Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, będziemy renderować witrynę bez stylów i języka JavaScript.
Nowe metody immunologiczne i spektrometrii mas do kompleksowej analizy trwałych oligosacharydów w słomie kukurydzianej poddanej wstępnej obróbce preparatem AFEX.Biomasa lignocelulozowa jest zrównoważoną alternatywą dla paliw kopalnych i jest szeroko wykorzystywana do rozwoju biotechnologii do produkcji produktów takich jak żywność, pasza, paliwa i chemikalia.Kluczem do tych technologii jest opracowanie konkurencyjnych kosztowo procesów przekształcania złożonych węglowodanów obecnych w ścianach komórkowych roślin w cukry proste, takie jak glukoza, ksyloza i arabinoza.Ponieważ biomasa lignocelulozowa jest bardzo uparta, musi być poddawana łącznie obróbce termochemicznej (np. złuszczanie włókien amoniakiem (AFEX), rozcieńczonymi kwasami (DA), cieczami jonowymi (IL)) oraz obróbce biologicznej (np. hydrolizie enzymatycznej i fermentacji mikrobiologicznej) w celu uzyskania pożądanego produktu..Jednakże, gdy w procesie hydrolizy stosuje się komercyjne enzymy grzybowe, tylko 75-85% utworzonych rozpuszczalnych cukrów to monosacharydy, a pozostałe 15-25% to rozpuszczalne, trudne w obróbce oligosacharydy, które nie zawsze są dostępne dla mikroorganizmów.Wcześniej udało nam się z powodzeniem wyizolować i oczyścić rozpuszczalne uporczywe oligosacharydy przy użyciu połączenia rozdzielania na węglu i ziemi okrzemkowej oraz chromatografii wykluczania, a także badaliśmy ich właściwości hamowania enzymów.Stwierdziliśmy, że oligosacharydy zawierające substytucje metylowanego kwasu uronowego o wyższym stopniu polimeryzacji (DP) są trudniejsze do przetworzenia z komercyjnymi mieszankami enzymów niż oligosacharydy o niskim DP i obojętne.Tutaj opisujemy zastosowanie kilku dodatkowych metod, w tym profilowanie glikanów przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (mAb) specyficznych dla glikanów z biomasy roślinnej w celu scharakteryzowania wiązań glikanów w ścianach komórkowych roślin i hydrolizatach enzymatycznych, jonizacji desorpcji laserowej wspomaganej matrycą, spektrometrii masowej czasu przelotu..MALDI-TOF-MS) wykorzystuje informujące o strukturze piki diagnostyczne uzyskane za pomocą spektroskopii po wtórnym rozpadzie jonów ujemnych, chromatografii gazowej i spektrometrii masowej (GC-MS) do scharakteryzowania wiązań oligosacharydowych z derywatyzacją i bez derywatyzacji.Ze względu na mały rozmiar oligosacharydów (DP 4–20), cząsteczki te są trudne w użyciu do wiązania i charakteryzowania mAb.Aby przezwyciężyć ten problem, zastosowaliśmy nową metodę immobilizacji oligosacharydów opartą na koniugacji biotyny, która z powodzeniem znakowała większość rozpuszczalnych oligosacharydów o niskim DP na powierzchni mikropłytki, którą następnie zastosowano w wysokowydajnym systemie mAb do specyficznej analizy ligacji.Ta nowa metoda ułatwi w przyszłości opracowanie bardziej zaawansowanych, wysokowydajnych testów glikomowych, które można będzie wykorzystać do izolowania i charakteryzowania oligosacharydów obecnych w biomarkerach do celów diagnostycznych.
Biomasa lignocelulozowa, składająca się z materiałów rolniczych, leśnych, trawy i drewna, jest potencjalnym surowcem do produkcji bioproduktów, w tym żywności, pasz, paliw i prekursorów chemicznych do wytwarzania produktów o wyższej wartości1.Węglowodany (takie jak celuloza i hemiceluloza) obecne w ścianach komórkowych roślin są depolimeryzowane do monosacharydów w wyniku obróbki chemicznej i biotransformacji (takiej jak hydroliza enzymatyczna i fermentacja mikrobiologiczna).Typowe zabiegi wstępne obejmują ekspansję włókien amoniaku (AFEX), rozcieńczony kwas (DA), ciecz jonową (IL) i eksplozję pary (SE), które wykorzystują kombinację chemikaliów i ciepła w celu zmniejszenia produkcji lignocelulozy poprzez otwieranie ścian komórkowych roślin3,4.uporczywość materii, 5. Hydrolizę enzymatyczną przeprowadza się przy dużym obciążeniu ciałami stałymi przy użyciu dostępnych w handlu enzymów zawierających aktywne węglowodany (CAZymes) oraz fermentacji mikrobiologicznej z wykorzystaniem transgenicznych drożdży lub bakterii do produkcji biopaliw i chemikaliów 6 .
CAZymy w komercyjnych enzymach składają się ze złożonej mieszaniny enzymów, które synergistycznie rozszczepiają złożone wiązania węglowodanowo-cukrowe, tworząc monosacharydy2,7.Jak informowaliśmy wcześniej, złożona sieć aromatycznych polimerów ligniny z węglowodanami sprawia, że ​​są one bardzo trudne do obróbki, co prowadzi do niepełnej konwersji cukru, gromadzącej 15-25% oligosacharydów płciowych, które nie są wytwarzane podczas enzymatycznej hydrolizy wstępnie obrobionej biomasy.Jest to częsty problem związany z różnymi metodami wstępnej obróbki biomasy.Niektóre przyczyny tego wąskiego gardła obejmują hamowanie enzymów podczas hydrolizy lub brak lub niski poziom niezbędnych niezbędnych enzymów, które są wymagane do rozbicia wiązań cukrowych w biomasie roślinnej.Zrozumienie składu i cech strukturalnych cukrów, takich jak wiązania cukrowe w oligosacharydach, pomoże nam ulepszyć konwersję cukru podczas hydrolizy, dzięki czemu procesy biotechnologiczne staną się konkurencyjne kosztowo w stosunku do produktów ropopochodnych.
Określenie struktury węglowodanów jest trudne i wymaga połączenia metod, takich jak chromatografia cieczowa (LC)11,12, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)13, elektroforeza kapilarna (CE)14,15,16 i spektrometria masowa (MS)17.,osiemnaście.Metody MS, takie jak spektrometria masowa czasu przelotu z desorpcją laserową i jonizacją z wykorzystaniem matrycy (MALDI-TOF-MS), są wszechstronną metodą identyfikacji struktur węglowodanowych.Ostatnio tandemowa dysocjacja indukowana kolizją (CID) adduktów jonów sodu była najczęściej stosowana do identyfikacji odcisków palców odpowiadających pozycjom przyłączania oligosacharydów, konfiguracjom anomerycznym, sekwencjom i pozycjom rozgałęzień 20, 21 .
Analiza glikanów jest doskonałym narzędziem do dogłębnej identyfikacji wiązań węglowodanowych22.Ta metoda wykorzystuje przeciwciała monoklonalne (mAb) skierowane przeciwko glikanowi ściany komórkowej roślin jako sondy do zrozumienia złożonych wiązań węglowodanowych.Na całym świecie dostępnych jest ponad 250 mAb, zaprojektowanych przeciwko różnym liniowym i rozgałęzionym oligosacharydom przy użyciu różnych sacharydów24.Kilka mAb było szeroko stosowanych do charakteryzowania struktury, składu i modyfikacji ściany komórkowej roślin, ponieważ istnieją znaczne różnice w zależności od typu komórki roślinnej, narządu, wieku, etapu rozwoju i środowiska wzrostu25,26.Niedawno metoda ta została wykorzystana do zrozumienia populacji pęcherzyków w systemach roślinnych i zwierzęcych oraz ich odpowiednich ról w transporcie glikanów, określonych przez markery subkomórkowe, stadia rozwojowe lub bodźce środowiskowe, oraz do określenia aktywności enzymatycznej.Niektóre z różnych zidentyfikowanych struktur glikanów i ksylanów obejmują pektynę (P), ksylan (X), mannan (M), ksyloglukany (XylG), glukany o wiązaniach mieszanych (MLG), arabinoksylan (ArbX), galaktomannan (GalG), kwas glukuronowy-arabinoksylan (GArbX) i arabino-galaktan (ArbG)29.
Jednak pomimo tych wszystkich wysiłków badawczych, tylko kilka badań skupiało się na naturze akumulacji oligosacharydów podczas hydrolizy z dużym ładunkiem ciał stałych (HSL), w tym uwalnianiu oligosacharydów, zmianach długości łańcucha oligomerów podczas hydrolizy, różnych polimerach o niskim DP i ich krzywych.dystrybucje 30,31,32.Tymczasem, chociaż analiza glikanów okazała się użytecznym narzędziem do kompleksowej analizy struktury glikanów, trudno jest ocenić rozpuszczalne w wodzie oligosacharydy o niskim DP przy użyciu metod przeciwciał.Mniejsze oligosacharydy DP o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5-10 kDa nie wiążą się z płytkami ELISA 33, 34 i są wypłukiwane przed dodaniem przeciwciała.
Tutaj po raz pierwszy demonstrujemy test ELISA na płytkach pokrytych awidyną przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, łącząc jednoetapową procedurę biotynylacji rozpuszczalnych opornych oligosacharydów z analizą glikomu.Nasze podejście do analizy glikomu zostało potwierdzone przez analizę opartą na MALDI-TOF-MS i GC-MS komplementarnych wiązań oligosacharydowych przy użyciu derywatyzacji trimetylosililowej (TMS) kompozycji zhydrolizowanych cukrów.To innowacyjne podejście może w przyszłości zostać opracowane jako metoda wysokowydajna i znaleźć szersze zastosowanie w badaniach biomedycznych35.
Modyfikacje potranslacyjne enzymów i przeciwciał, takie jak glikozylacja36, wpływają na ich aktywność biologiczną.Na przykład zmiany w glikozylacji białek surowicy odgrywają ważną rolę w zapalnym zapaleniu stawów, a zmiany w glikozylacji są wykorzystywane jako markery diagnostyczne37.W literaturze opisano występowanie różnych glikanów w różnych chorobach, w tym w przewlekłych chorobach zapalnych przewodu pokarmowego i wątroby, infekcjach wirusowych, raku jajnika, piersi i prostaty38,39,40.Zrozumienie struktury glikanów za pomocą metod ELISA glikanów opartych na przeciwciałach zapewni dodatkową pewność w diagnostyce choroby bez stosowania złożonych metod MS.
Nasze poprzednie badanie wykazało, że uporczywe oligosacharydy pozostały niezhydrolizowane po obróbce wstępnej i hydrolizie enzymatycznej (ryc. 1).W naszej wcześniej opublikowanej pracy opracowaliśmy metodę ekstrakcji w fazie stałej węglem aktywnym w celu wyizolowania oligosacharydów z hydrolizatu kukurydzy poddanego wstępnej obróbce AFEX (ACSH)8.Po początkowej ekstrakcji i rozdzieleniu oligosacharydy dalej frakcjonowano metodą chromatografii wykluczania (SEC) i zebrano w kolejności według masy cząsteczkowej.Monomery i oligomery cukru uwolnione z różnych procesów obróbki wstępnej analizowano za pomocą analizy składu cukru.Porównując zawartość oligomerów cukrowych otrzymanych różnymi metodami obróbki wstępnej, obecność oligosacharydów uporczywych jest powszechnym problemem w konwersji biomasy do monosacharydów i może prowadzić do obniżenia wydajności cukru o co najmniej 10-15%, a nawet do 18%.NAS.Metodę tę stosuje się do dalszej produkcji frakcji oligosacharydowych na dużą skalę.Powstały ACH i jego kolejne frakcje o różnej masie cząsteczkowej posłużyły jako materiał doświadczalny do charakteryzacji oligosacharydów w niniejszej pracy.
Po obróbce wstępnej i hydrolizie enzymatycznej trwałe oligosacharydy pozostały niezhydrolizowane.Tutaj (A) jest metodą rozdzielania oligosacharydów, w której oligosacharydy są izolowane z hydrolizatu ze słomy kukurydzianej poddanego wstępnej obróbce AFEX (ACSH) przy użyciu upakowanego złoża węgla aktywnego i ziemi okrzemkowej;(B) Sposób rozdzielania oligosacharydów.Oligosacharydy dalej rozdzielono metodą chromatografii wykluczania (SEC);(C) Monomery i oligomery sacharydowe uwolnione z różnych obróbek wstępnych (rozcieńczony kwas: DA, ciecz jonowa: IL i AFEX).Warunki hydrolizy enzymatycznej: wysokie obciążenie ciałami stałymi 25% (wag./wag.) (około 8% obciążenia glukanem), 96-godzinna hydroliza, obciążenie handlowe 20 mg/g enzymu (stosunek Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) i (D) Monomery cukrowe i oligomery glukozy, ksylozy i arabinozy uwolnione z macek do kukurydzy poddanej wstępnej obróbce AFEX (ACS).
Analiza glikanów okazała się użytecznym narzędziem do kompleksowej analizy strukturalnej glikanów w ekstraktach wyizolowanych z pozostałości biomasy stałej.Jednak sacharydy rozpuszczalne w wodzie są niedostatecznie reprezentowane przy użyciu tej tradycyjnej metody41, ponieważ oligosacharydy o niskiej masie cząsteczkowej są trudne do unieruchomienia na płytkach ELISA i są wypłukiwane przed dodaniem przeciwciała.Dlatego też, do wiązania i charakteryzacji przeciwciał, zastosowano jednoetapową metodę biotynylacji do powlekania rozpuszczalnych, niezgodnych oligosacharydów na pokrytych awidyną płytkach ELISA.Ta metoda została przetestowana przy użyciu naszego wcześniej wyprodukowanego ACSH i frakcji opartej na jego masie cząsteczkowej (lub stopniu polimeryzacji, DP).Zastosowano jednoetapową biotynylację w celu zwiększenia powinowactwa wiązania oligosacharydu przez dodanie hydrazydu biotyny-LC do redukującego końca węglowodanu (ryc. 2).W roztworze grupa hemiacetalowa na końcu redukującym reaguje z grupą hydrazydową biotyny-LC-hydrazydu, tworząc wiązanie hydrazonowe.W obecności czynnika redukującego NaCNBH3 wiązanie hydrazonowe jest redukowane do stabilnego biotynylowanego produktu końcowego.Wraz z modyfikacją końca redukującego cukier możliwe stało się wiązanie oligosacharydów o niskim DP z płytkami ELISA, aw naszym badaniu przeprowadzono to na płytkach pokrytych awidyną przy użyciu mAb ukierunkowanych na glikan.
Skrining przeciwciał monoklonalnych na podstawie testu ELISA na obecność biotynylowanych oligosacharydów.Tutaj (A) połączona biotynylacja oligosacharydów i późniejsze badanie przesiewowe ELISA z mAb ukierunkowanymi na glikan na płytkach powleczonych NeutrAvidin i (B) przedstawia jednoetapową procedurę biotynylacji produktów reakcji.
Płytki powlekane awidyną z przeciwciałami skoniugowanymi z oligosacharydami dodawano następnie do przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych i przemywano pożywką światłoczułą i czasową.Po zakończeniu wiązania przeciwciał dodać substrat TMB w celu inkubacji płytki.Reakcję ostatecznie zatrzymano kwasem siarkowym.Inkubowane płytki analizowano przy użyciu czytnika ELISA w celu określenia siły wiązania każdego przeciwciała w celu wykrycia sieciowania specyficznego dla przeciwciała.Szczegóły i parametry eksperymentu znajdują się w odpowiedniej sekcji „Materiały i metody”.
Wykazaliśmy przydatność tej nowo opracowanej metody do konkretnych zastosowań, charakteryzując rozpuszczalne oligosacharydy obecne w ACSH, jak również w surowych i oczyszczonych frakcjach oligosacharydów wyizolowanych z hydrolizatów lignocelulozowych.Jak pokazano na rycinie 3, najpowszechniejszymi ksylanami podstawionymi epitopem zidentyfikowanymi w ACSH przy użyciu metod oznaczania bioacylowanego glikomu są zwykle arabinogalaktany uronowe (U) lub metylouronowe (MeU) i pektynowe.Większość z nich znaleziono również w naszym poprzednim badaniu dotyczącym analizy glikanów niezhydrolizowanych ciał stałych (UHS)43.
Wykrywanie epitopów opornych oligosacharydów przy użyciu przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko glikanowi ściany komórkowej.Frakcja „obojętna” to frakcja ACN, a frakcja „kwaśna” to frakcja FA.Jaśniejsze czerwienie na mapie termicznej wskazują na wyższą zawartość epitopów, a jaśniejsze odcienie niebieskiego wskazują na puste tło.Wartości kolorów na skali oparte są na surowych wartościach OD dla receptur N=2.Główne epitopy rozpoznawane przez przeciwciała pokazano po prawej stronie.
Te struktury niecelulozowe nie mogły być rozszczepiane przez najpowszechniejsze celulazy i hemicelulazy w testowanej komercyjnej mieszaninie enzymów, która zawiera najczęściej stosowane komercyjne enzymy.Dlatego do ich hydrolizy potrzebne są nowe enzymy pomocnicze.Bez niezbędnych niecelulozowych enzymów pomocniczych te wiązania niecelulozowe uniemożliwiają całkowitą konwersję do monosacharydów, nawet jeśli ich macierzyste polimery cukrowe są w znacznym stopniu hydrolizowane na krótsze fragmenty i rozpuszczane przy użyciu komercyjnych mieszanin enzymów.
Dalsze badania rozkładu sygnału i jego siły wiązania wykazały, że epitopy wiążące były niższe we frakcjach cukru o wysokim DP (A, B, C, DP do 20+) niż we frakcjach o niskim DP (D, E, F, DP) w dimerach) (ryc. 1).Fragmenty kwasowe są bardziej powszechne w epitopach niecelulozowych niż fragmenty obojętne.Zjawiska te są zgodne ze wzorem obserwowanym w naszym poprzednim badaniu, w którym ugrupowania o wysokim DP i kwasie były bardziej odporne na hydrolizę enzymatyczną.Zatem obecność niecelulozowych epitopów glikanów oraz podstawień U i MeU może znacznie przyczynić się do stabilności oligosacharydów.Należy zauważyć, że wydajność wiązania i wykrywania może być problematyczna dla oligosacharydów o niskim DP, zwłaszcza jeśli epitop jest dimerycznym lub trimerycznym oligosacharydem.Można to przetestować stosując dostępne w handlu oligosacharydy o różnej długości, z których każdy zawiera tylko jeden epitop, który wiąże się z określonym mAb.
Zatem zastosowanie przeciwciał specyficznych dla struktury ujawniło pewne rodzaje opornych wiązań.W zależności od typu zastosowanego przeciwciała, odpowiedniego wzoru ligacji i siły wytwarzanego przez nie sygnału (najbardziej i najmniej obfitego), nowe enzymy można zidentyfikować i dodać półilościowo do mieszaniny enzymów w celu pełniejszej glikokonwersji.Biorąc za przykład analizę oligosacharydów ACSH, możemy stworzyć bazę danych wiązań glikanowych dla każdego materiału biomasy.Należy tutaj zauważyć, że należy wziąć pod uwagę różne powinowactwo przeciwciał, a jeśli ich powinowactwo jest nieznane, spowoduje to pewne trudności przy porównywaniu sygnałów różnych przeciwciał.Ponadto porównanie wiązań glikanowych może działać najlepiej między próbkami tego samego przeciwciała.Te uporczywe wiązania można następnie połączyć z bazą danych CAZyme, z której możemy zidentyfikować enzymy, wybrać enzymy kandydujące i przetestować enzymy rozrywające wiązania lub opracować systemy mikrobiologiczne do ekspresji tych enzymów do użytku w biorafineriach44.
Aby ocenić, w jaki sposób metody immunologiczne uzupełniają alternatywne metody charakteryzowania oligosacharydów o niskiej masie cząsteczkowej obecnych w hydrolizatach lignocelulozowych, wykonaliśmy MALDI (ryc. 4, S1-S8) i analizę sacharydów pochodzących z TMS na podstawie GC-MS na tym samym panelu (ryc. 5) część oligosacharydowa.MALDI służy do porównania, czy rozkład masy cząsteczek oligosacharydu odpowiada zamierzonej strukturze.na ryc.4 pokazuje MC neutralnych składników ACN-A i ACN-B.Analiza ACN-A potwierdziła zakres cukrów pentozowych w zakresie od DP 4–8 (ryc. 4) do DP 22 (ryc. S1), których masy odpowiadają oligosacharydom MeU-ksylanu.Analiza ACN-B potwierdziła serie pentozy i glukoksylanu z DP 8-15.W dodatkowym materiale, takim jak Rycina S3, mapy rozkładu masy ugrupowań kwasowych FA-C pokazują zakres cukrów pentozowych podstawionych (Me) U z DP 8-15, które są zgodne z podstawionymi ksylanami znalezionymi w badaniu przesiewowym mAb opartym na teście ELISA.Epitopy są spójne.
Widmo MALDI-MS rozpuszczalnych niezgodnych oligosacharydów obecnych w ACS.Tutaj (A) frakcje ACN-A o niskiej masie zawierające metylowany kwas uronowy (DP 4-8) podstawione oligosacharydy glukuroksylanowe i (B) ACN-B ksylan i metylowane oligosacharydy kwasu uronowego podstawione glukuroksylanem (DP 8-15).
Analiza składu reszty glikanowej oligosacharydów ogniotrwałych.Tutaj (A) Kompozycja sacharydowa TMS różnych frakcji oligosacharydowych otrzymana za pomocą analizy GC-MS.(B) Struktury różnych cukrów pochodzących z TMS obecnych w oligosacharydach.ACN – frakcja acetonitrylu zawierająca obojętne oligosacharydy oraz FA – frakcja kwasu ferulowego zawierająca kwaśne oligosacharydy.
Inny interesujący wniosek został wyciągnięty z analizy LC-MS frakcji oligosacharydów, jak pokazano na rysunku S9 (metody można zobaczyć w elektronicznym materiale dodatkowym).Podczas ligacji frakcji ACN-B wielokrotnie obserwowano fragmenty grup heksozy i -OAc.To odkrycie nie tylko potwierdza fragmentację obserwowaną w analizie glikomu i MALDI-TOF, ale także dostarcza nowych informacji na temat potencjalnych pochodnych węglowodanów w biomasie lignocelulozowej poddanej wstępnej obróbce.
Przeanalizowaliśmy również skład cukru frakcji oligosacharydów za pomocą derywatyzacji cukru TMS.Za pomocą GC-MS określiliśmy skład cukrów neuronalnych (niepochodnych) i kwaśnych (GluA i GalA) we frakcji oligosacharydów (ryc. 5).Kwas glukuronowy znajduje się w kwaśnych składnikach C i D, podczas gdy kwas galakturonowy znajduje się w kwaśnych składnikach A i B, z których oba są składnikami o wysokim DP kwaśnych cukrów.Wyniki te nie tylko potwierdzają nasze dane ELISA i MALDI, ale są również zgodne z naszymi poprzednimi badaniami akumulacji oligosacharydów.Dlatego uważamy, że nowoczesne metody immunologiczne wykorzystujące biotynylację oligosacharydów, a następnie skrining ELISA są wystarczające do wykrycia rozpuszczalnych opornych oligosacharydów w różnych próbkach biologicznych.
Ponieważ metody przesiewowe mAb oparte na ELISA zostały zweryfikowane kilkoma różnymi metodami, chcieliśmy dalej zbadać potencjał tej nowej metody ilościowej.Zakupiono i przetestowano dwa dostępne w handlu oligosacharydy, oligosacharyd ksyloheksasacharydu (XHE) i 23-α-L-arabinofuranozylo-ksylotriozę (A2XX), stosując nowe podejście mAb ukierunkowane na glikan ściany komórkowej.Figura 6 przedstawia liniową korelację między biotynylowanym sygnałem wiązania a logarytmicznym stężeniem stężenia oligosacharydu, co sugeruje możliwy model adsorpcji Langmuira.Wśród mAb CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 i CCRC-M151 korelowały z XHE, a CCRC-M108, CCRC-M109 i LM11 korelowały z A2XX w zakresie od 1 nm do 100 nano.Ze względu na ograniczoną dostępność przeciwciał podczas eksperymentu, przeprowadzono ograniczone eksperymenty z każdym stężeniem oligosacharydu.Należy tutaj zauważyć, że niektóre przeciwciała reagują bardzo różnie na ten sam oligosacharyd jako substrat, prawdopodobnie dlatego, że wiążą się z nieco innymi epitopami i mogą mieć bardzo różne powinowactwa wiązania.Mechanizmy i implikacje dokładnej identyfikacji epitopów będą znacznie bardziej złożone, gdy nowe podejście do mAb zostanie zastosowane do rzeczywistych próbek.
Do określenia zakresu wykrywania różnych mAb ukierunkowanych na glikany zastosowano dwa dostępne w handlu oligosacharydy.W tym przypadku liniowe korelacje ze stężeniem logarytmicznym stężenia oligosacharydu wskazują wzorce adsorpcji Langmuira dla (A) XHE z mAb i (B) A2XX z mAb.Odpowiednie epitopy wskazują struktury handlowych oligosacharydów stosowanych jako substraty w teście.
Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych ukierunkowanych na glikany (analiza glikokomiczna lub badanie przesiewowe mAb oparte na ELISA) jest potężnym narzędziem do dogłębnej charakterystyki większości głównych glikanów ściany komórkowej, które tworzą biomasę roślinną.Jednak klasyczna analiza glikanów charakteryzuje tylko większe glikany ściany komórkowej, ponieważ większość oligosacharydów nie jest skutecznie immobilizowana na płytkach ELISA.W tym badaniu śrutę kukurydzianą poddaną wstępnej obróbce AFEX poddano enzymatycznej hydrolizie przy wysokiej zawartości substancji stałych.Analizę cukru wykorzystano do określenia składu opornych węglowodanów ściany komórkowej w hydrolizacie.Jednak analiza mAb mniejszych oligosacharydów w hydrolizatach jest niedoceniana i potrzebne są dodatkowe narzędzia, aby skutecznie immobilizować oligosacharydy na płytkach ELISA.
Opisujemy tutaj nową i wydajną metodę immobilizacji oligosacharydów do badań przesiewowych mAb przez połączenie biotynylacji oligosacharydów, a następnie badanie przesiewowe ELISA na płytkach powleczonych NeutrAvidin™.Immobilizowane biotynylowane oligosacharydy wykazywały wystarczające powinowactwo do przeciwciała, aby umożliwić szybkie i skuteczne wykrywanie oligosacharydów opornych.Analiza składu tych uporczywych oligosacharydów oparta na spektrometrii mas potwierdziła wyniki tego nowego podejścia do badań immunoprzesiewowych.Zatem badania te pokazują, że połączenie biotynylacji oligosacharydów i przeszukiwania ELISA z przeciwciałami monoklonalnymi ukierunkowanymi na glikany może być stosowane do wykrywania usieciowania w oligosacharydach i może być szeroko stosowane w innych badaniach biochemicznych charakteryzujących strukturę oligosacharydów.
Ta oparta na biotynie metoda profilowania glikanów jest pierwszym raportem umożliwiającym zbadanie opornych wiązań węglowodanowych rozpuszczalnych oligosacharydów w biomasie roślinnej.Pomaga to zrozumieć, dlaczego niektóre części biomasy są tak uparte, jeśli chodzi o produkcję biopaliw.Ta metoda wypełnia ważną lukę w metodach analizy glikomu i rozszerza jej zastosowanie na szerszy zakres substratów poza oligosacharydami roślinnymi.W przyszłości możemy wykorzystać robotykę do biotynylacji i wykorzystać opracowaną przez nas metodę do wysokowydajnej analizy próbek metodą ELISA.
Słoma kukurydziana (CS) wyhodowana z nasion hybryd Pioneer 33A14 została zebrana w 2010 roku z Kramer Farms w Ray w Kolorado.Za zgodą właściciela gruntu biomasa ta może być wykorzystana do badań. Próbki przechowywano w stanie suchym < 6% wilgoci w torebkach strunowych w temperaturze pokojowej. Próbki przechowywano w stanie suchym < 6% wilgoci w torebkach strunowych w temperaturze pokojowej. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Próbki przechowywano w stanie suchym przy wilgotności <6% w zamykanych torebkach w temperaturze pokojowej.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Próbki przechowuje się w woreczkach strunowych w temperaturze pokojowej o wilgotności < 6%.Badanie było zgodne z lokalnymi i krajowymi wytycznymi.Analizę składu przeprowadzono stosując protokół NREL.Stwierdzono, że kompozycja zawiera 31,4% glukanu, 18,7% ksylanu, 3,3% arabinanu, 1,2% galaktanu, 2,2% acetylu, 14,3% ligniny, 1,7% białka i 13,4% popiołu.
Cellic® CTec2 (138 mg białka/ml, seria VCNI 0001) jest złożoną mieszaniną celulazy, β-glukozydazy i Cellic® HTec2 (157 mg białka/ml, seria VHN00001) z firmy Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg białka/ml), złożona mieszanka enzymów rozkładających pektynę, została podarowana przez firmę DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Stężenia białek enzymatycznych określono przez oszacowanie zawartości białka (i odjęcie udziału azotu niebiałkowego) przy użyciu analizy azotu Kjeldahla (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Ziemię okrzemkową 545 zakupiono od EMD Millipore (Billerica, MA).Węgiel aktywny (DARCO, granulki 100 mesh), Avicel (PH-101), ksylan bukowy i wszystkie inne chemikalia zakupiono od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Wstępną obróbkę AFEX przeprowadzono w GLBRC (Laboratorium Badań nad Konwersją Biomasy, MSU, Lansing, MI, USA).Obróbkę wstępną prowadzono w temperaturze 140°C przez 15 minut.46 czas przebywania przy stosunku 1:1 bezwodnego amoniaku do biomasy przy 60% (wag./wag.) załadowaniu w laboratoryjnym reaktorze okresowym ze stali nierdzewnej (Parr Instruments Company).Zajęło to 30 minut.Reaktor ogrzano do 140°C i szybko uwolniono amoniak, co umożliwiło szybki powrót biomasy do temperatury pokojowej.Skład maku do kukurydzy poddanego wstępnej obróbce AFEX (ACS) był podobny do składu maku do kukurydzy poddanego obróbce wstępnej (UT-CS).
Jako materiał wyjściowy do produkcji oligosacharydów na dużą skalę przygotowano ACSH 25% (wag./wag.) (obciążenie około 8% dekstranem).Hydrolizę enzymatyczną ACS przeprowadzono stosując komercyjną mieszaninę enzymów zawierającą Cellic® Ctec2 10 mg białka/g glukanu (we wstępnie przetworzonej biomasie), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg białka/g glukanu i Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg białka/g dekstranu.Hydrolizę enzymatyczną prowadzono w 5-litrowym bioreaktorze o roboczej objętości 3 litry, pH 4,8, 50°C i 250 obr./min.Po hydrolizie przez 96 godzin hydrolizat zebrano przez wirowanie przy 6000 obr./min przez 30 minut, a następnie przy 14000 obr./min przez 30 minut w celu usunięcia niezhydrolizowanych substancji stałych.Hydrolizat poddano następnie sterylnej filtracji przez zlewkę z filtrem 0,22 mm.Przesączony hydrolizat przechowywano w sterylnych butelkach w 4°C, a następnie frakcjonowano na węglu.
Analiza składu próbek biomasy ekstraktowej zgodnie z procedurami analiz laboratoryjnych NREL: przygotowanie próbek do analizy składu (NREL/TP-510-42620) oraz oznaczenie węglowodanów strukturalnych i ligniny w biomasie (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analizę oligosacharydów strumienia hydrolizatu przeprowadzono w skali 2 ml stosując autoklawową metodę hydrolizy kwasowej.Zmieszać próbkę hydrolizatu z 69,7 µl 72% kwasu siarkowego w 10 ml zakręcanej probówce hodowlanej i inkubować przez 1 godzinę na stole laboratoryjnym w temperaturze 121°C, schłodzić na lodzie i przefiltrować do fiolki do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).Stężenie oligosacharydów oznaczano odejmując stężenie monosacharydów w próbce niehydrolizowanej od całkowitego stężenia cukru w ​​próbce hydrolizowanej kwasem.
Stężenia glukozy, ksylozy i arabinozy w biomasie poddanej hydrolizie kwasowej analizowano przy użyciu systemu Shimadzu HPLC wyposażonego w autosampler, podgrzewacz kolumny, pompę izokratyczną i detektor współczynnika załamania światła na kolumnie Bio-Rad Aminex HPX-87H.Kolumnę utrzymywano w 50°C i eluowano 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 w wodzie.przepływ.
Supernatant hydrolizatu rozcieńczono i zanalizowano pod kątem zawartości monomerów i oligosacharydów.Cukry monomeryczne otrzymane po hydrolizie enzymatycznej analizowano metodą HPLC wyposażoną w kolumnę Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P i kolumnę ash guard.Temperaturę kolumny utrzymywano na poziomie 80°C, jako fazę ruchomą stosowano wodę z szybkością przepływu 0,6 ml/min.Oligosacharydy oznaczano przez hydrolizę w rozcieńczonym kwasie w temperaturze 121°C zgodnie z metodami opisanymi w pozycjach literaturowych.41, 48, 49.
Analizę sacharydów przeprowadzono na surowych, poddanych wstępnej obróbce AFEX i wszystkich niezhydrolizowanych pozostałościach biomasy (w tym produkcję seryjnych ekstraktów ze ścian komórkowych i ich przeszukiwanie mAb) przy użyciu wcześniej opisanych procedur 27, 43, 50, 51 .Do analizy glikomu nierozpuszczalne w alkoholu pozostałości materiału ściany komórkowej roślin są przygotowywane z pozostałości biomasy i poddawane seryjnej ekstrakcji z użyciem coraz bardziej agresywnych odczynników, takich jak szczawian amonu (50 mM), węglan sodu (50 mM i 0,5% w/v), CON.(1M i 4M, oba z 1% wag./obj. borowodorku sodu) i kwaśny chloryn, jak opisano wcześniej52,53.Ekstrakty poddano następnie testowi ELISA wobec złożonego panelu mAb50 skierowanego do glikanu ściany komórkowej, a reakcje wiązania mAb przedstawiono jako mapę cieplną.mAb ukierunkowane na glikan ściany komórkowej roślin zakupiono z zapasów laboratoryjnych (serie CCRC, JIM i MAC).
Jednoetapowa biotynylacja oligosacharydów.Sprzęganie węglowodanów z biotyną-LC-hydrazydem przeprowadzono stosując następującą procedurę.Biotyna-LC-hydrazyd (4,6 mg/12 μmol) rozpuszczono w sulfotlenku dimetylu (DMSO, 70 μl) energicznie mieszając i ogrzewając w temperaturze 65°C przez 1 min.Dodano lodowaty kwas octowy (30 µl) i mieszaninę wlano do cyjanoborowodorku sodu (6,4 mg/100 µmol) i całkowicie rozpuszczono po ogrzewaniu w temperaturze 65°C przez około 1 minutę.Następnie od 5 do 8 μl mieszaniny reakcyjnej dodano do wysuszonego oligosacharydu (1-100 nmol) w celu uzyskania 10-krotnego lub więcej molowego nadmiaru znacznika na redukującym końcu.Reakcję prowadzono w temperaturze 65°C przez 2 godziny, po czym próbki natychmiast oczyszczono.W doświadczeniach znakowania bez redukcji nie stosowano cyjanoborowodorku sodu, a próbki poddawano reakcji w temperaturze 65°C przez 2,5 godziny.
Powlekanie ELISA i przemywanie próbek biotynylowanych oligosacharydów.Do każdej studzienki płytki pokrytej awidyną dodano 25 μl biotynylowanych próbek (100 μl każdej zatężonej próbki rozcieńczonej w 5 ml 0,1 M roztworu buforowego Tris (TBS)).Studzienki kontrolne pokryto 50 μl biotyny w stężeniu 10 μg/ml w 0,1 M TBS.Woda dejonizowana została użyta jako powłoka dla ślepych pomiarów.Tabletkę inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.Płytkę przemyć 3 razy 0,1% odtłuszczonym mlekiem w 0,1 M TBS używając programu nr.11 dla mieszkania Greniera 3A.
Dodawanie i przemywanie przeciwciał pierwszorzędowych.Dodać 40 µl pierwszorzędowego przeciwciała do każdego dołka.Inkubować mikropłytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.Płytki następnie przemyto 3 razy 0,1% mlekiem w 0,1 M TBS stosując program przemywania nr 11 dla Grenier Flat 3A.
Dodać drugorzędowe przeciwciało i przemyć.Do każdej studzienki dodać 50 µl drugorzędowego przeciwciała myszy/szczura (rozcieńczonego 1:5000 w 0,1% mleku w 0,1 M TBS).Inkubować mikropłytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.Następnie mikropłytki przemyto 5 razy 0,1% mlekiem w 0,1 M TBS stosując program przemywania płytek Grenier Flat 5A nr 12.
Dodanie podłoża.Dodać 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB) do podłoża podstawowego (dodając 2 krople buforu, 3 krople TMB, 2 krople nadtlenku wodoru do 15 ml wody dejonizowanej).Przygotuj podłoże TMB.i worteksować przed użyciem).Inkubować mikropłytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.W ciemności.
Wykonaj krok i przeczytaj tabliczkę.Dodać 50 µl 1 N kwasu siarkowego do każdego dołka i zanotować absorbancję od 450 do 655 nm za pomocą czytnika ELISA.
Przygotować 1 mg/ml roztwory tych analitów w wodzie dejonizowanej: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksyloza, kwas galakturonowy (GalA), kwas glukuronowy (GlcA), mannoza, glukoza, galaktoza, laktoza, N-acetylomannozamina (manNAc), N-acetyloglukozamina.(glcNAc), N-acetylogalaktozamina (galNAc), inozytol (wzorzec wewnętrzny).Przygotowano dwa standardy dodając roztwory cukru o stężeniu 1 mg/ml przedstawione w Tabeli 1. Próbki zamraża się i liofilizuje w temperaturze -80°C aż do usunięcia całej wody (zwykle około 12-18 godzin).
Dodać 100–500 µg próbki do zakręcanych probówek na wadze analitycznej.Zapisz dodaną ilość.Próbkę najlepiej rozpuścić w rozpuszczalniku o określonym stężeniu i dodać do probówki jako płynną porcję.Użyj 20 µl inozytolu o stężeniu 1 mg/ml jako standardu wewnętrznego dla każdej probówki z próbką.Ilość wzorca wewnętrznego dodana do próbki musi być taka sama jak ilość wzorca wewnętrznego dodana do probówki wzorcowej.
Dodać 8 ml bezwodnego metanolu do zakręcanej fiolki.Następnie 4 ml 3 N metanolowego roztworu HCl, zakręcić i wstrząsnąć.Ten proces nie wykorzystuje wody.
Dodać 500 µl 1 M roztworu HCl w metanolu do próbek oligosacharydów i standardowych probówek TMS.Próbki inkubowano przez noc (168 godzin) w temperaturze 80°C w bloku termicznym.Wysuszyć produkt metanolizy w temperaturze pokojowej za pomocą kolektora suszącego.Dodać 200 µl MeOH i ponownie wysuszyć.Proces ten powtarza się dwukrotnie.Dodać do próbki 200 µl metanolu, 100 µl pirydyny i 100 µl bezwodnika octowego i dobrze wymieszać.Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut.i suszone.Dodać 200 µl metanolu i ponownie wysuszyć.
Dodaj 200 µl Tri-Sil i zamknij probówkę termiczną na 20 minut.80°C, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.Użyj kolektora suszącego, aby dalej wysuszyć próbkę do objętości około 50 µl.Należy zauważyć, że nie dopuściliśmy do całkowitego wyschnięcia próbek.
Dodać 2 ml heksanu i dobrze wymieszać przez worteksowanie.Napełnij końcówki pipet Pasteura (5-8 mm) kawałkiem waty szklanej, umieszczając wełnę szklaną na wierzchu pipety o średnicy 5-3/4 cala.Próbki wirowano przy 3000 g przez 2 minuty.Wytrącają się wszelkie nierozpuszczalne pozostałości.Wysuszyć próbkę do objętości 100-150 µl.Objętość około 1 μl wstrzyknięto do GC-MS w początkowej temperaturze 80 ° C i początkowym czasie 2, 0 minut (tabela 2).