴዎችን ጥምረት ይጠይቃል። እንደ የሌዘር ዲሶርፕሽን ያለው የጊዜ-ኦፍ-ፍላይት የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ እና ማትሪክስ (MALDI-TOF-MS) በመጠቀም አዮኔዜሽን ያሉ የMS ዘዴዎች የካርቦሃይድሬት አወቃቀሮችን ለመለየት ሁለገብ ዘዴ ናቸው። በቅርቡ፣ የግጭት-ኢንዳክድ ዲሶሲዬሽን (CID) ታንደም ኤምኤስ ኦፍ ሶዲየም አዮኖች አዳክተሮች ከኦሊጎስካካርዴድ አባሪ ቦታዎች፣ አኖሜሪክ ውቅሮች፣ ቅደም ተከተሎች እና የቅርንጫፍ ቦታዎች 20፣ 21 ጋር የሚዛመዱ የጣት አሻራዎችን ለመለየት በስፋት ጥቅም ላይ ውሏል።
የግላይካን ትንተና የካርቦሃይድሬት ትስስርን በጥልቀት ለመለየት በጣም ጥሩ መሳሪያ ነው22. ይህ ዘዴ ውስብስብ የካርቦሃይድሬት ትስስርን ለመረዳት እንደ መመርመሪያዎች ወደ ተክል ሴል ግድግዳ ግላይካን የሚመሩ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላትን (mAbs) ይጠቀማል። ከ250 mAbs በላይ በዓለም ዙሪያ ይገኛሉ፣ የተለያዩ ሳክራክራይዴስ24 በመጠቀም በተለያዩ መስመራዊ እና ቅርንጫፎች ባላቸው ኦሊጎሳካራይድ ላይ የተነደፉ ናቸው። በርካታ mAbs የእፅዋት ሴል ግድግዳ አወቃቀር፣ ቅንብር እና ማሻሻያዎችን ለመለየት በስፋት ጥቅም ላይ ውለዋል፣ ምክንያቱም በእፅዋት ሴል አይነት፣ አካል፣ ዕድሜ፣ የእድገት ደረጃ እና የእድገት አካባቢ ላይ በመመስረት ጉልህ ልዩነቶች ስላሉ25,26። በቅርብ ጊዜ፣ ይህ ዘዴ በእፅዋት እና በእንስሳት ስርዓቶች ውስጥ የቬሲክል ህዝቦችን እና በግላይካን ትራንስፖርት ውስጥ ያላቸውን ሚና ለመረዳት እና በንዑስ ሴሉላር ማርከሮች፣ የእድገት ደረጃዎች ወይም የአካባቢ ማነቃቂያዎች የሚወሰኑትን ለመረዳት እና የኢንዛይም እንቅስቃሴን ለመወሰን ጥቅም ላይ ውሏል። ከተለዩት የተለያዩ የግሊካን እና የዛይላን አወቃቀሮች መካከል ፔክቲን (P)፣ ዛይላን (X)፣ ማናን (M)፣ ዛይሎሉካን (XylG)፣ የተደባለቀ ቦንድ ግሉካንስ (MLG)፣ አራቢኖክሲላን (ArbX)፣ ጋላክቶማናን (GalG)፣ ግሉኩሮኒክ አሲድ-አራቢኖክሲላን (GArbX) እና አራቢኖ-ጋላክታን (ArbG)29 ይገኙበታል።
ይሁን እንጂ፣ እነዚህ ሁሉ የምርምር ጥረቶች ቢኖሩም፣ ከፍተኛ የጠጣር ጭነት (HSL) ሃይድሮሊሲስ በሚከሰትበት ጊዜ የኦሊጎሳካራይድ ክምችት ተፈጥሮ ላይ ያተኮሩ ጥቂት ጥናቶች ብቻ ናቸው፣ ይህም የኦሊጎሳካራይድ ልቀት፣ በሃይድሮሊሲስ ወቅት የኦሊጎሜሪክ ሰንሰለት ርዝመት ለውጦች፣ የተለያዩ ዝቅተኛ የዲፒ ፖሊመሮች እና ኩርባዎቻቸውን ያካትታል። ስርጭቶች 30,31,32። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ የግላይካን ትንተና የግላይካን መዋቅርን አጠቃላይ ትንተና ለማድረግ ጠቃሚ መሣሪያ መሆኑ ቢረጋገጥም፣ በውሃ የሚሟሟ ዝቅተኛ የዲፒ ኦሊጎሳካራዶችን ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም ለመገምገም አስቸጋሪ ነው። ከ5-10 kDa በታች የሆነ ሞለኪውላዊ ክብደት ያላቸው ትናንሽ የዲፒ ኦሊጎሳካራዶች ከELISA ሳህኖች 33፣ 34 ጋር አይጣበቁም እና ፀረ እንግዳ አካላት ከመጨመራቸው በፊት ይታጠባሉ።
እዚህ፣ ለመጀመሪያ ጊዜ፣ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም በአቪዲን በተሸፈኑ ሳህኖች ላይ የELISA ምርመራን እናሳያለን፣ ይህም የሚሟሟ የማይሟሙ ኦሊጎሳክሳክዴራዎችን ከአንድ ደረጃ ባዮቲኒሌሽን ሂደት ጋር ከግላይኮም ትንተና ጋር በማጣመር ነው። የግላይኮም ትንተና አቀራረባችን የተረጋገጠው በMALDI-TOF-MS እና በGC-MS ላይ በተመሠረተው የሃይድሮላይዝድ የስኳር ውህዶች ትሪሜቲልሲል (TMS) ዲሪቫታይዜሽን በመጠቀም በተሟሉ ኦሊጎሳክዴራ ትስስር ላይ በተመሠረተ ትንተና ነው። ይህ ፈጠራ ያለው አካሄድ ወደፊት እንደ ከፍተኛ-ውጤት ዘዴ ሊዘጋጅ እና በባዮሜዲካል ምርምር ውስጥ ሰፊ አተገባበርን ማግኘት ይቻላል35።
እንደ ግላይኮሲሌሽን ያሉ የኢንዛይሞች እና ፀረ እንግዳ አካላት ድህረ-ትርጉም ማሻሻያዎች ባዮሎጂያዊ እንቅስቃሴያቸውን ይነካሉ። ለምሳሌ፣ የሴረም ፕሮቲኖች ግላይኮሲሌሽን ለውጦች በእብጠት አርትራይተስ ውስጥ ትልቅ ሚና ይጫወታሉ፣ እና በግላይኮሲሌሽን ላይ የሚደረጉ ለውጦች እንደ የምርመራ ጠቋሚዎች ጥቅም ላይ ይውላሉ37። በሥነ ጽሑፍ ውስጥ የተለያዩ ግላይኮኖች በተለያዩ በሽታዎች ውስጥ በቀላሉ እንደሚታዩ ሪፖርት ተደርገዋል፣ ከእነዚህም ውስጥ የጨጓራና ትራክት እና የጉበት ሥር የሰደደ እብጠት በሽታዎች፣ የቫይረስ ኢንፌክሽኖች፣ የኦቫሪያን፣ የጡት እና የፕሮስቴት ካንሰሮችን ጨምሮ38,39,40። ፀረ እንግዳ አካላትን መሰረት ያደረገ ግላይካን የELISA ዘዴዎችን በመጠቀም የግላይኮኖች አወቃቀር መረዳት ውስብስብ የ MS ዘዴዎችን ሳይጠቀሙ በበሽታ ምርመራ ላይ ተጨማሪ እምነት ይሰጣል።
ቀደም ሲል ያደረግነው ጥናት እንደሚያሳየው ግትር የሆኑ ኦሊጎሳክሳክዴራዎች ከቅድመ-ህክምና እና ከኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ በኋላ ውሃ አልባ ሆነው ቆይተዋል (ምስል 1)። ቀደም ሲል በታተመው ስራችን፣ ኦሊጎሳክዴራዎችን ከ AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8 ለመለየት የነቃ የከሰል ጠንካራ-ደረጃ የማውጣት ዘዴ አዘጋጅተናል። ከመጀመሪያው ማውጣት እና መለያየት በኋላ፣ ኦሊጎሳክዴራዎች በመጠን ማግለል ክሮማቶግራፊ (SEC) የበለጠ ተከፋፍለው በሞለኪውላር ክብደት ቅደም ተከተል ተሰብስበው ነበር። ከተለያዩ ቅድመ-ህክምናዎች የተለቀቁ የስኳር ሞኖመሮች እና ኦሊጎመሮች በስኳር ቅንብር ትንተና ተተነተኑ። በተለያዩ ቅድመ-ህክምና ዘዴዎች የተገኙ የስኳር ኦሊጎመሮችን ይዘት ሲያወዳድሩ፣ ግትር የሆኑ ኦሊጎሳክዴራዎች መኖር ባዮማስን ወደ ሞኖሳክዴራሲዶች በመቀየር ረገድ የተለመደ ችግር ሲሆን ቢያንስ ከ10-15% እና እስከ 18% የአሜሪካ የስኳር ምርት መቀነስ ሊያስከትል ይችላል። ይህ ዘዴ ለተጨማሪ ትልቅ መጠን ያለው የኦሊጎሳክዴራ ክፍልፋዮች ምርት ያገለግላል። የተገኘው ACH እና የተለያዩ ሞለኪውላዊ ክብደቶች ያላቸው ተከታይ ክፍልፋዮቹ በዚህ ስራ ውስጥ የኦሊጎሳክዴራሲዶችን ባህሪ ለማሳየት እንደ የሙከራ ቁሳቁስ ጥቅም ላይ ውለዋል።
ከቅድመ ህክምና እና ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ በኋላ፣ የማያቋርጥ ኦሊጎሳካራይድስ ያለሃይድሮላይዝድ ቀርተዋል። እዚህ (ሀ) ኦሊጎሳካራይድስ ከAFEX-ቅድመ ህክምና የተደረገለት የበቆሎ ስቶቨር ሃይድሮላይዝት (ACSH) የታሸገ የነቃ ካርቦን እና ዲያቶማሴየስ ምድርን በመጠቀም የሚለዩበት የኦሊጎሳካራይድ መለያያ ዘዴ ነው፤ (ለ) ኦሊጎሳካራይድስን ለመለየት የሚያስችል ዘዴ። ኦሊጎሳካራይድስ በመጠን ማግለል ክሮማቶግራፊ (SEC) የበለጠ ተለያይተዋል፤ (ሐ) ከተለያዩ ቅድመ ህክምናዎች የተለቀቁ የሳክቻራይድ ሞኖመሮች እና ኦሊጎመሮች (የተደባለቀ አሲድ፡ DA፣ አዮኒክ ፈሳሽ፡ IL እና AFEX)። የኢንዛይማቲክ ሃይድሮላይዝስ ሁኔታዎች፡ ከፍተኛ ጠጣር 25% (ወ/ወ) ጭነት (በግምት 8% የግሉካን ጭነት)፣ 96 ሰዓታት ሃይድሮላይዝስ፣ 20 mg/g የንግድ ኢንዛይም ጭነት (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ጥምርታ) እና (መ) የስኳር ሞኖመሮች እና ኦሊጎመሮች ከAFEX ቅድመ ህክምና የተደረገለት የበቆሎ ስቶቨር (ACS) የተለቀቁ የግሉኮስ፣ የክሲሎዝ እና የአራቢኖዝ ኦሊጎመሮች።
የግላይካን ትንተና ከጠንካራ ባዮማስ ቅሪቶች በተለዩ ተዋጽኦዎች ውስጥ የግላይካን አጠቃላይ መዋቅራዊ ትንተና ለማድረግ ጠቃሚ መሣሪያ መሆኑ ተረጋግጧል። ሆኖም፣ ዝቅተኛ ሞለኪውላዊ ክብደት ያላቸው ኦሊጎሳካሪዶች በELISA ሳህኖች ላይ እንቅስቃሴን ለማገድ አስቸጋሪ ስለሆኑ እና ፀረ እንግዳ አካላት ከመጨመራቸው በፊት ስለሚታጠቡ፣ በውሃ የሚሟሟ ሳካሪዳዶች በዚህ ባህላዊ ዘዴ41 በመጠቀም ብዙም አይወከሉም። ስለዚህ፣ ፀረ እንግዳ አካላትን ለማሰር እና ለመለየት፣ የሚሟሟ፣ የማይጣጣሙ ኦሊጎሳካሪዶችን በአቪዲን በተሸፈኑ የELISA ሳህኖች ላይ ለመሸፈን አንድ-ደረጃ ባዮቲኒሌሽን ዘዴ ጥቅም ላይ ውሏል። ይህ ዘዴ ቀደም ሲል በተመረተው ACSH እና በሞለኪውላዊ ክብደቱ (ወይም የፖሊሜራይዜሽን ደረጃ፣ DP) ላይ የተመሠረተ ክፍልፋይ በመጠቀም ተፈትኗል። አንድ-ደረጃ ባዮቲኒሌሽን የካርቦሃይድሬትን በሚቀንስ ጫፍ ላይ ባዮቲን-LC-hydrazide በመጨመር የኦሊጎሳካሪ ትስስርን ለመጨመር ጥቅም ላይ ውሏል (ምስል 2)። በመፍትሔው ውስጥ፣ በሚቀነሰው ጫፍ ላይ ያለው የሂሚያሴታል ቡድን ከባዮቲን-LC-hydrazide የሃይድራዞን ትስስር ለመፍጠር ምላሽ ይሰጣል። የሚቀነሱ ንጥረ ነገሮች NaCNBH3 ባሉበት ጊዜ፣ የሃይድራዞን ትስስር ወደ የተረጋጋ ባዮቲኒላይድ የመጨረሻ ምርት ይቀነሳል። የስኳር ቅነሳው ጫፍ ሲሻሻል፣ ዝቅተኛ የዲፒ ኦሊጎሳክሳክዴይድ ከELISA ሳህኖች ጋር ማሰር ተችሏል፣ እና በጥናታችን ይህ የተደረገው ግላይካን-ታለመላቸው mAbs በመጠቀም በአቪዲን በተሸፈኑ ሳህኖች ላይ ነው።
በELISA ላይ የተመሰረቱ የሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላትን ለባዮቲኒላይድ ኦሊጎሳካራይድ ምርመራ። እዚህ (ሀ) የኦሊጎሳካራይድ ባዮቲኒላይዜሽን እና በመቀጠል በኒውትርአቪዲን በተሸፈኑ ሳህኖች ላይ ግላይካን-ታለመላቸው mAbs ጋር የELISA ምርመራ እና (ለ) የምላሽ ምርቶችን ባዮቲኒላይዜሽን ለማድረግ አንድ-ደረጃ ሂደትን ያሳያል።
ከዚያም ኦሊጎሳካራይድ-የተጣመሩ ፀረ እንግዳ አካላት ያላቸው አቪዲን-የተሸፈኑ ሳህኖች ወደ ዋና እና ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት ተጨምረው በብርሃን እና በጊዜ ስሜታዊ በሆነ መካከለኛ ውስጥ ታጥበዋል። ፀረ እንግዳ አካላት ትስስር ከተጠናቀቀ በኋላ ሳህኑን ለማቅለጥ የ TMB ንጣፍ ይጨምሩ። ምላሹ በመጨረሻ በሰልፈሪክ አሲድ ቆሟል። የተተከሉ ሳህኖች የእያንዳንዱን ፀረ እንግዳ አካላት የማሰሪያ ጥንካሬ ለማወቅ በELISA አንባቢ በመጠቀም ተተነተኑ። የሙከራውን ዝርዝሮች እና መለኪያዎች ለማግኘት “ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች” የሚለውን ተዛማጅ ክፍል ይመልከቱ።
ይህ አዲስ የተሻሻለ ዘዴ ለተወሰኑ አተገባበሮች ጥቅም እንዳለው እናሳያለን፤ በACSH ውስጥ የሚገኙትን የሚሟሟ ኦሊጎሳካራይድ እንዲሁም ከሊግኖሴሉሎሲክ ሃይድሮሊሳቶች የተገለሉ ጥሬ እና የተጣሩ የኦሊጎሳካራይድ ክፍልፋዮችን በመለየት። በስእል 3 ላይ እንደሚታየው፣ በACSH ውስጥ ባዮአሲላይትድ ግላይኮም ምርመራ ዘዴዎችን በመጠቀም የሚለዩት በጣም የተለመዱት ኤፒቶፕ-ተተኪ የሆኑ ክሲላንሶች አብዛኛውን ጊዜ uronic (U) ወይም methyluronic (MeU) እና pectic arabinogalactans ናቸው። አብዛኛዎቹ በቀደመው ጥናታችን ላይ በሃይድሮላይዝድ ያልሆኑ ጠጣሮች (UHS) ግላይካንስ ትንተና ላይ ተገኝተዋል43።
ወደ ሴል ግድግዳ ግላይካን የሚመራ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካል በመጠቀም የማይመለስ ኦሊጎሳካራይድ ኤፒቶፖችን መለየት። “ገለልተኛ” ክፍልፋይ የኤሲኤን ክፍልፋይ ሲሆን “አሲዳማ” ክፍልፋይ ደግሞ የኤፍኤ ክፍልፋይ ነው። በሙቀት ካርታው ላይ ያሉት ደማቅ ቀይ ቀለሞች ከፍ ያለ የኤፒቶፕ ይዘት ያመለክታሉ፣ እና ደማቅ ሰማያዊ ቀለሞች ደግሞ ባዶ ዳራ ያመለክታሉ። በመጠን ላይ ያሉት የቀለም እሴቶች ለቀመሮች N=2 ጥሬ የኦዲ እሴቶች ላይ የተመሰረቱ ናቸው። በፀረ እንግዳ አካላት የሚታወቁት ዋና ዋና ኤፒቶፖች በቀኝ በኩል ይታያሉ።
እነዚህ ሴሉሎስ ያልሆኑ መዋቅሮች በተፈተነው የንግድ ኢንዛይም ድብልቅ ውስጥ በጣም የተለመዱ ሴሉላሴዎች እና ሄሚሴሉላሴዎች ሊከፈሉ አልቻሉም፣ ይህም በብዛት ጥቅም ላይ የሚውሉ የንግድ ኢንዛይሞችን ያካትታል። ስለዚህ፣ ለሃይድሮሊሲስ አዲስ ረዳት ኢንዛይሞች ያስፈልጋሉ። አስፈላጊዎቹ ሴሉሎስ ያልሆኑ መለዋወጫ ኢንዛይሞች ከሌሉ፣ እነዚህ የሴሉሎስ ያልሆኑ ቦንዶች ወደ ሞኖሳካራይድ ሙሉ በሙሉ እንዳይቀየሩ ይከላከላሉ፣ ምንም እንኳን የወላጅ የስኳር ፖሊመሮቻቸው ወደ አጫጭር ቁርጥራጮች በስፋት ቢቀየሩ እና በንግድ ኢንዛይም ድብልቆች ቢሟሟም።
የሲግናል ስርጭት እና የማሰሪያ ጥንካሬው ተጨማሪ ጥናት እንደሚያሳየው ከፍተኛ የዲፒ የስኳር ክፍልፋዮች (A፣ B፣ C፣ DP እስከ 20+) ዝቅተኛ የዲፒ ክፍልፋዮች (D፣ E፣ F፣ DP) ከዲመርስ ውስጥ ካለው ጋር ሲነጻጸር የማሰሪያ ኤፒቶፖች ዝቅተኛ እንደሆኑ አሳይቷል (ምስል 1)። የአሲድ ቁርጥራጮች ከገለልተኛ ቁርጥራጮች ይልቅ ሴሉሎስ ባልሆኑ ኤፒቶፖች ውስጥ በብዛት የተለመዱ ናቸው። እነዚህ ክስተቶች በቀደመው ጥናታችን ውስጥ ከታየው ንድፍ ጋር የሚጣጣሙ ናቸው፣ ከፍተኛ ዲፒ እና የአሲድ ክፍሎች ለኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ የበለጠ የሚቋቋሙ ነበሩ። ስለዚህ፣ ሴሉሎስ ያልሆኑ ግላይካን ኤፒቶፖች እና የU እና MeU ምትክዎች መኖር ለኦሊጎሳካርዴስ መረጋጋት በእጅጉ አስተዋጽኦ ሊያደርግ ይችላል። በተለይም ኤፒቶፕ ዲሜሪክ ወይም ትራይሜሪክ ኦሊጎሳካርዴድ ከሆነ የማሰሪያ እና የመለየት ውጤታማነት ለዝቅተኛ ዲፒ ኦሊጎሳካርዴስ ችግር ሊፈጥር እንደሚችል ልብ ሊባል ይገባል። ይህ የተለያየ ርዝመት ያላቸውን የንግድ ኦሊጎሳካርዴስ በመጠቀም ሊሞከር ይችላል፣ እያንዳንዱም ከተወሰነ mAb ጋር የሚያያዝ አንድ ኤፒቶፕ ብቻ ይዟል።
ስለዚህ፣ መዋቅራዊ-ተኮር ፀረ እንግዳ አካላት አጠቃቀም የተወሰኑ የሪካልሲተርን ትስስር ዓይነቶችን አሳይቷል። ጥቅም ላይ የዋለው ፀረ እንግዳ አካል አይነት፣ ተገቢው የመለጠጥ ንድፍ እና የሚያመነጨው የምልክት ጥንካሬ (በጣም እና በጣም አነስተኛ) ላይ በመመስረት፣ አዳዲስ ኢንዛይሞች ሊለዩ እና ለበለጠ የተሟላ የግሉኮኮንቨርሽን የኢንዛይም ድብልቅ በከፊል በመጠን ሊጨመሩ ይችላሉ። የACSH ኦሊጎስካካርዴይድ ትንተናን እንደ ምሳሌ በመውሰድ፣ ለእያንዳንዱ ባዮማስ ቁሳቁስ የግሊካን ቦንዶች የውሂብ ጎታ መፍጠር እንችላለን። እዚህ ላይ የተለያዩ ፀረ እንግዳ አካላት ትስስር ግምት ውስጥ መግባት እንዳለበት ልብ ሊባል ይገባል፣ እና የእነሱ ትስስር የማይታወቅ ከሆነ፣ ይህ የተለያዩ ፀረ እንግዳ አካላት ምልክቶችን በማነፃፀር ረገድ የተወሰኑ ችግሮችን ይፈጥራል። በተጨማሪም፣ የግሊካን ቦንዶችን ማወዳደር ለተመሳሳይ ፀረ እንግዳ አካላት ናሙናዎች መካከል በተሻለ ሁኔታ ሊሠራ ይችላል። እነዚህ ግትር ቦንዶች ከዚያም ከCAZyme የውሂብ ጎታ ጋር ሊገናኙ ይችላሉ፣ ከእነዚህም ውስጥ ኢንዛይሞችን መለየት፣ እጩ ኢንዛይሞችን መምረጥ እና የቦንድ ሰባሪ ኢንዛይሞችን መሞከር እንችላለን፣ ወይም እነዚህን ኢንዛይሞች በባዮሬፊኔሪዎች ውስጥ ለመጠቀም ለመግለጽ የማይክሮባላዊ ስርዓቶችን ማዘጋጀት እንችላለን።
የበሽታ መከላከያ ዘዴዎች በሊግኖሴሉሎሲክ ሃይድሮሊሳቶች ውስጥ የሚገኙትን ዝቅተኛ ሞለኪውላዊ ክብደት ያላቸው ኦሊጎሳክሳክዴይድዎችን ለመለየት አማራጭ ዘዴዎችን እንዴት እንደሚያሟሉ ለመገምገም፣ MALDI (ምስል 4፣ S1-S8) እና በተመሳሳይ ፓነል (ምስል 5) ኦሊጎሳክዴይድ ክፍል ላይ በGC-MS ላይ ተመስርተው በቲኤምኤስ የተገኙ ሳክካርዴይድ ትንተና አድርገናል። MALDI የኦሊጎሳክዴይድ ሞለኪውሎች የጅምላ ስርጭት ከታሰበው መዋቅር ጋር ይጣጣም እንደሆነ ለማነፃፀር ይጠቅማል። በምስል 4 ላይ የገለልተኛ አካላት ACN-A እና ACN-B MC ያሳያል። የኤሲኤን-ኤ ትንተና ከDP 4-8 (ምስል 4) እስከ DP 22 (ምስል S1) የሚደርሱ የተለያዩ የፔንቶስ ስኳሮችን አረጋግጧል፣ ክብደታቸው ከMeU-xylan oligosaccharides ጋር ይዛመዳል። የኤሲኤን-ቢ ትንተና የፔንቶስ እና የግሉኮክሲላን ተከታታይን ከDP 8-15 ጋር አረጋግጧል። እንደ ምስል S3 ባሉ ተጨማሪ ቁሳቁሶች፣ የFA-C አሲድነት ያለው የጅምላ ስርጭት ካርታዎች በELISA ላይ በተመሰረተ mAb ማጣሪያ ውስጥ ከሚገኙት የተተኩ xylans ጋር የሚጣጣሙ (Me)U የተተኩ የፔንቶስ ስኳርዎችን ከ8-15 DP ጋር ያሳያሉ። ኤፒቶፖቹ ወጥነት አላቸው።
በACS ውስጥ የሚገኙ የሚሟሟ የማይጣጣሙ ኦሊጎሳካራዶች የማልዲ-ኤምኤስ ስፔክትረም። እዚህ፣ (ሀ) ሜቲላይት ዩሮኒክ አሲድ (DP 4-8) የያዙ ACN-A ዝቅተኛ የክብደት ክልል ክፍልፋዮች ግሉኩሮክሲላን ኦሊጎሳካራዶችን እና (ለ) በግሉኩሮክሲላን (DP 8-15) የተተኩ ACN-B xylan እና ሜቲላይት ዩሮኒክ አሲድ ኦሊጎሳካራዶች።
የሪፍራክተሪ ኦሊጎሳክሳክዴርስ የግላይካን ቅሪት ትንተና። እዚህ (ሀ) የጂሲ-ኤምኤስ ትንተናን በመጠቀም የተገኙ የተለያዩ የኦሊጎሳክዴሬድ ክፍልፋዮች የቲኤምኤስ ሳክራድሬት ቅንብር። (ለ) በኦሊጎሳክዴርስ ውስጥ የሚገኙ የተለያዩ የቲኤምኤስ የተገኙ ስኳር አወቃቀሮች። ኤሲኤን - ገለልተኛ ኦሊጎሳክዴርስ እና ኤኤፍኤ - አሲድ ኦሊጎሳክዴርስን የያዙ የፌሩሊክ አሲድ ክፍልፋይ።
ሌላው አስደሳች መደምደሚያ የተገኘው በምስል S9 ላይ እንደሚታየው የኦሊጎሳካርዴይድ ክፍልፋይ LC-MS ትንተና ላይ ነው (ዘዴዎቹ በኤሌክትሮኒክ ተጨማሪ ቁሳቁስ ውስጥ ሊታዩ ይችላሉ)። የሄክሶሴ እና የ-OAC ቡድኖች ቁርጥራጮች በኤሲኤን-ቢ ክፍልፋይ ሲገጣጠሙ በተደጋጋሚ ታይተዋል። ይህ ግኝት በግላይኮም እና በMALDI-TOF ትንተና ውስጥ የታየውን መከፋፈል የሚያረጋግጥ ብቻ ሳይሆን፣ አስቀድሞ በተታከሙ ሊግኖሴሉሎሲክ ባዮማስ ውስጥ ስለሚገኙ ሊሆኑ ስለሚችሉ የካርቦሃይድሬት ተዋጽኦዎች አዲስ መረጃም ይሰጣል።
በተጨማሪም የቲኤምኤስ የስኳር ዲሪቫታይዜሽንን በመጠቀም የኦሊጎሳካርዴር ክፍልፋይ የስኳር ስብጥርን ተንትነናል። GC-MSን በመጠቀም፣ በኦሊጎሳካርዴር ክፍልፋይ ውስጥ የነርቭ (ያልተመጣጠነ) እና አሲዳማ ስኳር (ግሉኤ እና ጋላኤ) ስብጥርን ለይተናል (ምስል 5)። ግሉኩሮኒክ አሲድ በአሲድ ክፍሎች C እና D ውስጥ ይገኛል፣ ጋላክቱሮኒክ አሲድ ደግሞ በአሲድ ክፍሎች A እና B ውስጥ ይገኛል፣ ሁለቱም ከፍተኛ የአሲድ ስኳር ዲፒ ክፍሎች ናቸው። እነዚህ ውጤቶች የELISA እና የMALDI መረጃችንን የሚያረጋግጡ ብቻ ሳይሆን፣ ቀደም ሲል ስለ ኦሊጎሳካርዴር ክምችት ካደረግናቸው ጥናቶች ጋር የሚጣጣሙ ናቸው። ስለዚህ፣ የኦሊጎሳካርዴር ባዮቲኒሌሽን እና ቀጣይ የELISA ምርመራን የሚጠቀሙ ዘመናዊ የበሽታ መከላከያ ዘዴዎች በተለያዩ ባዮሎጂያዊ ናሙናዎች ውስጥ የሚሟሟ ሪካልሲትራንት ኦሊጎሳካርዴርዎችን ለመለየት በቂ ናቸው ብለን እናምናለን።
በELISA ላይ የተመሰረቱ የmAb ማጣሪያ ዘዴዎች በተለያዩ ዘዴዎች የተረጋገጡ ስለሆኑ፣ የዚህን አዲስ የቁጥር ዘዴ አቅም የበለጠ ለማሰስ ፈልገን ነበር። ሁለት የንግድ ኦሊጎሳካሪዶች፣ xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) እና 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX)፣ የሴል ግድግዳ ግላይካንን ዒላማ ባደረገ አዲስ የmAb አቀራረብ በመጠቀም ተገዝተው ተፈትነዋል። ምስል 6 በባዮቲኒላይትድ ማሰሪያ ምልክት እና በኦሊጎሳካር ክምችት ሎግ ክምችት መካከል መስመራዊ ትስስር ያሳያል፣ ይህም የላንግሙር መምጠጥ ሞዴል ሊሆን ይችላል። ከ mAbs መካከል፣ CCRC-M137፣ CCRC-M138፣ CCRC-M147፣ CCRC-M148 እና CCRC-M151 ከXHE ጋር ተዛማጅነት ያላቸው እና CCRC-M108፣ CCRC-M109 እና LM11 ከ1 nm እስከ 100 ናኖ ክልል ውስጥ ከA2XX ጋር ተዛማጅነት ያላቸው ናቸው። በሙከራው ወቅት ፀረ እንግዳ አካላት ውስን አቅርቦት በመኖሩ፣ በእያንዳንዱ የኦሊጎሳካር ክምችት ላይ የተወሰኑ ሙከራዎች ተካሂደዋል። እዚህ ላይ አንዳንድ ፀረ እንግዳ አካላት እንደ አንድ ንጥረ ነገር ተመሳሳይ ኦሊጎሳካራይድ በጣም በተለየ መንገድ ምላሽ እንደሚሰጡ ልብ ሊባል ይገባል፣ ምክንያቱም ምናልባት ከትንሽ የተለያዩ ኤፒቶፖች ጋር ስለሚጣበቁ እና በጣም የተለያዩ የማሰሪያ ግንኙነቶች ሊኖራቸው ስለሚችል። አዲሱ የ mAb አቀራረብ በእውነተኛ ናሙናዎች ላይ ሲተገበር ትክክለኛ የኤፒቶፕ መለያ ዘዴዎች እና አንድምታዎች በጣም ውስብስብ ይሆናሉ።
የተለያዩ የግላይካን-ኢላማ የሚያደርጉ mAbs የመለየት ክልልን ለመወሰን ሁለት የንግድ ኦሊጎሳካራዶች ጥቅም ላይ ውለዋል። እዚህ ላይ፣ ከሎግሳካርዴይድ ክምችት ሎግ ክምችት ጋር መስመራዊ ትስስሮች የላንግሙየር መምጠጥ ቅጦችን ለ (A) XHE ከ mAb ጋር እና (B) A2XX ከ mAb ጋር ያመለክታሉ። ተዛማጅ ኤፒቶፖች በምርመራው ውስጥ እንደ ንጣፎች ጥቅም ላይ የዋሉ የንግድ ኦሊጎሳካራዶችን መዋቅሮች ያመለክታሉ።
ግላይካን-ኢላማ የተደረገባቸው ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (ግላይኮሚክ ትንተና ወይም ELISA-based mAb screening) መጠቀም የእፅዋት ባዮማስን የሚያዋህዱ ዋና ዋና የሴል ግድግዳ ግላይካኖችን በጥልቀት ለመለየት ኃይለኛ መሳሪያ ነው። ሆኖም ግን፣ ክላሲካል ግላይካን ትንተና ትላልቅ የሴል ግድግዳ ግላይካኖችን ብቻ ነው የሚገልጸው፣ ምክንያቱም አብዛኛዎቹ ኦሊጎሳክሳክዴሮች በELISA ሳህኖች ላይ በብቃት የማይንቀሳቀሱ ስለሆኑ። በዚህ ጥናት፣ AFEX-pretreated corn stover በከፍተኛ ጠጣር ይዘት ኢንዛይማቲክ በሆነ መልኩ ሃይድሮላይዝድ ተደርጓል። የስኳር ትንተና በሃይድሮላይዛት ውስጥ ያሉትን የሪካልሲትራንት ሴል ግድግዳ ካርቦሃይድሬት ስብጥር ለመወሰን ጥቅም ላይ ውሏል። ሆኖም፣ በሃይድሮላይዛት ውስጥ ያሉ ትናንሽ ኦሊጎሳክዴሮች mAb ትንተና ዝቅተኛ ግምት የሚሰጠው ሲሆን ኦሊጎሳክዴሮችን በELISA ሳህኖች ላይ ውጤታማ በሆነ መንገድ ለማገድ ተጨማሪ መሳሪያዎች ያስፈልጋሉ።
እዚህ ላይ የኦሊጎሳካርዴ ባዮቲኒሌሽንን በማጣመር እና ከዚያም በኔውትርአቪዲን™ በተሸፈኑ ሳህኖች ላይ የELISA ምርመራን በማጣመር ለmAb ማጣሪያ አዲስ እና ቀልጣፋ የሆነ የኦሊጎሳካርዴ ማይሞቢላይዜሽን ዘዴን ሪፖርት እናደርጋለን። የማይንቀሳቀሱት ባዮቲኒላይዝድ ኦሊጎሳካርዴዎች ፀረ እንግዳ አካላትን ፈጣን እና ቀልጣፋ የሆነ መለየት እንዲችሉ በቂ ጥንካሬ አሳይተዋል። በጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ላይ የተመሠረተ የእነዚህ ግትር ኦሊጎሳካርዴይድ ስብጥር ትንተና የዚህ አዲስ የበሽታ መከላከያ አቀራረብ ውጤቶችን አረጋግጧል። ስለዚህ፣ እነዚህ ጥናቶች የኦሊጎሳካርዴድ ባዮቲኒሌሽን እና የELISA ምርመራ ከግላይካን-ታለመ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት ጋር ጥምረት በኦሊጎሳካርዴድ ውስጥ ያሉትን መሻገሪያዎች ለመለየት ጥቅም ላይ ሊውል እንደሚችል እና የኦሊጎሳካርዴድ አወቃቀርን በሚገልጹ ሌሎች ባዮኬሚካላዊ ጥናቶች ውስጥ በስፋት ሊተገበር እንደሚችል ያሳያሉ።
ይህ በባዮቲን ላይ የተመሠረተ የግላይካን ፕሮፋይሊንግ ዘዴ በእፅዋት ባዮማስ ውስጥ የሚሟሟ ኦሊጎሳክሳክዴይድስን የማይሟሟ ካርቦሃይድሬት ትስስር ለመመርመር የሚያስችል የመጀመሪያው ሪፖርት ነው። ይህም አንዳንድ የባዮማስ ክፍሎች በባዮፊውል ምርት ረገድ ለምን በጣም ግትር እንደሆኑ ለመረዳት ይረዳል። ይህ ዘዴ በግላይኮም ትንተና ዘዴዎች ውስጥ ያለውን አስፈላጊ ክፍተት ይሞላል እና አተገባበሩን ከእፅዋት ኦሊጎሳክዴይድስ ባሻገር ሰፋ ባሉ ንጣፎች ላይ ያሰፋዋል። ወደፊት፣ ለባዮቲኒሌሽን ሮቦቲክስን ልንጠቀም እና ELISAን በመጠቀም ለናሙናዎች ከፍተኛ-ውጤት ትንተና የገነባነውን ዘዴ ልንጠቀም እንችላለን።
ከፓይነር 33A14 የተዳቀለ ዘር የሚበቅለው የበቆሎ ገለባ (CS) በ2010 በሬይ፣ ኮሎራዶ ከሚገኘው ክራመር ፋርምስ ተሰብስቧል። በመሬት ባለቤቱ ፈቃድ ይህ ባዮማስ ለምርምር ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል። ናሙናዎቹ በክፍል ሙቀት ውስጥ ከ6% በታች እርጥበት ባለው ዚፕ-ሎክ ከረጢቶች ውስጥ ደረቅ ሆነው ተከማችተዋል። ናሙናዎቹ በክፍል ሙቀት ውስጥ ከ6% በታች እርጥበት ባለው ዚፕ-ሎክ ከረጢቶች ውስጥ ደረቅ ሆነው ተከማችተዋል። Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. ናሙናዎቹ በክፍል ሙቀት ውስጥ በዚፐር በተሸፈኑ ከረጢቶች ውስጥ ከ6% በላይ እርጥበት ባለው ደረቅ ቦታ ተከማችተዋል።样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. ናሙናዎቹ በዚፐር ከረጢቶች ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ ከ 6% በታች በሆነ እርጥበት ውስጥ ይቀመጣሉ።ጥናቱ የአካባቢውን እና የሀገር አቀፍ መመሪያዎችን ያከበረ ነበር። የውህደት ትንተና የተካሄደው የNREL ፕሮቶኮልን በመጠቀም ነው። ቅንብሩ 31.4% ግሉካን፣ 18.7% ክሲላን፣ 3.3% አራቢናን፣ 1.2% ጋላክታን፣ 2.2% አሲቲል፣ 14.3% ሊግኒን፣ 1.7% ፕሮቲን እና 13.4% አመድ እንደያዘ ተገኝቷል።
ሴሊክ® CTec2 (138 ሚ.ግ ፕሮቲን/ሚሊ፣ ሎት VCNI 0001) ከኖቮዚምስ (ፍራንክሊንተን፣ ኤንሲ፣ ዩኤስኤ) የሴሉላሴ፣ β-ግሉኮሲዳሴ እና ሴሊክ® HTec2 (157 ሚ.ግ ፕሮቲን/ሚሊ፣ ሎት VHN00001) ውስብስብ ድብልቅ ነው። ባለብዙ ፌክት ፔክቲናሴ® (72 ሚ.ግ ፕሮቲን/ሚሊ፣)፣ የተበረከተው በዱፖንት ኢንዱስትሪያል ባዮሳይንስ (ፓሎ አልቶ፣ ካሊፎርኒያ፣ ዩኤስኤ) ነው። የኢንዛይም ፕሮቲን ክምችት የሚወሰነው የፕሮቲን ይዘትን በመገመት (እና ፕሮቲን ያልሆነውን ናይትሮጅን አስተዋጽኦ በመቀነስ) የKjeldahl ናይትሮጅን ትንተና (AOAC ዘዴ 2001.11፣ Dairy One Cooperative Inc.፣ ኢታካ፣ ኒውዮርክ፣ ዩኤስኤ) በመጠቀም ነው። ዲያቶማሴየስ ምድር 545 የተገዛው ከኢኤምዲ ሚሊፖሬ (ቢሌሪካ፣ ኤምኤ) ነው። የተነቃቁ ካርቦን (DARCO፣ 100 ሜሽ ቅንጣቶች)፣ አቪሴል (PH-101)፣ ቢች ክሲላን እና ሌሎች ሁሉም ኬሚካሎች የተገዙት ከሲግማ-አልድሪች (ሴንት ሉዊስ፣ ሚዙሪ) ነው።
የAFEX ቅድመ ህክምና በGLBRC (ባዮማስ ኮንቨርሽን ሪሰርች ላቦራቶሪ፣ MSU፣ ላንሲንግ፣ ሚቺጋን፣ ዩኤስኤ) ተካሂዷል። ቅድመ ህክምናው በ140°ሴ ለ15 ደቂቃዎች ተካሂዷል። 46 የመኖሪያ ጊዜ ከማይዝግ ብረት ቤንችቶፕ ባች ሪአክተር (ፓርር ኢንስትሩመንትስ ካምፓኒ) በ60% (w/w) ጭነት ጋር በ1፡1 ጥምርታ ከማይዝግ ብረት ቤንችቶፕ ባች ሪአክተር ጋር ተያይዟል። 30 ደቂቃዎችን ፈጅቷል። ሪአክተሩ ወደ 140°ሴ ተወሰደ እና አሞኒያ በፍጥነት ተለቋል፣ ይህም ባዮማስ በፍጥነት ወደ ክፍል ሙቀት እንዲመለስ አስችሎታል። የAFEX ቅድመ ህክምና የተደረገለት የበቆሎ ምድጃ (ACS) ቅንብር ከማይታከመ የበቆሎ ምድጃ (UT-CS) ጋር ተመሳሳይ ነበር።
ከፍተኛ ጠጣር ACSH 25% (w/w) (በግምት 8% ዴክስትራን ጭነት) ለትልቅ ደረጃ ኦሊጎሳክሳክራይድ ምርት እንደ መነሻ ቁሳቁስ ተዘጋጅቷል። የACS ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ የተከናወነው ሴሊክ® Ctec2 10 mg ፕሮቲን/ግ ግሉካን (በቅድመ-ህክምና ባዮማስ)፣ Htec2 (ኖቮዚሜስ፣ ፍራንክሊንተን፣ ኤንሲ)፣ 5 mg ፕሮቲን/ግ ግሉካን እና ባለብዙ ፌክት ፔክቲናሴ (ጄኔኮር ኢንክ፣ ዩኤስኤ)ን ጨምሮ የንግድ ኢንዛይም ድብልቅን በመጠቀም ነው። ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ የተከናወነው በ5-ሊትር ባዮሬአክተር ውስጥ ሲሆን 3 ሊትር፣ ፒኤች 4.8፣ 50°ሴ እና 250 rpm የስራ መጠን አለው። ለ96 ሰዓታት ሃይድሮሊሲስ ከተደረገ በኋላ ሃይድሮሊዛት በ6000 rpm ለ30 ደቂቃዎች በሴንትሪፉጌሽን ተሰብስቦ በ14000 rpm ለ30 ደቂቃዎች ያልተፈጨ ጠጣር ለማስወገድ ተሰበሰበ። ከዚያም ሃይድሮላይዛት በ0.22 ሚሜ የማጣሪያ ቢከር አማካኝነት ለጸዳ ማጣሪያ ተዳርጓል። የተጣራው ሃይድሮላይዛት በ4°ሴ ባለው የጸዳ ጠርሙሶች ውስጥ ተከማችቶ ከዚያም በካርቦን ተከፋፍሏል።
በNREL የላቦራቶሪ ትንተና ሂደቶች መሠረት የተወጣጡ ባዮማስ ናሙናዎች ስብጥር ትንተና፡- ለጥንቅር ትንተና ናሙናዎች ዝግጅት (NREL/TP-510-42620) እና በባዮማስ ውስጥ መዋቅራዊ ካርቦሃይድሬት እና ሊንጂን መወሰን (NREL/TP-510 - 42618)47።
የኦሊጎሳካርዴይድ የሃይድሮሊዛይድ ዥረት ትንተና በ2 ሚሊ ሊትር ሚዛን ላይ አውቶክላቭ ላይ የተመሠረተ የአሲድ ሃይድሮሊሲስ ዘዴን በመጠቀም ተካሂዷል። የሃይድሮሊዛይት ናሙናውን በ10 ሚሊ ሊትር የዊንች ክዳን ባህል ቱቦ ውስጥ ከ69.7 µl 72% ሰልፈሪክ አሲድ ጋር ይቀላቅሉ እና በ121 °C በቤንችቶፕ ላይ ለ1 ሰዓት ያቀዘቅዙ፣ በበረዶ ላይ ያቀዘቅዙ እና ወደ ከፍተኛ አፈጻጸም ያለው ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ (HPLC) ብልቃጥ ያጣሩ። የኦሊጎሳካርዴይድ ክምችት የሚወሰነው በሃይድሮሊዛይድ ናሙና ውስጥ ያለውን የሞኖሳካርዴይድ ክምችት ከአሲድ-ሃይድሮሊዛይድ ናሙና ውስጥ ካለው አጠቃላይ የስኳር ክምችት በመቀነስ ነው።
በአሲድ ሃይድሮላይዝድ ባዮማስ ውስጥ ያሉት የግሉኮስ፣ የሳይሎዝ እና የአራቢኖዝ ክምችቶች በባዮ-ራድ አሚኔክስ HPX-87H አምድ ላይ አውቶሳምፕለር፣ የአምድ ማሞቂያ፣ የኢሶክራቲክ ፓምፕ እና የሪፍራክቲቭ ኢንዴክስ ማወቂያ የተገጠመለት የሺማዱ ኤችፒኤልሲ ሲስተም በመጠቀም ተተነተኑ። አምድ በ50°ሴ ተጠብቆ 0.6 ሚሊ ሊትር/ደቂቃ 5 ሚሜ H2SO4 በውሃ ውስጥ ተለቋል። ፍሰት።
የሃይድሮላይዛት ሱፐርናታንት ለሞኖመር እና ለኦሊጎሳካራይድ ይዘት ተበረዘ እና ተተነተነ። ከኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ በኋላ የተገኙት ሞኖሜሪክ ስኳሮች በባዮ-ራድ (ሄርኩለስ፣ ካሊፎርኒያ) አሚኔክስ HPX-87P አምድ እና በአመድ ጠባቂ አምድ በተገጠመለት HPLC ተተነተኑ። የአምዱ የሙቀት መጠን በ80°ሴ ተጠብቆ ቆይቷል፣ ውሃ እንደ ተንቀሳቃሽ ደረጃ 0.6 ሚሊ ሊትር/ደቂቃ የፍሰት መጠን ጥቅም ላይ ውሏል። ኦሊጎሳካራይድ በማጣቀሻዎች 41፣ 48፣ 49 ላይ በተገለጹት ዘዴዎች መሠረት በ121°ሴ በተሟሟ አሲድ ውስጥ በሃይድሮሊሲስ ተወስኗል።
የሳቻራይድ ትንተና የተከናወነው ጥሬ፣ AFEX ቅድመ-ታክመው እና ሁሉም በሃይድሮላይዝድ ባልሆኑ የባዮማስ ቅሪቶች (የተከታታይ የሴል ግድግዳ ተዋጽኦዎችን ማምረት እና የ mAb ማጣሪያቸውን ጨምሮ) ላይ ቀደም ሲል የተገለጹትን ሂደቶች 27፣ 43፣ 50፣ 51 በመጠቀም ነው። ለግላይኮም ትንተና፣ የአልኮል-የማይሟሟ የእፅዋት ሴል ግድግዳ ቁሳቁስ ቅሪቶች ከባዮማስ ቅሪቶች ይዘጋጃሉ እና እንደ አሞኒየም ኦክሳሌት (50 mM)፣ ሶዲየም ካርቦኔት (50 mM እና 0.5% w/v)፣ CON. (1M እና 4M፣ ሁለቱም 1% w/v ሶዲየም ቦሮሃይድሬድ) እና አሲድ ክሎራይት ባሉ እየጨመረ በሚመጡ ኃይለኛ ንጥረ ነገሮች ተከታታይ ማውጣት ይደረግባቸዋል52,53። ከዚያም ተዋጽኦዎቹ ወደ ሴል ግድግዳ ግላይካን በሚመሩ ውስብስብ የ mAb50ዎች ፓነል ላይ ለELISA ተገዝተዋል፣ እና የ mAb ትስስር ግብረመልሶች እንደ የሙቀት ካርታ ቀርበዋል። የእፅዋት ሴል ግድግዳ ግላይካን ኢላማ የሚያደርጉ mAbs ከላቦራቶሪ አክሲዮኖች (CCRC፣ JIM እና MAC ተከታታይ) ተገዝተዋል።
የኦሊጎሳክሳክዴይድ አንድ-ደረጃ ባዮቲኒሌሽን። ካርቦሃይድሬትን ከባዮቲን-LC-hydrazide ጋር ማዋሃድ የተከናወነው በሚከተለው አሰራር ነው። ባዮቲን-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) በዲሜቲል ሰልፎክሳይድ (DMSO፣ 70 μl) ውስጥ በ65°ሴ ለ1 ደቂቃ በማሞቅ በከፍተኛ ሁኔታ በማነሳሳት እና በማሞቅ ተወስዷል። ግላሻል አሴቲክ አሲድ (30 µl) ተጨምሮ ድብልቁ በሶዲየም ሳይያኖቦሮሃይድሬድ (6.4 mg/100 µmol) ላይ ፈሰሰ እና በ65°ሴ ለ1 ደቂቃ ያህል ከሞቀ በኋላ ሙሉ በሙሉ ፈሰሰ። ከዚያም ከ5 እስከ 8 μl የምላሽ ድብልቁ ወደ ደረቅ ኦሊጎሳክዴካርዴድ (1-100 nmol) ተጨምሮ በተቀነሰው ጫፍ ላይ 10 እጥፍ ወይም ከዚያ በላይ የሞላር ትርፍ ለማግኘት ተችሏል። ምላሹ በ65°ሴ ለ2 ሰዓታት ተካሂዷል፣ ከዚያ በኋላ ናሙናዎቹ ወዲያውኑ ተጠርገዋል። በመለያ ሙከራዎቹ ላይ ምንም አይነት ሶዲየም ሳይኖቦሮሃይድሬድ ሳይቀንስ ጥቅም ላይ አልዋለም፣ እና ናሙናዎቹ በ65°ሴ ለ2.5 ሰዓታት ምላሽ ተሰጥቷቸዋል።
የባዮቲኒላይድ ኦሊጎሳክሳክራይድ ናሙናዎችን በELISA ሽፋን እና በማጠብ። በአቪዲን በተሸፈነው ሳህን ውስጥ በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 25 μl የባዮቲኒላይድ ናሙናዎች (በ5 ሚሊ ሊትር 0.1 ሜ ትሪስ ባፈር መፍትሄ (TBS) ውስጥ የተበረዘ እያንዳንዱ የተከማቸ ናሙና 100 μl) ተጨምረዋል። ​​የመቆጣጠሪያ ጉድጓዶች በ0.1 ሜ ትራይስ ባፈር መፍትሄ (TBS) ውስጥ በ10 μg/ml ክምችት በ50 μl ባዮቲን ተሸፍነዋል። ባዶ መለኪያዎችን ለመለካት ዲዮናይዝድ ውሃ እንደ ሽፋን ጥቅም ላይ ውሏል። ታብሌቱ በጨለማ ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ2 ሰዓታት ታጥቧል። ለግሬኒየር ጠፍጣፋ 3A ፕሮግራም ቁጥር 11 በመጠቀም ሳህኑን በ0.1% የተወገደ ወተት በ0.1 ሜ ትራይስ ባፈር ወተት 3 ጊዜ ያጠቡ።
ዋና ፀረ እንግዳ አካላትን መጨመር እና ማጠብ። በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 40 µl የመጀመሪያ ፀረ እንግዳ አካላትን ይጨምሩ። ማይክሮፕሌቱን በጨለማ ውስጥ ለ1 ሰዓት በክፍል ሙቀት ውስጥ ያቀቡት። ከዚያም ሳህኖቹ ለግሬኒየር ፍላት 3A የማጠቢያ ፕሮግራም #11 በመጠቀም በ0.1 ሚሊዮን ቲቢዎች ውስጥ 3 ጊዜ በ0.1% ወተት ታጥበዋል።
ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካል ይጨምሩና ይታጠቡ። በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 50 µl የአይጥ/አይጥ ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካል (በ0.1% ወተት ውስጥ 1:5000 የተቀላቀለ በ0.1% ወተት ውስጥ) ይጨምሩ። ማይክሮፕሌቱን በጨለማ ውስጥ ለ1 ሰዓት በክፍል ሙቀት ውስጥ ያቀቡት። ከዚያም ማይክሮፕሌቶቹ በ0.1% ወተት ውስጥ 5 ጊዜ በ0.1% ወተት በGrenier Flat 5A ሳህን ማጠቢያ ፕሮግራም #12 በመጠቀም ታጥበዋል።
አንድ ንጣፍ መጨመር። 50 µl የ3,3′፣5,5′-ቴትራሜቲልቤንዚዲን (TMB) ወደ መሰረታዊው ንጣፍ (2 ጠብታዎች ቋት፣ 3 የቲኤምቢ ጠብታዎች፣ 2 የሃይድሮጂን ፐርኦክሳይድ ጠብታዎች በ15 ሚሊ ሊትር ዳይኦኒዝድ ውሃ ውስጥ በመጨመር) ይጨምሩ። ከመጠቀምዎ በፊት የቲኤምቢ ንጣፉን ያዘጋጁ እና ሽክርክሪት ያዘጋጁ። ማይክሮፕሌቱን በክፍል ሙቀት ለ30 ደቂቃዎች ያቀዘቅዙ። በጨለማ ውስጥ።
ደረጃውን ጨርሰው ታብሌቱን ያንብቡ። በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 50 µl የ1 N ሰልፈሪክ አሲድ ይጨምሩ እና የ ELISA አንባቢን በመጠቀም ከ450 እስከ 655 nm ያለውን የመምጠጥ መጠን ይመዝግቡ።
የእነዚህ አናላይቶች 1 mg/ml መፍትሄዎችን በተጣራ ውሃ ውስጥ ያዘጋጁ፡ አራቢኖዝ፣ ራምኖዝ፣ ፉኮዝ፣ ክሲሎዝ፣ ጋላክቱሮኒክ አሲድ (GalA)፣ ግሉኩሮኒክ አሲድ (GlcA)፣ ማንኖዝ፣ ግሉኮስ፣ ጋላክቶስ፣ ላክቶስ፣ ኤን-አሲቲልማኖሳሚን (ማንናክ)፣ ኤን-አሲቲልግሉኮሳሚን። (glcNAc)፣ ኤን-አሲቲልጋላክቶሳሚን (galNAc)፣ ኢንኦሲቶል (ውስጣዊ ደረጃ)። በሰንጠረዥ 1 ላይ እንደሚታየው 1 mg/mL የስኳር መፍትሄዎችን በመጨመር ሁለት መመዘኛዎች ተዘጋጅተዋል። ናሙናዎቹ ቀዝቅዘው በ-80°ሴ ውስጥ ሁሉም ውሃ እስኪወገድ ድረስ (ብዙውን ጊዜ ከ12-18 ሰዓታት አካባቢ) ሊዮፊሊሲስ ይደረግባቸዋል።
የካፒታሉን ቱቦዎች በትንታኔ ሚዛን ለመጠምዘዝ ከ100-500 µg የናሙና መጠን ይጨምሩ። የተጨመረውን መጠን ይመዝግቡ። ናሙናውን በተወሰነ የሟሟ ክምችት ውስጥ በማሟሟት እና እንደ ፈሳሽ መጠን ወደ ቱቦው ማከል ጥሩ ነው። ለእያንዳንዱ የናሙና ቱቦ እንደ ውስጣዊ መለኪያ 20 µl 1 mg/ml ኢንኦሲቶል ይጠቀሙ። በናሙናው ላይ የተጨመረው የውስጥ መለኪያ መጠን ከመደበኛ ቱቦው ጋር ተመሳሳይ መሆን አለበት።
8 ሚሊ ሊትር የማይጠጣ ሜታኖል በዊንች ክዳን ብልቃጥ ውስጥ ይጨምሩ። ከዚያም 4 ሚሊ ሊትር 3 N. methanolic HCl መፍትሄ፣ ክዳኑን ሸፍኖ ይንቀጠቀጣል። ይህ ሂደት ውሃ አይጠቀምም።
500 µl የ1 M HCl ሜታኖል መፍትሄ ወደ ኦሊጎስካካርዴይድ ናሙናዎች እና መደበኛ የቲኤምኤስ ቱቦዎች ይጨምሩ። ናሙናዎቹ በአንድ ሌሊት (168 ሰዓታት) በ80°ሴ የሙቀት ማገጃ ውስጥ ተጨምረዋል። ​​የሜታኖሊሲስ ምርቱን በክፍል ሙቀት ውስጥ በማድረቂያ ማኒፎልድ ያድርቁት። 200 µl MeOH ይጨምሩ እና እንደገና ያድርቁ። ይህ ሂደት ሁለት ጊዜ ይደገማል። 200 µl ሜታኖል፣ 100 µl ፒሪዲን እና 100 µl አሲቲክ አንሃይድሬድ ወደ ናሙናው ይጨምሩ እና በደንብ ይቀላቅሉ። ናሙናዎቹ በክፍል ሙቀት ለ30 ደቂቃዎች ተጨምረው ደርቀዋል። 200 µl ሜታኖል ይጨምሩ እና እንደገና ያድርቁ።
200 µl Tri-Sil ይጨምሩ እና ክዳኑን ለ20 ደቂቃዎች ያሞቁ። 80°ሴ፣ ከዚያም ወደ ክፍሉ የሙቀት መጠን ያቀዘቅዙ። ናሙናውን ወደ 50 µl መጠን ለማድረቅ የማድረቂያ ማኒፎልድ ይጠቀሙ። ናሙናዎቹ ሙሉ በሙሉ እንዲደርቁ እንዳልፈቀድን ልብ ማለት ያስፈልጋል።
2 ሚሊ ሊትር ሄክሳን ጨምርና በቮርቴክሲንግ በደንብ አዋህድ። የመስታወቱን ሱፍ በ5-3/4 ኢንች ዲያሜትር ባለው ፒፔት ላይ በማስገባት የፓስተር ፒፔት ጫፎችን (5-8 ሚሜ) በመስታወት ሱፍ ይሙሉት። ናሙናዎቹ በ3000 ግራም ለ2 ደቂቃዎች ሴንትሪፉጅ ተደርገዋል። ማንኛውም የማይሟሟ ቅሪቶች ይጣላሉ። ናሙናውን እስከ 100-150 µl ድረስ ያድርቁት። በግምት 1 μl የሆነ መጠን በGC-MS ውስጥ በ80 °ሴ የመጀመሪያ የሙቀት መጠን እና በ2.0 ደቂቃዎች የመጀመሪያ ጊዜ ተረክቧል (ሠንጠረዥ 2)።