Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රවුසර අනුවාදයට සීමිත CSS සහය ඇත.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා මාදිලිය අක්‍රිය කරන්න).මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය ලබා දෙන්නෙමු.
AFEX සමඟ පූර්ව ප්‍රතිකාර කරන ලද බඩ ඉරිඟු උදුනෙහි පවතින ස්ථීර ඔලිගෝසැකරයිඩවල සංකීර්ණ විශ්ලේෂණය සඳහා නව ප්‍රතිශක්තිකරණ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂ ක්‍රම.ලිග්නොසෙලියුලෝසික් ජෛව ස්කන්ධ යනු පොසිල ඉන්ධන සඳහා තිරසාර විකල්පයක් වන අතර ආහාර, ආහාර, ඉන්ධන සහ රසායනික ද්‍රව්‍ය වැනි නිෂ්පාදන නිෂ්පාදනය සඳහා ජෛව තාක්‍ෂණය දියුණු කිරීම සඳහා බහුලව භාවිතා වේ.මෙම තාක්ෂණයන් සඳහා යතුර වන්නේ ශාක සෛල බිත්තිවල ඇති සංකීර්ණ කාබෝහයිඩ්රේට ග්ලූකෝස්, සයිලෝස් සහ ඇරබිනෝස් වැනි සරල සීනි බවට පරිවර්තනය කිරීම සඳහා පිරිවැය-තරඟකාරී ක්රියාවලීන් වර්ධනය කිරීමයි.ලිග්නොසෙලියුලෝසික් ජෛව ස්කන්ධය ඉතා මුරණ්ඩු බැවින්, එය අපේක්ෂිත නිෂ්පාදනය ලබා ගැනීම සඳහා තාප රසායනික ප්‍රතිකාර (උදා: ඇමෝනියා තන්තු පිටකිරීම (AFEX), තනුක අම්ල (DA), අයනික ද්‍රව (IL)) සහ ජීව විද්‍යාත්මක ප්‍රතිකාර (උදා: එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය සහ ක්ෂුද්‍රජීවී පැසවීම) වලට භාජනය කළ යුතුය..කෙසේ වෙතත්, ජල විච්ඡේදනය කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී වාණිජ දිලීර එන්සයිම භාවිතා කරන විට, සෑදෙන ද්‍රාව්‍ය සීනි වලින් 75-85% ක් පමණක් මොනොසැකරයිඩ වන අතර ඉතිරි 15-25% ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්ට සැමවිටම ලබා ගත නොහැකි ද්‍රාව්‍ය, අස්ථායී ඔලිගෝසැකරයිඩ වේ.මීට පෙර, අපි කාබන් සහ ඩයටෝමැසියස් පෘථිවි වෙන් කිරීම සහ ප්‍රමාණය බැහැර කිරීමේ වර්ණදේහවල සංයෝජනයක් භාවිතා කරමින් ද්‍රාව්‍ය මුරණ්ඩු ඔලිගොසැකරයිඩ සාර්ථකව හුදකලා කර පිරිසිදු කර ඇති අතර ඒවායේ එන්සයිම නිෂේධන ගුණාංග ද විමර්ශනය කර ඇත.අඩු DP සහ උදාසීන oligosaccharides වලට වඩා ඉහළ මට්ටමේ බහුඅවයවීකරණය (DP) මෙතිලේටඩ් යූරොනික් අම්ල ආදේශන අඩංගු ඔලිගොසැකරයිඩ වාණිජ එන්සයිම මිශ්‍රණ සමඟ සැකසීමට අපහසු බව අපි සොයාගෙන ඇත.ශාක සෛල බිත්ති සහ එන්සයිම හයිඩ්‍රොලයිසේට් වල ග්ලයිකාන් බන්ධන සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා ශාක ජෛව ස්කන්ධ ග්ලයිකන් සඳහා විශේෂිත වූ මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ (mAbs) භාවිතා කරමින් glycan පැතිකඩ කිරීම ඇතුළු අමතර ක්‍රම කිහිපයක් භාවිතා කිරීම අපි මෙහිදී වාර්තා කරමු..MALDI-TOF-MS) සෘණ අයනවල ද්විතියික ක්ෂය වීමෙන් පසු වර්ණාවලීක්ෂය මගින් ලබාගත් ව්‍යුහය-තොරතුරු රෝග විනිශ්චය උච්චයන්, වායු වර්ණදේහ විද්‍යාව සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (GC-MS) ව්‍යුත්පන්න කිරීම සමඟ සහ රහිතව ඔලිගොසැකරයිඩ බන්ධන සංලක්ෂිත කිරීමට භාවිතා කරයි.ඔලිගොසැකරයිඩ (DP 4-20) කුඩා ප්‍රමාණය නිසා මෙම අණු mAb බන්ධනය සහ ගුනාංගීකරනය සඳහා භාවිතා කිරීමට අපහසු වේ.මෙම ගැටළුව මඟහරවා ගැනීම සඳහා, අපි මයික්‍රොප්ලේට් මතුපිට අඩු DP ද්‍රාව්‍ය ඔලිගොසැකරයිඩ බහුතරයක් සාර්ථකව ලේබල් කරන ලද නව biotin conjugation-based oligosaccharide immobilization ක්‍රමයක් යෙදුවෙමු, පසුව එය විශේෂිත බන්ධන විශ්ලේෂණය සඳහා ඉහළ ප්‍රතිදාන mAb පද්ධතියක භාවිතා කරන ලදී.මෙම නව ක්‍රමය අනාගතයේ දී වඩාත් දියුණු අධි ප්‍රතිදාන ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණයන් සංවර්ධනය කිරීමට පහසුකම් සපයනු ඇති අතර එය රෝග විනිශ්චය අරමුණු සඳහා ජෛව සලකුණු වල ඇති ඔලිගෝසැකරයිඩ හුදකලා කිරීමට සහ සංලක්ෂිත කිරීමට භාවිතා කරයි.
කෘෂිකාර්මික, වන වගා, තෘණ සහ දැවමය ද්‍රව්‍ය වලින් සමන්විත ලිග්නොසෙලියුලෝසික් ජෛව ස්කන්ධය, ඉහළ වටිනාකමක් ඇති නිෂ්පාදන නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා ආහාර, ආහාර, ඉන්ධන සහ රසායනික පූර්වගාමීන් ඇතුළු ජෛව පාදක නිෂ්පාදන නිෂ්පාදනය සඳහා විභව පෝෂකයකි.ශාක සෛල බිත්තිවල ඇති කාබෝහයිඩ්‍රේට් (සෙලියුලෝස් සහ හෙමිසෙලුලෝස් වැනි) රසායනික සැකසුම් සහ ජෛව පරිවර්තනය (එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය සහ ක්ෂුද්‍රජීවී පැසවීම වැනි) මගින් මොනොසැකරයිඩ බවට ඩිපොලිමර්කරණය කරනු ලැබේ.සාමාන්‍ය පූර්ව ප්‍රතිකාර අතර ඇමෝනියා තන්තු ප්‍රසාරණය (AFEX), තනුක අම්ලය (DA), අයනික ද්‍රව (IL) සහ වාෂ්ප පිපිරීම (SE), ශාක සෛල බිත්ති විවෘත කිරීම මගින් ලිග්නොසෙලියුලෝස් නිෂ්පාදනය අඩු කිරීම සඳහා රසායනික ද්‍රව්‍ය සහ තාප සංයෝගයක් භාවිතා කරයි.ද්‍රව්‍යයේ මුරණ්ඩු බව, 5. එන්සයිම ජලවිච්ඡේදනය වාණිජමය ක්‍රියාකාරී කාබෝහයිඩ්‍රේට් අඩංගු එන්සයිම (CAZymes) භාවිතා කරමින් ඉහළ ඝන ද්‍රව්‍ය බරකදී සිදු කරනු ලබන අතර ජෛව පාදක ඉන්ධන සහ රසායනික ද්‍රව්‍ය නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා ජානමය යීස්ට් හෝ බැක්ටීරියා භාවිතයෙන් ක්ෂුද්‍රජීවී පැසවීම 6 .
වාණිජ එන්සයිමවල ඇති CAZymes සමන්විත වන්නේ සංකීර්ණ කාබෝහයිඩ්‍රේට්-සීනි බන්ධන ඒකාබද්ධ කර මොනොසැකරයිඩ 2,7 සාදනු ලබන එන්සයිමවල සංකීර්ණ මිශ්‍රණයකිනි.අප කලින් වාර්තා කළ පරිදි, කාබෝහයිඩ්‍රේට් සමඟ ලිග්නින් ඇරෝමැටික බහු අවයවක සංකීර්ණ ජාලය ඒවා අධික ලෙස අශෝභන බවට පත් කරයි, එය අසම්පූර්ණ සීනි පරිවර්තනයකට තුඩු දෙයි, පෙර සැකසූ ජෛව ස්කන්ධයේ එන්සයිම ජල විච්ඡේදනයේදී නිපදවන්නේ නැති ලිංගික ඔලිගොසැකරයිඩ වලින් 15-25% ක් එකතු වේ.විවිධ ජෛව ස්කන්ධ පූර්ව ප්‍රතිකාර ක්‍රම සමඟ මෙය පොදු ගැටළුවකි.ජල විච්ඡේදනය අතරතුර එන්සයිම නිෂේධනය වීම හෝ ශාක ජෛව ස්කන්ධවල සීනි බන්ධන බිඳීමට අවශ්‍ය අත්‍යවශ්‍ය එන්සයිම නොමැති වීම හෝ අඩු මට්ටමක පැවතීම මෙම බාධකයට හේතු වේ.ඔලිගෝසැකරයිඩවල ඇති සීනි බන්ධන වැනි සීනිවල සංයුතිය සහ ව්‍යුහාත්මක ලක්ෂණ අවබෝධ කර ගැනීම, ජල විච්ඡේදනය අතරතුර සීනි පරිවර්තනය වැඩි දියුණු කිරීමට උපකාරී වනු ඇත, ජෛව තාක්‍ෂණ ක්‍රියාවලීන් ඛනිජ තෙල් ව්‍යුත්පන්න නිෂ්පාදන සමඟ පිරිවැය-තරඟකාරී කරයි.
කාබෝහයිඩ්‍රේටවල ව්‍යුහය නිර්ණය කිරීම අභියෝගාත්මක වන අතර ද්‍රව වර්ණදේහ (LC)11,12, න්‍යෂ්ටික චුම්භක අනුනාද වර්ණාවලීක්ෂය (NMR)13, කේශනාලිකා විද්‍යුත් විච්ඡේදනය (CE)14,15,16 සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (MS)17 වැනි ක්‍රමවල එකතුවක් අවශ්‍ය වේ., දහඅට.කාබෝහයිඩ්‍රේට් ව්‍යුහයන් හඳුනා ගැනීම සඳහා MS ක්‍රම වන ලේසර් අවශෝෂණ හා අනුකෘතියක් (MALDI-TOF-MS) භාවිතයෙන් අයනීකරණය සමඟ පියාසර කරන වේලාවේ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය වැනි බහුකාර්ය ක්‍රමයකි.මෑතදී, ඝට්ටන-ප්‍රේරිත විඝටනය (CID) ටැන්ඩම් එම්එස් හි සෝඩියම් අයන එකතු කිරීම ඔලිගෝසැකරයිඩ ඇමුණුම් ස්ථාන, ඇනෝමරික් වින්‍යාස කිරීම්, අනුපිළිවෙලවල් සහ ශාඛා ස්ථාන 20, 21 ට අනුරූප ඇඟිලි සලකුණු හඳුනා ගැනීම සඳහා බහුලව භාවිතා වේ.
Glycan විශ්ලේෂණය යනු කාබෝහයිඩ්‍රේට් බන්ධන ගැඹුරින් හඳුනා ගැනීම සඳහා විශිෂ්ට මෙවලමකි22.මෙම ක්‍රමය සංකීර්ණ කාබෝහයිඩ්‍රේට් සම්බන්ධතා අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා පරීක්ෂණ ලෙස සෛල බිත්ති ග්ලයිකාන් සිටුවීමට යොමු කරන මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ (mAbs) භාවිතා කරයි.විවිධ saccharides භාවිතා කරමින් විවිධ රේඛීය සහ අතු බෙදී ඇති oligosaccharides වලට එරෙහිව නිර්මාණය කර ඇති mAbs 250 කට වඩා ලොව පුරා පවතී.ශාක සෛල වර්ගය, ඉන්ද්‍රිය, වයස, සංවර්ධන අවධිය සහ වර්ධන පරිසරය අනුව සැලකිය යුතු වෙනස්කම් ඇති බැවින්, ශාක සෛල බිත්තියේ ව්‍යුහය, සංයුතිය සහ වෙනස් කිරීම් සංලක්ෂිත කිරීමට mAbs කිහිපයක් බහුලව භාවිතා වේ.වඩාත් මෑතක දී, මෙම ක්‍රමය උප සෛලීය සලකුණු, සංවර්ධන අවධීන් හෝ පාරිසරික උත්තේජක මගින් තීරණය වන පරිදි ශාක හා සත්ත්ව පද්ධතිවල වෙසිලි ජනගහන සහ ග්ලයිකන් ප්‍රවාහනයේදී ඒවායේ අදාළ භූමිකාවන් අවබෝධ කර ගැනීමට සහ එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් තීරණය කිරීමට භාවිතා කර ඇත.හඳුනාගෙන ඇති ග්ලයිකන් සහ සයිලන් වල විවිධ ව්‍යුහයන් අතරට පෙක්ටීන් (P), සයිලන් (X), මන්නන් (M), සයිලොග්ලුකන්ස් (XylG), මිශ්‍ර බන්ධන ග්ලූකන් (MLG), ඇරබිනොක්සිලාන් (ArbX), galactomannan (GalG) , glucuronic) සහ GArabinoxylanact a-2. 9.
කෙසේ වෙතත්, මෙම සියලු පර්යේෂණ ප්‍රයත්නයන් නොතකා, ඔලිගෝසැකරයිඩ මුදා හැරීම, ජල විච්ඡේදනයේදී ඔලිගෝමරික් දාමයේ දිග වෙනස්වීම්, විවිධ අඩු DP බහු අවයවක සහ ඒවායේ වක්‍ර ඇතුළුව, අධික ඝන ද්‍රව්‍ය බර (HSL) ජල විච්ඡේදනය තුළ ඔලිගොසැකරයිඩ සමුච්චය වීමේ ස්වභාවය පිළිබඳව අධ්‍යයනයන් කිහිපයක් පමණක් අවධානය යොමු කර ඇත.බෙදාහැරීම් 30,31,32.මේ අතර, glycan විශ්ලේෂණය ග්ලයිකන් ව්‍යුහය පිළිබඳ පුළුල් විශ්ලේෂණයක් සඳහා ප්‍රයෝජනවත් මෙවලමක් බව ඔප්පු වී ඇතත්, ප්‍රතිදේහ ක්‍රම භාවිතයෙන් ජලයේ ද්‍රාව්‍ය අඩු DP ඔලිගෝසැකරයිඩ ඇගයීම අපහසුය.5-10 kDa ට වඩා අඩු අණුක බරක් සහිත කුඩා DP oligosaccharides ELISA තහඩු 33, 34 සමඟ බැඳෙන්නේ නැති අතර ප්‍රතිදේහ එකතු කිරීමට පෙර සෝදා හරිනු ලැබේ.
මෙහිදී, ප්‍රථම වතාවට, අපි ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණය සමඟ ද්‍රාව්‍ය පරාවර්තක ඔලිගොසැකරයිඩ සඳහා එක්-පියවර බයෝටයිනයිලේෂන් ක්‍රියා පටිපාටියක් ඒකාබද්ධ කරමින් මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ භාවිතා කරමින් avidin-ආලේපිත තහඩු මත ELISA විශ්ලේෂණයක් නිරූපණය කරමු.ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණය සඳහා අපගේ ප්‍රවේශය MALDI-TOF-MS සහ GC-MS පදනම් කරගත් පරිපූරක ඔලිගෝසැකරයිඩ සම්බන්ධ විශ්ලේෂණය මගින් හයිඩ්‍රොලිසයිඩ් සීනි සංයුතිවල ට්‍රයිමෙතිල්සිලිල් (TMS) ව්‍යුත්පන්න කිරීම මගින් තහවුරු කරන ලදී.මෙම නව්‍ය ප්‍රවේශය අනාගතයේ දී ඉහළ කාර්යක්‍ෂම ක්‍රමයක් ලෙස සංවර්ධනය කළ හැකි අතර ජෛව වෛද්‍ය පර්යේෂණ සඳහා පුළුල් යෙදුමක් සොයාගත හැකිය35.
Glycosylation වැනි එන්සයිම සහ ප්‍රතිදේහ වල පශ්චාත් පරිවර්තන වෙනස් කිරීම්,36 ඔවුන්ගේ ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් වලට බලපායි.උදාහරණයක් ලෙස, සෙරුමය ප්‍රෝටීන වල ග්ලයිකොසයිලේෂන් වෙනස්වීම් ගිනි අවුලුවන ආතරයිටිස් සඳහා වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි, සහ ග්ලයිකෝසයිලේෂන් හි වෙනස්වීම් රෝග විනිශ්චය සලකුණු ලෙස භාවිතා කරයි37.ආමාශ ආන්ත්රයික පත්රිකාවේ සහ අක්මාවේ නිදන්ගත ගිනි අවුලුවන රෝග, වෛරස් ආසාදන, ඩිම්බකෝෂ, පියයුරු සහ පුරස්ථි ග්‍රන්ථි පිළිකා ඇතුළු විවිධ රෝග වල විවිධ ග්ලයිකන් පහසුවෙන් පෙනී සිටින බව සාහිත්‍යයේ වාර්තා වී ඇත.ප්‍රතිදේහ මත පදනම් වූ ග්ලයිකාන් ELISA ක්‍රම භාවිතා කරමින් ග්ලයිකන් වල ව්‍යුහය අවබෝධ කර ගැනීම සංකීර්ණ MS ක්‍රම භාවිතයෙන් තොරව රෝග විනිශ්චය සඳහා අමතර විශ්වාසයක් ලබා දෙනු ඇත.
අපගේ පෙර අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කළේ පෙර ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් සහ එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය කිරීමෙන් පසුව මුරණ්ඩු ඔලිගොසැකරයිඩ ජල විච්ඡේදනය නොවී පවතින බවයි (රූපය 1).අපගේ පෙර ප්‍රකාශිත කාර්යයේදී, අපි AFEX-පෙර ප්‍රතිකාර කළ ඉරිඟු ස්ටෝවර් හයිඩ්‍රොලයිසේට් (ACSH)8 වෙතින් ඔලිගොසැකරයිඩ හුදකලා කිරීමට සක්‍රිය අඟුරු ඝන-අදියර නිස්සාරණ ක්‍රමයක් සකස් කළෙමු.මුලික නිස්සාරණයෙන් සහ වෙන්වීමෙන් පසුව, ඔලිගොසැකරයිඩ තවදුරටත් ප්‍රමාණයෙන් බැහැර වර්ණදේහ (SEC) මගින් කොටස් කර අණුක බර අනුපිළිවෙලින් එකතු කරන ලදී.විවිධ පූර්ව ප්‍රතිකාර වලින් නිකුත් කරන ලද සීනි මොනෝමර් සහ ඔලිගොමර් සීනි සංයුතිය විශ්ලේෂණය මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.විවිධ පූර්ව ප්‍රතිකාර ක්‍රම මගින් ලබාගත් සීනි ඔලිගොමර්වල අන්තර්ගතය සංසන්දනය කිරීමේදී, ජීව ස්කන්ධය මොනොසැකරයිඩ බවට පරිවර්තනය කිරීමේදී මුරණ්ඩු ඔලිගොසැකරයිඩ තිබීම පොදු ගැටළුවක් වන අතර අවම වශයෙන් 10-15% කින් සහ 18% දක්වා සීනි අස්වැන්න අඩු කිරීමට හේතු විය හැක.අප.මෙම ක්‍රමය ඔලිගොසැකරයිඩ කොටස් තවදුරටත් මහා පරිමාණයෙන් නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා යොදා ගනී.මෙම කාර්යයේ දී ඔලිගෝසැකරයිඩවල ගුනාංගීකරනය සඳහා පර්යේෂණාත්මක ද්රව්යයක් ලෙස විවිධ අණුක බර සහිත එහි ප්රතිඵලයක් ලෙස ACH සහ එහි පසුකාලීන කොටස් භාවිතා කරන ලදී.
පූර්ව ප්‍රතිකාර සහ එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය කිරීමෙන් පසුව, නොනැසී පවතින ඔලිගොසැකරයිඩ ජල විච්ඡේදනය නොවී පැවතුනි.මෙහි (A) ඔලිගොසැකරයිඩ වෙන් කිරීමේ ක්‍රමයකි, එහි සක්‍රිය කාබන් සහ ඩයටෝමැසියස් පෘථිවි ඇසුරුම් කළ ඇඳක් භාවිතා කරමින් AFEX-පෙර ප්‍රතිකාර කළ ඉරිඟු ස්ටෝවර් හයිඩ්‍රොලයිසේට් (ACSH) වෙතින් ඔලිගොසැකරයිඩ හුදකලා කරනු ලැබේ;(B) ඔලිගෝසැකරයිඩ වෙන් කිරීමේ ක්‍රමය.ඔලිගොසැකරයිඩ තවදුරටත් ප්‍රමාණයෙන් බැහැර වර්ණදේහ (SEC) මගින් වෙන් කරන ලදී;(C) විවිධ පූර්ව ප්‍රතිකාර වලින් නිකුත් කරන ලද සැකරයිඩ මොනෝමර් සහ ඔලිගොමර් (තනුක කළ අම්ලය: DA, අයනික ද්‍රව: IL සහ AFEX).එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය තත්ත්වයන්: 25% (w/w) අධික ඝන ද්‍රව්‍ය පැටවීම (ආසන්න වශයෙන් 8% ග්ලූකන් පැටවීම), පැය 96 ජල විච්ඡේදනය, 20 mg/g වාණිජ එන්සයිම පැටවීම (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 අනුපාතය) සහ (D) ෂුගර් මොනෝමර්, ග්ලූකෝරෝසෙට් සහ ඔලිකොරොසෙට් වලින් නිකුත් කරන ලද ප්‍රීඑක්ස්එක්ස් ඉරිඟු උදුන (ACS).
Glycan විශ්ලේෂණය ඝන ජෛව ස්කන්ධ අපද්‍රව්‍ය වලින් හුදකලා වූ නිස්සාරකවල ග්ලයිකානවල විස්තීර්ණ ව්‍යුහාත්මක විශ්ලේෂණයක් සඳහා ප්‍රයෝජනවත් මෙවලමක් බව ඔප්පු වී ඇත.කෙසේ වෙතත්, මෙම සාම්ප්‍රදායික ක්‍රමය භාවිතා කරමින් ජලයේ ද්‍රාව්‍ය සැකරයිඩ අඩුවෙන් නියෝජනය වේඑබැවින්, ප්‍රතිදේහ බන්ධනය සහ ගුනාංගීකරනය සඳහා, avidin-ආලේපිත ELISA තහඩු මත ද්‍රාව්‍ය, අනුකූල නොවන oligosaccharides ආලේප කිරීම සඳහා එක්-පියවර biotinylation ක්‍රමයක් භාවිතා කරන ලදී.මෙම ක්‍රමය අප විසින් කලින් නිපදවන ලද ACSH සහ එහි අණුක බර (හෝ බහුඅවයවීකරණයේ උපාධිය, DP) මත පදනම් වූ කොටසක් භාවිතා කර පරීක්ෂා කරන ලදී.කාබෝහයිඩ්රේට අඩු කරන අන්තයට biotin-LC-hydrazide එකතු කිරීම මගින් oligosaccharide බන්ධන සම්බන්ධතාවය වැඩි කිරීම සඳහා එක්-පියවර biotinylation භාවිතා කරන ලදී (රූපය 2).ද්‍රාවණයේදී, අඩු කිරීමේ අන්තයේ ඇති hemiacetal කාණ්ඩය, biotin-LC-hydrazide හි හයිඩ්‍රසයිඩ් කාණ්ඩය සමඟ ප්‍රතික්‍රියා කර හයිඩ්‍රසෝන් බන්ධනයක් සාදයි.NaCNBH3 අඩු කිරීමේ කාරකය හමුවේ, හයිඩ්‍රසෝන් බන්ධනය ස්ථායී බයෝටයිනයිලේටඩ් අවසාන නිෂ්පාදනයක් දක්වා අඩු වේ.සීනි අඩු කිරීමේ අවසානය වෙනස් කිරීමත් සමඟ, අඩු DP ඔලිගොසැකරයිඩ ELISA තහඩුවලට බන්ධනය කිරීමට හැකි වූ අතර, අපගේ අධ්‍යයනයේ දී මෙය ග්ලයිකාන් ඉලක්ක කරගත් mAbs භාවිතයෙන් Avidin-ආලේපිත තහඩු මත සිදු කරන ලදී.
Biotinylated oligosaccharides සඳහා ELISA මත පදනම් වූ monoclonal ප්රතිදේහ පරීක්ෂා කිරීම.මෙහි (A) ඔලිගොසැකරයිඩවල ඒකාබද්ධ biotinylation සහ NeutrAvidin ආලේපිත තහඩු මත glycan-ඉලක්කගත mAbs සමඟ ELISA පරීක්ෂාව සහ (B) ප්‍රතික්‍රියා නිෂ්පාදනවල biotinylation සඳහා එක්-පියවර ක්‍රියා පටිපාටියක් පෙන්වයි.
පසුව oligosaccharide-සංයුක්ත ප්‍රතිදේහ සහිත Avidin-ආලේපිත තහඩු ප්‍රාථමික සහ ද්විතියික ප්‍රතිදේහ වලට එකතු කර ආලෝකය සහ වේලාවට සංවේදී මාධ්‍යයකින් සෝදා ඇත.ප්‍රතිදේහ බන්ධනය සම්පූර්ණ වූ පසු, තහඩුව පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීමට TMB උපස්ථරයක් එක් කරන්න.ප්රතික්රියාව අවසානයේ සල්ෆියුරික් අම්ලය සමඟ නතර විය.ප්‍රතිදේහ-විශේෂිත හරස් සම්බන්ධ කිරීම හඳුනා ගැනීම සඳහා එක් එක් ප්‍රතිදේහයේ බන්ධන ශක්තිය තීරණය කිරීම සඳහා ඉන්කියුබේටඩ් තහඩු ELISA කියවනය භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.අත්හදා බැලීමේ විස්තර සහ පරාමිතීන් සඳහා, "ද්රව්ය සහ ක්රම" අනුරූප කොටස බලන්න.
ACSH හි ඇති ද්‍රාව්‍ය ඔලිගොසැකරයිඩ මෙන්ම ලිග්නොසෙලියුලෝසික් හයිඩ්‍රොලයිසේට් වලින් හුදකලා වූ බොරතෙල් සහ පිරිසිදු කරන ලද ඔලිගොසැකරයිඩ කොටස්වල ඇති ද්‍රාව්‍ය ඔලිගොසැකරයිඩ සංලක්ෂිත කිරීමෙන් විශේෂිත යෙදුම් සඳහා මෙම අලුතින් සංවර්ධනය කරන ලද ක්‍රමයේ උපයෝගීතාව අපි පෙන්නුම් කරමු.රූප සටහන 3 හි පෙන්වා ඇති පරිදි, ACSH හි ජෛව ඇසිලේටඩ් ග්ලයිකෝම් පරීක්ෂණ ක්‍රම භාවිතා කරමින් හඳුනාගෙන ඇති වඩාත් සුලභ එපිටොප්-ආදේශක සයිලන් සාමාන්‍යයෙන් යූරොනික් (යූ) හෝ මෙතිලුරෝනික් (MeU) සහ පෙක්ටික් ඇරබිනොගලැක්ටන් වේ.ඒවායින් බොහොමයක් ජල විච්ඡේදනය නොවන ඝන ද්‍රව්‍යවල (UHS) ග්ලයිකන් විශ්ලේෂණය පිළිබඳ අපගේ පෙර අධ්‍යයනයේ දී ද සොයා ගන්නා ලදී.
සෛල බිත්ති ග්ලයිකාන් වෙත යොමු කරන මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහයක් භාවිතයෙන් ප්‍රතික්‍රියාශීලී ඔලිගොසැකරයිඩ එපිටොප් හඳුනා ගැනීම."උදාසීන" කොටස ACN භාගය වන අතර "ආම්ලික" කොටස FA භාගය වේ.තාප සිතියමේ දීප්තිමත් රතු පැහැයෙන් ඉහළ එපිටොප් අන්තර්ගතයක් පෙන්නුම් කරන අතර දීප්තිමත් නිල් පාටින් හිස් පසුබිමක් දක්වයි.පරිමාණයේ වර්ණ අගයන් N=2 සූත්‍රගත කිරීම් සඳහා අමු OD අගයන් මත පදනම් වේ.ප්‍රතිදේහ මගින් හඳුනාගත් ප්‍රධාන epitopes දකුණු පසින් පෙන්වා ඇත.
මෙම සෙලියුලෝස් නොවන ව්‍යුහයන් පරීක්‍ෂා කරන ලද වාණිජ එන්සයිම මිශ්‍රණයේ ඇති වඩාත් සුලභ සෙලියුලේස් සහ හෙමිසෙලුලේස් මගින් බෙදීමට නොහැකි විය, එයට බහුලව භාවිතා වන වාණිජ එන්සයිම ඇතුළත් වේ.එබැවින් ඒවායේ ජල විච්ඡේදනය සඳහා නව සහායක එන්සයිම අවශ්ය වේ.අවශ්‍ය සෙලියුලෝස් නොවන අමතර එන්සයිම නොමැතිව, මෙම සෙලියුලෝස් නොවන බන්ධන මොනොසැකරයිඩ බවට සම්පූර්ණයෙන් පරිවර්තනය වීම වළක්වයි, ඒවායේ මව් සීනි බහු අවයවයන් කෙටි කොටස්වලට පුළුල් ලෙස ජල විච්ඡේදනය කර වාණිජ එන්සයිම මිශ්‍රණ භාවිතයෙන් විසුරුවා හරිනු ලැබුවද.
සංඥා ව්‍යාප්තිය සහ එහි බන්ධන ශක්තිය පිළිබඳ වැඩිදුර අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කළේ ඩිමර්වල අඩු ඩීපී භාග (ඩී, ඊ, එෆ්, ඩීපී) ට වඩා ඉහළ ඩීපී සීනි කොටස් (ඒ, බී, සී, ඩීපී 20+ දක්වා) බන්ධන එපිටොප් අඩු බවයි (රූපය 1).උදාසීන කොටස් වලට වඩා සෙලියුලෝස් නොවන එපිටොප් වල අම්ල කොටස් බහුලව දක්නට ලැබේ.මෙම සංසිද්ධි අපගේ පෙර අධ්‍යයනයේ දී නිරීක්ෂණය කරන ලද රටාවට අනුකූල වේ, එහිදී ඉහළ DP සහ අම්ල කොටස් එන්සයිම ජල විච්ඡේදනයට වඩා ප්‍රතිරෝධී වේ.එබැවින්, සෙලියුලෝස් නොවන ග්ලයිකන් එපිටොප් සහ U සහ MeU ආදේශක පැවතීම ඔලිගොසැකරයිඩවල ස්ථායීතාවයට බෙහෙවින් දායක විය හැක.අඩු DP oligosaccharides සඳහා බන්ධන සහ හඳුනාගැනීමේ කාර්යක්ෂමතාව ගැටළුකාරී විය හැකි බව සටහන් කළ යුතුය, විශේෂයෙන්ම epitope dimeric හෝ trimeric oligosaccharide නම්.මෙය විවිධ දිගවල වාණිජ ඔලිගොසැකරයිඩ භාවිතයෙන් පරීක්‍ෂා කළ හැකි අතර, ඒ සෑම එකක්ම නිශ්චිත mAb එකකට බන්ධනය වන එක් epitope එකක් පමණක් අඩංගු වේ.
මේ අනුව, ව්‍යුහයට විශේෂිත වූ ප්‍රතිදේහ භාවිතය මගින් ඇතැම් වර්ගවල ප්‍රතිචක්‍රීකරණ බන්ධන අනාවරණය විය.භාවිතා කරන ප්‍රතිදේහ වර්ගය, සුදුසු බන්ධන රටාව සහ එය නිපදවන සංඥාවේ ප්‍රබලත්වය (බොහෝ සහ අවම වශයෙන් බහුල) මත පදනම්ව, නව එන්සයිම හඳුනාගෙන අර්ධ ප්‍රමාණාත්මකව එන්සයිම මිශ්‍රණයට එකතු කිරීමෙන් වඩාත් සම්පූර්ණ ග්ලයිකෝ පරිවර්තන වේ.උදාහරණයක් ලෙස ACSH oligosaccharides විශ්ලේෂණය ගනිමින්, අපට එක් එක් ජෛව ස්කන්ධ ද්රව්ය සඳහා glycan බන්ධන දත්ත ගබඩාවක් නිර්මාණය කළ හැකිය.ප්‍රතිදේහවල විවිධ සම්බන්ධය සැලකිල්ලට ගත යුතු බව මෙහිදී සටහන් කළ යුතු අතර, ඒවායේ සම්බන්ධය නොදන්නා නම්, විවිධ ප්‍රතිදේහවල සංඥා සංසන්දනය කිරීමේදී මෙය යම් යම් දුෂ්කරතා ඇති කරයි.මීට අමතරව, ග්ලයිකන් බන්ධන සංසන්දනය කිරීම එකම ප්‍රතිදේහ සඳහා සාම්පල අතර වඩාත් හොඳින් ක්‍රියා කළ හැකිය.මෙම මුරණ්ඩු බන්ධන පසුව CAZyme දත්ත ගබඩාවට සම්බන්ධ කළ හැකි අතර, එයින් අපට එන්සයිම හඳුනා ගැනීමට, අපේක්ෂක එන්සයිම තෝරා ගැනීමට සහ බන්ධන බිඳීමේ එන්සයිම සඳහා පරීක්ෂා කිරීමට හෝ ජෛව පිරිපහදුවල භාවිතය සඳහා මෙම එන්සයිම ප්‍රකාශ කිරීමට ක්ෂුද්‍රජීවී පද්ධති සංවර්ධනය කිරීමට හැකිය.
lignocellulosic hydrolysates හි පවතින අඩු අණුක බර oligosaccharides ගුනාංගීකරනය කිරීම සඳහා ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්‍රම විකල්ප ක්‍රම පූරණය කරන්නේ කෙසේද යන්න ඇගයීමට, අපි MALDI (පය. 4, S1-S8) සහ GC-MS මත පදනම් වූ TMS-ව්‍යුත්පන්න සැකරයිඩ විශ්ලේෂණය කිරීම (පය. 5) oligosaccharide කොටස.ඔලිගෝසැකරයිඩ අණුවල ස්කන්ධ ව්‍යාප්තිය අපේක්ෂිත ව්‍යුහයට ගැලපේද යන්න සංසන්දනය කිරීමට MALDI භාවිතා කරයි.අත්තික්කා මත.4 උදාසීන සංරචක ACN-A සහ ACN-B හි MC පෙන්වයි.ACN-A විශ්ලේෂණය මගින් DP 4-8 (පය. 4) සිට DP 22 (Fig. S1) දක්වා වූ පෙන්ටෝස් සීනි පරාසයක් තහවුරු කරන ලදී, එහි බර MeU-xylan oligosaccharides වලට අනුරූප වේ.ACN-B විශ්ලේෂණය DP 8-15 සමඟ pentose සහ glucoxylan මාලාව තහවුරු කළේය.රූප සටහන S3 වැනි පරිපූරක ද්‍රව්‍යවල, FA-C ආම්ලික කොටස් ස්කන්ධ බෙදා හැරීමේ සිතියම් මඟින් ELISA-පාදක mAb පරීක්ෂාවේදී සොයාගත් ආදේශක සයිලන්වලට අනුකූල වන (Me)U ආදේශක 8-15 DP සහිත පෙන්ටෝස් සීනි පරාසයක් පෙන්වයි.epitopes අනුකූල වේ.
ACS හි ඇති ද්‍රාව්‍ය අනුකූල නොවන ඔලිගොසැකරයිඩ වල MALDI-MS වර්ණාවලිය.මෙහිදී, (A) මෙතිලේටඩ් යූරොනික් අම්ලය (DP 4-8) අඩංගු ACN-A අඩු බර පරාසයක කොටස් ග්ලූකුරොක්සිලාන් ඔලිගෝසැකරයිඩ සහ (B) ACN-B සයිලාන් සහ මෙතිලේටඩ් යූරෝනික් අම්ලය ඔලිගොසැකරයිඩ ආදේශ කරන ලද (DPP85)
පරාවර්තක ඔලිගෝසැකරයිඩවල ග්ලයිකන් අවශේෂ සංයුතිය විශ්ලේෂණය කිරීම.මෙහි (A) GC-MS විශ්ලේෂණය භාවිතයෙන් ලබාගත් විවිධ ඔලිගෝසැකරයිඩ කොටස්වල TMS සැකරයිඩ සංයුතිය.(B) ඔලිගෝසැකරයිඩවල ඇති විවිධ TMS-ව්‍යුත්පන්න සීනිවල ව්‍යුහයන්.ACN - උදාසීන oligosaccharides අඩංගු acetonitrile භාගය සහ FA - ferulic අම්ල භාගය අම්ල oligosaccharides අඩංගු වේ.
රූප සටහන S9 හි පෙන්වා ඇති පරිදි ඔලිගෝසැකරයිඩ භාගයේ LC-MS විශ්ලේෂණයෙන් තවත් රසවත් නිගමනයක් ලබා ගන්නා ලදී (ක්‍රම ඉලෙක්ට්‍රොනික පරිපූරක ද්‍රව්‍යවල දැකිය හැකිය).ACN-B කොටස බන්ධනය කිරීමේදී හෙක්සෝස් සහ -OAc කාණ්ඩවල කොටස් නැවත නැවතත් නිරීක්ෂණය කරන ලදී.මෙම සොයා ගැනීම glycome සහ MALDI-TOF විශ්ලේෂණයේදී නිරීක්ෂණය කරන ලද ඛණ්ඩනය තහවුරු කරනවා පමණක් නොව, පූර්ව ප්‍රතිකාර කළ lignocellulosic ජෛව ස්කන්ධවල විභව කාබෝහයිඩ්‍රේට් ව්‍යුත්පන්නයන් පිළිබඳ නව තොරතුරු සපයයි.
අපි ටීඑම්එස් සීනි ව්‍යුත්පන්න කිරීම භාවිතයෙන් ඔලිගෝසැකරයිඩ භාගයේ සීනි සංයුතිය ද විශ්ලේෂණය කළෙමු.GC-MS භාවිතා කරමින්, අපි oligosaccharide කොටසෙහි (රූපය 5) ස්නායුක (ව්යුත්පන්න නොවන) සහ ආම්ලික සීනි (GluA සහ GalA) සංයුතිය තීරණය කළෙමු.Glucuronic අම්ලය ආම්ලික සංඝටක C සහ D වල දක්නට ලැබෙන අතර Galacturonic අම්ලය A සහ ​​B ආම්ලික සංරචක වල දක්නට ලැබේ, මේ දෙකම ආම්ලික සීනිවල ඉහළ DP සංරචක වේ.මෙම ප්‍රතිඵල අපගේ ELISA සහ MALDI දත්ත තහවුරු කරනවා පමණක් නොව, oligosaccharide සමුච්චය පිළිබඳ අපගේ පෙර අධ්‍යයනයන් සමඟ ද අනුකූල වේ.එබැවින්, විවිධ ජීව විද්‍යාත්මක සාම්පලවල ද්‍රාව්‍ය ප්‍රතිචක්‍රීකරණ ඔලිගොසැකරයිඩ හඳුනා ගැනීම සඳහා ඔලිගෝසැකරයිඩවල බයෝටයිනයිලීකරණය සහ පසුව ELISA පරීක්ෂාව භාවිතා කරන නවීන ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්‍රම ප්‍රමාණවත් බව අපි විශ්වාස කරමු.
ELISA මත පදනම් වූ mAb පිරික්සුම් ක්‍රම විවිධ ක්‍රම කිහිපයකින් වලංගු කර ඇති බැවින්, මෙම නව ප්‍රමාණාත්මක ක්‍රමයේ විභවය තවදුරටත් ගවේෂණය කිරීමට අපට අවශ්‍ය විය.වාණිජ oligosaccharides දෙකක්, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) සහ 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), සෛල බිත්ති ග්ලයිකාන් ඉලක්ක කරගත් නව mAb ප්‍රවේශයක් භාවිතා කරමින් මිලදී ගෙන පරීක්ෂා කරන ලදී.රූප සටහන 6 මගින් biotinylated බන්ධන සංඥාව සහ oligosaccharide සාන්ද්‍රණයේ ලඝු සාන්ද්‍රණය අතර රේඛීය සහසම්බන්ධයක් පෙන්නුම් කරයි, හැකි Langmuir adsorption ආකෘතියක් යෝජනා කරයි.mAbs අතර, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, සහ CCRC-M151 XHE සමඟ සහසම්බන්ධ වන අතර CCRC-M108, CCRC-M109, සහ LM11 A2X0n සිට 110n දක්වා පරාසයක සහසම්බන්ධ වේ.අත්හදා බැලීමේදී ප්‍රතිදේහ සීමිත බැවින්, එක් එක් ඔලිගොසැකරයිඩ සාන්ද්‍රණය සමඟ සීමිත පරීක්ෂණ සිදු කරන ලදී.සමහර ප්‍රතිදේහ උපස්ථරයක් ලෙස එකම ඔලිගොසැකරයිඩ වලට බෙහෙවින් වෙනස් ලෙස ප්‍රතික්‍රියා කරන බව මෙහිදී සටහන් කළ යුතුය, අනුමාන වශයෙන් ඒවා තරමක් වෙනස් එපිටොප් වලට බන්ධනය වන නිසා සහ ඉතා වෙනස් බන්ධන සම්බන්ධතා තිබිය හැක.නව mAb ප්‍රවේශය සැබෑ සාම්පල සඳහා යොදන විට නිවැරදි epitope හඳුනාගැනීමේ යාන්ත්‍රණ සහ ඇඟවුම් වඩාත් සංකීර්ණ වනු ඇත.
විවිධ ග්ලයිකන් ඉලක්ක කරන mAbs හඳුනාගැනීමේ පරාසය තීරණය කිරීම සඳහා වාණිජ ඔලිගෝසැකරයිඩ දෙකක් භාවිතා කරන ලදී.මෙහිදී, ඔලිගොසැකරයිඩ සාන්ද්‍රණයේ ලඝු සාන්ද්‍රණය සමඟ රේඛීය සහසම්බන්ධතා (A) XHE mAb සහ (B) A2XX mAb සඳහා Langmuir adsorption රටා පෙන්නුම් කරයි.අනුරූප එපිටොප් මගින් විශ්ලේෂණයේ උපස්ථර ලෙස භාවිතා කරන වාණිජ ඔලිගෝසැකරයිඩවල ව්‍යුහයන් දක්වයි.
ග්ලයිකාන් ඉලක්ක කරගත් මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ භාවිතය (ග්ලයිකොකොමික් විශ්ලේෂණය හෝ ELISA මත පදනම් වූ mAb පරීක්ෂාව) ශාක ජෛව ස්කන්ධ සෑදෙන ප්‍රධාන සෛල බිත්ති ග්ලයිකාන බොහෝමයක් ගැඹුරින් සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා ප්‍රබල මෙවලමකි.කෙසේ වෙතත්, බොහෝ ඔලිගෝසැකරයිඩ ELISA තහඩු මත කාර්යක්ෂමව නිශ්චල නොවන බැවින් සම්භාව්‍ය ග්ලයිකන් විශ්ලේෂණය මගින් විශාල සෛල බිත්ති ග්ලයිකාන පමණක් සංලක්ෂිත වේ.මෙම අධ්‍යයනයේ දී, AFEX-පෙර ප්‍රතිකාර කළ බඩ ඉරිඟු ලිප ඉහළ ඝන ද්‍රව්‍ය ප්‍රමාණයකින් එන්සයිමය වශයෙන් ජල විච්ඡේදනය කරන ලදී.සීනි විශ්ලේෂණය හයිඩ්‍රොලිසේට් හි ප්‍රතිචක්‍රීකරණ සෛල බිත්ති කාබෝහයිඩ්‍රේට් සංයුතිය තීරණය කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී.කෙසේ වෙතත්, හයිඩ්‍රොලයිසේට් වල කුඩා ඔලිගොසැකරයිඩ පිළිබඳ mAb විශ්ලේෂණය අවතක්සේරු කර ඇති අතර, ELISA තහඩු මත ඔලිගොසැකරයිඩ ඵලදායී ලෙස නිශ්චල කිරීමට අමතර මෙවලම් අවශ්‍ය වේ.
නියුට්‍රාවිඩින්™ ආලේපිත තහඩු මත ඔලිගෝසැකරයිඩ බයෝටයිනයිලේෂන් සහ පසුව එලිසා පරීක්‍ෂණය ඒකාබද්ධ කිරීමෙන් mAb පරීක්‍ෂණය සඳහා නව සහ කාර්යක්ෂම ඔලිගොසැකරයිඩ ප්‍රතිචක්‍රීකරණ ක්‍රමයක් අපි මෙහි වාර්තා කරන්නෙමු.නිශ්චල බයෝටයිනයිලේටඩ් ඔලිගෝසැකරයිඩ ප්‍රතිදේහ සඳහා ප්‍රමාණවත් සම්බන්ධයක් පෙන්නුම් කළේ ප්‍රතිචක්‍රීකරණය කරන ඔලිගෝසැකරයිඩ වේගවත් හා කාර්යක්ෂමව හඳුනාගැනීම සඳහාය.ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය මත පදනම් වූ මෙම මුරණ්ඩු ඔලිගෝසැකරයිඩවල සංයුතිය විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් ප්රතිශක්තිකරණය සඳහා මෙම නව ප්රවේශයේ ප්රතිඵල තහවුරු විය.මේ අනුව, මෙම අධ්‍යයනයන් පෙන්නුම් කරන්නේ ඔලිගොසැකරයිඩ බයෝටයිනයිලේෂන් සහ ග්ලයිකාන් ඉලක්ක කරගත් මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ සමඟ ELISA පරීක්‍ෂණයේ සංකලනය ඔලිගොසැකරයිඩවල හරස් සම්බන්ධක හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කළ හැකි අතර ඔලිගෝසැකරයිඩවල ව්‍යුහය සංලක්ෂිත අනෙකුත් ජෛව රසායනික අධ්‍යයනයන්හි බහුලව යෙදිය හැකි බවයි.
මෙම biotin මත පදනම් වූ glycan පැතිකඩ කිරීමේ ක්‍රමය ශාක ජෛව ස්කන්ධවල ද්‍රාව්‍ය ඔලිගොසැකරයිඩවල ප්‍රතිචලනය කරන කාබෝහයිඩ්‍රේට් බන්ධන විමර්ශනය කළ හැකි පළමු වාර්තාව වේ.ජෛව ඉන්ධන නිෂ්පාදනයේදී ජෛව ස්කන්ධයේ සමහර කොටස් මෙතරම් මුරණ්ඩු වන්නේ මන්දැයි මෙය තේරුම් ගැනීමට උපකාරී වේ.මෙම ක්‍රමය ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණ ක්‍රමවල වැදගත් හිඩැසක් පුරවන අතර එහි යෙදුම ශාක ඔලිගොසැකරයිඩවලින් ඔබ්බට පුළුල් පරාසයක උපස්ථර දක්වා විහිදේ.අනාගතයේදී, අපි biotinylation සඳහා රොබෝ තාක්ෂණය භාවිතා කළ හැකි අතර ELISA භාවිතයෙන් සාම්පලවල ඉහළ-විශ්ලේෂණ සඳහා අප විසින් සකස් කර ඇති ක්‍රමය භාවිතා කළ හැකිය.
Pioneer 33A14 දෙමුහුන් බීජ වලින් වගා කරන ලද බඩ ඉරිඟු පිදුරු (CS) 2010 දී කොලරාඩෝ හි රේ හි ක්‍රේමර් ෆාම්ස් වෙතින් නෙලා ගන්නා ලදී.ඉඩම් හිමියාගේ අවසරය ඇතිව, මෙම ජෛව ස්කන්ධය පර්යේෂණ සඳහා භාවිතා කළ හැකිය. සාම්පල කාමර උෂ්ණත්වයේ සිප්-ලොක් බෑග්වල වියළි <6% තෙතමනය ගබඩා කර ඇත. සාම්පල කාමර උෂ්ණත්වයේ සිප්-ලොක් බෑග්වල වියළි <6% තෙතමනය ගබඩා කර ඇත. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной темпее. සාම්පල කාමර උෂ්ණත්වයේ සිපර් කළ බෑග්වල <6% ආර්ද්‍රතාවයේ වියළි ලෙස ගබඩා කර ඇත.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. සාම්පල කාමර උෂ්ණත්වයේ දී සිපර් බෑග්වල ගබඩා කර ඇත ආර්ද්රතාවය <6%.අධ්යයනය දේශීය හා ජාතික මාර්ගෝපදේශවලට අනුකූල විය.NREL ප්‍රොටෝකෝලය භාවිතයෙන් සංයුති විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.සංයුතියේ 31.4% ග්ලූකන්, 18.7% සයිලාන්, 3.3% ඇරබිනන්, 1.2% ගැලැක්ටන්, 2.2% ඇසිටිල්, 14.3% ලිග්නින්, 1.7% ප්‍රෝටීන් සහ 13. 4% අළු අඩංගු බව සොයා ගන්නා ලදී.
Cellic® CTec2 (138 mg ප්‍රෝටීන්/මිලි, ගොඩක් VCNI 0001) යනු Novozymes (Franklinton, NC, USA) වෙතින් සෙලියුලේස්, β-glucosidase සහ Cellic® HTec2 (157 mg ප්‍රෝටීන්/මිලි, ගොඩක් VHN00001) මිශ්‍රණයකි.බහුකාර්ය Pectinase® (72 mg ප්‍රෝටීන්/mL), පෙක්ටීන් පිරිහෙන එන්සයිමවල සංකීර්ණ මිශ්‍රණයක්, DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) විසින් පරිත්‍යාග කරන ලදී.Kjeldahl නයිට්‍රජන් විශ්ලේෂණය (AOAC ක්‍රමය 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන් අන්තර්ගතය (සහ ප්‍රෝටීන් නොවන නයිට්‍රජන් වල දායකත්වය අඩු කිරීම) මගින් එන්සයිම ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය තීරණය කරන ලදී.Diatomaceous earth 545 EMD Millipore (Billerica, MA) වෙතින් මිලදී ගන්නා ලදී.සක්‍රිය කාබන් (DARCO, දැල් කැට 100), Avicel (PH-101), beech xylan, සහ අනෙකුත් සියලුම රසායනික ද්‍රව්‍ය Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) වෙතින් මිලදී ගන්නා ලදී.
AFEX පූර්ව ප්‍රතිකාරය GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) හිදී සිදු කරන ලදී.මිනිත්තු 15 ක් සඳහා 140 ° C. පෙර-ප්රතිකාර සිදු කරනු ලැබේ.46 පදිංචි කාලය 1:1 අනුපාතයට නිර්ජලීය ඇමෝනියා සහ ජෛව ස්කන්ධය 60% (w/w) මල නොබැඳෙන වානේ බෙන්ච්ටොප් කාණ්ඩ ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක පැටවීම (Parr Instruments Company).එය විනාඩි 30 ක් ගත විය.ප්‍රතික්‍රියාකාරකය 140°C දක්වා ගෙන ආ අතර ඇමෝනියා ශීඝ්‍රයෙන් මුදාහරින ලද අතර, ජෛව ස්කන්ධය ඉක්මනින් කාමර උෂ්ණත්වයට පැමිණීමට ඉඩ සැලසේ.AFEX පෙර-ප්‍රතිකාර කළ ඉරිඟු උදුනේ (ACS) සංයුතිය ප්‍රතිකාර නොකළ ඉරිඟු ලිප (UT-CS) හා සමාන විය.
ඉහළ ඝන ACSH 25% (w/w) (ආසන්න වශයෙන් 8% ඩෙක්ස්ට්‍රාන් පැටවීම) මහා පරිමාණ ඔලිගොසැකරයිඩ නිෂ්පාදනය සඳහා ආරම්භක ද්‍රව්‍යයක් ලෙස සකස් කරන ලදී.Cellic® Ctec2 10 mg ප්‍රෝටීන්/g glucan (පෙර ප්‍රතිකාර කළ ජෛව ස්කන්ධය තුළ), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg ප්‍රෝටීන්/g glucan, සහ Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) ඇතුළු වාණිජ එන්සයිම මිශ්‍රණයක් භාවිතයෙන් ACS හි එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය සිදු කරන ලදී.)), 5 mg ප්‍රෝටීන් / g dextran.එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය ලීටර් 3, pH 4.8, 50 ° C සහ 250 rpm වැඩ කරන පරිමාවක් සහිත ලීටර් 5 ජෛව ප්රතික්රියාකාරකයක් තුළ සිදු කරන ලදී.පැය 96 ක් ජල විච්ඡේදනය කිරීමෙන් පසු, හයිඩ්‍රොලයිසේට් 6000 rpm දී විනාඩි 30 ක් සහ පසුව 14000 rpm දී විනාඩි 30 ක් සඳහා කේන්ද්‍රාපසාරී මගින් හයිඩ්‍රොලිසයිඩ් එකතු කරන ලදී.ඉන්පසුව හයිඩ්‍රොලයිසේට් මිලිමීටර් 0.22 ෆිල්ටර් බීකරයක් හරහා වඳ පෙරීමකට ලක් කරන ලදී.පෙරන ලද හයිඩ්‍රොලයිසේට් 4 ° C. දී වඳ බෝතල්වල ගබඩා කර පසුව කාබන් මත ඛණ්ඩනය කරන ලදී.
NREL රසායනාගාර විශ්ලේෂණ ක්‍රියා පටිපාටිවලට අනුව නිස්සාරණය මත පදනම් වූ ජෛව ස්කන්ධ සාම්පලවල සංයුතිය විශ්ලේෂණය කිරීම: සංයුතිය විශ්ලේෂණය සඳහා සාම්පල සකස් කිරීම (NREL/TP-510-42620) සහ ජෛව ස්කන්ධයේ ව්‍යුහාත්මක කාබෝහයිඩ්‍රේට් සහ ලිග්නින් තීරණය කිරීම (NREL/TP-510 - 42618)47.
හයිඩ්‍රොලිසේට් ප්‍රවාහයේ ඔලිගොසැකරයිඩ විශ්ලේෂණය ස්වයංක්‍රීය අම්ල හයිඩ්‍රොලිසිස් ක්‍රමයක් භාවිතයෙන් මිලි ලීටර් 2 ක පරිමාණයකින් සිදු කරන ලදී.හයිඩ්‍රොලයිසේට් සාම්පලය 72% සල්ෆියුරික් අම්ලය 69.7 µl සමඟ මිශ්‍ර කර මිලි ලීටර් 10 ක ඉස්කුරුප්පු කැප් සංස්කෘතිය නලයක් තුළ 121 ° C දී බංකුවක් මත පැය 1 ක් පුර්වාංගත කරන්න, අයිස් මත සිසිල් කර ඉහළ ක්‍රියාකාරී ද්‍රව වර්ණදේහ (HPLC) කුප්පියකට පෙරන්න.oligosaccharides සාන්ද්‍රණය තීරණය කරනු ලැබුවේ අම්ල-ජල විච්ඡේදක නියැදියේ ඇති සම්පූර්ණ සීනි සාන්ද්‍රණයෙන් හයිඩ්‍රොලික් නොවන සාම්පලයේ මොනොසැකරයිඩ සාන්ද්‍රණය අඩු කිරීමෙනි.
Bio-Rad Aminex HPX-87H තීරුවක ස්වයංක්‍රීය සාම්පලයක්, තීරු තාපකයක්, සමස්ථානික පොම්පයක් සහ වර්තන දර්ශක අනාවරකයක් සහිත Shimadzu HPLC පද්ධතියක් භාවිතයෙන් අම්ල ජල විච්ඡේදනය කරන ලද ජෛව ස්කන්ධයේ ඇති ග්ලූකෝස්, සයිලෝස් සහ ඇරබිනෝස් සාන්ද්‍රණය විශ්ලේෂණය කරන ලදී.තීරුව 50 ° C දී පවත්වා ගෙන යන අතර 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ජලයෙන් ඉවත් කරන ලදී.ගලනවා.
hydrolyzate supernatant තනුක කර මොනෝමර් සහ oligosaccharide අන්තර්ගතය සඳහා විශ්ලේෂණය කරන ලදී.එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය කිරීමෙන් පසු ලබාගත් මොනමරික් සීනි Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P තීරුවකින් සහ අළු ආරක්ෂක තීරුවකින් සමන්විත HPLC විසින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.තීරු උෂ්ණත්වය 80 ° C දී පවත්වා ගෙන යන ලදී, ජලය 0.6 ml / min ප්රවාහ අනුපාතය සමඟ ජංගම අදියර ලෙස භාවිතා කරන ලදී.refs හි විස්තර කර ඇති ක්‍රමවලට අනුව 121 ° C දී තනුක අම්ලයේ ජල විච්ඡේදනය මගින් Oligosaccharides තීරණය කරන ලදී.41, 48, 49.
කලින් විස්තර කරන ලද ක්‍රියා පටිපාටි 27, 43, 50, 51 භාවිතා කරමින් අමු, AFEX පෙර-ප්‍රතිකාර කළ සහ සියලුම ජල විච්ඡේදනය නොවන ජෛව ස්කන්ධ අපද්‍රව්‍ය (අනුක්‍රමික සෛල බිත්ති නිස්සාරණ නිෂ්පාදනය සහ ඒවායේ mAb පරීක්ෂා කිරීම ඇතුළුව) මත සැකරයිඩ විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණය සඳහා, ශාක සෛල බිත්ති ද්‍රව්‍යවල ඇල්කොහොල්-ද්‍රාව්‍ය අපද්‍රව්‍ය ජෛව ස්කන්ධ අපද්‍රව්‍ය වලින් සකස් කර ඇමෝනියම් ඔක්සලේට් (50 mM), සෝඩියම් කාබනේට් (50 mM සහ 0.5% w/v), CON වැනි වැඩි වැඩියෙන් ආක්‍රමණශීලී ප්‍රතික්‍රියාකාරක සමඟ අනුක්‍රමික නිස්සාරණයට ලක් කෙරේ.(1M සහ 4M, දෙකම 1% w/v සෝඩියම් බෝරෝහයිඩ්‍රයිඩ් සමඟ) සහ කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි අම්ල ක්ලෝරයිට්52,53.සෛල බිත්ති ග්ලයිකාන් වෙත යොමු කරන ලද mAb50s සංකීර්ණ පුවරුවකට එරෙහිව සාරය ELISA වෙත යොමු කරන ලද අතර mAb බන්ධන ප්‍රතික්‍රියා තාප සිතියමක් ලෙස ඉදිරිපත් කරන ලදී.ශාක සෛල බිත්ති ග්ලයිකාන් ඉලක්ක කරගත් mAbs රසායනාගාර තොගවලින් (CCRC, JIM සහ MAC ශ්‍රේණි) මිලදී ගන්නා ලදී.
ඔලිගෝසැකරයිඩවල එක්-පියවර බයෝටයිනයිලීකරණය.Biotin-LC-hydrazide සමඟ කාබෝහයිඩ්රේට සංයෝජනය පහත සඳහන් ක්රියා පටිපාටිය භාවිතා කර ඇත.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) විනාඩි 1 ක් සඳහා දැඩි ලෙස ඇවිස්සීම සහ 65 ° C. රත් කිරීම මගින් dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) දියකර ඇත.ග්ලැසියර ඇසිටික් අම්ලය (30 µl) එකතු කරන ලද අතර එම මිශ්‍රණය සෝඩියම් සයනොබොරෝහයිඩ්‍රයිඩ් (6.4 mg/100 µmol) මතට වත් කර විනාඩි 1ක් පමණ 65° C. උනුසුම් කිරීමෙන් පසු සම්පූර්ණයෙන්ම විසුරුවා හරින ලදී.ඉන්පසුව, ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයෙන් 5 සිට 8 μl දක්වා ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණය වියලන ලද ඔලිගොසැකරයිඩ (1-100 nmol) වෙත එකතු කරන ලද අතර, අඩු කිරීමේ අවසානයට වඩා ලේබලයේ 10 ගුණයක් හෝ ඊට වැඩි මෝලර් අතිරික්තයක් ලබා ගනී.ප්රතික්රියාව පැය 2 ක් සඳහා 65 ° C දී සිදු කරන ලද අතර, පසුව සාම්පල වහාම පිරිසිදු කර ඇත.අඩු කිරීමකින් තොරව ලේබල් කිරීමේ අත්හදා බැලීම් වලදී සෝඩියම් සයනොබොරෝහයිඩ්‍රයිඩ් භාවිතා නොකළ අතර සාම්පල 65 ° C. පැය 2.5 ක් සඳහා ප්‍රතික්‍රියා කරන ලදී.
ELISA ආලේපනය සහ biotinylated oligosaccharides සාම්පල සේදීම.Biotinylated සාම්පල 25 μl (එක් එක් සාන්ද්‍රිත සාම්පලයේ 100 μl 0.1 M ට්‍රිස් බෆර ද්‍රාවණයේ (TBS) මිලි ලීටර් 5 ක තනුක කර ඇත) Avidin-ආලේපිත තහඩුවේ සෑම ළිඳකටම එකතු කරන ලදී.පාලන ළිං 0.1 M TBS හි 10 μg / ml සාන්ද්‍රණයකින් බයෝටින් 50 μl සමඟ ආලේප කර ඇත.හිස් මිනුම් සඳහා ආලේපනයක් ලෙස ඩියෝනීකරණය කළ ජලය භාවිතා කරන ලදී.අඳුරේ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 2 ක් සඳහා ටැබ්ලට් එක තැන්පත් කර ඇත.වැඩසටහන් අංකය භාවිතයෙන් 0.1 M TBS හි 0.1% මුදවපු කිරි සමග 3 වරක් පිඟාන සෝදන්න.Grenier flat 3A සඳහා 11.
ප්රාථමික ප්රතිදේහ එකතු කිරීම සහ සේදීම.සෑම ළිඳකටම ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ 40 µl එකතු කරන්න.අඳුරේ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් මයික්‍රොප්ලේට් ඉන්කියුබ් කරන්න.පසුව Grenier Flat 3A සඳහා වොෂ් වැඩසටහන #11 භාවිතා කරමින් 0.1M TBS හි 0.1% කිරි සමග තහඩු 3 වරක් සෝදා ඇත.
ද්විතියික ප්රතිදේහ එකතු කර සෝදා හරින්න.සෑම ළිඳකටම මීයන්/මීයන් ද්විතියික ප්‍රතිදේහ 50 µl (0.1% කිරි 0.1%ක තනුක කර ඇත) එක් එක් ළිඳට එක් කරන්න.අඳුරේ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් මයික්‍රොප්ලේට් ඉන්කියුබ් කරන්න.ඉන්පසු Grenier Flat 5A තහඩු සේදීමේ වැඩසටහන #12 භාවිතයෙන් මයික්‍රොප්ලේට් 0.1% කිරි සමග 0.1 M TBS වලින් 5 වරක් සෝදා ඇත.
උපස්ථරයක් එකතු කිරීම.මූලික උපස්ථරයට 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) 50 µl එකතු කරන්න (බෆර බිංදු 2 ක්, TMB බිංදු 3 ක්, හයිඩ්‍රජන් පෙරොක්සයිඩ් බිංදු 2 ක් ඩියෝනීකරණය කළ ජලය මිලි ලීටර් 15 ට එකතු කිරීමෙන්).TMB උපස්ථරය සකස් කරන්න.සහ භාවිතයට පෙර සුලිය).මිනිත්තු 30 ක් සඳහා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මයික්රොප්ලේට් පුරවන්න.අඳුරේ.
පියවර සම්පූර්ණ කර ටැබ්ලටය කියවන්න.සෑම ළිඳකටම 1 N සල්ෆියුරික් අම්ලය 50 µl එකතු කර ELISA කියවනය භාවිතයෙන් අවශෝෂණය 450 සිට 655 nm දක්වා වාර්තා කරන්න.
මෙම විශ්ලේෂණ ද්‍රාවණ 1 mg/ml deionized ජලය තුළ සකස් කරන්න: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (NAacetylmannosamine), N-acetylmannosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (අභ්‍යන්තර සම්මත).වගුව 1 හි පෙන්වා ඇති 1 mg/mL සීනි ද්‍රාවණ එකතු කිරීමෙන් ප්‍රමිතීන් දෙකක් සකස් කර ඇත. සියලුම ජලය ඉවත් කරන තුරු (සාමාන්‍යයෙන් පැය 12-18 පමණ) නියැදි -80° C. දී ශීත කළ සහ lyophilized වේ.
විශ්ලේෂණාත්මක ශේෂයක් මත ඉස්කුරුප්පු කැප් නල සඳහා සාම්පල 100-500 μg එකතු කරන්න.එකතු කළ මුදල සටහන් කරන්න.නියැදිය නිශ්චිත සාන්ද්‍රණයක ද්‍රාවණයක විසුරුවා හැරීම සහ දියර ඇල්කොට් ලෙස නලයට එකතු කිරීම වඩාත් සුදුසුය.එක් එක් නියැදි නලයක් සඳහා අභ්‍යන්තර ප්‍රමිතියක් ලෙස 1 mg/ml inositol 20 µl භාවිතා කරන්න.නියැදියට එකතු කරන ලද අභ්‍යන්තර ප්‍රමිතියේ ප්‍රමාණය සම්මත නලයට එකතු කරන ලද අභ්‍යන්තර ප්‍රමිතියේ ප්‍රමාණයට සමාන විය යුතුය.
ඉස්කුරුප්පු ඇණ කුප්පියකට නිර්ජලීය මෙතනෝල් මිලි ලීටර් 8 ක් එකතු කරන්න.ඉන්පසු 3 N. methanolic HCl ද්‍රාවණයෙන් මිලි ලීටර් 4ක්, ආවරණය කර සොලවන්න.මෙම ක්රියාවලිය ජලය භාවිතා නොකරයි.
ඔලිගොසැකරයිඩ සාම්පල සහ සම්මත TMS නල වලට 1 M HCl මෙතනෝල් ද්‍රාවණයෙන් 500 µl එකතු කරන්න.සාම්පල එක රැයකින් (පැය 168) 80 ° C. තාප කුට්ටියක තැන්පත් කරන ලදී.වියළන බහුකාර්යයක් භාවිතයෙන් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මෙතනොලිසිස් නිෂ්පාදනය වියළන්න.200 µl MeOH එකතු කර නැවත වියළන්න.මෙම ක්රියාවලිය දෙවරක් නැවත නැවතත් සිදු කෙරේ.සාම්පලයට මෙතනෝල් 200 µl, පිරිඩීන් 100 µl සහ ඇසිටික් ඇන්හයිඩ්‍රයිඩ් 100 µl එකතු කර හොඳින් මිශ්‍ර කරන්න.නියැදි විනාඩි 30 ක් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී ඉන්කියුටේෂන් කර ඇත.සහ වියලන ලද.මෙතනෝල් 200 µl එකතු කර නැවත වියළන්න.
ට්‍රයි-සිල් 200 µl එකතු කර විනාඩි 20 ක් සඳහා ආවරණ නළය රත් කරන්න.80 ° C, පසුව කාමර උෂ්ණත්වයට සිසිල්.නියැදිය 50 µl පමණ පරිමාවකට තවදුරටත් වියළීම සඳහා වියළන බහුවිධයක් භාවිතා කරන්න.අපි සාම්පල සම්පූර්ණයෙන්ම වියළීමට ඉඩ නොදුන් බව සැලකිල්ලට ගැනීම වැදගත්ය.
හෙක්සෙන් මිලි ලීටර් 2 ක් එකතු කර සුළි කිරීම මගින් හොඳින් මිශ්ර කරන්න.අඟල් 5-3/4 ක විෂ්කම්භයකින් යුත් පයිප්පයක් මත වීදුරු ලොම් ඇතුල් කිරීම මගින් පාස්චර් පයිප්පවල (5-8 මි.මී.) ඉඟි වීදුරු ලොම් කැබැල්ලකින් පුරවන්න.නියැදි විනාඩි 2 ක් සඳහා ග්රෑම් 3000 ට කේන්ද්රාපසාරී කර ඇත.ඕනෑම දිය නොවන අපද්‍රව්‍ය අවක්ෂේප කරනු ලැබේ.නියැදිය 100-150 µl දක්වා වියළන්න.ආසන්න වශයෙන් 1 μl පරිමාවක් GC-MS වෙත 80 °C ආරම්භක උෂ්ණත්වයකදී එන්නත් කරන ලද අතර ආරම්භක කාලය විනාඩි 2.0 (වගුව 2).