Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS-stuðning. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Nýjar ónæmisfræðilegar og massagreiningaraðferðir fyrir flókna greiningu á þrálátum oligosakkaríðum í maísstönglum sem hafa verið formeðhöndlaðir með AFEX. Lífmassi úr lignósellulósa er sjálfbær valkostur við jarðefnaeldsneyti og er mikið notaður til að þróa líftækni til framleiðslu á vörum eins og matvælum, fóðri, eldsneyti og efnum. Lykillinn að þessari tækni er þróun hagkvæmra ferla til að umbreyta flóknum kolvetnum sem eru til staðar í frumuveggjum plantna í einfaldar sykurtegundir eins og glúkósa, xýlósa og arabínósa. Þar sem lífmassi úr lignósellulósa er mjög þrjóskur verður að gangast undir hitaefnafræðilegar meðferðir (t.d. afhýðingu ammóníaktrefja (AFEX), þynntar sýrur (DA), jónískar vökvar (IL)) og líffræðilegar meðferðir (t.d. ensímhýdroxý og örverugerjun) í samsetningu til að fá fram þá vöru sem óskað er eftir. Hins vegar, þegar hefðbundin sveppaensím eru notuð í vatnsrofsferlinu, eru aðeins 75-85% af leysanlegum sykri sem myndast einsykrur og eftirstandandi 15-25% eru leysanlegar, óleysanlegar oligosakkaríð, sem eru ekki alltaf aðgengilegar örverum. Áður höfum við einangrað og hreinsað leysanleg þrjósk fásykrur með því að nota blöndu af kolefnis- og kísilgúrsaðskilnaði og stærðarútilokunarskiljun, og einnig rannsakað ensímhemjandi eiginleika þeirra. Við höfum komist að því að fásykrur sem innihalda metýleraðar úrónsýruskiptingar með hærri fjölliðunargráðu (DP) eru erfiðari í vinnslu með hefðbundnum ensímblöndum en fásykrur með lágu DP-innihaldi og hlutlausum fásykrum. Hér greinum við frá notkun nokkurra viðbótaraðferða, þar á meðal glýkanagreiningu með því að nota einstofna mótefni (mAb) sem eru sértæk fyrir glýkana úr lífmassa plantna til að einkenna glýkantengi í frumuveggjum plantna og ensímhýdrólýsi, leysigeislajónun með aðstoð leysigeisla og flugtímamassagreiningu. MALDI-TOF-MS notar uppbyggingarupplýsandi greiningartinda sem fengust með litrófsgreiningu eftir efri rotnun neikvæðra jóna, gasskiljun og massagreiningu (GC-MS) til að einkenna fásykrutengi með og án afleiðumyndunar. Vegna smæðar fásykranna (DP 4–20) eru þessar sameindir erfiðar í notkun til að bindast og einkenna fásykrur. Til að vinna bug á þessu vandamáli notuðum við nýja aðferð til að festa oligosakkaríð við hreyfanleika, byggða á bíótín-samtengingu, sem merkti með góðum árangri meirihluta leysanlegra oligosakkaríða með lágu DP-gildi á yfirborði örplötunnar, sem síðan voru notaðar í háafköstum mAb-kerfi fyrir sértæka límingagreiningu. Þessi nýja aðferð mun auðvelda þróun flóknari glýkómeðhöndlunarprófa með háum afköstum í framtíðinni sem hægt er að nota til að einangra og greina oligosakkaríð sem eru til staðar í lífmerkjum í greiningarskyni.
Lífmassi úr lignósellulósa, sem samanstendur af landbúnaði, skógrækt, grasi og viðarefnum, er hugsanlegt hráefni fyrir framleiðslu á lífrænum vörum, þar á meðal matvælum, fóðri, eldsneyti og efnaforverum til að framleiða verðmætari vörur1. Kolvetni (eins og sellulósi og hemísellulósi) sem eru til staðar í frumuveggjum plantna eru afpolymeruð í einsykrur með efnavinnslu og lífumbreytingu (eins og ensímhýdroxý og örverugerjun). Algengar forvinnslur eru meðal annars ammóníakþráðaþensla (AFEX), þynnt sýra (DA), jónískur vökvi (IL) og gufusprenging (SE), sem nota blöndu af efnum og hita til að draga úr framleiðslu lignósellulósa með því að opna frumuveggi plantna3,4. þrjóskleiki efnisins, 5. Ensímhýdroxý er framkvæmt við mikið fast efnismagn með því að nota viðskiptaleg virka kolvetnainnihaldandi ensím (CAZymes) og örverugerjun með því að nota erfðabreyttar ger eða bakteríur til að framleiða lífrænt eldsneyti og efni6.
Kólesteról-ensím í viðskiptaensímum eru samsett úr flókinni blöndu ensíma sem kljúfa samverkandi flókin kolvetnis-sykurtengi til að mynda einsykrur2,7. Eins og við greindum frá áður, gerir flókna net arómatískra fjölliða ligníns með kolvetnum þau mjög erfið að meðhöndla, sem leiðir til ófullkominnar sykurumbreytingar og safnast fyrir 15-25% af kyn-ólígósykrum sem ekki eru framleidd við ensímhýdroxíu á formeðhöndluðum lífmassa. Þetta er algengt vandamál með ýmsum formeðhöndlunaraðferðum á lífmassa. Meðal ástæðna fyrir þessum flöskuhálsi eru ensímhömlun við vatnsrof, eða skortur eða lítið magn nauðsynlegra ensíma sem eru nauðsynleg til að brjóta sykurtengi í lífmassa plantna. Skilningur á samsetningu og byggingareiginleikum sykra, svo sem sykurtengjum í ólígósykrum, mun hjálpa okkur að bæta sykurumbreytingu við vatnsrof, sem gerir líftækniferli samkeppnishæfari við olíuafurðir.
Að ákvarða uppbyggingu kolvetna er krefjandi og krefst samsetningar aðferða eins og vökvaskiljunar (LC)11,12, kjarnasegulómunargreiningar (NMR)13, háræðarafdrætti (CE)14,15,16 og massagreiningar (MS)17. ,átján. MS aðferðir eins og flugtímamassagreining með leysigeislaafsorpi og jónun með því að nota fylliefni (MALDI-TOF-MS) eru fjölhæf aðferð til að bera kennsl á kolvetnabyggingar. Nýlega hefur árekstrarframkallað sundrunar-MS (CID) tandem MS natríumjónaaðleiða verið mikið notuð til að bera kennsl á fingraför sem samsvara festingarstöðum oligosakkaríða, anómera stillingum, röðum og greiningarstöðum 20, 21.
Glýkangreining er frábært tæki til að greina ítarlega kolvetnatengsl22. Þessi aðferð notar einstofna mótefni (mAbs) sem beinast að glýkani í frumuvegg plantna sem mælikvarða til að skilja flókin kolvetnatengsl. Meira en 250 mAbs eru fáanleg um allan heim, hönnuð gegn ýmsum línulegum og greinóttum oligosakkaríðum með því að nota ýmsar sykaríð24. Nokkur mAbs hafa verið mikið notuð til að lýsa uppbyggingu, samsetningu og breytingum á frumuvegg plantna, þar sem verulegur munur er eftir frumugerð, líffæri, aldri, þroskastigi og vaxtarumhverfi25,26. Nýlega hefur þessi aðferð verið notuð til að skilja blöðrustofna í plöntu- og dýrakerfum og hlutverk þeirra í flutningi glýkans eins og ákvarðað er af undirfrumumerkjum, þroskastigum eða umhverfisörvum, og til að ákvarða ensímvirkni. Meðal þeirra mismunandi byggingarefna glýkana og xýlana sem hafa fundist eru pektín (P), xýlan (X), mannan (M), xýloglúkanar (XylG), glúkanar með blönduðum tengjum (MLG), arabínoxýlan (ArbX), galaktómannan (GalG), glúkúrónsýru-arabínoxýlan (GArbX) og arabínó-galaktan (ArbG)29.
Þrátt fyrir allar þessar rannsóknir hafa aðeins fáar rannsóknir einbeitt sér að eðli uppsöfnunar fágsykra við vatnsrof með miklu föstu efni (HSL), þar á meðal losun fágsykra, breytingum á lengd fágsykrakeðjunnar við vatnsrof, ýmsum fjölliðum með lágt DP-innihald og dreifingu þeirra [30,31,32]. Þó að glýkangreining hafi reynst gagnlegt tæki til alhliða greiningar á uppbyggingu glýkans, er erfitt að meta vatnsleysanleg fágsykrur með lágt DP-innihald með mótefnaaðferðum. Minni fágsykrur með lágan mólþunga og mólþunga minni en 5-10 kDa bindast ekki ELISA-plötum [33, 34] og eru skolaðar burt áður en mótefnum er bætt við.
Hér sýnum við í fyrsta skipti fram á ELISA prófun á avídínhúðuðum plötum með því að nota einstofna mótefni, þar sem sameinað er eins-þreps bíótínýleringarferli fyrir leysanleg þráláttar fjölsykrur með glýkómgreiningu. Aðferð okkar við glýkómgreiningu var staðfest með MALDI-TOF-MS og GC-MS byggðri greiningu á viðbótar fjölsykrutengjum með því að nota trímetýlsilýl (TMS) afleiðumyndun á vatnsrofnum sykurblöndum. Þessa nýstárlegu aðferð er hægt að þróa sem háafköstaaðferð í framtíðinni og finna víðtækari notkun í lífeðlisfræðilegum rannsóknum35.
Breytingar á ensímum og mótefnum eftir þýðingar, svo sem glýkósýlering,36 hafa áhrif á líffræðilega virkni þeirra. Til dæmis gegna breytingar á glýkósýleringu sermispróteina mikilvægu hlutverki í bólgusjúkdómi í liðagigt og breytingar á glýkósýleringu eru notaðar sem greiningarmerki37. Í ritrýndum heimildum hefur verið greint frá því að ýmis glýkön komi auðveldlega fram í ýmsum sjúkdómum, þar á meðal langvinnum bólgusjúkdómum í meltingarvegi og lifur, veirusýkingum, krabbameini í eggjastokkum, brjóstum og blöðruhálskirtli38,39,40. Að skilja uppbyggingu glýkana með því að nota mótefnabundnar ELISA aðferðir með glýkönum mun veita aukið öryggi í sjúkdómsgreiningu án þess að nota flóknar MS aðferðir.
Fyrri rannsókn okkar sýndi að þrjósk oligosakkaríð voru óvatnsrofið eftir formeðferð og ensímhvatsrof (Mynd 1). Í áður birtri vinnu okkar þróuðum við aðferð til að útdráttar virkjuð kol í föstum fasa til að einangra oligosakkaríð úr AFEX-formeðhöndluðu maísstöngulhýdrólýsi (ACSH)8. Eftir upphaflega útdrátt og aðskilnað voru oligosakkaríðin frekar aðgreind með stærðarútilokunarskiljun (SEC) og safnað í röð eftir mólþyngd. Sykurmónómerar og oligosakkaríð sem losnuðu úr ýmsum formeðferðum voru greind með greiningu á sykursamsetningu. Þegar innihald sykurolíómera sem fengust með ýmsum formeðferðaraðferðum var borið saman er nærvera þrjóskra oligosakkaríða algengt vandamál við umbreytingu lífmassa í einsykrur og getur leitt til lækkunar á sykuruppskeru um að minnsta kosti 10-15% og jafnvel allt að 18%. Þessi aðferð er notuð til frekari stórfelldrar framleiðslu á oligosakkaríðum. ACH sem myndast og síðari brot þess með mismunandi mólþyngdum voru notuð sem tilraunaefni til að greina oligosakkaríð í þessari vinnu.
Eftir formeðferð og ensímhýdroxý, voru þrálátar oligosakkaríð óvatnsrofnar. Hér er (A) aðferð til að aðskilja oligosakkaríð þar sem oligosakkaríð eru einangruð úr AFEX-formeðhöndluðu maísstróki (ACSH) með því að nota pakkað lag af virku kolefni og kísilgúr; (B) Aðferð til aðskilnaðar oligosakkaríða. Oligosakkaríðin voru frekar aðskilin með stærðarútilokunarskiljun (SEC); (C) Sykurmónómerar og oligómerar sem losnuðu úr ýmsum formeðferðum (þynnt sýra: DA, jónískur vökvi: IL og AFEX). Ensímhýdroxýskilyrði: mikið fast efnismagn upp á 25% (w/w) (u.þ.b. 8% glúkanmagn), 96 klukkustunda vatnsrof, 20 mg/g viðskiptaensímhleðsla (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 hlutfall) og (D) Sykurmónómerar og oligómerar af glúkósa, xýlósa og arabínósa sem losnuðu úr AFEX-formeðhöndluðu maísstróki (ACS).
Glýkangreining hefur reynst gagnlegt tæki til alhliða byggingargreiningar á glýkönum í útdrætti sem einangraðir eru úr föstum lífmassaleifum. Hins vegar eru vatnsleysanlegar sykurtegundir vanmetnar með þessari hefðbundnu aðferð41 þar sem erfitt er að festa lágsameindasykrur á ELISA-plötum og þær skolast út áður en mótefnum er bætt við. Þess vegna var, fyrir mótefnabindingu og einkenningu, notuð eins-þreps bíótínýleringaraðferð til að húða leysanlegar, ósamhæfðar olígósykrur á avídín-húðaðar ELISA-plötur. Þessi aðferð var prófuð með því að nota áður framleidda ACSH og brot byggt á mólþyngd þess (eða fjölliðunarstigi, DP). Eins-þreps bíótínýlering var notuð til að auka bindingarhæfni olígósykra með því að bæta bíótín-LC-hýdrasíði við afoxunarenda kolvetnsins (Mynd 2). Í lausn hvarfast hemíasetalhópurinn við afoxunarenda við hýdrasíðhóp bíótín-LC-hýdrasíðs til að mynda hýdrasóntengi. Í viðurvist afoxunarefnisins NaCNBH3 er hýdrasóntengið afoxað í stöðuga bíótínýleraða lokaafurð. Með breytingu á sykurafoxandi endanum varð möguleg binding ólígósakkaríða með lágu DP við ELISA plötur, og í okkar rannsókn var þetta gert á avíðínhúðuðum plötum með því að nota glýkan-miðaðar mAbs.
Skimun á einstofna mótefnum byggð á ELISA fyrir bíótínýleruð oligosakkaríð. Hér (A) er bíótínýlering oligosakkaríða og síðari ELISA skimun með glýkan-miðuðum mAbs á NeutrAvidin húðuðum plötum sameinuð og (B) er sýnt eins-þreps aðferð fyrir bíótínýleringu hvarfafurða.
Avídínhúðaðar plötur með ólígósakkaríð-tengdum mótefnum voru síðan bætt við aðal- og aukamótefni og þvegnar í ljós- og tímanæmum miðli. Eftir að mótefnabindingu var lokið var TMB hvarfefni bætt við til að rækta plötuna. Viðbrögðunum var að lokum hætt með brennisteinssýru. Ræktuðu plöturnar voru greindar með ELISA lesara til að ákvarða bindingarstyrk hvers mótefnis til að greina mótefnasértæka þvertengingu. Nánari upplýsingar og breytur tilraunarinnar er að finna í samsvarandi kafla „Efni og aðferðir“.
Við sýnum fram á notagildi þessarar nýþróuðu aðferðar fyrir tilteknar notkunarmöguleika með því að greina leysanlegar oligosakkaríð sem eru til staðar í ACSH sem og í hráum og hreinsuðum oligosakkaríðbrotum einangruðum úr lignósellulósa vatnsrofsefnum. Eins og sést á mynd 3 eru algengustu epitóp-skiptu xýlanin sem greind eru í ACSH með lífasýleruðum glýkómprófunaraðferðum venjulega úrónsýru (U) eða metýlúrónsýru (MeU) og pektín arabínógalaktan. Flest þeirra fundust einnig í fyrri rannsókn okkar á greiningu á glýkönum úr óvatnsrofnum föstum efnum (UHS)43.
Greining á þrjóskum oligosakkaríðþáttum með því að nota einstofna mótefni sem beinist að glýkani í frumuvegg. „Hlutlausa“ hlutinn er ACN hlutinn og „súra“ hlutinn er FA hlutinn. Bjartari rauðir litir á hitakortinu gefa til kynna hærra þáttainnihald og bjartari bláir litir gefa til kynna auðan bakgrunn. Litagildi á kvarðanum eru byggð á hráum OD gildum fyrir formúlur N=2. Helstu þáttirnir sem mótefnin þekkja eru sýndir til hægri.
Þessar ósellulósabyggingar gátu ekki verið kljúfar af algengustu sellulósa- og hemísellulósa-þáttunum í prófuðu ensímblöndunni, sem inniheldur algengustu ensímin sem notuð eru í verslunum. Því þarf ný hjálparensím til vatnsrofs þeirra. Án nauðsynlegra hjálparensíma sem ekki eru sellulósi koma þessi ósellulósa-tengi í veg fyrir fullkomna umbreytingu í einsykrur, jafnvel þótt upprunalegu sykurfjölliðurnar þeirra séu að miklu leyti vatnsrofnar í styttri brot og leystar upp með ensímblöndum sem notaðar eru í verslunum.
Frekari rannsóknir á merkjadreifingu og bindingarstyrk þess sýndu að bindingarepitópar voru lægri í sykurhlutum með hátt DP (A, B, C, DP allt að 20+) en í hlutum með lágt DP (D, E, F, DP) í tvíliðum (Mynd 1). Sýrubrot eru algengari í epitópum sem ekki eru sellulósi en í hlutlausum brotum. Þessi fyrirbæri eru í samræmi við mynstrið sem sást í fyrri rannsókn okkar, þar sem einingar með hátt DP og sýru voru ónæmari fyrir ensímhýdroxý. Þess vegna getur nærvera epitópa sem ekki eru sellulósi og U og MeU skiptingar stuðlað verulega að stöðugleika oligosakkaríða. Það skal tekið fram að bindingar- og greiningarhagkvæmni getur verið vandasamur fyrir oligosakkaríð með lágt DP, sérstaklega ef epitópurinn er tvíliða eða þríliða oligosakkaríð. Þetta er hægt að prófa með því að nota hefðbundnar oligosakkaríð af mismunandi lengd, þar sem hvert inniheldur aðeins eitt epitóp sem binst tilteknu mAb.
Þannig leiddi notkun á byggingarsértækum mótefnum í ljós ákveðnar gerðir af þrjóskum tengjum. Eftir því hvaða tegund mótefnis er notað, viðeigandi bindingarmynstur og styrk merkisins sem það framleiðir (mest og sjaldgæft), er hægt að bera kennsl á ný ensím og bæta þeim hálf-magnbundið við ensímblönduna til að ná betri glýkóumbreytingu. Með því að taka greiningu á ACSH oligosakkaríðum sem dæmi getum við búið til gagnagrunn yfir glýkantengi fyrir hvert lífmassaefni. Það skal tekið fram hér að taka ætti tillit til mismunandi sækni mótefna og ef sækni þeirra er óþekkt mun það skapa ákveðna erfiðleika við samanburð á merkjum mismunandi mótefna. Að auki gæti samanburður á glýkantengjum virkað best milli sýna fyrir sama mótefnið. Þessi þrjósku tengsl er síðan hægt að tengja við CAZyme gagnagrunninn, þar sem við getum borið kennsl á ensím, valið hugsanleg ensím og prófað fyrir ensím sem brjóta niður tengsl, eða þróað örverukerfi til að tjá þessi ensím til notkunar í lífhreinsunarstöðvum44.
Til að meta hvernig ónæmisfræðilegar aðferðir bæta upp aðrar aðferðir til að greina lágsameindaþyngd ólígósykrur í lignósellulósa vatnsrofsefnum, framkvæmdum við MALDI (mynd 4, S1-S8) og greiningu á TMS-afleiddum sykrum byggða á GC-MS á sama spjaldi (mynd 5) ólígósykruhluta. MALDI er notað til að bera saman hvort massadreifing ólígósykrusameinda samræmist fyrirhugaðri uppbyggingu. Á mynd 4 sést MC hlutlausu efnisþáttanna ACN-A og ACN-B. ACN-A greining staðfesti úrval af pentósusykrum á bilinu DP 4–8 (mynd 4) til DP 22 (mynd S1), þar sem þyngd þeirra samsvarar MeU-xýlan ólígósykrum. ACN-B greining staðfesti pentósa og glúkóxýlan seríuna með DP 8-15. Í viðbótarefni eins og mynd S3 sýna dreifingarkort af FA-C sýruhluta fjölda (Me)U-skiptra pentósusykra með DP upp á 8-15 sem eru í samræmi við skiptu xýlan sem finnast í ELISA-byggðri mAb skimun. Mótefnavakarnir eru í samræmi.
MALDI-MS litróf leysanlegra, ósamhæfðra oligosakkaríða sem finnast í ACS. Hér eru (A) ACN-A lágþyngdarbrot sem innihalda metýleraða úrónsýru (DP 4-8) skipt út með glúkúroxýlan oligosakkaríðum og (B) ACN-B xýlan og metýleraðar úrónsýru oligosakkaríð skipt út með glúkúroxýlani (DP 8-15).
Greining á samsetningu glýkanleifa úr þráláttum fágsykrum. Hér er (A) TMS fágsykrusamsetning ýmissa fágsykrubrota sem fengust með GC-MS greiningu. (B) Byggingar ýmissa TMS-afleiddra sykra sem eru til staðar í fágsykrum. ACN – asetónítrílbrot sem inniheldur hlutlaus fágsykrur og FA – ferúlsýrubrot sem inniheldur sýrufrágsykrur.
Önnur áhugaverð niðurstaða var dregin af LC-MS greiningu á oligosakkaríhlutanum, eins og sýnt er á mynd S9 (aðferðir má sjá í rafrænu viðbótarefni). Brot af hexósa og -OAc hópum sáust ítrekað við límingu ACN-B hlutans. Þessi niðurstaða staðfestir ekki aðeins sundrunina sem sást í glýkóm- og MALDI-TOF greiningunni, heldur veitir einnig nýjar upplýsingar um mögulegar kolvetnisafleiður í formeðhöndluðum lignósellulósa lífmassa.
Við greindum einnig sykursamsetningu oligosakkaríðahlutans með TMS sykurafleiðugreiningu. Með því að nota GC-MS ákvörðuðum við samsetningu taugasykra (ekki afleiddra) og súrra sykra (GluA og GalA) í oligosakkaríðahlutanum (Mynd 5). Glúkúrónsýra finnst í súru þáttunum C og D, en galaktúrónsýra finnst í súru þáttunum A og B, sem báðir eru þættir með hátt DP gildi í súrum sykri. Þessar niðurstöður staðfesta ekki aðeins ELISA og MALDI gögn okkar, heldur eru þær einnig í samræmi við fyrri rannsóknir okkar á uppsöfnun oligosakkaríða. Þess vegna teljum við að nútíma ónæmisfræðilegar aðferðir sem nota bíótínýleringu oligosakkaríða og síðari ELISA skimun séu nægjanlegar til að greina leysanlegar þrjóskar oligosakkaríð í ýmsum líffræðilegum sýnum.
Þar sem ELISA-byggðar mAb skimunaraðferðir hafa verið staðfestar með nokkrum mismunandi aðferðum, vildum við kanna frekar möguleika þessarar nýju megindlegu aðferðar. Tvær viðskiptalegar oligosakkaríð, xýlohexasakkaríð oligosakkaríð (XHE) og 23-α-L-arabínófúranósýl-xýlótríósi (A2XX), voru keyptar og prófaðar með nýrri mAb aðferð sem beinist að frumuveggsglýkani. Mynd 6 sýnir línulega fylgni milli bíótínýleraðs bindingarmerkis og log styrk oligosakkaríðstyrks, sem bendir til mögulegs Langmuir aðsogslíkans. Meðal mAbs tengdust CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 og CCRC-M151 XHE, og CCRC-M108, CCRC-M109 og LM11 A2XX á bilinu 1 nm til 100 nanó. Vegna takmarkaðs framboðs á mótefnum meðan á tilrauninni stóð voru takmarkaðar tilraunir framkvæmdar með hverjum oligosakkaríðstyrk. Það skal tekið fram hér að sum mótefni bregðast mjög mismunandi við sama oligosakkaríði sem hvarfefni, líklega vegna þess að þau bindast örlítið mismunandi mótefnavaka og geta haft mjög mismunandi bindingarhæfni. Aðferðirnar og afleiðingarnar af nákvæmri mótefnaauðkenningu verða mun flóknari þegar nýja mAb aðferðin verður notuð á raunveruleg sýni.
Tvær hefðbundnar fágsykrur voru notaðar til að ákvarða greiningarsvið ýmissa glýkan-miðaðra mAbs. Hér benda línulegar fylgni við log styrk fágsykruþéttni til Langmuir aðsogsmynstra fyrir (A) XHE með mAb og (B) A2XX með mAb. Samsvarandi mótefnavakar gefa til kynna uppbyggingu hefðbundinna fágsykranna sem notaðir voru sem hvarfefni í prófuninni.
Notkun glýkan-miðaðra einstofna mótefna (glýkósamísk greining eða ELISA-byggð mAb skimun) er öflugt tæki til ítarlegrar greiningar á flestum helstu frumuveggsglýkönum sem mynda lífmassa plantna. Hins vegar einkennir hefðbundin glýkangreining aðeins stærri frumuveggsglýkön, þar sem flest fágsykrur eru ekki skilvirkt festar á ELISA plötum. Í þessari rannsókn var AFEX-formeðhöndluð maísstöngull ensímvatnsrofinn við hátt fast efnisinnihald. Sykurgreining var notuð til að ákvarða samsetningu þrjóskra frumuveggskolvetna í vatnsrofsefninu. Hins vegar er mAb greining á minni fágsykrum í vatnsrofsefnum vanmetin og þörf er á viðbótartólum til að festa fágsykrur á skilvirkan hátt á ELISA plötum.
Við greinum hér frá nýrri og skilvirkri aðferð til að festa ólígósakkaríð í hreyfingu fyrir mAb skimun með því að sameina bíótínýleringu ólígósakkaríða og síðan ELISA skimun á NeutrAvidin™ húðuðum plötum. Ófestu bíótínýleruðu ólígósakkaríðin sýndu nægilega sækni í mótefnið til að gera kleift að greina þrjósk ólígósakkaríð hratt og skilvirkt. Greining á samsetningu þessara þrjósku ólígósakkaríða byggð á massagreiningu staðfesti niðurstöður þessarar nýju aðferðar við ónæmisskimun. Þannig sýna þessar rannsóknir að samsetning bíótínýleringar ólígósakkaríða og ELISA skimunar með glýkan-miðuðum einstofna mótefnum er hægt að nota til að greina þvertengingar í ólígósakkaríðum og er hægt að beita henni víða í öðrum lífefnafræðilegum rannsóknum sem einkenna uppbyggingu ólígósakkaríða.
Þessi aðferð til að greina glýkana, sem byggir á bíótíni, er fyrsta skýrslan sem getur rannsakað þrjósk kolvetnistengi leysanlegra oligosakkaríða í lífmassa plantna. Þetta hjálpar til við að skilja hvers vegna sumir hlutar lífmassa eru svo þrjóskir þegar kemur að framleiðslu á lífeldsneyti. Þessi aðferð fyllir mikilvægt skarð í glýkógengreiningaraðferðum og víkkar notkun hennar út fyrir fjölbreyttari hvarfefni en plöntuolígasakkaríða. Í framtíðinni gætum við notað vélmenni til bíótínýleringar og notað aðferðina sem við höfum þróað fyrir háafköstsgreiningu sýna með ELISA.
Maísstrá (CS) ræktað úr Pioneer 33A14 blendingsfræjum var uppskorið árið 2010 frá Kramer Farms í Ray, Colorado. Með leyfi landeiganda má nota þennan lífmassa til rannsókna. Sýnin voru geymd þurr með < 6% rakastigi í renniláspokum við stofuhita. Sýnin voru geymd þurr með < 6% rakastigi í renniláspokum við stofuhita. Bæta við kerfi fyrir heimilistæki < 6% á kostnaði með kerfisbundnum tölvubúnaði. Sýni voru geymd þurr við <6% rakastig í renniláspokum við stofuhita.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Breytingar á raforku með neyðartilvikum eru < 6%. Sýni eru geymd í renniláspokum við stofuhita og rakastig < 6%.Rannsóknin var í samræmi við staðbundnar og landsbundnar leiðbeiningar. Samsetningargreining var framkvæmd samkvæmt NREL samskiptareglunni. Samsetningin reyndist innihalda 31,4% glúkan, 18,7% xýlan, 3,3% arabínan, 1,2% galaktan, 2,2% asetýl, 14,3% lignín, 1,7% prótein og 13,4% ösku.
Cellic® CTec2 (138 mg prótein/ml, lotunúmer VCNI 0001) er flókin blanda af sellulósa, β-glúkósídasa og Cellic® HTec2 (157 mg prótein/ml, lotunúmer VHN00001) frá Novozymes (Franklinton, Norður-Karólínu, Bandaríkjunum)). Multifect Pectinase® (72 mg prótein/ml), flókin blanda af pektínbrjótandi ensímum, var gefin af DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, Kaliforníu, Bandaríkjunum). Próteinþéttni ensíma var ákvörðuð með því að áætla próteininnihald (og draga frá framlag köfnunarefnis sem ekki er prótein) með því að nota Kjeldahl köfnunarefnisgreiningu (AOAC aðferð 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, New York, Bandaríkin). Kísilgúr 545 var keyptur frá EMD Millipore (Billerica, Massachusetts). Virkjað kolefni (DARCO, 100 möskva korn), Avicel (PH-101), xýlan úr beyki og öll önnur efni voru keypt frá Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri).
Forvinnsla á AFEX var framkvæmd hjá GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, Bandaríkjunum). Forvinnslan fór fram við 140°C í 15 mínútur. Dvalartími var 46 mínútur við 1:1 hlutfall vatnsfrís ammóníaks og lífmassa við 60% (w/w) hleðslu í borðhitaviðbragðshvarfefni úr ryðfríu stáli (Parr Instruments Company). Það tók 30 mínútur. Hvarfefnið var hitað í 140°C og ammóníakið losnaði hratt, sem gerði lífmassanum kleift að ná fljótt stofuhita. Samsetning AFEX formeðhöndlaðs maísstrovs (ACS) var svipuð og ómeðhöndlaðs maísstrovs (UT-CS).
ACSH 25% (w/w) með háu föstu efni (u.þ.b. 8% dextranmagn) var útbúið sem upphafsefni fyrir stórfellda framleiðslu á oligosakkaríðum. Ensímvatnsrof á ACS var framkvæmd með því að nota hefðbundna ensímblöndu sem innihélt Cellic® Ctec2 10 mg prótein/g glúkan (í formeðhöndluðum lífmassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg prótein/g glúkan og Multifect Pectinase (Genencor Inc, Bandaríkin). ), 5 mg prótein/g dextran. Ensímvatnsrof var framkvæmd í 5 lítra lífhvarfefni með 3 lítra vinnslurúmmáli, pH 4,8, 50°C og 250 snúninga á mínútu. Eftir vatnsrof í 96 klukkustundir var vatnsrofið safnað með skilvindu við 6000 snúninga á mínútu í 30 mínútur og síðan við 14000 snúninga á mínútu í 30 mínútur til að fjarlægja óvatnsrofið föst efni. Vatnsrofsefnið var síðan síað með dauðhreinsuðum vökva í gegnum 0,22 mm síuglas. Síaða vatnsrofsefnið var geymt í dauðhreinsuðum flöskum við 4°C og síðan aðskilið með kolefni.
Greining á samsetningu lífmassasýna úr útdrætti samkvæmt greiningaraðferðum NREL rannsóknarstofu: undirbúningur sýna fyrir samsetningargreiningu (NREL/TP-510-42620) og ákvörðun á byggingarlegum kolvetnum og ligníni í lífmassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Greining á fálígósakkaríðum á vatnsrofsstraumnum var framkvæmd á 2 ml kvarða með því að nota sýruvatnsrofsaðferð í sjálfsofnsíunartæki. Blandið vatnsrofssýninu saman við 69,7 µl af 72% brennisteinssýru í 10 ml ræktunarröri með skrúftappa og ræktið í 1 klst. á borð við 121°C, kælið á ís og síið í háafköstavökvaskiljunarglas (HPLC). Styrkur fálígósakkaríða var ákvarðaður með því að draga styrk einsykrur í óvatnsrofna sýninu frá heildarsykurstyrk í sýruvatnsrofna sýninu.
Glúkósa-, xýlósa- og arabínósaþéttni í sýruvatnsrofnu lífmassanum var greind með Shimadzu HPLC kerfi sem var útbúið með sjálfvirkum sýnatökutæki, dálkhitara, ísókratískri dælu og ljósbrotsstuðulsnema á Bio-Rad Aminex HPX-87H dálki. Súlan var haldið við 50°C og skoluð út með 0,6 ml/mín. 5 mM H2SO4 í vatni.
Ofanfljótandi vökvinn úr vatnsrofinu var þynntur og greindur fyrir einliða- og ólígósykruinnihald. Einliðasykur sem fengust eftir ensímhýdroxý var greindur með háþrýstingsvökvaskiljun (HPLC) útbúinn með Bio-Rad (Hercules, Kaliforníu) Aminex HPX-87P dálki og öskuvarnarsúlu. Hitastig dálksins var haldið við 80°C, vatn var notað sem hreyfanlegt fasa með rennslishraða 0,6 ml/mín. Ólígósykrur voru ákvarðaðar með vatnsrofi í þynntri sýru við 121°C samkvæmt aðferðunum sem lýst er í heimildum 41, 48, 49.
Sakkaríðgreining var framkvæmd á hráum, AFEX formeðhöndluðum og öllum óvatnsrofnum lífmassaleifum (þar með talið framleiðsla á raðútdrætti úr frumuvegg og skimun fyrir mAb þeirra) með því að nota áður lýstar aðferðir 27, 43, 50, 51. Fyrir glýkómegreiningu eru alkóhólóleysanlegar leifar af frumuveggsefni plantna útbúnar úr lífmassaleifum og látnar gangast undir raðútdrátt með sífellt öflugri hvarfefnum eins og ammóníumoxalati (50 mM), natríumkarbónati (50 mM og 0,5% w/v), CON. (1M og 4M, bæði með 1% w/v natríumbórhýdríði) og sýruklóríti eins og áður hefur verið lýst 52,53. Útdrættirnir voru síðan látnir gangast undir ELISA gegn flóknu paneli af mAb50 sem beinast að glýkani frumuveggsins og mAb bindingarviðbrögðin voru kynnt sem hitakort. mAbs sem miða á glýkan úr frumuvegg plantna voru keypt úr rannsóknarstofubirgðum (CCRC, JIM og MAC serían).
Einþrepa bíótínýlering á oligosakkaríðum. Samtenging kolvetna við bíótín-LC-hýdrazíð var framkvæmd með eftirfarandi aðferð. Bíótín-LC-hýdrazíð (4,6 mg/12 míkrómól) var leyst upp í dímetýlsúlfoxíði (DMSO, 70 míkrómól) með kröftugri hræringu og hita við 65°C í 1 mínútu. Ísediki (30 míkrómól) var bætt við og blöndunni hellt yfir natríumsýanóbórhýdríð (6,4 mg/100 míkrómól) og alveg leyst upp eftir hitun við 65°C í um það bil 1 mínútu. Síðan voru 5 til 8 míkrómól af hvarfblöndunni bætt við þurrkaða oligosakkaríðið (1-100 nmól) til að fá 10-falt eða meira mólar umfram merkimiðann umfram afoxunarendann. Hvarfið var framkvæmt við 65°C í 2 klst., eftir það voru sýnin strax hreinsuð. Ekkert natríumsýanóbóróhýdríð var notað í merkingartilraununum án afoxunar og sýnin voru látin hvarfast við 65°C í 2,5 klukkustundir.
ELISA húðun og þvottur sýna af bíótínýleruðum oligosakkaríðum. 25 μl af bíótínýleruðum sýnum (100 μl af hverju þykkni þynntu í 5 ml af 0,1 M Tris stuðpúðalausn (TBS)) voru bætt í hvern brunn á avídínhúðaðri plötunni. Viðmiðunarbrunnum var húðað með 50 μl af bíótíni í styrk 10 μg/ml í 0,1 M TBS. Afjónað vatn var notað sem húðun fyrir eyðublöðin. Taflan var ræktuð í 2 klukkustundir við stofuhita í myrkri. Þvoið plötuna 3 sinnum með 0,1% undanrennu í 0,1 M TBS með forriti nr. 11 fyrir Grenier flat 3A.
Viðbót og þvottur á frummótefnum. Bætið 40 µl af frummótefni í hvert brunn. Ræktið örplötuna í 1 klukkustund við stofuhita í myrkri. Plöturnar voru síðan þvegnar 3 sinnum með 0,1% mjólk í 0,1M TBS með þvottakerfi #11 fyrir Grenier Flat 3A.
Bætið við aukamótefni og þvoið. Bætið 50 µl af aukamótefni músa/rotta (þynnt 1:5000 í 0,1% mjólk í 0,1 M TBS) í hvert brunn. Ræktið örplötuna í 1 klukkustund við stofuhita í myrkri. Örplöturnar voru síðan þvegnar 5 sinnum með 0,1% mjólk í 0,1 M TBS með Grenier Flat 5A plötuþvottakerfi #12.
Bæta við undirlagi. Bætið 50 µl af 3,3′,5,5′-tetrametýlbensidíni (TMB) út í grunnundirlagið (með því að bæta 2 dropum af stuðpúða, 3 dropum af TMB, 2 dropum af vetnisperoxíði út í 15 ml af afjónuðu vatni). Undirbúið TMB undirlagið og hristið í vortex fyrir notkun). Ræktið örplötuna við stofuhita í 30 mínútur. Í myrkri.
Ljúktu skrefinu og lestu af töflunni. Bættu 50 µl af 1 N brennisteinssýru í hvert hol og skráðu gleypnina frá 450 til 655 nm með ELISA lestæki.
Útbúið 1 mg/ml lausnir af þessum greiningarefnum í afjónuðu vatni: arabínósa, ramnósa, fúkósa, xýlósa, galaktúrónsýru (GalA), glúkúrónsýru (GlcA), mannósa, glúkósa, galaktósa, laktósa, N-asetýlmannósamín (manNAc), N-asetýlglúkósamín (glcNAc), N-asetýlgalaktósamín (galNAc), inositól (innri staðall). Tveir staðlar voru útbúnir með því að bæta við 1 mg/ml sykurlausnum sem sýndar eru í töflu 1. Sýnin eru fryst og frostþurrkað við -80°C þar til allt vatn er fjarlægt (venjulega um 12-18 klukkustundir).
Bætið 100–500 µg af sýni út í skrúftappaglös á greiningarvog. Skráið magnið sem bætt er við. Best er að leysa sýnið upp í ákveðnum styrk leysiefnis og bæta því út í rörið sem fljótandi skammt. Notið 20 µl af 1 mg/ml inositoli sem innri staðal fyrir hvert sýnishornsrör. Magn innri staðals sem bætt er út í sýnið verður að vera það sama og magn innri staðals sem bætt er út í staðalrörið.
Bætið 8 ml af vatnsfríu metanóli út í hettuglas með skrúftappa. Síðan er bætt við 4 ml af 3 N metanól HCl lausn, lokið og hrist. Þetta ferli notar ekki vatn.
Bætið 500 µl af 1 M HCl metanóllausn út í oligosakkaríðsýnin og staðlaðar TMS rör. Sýnin voru ræktuð yfir nótt (168 klukkustundir) við 80°C í hitablokk. Þurrkið metanóllýsuafurðina við stofuhita með þurrkunarröri. Bætið 200 µl af MeOH út í og ​​þurrkið aftur. Þetta ferli er endurtekið tvisvar. Bætið 200 µl af metanóli, 100 µl af pýridíni og 100 µl af ediksýruanhýdríði út í sýnið og blandið vel saman. Sýnin voru ræktuð við stofuhita í 30 mínútur og þurrkuð. Bætið 200 µl af metanóli út í og ​​þurrkið aftur.
Bætið 200 µl af Tri-Sil út í og ​​hitið lok á rörinu í 20 mínútur. Hitið við 80°C og kælið síðan niður í stofuhita. Notið þurrkrör til að þurrka sýnið enn frekar niður í um það bil 50 µl rúmmál. Mikilvægt er að hafa í huga að við leyfðum sýnunum ekki að þorna alveg.
Bætið 2 ml af hexani út í og ​​blandið vel með vortex-blöndu. Fyllið oddana á Pasteur-pípettum (5-8 mm) með glerullarbút með því að stinga glerullinni ofan á pípettu sem er 5-3/4 tommu í þvermál. Sýnin voru skilvinduð við 3000 g í 2 mínútur. Allar óleysanlegar leifar falla út. Þurrkið sýnið í 100-150 µl. Um það bil 1 µl rúmmál var sprautað inn í GC-MS við upphafshita 80°C og upphafstíma 2,0 mínútur (Tafla 2).