Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።እየተጠቀሙበት ያለው የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ አለው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።እስከዚያው ድረስ ቀጣይ ድጋፍን ለማረጋገጥ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናቀርባለን።
አዲስ የበሽታ መከላከያ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪክ ዘዴዎች በ AFEX ቀድሞ የታከመ በቆሎ ምድጃ ውስጥ የማያቋርጥ oligosaccharides ውስብስብ ትንተና።Lignocellulosic biomass ከቅሪተ አካል ነዳጆች ዘላቂ አማራጭ ሲሆን እንደ ምግብ፣ መኖ፣ ነዳጅ እና ኬሚካሎች ያሉ ምርቶችን ለማምረት ባዮቴክኖሎጂዎችን ለማምረት በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላል።የእነዚህ ቴክኖሎጂዎች ቁልፍ በዕፅዋት ሴል ግድግዳዎች ውስጥ የሚገኙትን ውስብስብ ካርቦሃይድሬትስ ወደ ቀላል ስኳር እንደ ግሉኮስ ፣ xylose እና arabinose ለመለወጥ ወጪ-ውድድር ሂደቶችን ማዳበር ነው።Lignocellulosic biomass በጣም ግትር ስለሆነ የተፈለገውን ምርት ለማግኘት በቴርሞኬሚካል ሕክምናዎች (ለምሳሌ አሞኒያ ፋይበር ኤክስፎሊሽን (AFEX)፣ Dilute acids (DA)፣ ionic ፈሳሽ (IL)) እና ባዮሎጂካል ሕክምናዎች (ለምሳሌ ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ እና ማይክሮቢያል ፍላት) የተፈለገውን ምርት ለማግኘት በጥምረት መደረግ አለበት።.ይሁን እንጂ, hydrolysis ሂደት ውስጥ የንግድ hrybkovыh ኢንዛይሞች yspolzuetsya ጊዜ, ብቻ 75-85% የሚሟሟ ስኳር obrazuetsja monosaccharides, እና ቀሪው 15-25% mykroorhanyzmы ሁልጊዜ የማይገኙ የማይል oligosaccharides, እና.ከዚህ ቀደም በተሳካ ሁኔታ የካርቦን እና የዲያቶማስ ምድር መለያየትን እና የመጠን ማግለል ክሮሞግራፊን በመጠቀም የሚሟሟ ግትር ኦሊጎሳካርዴድን ለይተናል እና አጽድተናል እንዲሁም የኢንዛይም መከላከያ ባህሪያቸውን መርምረናል።ከፍተኛ መጠን ያለው ፖሊሜራይዜሽን (ዲፒ) ሜቲላይትድ ዩሮኒክ አሲድ መለወጫዎችን ከዝቅተኛ ዲፒ እና ገለልተኛ ኦሊጎሳካራይድ ይልቅ ከንግድ ኢንዛይም ውህዶች ጋር ለመስራት በጣም አስቸጋሪ መሆናቸውን ደርሰንበታል።እዚህ ላይ በርካታ ተጨማሪ ዘዴዎችን መጠቀማችንን ሪፖርት እናደርጋለን፣ ግሊካን ፕሮፋይልን ጨምሮ monoclonal antibodies (mAbs) በዕፅዋት ሴል ግድግዳዎች እና ኢንዛይማቲክ ሃይድሮላይዜቶች ውስጥ ግላይካን ቦንድ ለመለየት ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላትን (mAbs) በመጠቀም፣ በማትሪክስ የታገዘ የሌዘር ማድረቂያ ionization፣ የበረራ ጊዜ የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ።.ማልዲ-ቶፍ-ኤምኤስ) የ oligosaccharide ቦንዶችን ከዲሪቬታይዜሽን ጋር ለመለየት እና አሉታዊ ionዎች ፣ ጋዝ ክሮማቶግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (ጂሲ-ኤምኤስ) ሁለተኛ መበስበስ በኋላ በስፔክትሮስኮፒ የተገኙ የመዋቅር መረጃ ሰጪ የምርመራ ጫፎችን ይጠቀማል።በትንሽ መጠን ኦሊጎሳካካርዴስ (DP 4-20) እነዚህ ሞለኪውሎች ለኤምኤቢ ትስስር እና ባህሪ ለመጠቀም አስቸጋሪ ናቸው።ይህንን ችግር ለመቅረፍ፣ አብዛኛው ዝቅተኛ ዲፒ የሚሟሟ oligosaccharides በማይክሮፕሌት ወለል ላይ በተሳካ ሁኔታ የተሰየመ አዲስ ባዮቲን conjugation-based oligosaccharide immobiliization ዘዴን ተግብረናል፣ይህም ለልዩ ligation ትንተና በከፍተኛ የመተላለፊያ mAB ስርዓት ውስጥ ጥቅም ላይ ውሏል።ይህ አዲስ ዘዴ ለምርመራ ዓላማዎች በባዮማርከርስ ውስጥ የሚገኙትን ኦሊጎሳካካርዳይዶችን ለመለየት እና ለመለየት የሚያገለግሉ የላቀ ከፍተኛ የግብአት ግላይኮሜይ ምርመራዎችን ወደፊት ለማዳበር ያስችላል።
ከግብርና፣ ከደን፣ ከሳርና ከእንጨት በተሠሩ ቁሶች የተዋቀረ ሊኖሴሉሎሲክ ባዮማስ ከፍተኛ ዋጋ ያላቸውን ምርቶች ለማምረት ምግብ፣ መኖ፣ ነዳጅ እና ኬሚካላዊ ቀዳሚዎችን ጨምሮ ባዮ-ተኮር ምርቶችን ለማምረት የሚያስችል እምቅ መኖ ነው።በእጽዋት ሴል ግድግዳዎች ውስጥ የሚገኙት ካርቦሃይድሬቶች (እንደ ሴሉሎስ እና ሄሚሴሉሎዝ ያሉ) በኬሚካላዊ ሂደት እና ባዮትራንስፎርሜሽን (እንደ ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ እና ማይክሮቢያል ፍላት) ወደ monosaccharides ይቀመጣሉ።የተለመዱ የቅድመ-ህክምናዎች የአሞኒያ ፋይበር ማስፋፊያ (AFEX)፣ ዲሉቲክ አሲድ (ዲኤ)፣ አዮኒክ ፈሳሽ (IL) እና የእንፋሎት ፍንዳታ (SE) ሲሆኑ እነዚህም የኬሚካልና የሙቀቱን ውህደት በመጠቀም የእፅዋትን ሴል ግድግዳዎች3,4 በመክፈት የሊኖሴሉሎስ ምርትን ይቀንሳል።የቁስ ግትርነት ፣ 5. ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ በከፍተኛ ደረቅ ጭነት ውስጥ የሚከናወነው የንግድ ንቁ ካርቦሃይድሬት-የያዙ ኢንዛይሞች (CAZymes) እና ረቂቅ ተሕዋስያንን በመጠቀም ባዮ-ተኮር ነዳጆችን እና ኬሚካሎችን ለማምረት ትራንስጄኒክ እርሾ ወይም ባክቴሪያን በመጠቀም 6 .
በንግድ ኢንዛይሞች ውስጥ ያሉ CAZymes ውስብስብ የካርቦሃይድሬት-ስኳር ቦንዶችን በማጣመር monosaccharides2,7 በሚፈጥሩ ውስብስብ የኢንዛይሞች ድብልቅ የተዋቀረ ነው።ቀደም ሲል እንደዘገበው ፣ የሊኒን ካርቦሃይድሬትስ ያለው ውስብስብ የአውታረ መረብ መዓዛ ያላቸው ፖሊመሮች በጣም በቀላሉ የማይበገሩ ያደርጋቸዋል ፣ ይህም ወደ ያልተሟላ የስኳር ለውጥ ያመራል ፣ ይህም ከ15-25% የወሲብ oligosaccharides በማጠራቀም የ pretreated biomass መካከል enzymatic hydrolysis ወቅት ምርት አይደለም.ይህ በተለያዩ የባዮማስ ቅድመ-ህክምና ዘዴዎች የተለመደ ችግር ነው.ለዚህ ማነቆ አንዳንድ ምክንያቶች በሃይድሮላይዜስ ወቅት ኢንዛይም መከልከል ወይም በእጽዋት ባዮማስ ውስጥ ያለውን የስኳር ትስስር ለመስበር የሚያስፈልጉ አስፈላጊ አስፈላጊ ኢንዛይሞች አለመኖር ወይም ዝቅተኛ ደረጃ ያካትታሉ።እንደ oligosaccharides ውስጥ ያለውን የስኳር ቦንዶችን የመሳሰሉ የስኳር ስብጥርን እና መዋቅራዊ ባህሪያትን መረዳታችን በሃይድሮሊሲስ ወቅት የስኳር ለውጥን ለማሻሻል ይረዳናል፣ ይህም የባዮቴክኖሎጂ ሂደቶችን ከፔትሮሊየም ከሚመነጩ ምርቶች ጋር ተመጣጣኝ ያደርገዋል።
የካርቦሃይድሬትስ አወቃቀሩን መወሰን ፈታኝ ነው እና እንደ ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ (LC) 11,12, ኑክሌር ማግኔቲክ ሬዞናንስ ስፔክትሮስኮፒ (NMR) 13, capillary electrophoresis (CE) 14,15,16 እና mass spectrometry (MS)17 የመሳሰሉ ዘዴዎችን ጥምር ይጠይቃል.,አስራ ስምንት.እንደ የበረራ ጊዜ የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ያሉ የኤምኤስ ዘዴዎች ማትሪክስ (MALDI-TOF-MS) በመጠቀም የሌዘር ዲዘርፕሽን እና ionization የካርቦሃይድሬት አወቃቀሮችን ለመለየት ሁለገብ ዘዴ ነው።በቅርብ ጊዜ, ግጭት-የተፈጠረ ዲስኦርደር (CID) tandem MS የሶዲየም ion adducts በብዛት ጥቅም ላይ የዋለው ከ oligosaccharide አባሪ አቀማመጥ, አኖሜሪክ ውቅሮች, ቅደም ተከተሎች እና የቅርንጫፍ ቦታዎች 20, 21 ጋር የሚዛመዱ የጣት አሻራዎችን ለመለየት ነው.
ግላይካን ትንተና የካርቦሃይድሬት ቦንዶችን በጥልቀት ለመለየት በጣም ጥሩ መሳሪያ ነው22.ይህ ዘዴ ውስብስብ የካርቦሃይድሬትስ ትስስርን ለመረዳት እንደ መመርመሪያ የሕዋስ ግድግዳ ግላይካንን ለመትከል የታዘዙ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላትን (mAbs) ይጠቀማል።ከ 250 mAbs በላይ በአለምአቀፍ ደረጃ ይገኛሉ፣ ከተለያዩ መስመራዊ እና ቅርንጫፍ ኦሊጎሳካራይድ ጋር የተነደፉ የተለያዩ saccharides24ን በመጠቀም።በእጽዋት ሴል ዓይነት፣ አካል፣ ዕድሜ፣ የእድገት ደረጃ እና የእድገት አካባቢ ላይ ተመስርተው ከፍተኛ ልዩነቶች ስላሉት የእጽዋት ሴል ግድግዳ አወቃቀሩን፣ አወቃቀሩን እና ማሻሻያዎችን ለመለየት በርካታ mAbs በሰፊው ጥቅም ላይ ውለዋል።በቅርብ ጊዜ ይህ ዘዴ በእጽዋት እና በእንስሳት ስርዓቶች ውስጥ ያሉትን የ vesicles ህዝቦች ለመረዳት እና በ glycan ትራንስፖርት ውስጥ ያላቸውን ሚናዎች በንዑስ ሴል ማርከሮች ፣ በእድገት ደረጃዎች ወይም በአከባቢ ማነቃቂያዎች የሚወሰነው እና የኢንዛይም እንቅስቃሴን ለመወሰን ጥቅም ላይ ውሏል።ከተለዩት የ glycans እና xylans ልዩ ልዩ አወቃቀሮች መካከል ፒኬቲን (ፒ)፣ xylan (ኤክስ)፣ ማንን (ኤም)፣ xyloglucans (XylG)፣ የተቀላቀለ ቦንድ ግሉካን (MLG)፣ arabinoxylan (ArbX)፣ ጋላክቶማን (ጋልጂ)፣ ግሉኩሮኒክ አሲድ-አራቢኖክሲላን (አርቢኤክስ) እና አራቢኖ-ጋቦኖ (አራቢኖ-ጋቦክስ)
ይሁን እንጂ እነዚህ ሁሉ የምርምር ጥረቶች ቢኖሩም, ጥቂት ጥናቶች ብቻ በከፍተኛ የጠጣር ጭነት (HSL) ሃይድሮሊሲስ ተፈጥሮ ላይ ያተኮሩ ናቸው oligosaccharide መለቀቅን ጨምሮ, የ oligomeric ሰንሰለት ርዝመት በሃይድሮሊሲስ, የተለያዩ ዝቅተኛ ዲፒ ፖሊመሮች እና ኩርባዎቻቸው.ማከፋፈያዎች 30,31,32.ይህ በእንዲህ እንዳለ የ glycan ትንታኔ ለግሊካን መዋቅር አጠቃላይ ትንተና ጠቃሚ መሳሪያ ሆኖ ቢገኝም ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም በውሃ የሚሟሟ ዝቅተኛ ዲፒ ኦሊጎሳቻራይድ ለመገምገም አስቸጋሪ ነው።ሞለኪውላዊ ክብደት ከ5-10 kDa ያነሱ ትናንሽ ዲፒ oligosaccharides ከ ELISA plates 33, 34 ጋር አይገናኙም እና ፀረ እንግዳ አካላት ከመጨመራቸው በፊት ይታጠባሉ.
እዚህ ለመጀመሪያ ጊዜ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም በአቪዲን በተሸፈኑ ሳህኖች ላይ የኤሊዛ ምርመራን እናሳያለን ፣ አንድ-ደረጃ ባዮቲኒየሽን አሰራርን ለሟሟ ሬፍራክቶሪ ኦሊጎሳካርዴድ ከ glycome ትንተና ጋር በማጣመር።የጂሊኮሜ ትንተና አካሄዳችን በMALDI-TOF-MS እና GC-MS ላይ የተመሰረተ የተጨማሪ ኦሊጎሳክቻራይድ ትስስርን በመጠቀም trimethylsilyl (TMS) የሀይድሮላይዝድ ስኳር ውህዶችን በማውጣት የተረጋገጠ ነው።ይህ የፈጠራ አካሄድ ወደፊት እንደ ከፍተኛ ዘዴ ሊዳብር ይችላል እና በባዮሜዲካል ጥናት ውስጥ ሰፋ ያለ መተግበሪያ ማግኘት35።
የድህረ-ትርጉም ለውጦች የኢንዛይሞች እና ፀረ እንግዳ አካላት፣ ለምሳሌ ግላይኮሲሌሽን፣ 36 በባዮሎጂካል እንቅስቃሴያቸው ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል።ለምሳሌ፣ የሴረም ፕሮቲኖች ግላይኮሲሌሽን (glycosylation) ላይ የሚደረጉ ለውጦች ለኢንፍላማቶሪ አርትራይተስ ትልቅ ሚና ይጫወታሉ፣ እና የ glycosylation ለውጦች እንደ የምርመራ ምልክቶች37 ጥቅም ላይ ይውላሉ።የተለያዩ ግሊካንስ በጽሑፎቹ ውስጥ በተለያዩ በሽታዎች ውስጥ በቀላሉ እንዲታዩ ተዘግበዋል, እነዚህም ሥር የሰደደ የጨጓራና ትራክት እና ጉበት, የቫይረስ ኢንፌክሽኖች, ኦቭቫርስ, የጡት እና የፕሮስቴት ካንሰር 38,39,40.በፀረ-ሰውነት ላይ የተመሰረተ የ ELISA ዘዴዎችን በመጠቀም የ glycans አወቃቀሩን መረዳት ውስብስብ የኤምኤስ ዘዴዎችን ሳይጠቀም በበሽታ ምርመራ ላይ ተጨማሪ እምነት ይሰጣል.
የቀድሞ ጥናታችን እንደሚያሳየው ግትር የሆኑት ኦሊጎሳካራይዶች ከቅድመ-ህክምና እና ኢንዛይሚክ ሃይድሮሊሲስ (ምስል 1) በኋላ ውሃ ሳይወስዱ መቆየታቸውን ያሳያል።ቀደም ሲል በታተመው ሥራችን ኦሊጎሳካራይድስን ከ AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) 8 ለመለየት የነቃ ከሰል ጠንካራ-ደረጃ የማውጣት ዘዴ ሠራን።ከመጀመሪያው ማውጣት እና መለያየት በኋላ ኦሊጎሳካካርዲዶች በመጠን ማግለል ክሮማቶግራፊ (SEC) የበለጠ ተከፋፍለው በሞለኪውላዊ ክብደት ቅደም ተከተል ተሰበሰቡ።ከተለያዩ ቅድመ-ህክምናዎች የተለቀቁ ሹገር ሞኖመሮች እና ኦሊጎመሮች በስኳር ስብጥር ትንተና ተንትነዋል።በተለያዩ የቅድመ-ህክምና ዘዴዎች የተገኘውን የስኳር ኦሊጎመሮች ይዘትን በማነፃፀር ፣ ግትር ኦሊጎሳካራይትስ መኖሩ ባዮማስ ወደ ሞኖሳካካርዴስ መለወጥ የተለመደ ችግር ሲሆን ቢያንስ ከ10-15% እና እስከ 18% እንኳን ሳይቀር የስኳር ምርት እንዲቀንስ ሊያደርግ ይችላል።ዩኤስይህ ዘዴ ተጨማሪ የ oligosaccharide ክፍልፋዮችን ለማምረት ያገለግላል.የተገኘው ACH እና ተከታይ ክፍልፋዮች ከተለያዩ ሞለኪውላዊ ክብደት ጋር በዚህ ሥራ ውስጥ ኦሊጎሳካካርዴድን ለመለየት እንደ የሙከራ ቁሳቁስ ጥቅም ላይ ውለዋል።
ከቅድመ-ህክምና እና ኢንዛይም ሃይድሮሊሲስ በኋላ, የማያቋርጥ oligosaccharides ሃይድሮሊክ ሳይደረግ ቀርቷል.እዚህ (ሀ) ኦሊጎሳክካርዳይድ ከ AFEX-pretreated የበቆሎ ምድጃ ሃይድሮላይዜት (ACSH) የተነጠለ የካርቦን እና የዲያቶማስ ምድር የታሸገ አልጋ በመጠቀም የ oligosaccharides መለያየት ዘዴ ነው።(ለ) oligosaccharides የመለየት ዘዴ.የ oligosaccharides ተጨማሪ በመጠን ማግለል chromatography (SEC) ተለዩ;(ሐ) ከተለያዩ ቅድመ-ህክምናዎች የተለቀቁ ሳካራይድ ሞኖመሮች እና ኦሊጎመሮች (የተቀቀለ አሲድ: DA, ionic ፈሳሽ: IL እና AFEX).የኢንዛይም ሃይድሮሊሲስ ሁኔታዎች፡ ከፍተኛ ጠጣር የ 25% (ወ/ወ) (በግምት 8% ግሉካን መጫን)፣ 96 ሰአታት ሃይድሮሊሲስ፣ 20 mg/g የንግድ ኢንዛይም ጭነት (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) እና (D) Sugar monomers እና oligomers of glucose, xyloseated and AF pribinoses stove (ኤኤፍ ኮርኖስ አራቢን አራቢን) ግሉኮስ።
ግላይካን ትንታኔ ከጠንካራ ባዮማስ ቀሪዎች በተለዩ ውህዶች ውስጥ ያለውን ግላይካን አጠቃላይ መዋቅራዊ ትንተና ጠቃሚ መሳሪያ መሆኑን አረጋግጧል።ነገር ግን በውሃ የሚሟሟ ሳክራራይዶች ይህን ባህላዊ ዘዴ በመጠቀም ብዙም አይወከሉም ምክንያቱም ዝቅተኛ ሞለኪውላዊ ክብደት oligosaccharides በ ELISA ሰሌዳዎች ላይ ለመንቀሳቀስ አስቸጋሪ ስለሆነ እና ፀረ እንግዳ አካላት ከመጨመራቸው በፊት ይታጠባሉ.ስለዚህ, ለፀረ-ሰው ማሰር እና ባህሪ, አንድ-ደረጃ ባዮቲኒየሽን ዘዴ በአቪዲን-የተሸፈኑ ELISA ሳህኖች ላይ የሚሟሟ, የማያሟሉ oligosaccharides ለመልበስ ጥቅም ላይ ውሏል.ይህ ዘዴ ቀደም ሲል በተመረተው ACSH እና በሞለኪውላዊ ክብደቱ (ወይም በፖሊሜራይዜሽን ዲግሪ፣ ዲፒ) ላይ የተመሰረተ ክፍልፋይ በመጠቀም ተፈትኗል።አንድ-ደረጃ ባዮቲንላይዜሽን ባዮቲን-ኤልሲ-ሃይድሮዛይድን ወደ ካርቦሃይድሬት ቅነሳ መጨረሻ (ምስል 2) በመጨመር oligosaccharide ትስስርን ለመጨመር ጥቅም ላይ ውሏል።በመፍትሔው ውስጥ፣ በመቀነሱ መጨረሻ ላይ ያለው የሂሚአቴታል ቡድን ከባዮቲን-ኤልሲ-ሃይድሮዛይድ ሃይድራዛይድ ቡድን ጋር በመሆን የሃይድሮዞን ትስስር ይፈጥራል።የመቀነስ ወኪል NaCNBH3 በሚኖርበት ጊዜ የሃይድሮዞን ትስስር ወደ የተረጋጋ የባዮቲኒላድ የመጨረሻ ምርት ይቀንሳል።የስኳር ቅነሳውን ጫፍ በመቀየር ዝቅተኛ ዲፒ oligosaccharides ከ ELISA ሰሌዳዎች ጋር ማገናኘት ተችሏል ፣ እና በጥናታችን ውስጥ ይህ በ glycan- targetted mAbs በመጠቀም በአቪዲን በተሸፈኑ ሳህኖች ላይ ተሠርቷል ።
በ ELISA ላይ የተመሰረቱ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላትን ለባዮቲኒላድ ኦሊጎሳካራይትስ ማጣራት።እዚህ (ሀ) የ oligosaccharides ጥምር ባዮቲንላይዜሽን እና የ ELISA ማጣሪያ በ glycan-targeted mAbs በ NeutrAvidin በተሸፈኑ ሳህኖች ላይ እና (B) የምላሽ ምርቶችን ባዮቲንላይዜሽን አንድ-ደረጃ ሂደት ያሳያል።
አቪዲን-የተሸፈኑ ሳህኖች ከ oligosaccharide-conjugated ፀረ እንግዳ አካላት ጋር ወደ አንደኛ ደረጃ እና ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት ተጨምረዋል እና ቀላል እና ጊዜን በሚነካ መካከለኛ ውስጥ ይታጠቡ።ፀረ እንግዳ አካላት ማሰር ከተጠናቀቀ በኋላ ሳህኑን ለመክተት TMB substrate ጨምሩ።ምላሹ በመጨረሻ በሰልፈሪክ አሲድ ቆመ።የተከተቡት ሳህኖች ፀረ-ሰው-ተኮር መሻገሪያን ለመለየት የእያንዳንዱን ፀረ እንግዳ አካላት አስገዳጅ ጥንካሬ ለመወሰን ELISA አንባቢን በመጠቀም ተንትነዋል።ለሙከራ ዝርዝሮች እና ግቤቶች "ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች" የሚለውን ተዛማጅ ክፍል ይመልከቱ.
በACSH ውስጥ የሚገኙትን የሚሟሟ oligosaccharides እንዲሁም ከሊግኖሴሉሎስሲክ ሃይድሮላይዛትስ በተለዩ ድፍድፍ እና የተጣራ ኦሊጎሳክካርራይድ ክፍልፋዮችን በመለየት የዚህ አዲስ የተሻሻለ ዘዴ ለተወሰኑ አፕሊኬሽኖች ያለውን ጥቅም እናሳያለን።በስእል 3 ላይ እንደሚታየው በ ACSH ውስጥ ባዮአሲላይትድ ግላይኮሜ መመርመሪያ ዘዴዎችን በመጠቀም ተለይተው የሚታወቁት በጣም የተለመዱ የኤፒቶፕ ምትክ xylans ዩሮኒክ (U) ወይም methyluronic (MeU) እና pectic arabinogalactans ናቸው።አብዛኛዎቹም በቀደመው ጥናታችን ላይ ግሊካንስ ያልሆኑ ሃይድሮላይዝድ ጠጣር (UHS) 43 ትንታኔ ላይ ተገኝተዋል።
ወደ ሴል ግድግዳ ግላይካን የሚመራ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም ሪካልሲትረንት ኦሊጎሳካርራይድ ኤፒቶፖችን መለየት።የ "ገለልተኛ" ክፍልፋይ የ ACN ክፍልፋይ እና "አሲዳማ" ክፍልፋዩ የኤፍኤ ክፍልፋይ ነው.በሙቀት ካርታው ላይ ያሉት ደማቅ ቀይዎች ከፍ ያለ የኤፒቶፕ ይዘት ያመለክታሉ፣ እና ደማቅ ሰማያዊዎቹ ባዶ ዳራ ያመለክታሉ።በመለኪያው ላይ ያሉ የቀለም ዋጋዎች N=2 ቀመሮች በጥሬ OD እሴቶች ላይ የተመሰረቱ ናቸው።በፀረ እንግዳ አካላት የሚታወቁት ዋናዎቹ ኤፒቶፖች በቀኝ በኩል ይታያሉ.
እነዚህ ሴሉሎስ ያልሆኑ አወቃቀሮች በብዛት ጥቅም ላይ የዋሉ የንግድ ኢንዛይሞችን በሚያካትት በተፈተሸው የንግድ ኢንዛይም ድብልቅ ውስጥ በጣም በተለመዱት ሴሉላሴስ እና ሄሚሴሉላሴስ ሊሰነጣጠቁ አልቻሉም።ስለዚህ, ለሃይድሮሊሲስ አዲስ ረዳት ኢንዛይሞች ያስፈልጋሉ.አስፈላጊው ሴሉሎስ ያልሆኑ ተቀጥላ ኢንዛይሞች ከሌሉ እነዚህ ሴሉሎስ ያልሆኑ ቦንዶች ሙሉ በሙሉ ወደ ሞኖሳካካርዳይድ መለወጥን ይከላከላሉ፣ ምንም እንኳን የወላጆቻቸው የስኳር ፖሊመሮች በብዛት ወደ አጭር ቁርጥራጮች ሃይድሮላይዝድ ቢደረጉ እና የንግድ ኢንዛይም ድብልቆችን በመጠቀም ቢሟሟቸውም።
የሲግናል ስርጭት እና የማሰር ጥንካሬው ተጨማሪ ጥናት እንደሚያሳየው አስገዳጅ ኤፒቶፖች በከፍተኛ ዲፒ ስኳር ክፍልፋዮች (A, B, C, DP እስከ 20+) ከዝቅተኛ ዲፒ ክፍልፋዮች (D, E, F, DP) በዲሚር) (ምስል 1) ዝቅተኛ ናቸው.የአሲድ ቁርጥራጮች ከገለልተኛ ክፍልፋዮች ይልቅ ሴሉሎስ ባልሆኑ ኤፒቶፖች ውስጥ በብዛት ይገኛሉ።እነዚህ ክስተቶች ባለፈው ጥናታችን ከታየው ንድፍ ጋር የሚጣጣሙ ናቸው, ከፍተኛ የዲፒ እና የአሲድ አካላት ለኤንዛይም ሃይድሮሊሲስ የበለጠ የመቋቋም ችሎታ ያላቸው ናቸው.ስለዚህ, ሴሉሎስ ያልሆኑ ግሊካን ኤፒቶፖች እና የ U እና MeU ተተኪዎች መኖራቸው ለ oligosaccharides መረጋጋት ከፍተኛ አስተዋጽኦ ሊያደርግ ይችላል.ለዝቅተኛ ዲፒ oligosaccharides ፣ በተለይም ኤፒቶፕ ዲሜሪክ ወይም ትሪሜሪክ ኦሊጎሳካርዴድ ከሆነ የማሰር እና የመለየት ውጤታማነት ችግር ሊሆን እንደሚችል ልብ ሊባል ይገባል።ይህ የተለያየ ርዝመት ያላቸውን የንግድ oligosaccharides በመጠቀም መሞከር ይቻላል፣ እያንዳንዱም ከአንድ የተወሰነ mAB ጋር የሚያገናኝ አንድ ኤፒቶፕ ብቻ ይይዛል።
ስለዚህ, መዋቅራዊ-ተኮር ፀረ እንግዳ አካላትን መጠቀም አንዳንድ የሪካልሲትተን ቦንዶችን አሳይቷል.ጥቅም ላይ የዋለው ፀረ እንግዳ አካል ዓይነት፣ ተገቢው የሊጅሽን ንድፍ እና የሚያመነጨው የምልክት ጥንካሬ (በጣም እና በትንሹ በብዛት) ላይ በመመስረት አዳዲስ ኢንዛይሞች ተለይተው ከፊል መጠናዊ በሆነ መልኩ ወደ ኢንዛይም ድብልቅ ለበለጠ የተሟላ የ glycoconversion መጨመር ይችላሉ።የACSH oligosaccharides ትንታኔን እንደ ምሳሌ በመውሰድ ለእያንዳንዱ የባዮማስ ቁሳቁስ የ glycan bonds ዳታቤዝ መፍጠር እንችላለን።እዚህ ላይ ልብ ሊባል የሚገባው ፀረ እንግዳ አካላት የተለያዩ ተያያዥነት ግምት ውስጥ መግባት አለባቸው, እና የእነሱ ግንኙነት የማይታወቅ ከሆነ, ይህ የተለያዩ ፀረ እንግዳ አካላት ምልክቶችን ሲያወዳድሩ አንዳንድ ችግሮች ይፈጥራል.በተጨማሪም፣ የ glycan bonds ንፅፅር ለተመሳሳይ ፀረ እንግዳ አካላት ናሙናዎች በተሻለ ሁኔታ ሊሠራ ይችላል።እነዚህ ግትር ቦንዶች ከ CAZyme ዳታቤዝ ጋር ሊገናኙ ይችላሉ፣ ከእሱም ኢንዛይሞችን መለየት፣ እጩ ኢንዛይሞችን መምረጥ እና ቦንድ የሚሰብሩ ኢንዛይሞችን መሞከር ወይም ማይክሮቢያል ሲስተምን ማዳበር እነዚህን ኢንዛይሞች በ biorefineries44 ውስጥ መጠቀም እንችላለን።
ዝቅተኛ ሞለኪውላዊ ክብደት oligosaccharides lignocellulosic hydrolysates ውስጥ የሚገኙትን ዝቅተኛ ሞለኪውላዊ ክብደት oligosaccharides ለመለየት የበሽታ መከላከያ ዘዴዎች እንዴት እንደሚሟሉ ለመገምገም, MALDI (ምስል 4, S1-S8) እና በ GC-MS ላይ በተመሳሳዩ ፓነል (ምስል 5) ላይ ባለው የ oligosaccharide ክፍል ላይ በመመርኮዝ የቲኤምኤስ-የተገኙ saccharides ትንተና አደረግን.ማልዲ የ oligosaccharide ሞለኪውሎች የጅምላ ስርጭት ከታሰበው መዋቅር ጋር ይዛመዳል የሚለውን ለማነፃፀር ይጠቅማል።በለስ ላይ.4 የገለልተኛ ክፍሎችን ኤሲኤን-ኤ እና ኤሲኤን-ቢን ያሳያል።የ ACN-A ትንተና ከ DP 4-8 (ምስል 4) እስከ DP 22 (ምስል S1) ያሉ የፔንቶስ ስኳር መጠን አረጋግጧል, ክብደታቸው ከ MeU-xylan oligosaccharides ጋር ይዛመዳል.የ ACN-B ትንተና የፔንቶስ እና የግሉኮክሲላን ተከታታይ በ DP 8-15 አረጋግጧል.እንደ ስእል ኤስ 3 ባሉ ተጨማሪ ነገሮች የኤፍኤ-ሲ አሲዳማ ህዋሶች የጅምላ ማከፋፈያ ካርታዎች በELISA ላይ በተመሰረተ mAB ማጣሪያ ውስጥ ከሚገኙት የተተኩ xylans ጋር የሚጣጣሙ የፔንቶዝ ስኳር መጠን ከ 8-15 ጋር የሚተካከሉ (Me) ዩ ክልል ያሳያሉ።ኤፒቶፖች ወጥነት ያላቸው ናቸው.
በኤሲኤስ ውስጥ ማልዲ-ኤምኤስ የሚሟሟ የማይታዘዙ oligosaccharides ስፔክትረምእዚህ፣ (A) ACN-A ዝቅተኛ የክብደት ክልል ክፍልፋዮች ሜቲላይትድ ዩሮኒክ አሲድ (DP 4-8) የተተኩ ግሉኩሮክሲላን oligosaccharides እና (B) ACN-B xylan እና methylated uronic acid oligosaccharides በglucuroxylan (DP 8-15) የተተኩ።
Refractory oligosaccharides መካከል glycan ቅሪት ስብጥር ትንተና.እዚህ (ሀ) የ GC-MS ትንታኔን በመጠቀም የተገኙ የተለያዩ የ oligosacchariide ክፍልፋዮች የቲኤምኤስ saccharide ጥንቅር።(ለ) በ oligosaccharides ውስጥ የሚገኙ የተለያዩ የቲኤምኤስ-የተመነጩ ስኳሮች አወቃቀሮች።ACN - ገለልተኛ oligosaccharides እና FA - አሲድ oligosaccharides የያዘ ferulic አሲድ ክፍልፋይ የያዘ acetonitrile ክፍልፋይ.
በስእል S9 ላይ እንደሚታየው (ዘዴዎች በኤሌክትሮኒካዊ ተጨማሪ ነገሮች ውስጥ ሊታዩ ይችላሉ) ከ LC-MS ትንተና ኦሊጎሳክካርዴድ ክፍልፋይ ሌላ አስደሳች መደምደሚያ ቀርቧል.የ ACN-B ክፍልፋይን በማያያዝ ጊዜ የሄክሶስ እና -OAc ቡድኖች ቁርጥራጮች በተደጋጋሚ ተስተውለዋል.ይህ ግኝት በ glycome እና MALDI-TOF ትንታኔ ላይ የተስተዋለውን ስብጥር የሚያረጋግጥ ብቻ ሳይሆን አስቀድሞ በሊኖሴሉሎሲክ ባዮማስ ውስጥ ሊኖሩ ስለሚችሉ የካርቦሃይድሬት ተዋጽኦዎች አዲስ መረጃ ይሰጣል።
እንዲሁም የቲኤምኤስ ስኳር ዲሪቫታይዜሽን በመጠቀም የ oligosaccharide ክፍልፋይን የስኳር ቅንጅት ተንትነናል።GC-MS ን በመጠቀም በ oligosaccharide ክፍልፋይ (ምስል 5) ውስጥ የነርቭ (የማይገኙ) እና የአሲድ ስኳር (ግሉኤ እና ጋላ) ስብጥርን ወስነናል።ግሉኩሮኒክ አሲድ በአሲዳማ ክፍሎች C እና D ውስጥ ይገኛል ፣ ጋላክቱሮኒክ አሲድ በአሲዳማ ክፍሎች A እና B ውስጥ ይገኛል ፣ ሁለቱም ከፍተኛ የ DP የአሲድ ስኳር አካላት ናቸው።እነዚህ ውጤቶች የእኛን ELISA እና MALDI መረጃ የሚያረጋግጡ ብቻ አይደሉም፣ ነገር ግን ከቀደምት የ oligosaccharide ክምችት ጥናቶቻችን ጋር የሚጣጣሙ ናቸው።ስለዚህ, እኛ oligosaccharides መካከል biotinylation እና ተከታይ ELISA ማጣሪያ በመጠቀም ዘመናዊ immunological ዘዴዎች በተለያዩ ባዮሎጂያዊ ናሙናዎች ውስጥ የሚሟሟ recalcitrant oligosaccharides ለመለየት በቂ ናቸው ብለን እናምናለን.
በELISA ላይ የተመሰረቱ mAb የማጣሪያ ዘዴዎች በተለያዩ መንገዶች የተረጋገጡ በመሆናቸው፣ የዚህን አዲስ የቁጥር ዘዴ አቅም የበለጠ ለመመርመር እንፈልጋለን።ሁለት የንግድ oligosaccharides, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) እና 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) የተገዙ እና ሕዋስ ግድግዳ glycan ላይ ያነጣጠረ አዲስ mAb አካሄድ በመጠቀም ተፈትኗል.ምስል 6 በባዮቲንላይድ ማሰሪያ ሲግናል እና በ oligosaccharide ትኩረት የምዝግብ ማስታወሻ መካከል ያለውን ቀጥተኛ ትስስር ያሳያል፣ ይህም የ Langmuir adsorption ሞዴል ሊሆን ይችላል።ከ mAbs መካከል፣ CCRC-M137፣ CCRC-M138፣ CCRC-M147፣ CCRC-M148 እና CCRC-M151 ከXHE እና CCRC-M108፣ CCRC-M109 እና LM11 ከ A2XX ከ10 namno ጋር የተቆራኙ ናቸው።በሙከራው ወቅት ፀረ እንግዳ አካላት ያለው ውሱንነት በመኖሩ በእያንዳንዱ የ oligosaccharide ትኩረት ውስን ሙከራዎች ተካሂደዋል።እዚህ ላይ ልብ ሊባል የሚገባው አንዳንድ ፀረ እንግዳ አካላት ለተመሳሳይ ኦሊጎሳክካርራይድ እንደ ንኡስ ክፍል በጣም በተለየ መልኩ ምላሽ ይሰጣሉ፣ ምናልባትም እነሱ ከትንሽ የተለያዩ ኤፒቶፖች ጋር ስለሚተሳሰሩ እና በጣም የተለያየ ትስስር ሊኖራቸው ይችላል።አዲሱ mAb አቀራረብ በእውነተኛ ናሙናዎች ላይ ሲተገበር ትክክለኛው የኤፒቶፕ መለያ ስልቶች እና አንድምታዎች በጣም ውስብስብ ይሆናሉ።
ሁለት የንግድ oligosaccharides የተለያዩ ግላይካን-ያነጣጠሩ mAbs የመለየት ክልልን ለመወሰን ጥቅም ላይ ውለዋል።እዚህ፣ ከሎጎሳክካርራይድ ክምችት ሎግ ማጎሪያ ጋር ያለው መስመራዊ ትስስሮች የ Langmuir adsorption ቅጦችን ለ(A) XHE ከ mAb እና (B) A2XX ከ mAB ጋር ያመለክታሉ።ተጓዳኝ ኤፒቶፖች በምርመራው ውስጥ እንደ መለዋወጫነት የሚያገለግሉትን የንግድ ኦሊጎሳካካርዴዶች አወቃቀሮችን ያመለክታሉ።
ግላይካን-ያነጣጠረ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (glycocomic analysis or ELISA-based mAb screening) መጠቀም የእጽዋት ባዮማስ የሆኑትን አብዛኛዎቹን ዋና ዋና የሕዋስ ግድግዳ ግላይካንስ ጠለቅ ያለ ባህሪን ለማሳየት ኃይለኛ መሳሪያ ነው።ይሁን እንጂ ክላሲካል ግላይካን ትንተና የሚለየው ትልቅ የሕዋስ ግድግዳ ግላይካንን ብቻ ነው፣ ምክንያቱም አብዛኞቹ ኦሊጎሳካርዳይድ በ ELISA ሰሌዳዎች ላይ በብቃት የማይንቀሳቀሱ ናቸው።በዚህ ጥናት ውስጥ, AFEX-pretreated የበቆሎ ምድጃ በከፍተኛ ጠጣር ይዘት ውስጥ ኢንዛይም ሃይድሮላይዝድ ተደርጓል.የስኳር ትንተና በሃይድሮላይዜድ ውስጥ ያለውን የሪካልሲት ሴል ግድግዳ ካርቦሃይድሬትን ስብጥር ለመወሰን ጥቅም ላይ ውሏል.ይሁን እንጂ በሃይድሮላይዜስ ውስጥ የሚገኙትን ትናንሽ ኦሊጎሳካካርዴዶችን በተመለከተ mAb ትንታኔ ዝቅተኛ ነው, እና በ ELISA ሰሌዳዎች ላይ oligosaccharidesን ውጤታማ በሆነ መንገድ ለማራገፍ ተጨማሪ መሳሪያዎች ያስፈልጋሉ.
Oligosaccharide biotinylation በማጣመር እና በNeutrAvidin ™ በተሸፈኑ ሰሌዳዎች ላይ የኤሊሳ ማጣሪያን በማጣመር ለኤምኤቢ ማጣሪያ አዲስ እና ቀልጣፋ የሆነ ኦሊጎሳክካርራይድ የማይንቀሳቀስ ዘዴን እዚህ ሪፖርት እናደርጋለን።የማይንቀሳቀስ ባዮቲኒላድ ኦሊጎሳካካርዴስ ፈጣን እና ቀልጣፋ ሪcalcitrant oligosaccharidesን ለይቶ ለማወቅ ለፀረ እንግዳ አካላት በቂ የሆነ ቅርርብ አሳይቷል።በጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ላይ የተመሰረተው የእነዚህ ግትር ኦሊጎሳካካርዳይዶች ስብጥር ትንተና የዚህን አዲስ የበሽታ መከላከያ ዘዴ ውጤት አረጋግጧል.ስለዚህ እነዚህ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የ oligosaccharides biotinylation እና ELISA ማጣሪያ ከ glycan-targeted monoclonal ፀረ እንግዳ አካላት ጋር በማጣመር በ oligosaccharides ውስጥ ያሉ ግንኙነቶችን ለመለየት እና በሌሎች ባዮኬሚካላዊ ጥናቶች ውስጥ የኦሊጎሳክካርዳይድ አወቃቀርን በሚያሳዩ ሌሎች ባዮኬሚካላዊ ጥናቶች ውስጥ በሰፊው ሊተገበር ይችላል ።
ይህ በባዮቲን ላይ የተመሰረተ ግላይካን የመገለጫ ዘዴ በእጽዋት ባዮማስ ውስጥ የሚሟሟ ኦሊጎሳካካርዳይዶችን እምቢተኛ የካርቦሃይድሬትስ ቦንዶችን ለመመርመር የሚችል የመጀመሪያው ሪፖርት ነው።ይህ አንዳንድ የባዮማስ ክፍሎች ወደ ባዮፊውል ምርት በሚመጡበት ጊዜ በጣም ግትር የሆኑት ለምን እንደሆነ ለመረዳት ይረዳል.ይህ ዘዴ በ glycome ትንተና ዘዴዎች ውስጥ አስፈላጊ ክፍተትን የሚሞላ እና አተገባበሩን ከዕፅዋት oligosaccharides ባለፈ ወደ ሰፋ ያሉ ንዑሳን ክፍሎች ያራዝመዋል።ለወደፊት፣ ሮቦቲክስን ለባዮቲኒሌሽን ልንጠቀም እና ELISAን በመጠቀም ናሙናዎችን ለከፍተኛ ትንተና የፈጠርነውን ዘዴ ልንጠቀም እንችላለን።
የበቆሎ ገለባ (ሲኤስ) ከአቅኚ 33A14 የተዳቀለ ዘር በ2010 በሬይ፣ ኮሎራዶ ከሚገኘው ከክራመር እርሻ ተሰብስቧል።በባለንብረቱ ፈቃድ ይህ ባዮማስ ለምርምር ሊያገለግል ይችላል። ናሙናዎቹ በደረቅ <6% እርጥበት በዚፕ-መቆለፊያ ቦርሳዎች ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ ተከማችተዋል. ናሙናዎቹ በደረቅ <6% እርጥበት በዚፕ-መቆለፊያ ቦርሳዎች ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ ተከማችተዋል. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. ናሙናዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ በዚፐር ቦርሳዎች ውስጥ በ <6% እርጥበት በደረቁ ተከማችተዋል.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. ናሙናዎች በዚፐር ከረጢቶች ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ እርጥበት< 6% ይቀመጣሉ.ጥናቱ የአካባቢ እና የሀገር መመሪያዎችን አሟልቷል.የ NREL ፕሮቶኮልን በመጠቀም የአጻጻፍ ትንተና ተካሂዷል።ቅንብሩ 31.4% ግሉካን፣ 18.7% xylan፣ 3.3% arabinan፣ 1.2% galactan፣ 2.2% acetyl፣ 14.3% lignin፣ 1.7% protein እና 13. 4% አመድ ይዟል።
Cellic® CTec2 (138 mg ፕሮቲን / ml, lot VCNI 0001) የሴሉላሴ, β-glucosidase እና Cellic® HTec2 (157 mg ፕሮቲን / ml, ሎጥ VHN00001) ከ Novozymes (ፍራንክሊንተን, ኤንሲ, ዩኤስኤ) ድብልቅ ድብልቅ ነው.Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL)፣ የፔክቲን አበላሽ ኢንዛይሞች ድብልቅ፣ በዱፖንት ኢንደስትሪያል ባዮሳይንስ (ፓሎ አልቶ፣ ሲኤ፣ ዩኤስኤ) ተሰጥቷል።የኢንዛይም ፕሮቲን መጠን የሚወሰነው የፕሮቲን ይዘትን በመገመት (እና የፕሮቲን ያልሆኑ ናይትሮጅንን አስተዋፅኦ በመቀነስ) የኬጄልዳህል ናይትሮጅን ትንተና (AOAC method 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) በመጠቀም ነው.Diatomaceous earth 545 የተገዛው ከኤምዲ ሚሊፖሬ (ቢሊሪካ፣ ኤምኤ) ነው።ገቢር ካርቦን (DARCO, 100 mesh granules), አቪሴል (PH-101), beech xylan እና ሁሉም ሌሎች ኬሚካሎች የተገዙት ከሲግማ-አልድሪች (ሴንት ሉዊስ, MO) ነው.
የ AFEX ቅድመ-ህክምና በ GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) ተከናውኗል.ቅድመ-ህክምና በ 140 ° ሴ ለ 15 ደቂቃዎች ተከናውኗል.46 የመኖሪያ ጊዜ በ 1: 1 የአናይድድ አሞኒያ እና ባዮማስ ጥምርታ በ 60% (ወ/ወ) ከማይዝግ ብረት የተሰራ የቤንችቶፕ ባች ሬአክተር (ፓርር መሳሪያዎች ኩባንያ) በመጫን ላይ።30 ደቂቃ ፈጅቷል።ሬአክተሩ ወደ 140 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ቀረበ እና አሞኒያ በፍጥነት ተለቀቀ, ይህም ባዮማስ በፍጥነት ወደ ክፍል ሙቀት እንዲመለስ አስችሎታል.የ AFEX ቅድመ-የታከመ የበቆሎ ምድጃ (ኤሲኤስ) ጥንቅር ካልታከመ የበቆሎ ምድጃ (UT-CS) ጋር ተመሳሳይ ነው።
ከፍተኛ ጠጣር ACSH 25% (ወ/ወ) (በግምት 8% ዴክስትራን መጫን) ኦሊጎሳካርዳይድ ለትልቅ ደረጃ ለማምረት እንደ መነሻ ተዘጋጅቷል።የACS ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ የተደረገው Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (በቅድመ ባዮማስ)፣ Htec2 (Novozymes፣ Franklinton፣ NC)፣ 5 mg protein/g glucan እና Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA)ን ጨምሮ የንግድ ኢንዛይም ድብልቅን በመጠቀም ነው።).), 5 ሚ.ግ ፕሮቲን / g dextran.ኢንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ በ 5-ሊትር ባዮሬክተር ውስጥ በ 3 ሊትር, ፒኤች 4.8, 50 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና 250 ራም / ደቂቃ የስራ መጠን ተካሂዷል.ለ 96 ሰአታት ከሃይድሮላይዜስ በኋላ, ሃይድሮላይዜድ በ 6000 ሩብ ደቂቃ ለ 30 ደቂቃዎች እና ከዚያም በ 14000 ሬፐር / ደቂቃ በ 30 ደቂቃዎች ውስጥ በሴንትሪፍግሽን አማካኝነት ያልተጣራ ቆሻሻዎችን ያስወግዳል.ከዚያም ሃይድሮላይዜቱ በ 0.22 ሚሊ ሜትር የማጣሪያ ማንቆርቆሪያ አማካኝነት በንጽሕና ማጣሪያ ውስጥ ተሠርቷል.የተጣራው ሃይድሮላይዜት በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ በማይጸዳ ጠርሙሶች ውስጥ ተከማችቷል ከዚያም በካርቦን ላይ ተከፋፍሏል.
በ NREL የላቦራቶሪ ትንታኔ ሂደቶች መሠረት የማውጣት-ተኮር ባዮማስ ናሙናዎችን ስብጥር ትንተና-ለአቀናብር ትንተና ናሙናዎች ዝግጅት (NREL / TP-510-42620) እና መዋቅራዊ ካርቦሃይድሬትስ እና lignin በባዮማስ (NREL / TP-510 - 42618) 47 ።
የሃይድሮላይዜት ዥረት ኦሊጎሳክካርዴድ ትንተና በ 2 ሚሊ ሜትር ሚዛን በአውቶክላቭ ላይ የተመሰረተ አሲድ ሃይድሮሊሲስ ዘዴን በመጠቀም ተካሂዷል.የሃይድሮላይዜት ናሙናውን ከ69.7 µl ከ72% ሰልፈሪክ አሲድ ጋር በ10 ሚሊር ስክራፕ ካፕ የባህል ቱቦ ውስጥ በመቀላቀል ለ1 ሰአታት በቤንችቶፕ ላይ በ121 ድግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ አፍስሱ ፣ በበረዶ ላይ ያቀዘቅዙ እና ከፍተኛ አፈፃፀም ባለው ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ (HPLC) ጠርሙስ ውስጥ ያጣሩ።የ oligosaccharides ትኩረት የሚወሰነው በአሲድ-ሃይድሮላይዝድ ናሙና ውስጥ ካለው አጠቃላይ የስኳር መጠን ውስጥ የ monosaccharides ክምችት በሃይድሮሊክ ባልሆነ ናሙና ውስጥ በመቀነስ ነው።
በአሲድ ሃይድሮላይዝድ ባዮማስ ውስጥ ያሉት የግሉኮስ፣ xylose እና የአራቢኖዝ ውህዶች በባዮ ራድ አሚኔክስ HPX-87H አምድ ላይ አውቶማሳመር፣ አምድ ማሞቂያ፣ አይዞክራቲክ ፓምፕ እና የማጣቀሻ ኢንዴክስ የተገጠመ የ Shimadzu HPLC ስርዓት በመጠቀም ተንትነዋል።ዓምዱ በ 50 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ተጠብቆ በ 0.6 ml / ደቂቃ 5 mM H2SO4 በውሃ ውስጥ ተጣብቋል.ፍሰት.
የሃይድሮላይዜት ሱፐርኔታንት ለሞኖሜር እና ኦሊጎሳካርራይድ ይዘት ተዳሷል እና ተተነተነ።ከኤንዛይማቲክ ሃይድሮሊሲስ በኋላ የተገኙት ሞኖሜሪክ ስኳር በ HPLC በባዮ-ራድ (ሄርኩለስ, ሲኤ) አሚኔክስ HPX-87P አምድ እና አመድ ጠባቂ አምድ ተዘጋጅቷል.የአምዱ ሙቀት በ 80 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ተጠብቆ ቆይቷል, ውሃ እንደ ተንቀሳቃሽ ደረጃ በ 0.6 ml / ደቂቃ ፍሰት መጠን ጥቅም ላይ ይውላል.በማጣቀሻዎች ውስጥ በተገለጹት ዘዴዎች በ 121 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ በዲልቲክ አሲድ ውስጥ በሃይድሮሊሲስ ኦሊጎሳካካርዴስ ተወስኗል.41፣ 48፣ 49።
ቀደም ሲል የተገለጹትን ሂደቶች 27, 43, 50, 51 በመጠቀም የሳክራራይድ ትንተና በጥሬው, በ AFEX ቅድመ-የታከሙ እና ሁሉም ሃይድሮሊዝድ ባልሆኑ ባዮማስ ቅሪቶች (የሴሪያል ሴል ሴል ሴል ስክሪን ማምረት እና የእነሱ mAB ማጣሪያን ጨምሮ) ተካሂደዋል.ለ glycome ትንተና የአልኮሆል-የማይሟሟ የእጽዋት ሴል ግድግዳ ቅሪቶች ከባዮማስ ቅሪቶች ተዘጋጅተዋል እና ከጊዜ ወደ ጊዜ እየጨመረ ከሚሄድ ኃይለኛ ሬጀንቶች ለምሳሌ ammonium oxalate (50 mM), ሶዲየም ካርቦኔት (50 ሚሜ እና 0.5% ወ / ቪ), CON.(1M እና 4M፣ ሁለቱም ከ1% w/v sodium borohydride ጋር) እና አሲድ ክሎራይት ቀደም ሲል እንደተገለፀው 52,53።ነጥቦቹ ወደ ሴል ግድግዳ ግላይካን በተዘጋጀው ውስብስብ የ mAb50s ፓነል ላይ ለኤሊሳ ተዳርገዋል፣ እና mAB አስገዳጅ ምላሾች እንደ ሙቀት ካርታ ቀርበዋል።የእጽዋት ሕዋስ ግድግዳ ግላይካን ኢላማ ያደረጉ mAbs የተገዙት ከላቦራቶሪ አክሲዮኖች (CCRC፣ JIM እና MAC ተከታታይ) ነው።
የ oligosaccharides አንድ-ደረጃ ባዮቲንላይዜሽን.የካርቦሃይድሬትስ ከቢዮቲን-ኤልሲ-ሃይድሮዛይድ ጋር መቀላቀል የሚከናወነው በሚከተለው ቅደም ተከተል ነው.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) በዲቲሜትል ሰልፎክሳይድ (DMSO, 70 μl) ውስጥ በጠንካራ ማነሳሳት እና በ 65 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ በማሞቅ ለ 1 ደቂቃ.ግላሲያል አሴቲክ አሲድ (30 µl) ተጨምሮበት እና ውህዱ በሶዲየም ሳይያኖቦሮይድራይድ (6.4 mg/100 µmol) ላይ ፈሰሰ እና በ65° ሴ ሙቀት ውስጥ ለ1 ደቂቃ ያህል ሙሉ በሙሉ ሟሟል።ከዚያም ከ 5 እስከ 8 μl የምላሽ ድብልቅ በደረቁ ኦሊጎሳክካርዴድ (1-100 nmol) ላይ ተጨምሮ ከተቀነሰው ጫፍ ላይ 10 እጥፍ ወይም ከዚያ በላይ የሞላር ትርፍ ለማግኘት።ምላሹ በ 65 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 2 ሰዓታት ተካሂዷል, ከዚያ በኋላ ናሙናዎቹ ወዲያውኑ ይጸዳሉ.ምንም ዓይነት ሶዲየም ሳይያኖቦሮይዳይድ በመሰየሚያ ሙከራዎች ውስጥ ሳይቀንስ ጥቅም ላይ አልዋለም, እና ናሙናዎቹ በ 65 ° ሴ ለ 2.5 ሰዓታት ምላሽ ተሰጥተዋል.
የ ELISA ሽፋን እና የባዮቲኒላድ ኦሊጎሳካካርዴስ ናሙናዎችን ማጠብ.25 μl የባዮቲኒላድ ናሙናዎች (100 μl እያንዳንዱ የተከማቸ ናሙና በ 5 ml 0.1 M Tris buffer solution (ቲቢኤስ) ውስጥ ተጨምሯል) በአቪዲን የተሸፈነው ጠፍጣፋ በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ ተጨምሯል.የመቆጣጠሪያ ጉድጓዶች በ 0.1 M TBS ውስጥ በ 10 μg / ml በ 50 μl ባዮቲን ተሸፍነዋል.የተዳከመ ውሃ ከባዶ መለኪያዎች እንደ ሽፋን ጥቅም ላይ ውሏል.ጡባዊው በጨለማ ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 2 ሰዓታት ያህል ተተክሏል.በፕሮግራም ቁጥር 0.1M TBS ውስጥ 0.1% የተቀዳ ወተት ሳህኑን 3 ጊዜ ያጠቡ።11 ለግሬኒየር ጠፍጣፋ 3A።
የመጀመሪያ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት መጨመር እና ማጠብ.በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 40 μl ዋና ፀረ እንግዳ አካላት ይጨምሩ።በጨለማ ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 1 ሰዓት ማይክሮፕሌት ይንቁ.ከዚያም ሳህኖቹ ለግሬኒየር ፍላት 3A ማጠቢያ ፕሮግራም #11 በመጠቀም በ0.1% ወተት በ0.1M TBS 3 ጊዜ ይታጠባሉ።
ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላትን ይጨምሩ እና ይታጠቡ።በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 50 μl የመዳፊት/አይጥ ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት (የተቀለቀ 1:5000 በ0.1% ወተት በ0.1M TBS) ይጨምሩ።በጨለማ ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 1 ሰዓት ማይክሮፕሌት ይንቁ.ከዚያም ማይክሮፕሌቶቹ 5 ጊዜ በ0.1% ወተት በ0.1M TBS ውስጥ Grenier Flat 5A plate wash program #12 በመጠቀም ይታጠባሉ።
አንድ substrate በማከል.50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) በመሠረታዊ ንኡስ ክፍል ውስጥ ይጨምሩ (2 ጠብታዎች ቋት ፣ 3 ጠብታ የቲኤምቢ ጠብታዎች ፣ 2 ጠብታዎች ሃይድሮጂን ፓርሞክሳይድ ወደ 15 ሚሊ ሜትር የተቀላቀለ ውሃ)።የቲኤምቢ ንጣፍ ያዘጋጁ.እና አዙሪት ከመጠቀምዎ በፊት).ማይክሮፕሌትን በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 30 ደቂቃዎች ያፍሱ.ጨለማ ውስጥ.
ደረጃውን ይሙሉ እና ጡባዊውን ያንብቡ.በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 50 μl 1 N ሰልፈሪክ አሲድ ይጨምሩ እና የ ELISA አንባቢን በመጠቀም ከ 450 እስከ 655 nm መምጠጥ ይመዝግቡ።
የእነዚህ ትንታኔዎች 1 mg / ml መፍትሄዎችን በዲዮኒዝድ ውሃ ውስጥ ያዘጋጁ-አራቢኖዝ, ራሃምኖስ, ፊውኮስ, xylose, ጋላክቱሮኒክ አሲድ (GalA), ግሉኩሮኒክ አሲድ (GlcA), ማንኖስ, ግሉኮስ, ጋላክቶስ, ላክቶስ, ኤን-አሲቲልማኖሳሚን (ማን ኤንአክ), ኤን-አሲቲልግሉኮሳሚን.(glcNAc)፣ N-acetylgalactosamine (galNAc)፣ inositol (ውስጣዊ ደረጃ)።በሰንጠረዥ 1 ውስጥ የሚታየውን የ 1 mg / ml የስኳር መፍትሄዎችን በመጨመር ሁለት ደረጃዎች ተዘጋጅተዋል. ናሙናዎች በረዶ እና lyophilized በ -80 ° ሴ. ሁሉም ውሃ እስኪወገድ ድረስ (ብዙውን ጊዜ ከ12-18 ሰአታት).
በትንታኔ ሚዛን ላይ ቱቦዎችን ለመጠምዘዝ 100-500 μg ናሙና ይጨምሩ።የተጨመረውን መጠን ይመዝግቡ.ናሙናውን በተወሰነ የሟሟ ክምችት ውስጥ ማሟሟት እና ወደ ቱቦው እንደ ፈሳሽ አልኮሆል መጨመር ጥሩ ነው.ለእያንዳንዱ የናሙና ቱቦ 20 μl 1 mg/ml inositol እንደ ውስጣዊ መለኪያ ይጠቀሙ።በናሙና ውስጥ የተጨመረው የውስጣዊ ደረጃ መጠን በመደበኛ ቱቦ ውስጥ ከተጨመረው የውስጥ ደረጃ ጋር ተመሳሳይ መሆን አለበት.
8 ሚሊ ሜትር አናይድሬትስ ሜታኖል ወደ ስክሪፕት ኮፍያ ጠርሙዝ ይጨምሩ።ከዚያም 4 ml የ 3 N. ሜታኖሊክ HCl መፍትሄ, የተሸፈነ እና የተንቀጠቀጠ.ይህ ሂደት ውሃ አይጠቀምም.
500 μl የ 1 M HCl ሜታኖል መፍትሄ ወደ ኦሊጎሳካርራይድ ናሙናዎች እና መደበኛ የቲኤምኤስ ቱቦዎች ይጨምሩ።ናሙናዎች በአንድ ሌሊት (168 ሰአታት) በ 80 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ በሙቀት መከላከያ ውስጥ ተተክለዋል.የማድረቂያ ማከፋፈያ በመጠቀም የሜታኖሊሲስ ምርትን በክፍል ሙቀት ውስጥ ያድርቁት.200 µl MeOH ይጨምሩ እና እንደገና ያድርቁ።ይህ ሂደት ሁለት ጊዜ ይደገማል.ለናሙናው 200 μል ሜታኖል፣ 100 μል ፒሪዲን እና 100 μል አሴቲክ አንዳይድድ ይጨምሩ እና በደንብ ይቀላቅሉ።ናሙናዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 30 ደቂቃዎች ተወስደዋል.እና የደረቀ.200 ሚሊ ሜትር ሜታኖል ይጨምሩ እና እንደገና ያድርቁ።
200 µl ትሪ-ሲል ይጨምሩ እና የተዘጋውን ቱቦ ለ 20 ደቂቃዎች ያሞቁ።80 ° ሴ, ከዚያም ወደ ክፍል የሙቀት መጠን ይቀዘቅዛል.ናሙናውን ወደ 50 µl መጠን የበለጠ ለማድረቅ የማድረቂያ ማከፋፈያ ይጠቀሙ።ናሙናዎቹ ሙሉ በሙሉ እንዲደርቁ እንዳልፈቀድን ልብ ማለት ያስፈልጋል.
2 ሚሊ ሊትር ሄክሳን ይጨምሩ እና በማወዛወዝ በደንብ ይቀላቀሉ.የመስታወት ሱፍ ከ5-3/4 ኢንች ዲያሜትር ባለው የፓይፕ ጫፍ ላይ በማስገባት የፓስተር ፒፔትስ (5-8 ሚሜ) ጫፎችን ከመስታወት ሱፍ ጋር ይሙሉ።ናሙናዎች በ 3000 ግራም ለ 2 ደቂቃዎች በሴንትሪፉድ ተቀምጠዋል.ማንኛውም የማይሟሟ ቅሪቶች ተጭነዋል።ናሙናውን ወደ 100-150 µl ማድረቅ.በግምት 1 μl መጠን ወደ ጂሲ-ኤምኤስ በ 80 ዲግሪ ሴንቲግሬድ የመጀመሪያ የሙቀት መጠን እና በ 2.0 ደቂቃዎች የመጀመሪያ ጊዜ (ሠንጠረዥ 2) ውስጥ ገብቷል.