Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við gera síðuna án stíla og JavaScript.
Nýjar ónæmisfræðilegar og massagreiningaraðferðir fyrir flókna greiningu á þrálátum fásykrum í maísofni formeðhöndluðum með AFEX.Lignocellulosic lífmassi er sjálfbær valkostur við jarðefnaeldsneyti og er mikið notaður til að þróa líftækni til framleiðslu á vörum eins og matvælum, fóðri, eldsneyti og kemískum efnum.Lykillinn að þessari tækni er þróun kostnaðarsamkeppnisferla til að breyta flóknum kolvetnum sem eru til staðar í plöntufrumuveggjum í einfaldar sykur eins og glúkósa, xýlósa og arabínósa.Vegna þess að lífmassi lignósellu er mjög þrjóskur, verður að gangast undir hitaefnafræðilega meðferð (td ammoníak trefjaflögnun (AFEX), þynntar sýrur (DA), jónískir vökvar (IL)) og líffræðilegar meðferðir (td ensímvatnsrof og gerjun örvera) til að fá þá vöru sem óskað er eftir..Hins vegar, þegar sveppaensím eru notuð í vatnsrofsferlinu, eru aðeins 75-85% af leysanlegu sykrunum sem myndast einsykrur, og hinir 15-25% eru leysanlegar, óleysanlegar fásykrur, sem eru ekki alltaf aðgengilegar örverum.Áður höfum við einangrað og hreinsað leysanlegar þrjóskar fásykrur með góðum árangri með því að nota blöndu af kolefnis- og kísilgúr aðskilnaði og stærðarútilokunarskiljun, og einnig rannsakað ensímhamlandi eiginleika þeirra.Við höfum komist að því að fásykrur sem innihalda meiri fjölliðunarstig (DP) metýleraðar úrónsýruskipti eru erfiðari í vinnslu með viðskiptalegum ensímblöndum en lágt DP og hlutlausar fásykrur.Hér greinum við frá notkun nokkurra viðbótaraðferða, þar á meðal glýkanprófíl með því að nota einstofna mótefni (mAbs) sem eru sértæk fyrir plöntulífmassaglýkana til að einkenna glýkantengi í plöntufrumuveggjum og ensímvatnsrofsvökva, fylkisaðstoðuð leysirafsogsjónun, massagreiningu á flugtíma..MALDI-TOF-MS) notar byggingarupplýsandi greiningartoppa sem fást með litrófsgreiningu eftir efri rotnun neikvæðra jóna, gasskiljun og massagreiningu (GC-MS) til að einkenna fásykrutengi með og án afleiðumyndunar.Vegna smæðar fásykra (DP 4-20) er erfitt að nota þessar sameindir til að binda og lýsa mAb.Til að vinna bug á þessu vandamáli beittum við nýrri bíótínsamtengingar-bundinni óhreyfingaraðferð á fásykrum sem merkti með góðum árangri meirihluta lág-DP leysanlegra fásykra á yfirborði örplötunnar, sem síðan var notað í mAb-kerfi með miklum afköstum fyrir sértæka bindingargreiningu.Þessi nýja aðferð mun auðvelda þróun háþróaðra glúkómmælinga með háum afköstum í framtíðinni sem hægt er að nota til að einangra og einkenna fásykrur sem eru til staðar í lífmerkjum til greiningar.
Lignocellulosic lífmassi, sem samanstendur af landbúnaði, skógrækt, grasi og viðarefnum, er hugsanlegt hráefni til framleiðslu á lífrænum vörum, þar með talið matvælum, fóðri, eldsneyti og efnaforefni til að framleiða verðmætari vörur1.Kolvetni (eins og sellulósa og hemicellulose) sem eru til staðar í plöntufrumuveggjum eru affjölliðuð í einsykrur með efnavinnslu og lífumbreytingum (svo sem ensímvatnsrof og gerjun örvera).Algengar formeðferðir fela í sér stækkun ammoníak trefja (AFEX), þynnt sýra (DA), jónísk vökvi (IL) og gufusprenging (SE), sem nota blöndu af efnum og hita til að draga úr framleiðslu lignósellulósa með því að opna frumuveggi plantna3,4.þrjóska efnis, 5. Ensímvatnsrof er framkvæmt við mikið magn af föstum efnum með því að nota virk kolvetna- sem innihalda ensím (CAZymes) og örverugerjun með því að nota erfðabreytt ger eða bakteríur til að framleiða lífrænt eldsneyti og efni 6 .
CAZym í verslunarensímum eru samsett úr flókinni blöndu af ensímum sem klofna með samverkandi hætti flókin kolvetni-sykurtengi til að mynda einsykrur2,7.Eins og við greint frá áðan, gerir hið flókna net arómatískra fjölliða ligníns með kolvetnum þær mjög óviðráðanlegar, sem leiðir til ófullkomins sykursbreytingar, sem safnar 15-25% af kynfásykrum sem ekki myndast við ensímvatnsrof formeðhöndlaðs lífmassans.Þetta er algengt vandamál með ýmsum formeðferðaraðferðum fyrir lífmassa.Sumar ástæður fyrir þessum flöskuhálsi eru hömlun á ensímum við vatnsrof eða skortur eða lítið magn nauðsynlegra ensíma sem þarf til að brjóta sykurtengi í lífmassa plantna.Skilningur á samsetningu og byggingareiginleikum sykurs, eins og sykurtengi í fásykrum, mun hjálpa okkur að bæta sykurbreytingu við vatnsrof, sem gerir líftækniferli kostnaðarsamkeppnishæft með olíuafurðum.
Að ákvarða uppbyggingu kolvetna er krefjandi og krefst blöndu af aðferðum eins og vökvaskiljun (LC)11,12, kjarnasegulómun (NMR)13, háræðarafnám (CE)14,15,16 og massagreiningu (MS)17., átján.MS aðferðir eins og massagreiningu á flugtíma með leysigeisli og jónun með því að nota fylki (MALDI-TOF-MS) eru fjölhæf aðferð til að bera kennsl á kolvetnabyggingar.Nýlega hefur Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS af natríumjónadúktum verið mest notaður til að bera kennsl á fingraför sem samsvara viðhengi fásykrunnar, anómerískum stillingum, röðum og greiningarstöðum 20, 21 .
Glýkangreining er frábært tæki til að greina ítarlega kolvetnatengi22.Þessi aðferð notar einstofna mótefni (mAbs) beint að plöntufrumuvegg glýkani sem rannsaka til að skilja flóknar kolvetnatengingar.Meira en 250 mAbs eru fáanleg um allan heim, hönnuð gegn ýmsum línulegum og greinóttum fásykrum með því að nota ýmsar sykrur24.Nokkrir mAbs hafa verið mikið notaðir til að einkenna uppbyggingu, samsetningu og breytingar á plöntufrumuveggnum, þar sem verulegur munur er eftir plöntufrumugerð, líffæri, aldri, þroskastigi og vaxtarumhverfi25,26.Nýlega hefur þessi aðferð verið notuð til að skilja blöðrustofna í plöntu- og dýrakerfum og hlutverk þeirra í glýkanflutningi eins og ákvarðað er af undirfrumumerkjum, þroskastigum eða umhverfisáreitum og til að ákvarða ensímvirkni.Sumir af mismunandi uppbyggingu glýkana og xýlana sem hafa verið auðkenndir eru pektín (P), xýlan (X), mannan (M), xýlóglúkanar (XylG), blandaða glúkana (MLG), arabínoxýlan (ArbX), galaktómannan (GalG), glúkúrónsýra-arabínoxýlan (GArbínoxýlan (GArbínóX) (Garbínóx) (GarbinoX) og 29
Hins vegar, þrátt fyrir alla þessa rannsóknarviðleitni, hafa aðeins nokkrar rannsóknir beinst að eðli oligosaccharide uppsöfnunar við vatnsrof með háu fastefnisálagi (HSL), þar á meðal losun fásykra, breytingar á fásykrunni við vatnsrofi, ýmsar lág-DP fjölliður og ferlar þeirra.úthlutun 30,31,32.Á meðan, þrátt fyrir að glýkangreining hafi reynst gagnlegt tæki til alhliða greiningar á glýkanbyggingu, er erfitt að meta vatnsleysanleg lág DP fásykrur með mótefnaaðferðum.Minni DP fásykrur með mólmassa undir 5-10 kDa bindast ekki ELISA plötum 33, 34 og skolast í burtu áður en mótefna er bætt við.
Hér, í fyrsta skipti, sýnum við ELISA próf á avidinhúðuðum plötum með einstofna mótefnum, sem sameinar eins þrepa líftínýlerunaraðferð fyrir leysanlegar eldfastar fásykrur með glýkómegreiningu.Nálgun okkar við glýkómegreiningu var staðfest með MALDI-TOF-MS og GC-MS byggðri greiningu á óligósakkaríðtengingum með því að nota trimethylsilyl (TMS) afleiðugerð á vatnsrofnar sykursamsetningar.Hægt er að þróa þessa nýstárlegu nálgun sem afkastamikil aðferð í framtíðinni og finna víðari notkun í líflæknisfræðilegum rannsóknum35.
Breytingar á ensímum og mótefnum eftir þýðingu, svo sem glýkósýleringu,36 hafa áhrif á líffræðilega virkni þeirra.Til dæmis gegna breytingar á glýkósýleringu sermispróteina mikilvægu hlutverki í bólguliðagigt og breytingar á glýkósýleringu eru notaðar sem greiningarmerki37.Greint hefur verið frá ýmsu glýkanum í bókmenntum sem koma auðveldlega fram í ýmsum sjúkdómum, þar á meðal langvinnum bólgusjúkdómum í meltingarvegi og lifur, veirusýkingum, krabbameini í eggjastokkum, brjóstum og blöðruhálskirtli38,39,40.Skilningur á uppbyggingu glýkana með því að nota glýkan ELISA aðferðir sem byggja á mótefnum mun veita aukið sjálfstraust við sjúkdómsgreiningu án þess að nota flóknar MS-aðferðir.
Fyrri rannsókn okkar sýndi að þrjóskar fásykrur héldust óvatnsrofnar eftir formeðferð og ensímvatnsrof (Mynd 1).Í áður útgefnum verkum okkar þróuðum við virkjaða kolfasa útdráttaraðferð til að einangra fásykrur úr AFEX-formeðhöndluðu maísstýrivatnsrofi (ACSH)8.Eftir upphafsútdrátt og aðskilnað voru fásykrurnar sundurliðaðar frekar með stærðarútskilnaði (SEC) og safnað í röð eftir mólþunga.Sykureinliða og fáliður sem losaðar voru við ýmsar formeðferðir voru greindar með greiningu á sykursamsetningu.Þegar borið er saman innihald sykursýkra sem fengnar eru með ýmsum formeðferðaraðferðum er tilvist þrjóskrar fásykra algengt vandamál við umbreytingu lífmassa í einsykrur og getur leitt til minnkunar á sykuruppskeru um að minnsta kosti 10-15% og jafnvel allt að 18%.BNA.Þessi aðferð er notuð til frekari stórfelldra framleiðslu á fásykruhlutum.ACH sem myndaðist og síðari hlutar þess með mismunandi mólmassa voru notaðir sem tilraunaefni til að lýsa fásykrum í þessari vinnu.
Eftir formeðferð og ensímvatnsrof voru þrávirkar fásykrur óvatnsrofnar.Hér er (A) aðferð við að aðskilja fásykrur þar sem fásykrur eru einangraðar úr AFEX-formeðhöndluðu maísofnarvatnsrofi (ACSH) með því að nota pakkað rúm af virku kolefni og kísilgúr;(B) Aðferð við aðskilnað fásykra.Fásykrurnar voru frekar aðskildar með stærðarútilokunarskiljun (SEC);(C) Sakkaríð einliða og fáliður losaðar frá ýmsum formeðferðum (þynnt sýra: DA, jónísk vökvi: IL og AFEX).Ensímvatnsrofsskilyrði: mikil hleðsla á föstu efni upp á 25% (w/w) (u.þ.b. 8% glúkanhleðsla), 96 klst vatnsrof, 20 mg/g hleðsla á ensímum í atvinnuskyni (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 hlutfall) og (D) Sykureinliður og fáliður glúkósa, forósaxýlós og AF kornsoxýlósi losað úr AF kornsoxýlósi.
Glýkangreining hefur reynst gagnlegt tæki til yfirgripsmikillar byggingargreiningar á glýkönum í útdrætti sem er einangrað úr föstum lífmassaleifum.Hins vegar eru vatnsleysanlegar sykrur vantákaðar með þessari hefðbundnu aðferð41 vegna þess að erfitt er að festa fásykrur með litlum mólþunga á ELISA plötum og þær eru skolaðar út áður en mótefna er bætt við.Þess vegna, til að binda og lýsa mótefni, var eins þrepa líftínýleringaraðferð notuð til að húða leysanlegar, ósamhæfðar fásykrur á avidin-húðaðar ELISA plötur.Þessi aðferð var prófuð með því að nota áður framleidd ACSH okkar og brot byggt á mólmassa þess (eða fjölliðunarstig, DP).Eins þrepa bíótínýlering var notuð til að auka bindisækni oligosaccharides með því að bæta bíótín-LC-hýdrazíði við afoxandi enda kolvetnsins (mynd 2).Í lausn hvarfast hemiacetal hópurinn í afoxandi endanum við hýdrazíðhópinn af bíótín-LC-hýdrazíði til að mynda hýdrazontengi.Í nærveru afoxunarefnisins NaCNBH3 er hýdrasóntengi minnkað í stöðuga bíótínýleraða lokaafurð.Með breytingu á sykurminnkandi endanum varð binding fásykra með lágt DP við ELISA plötur möguleg og í rannsókn okkar var þetta gert á avidinhúðuðum plötum með glýkanmiðuðum mAbs.
Skimun einstofna mótefna byggt á ELISA fyrir bíótínýleruðum fásykrum.Hér (A) sameinuð líftínýlering á fásykrum og síðari ELISA skimun með glýkanmiðuðum mAbs á NeutrAvidin húðuðum plötum og (B) sýnir eins skrefs aðferð við líftínýleringu hvarfefna.
Avidin-húðaðar plötur með fásykrum-tengdum mótefnum var síðan bætt við aðal- og aukamótefni og þvegin í ljós- og tímanæmum miðli.Eftir að mótefnabindingu er lokið skaltu bæta við TMB hvarfefni til að rækta plötuna.Hvarfið var að lokum stöðvað með brennisteinssýru.Ræktuðu plöturnar voru greindar með því að nota ELISA-lesara til að ákvarða bindistyrk hvers mótefnis til að greina mótefnasértæka krosstengingu.Fyrir upplýsingar og færibreytur tilraunarinnar, sjá samsvarandi kafla „Efni og aðferðir“.
Við sýnum fram á notagildi þessarar nýþróuðu aðferðar til sérstakra nota með því að einkenna leysanlegu fásykrurnar sem eru til staðar í ACSH sem og í hráum og hreinsuðum fásykrumhlutum sem eru einangraðir úr lignocellulosic hydrolysates.Eins og sýnt er á mynd 3 eru algengustu epitope-setnaðir xýlan sem eru auðkennd í ACSH með því að nota lífasýleruð glýkómet prófunaraðferðir venjulega úrón (U) eða metýlúrón (MeU) og pektín arabínógalaktan.Flestir þeirra fundust einnig í fyrri rannsókn okkar á greiningu á glýkönum á óvatnsrofnu föstu efni (UHS)43.
Greining á þröngsýnum fásykrum epitopum með því að nota einstofna mótefni sem beint er að frumuvegg glýkani."Hlutlausa" brotið er ACN brotið og "súrt" brotið er FA brotið.Bjartari rauðir á hitakortinu gefa til kynna hærra innihald myndefnis og bjartari blár gefur til kynna auðan bakgrunn.Litagildi á kvarðanum eru byggð á hráum OD-gildum fyrir samsetningar N=2.Helstu myndefnin sem mótefnin þekkja eru sýnd til hægri.
Þessar byggingar sem ekki eru sellulósa gátu ekki verið klofnar með algengustu frumu- og hemisellusum í prófuðu viðskiptaensímblöndunni, sem inniheldur algengustu viðskiptaensímin.Þess vegna þarf ný hjálparensím fyrir vatnsrof þeirra.Án nauðsynlegra aukaensíma sem ekki eru sellulósa koma þessi tengi sem ekki eru sellulósa í veg fyrir algjöra umbreytingu í einsykrur, jafnvel þótt móðursykurfjölliður þeirra séu mikið vatnsrofnar í styttri brot og leyst upp með því að nota ensímblöndur í verslunum.
Frekari rannsókn á merkjadreifingu og bindistyrk þess sýndi að bindingareitópur voru lægri í sykurhlutum með háum DP (A, B, C, DP allt að 20+) en í hlutum með lágum DP (D, E, F, DP) í dimerum) (Mynd 1).Sýrubrot eru algengari í frumum sem ekki eru sellulósa en hlutlaus brot.Þessi fyrirbæri eru í samræmi við mynstur sem sést í fyrri rannsókn okkar, þar sem há DP og sýruhlutir voru ónæmari fyrir ensímvatnsrofi.Þess vegna getur nærvera glýkaneitópa sem ekki eru sellulósa og U og MeU skiptingar stuðlað mjög að stöðugleika fásykranna.Það skal tekið fram að skilvirkni bindingar og greiningar getur verið erfið fyrir fásykrur með lágt DP, sérstaklega ef epitope er tví- eða þrímerísk fásykra.Þetta er hægt að prófa með því að nota fásykrur af mismunandi lengd, sem hver inniheldur aðeins eina epitope sem binst tilteknu mAb.
Þannig leiddi notkun byggingarsértækra mótefna í ljós ákveðnar gerðir af þrjóskandi tengjum.Það fer eftir tegund mótefna sem notað er, viðeigandi bindingarmynstur og styrk merkisins sem það framleiðir (mest og minnst mikið), hægt er að bera kennsl á ný ensím og bæta við hálf-magnfræðilegum hætti við ensímblönduna til að fá fullkomnari glýkóbreytingu.Með því að taka greiningu á ACSH fásykrum sem dæmi, getum við búið til gagnagrunn með glýkantengi fyrir hvert lífmassaefni.Hér skal tekið fram að taka skal tillit til mismunandi sækni mótefna og ef sækni þeirra er óþekkt mun það skapa ákveðna erfiðleika þegar borin eru saman merki mismunandi mótefna.Að auki getur samanburður á glýkantengjum virkað best á milli sýna fyrir sama mótefni.Þessi þrjóskutengi er síðan hægt að tengja við CAZyme gagnagrunninn, þaðan sem við getum greint ensím, valið frambjóðandi ensím og prófað fyrir bindabrjótandi ensím eða þróað örverukerfi til að tjá þessi ensím til notkunar í lífhreinsunarstöðvum44.
Til að meta hvernig ónæmisfræðilegar aðferðir eru viðbót við aðrar aðferðir til að einkenna fásykrur með lágan mólþunga sem eru til staðar í lignocellulosic hydrolysates, gerðum við MALDI (Mynd. 4, S1-S8) og greiningu á TMS-afleiddum sykrum byggt á GC-MS á sama spjaldi (Mynd. 5) fásykrur hluta.MALDI er notað til að bera saman hvort massadreifing fásykra sameinda passi við fyrirhugaða uppbyggingu.Á mynd.4 sýnir MC hlutlausu íhlutanna ACN-A og ACN-B.ACN-A greining staðfesti úrval af pentósasykrum á bilinu DP 4-8 (mynd 4) til DP 22 (mynd S1), en þyngd þeirra samsvarar MeU-xýlan fásykrum.ACN-B greining staðfesti pentósa og glúkóxýlan röð með DP 8-15.Í viðbótarefni eins og mynd S3, sýna FA-C súrhlutamassadreifingarkort úrval af (Me)U setnum pentósasykrum með DP 8-15 sem eru í samræmi við útskipt xýlan sem finnast í ELISA-undirstaða mAb skimun.Eptópurnar eru í samræmi.
MALDI-MS litróf leysanlegra ósamhæfra fásykra sem eru til staðar í ACS.Hér eru (A) ACN-A hlutar með lágþyngdarsviði sem innihalda metýleraða úrónsýru (DP 4-8) útskipt glúkúroxýlan fásykrur og (B) ACN-B xýlan og metýleruð úronsýru fásykrur skipt út fyrir glúkúroxýlan (DP 8-15).
Greining á samsetningu glýkanleifa eldföstum fásykrum.Hér (A) TMS sykursamsetning ýmissa fásykruhluta sem fæst með GC-MS greiningu.(B) Uppbygging ýmissa TMS-afleiddra sykra sem eru til staðar í fásykrum.ACN – asetónítrílhluti sem inniheldur hlutlausar fásykrur og FA – ferúlsýruhluti sem inniheldur súr fásykrur.
Önnur áhugaverð ályktun var dregin út frá LC-MS greiningu á fásykruhlutanum, eins og sýnt er á mynd S9 (aðferðir má sjá í rafrænu viðbótarefninu).Brot af hexósa og -OAc hópum sáust ítrekað við bindingu á ACN-B brotinu.Þessi niðurstaða staðfestir ekki aðeins sundrunina sem sést í glycome og MALDI-TOF greiningu, heldur veitir hún einnig nýjar upplýsingar um hugsanlegar kolvetnaafleiður í formeðhöndluðum lignocellulosic lífmassa.
Við greindum einnig sykursamsetningu fásykruhlutans með því að nota TMS sykurafleiður.Með því að nota GC-MS ákváðum við samsetningu tauga (ekki afleiddra) og súrs sykurs (GluA og GalA) í fásykruhlutanum (mynd 5).Glúkúrónsýra er að finna í súrum efnisþáttum C og D, en galaktúrónsýra er að finna í súrum hlutum A og B, sem báðir eru háir DP hluti af súrum sykri.Þessar niðurstöður staðfesta ekki aðeins ELISA og MALDI gögn okkar, heldur eru þær einnig í samræmi við fyrri rannsóknir okkar á uppsöfnun fásykra.Þess vegna teljum við að nútíma ónæmisfræðilegar aðferðir sem nota líftínýleringu á fásykrum og síðari ELISA skimun nægi til að greina leysanlegar þrjóskar fásykrur í ýmsum lífsýnum.
Þar sem ELISA-undirstaða mAb skimunaraðferðir hafa verið staðfestar með nokkrum mismunandi aðferðum, vildum við kanna frekar möguleika þessarar nýju megindlegu aðferðar.Tvær fásykrur í atvinnuskyni, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) og 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), voru keyptar og prófaðar með því að nota nýja mAb nálgun sem miðar að frumuvegg glýkani.Mynd 6 sýnir línulega fylgni á milli bíótínýleraðs bindismerkis og logstyrks styrks fásykru, sem bendir til mögulegs Langmuir aðsogslíkans.Meðal mAbs höfðu CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 og CCRC-M151 fylgni við XHE og CCRC-M108, CCRC-M109 og LM11 fylgni við A2XX á bilinu 100n namno.Vegna takmarkaðs framboðs mótefna í tilrauninni voru takmarkaðar tilraunir gerðar með hverri fásykrustyrk.Það skal tekið fram hér að sum mótefni bregðast mjög mismunandi við sama fásykrunni sem hvarfefni, væntanlega vegna þess að þau bindast aðeins mismunandi epitopum og geta haft mjög mismunandi bindisækni.Aðferðir og afleiðingar nákvæmrar auðkenningar á epitópum verða miklu flóknari þegar nýja mAb nálgunin er notuð á raunveruleg sýni.
Tvær fásykrur í atvinnuskyni voru notaðar til að ákvarða greiningarsvið ýmissa glýkan-markandi mAbs.Hér gefa línuleg fylgni við log styrk fásykrunnar til kynna Langmuir aðsogsmynstur fyrir (A) XHE með mAb og (B) A2XX með mAb.Samsvarandi epitopur gefa til kynna uppbyggingu fásykranna sem notaðar eru sem hvarfefni í prófuninni.
Notkun einstofna mótefna sem miða á glýkan (glycocomic greining eða ELISA-undirstaða mAb skimun) er öflugt tæki til að lýsa ítarlegri lýsingu á flestum helstu frumuveggja glýkönum sem mynda lífmassa plantna.Hins vegar einkennir klassísk glýkangreining aðeins stærri frumuvegg glýkana, þar sem flestar fásykrur eru ekki á skilvirkan hátt óhreyfðar á ELISA plötum.Í þessari rannsókn var AFEX-formeðhöndlaður maísofni vatnsrofaður með ensímaðri efnainnihaldi.Sykurgreining var notuð til að ákvarða samsetningu þröngsýna frumuveggkolvetna í vatnsrofinu.Hins vegar er mAb greining á smærri fásykrum í vatnsrofsefnum vanmetin og viðbótarverkfæri eru nauðsynleg til að festa fásykrur á áhrifaríkan hátt á ELISA plötum.
Við greinum hér frá nýrri og skilvirkri óhreyfingaraðferð á fásykrum fyrir mAb skimun með því að sameina fásykrur líftínýleringu og síðan ELISA skimun á NeutrAvidin™ húðuðum plötum.Óhreyfðu bíótínýleruðu fásykrurnar sýndu nægjanlega sækni fyrir mótefnið til að gera hraða og skilvirka greiningu á óþrjótandi fásykrum.Greining á samsetningu þessara þrjósku fásykra byggða á massagreiningu staðfesti niðurstöður þessarar nýju aðferðar við ónæmisskimun.Þannig sýna þessar rannsóknir fram á að hægt er að nota blöndu af fásykrum líftínýleringu og ELISA skimun með glýkanmiðuðum einstofna mótefnum til að greina krosstengingar í fásykrum og hægt er að nota þær víða í öðrum lífefnafræðilegum rannsóknum sem einkenna uppbyggingu fásykra.
Þessi bíótín-undirstaða glýkanprófunaraðferð er fyrsta skýrslan sem getur rannsakað þrjósk kolvetnatengi leysanlegra fásykra í lífmassa plantna.Þetta hjálpar til við að skilja hvers vegna sumir hlutar lífmassa eru svo þrjóskur þegar kemur að framleiðslu lífeldsneytis.Þessi aðferð fyllir mikilvægt skarð í glýkómegreiningaraðferðum og útvíkkar beitingu hennar á fjölbreyttari hvarfefni umfram fásykrur plantna.Í framtíðinni gætum við notast við vélfærafræði til að nota líftínýleringu og nota aðferðina sem við höfum þróað til að greina sýni með miklum afköstum með ELISA.
Kornstrá (CS) ræktað úr Pioneer 33A14 blendingsfræi var safnað árið 2010 frá Kramer Farms í Ray, Colorado.Með leyfi landeiganda má nýta þennan lífmassa til rannsókna. Sýnin voru geymd þurr < 6% raka í zip-lock pokum við stofuhita. Sýnin voru geymd þurr < 6% raka í zip-lock pokum við stofuhita. Bæta við kerfi fyrir heimilistæki < 6% á kostnaði með kerfisbundnum tölvubúnaði. Sýni voru geymd þurr við <6% raka í rennilásum pokum við stofuhita.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Breytingar á raforku með neyðartilvikum eru < 6%. Sýni eru geymd í rennilásum við stofuhita með raka < 6%.Rannsóknin var í samræmi við staðbundnar og landsbundnar leiðbeiningar.Samsetningargreining var framkvæmd með því að nota NREL samskiptareglur.Samsetningin reyndist innihalda 31,4% glúkan, 18,7% xýlan, 3,3% arabínan, 1,2% galaktan, 2,2% asetýl, 14,3% lignín, 1,7% prótein og 13,4% aska.
Cellic® CTec2 (138 mg prótein/ml, lota VCNI 0001) er flókin blanda af sellulasa, β-glúkósíðasa og Cellic® HTec2 (157 mg prótein/ml, lota VHN00001) frá Novozymes (Franklinton, NC, Bandaríkjunum)).Multifect Pectinase® (72 mg prótein/ml), flókin blanda af pektín niðurbrotsensímum, var gefin af DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, Bandaríkjunum).Styrkur ensímpróteina var ákvarðaður með því að meta próteininnihald (og draga frá framlagi köfnunarefnis sem ekki er prótein) með því að nota Kjeldahl köfnunarefnisgreiningu (AOAC aðferð 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Kísilgúr 545 var keypt frá EMD Millipore (Billerica, MA).Virkt kolefni (DARCO, 100 möskva korn), Avicel (PH-101), beykisýlan og öll önnur efni voru keypt frá Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX formeðferð var framkvæmd á GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, Bandaríkjunum).Formeðferð var framkvæmd við 140°C í 15 mínútur.46 dvalartími við 1:1 hlutfall vatnsfrís ammóníaks á móti lífmassa við 60% (w/w) hleðslu í ryðfríu stáli lotukjarnaofni (Parr Instruments Company).Það tók 30 mínútur.Kjarnaofninn var færður í 140°C og ammoníakið losað hratt, sem gerir lífmassanum kleift að komast fljótt aftur í stofuhita.Samsetning AFEX formeðhöndlaðs maísofnar (ACS) var svipuð og ómeðhöndlaðs maísofnar (UT-CS).
ACSH 25% (w/w) með háu föstu efni (um það bil 8% dextranhleðsla) var útbúið sem upphafsefni fyrir framleiðslu á fásykrum í stórum stíl.Ensímvatnsrof á ACS var framkvæmt með því að nota ensímblöndu í verslun sem inniheldur Cellic® Ctec2 10 mg prótein/g glúkan (í formeðhöndluðum lífmassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg prótein/g glúkans og Multifect Pectinase (Genencor Inc, Bandaríkjunum).).), 5 mg prótein/g dextran.Ensímvatnsrof var framkvæmt í 5 lítra lífhverfa með vinnslurúmmáli 3 lítra, pH 4,8, 50°C og 250 snúninga á mínútu.Eftir vatnsrof í 96 klukkustundir var vatnsrofinu safnað með skilvindu við 6000 rpm í 30 mínútur og síðan við 14000 rpm í 30 mínútur til að fjarlægja óvatnsrofið fast efni.Vatnsrofið var síðan sett í dauðhreinsaða síun í gegnum 0,22 mm síubikar.Síað vatnsrofið var geymt í dauðhreinsuðum flöskum við 4°C og síðan skipt á kolefni.
Greining á samsetningu lífmassasýna úr útdrætti í samræmi við NREL rannsóknarstofugreiningaraðferðir: undirbúningur sýna fyrir samsetningargreiningu (NREL/TP-510-42620) og ákvörðun byggingarkolvetna og ligníns í lífmassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Fásykrurgreining á vatnsrofsstraumnum var framkvæmd á 2 ml mælikvarða með því að nota sýruvatnsrofsaðferð sem byggir á autoclave.Blandið vatnsrofssýninu saman við 69,7 µl af 72% brennisteinssýru í 10 ml ræktunarröri með skrúfuðu loki og ræktið í 1 klst á borðplötu við 121 °C, kælt á ís og síað í hettuglas með hágæða vökvaskiljun (HPLC).Styrkur fásykra var ákvarðaður með því að draga styrk einsykra í óvatnsrofna sýninu frá heildarsykristyrk í sýruvatnsrofna sýninu.
Styrkur glúkósa, xýlósa og arabínósa í sýru vatnsrofna lífmassanum var greindur með því að nota Shimadzu HPLC kerfi útbúið með sjálfssýnistæki, súluhitara, ísókratískri dælu og brotstuðulsskynjara á Bio-Rad Aminex HPX-87H súlu.Súlan var haldið við 50°C og skoluð með 0,6 ml/mín. 5 mM H2SO4 í vatni.flæði.
Vatnsrofið flotið var þynnt og greint með tilliti til einliða og fásykruinnihalds.Einliða sykur sem fengust eftir ensímvatnsrof voru greindir með HPLC útbúnum Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P súlu og öskuvarnarsúlu.Súluhitanum var haldið við 80°C, vatn var notað sem hreyfanlegur fasi með flæðihraða 0,6 ml/mín.Fásykrur voru ákvarðaðar með vatnsrofi í þynntri sýru við 121°C samkvæmt aðferðunum sem lýst er í sk.41, 48, 49.
Sykurgreining var gerð á hráum, AFEX formeðhöndluðum og öllum óvatnsrofnum lífmassaleifum (þar á meðal framleiðslu á raðfrumuveggsútdrætti og mAb skimun þeirra) með því að nota áður lýstar aðferðir 27, 43, 50, 51 .Fyrir glýkomgreiningu eru alkóhólóleysanlegar leifar af plöntufrumuveggefni unnin úr lífmassaleifum og látnar fara í raðútdrátt með sífellt árásargjarnari hvarfefnum eins og ammóníumoxalati (50 mM), natríumkarbónat (50 mM og 0,5% w/v), CON.(1M og 4M, bæði með 1% w/v natríumbórhýdríði) og sýruklórít eins og áður hefur verið lýst52,53.Útdrættirnir voru síðan látnir fara í ELISA gegn flóknu spjaldi mAb50s sem beint var að frumuvegg glýkaninu og mAb bindihvörfin voru sýnd sem hitakort.mAbs sem miða að plöntufrumuvegg glýkani voru keyptir af rannsóknarstofum (CCRC, JIM og MAC röð).
Eins þrepa líftínýlering fásykra.Samtenging kolvetna við biotin-LC-hýdrazíð var framkvæmd með eftirfarandi aðferð.Bíótín-LC-hýdrasíð (4,6 mg/12 μmól) var leyst upp í dímetýlsúlfoxíði (DMSO, 70 μl) með kröftugri hræringu og upphitun við 65°C í 1 mín.Ísediksýru (30 µl) var bætt við og blöndunni var hellt á natríumsýanóborhýdríð (6,4 mg/100 µmól) og leyst upp að fullu eftir hitun við 65°C í um það bil 1 mínútu.Síðan var 5 til 8 μl af hvarfblöndunni bætt við þurrkaða fásykruna (1-100 nmól) til að fá 10-falt eða meira mól umfram merkimiðann yfir afoxandi enda.Hvarfið var framkvæmt við 65°C í 2 klst, eftir það voru sýnin strax hreinsuð.Ekkert natríumsýanóborhýdríð var notað í merkingartilraununum án minnkunar og sýnin voru látin hvarfast við 65°C í 2,5 klst.
ELISA húðun og þvottur á sýnum af bíótínýleruðum fásykrum.25 μl af bíótínýleruðum sýnum (100 μl af hverju þéttu sýni þynnt í 5 ml af 0,1 M Tris jafnalausn (TBS)) var bætt í hvern brunn á avidinhúðuðu plötunni.Viðmiðunarholur voru húðaðir með 50 μl af biotíni í styrkleikanum 10 μg/ml í 0,1 M TBS.Afjónað vatn var notað sem húðun fyrir núllmælingar.Taflan var ræktuð í 2 klukkustundir við stofuhita í myrkri.Þvoið plötuna þrisvar sinnum með 0,1% undanrennu í 0,1 M TBS með kerfi nr.11 fyrir Grenier íbúð 3A.
Viðbót og þvott á frummótefnum.Bætið 40 µl af aðalmótefni í hvern brunn.Ræktaðu örplötuna í 1 klukkustund við stofuhita í myrkri.Plöturnar voru síðan þvegnar þrisvar sinnum með 0,1% mjólk í 0,1M TBS með þvottakerfi #11 fyrir Grenier Flat 3A.
Bætið öðru mótefni við og þvoið.Bætið 50 µl af mús-/rottumótefni (þynnt 1:5000 í 0,1% mjólk í 0,1 M TBS) í hvern brunn.Ræktaðu örplötuna í 1 klukkustund við stofuhita í myrkri.Örplöturnar voru síðan þvegnar 5 sinnum með 0,1% mjólk í 0,1 M TBS með því að nota Grenier Flat 5A plötuþvottakerfi #12.
Að bæta við undirlagi.Bætið 50 µl af 3,3′,5,5′-tetrametýlbensídíni (TMB) við grunnhvarfefnið (með því að bæta 2 dropum af jafnalausn, 3 dropum af TMB, 2 dropum af vetnisperoxíði í 15 ml af afjónuðu vatni).Undirbúðu TMB undirlagið.og hringdu fyrir notkun).Ræktaðu örplötuna við stofuhita í 30 mínútur.Í myrkrinu.
Ljúktu skrefinu og lestu spjaldtölvuna.Bætið 50 µl af 1 N brennisteinssýru í hvern brunn og skráðu gleypni frá 450 til 655 nm með því að nota ELISA lesara.
Undirbúið 1 mg/ml lausnir af þessum greiningarefnum í afjónuðu vatni: arabínósi, ramnósi, fúkósi, xylósi, galaktúrónsýra (GalA), glúkúrónsýra (GlcA), mannósa, glúkósa, galaktósi, laktósa, N-asetýlmannósamín (manNAc), N-asetýlglúkósamín.(glcNAc), N-asetýlgalaktósamín (galNAc), inositól (innri staðall).Tveir staðlar voru útbúnir með því að bæta við 1 mg/mL sykurlausnunum sem sýndar eru í töflu 1. Sýni eru fryst og frostþurrkuð við -80°C þar til allt vatn er fjarlægt (venjulega um 12-18 klukkustundir).
Bætið 100–500 µg af sýni í slöngur með skrúftappa á greiningarvog.Skráðu upphæðina sem bætt er við.Best er að leysa sýnið upp í ákveðnum styrk leysis og bæta því í túpuna sem vökvadeil.Notaðu 20 µl af 1 mg/ml inositóli sem innri staðal fyrir hvert sýnisglas.Magn innri staðals sem bætt er við sýnið verður að vera það sama og magn innri staðals sem bætt er við staðlaða rörið.
Bætið 8 ml af vatnsfríu metanóli í hettuglas með skrúfað loki.Síðan 4 ml af 3 N. metanólískri HCl lausn, lokuð og hrist.Þetta ferli notar ekki vatn.
Bætið 500 µl af 1 M HCl metanóllausn við fásykrusýnin og staðlað TMS glös.Sýni voru ræktuð yfir nótt (168 klst.) við 80°C í varmablokk.Þurrkaðu metanólýsuafurðina við stofuhita með því að nota þurrkunargrein.Bætið við 200 µl MeOH og þurrkið aftur.Þetta ferli er endurtekið tvisvar.Bætið 200 µl af metanóli, 100 µl af pýridíni og 100 µl af ediksýruanhýdríði við sýnið og blandið vel saman.Sýni voru ræktuð við stofuhita í 30 mínútur.og þurrkað.Bætið við 200 µl af metanóli og þurrkið aftur.
Bættu við 200 µl af Tri-Sil og hitaðu loki í 20 mínútur.80°C, síðan kælt niður í stofuhita.Notaðu þurrkunargrein til að þurrka sýnið enn frekar í rúmmál sem er um það bil 50 µl.Það er mikilvægt að hafa í huga að við leyfðum ekki sýnunum að þorna alveg.
Bætið 2 ml af hexani út í og ​​blandið vel saman með því að hringsnúast.Fylltu endana á Pasteur pípettum (5-8 mm) með stykki af glerull með því að setja glerullina ofan á 5-3/4 tommu pípettu í þvermál.Sýnin voru skilin í skilvindu við 3000 g í 2 mínútur.Allar óleysanlegar leifar eru felldar út.Þurrkaðu sýnið í 100-150 µl.Rúmmáli um það bil 1 μl var sprautað í GC-MS við upphafshitastig 80 °C og upphafstími 2,0 mínútur (tafla 2).