Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තූතියි. ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රව්සර් අනුවාදයේ සීමිත CSS සහාය ඇත. හොඳම අත්දැකීම සඳහා, යාවත්කාලීන කළ බ්‍රව්සරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා මාදිලිය අක්‍රීය කරන්න). මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි වෙබ් අඩවිය විලාස සහ JavaScript නොමැතිව විදැහුම් කරන්නෙමු.
AFEX සමඟ පූර්ව ප්‍රතිකාර කරන ලද ඉරිඟු උදුනෙහි අඛණ්ඩ ඔලිගෝසැකරයිඩ සංකීර්ණ විශ්ලේෂණය සඳහා නව ප්‍රතිශක්තිකරණ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂ ක්‍රම. ලිග්නොසෙලියුලෝසික් ජෛව ස්කන්ධය යනු පොසිල ඉන්ධන සඳහා තිරසාර විකල්පයක් වන අතර ආහාර, ආහාර, ඉන්ධන සහ රසායනික ද්‍රව්‍ය වැනි නිෂ්පාදන නිෂ්පාදනය සඳහා ජෛව තාක්ෂණයන් සංවර්ධනය කිරීම සඳහා බහුලව භාවිතා වේ. මෙම තාක්ෂණයන්හි යතුර වන්නේ ශාක සෛල බිත්තිවල ඇති සංකීර්ණ කාබෝහයිඩ්‍රේට් ග්ලූකෝස්, සයිලෝස් සහ ඇරබිනෝස් වැනි සරල සීනි බවට පරිවර්තනය කිරීම සඳහා පිරිවැය-තරඟකාරී ක්‍රියාවලීන් සංවර්ධනය කිරීමයි. ලිග්නොසෙලියුලෝසික් ජෛව ස්කන්ධය ඉතා මුරණ්ඩු බැවින්, අපේක්ෂිත නිෂ්පාදනය ලබා ගැනීම සඳහා එය තාප රසායනික ප්‍රතිකාර (උදා: ඇමෝනියා තන්තු පිටකිරීම (AFEX), තනුක අම්ල (DA), අයනික ද්‍රව (IL)) සහ ජීව විද්‍යාත්මක ප්‍රතිකාර (උදා: එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය සහ ක්ෂුද්‍රජීවී පැසවීම) ඒකාබද්ධව සිදු කළ යුතුය. . කෙසේ වෙතත්, වාණිජ දිලීර එන්සයිම ජල විච්ඡේදක ක්‍රියාවලියේදී භාවිතා කරන විට, සෑදෙන ද්‍රාව්‍ය සීනි වලින් 75-85% ක් පමණක් මොනොසැකරයිඩ වන අතර, ඉතිරි 15-25% ද්‍රාව්‍ය, දිය කළ නොහැකි ඔලිගෝසැකරයිඩ වන අතර ඒවා ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්ට සැමවිටම ලබා ගත නොහැක. මීට පෙර, අපි කාබන් සහ ඩයටෝමැසියස් පෘථිවි වෙන් කිරීම සහ ප්‍රමාණය බැහැර කිරීමේ වර්ණදේහ සංයෝජනයක් භාවිතා කරමින් ද්‍රාව්‍ය මුරණ්ඩු ඔලිගෝසැකරයිඩ සාර්ථකව හුදකලා කර පිරිසිදු කර ඇති අතර, ඒවායේ එන්සයිම නිෂේධනීය ගුණාංග ද විමර්ශනය කර ඇත්තෙමු. අඩු DP සහ උදාසීන ඔලිගෝසැකරයිඩ වලට වඩා ඉහළ මට්ටමේ බහුඅවයවීකරණය (DP) මෙතිලේටඩ් යූරොනික් අම්ල ආදේශක අඩංගු ඔලිගෝසැකරයිඩ වාණිජ එන්සයිම මිශ්‍රණ සමඟ සැකසීමට වඩා දුෂ්කර බව අපි සොයාගෙන ඇත්තෙමු. මෙහිදී අපි ශාක සෛල බිත්ති සහ එන්සයිම හයිඩ්‍රොලයිසේට් වල ග්ලයිකන් බන්ධන සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා ශාක ජෛව ස්කන්ධ ග්ලයිකන් වලට විශේෂිත මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ (mAbs) භාවිතා කරමින් ග්ලයිකන් පැතිකඩ කිරීම, අනුකෘති-සහායිත ලේසර් අවශෝෂණ අයනීකරණය, පියාසර ස්කන්ධ-වර්ණාවලීක්ෂය ඇතුළු අතිරේක ක්‍රම කිහිපයක් භාවිතා කිරීම වාර්තා කරමු. MALDI-TOF-MS) සෘණ අයන, වායු වර්ණදේහ විද්‍යාව සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (GC-MS) වල ද්විතියික ක්ෂය වීමෙන් පසු වර්ණාවලීක්ෂය මගින් ලබාගත් ව්‍යුහ-තොරතුරු රෝග විනිශ්චය උච්චයන් භාවිතා කරමින් ව්‍යුත්පන්නකරණය සමඟ සහ රහිතව ඔලිගෝසැකරයිඩ බන්ධන සංලක්ෂිත කරයි. ඔලිගෝසැකරයිඩවල කුඩා ප්‍රමාණය (DP 4–20) නිසා, මෙම අණු mAb බන්ධනය සහ චරිත නිරූපණය සඳහා භාවිතා කිරීමට අපහසු වේ. මෙම ගැටළුව මඟහරවා ගැනීම සඳහා, අපි ක්ෂුද්‍ර තහඩු මතුපිට අඩු DP ද්‍රාව්‍ය ඔලිගෝසැකරයිඩ බහුතරයක් සාර්ථකව ලේබල් කරන ලද නව බයෝටින් සංයෝජන-පාදක ඔලිගෝසැකරයිඩ නිශ්චලකරණ ක්‍රමයක් යෙදුවෙමු, පසුව එය නිශ්චිත බන්ධන විශ්ලේෂණය සඳහා ඉහළ ප්‍රතිදාන mAb පද්ධතියක භාවිතා කරන ලදී. මෙම නව ක්‍රමය අනාගතයේදී රෝග විනිශ්චය අරමුණු සඳහා ජෛව සලකුණු වල ඇති ඔලිගෝසැකරයිඩ හුදකලා කිරීමට සහ සංලක්ෂිත කිරීමට භාවිතා කළ හැකි වඩාත් දියුණු ඉහළ ප්‍රතිදාන ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණයන් සංවර්ධනය කිරීමට පහසුකම් සපයනු ඇත.
කෘෂිකාර්මික, වන වගාව, තෘණ සහ දැවමය ද්‍රව්‍ය වලින් සමන්විත ලිග්නොසෙලියුලෝසික් ජෛව ස්කන්ධය, ඉහළ වටිනාකමක් ඇති නිෂ්පාදන නිපදවීම සඳහා ආහාර, ආහාර, ඉන්ධන සහ රසායනික පූර්වගාමීන් ඇතුළු ජෛව පාදක නිෂ්පාදන නිෂ්පාදනය සඳහා විභව පෝෂක තොගයකි. ශාක සෛල බිත්තිවල ඇති කාබෝහයිඩ්‍රේට් (සෙලියුලෝස් සහ හෙමිසෙලියුලෝස් වැනි) රසායනික සැකසුම් සහ ජෛව පරිවර්තනය (එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය සහ ක්ෂුද්‍රජීවී පැසවීම වැනි) මගින් මොනොසැකරයිඩ බවට විස්ථාපනය වේ. පොදු පූර්ව ප්‍රතිකාර අතරට ඇමෝනියා තන්තු ප්‍රසාරණය (AFEX), තනුක අම්ලය (DA), අයනික ද්‍රව (IL) සහ වාෂ්ප පිපිරීම (SE) ඇතුළත් වන අතර ඒවා ශාක සෛල බිත්ති විවෘත කිරීමෙන් ලිග්නොසෙලියුලෝස් නිෂ්පාදනය අඩු කිරීම සඳහා රසායනික ද්‍රව්‍ය හා තාපයේ සංයෝජනයක් භාවිතා කරයි3,4. පදාර්ථයේ මුරණ්ඩුකම, 5. වාණිජ ක්‍රියාකාරී කාබෝහයිඩ්‍රේට් අඩංගු එන්සයිම (CAZymes) සහ ජෛව පාදක ඉන්ධන සහ රසායනික ද්‍රව්‍ය නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා ට්‍රාන්ස්ජනික් යීස්ට් හෝ බැක්ටීරියා භාවිතා කරමින් ක්ෂුද්‍රජීවී පැසවීම භාවිතා කරමින් ඉහළ ඝන ද්‍රව්‍ය බරකින් එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය සිදු කෙරේ. 6 .
වාණිජ එන්සයිමවල ඇති CAZymes, සංකීර්ණ කාබෝහයිඩ්‍රේට්-සීනි බන්ධන සහජීවනයෙන් බිඳ දමා මොනොසැකරයිඩ සාදයි2,7. අප කලින් වාර්තා කළ පරිදි, කාබෝහයිඩ්‍රේට් සමඟ ලිග්නින් වල ඇරෝමැටික බහු අවයවක සංකීර්ණ ජාලය ඒවා ඉතා පහසුවෙන් බෙදා ගත නොහැකි කරයි, එය අසම්පූර්ණ සීනි පරිවර්තනයකට මග පාදයි, පූර්ව ප්‍රතිකාර කළ ජෛව ස්කන්ධයේ එන්සයිම ජල විච්ඡේදනයේදී නිපදවන්නේ නැති ලිංගික ඔලිගෝසැකරයිඩ වලින් 15-25% ක් රැස් කරයි. මෙය විවිධ ජෛව ස්කන්ධ පූර්ව ප්‍රතිකාර ක්‍රම සමඟ පොදු ගැටළුවකි. මෙම බාධකයට හේතු කිහිපයක් වන්නේ ජල විච්ඡේදනයේදී එන්සයිම නිෂේධනය කිරීම හෝ ශාක ජෛව ස්කන්ධයේ සීනි බන්ධන බිඳ දැමීමට අවශ්‍ය අත්‍යවශ්‍ය අත්‍යවශ්‍ය එන්සයිම නොමැති වීම හෝ අඩු මට්ටම් ය. ඔලිගෝසැකරයිඩවල සීනි බන්ධන වැනි සීනිවල සංයුතිය සහ ව්‍යුහාත්මක ලක්ෂණ තේරුම් ගැනීම, ජල විච්ඡේදනයේදී සීනි පරිවර්තනය වැඩි දියුණු කිරීමට අපට උපකාරී වන අතර, ඛනිජ තෙල් වලින් ලබාගත් නිෂ්පාදන සමඟ ජෛව තාක්ෂණික ක්‍රියාවලීන් පිරිවැය-තරඟකාරී කරයි.
කාබෝහයිඩ්‍රේට් වල ව්‍යුහය තීරණය කිරීම අභියෝගාත්මක වන අතර ද්‍රව වර්ණදේහ විද්‍යාව (LC)11,12, න්‍යෂ්ටික චුම්භක අනුනාද වර්ණාවලීක්ෂය (NMR)13, කේශනාලිකා විද්‍යුත් විච්ඡේදනය (CE)14,15,16 සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (MS)17 වැනි ක්‍රමවල සංයෝජනයක් අවශ්‍ය වේ. ,දහඅට. ලේසර් විසර්ජනය සහ අනුකෘතියක් (MALDI-TOF-MS) භාවිතයෙන් අයනීකරණය සමඟ පියාසර කරන කාල ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය වැනි MS ක්‍රම කාබෝහයිඩ්‍රේට් ව්‍යුහයන් හඳුනා ගැනීම සඳහා බහුකාර්ය ක්‍රමයකි. මෑතකදී, ඔලිගෝසැකරයිඩ ඇමිණුම් ස්ථාන, ඇනෝමරික් වින්‍යාසයන්, අනුපිළිවෙලවල් සහ අතු බෙදීමේ ස්ථාන 20, 21 ට අනුරූප ඇඟිලි සලකුණු හඳුනා ගැනීම සඳහා ඝට්ටන-ප්‍රේරිත විඝටනය (CID) ටැන්ඩම් MS සෝඩියම් අයන ඇඩක්ට් වඩාත් බහුලව භාවිතා කර ඇත.
කාබෝහයිඩ්‍රේට් බන්ධන ගැඹුරින් හඳුනා ගැනීම සඳහා ග්ලයිකන් විශ්ලේෂණය විශිෂ්ට මෙවලමකි22. මෙම ක්‍රමය සංකීර්ණ කාබෝහයිඩ්‍රේට් සම්බන්ධතා තේරුම් ගැනීම සඳහා පරීක්ෂණ ලෙස ශාක සෛල බිත්ති ග්ලයිකන් වෙත යොමු කරන ලද ඒක ක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ (mAbs) භාවිතා කරයි. ලොව පුරා mAbs 250 කට වඩා ලබා ගත හැකි අතර, විවිධ සැකරයිඩ භාවිතා කරමින් විවිධ රේඛීය සහ අතු සහිත ඔලිගෝසැකරයිඩ වලට එරෙහිව නිර්මාණය කර ඇත24. ශාක සෛල වර්ගය, ඉන්ද්‍රිය, වයස, සංවර්ධන අවධිය සහ වර්ධන පරිසරය අනුව සැලකිය යුතු වෙනස්කම් ඇති බැවින්, ශාක සෛල බිත්තියේ ව්‍යුහය, සංයුතිය සහ වෙනස් කිරීම් සංලක්ෂිත කිරීමට mAbs කිහිපයක් බහුලව භාවිතා කර ඇත25,26. වඩාත් මෑතකදී, මෙම ක්‍රමය ශාක හා සත්ව පද්ධතිවල වෙසිලි ජනගහනය සහ උප සෛලීය සලකුණු, සංවර්ධන අවධීන් හෝ පාරිසරික උත්තේජක මගින් තීරණය කරනු ලබන ග්ලයිකන් ප්‍රවාහනයේදී ඒවායේ අදාළ භූමිකාවන් තේරුම් ගැනීමට සහ එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් තීරණය කිරීමට භාවිතා කර ඇත. හඳුනාගෙන ඇති ග්ලයිකන් සහ සයිලන් වල විවිධ ව්‍යුහයන් අතරට පෙක්ටින් (P), සයිලන් (X), මන්නන් (M), සයිලොග්ලූකන් (XylG), මිශ්‍ර බන්ධන ග්ලූකන් (MLG), ඇරබිනොක්සිලන් (ArbX), ගැලැක්ටොමැනන් (GalG), ග්ලූකුරෝනික් අම්ලය-අරබිනොක්සිලන් (GArbX) සහ ඇරබිනෝ-ගැලැක්ටන් (ArbG)29 ඇතුළත් වේ.
කෙසේ වෙතත්, මෙම සියලු පර්යේෂණ උත්සාහයන් තිබියදීත්, ඔලිගෝසැකරයිඩ මුදා හැරීම, ජල විච්ඡේදනය අතරතුර ඔලිගෝමරික් දාම දිග වෙනස්වීම්, විවිධ අඩු DP පොලිමර් සහ ඒවායේ වක්‍ර ඇතුළුව ඉහළ ඝන ද්‍රව්‍ය බර (HSL) ජල විච්ඡේදනය අතරතුර ඔලිගෝසැකරයිඩ සමුච්චය වීමේ ස්වභාවය කෙරෙහි අවධානය යොමු කර ඇත්තේ අධ්‍යයන කිහිපයක් පමණි. බෙදාහැරීම් 30,31,32. මේ අතර, ග්ලයිකන් විශ්ලේෂණය ග්ලයිකන් ව්‍යුහය පිළිබඳ පුළුල් විශ්ලේෂණයක් සඳහා ප්‍රයෝජනවත් මෙවලමක් බව ඔප්පු වී ඇතත්, ප්‍රතිදේහ ක්‍රම භාවිතයෙන් ජලයේ ද්‍රාව්‍ය අඩු DP ඔලිගෝසැකරයිඩ ඇගයීම දුෂ්කර ය. 5-10 kDa ට අඩු අණුක බරක් සහිත කුඩා DP ඔලිගෝසැකරයිඩ ELISA තහඩු 33, 34 ට බන්ධනය නොවන අතර ප්‍රතිදේහ එකතු කිරීමට පෙර සෝදා හරිනු ලැබේ.
මෙහිදී, ප්‍රථම වතාවට, අපි මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ භාවිතා කරමින් ඇවිඩින්-ආලේපිත තහඩු මත ELISA විශ්ලේෂණයක් ප්‍රදර්ශනය කරමු, ද්‍රාව්‍ය පරාවර්තක ඔලිගෝසැකරයිඩ සඳහා එක්-පියවර ජෛව ටයිනයිලේෂන් ක්‍රියා පටිපාටියක් ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණය සමඟ ඒකාබද්ධ කරමු. ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණය සඳහා අපගේ ප්‍රවේශය MALDI-TOF-MS සහ GC-MS පදනම් කරගත් ජල විච්ඡේදනය කළ සීනි සංයුතිවල ට්‍රයිමෙතිල්සිලයිල් (TMS) ව්‍යුත්පන්නය භාවිතා කරමින් අනුපූරක ඔලිගෝසැකරයිඩ සම්බන්ධතා විශ්ලේෂණය මගින් වලංගු කරන ලදී. මෙම නව්‍ය ප්‍රවේශය අනාගතයේ දී ඉහළ කාර්යසාධන ක්‍රමයක් ලෙස සංවර්ධනය කළ හැකි අතර ජෛව වෛද්‍ය පර්යේෂණවල පුළුල් යෙදුමක් සොයාගත හැකිය35.
එන්සයිම සහ ප්‍රතිදේහවල, ග්ලයිකෝසයිලේෂන් වැනි, පශ්චාත් පරිවර්තන වෙනස් කිරීම්,36 ඒවායේ ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරිත්වයට බලපායි. නිදසුනක් ලෙස, සෙරුම් ප්‍රෝටීන වල ග්ලයිකෝසයිලේෂන් වෙනස්කම් ගිනි අවුලුවන ආතරයිටිස් සඳහා වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරන අතර, ග්ලයිකෝසයිලේෂන් වෙනස්කම් රෝග විනිශ්චය සලකුණු ලෙස භාවිතා කරයි37. ආමාශ ආන්ත්‍රික පත්රිකාවේ සහ අක්මාවේ නිදන්ගත ගිනි අවුලුවන රෝග, වෛරස් ආසාදන, ඩිම්බකෝෂ, පියයුරු සහ පුරස්ථි ග්‍රන්ථි පිළිකා ඇතුළු විවිධ රෝග වල විවිධ ග්ලයිකන් පහසුවෙන් දිස්වන බව සාහිත්‍යයේ වාර්තා වී ඇත38,39,40. ප්‍රතිදේහ මත පදනම් වූ ග්ලයිකන් ELISA ක්‍රම භාවිතා කරමින් ග්ලයිකන් වල ව්‍යුහය අවබෝධ කර ගැනීම සංකීර්ණ MS ක්‍රම භාවිතා නොකර රෝග විනිශ්චය කිරීමේදී අමතර විශ්වාසයක් ලබා දෙනු ඇත.
අපගේ පෙර අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කළේ පූර්ව ප්‍රතිකාර හා එන්සයිම ජල විච්ඡේදනයෙන් පසුව මුරණ්ඩු ඔලිගෝසැකරයිඩ ජල විච්ඡේදනයෙන් තොරව පවතින බවයි (රූපය 1). අපගේ පෙර ප්‍රකාශිත කෘතියේදී, AFEX-පූර්ව ප්‍රතිකාර කළ ඉරිඟු උදුන ජල විච්ඡේදනයෙන් (ACSH) ඔලිගෝසැකරයිඩ හුදකලා කිරීම සඳහා අපි සක්‍රිය අඟුරු ඝන-අදියර නිස්සාරණ ක්‍රමයක් සංවර්ධනය කළෙමු. 8. මූලික නිස්සාරණයෙන් සහ වෙන් කිරීමෙන් පසුව, ඔලිගෝසැකරයිඩ ප්‍රමාණය බැහැර කිරීමේ වර්ණදේහ විද්‍යාව (SEC) මගින් තවදුරටත් ඛණ්ඩනය කර අණුක බර අනුව එකතු කරන ලදී. විවිධ පූර්ව ප්‍රතිකාර වලින් මුදා හරින ලද සීනි මොනෝමර් සහ ඔලිගෝමර් සීනි සංයුතිය විශ්ලේෂණය මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. විවිධ පූර්ව ප්‍රතිකාර ක්‍රම මගින් ලබාගත් සීනි ඔලිගෝමර්වල අන්තර්ගතය සංසන්දනය කිරීමේදී, මුරණ්ඩු ඔලිගෝසැකරයිඩ තිබීම ජෛව ස්කන්ධය මොනෝසැකරයිඩ බවට පරිවර්තනය කිරීමේදී පොදු ගැටළුවක් වන අතර අවම වශයෙන් 10-15% ක් සහ 18% දක්වා පවා සීනි අස්වැන්න අඩු කිරීමට හේතු විය හැක. එක්සත් ජනපදය. මෙම ක්‍රමය ඔලිගෝසැකරයිඩ භාග තවදුරටත් විශාල පරිමාණයෙන් නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා භාවිතා කරයි. විවිධ අණුක බරින් යුත් එහි පසුකාලීන කොටස් මෙම කාර්යයේදී ඔලිගෝසැකරයිඩවල ගුනාංගීකරනය සඳහා පර්යේෂණාත්මක ද්‍රව්‍ය ලෙස භාවිතා කරන ලදී.
පූර්ව ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් සහ එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය කිරීමෙන් පසුව, අඛණ්ඩ ඔලිගෝසැකරයිඩ ජල විච්ඡේදනය නොවී පැවතුනි. මෙහි (A) යනු ඔලිගෝසැකරයිඩ AFEX-පූර්ව ප්‍රතිකාර කළ ඉරිඟු උදුන ජල විච්ඡේදනය (ACSH) වලින් හුදකලා කරන ඔලිගෝසැකරයිඩ වෙන් කිරීමේ ක්‍රමයකි, එහිදී සක්‍රිය කාබන් සහ ඩයටෝමැසියස් පෘථිවියේ ඇසුරුම් කළ ඇඳක් භාවිතා කරයි; (B) ඔලිගෝසැකරයිඩ වෙන් කිරීමේ ක්‍රමය. ඔලිගෝසැකරයිඩ ප්‍රමාණය බැහැර කිරීමේ වර්ණදේහ (SEC) මගින් තවදුරටත් වෙන් කරන ලදී; (C) විවිධ පූර්ව ප්‍රතිකාර වලින් මුදා හරින ලද සැකරයිඩ මොනෝමර් සහ ඔලිගෝමර් (තනුක කළ අම්ලය: DA, අයනික ද්‍රවය: IL සහ AFEX). එන්සයිම ජල විච්ඡේදන තත්වයන්: 25% ක ඉහළ ඝන ද්‍රව්‍ය පැටවීම (w/w) (ආසන්න වශයෙන් 8% ග්ලූකන් පැටවීම), පැය 96 ජල විච්ඡේදනය, 20 mg/g වාණිජ එන්සයිම පැටවීම (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 අනුපාතය) සහ (D) AFEX පූර්ව ප්‍රතිකාර කළ ඉරිඟු උදුන (ACS) වෙතින් නිකුත් කරන ලද ග්ලූකෝස්, සයිලෝස් සහ ඇරබිනෝස් වල සීනි මොනෝමර් සහ ඔලිගෝමර්.
ඝන ජෛව ස්කන්ධ අපද්‍රව්‍ය වලින් හුදකලා වූ නිස්සාරණවල ග්ලයිකන් පිළිබඳ පුළුල් ව්‍යුහාත්මක විශ්ලේෂණයක් සඳහා ග්ලයිකන් විශ්ලේෂණය ප්‍රයෝජනවත් මෙවලමක් බව ඔප්පු වී ඇත. කෙසේ වෙතත්, මෙම සාම්ප්‍රදායික ක්‍රමය භාවිතා කරමින් ජල-ද්‍රාව්‍ය සැකරයිඩ අඩුවෙන් නියෝජනය වේ41 මන්ද අඩු අණුක බර ඔලිගෝසැකරයිඩ ELISA තහඩු මත නිශ්චල කිරීමට අපහසු වන අතර ප්‍රතිදේහ එකතු කිරීමට පෙර සෝදා හරිනු ලැබේ. එබැවින්, ප්‍රතිදේහ බන්ධනය සහ ලක්ෂණකරණය සඳහා, ඇවිඩින්-ආලේපිත ELISA තහඩු මත ද්‍රාව්‍ය, අනුකූල නොවන ඔලිගෝසැකරයිඩ ආලේප කිරීම සඳහා එක්-පියවර ජෛව ටයිනයිලේෂන් ක්‍රමයක් භාවිතා කරන ලදී. මෙම ක්‍රමය අපගේ කලින් නිෂ්පාදනය කරන ලද ACSH සහ එහි අණුක බර (හෝ බහුඅවයවීකරණ මට්ටම, DP) මත පදනම් වූ කොටසක් භාවිතයෙන් පරීක්ෂා කරන ලදී. කාබෝහයිඩ්‍රේටයේ අඩු කිරීමේ කෙළවරට බයෝටින්-LC-හයිඩ්‍රසයිඩ් එකතු කිරීමෙන් ඔලිගෝසැකරයිඩ බන්ධන සම්බන්ධතාවය වැඩි කිරීමට එක්-පියවර ජෛව ටයිනයිලේෂන් භාවිතා කරන ලදී (රූපය 2). ද්‍රාවණයේදී, අඩු කිරීමේ කෙළවරේ ඇති හෙමියාසිටල් කාණ්ඩය බයෝටින්-LC-හයිඩ්‍රසයිඩ් හි හයිඩ්‍රසයිඩ් කාණ්ඩය සමඟ ප්‍රතික්‍රියා කර හයිඩ්‍රසෝන් බන්ධනයක් සාදයි. NaCNBH3 අඩු කිරීමේ කාරකය ඉදිරියේ, හයිඩ්‍රසෝන් බන්ධනය ස්ථායී බයෝටිනයිලේටඩ් අවසාන නිෂ්පාදනයක් දක්වා අඩු කෙරේ. සීනි අඩු කිරීමේ අන්තය වෙනස් කිරීමත් සමඟ, අඩු DP ඔලිගෝසැකරයිඩ ELISA තහඩු වලට බන්ධනය කිරීමට හැකි වූ අතර, අපගේ අධ්‍යයනයේ දී මෙය ග්ලයිකන්-ඉලක්කගත mAbs භාවිතයෙන් ඇවිඩින්-ආලේපිත තහඩු මත සිදු කරන ලදී.
බයෝටිනයිලේටඩ් ඔලිගෝසැකරයිඩ සඳහා ELISA මත පදනම් වූ මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ පරීක්ෂා කිරීම. මෙහිදී (A) ඔලිගෝසැකරයිඩවල ඒකාබද්ධ බයෝටිනයිලේෂන් සහ පසුව නියුට්‍රාඅවිඩින් ආලේපිත තහඩු මත ග්ලයිකන්-ඉලක්කගත mAbs සමඟ ELISA පරීක්ෂාව සහ (B) ප්‍රතික්‍රියා නිෂ්පාදන බයෝටිනයිලේෂන් සඳහා එක්-පියවර ක්‍රියා පටිපාටියක් පෙන්වයි.
ඔලිගෝසැකරයිඩ-සංයුක්ත ප්‍රතිදේහ සහිත අවිඩින්-ආලේපිත තහඩු පසුව ප්‍රාථමික සහ ද්විතියික ප්‍රතිදේහවලට එකතු කර ආලෝක සහ කාල සංවේදී මාධ්‍යයකින් සෝදා හරින ලදී. ප්‍රතිදේහ බන්ධනය සම්පූර්ණ වූ පසු, තහඩුව පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීම සඳහා TMB උපස්ථරයක් එක් කරන්න. ප්‍රතික්‍රියාව අවසානයේ සල්ෆියුරික් අම්ලය සමඟ නතර කරන ලදී. ප්‍රතිදේහ-විශේෂිත හරස්-සම්බන්ධ කිරීම හඳුනා ගැනීම සඳහා එක් එක් ප්‍රතිදේහයේ බන්ධන ශක්තිය තීරණය කිරීම සඳහා පුර්ව ලියාපදිංචි තහඩු ELISA කියවනයක් භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. අත්හදා බැලීමේ විස්තර සහ පරාමිතීන් සඳහා, අනුරූප කොටස "ද්‍රව්‍ය සහ ක්‍රම" බලන්න.
ACSH හි ඇති ද්‍රාව්‍ය ඔලිගෝසැකරයිඩ මෙන්ම ලිග්නොසෙලියුලෝසික් හයිඩ්‍රොලයිසේට් වලින් හුදකලා කරන ලද අමු සහ පිරිසිදු කරන ලද ඔලිගෝසැකරයිඩ කොටස් වල සංලක්ෂිත කිරීමෙන්, විශේෂිත යෙදුම් සඳහා මෙම අලුතින් සංවර්ධනය කරන ලද ක්‍රමයේ උපයෝගීතාව අපි පෙන්නුම් කරමු. රූපය 3 හි පෙන්වා ඇති පරිදි, ජෛව ඇසිලේටඩ් ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණ ක්‍රම භාවිතයෙන් ACSH හි හඳුනාගත් වඩාත් සුලභ එපිටෝප්-ආදේශක සයිලාන් සාමාන්‍යයෙන් යූරොනික් (U) හෝ මෙතිලුරොනික් (MeU) සහ පෙක්ටික් අරාබිනොගලැක්ටන් වේ. ඒවායින් බොහොමයක් ජල විච්ඡේදනය නොකළ ඝන ද්‍රව්‍යවල (UHS) ග්ලයිකන් විශ්ලේෂණය පිළිබඳ අපගේ පෙර අධ්‍යයනයේදී ද සොයා ගන්නා ලදී43.
සෛල බිත්ති ග්ලයිකන් වෙත යොමු කරන ලද මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහයක් භාවිතයෙන් ප්‍රතිචක්‍රීකරණ ඔලිගෝසැකරයිඩ එපිටෝප් හඳුනා ගැනීම. "උදාසීන" කොටස ACN කොටස වන අතර "ආම්ලික" කොටස FA කොටස වේ. තාප සිතියමේ දීප්තිමත් රතු පැහැයෙන් ඉහළ එපිටෝප් අන්තර්ගතයක් පෙන්නුම් කරන අතර දීප්තිමත් නිල් පැහැයෙන් හිස් පසුබිමක් දක්වයි. පරිමාණයේ වර්ණ අගයන් N=2 සූත්‍රගත කිරීම සඳහා අමු OD අගයන් මත පදනම් වේ. ප්‍රතිදේහ මගින් හඳුනාගත් ප්‍රධාන එපිටෝප් දකුණු පසින් දක්වා ඇත.
පරීක්ෂා කරන ලද වාණිජ එන්සයිම මිශ්‍රණයේ බහුලව භාවිතා වන වාණිජ එන්සයිම ඇතුළත් වන වඩාත් සුලභ සෙලියුලේස් සහ අර්ධ සෙලියුලේස් මගින් මෙම සෙලියුලෝස් නොවන ව්‍යුහයන් වෙන් කළ නොහැක. එබැවින්, ඒවායේ ජල විච්ඡේදනය සඳහා නව සහායක එන්සයිම අවශ්‍ය වේ. අවශ්‍ය සෙලියුලෝස් නොවන උපාංග එන්සයිම නොමැතිව, මෙම සෙලියුලෝස් නොවන බන්ධන මොනොසැකරයිඩ බවට සම්පූර්ණ පරිවර්තනය වළක්වයි, ඒවායේ මව් සීනි පොලිමර් පුළුල් ලෙස කෙටි කොටස් බවට ජල විච්ඡේදනය කර වාණිජ එන්සයිම මිශ්‍රණ භාවිතයෙන් විසුරුවා හරිනු ලැබුවද.
සංඥා ව්‍යාප්තිය සහ එහි බන්ධන ශක්තිය පිළිබඳ වැඩිදුර අධ්‍යයනයකින් පෙන්නුම් කළේ ඉහළ DP සීනි කොටස්වල (A, B, C, DP 20+ දක්වා) බන්ධන එපිටෝප් අඩු බවයි. ඩයිමර්වල අඩු DP කොටස්වල (D, E, F, DP) වඩා අඩුය (රූපය 1). අම්ල කොටස් සෙලියුලෝස් නොවන එපිටෝප් වල උදාසීන කොටස් වලට වඩා බහුලව දක්නට ලැබේ. මෙම සංසිද්ධි අපගේ පෙර අධ්‍යයනයේ නිරීක්ෂණය කරන ලද රටාවට අනුකූල වේ, එහිදී ඉහළ DP සහ අම්ල කොටස් එන්සයිම ජල විච්ඡේදනයට වඩා ප්‍රතිරෝධී විය. එබැවින්, සෙලියුලෝස් නොවන ග්ලයිකන් එපිටෝප් සහ U සහ MeU ආදේශක පැවතීම ඔලිගෝසැකරයිඩවල ස්ථායිතාවයට බෙහෙවින් දායක විය හැකිය. බන්ධන සහ හඳුනාගැනීමේ කාර්යක්ෂමතාව අඩු DP ඔලිගෝසැකරයිඩ සඳහා ගැටළු සහගත විය හැකි බව සැලකිල්ලට ගත යුතුය, විශේෂයෙන් එපිටෝප් ඩයිමරික් හෝ ට්‍රයිමරික් ඔලිගෝසැකරයිඩයක් නම්. මෙය විවිධ දිගකින් යුත් වාණිජ ඔලිගෝසැකරයිඩ භාවිතයෙන් පරීක්ෂා කළ හැකි අතර, ඒ සෑම එකක්ම නිශ්චිත mAb එකකට බන්ධනය වන එක් එපිටෝප් එකක් පමණක් අඩංගු වේ.
මේ අනුව, ව්‍යුහ-විශේෂිත ප්‍රතිදේහ භාවිතය මගින් ඇතැම් ආකාරයේ ප්‍රති-කැල්සිට්‍රන්ට් බන්ධන අනාවරණය විය. භාවිතා කරන ප්‍රතිදේහ වර්ගය, සුදුසු බන්ධන රටාව සහ එය නිපදවන සංඥාවේ ශක්තිය (වඩාත්ම සහ අවම වශයෙන් බහුල) මත පදනම්ව, නව එන්සයිම හඳුනාගෙන වඩාත් සම්පූර්ණ ග්ලයිකෝ පරිවර්තනය සඳහා එන්සයිම මිශ්‍රණයට අර්ධ ප්‍රමාණාත්මකව එකතු කළ හැකිය. උදාහරණයක් ලෙස ACSH ඔලිගෝසැකරයිඩ විශ්ලේෂණය ගනිමින්, අපට එක් එක් ජෛව ස්කන්ධ ද්‍රව්‍ය සඳහා ග්ලයිකන් බන්ධන දත්ත සමුදායක් නිර්මාණය කළ හැකිය. ප්‍රතිදේහවල විවිධ සම්බන්ධතාවය සැලකිල්ලට ගත යුතු බවත්, ඒවායේ සම්බන්ධතාවය නොදන්නා නම්, විවිධ ප්‍රතිදේහවල සංඥා සංසන්දනය කිරීමේදී මෙය යම් යම් දුෂ්කරතා ඇති කරන බවත් මෙහිදී සටහන් කළ යුතුය. ඊට අමතරව, එකම ප්‍රතිදේහය සඳහා සාම්පල අතර ග්ලයිකන් බන්ධන සංසන්දනය කිරීම වඩාත් හොඳින් ක්‍රියා කළ හැකිය. මෙම මුරණ්ඩු බන්ධන පසුව CAZyme දත්ත සමුදායට සම්බන්ධ කළ හැකි අතර, එයින් අපට එන්සයිම හඳුනා ගැනීමට, අපේක්ෂක එන්සයිම තෝරා ගැනීමට සහ බන්ධන බිඳ දැමීමේ එන්සයිම සඳහා පරීක්ෂා කිරීමට හෝ ජෛව පිරිපහදු 44 සඳහා මෙම එන්සයිම ප්‍රකාශ කිරීමට ක්ෂුද්‍රජීවී පද්ධති සංවර්ධනය කිරීමට හැකිය.
ලිග්නොසෙලියුලෝසික් හයිඩ්‍රොලයිසේට් වල ඇති අඩු අණුක බර ඔලිගෝසැකරයිඩ සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්‍රම විකල්ප ක්‍රමවලට අනුපූරක වන ආකාරය ඇගයීමට, අපි එකම පුවරුවේ (රූපය 5) ඔලිගෝසැකරයිඩ කොටසෙහි MALDI (රූපය 4, S1-S8) සහ GC-MS මත පදනම් වූ TMS-ව්‍යුත්පන්න සැචරයිඩ විශ්ලේෂණය සිදු කළෙමු. ඔලිගෝසැකරයිඩ අණු වල ස්කන්ධ ව්‍යාප්තිය අපේක්ෂිත ව්‍යුහයට ගැලපෙනවාද යන්න සංසන්දනය කිරීමට MALDI භාවිතා කරයි. රූපය 4 හි උදාසීන සංරචක ACN-A සහ ACN-B හි MC පෙන්වයි. ACN-A විශ්ලේෂණය DP 4–8 (රූපය 4) සිට DP 22 (රූපය S1) දක්වා පරාසයක පෙන්ටෝස් සීනි පරාසයක් තහවුරු කළ අතර, එහි බර MeU-xylan ඔලිගෝසැකරයිඩ වලට අනුරූප වේ. ACN-B විශ්ලේෂණය DP 8-15 සමඟ පෙන්ටෝස් සහ ග්ලූකොක්සිලන් ශ්‍රේණිය තහවුරු කළේය. රූපය S3 වැනි අතිරේක ද්‍රව්‍යවල, FA-C ආම්ලික කොටස් ස්කන්ධ ව්‍යාප්ති සිතියම් මඟින් ELISA මත පදනම් වූ mAb පරීක්ෂාවේදී හමු වූ ආදේශක සයිලන් සමඟ අනුකූල වන 8-15 DP සහිත (Me)U ආදේශක පෙන්ටෝස් සීනි පරාසයක් පෙන්වයි. එපිටෝප් අනුකූල වේ.
ACS හි පවතින ද්‍රාව්‍ය අනුකූල නොවන ඔලිගෝසැකරයිඩ වල MALDI-MS වර්ණාවලිය. මෙහිදී, (A) මෙතිලේටඩ් යූරොනික් අම්ලය (DP 4-8) අඩංගු ACN-A අඩු බර පරාස භාග ග්ලූකුරොක්සිලන් ඔලිගෝසැකරයිඩ ආදේශ කර ඇති අතර (B) ග්ලූකුරොක්සිලන් (DP 8-15) සමඟ ආදේශ කර ඇති ACN-B සයිලන් සහ මෙතිලේටඩ් යූරෝනික් අම්ල ඔලිගෝසැකරයිඩ.
පරාවර්තක ඔලිගෝසැකරයිඩවල ග්ලයිකන් අවශේෂයේ සංයුතිය විශ්ලේෂණය කිරීම. මෙන්න (A) GC-MS විශ්ලේෂණය භාවිතයෙන් ලබාගත් විවිධ ඔලිගෝසැකරයිඩ භාගවල TMS සැචරයිඩ සංයුතිය. (B) ඔලිගෝසැකරයිඩවල ඇති විවිධ TMS-ව්‍යුත්පන්න සීනිවල ව්‍යුහයන්. ACN - උදාසීන ඔලිගෝසැකරයිඩ අඩංගු ඇසිටෝනයිට්‍රයිල් භාගය සහ අම්ල ඔලිගෝසැකරයිඩ අඩංගු FA - ෆෙරුලික් අම්ල භාගය.
රූප සටහන S9 හි පෙන්වා ඇති පරිදි ඔලිගෝසැකරයිඩ භාගයේ LC-MS විශ්ලේෂණයෙන් තවත් රසවත් නිගමනයක් ලබා ගන්නා ලදී (ක්‍රම ඉලෙක්ට්‍රොනික අතිරේක ද්‍රව්‍යවල දැකිය හැකිය). ACN-B භාගයේ බන්ධනය අතරතුර හෙක්සෝස් සහ -OAc කාණ්ඩවල කොටස් නැවත නැවතත් නිරීක්ෂණය කරන ලදී. මෙම සොයා ගැනීම ග්ලයිකෝම් සහ MALDI-TOF විශ්ලේෂණයේ නිරීක්ෂණය කරන ලද ඛණ්ඩනය තහවුරු කරනවා පමණක් නොව, පූර්ව ප්‍රතිකාර කළ ලිග්නොසෙලියුලෝසික් ජෛව ස්කන්ධයේ විභව කාබෝහයිඩ්‍රේට් ව්‍යුත්පන්නයන් පිළිබඳ නව තොරතුරු ද සපයයි.
අපි TMS සීනි ව්‍යුත්පන්නකරණය භාවිතයෙන් ඔලිගෝසැකරයිඩ භාගයේ සීනි සංයුතිය විශ්ලේෂණය කළෙමු. GC-MS භාවිතා කරමින්, ඔලිගෝසැකරයිඩ භාගයේ ස්නායුක (ව්‍යුත්පන්න නොවන) සහ ආම්ලික සීනි (GluA සහ GalA) සංයුතිය අපි තීරණය කළෙමු (රූපය 5). ග්ලූකුරෝනික් අම්ලය C සහ D ආම්ලික සංරචක වල දක්නට ලැබෙන අතර, ගැලැක්ටුරෝනික් අම්ලය A සහ ​​B ආම්ලික සංරචක වල දක්නට ලැබේ, මේ දෙකම ආම්ලික සීනි වල ඉහළ DP සංරචක වේ. මෙම ප්‍රතිඵල අපගේ ELISA සහ MALDI දත්ත තහවුරු කරනවා පමණක් නොව, ඔලිගෝසැකරයිඩ සමුච්චය කිරීම පිළිබඳ අපගේ පෙර අධ්‍යයනයන්ට ද අනුකූල වේ. එබැවින්, ඔලිගෝසැකරයිඩ වල බයෝටිනයිලීකරණය සහ පසුව ELISA පරීක්ෂාව භාවිතා කරන නවීන ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්‍රම විවිධ ජීව විද්‍යාත්මක සාම්පලවල ද්‍රාව්‍ය ප්‍රතිචක්‍රීකරණ ඔලිගෝසැකරයිඩ හඳුනා ගැනීමට ප්‍රමාණවත් බව අපි විශ්වාස කරමු.
ELISA මත පදනම් වූ mAb පරීක්ෂණ ක්‍රම විවිධ ක්‍රම කිහිපයකින් වලංගු කර ඇති බැවින්, මෙම නව ප්‍රමාණාත්මක ක්‍රමයේ විභවය තවදුරටත් ගවේෂණය කිරීමට අපට අවශ්‍ය විය. වාණිජ ඔලිගෝසැකරයිඩ දෙකක්, සයිලෝහෙක්සාසැකරයිඩ ඔලිගෝසැකරයිඩ (XHE) සහ 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) මිලදී ගෙන සෛල බිත්ති ග්ලයිකන් ඉලක්ක කරගත් නව mAb ප්‍රවේශයක් භාවිතයෙන් පරීක්ෂා කරන ලදී. රූපය 6 ජෛව-ටයිනයිලේටඩ් බන්ධන සංඥාව සහ ඔලිගෝසැකරයිඩ සාන්ද්‍රණයේ ලොග් සාන්ද්‍රණය අතර රේඛීය සහසම්බන්ධයක් පෙන්නුම් කරයි, එය හැකි ලැන්ග්මුයර් අවශෝෂණ ආකෘතියක් යෝජනා කරයි. mAbs අතර, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, සහ CCRC-M151 XHE සමඟ සහසම්බන්ධ වන අතර CCRC-M108, CCRC-M109, සහ LM11 1 nm සිට 100 නැනෝ පරාසයක A2XX සමඟ සහසම්බන්ධ වේ. අත්හදා බැලීම අතරතුර ප්‍රතිදේහ සීමිත ලෙස ලබා ගැනීම නිසා, එක් එක් ඔලිගෝසැකරයිඩ සාන්ද්‍රණය සමඟ සීමිත අත්හදා බැලීම් සිදු කරන ලදී. සමහර ප්‍රතිදේහ උපස්ථරයක් ලෙස එකම ඔලිගෝසැකරයිඩයට බෙහෙවින් වෙනස් ලෙස ප්‍රතික්‍රියා කරන බව මෙහිදී සටහන් කළ යුතුය, මන්ද ඒවා තරමක් වෙනස් එපිටෝප් වලට බන්ධනය වන අතර ඉතා වෙනස් බන්ධන සම්බන්ධතා තිබිය හැකිය. නව mAb ප්‍රවේශය සැබෑ සාම්පල සඳහා යොදන විට නිවැරදි එපිටෝප් හඳුනාගැනීමේ යාන්ත්‍රණ සහ ඇඟවුම් වඩාත් සංකීර්ණ වනු ඇත.
විවිධ ග්ලයිකන්-ඉලක්කගත mAbs වල හඳුනාගැනීමේ පරාසය තීරණය කිරීම සඳහා වාණිජ ඔලිගෝසැකරයිඩ දෙකක් භාවිතා කරන ලදී. මෙහිදී, ඔලිගෝසැකරයිඩ සාන්ද්‍රණයේ ලොග් සාන්ද්‍රණය සමඟ රේඛීය සහසම්බන්ධතා මගින් (A) XHE සඳහා mAb සමඟ සහ (B) A2XX සඳහා mAb සමඟ ලැන්ග්මුයර් අවශෝෂණ රටා පෙන්නුම් කරයි. අනුරූප එපිටෝප් මඟින් විශ්ලේෂණයේ උපස්ථර ලෙස භාවිතා කරන වාණිජ ඔලිගෝසැකරයිඩවල ව්‍යුහයන් දක්වයි.
ග්ලයිකන්-ඉලක්කගත මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ භාවිතය (ග්ලයිකොකොමික් විශ්ලේෂණය හෝ ELISA-පාදක mAb පරීක්ෂාව) ශාක ජෛව ස්කන්ධය සෑදෙන ප්‍රධාන සෛල බිත්ති ග්ලයිකන් බොහොමයක ගැඹුරු ගුනාංගීකරණය සඳහා ප්‍රබල මෙවලමකි. කෙසේ වෙතත්, සම්භාව්‍ය ග්ලයිකන් විශ්ලේෂණය විශාල සෛල බිත්ති ග්ලයිකන් පමණක් සංලක්ෂිත කරයි, මන්ද බොහෝ ඔලිගෝසැකරයිඩ ELISA තහඩු මත කාර්යක්ෂමව නිශ්චල නොවේ. මෙම අධ්‍යයනයේ දී, AFEX-පූර්ව ප්‍රතිකාර කළ ඉරිඟු උදුන ඉහළ ඝන ද්‍රව්‍ය අන්තර්ගතයකදී එන්සයිමමය වශයෙන් ජල විච්ඡේදනය කරන ලදී. හයිඩ්‍රොලයිසේට් හි ප්‍රතිචක්‍රීකරණ සෛල බිත්ති කාබෝහයිඩ්‍රේට් වල සංයුතිය තීරණය කිරීම සඳහා සීනි විශ්ලේෂණය භාවිතා කරන ලදී. කෙසේ වෙතත්, හයිඩ්‍රොලයිසේට් වල කුඩා ඔලිගෝසැකරයිඩවල mAb විශ්ලේෂණය අවතක්සේරු කර ඇති අතර, ELISA තහඩු මත ඔලිගෝසැකරයිඩ ඵලදායී ලෙස නිශ්චල කිරීමට අමතර මෙවලම් අවශ්‍ය වේ.
නියුට්‍රාඇවිඩින්™ ආලේපිත තහඩු මත ඔලිගෝසැකරයිඩ බයෝටිනයිලේෂන් සහ ELISA පරීක්ෂාව ඒකාබද්ධ කිරීමෙන් mAb පරීක්ෂාව සඳහා නව සහ කාර්යක්ෂම ඔලිගෝසැකරයිඩ ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්‍රමයක් අපි මෙහි වාර්තා කරමු. නිශ්චල නොවන බයෝටිනයිලේටඩ් ඔලිගෝසැකරයිඩ ප්‍රතිදේහයට ප්‍රමාණවත් ඇල්මක් පෙන්නුම් කළේ ප්‍රතිචක්‍රීකරණ ඔලිගෝසැකරයිඩ වේගවත් හා කාර්යක්ෂමව හඳුනා ගැනීමට හැකි වන පරිදි ය. ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය මත පදනම් වූ මෙම මුරණ්ඩු ඔලිගෝසැකරයිඩවල සංයුතිය විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් ප්‍රතිශක්තිකරණ පරීක්ෂාව සඳහා මෙම නව ප්‍රවේශයේ ප්‍රතිඵල තහවුරු විය. මේ අනුව, මෙම අධ්‍යයනයන් පෙන්නුම් කරන්නේ ඔලිගෝසැකරයිඩවල හරස් සබැඳි හඳුනා ගැනීමට ඔලිගෝසැකරයිඩ බයෝටිනයිලේෂන් සහ ELISA පරීක්ෂාව ග්ලයිකන්-ඉලක්කගත මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ සමඟ සංයෝජනය භාවිතා කළ හැකි බවත් ඔලිගෝසැකරයිඩවල ව්‍යුහය සංලක්ෂිත අනෙකුත් ජෛව රසායනික අධ්‍යයනයන්හි බහුලව යෙදිය හැකි බවත්ය.
මෙම බයෝටින් මත පදනම් වූ ග්ලයිකන් පැතිකඩකරණ ක්‍රමය ශාක ජෛව ස්කන්ධයේ ද්‍රාව්‍ය ඔලිගෝසැකරයිඩවල ප්‍රතිචක්‍රීකරණ කාබෝහයිඩ්‍රේට් බන්ධන විමර්ශනය කළ හැකි පළමු වාර්තාවයි. ජෛව ඉන්ධන නිෂ්පාදනය සම්බන්ධයෙන් ජෛව ස්කන්ධයේ සමහර කොටස් මෙතරම් මුරණ්ඩු වන්නේ මන්දැයි තේරුම් ගැනීමට මෙය උපකාරී වේ. මෙම ක්‍රමය ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණ ක්‍රමවල වැදගත් පරතරයක් පුරවන අතර ශාක ඔලිගෝසැකරයිඩවලින් ඔබ්බට පුළුල් පරාසයක උපස්ථර වෙත එහි යෙදුම ව්‍යාප්ත කරයි. අනාගතයේදී, අපට ජෛව ටයිනයිලීකරණය සඳහා රොබෝ විද්‍යාව භාවිතා කළ හැකි අතර ELISA භාවිතයෙන් සාම්පලවල ඉහළ ප්‍රතිදාන විශ්ලේෂණය සඳහා අප විසින් සංවර්ධනය කර ඇති ක්‍රමය භාවිතා කළ හැකිය.
Pioneer 33A14 දෙමුහුන් බීජ වලින් වගා කරන ලද ඉරිඟු පිදුරු (CS) 2010 දී කොලරාඩෝවේ රේ හි ක්‍රේමර් ෆාම්ස් වෙතින් අස්වනු නෙලනු ලැබීය. ඉඩම් හිමියාගේ අවසරය ඇතිව, මෙම ජෛව ස්කන්ධය පර්යේෂණ සඳහා භාවිතා කළ හැකිය. සාම්පල කාමර උෂ්ණත්වයේ දී වියළිව 6% ට අඩු තෙතමනයක් සහිත සිප්-ලොක් බෑග්වල ගබඩා කර ඇත. සාම්පල කාමර උෂ්ණත්වයේ දී වියළිව 6% ට අඩු තෙතමනයක් සහිත සිප්-ලොක් බෑග්වල ගබඩා කර ඇත. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной темпее. සාම්පල කාමර උෂ්ණත්වයේ දී සිපර් බෑග්වල වියළිව <6% ආර්ද්‍රතාවයේ ගබඩා කර ඇත.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. සාම්පල කාමර උෂ්ණත්වයේ දී ආර්ද්‍රතාවය 6% ට අඩු සිපර් බෑග්වල ගබඩා කර ඇත.මෙම අධ්‍යයනය දේශීය හා ජාතික මාර්ගෝපදේශවලට අනුකූල විය. NREL ප්‍රොටෝකෝලය භාවිතයෙන් සංයුති විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී. සංයුතියේ 31.4% ග්ලූකන්, 18.7% සයිලන්, 3.3% ඇරබිනන්, 1.2% ගැලැක්ටන්, 2.2% ඇසිටිල්, 14.3% ලිග්නින්, 1.7% ප්‍රෝටීන් සහ 13. 4% අළු අඩංගු බව සොයා ගන්නා ලදී.
සෙලික්® CTec2 (138 mg ප්‍රෝටීන්/මිලි, ලොට් VCNI 0001) යනු නොවොසයිම්ස් (ෆ්‍රෑන්ක්ලින්ටන්, NC, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) වෙතින් සෙලියුලේස්, β-ග්ලූකෝසයිඩේස් සහ සෙලික්® HTec2 (157 mg ප්‍රෝටීන්/මිලි, ලොට් VHN00001) හි සංකීර්ණ මිශ්‍රණයකි. පෙක්ටින් හායන එන්සයිමවල සංකීර්ණ මිශ්‍රණයක් වන බහුකාර්ය පෙක්ටිනේස්® (72 mg ප්‍රෝටීන්/මිලි) ඩූපොන්ට් කාර්මික ජෛව විද්‍යාව (පැලෝ ඇල්ටෝ, CA, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) විසින් පරිත්‍යාග කරන ලදී. එන්සයිම ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය තීරණය කරනු ලැබුවේ කෙල්ඩාල් නයිට්‍රජන් විශ්ලේෂණය භාවිතා කරමින් ප්‍රෝටීන් අන්තර්ගතය තක්සේරු කිරීම (සහ ප්‍රෝටීන් නොවන නයිට්‍රජන් දායකත්වය අඩු කිරීම) මගිනි (AOAC ක්‍රමය 2001.11, ඩයරි වන් කෝපරේටිව් ඉන්කෝපරේෂන්, ඉතාකා, NY, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය). ඩයටෝමැසියස් පෘථිවිය 545 EMD මිලිපෝර් (බිලරිකා, MA) වෙතින් මිලදී ගන්නා ලදී. සක්‍රිය කාබන් (DARCO, දැල් කැටිති 100), Avicel (PH-101), beech xylan සහ අනෙකුත් සියලුම රසායනික ද්‍රව්‍ය Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) වෙතින් මිලදී ගන්නා ලදී.
AFEX පූර්ව ප්‍රතිකාරය GLBRC (ජෛව පරිවර්තන පර්යේෂණ රසායනාගාරය, MSU, ලැන්සිං, MI, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) හිදී සිදු කරන ලදී. පූර්ව ප්‍රතිකාරය 140°C දී මිනිත්තු 15ක් සිදු කරන ලදී. මල නොබැඳෙන වානේ බංකු මුදුන කාණ්ඩ ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක (Parr Instruments Company) 60% (w/w) පැටවීමේදී නිර්ජලීය ඇමෝනියා ජෛව ස්කන්ධයට 1:1 අනුපාතයකින් 46 නේවාසික කාලය. එයට මිනිත්තු 30ක් ගත විය. ප්‍රතික්‍රියාකාරකය 140°C දක්වා ගෙන එන ලද අතර ඇමෝනියා වේගයෙන් මුදා හරින ලද අතර එමඟින් ජෛව ස්කන්ධය ඉක්මනින් කාමර උෂ්ණත්වයට නැවත පැමිණීමට ඉඩ සැලසේ. AFEX පූර්ව ප්‍රතිකාර කළ ඉරිඟු උදුනේ (ACS) සංයුතිය ප්‍රතිකාර නොකළ ඉරිඟු උදුනේ (UT-CS) සංයුතියට සමාන විය.
ඔලිගෝසැකරයිඩ මහා පරිමාණයෙන් නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා ආරම්භක ද්‍රව්‍යයක් ලෙස ඉහළ ඝන ද්‍රව්‍ය ACSH 25% (w/w) (ආසන්න වශයෙන් 8% ඩෙක්ස්ට්‍රාන් පැටවීම) සකස් කරන ලදී. Cellic® Ctec2 10 mg ප්‍රෝටීන්/g ග්ලූකන් (පූර්ව ප්‍රතිකාර කළ ජෛව ස්කන්ධය තුළ), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg ප්‍රෝටීන්/g ග්ලූකන් සහ Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) ඇතුළු වාණිජ එන්සයිම මිශ්‍රණයක් භාවිතයෙන් ACS හි එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය සිදු කරන ලදී. ), 5 mg ප්‍රෝටීන්/g ඩෙක්ස්ට්‍රාන්. ලීටර් 3 ක වැඩ කරන පරිමාවක් සහිත ලීටර් 5 ක ජෛව ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක එන්සයිම ජල විච්ඡේදනය සිදු කරන ලදී, pH අගය 4.8, 50°C සහ 250 rpm. පැය 96 ක් ජල විච්ඡේදනය කිරීමෙන් පසු, ජල විච්ඡේදනය නොකළ ඝන ද්‍රව්‍ය ඉවත් කිරීම සඳහා මිනිත්තු 30 ක් සඳහා 6000 rpm හි කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් සහ පසුව 14000 rpm හි විනාඩි 30 ක් සඳහා ජල විච්ඡේදනය නොකළ ඝන ද්‍රව්‍ය එකතු කරන ලදී. ඉන්පසු ජල විච්ඡේදනය 0.22 mm පෙරහන් බීකරයක් හරහා විෂබීජහරණය කරන ලද පෙරීමකට ලක් කරන ලදී. පෙරන ලද ජල විච්ඡේදනය 4° C හි විෂබීජහරණය කළ බෝතල්වල ගබඩා කර පසුව කාබන් මත ඛණ්ඩනය කරන ලදී.
NREL රසායනාගාර විශ්ලේෂණ ක්‍රියා පටිපාටිවලට අනුව සාරය මත පදනම් වූ ජෛව ස්කන්ධ සාම්පලවල සංයුතිය විශ්ලේෂණය කිරීම: සංයුති විශ්ලේෂණය සඳහා සාම්පල සකස් කිරීම (NREL/TP-510-42620) සහ ජෛව ස්කන්ධයේ ව්‍යුහාත්මක කාබෝහයිඩ්‍රේට් සහ ලිග්නින් තීරණය කිරීම (NREL/TP-510 – 42618)47.
ඔටෝක්ලේව් පාදක අම්ල ජල විච්ඡේදක ක්‍රමයක් භාවිතා කරමින් හයිඩ්‍රොලයිසේට් ප්‍රවාහයේ ඔලිගෝසැකරයිඩ විශ්ලේෂණය මිලි ලීටර් 2 පරිමාණයකින් සිදු කරන ලදී. හයිඩ්‍රොලයිසේට් සාම්පලය 72% සල්ෆියුරික් අම්ලයේ 69.7 µl සමඟ මිලි ලීටර් 10 ක ඉස්කුරුප්පු කැප් සංස්කෘතික නළයක මිශ්‍ර කර 121 °C දී බංකුවක් මත පැය 1 ක් පුර්ව ගන්වා, අයිස් මත සිසිල් කර ඉහළ කාර්යසාධනයක් සහිත ද්‍රව වර්ණදේහ (HPLC) කුප්පියකට පෙරහන් කරන්න. ඔලිගෝසැකරයිඩ සාන්ද්‍රණය තීරණය කරනු ලැබුවේ අම්ල-ජල විච්ඡේදනය කළ සාම්පලයේ මුළු සීනි සාන්ද්‍රණයෙන් හයිඩ්‍රොලයිසේට් නොකළ සාම්පලයේ මොනොසැකරයිඩ සාන්ද්‍රණය අඩු කිරීමෙනි.
අම්ල ජල විච්ඡේදනය කරන ලද ජෛව ස්කන්ධයේ ග්ලූකෝස්, සයිලෝස් සහ ඇරබිනෝස් සාන්ද්‍රණයන් විශ්ලේෂණය කරන ලද්දේ බයෝ-රැඩ් ඇමිනෙක්ස් HPX-87H තීරුවක ස්වයංක්‍රීය සාම්පලයක්, තීරු තාපකයක්, සමස්ථානික පොම්පයක් සහ වර්තන දර්ශක අනාවරකයක් සහිත ෂිමාඩ්සු HPLC පද්ධතියක් භාවිතා කරමිනි. තීරුව 50°C දී පවත්වා ගෙන යන ලද අතර ජල ප්‍රවාහයේ 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 සමඟ ඉවත් කරන ලදී.
හයිඩ්‍රොලයිසේට් සුපර්නැටන්ට් එක තනුක කර මොනෝමර් සහ ඔලිගෝසැකරයිඩ අන්තර්ගතය සඳහා විශ්ලේෂණය කරන ලදී. එන්සයිම ජල විච්ඡේදනයෙන් පසු ලබාගත් මොනෝමරික් සීනි, ජෛව-රැඩ් (හර්කියුලිස්, කැලිෆෝනියා) ඇමිනෙක්ස් HPX-87P තීරුවකින් සහ අළු ආරක්ෂක තීරුවකින් සමන්විත HPLC මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. තීරු උෂ්ණත්වය 80°C හි පවත්වා ගෙන යන ලද අතර, ජලය 0.6 ml/min ප්‍රවාහ අනුපාතයක් සහිත ජංගම අවධිය ලෙස භාවිතා කරන ලදී. යොමු 41, 48, 49 හි විස්තර කර ඇති ක්‍රමවලට අනුව 121°C දී තනුක අම්ලයේ ජල විච්ඡේදනයෙන් ඔලිගෝසැකරයිඩ තීරණය කරන ලදී.
අමු, AFEX පූර්ව ප්‍රතිකාර කළ සහ සියලුම ජල විච්ඡේදනය නොකළ ජෛව විච්ඡේදක අපද්‍රව්‍ය (අනුක්‍රමික සෛල බිත්ති සාරය නිෂ්පාදනය සහ ඒවායේ mAb පරීක්ෂාව ඇතුළුව) මත සැකරයිඩ් විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලද්දේ කලින් විස්තර කරන ලද ක්‍රියා පටිපාටි 27, 43, 50, 51 භාවිතා කරමිනි. ග්ලයිකෝම් විශ්ලේෂණය සඳහා, ශාක සෛල බිත්ති ද්‍රව්‍යවල ඇල්කොහොල්-දිය නොවන අපද්‍රව්‍ය ජෛව ස්කන්ධ අපද්‍රව්‍ය වලින් සකස් කර ඇමෝනියම් ඔක්සලේට් (50 mM), සෝඩියම් කාබනේට් (50 mM සහ 0.5% w/v), CON. (1M සහ 4M, දෙකම 1% w/v සෝඩියම් බෝරෝහයිඩ්‍රයිඩ් සමඟ) සහ කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි අම්ල ක්ලෝරයිට් වැනි වැඩි වැඩියෙන් ආක්‍රමණශීලී ප්‍රතික්‍රියාකාරක සමඟ අනුක්‍රමික නිස්සාරණයට භාජනය වේ. පසුව සාරය සෛල බිත්ති ග්ලයිකන් වෙත යොමු කරන ලද mAb50s සංකීර්ණ පුවරුවකට එරෙහිව ELISA වලට භාජනය කරන ලද අතර mAb බන්ධන ප්‍රතික්‍රියා තාප සිතියමක් ලෙස ඉදිරිපත් කරන ලදී. ශාක සෛල බිත්ති ග්ලයිකන් ඉලක්ක කරගත් mAbs රසායනාගාර තොගවලින් (CCRC, JIM සහ MAC ශ්‍රේණි) මිලදී ගන්නා ලදී.
ඔලිගෝසැකරයිඩවල එක්-පියවර බයෝටයිනයිලේෂන්. බයෝටින්-LC-හයිඩ්‍රසයිඩ් සමඟ කාබෝහයිඩ්‍රේට් සංයෝජන කිරීම පහත ක්‍රියා පටිපාටිය භාවිතා කරන ලදී. බයෝටින්-LC-හයිඩ්‍රසයිඩ් (4.6 mg/12 μmol) ඩයිමෙතිල් සල්ෆොක්සයිඩ් (DMSO, 70 μl) හි 65°C දී දැඩි ලෙස කලවම් කර විනාඩි 1 ක් රත් කිරීමෙන් දිය කරන ලදී. ග්ලැසියර ඇසිටික් අම්ලය (30 µl) එකතු කර මිශ්‍රණය සෝඩියම් සයනොබොරෝහයිඩ්‍රයිඩ් (6.4 mg/100 µmol) මතට වත් කර විනාඩි 1 ක් පමණ 65°C දී රත් කිරීමෙන් පසු සම්පූර්ණයෙන්ම විසුරුවා හරින ලදී. ඉන්පසු, ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයෙන් 5 සිට 8 μl දක්වා වියළන ලද ඔලිගෝසැකරයිඩයට (1-100 nmol) එකතු කර අඩු කිරීමේ කෙළවරට වඩා ලේබලයේ 10 ගුණයක් හෝ ඊට වැඩි මෝලර් අතිරික්තයක් ලබා ගන්නා ලදී. ප්‍රතික්‍රියාව පැය 2 ක් සඳහා 65°C දී සිදු කරන ලද අතර, පසුව සාම්පල වහාම පිරිසිදු කරන ලදී. ලේබල් කිරීමේ අත්හදා බැලීම් වලදී අඩු කිරීමකින් තොරව සෝඩියම් සයනොබොරෝහයිඩ්‍රයිඩ් භාවිතා නොකළ අතර, සාම්පල පැය 2.5 ක් සඳහා 65°C හි ප්‍රතික්‍රියා කරන ලදී.
බයෝටිනයිලේටඩ් ඔලිගෝසැකරයිඩ සාම්පල ELISA ආලේප කිරීම සහ සේදීම. බයෝටිනයිලේටඩ් සාම්පල 25 μl (0.1 M ට්‍රිස් බෆර් ද්‍රාවණයේ (TBS) මිලි ලීටර් 5 ක තනුක කරන ලද එක් එක් සාන්ද්‍රිත සාම්පලයෙන් 100 μl) ඇවිඩින්-ආලේපිත තහඩුවේ සෑම ළිඳකටම එකතු කරන ලදී. පාලක ළිං 0.1 M TBS හි 10 μg/ml සාන්ද්‍රණයකින් බයෝටින් 50 μl ආලේප කරන ලදී. හිස් මිනුම් සඳහා ආලේපනයක් ලෙස ඩියෝනීකරණය කළ ජලය භාවිතා කරන ලදී. ටැබ්ලටය කාමර උෂ්ණත්වයේ දී අඳුරේ පැය 2 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. ග්‍රෙනියර් ෆ්ලැට් 3A සඳහා වැඩසටහන් අංක 11 භාවිතා කරමින් 0.1 M TBS හි 0.1% මුදවපු කිරි සමඟ තහඩුව 3 වතාවක් සෝදන්න.
ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ එකතු කිරීම සහ සේදීම. සෑම ළිඳකටම ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ 40 µl බැගින් එකතු කරන්න. කාමර උෂ්ණත්වයේ දී අඳුරේ පැය 1 ක් ක්ෂුද්‍ර තහඩුව ඉන්කියුබේට් කරන්න. ඉන්පසු ග්‍රෙනියර් ෆ්ලැට් 3A සඳහා සේදීමේ වැඩසටහන #11 භාවිතා කරමින් තහඩු 0.1M TBS හි 0.1% කිරි වලින් 3 වතාවක් සෝදා හරින ලදී.
ද්විතියික ප්‍රතිදේහ එකතු කර සෝදා හරින්න. මීයන්/මීයන් ද්විතියික ප්‍රතිදේහ 50 µl බැගින් (0.1% කිරි 0.1% ක 0.1 M TBS තනුක කර 1:5000) එක් එක් ළිඳට එක් කරන්න. කාමර උෂ්ණත්වයේ දී අඳුරු තැනක පැය 1 ක් සඳහා ක්ෂුද්‍ර තහඩුව ඉන්කියුබේට් කරන්න. ඉන්පසු ග්‍රෙනියර් ෆ්ලැට් 5A තහඩු සේදීමේ වැඩසටහන #12 භාවිතා කර 0.1 M TBS ක 0.1% කිරි වලින් ක්ෂුද්‍ර තහඩු 5 වතාවක් සෝදා හරින ලදී.
උපස්ථරයක් එකතු කිරීම. 3,3′,5,5′-ටෙට්‍රමෙතිල්බෙන්සයිඩින් (TMB) 50 µl පාදක උපස්ථරයට එක් කරන්න (බෆර් බිංදු 2 ක්, TMB බිංදු 3 ක්, හයිඩ්‍රජන් පෙරොක්සයිඩ් බිංදු 2 ක් අයනීකරණය කළ ජලය මිලි ලීටර් 15 කට එකතු කිරීමෙන්). TMB උපස්ථරය සකස් කර භාවිතයට පෙර වෝටෙක්ස් කරන්න. මයික්‍රොප්ලේට් එක කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 30 ක් පුර්ව ගන්වන්න. අඳුරේ.
පියවර සම්පූර්ණ කර ටැබ්ලටය කියවන්න. සෑම ළිඳකටම 1 N සල්ෆියුරික් අම්ලයේ 50 µl එකතු කර ELISA කියවනයක් භාවිතයෙන් 450 සිට 655 nm දක්වා අවශෝෂණය වාර්තා කරන්න.
මෙම විශ්ලේෂණවල 1 mg/ml ද්‍රාවණ අයනීකරණය කළ ජලයේ සකස් කරන්න: ඇරබිනෝස්, රම්නෝස්, ෆියුකෝස්, සයිලෝස්, ගැලැක්ටුරෝනික් අම්ලය (GalA), ග්ලූකුරෝනික් අම්ලය (GlcA), මැනෝස්, ග්ලූකෝස්, ගැලැක්ටෝස්, ලැක්ටෝස්, N-ඇසිටිල්මන්නෝසමයින් (manNAc), N-ඇසිටිල්ග්ලූකොසමයින්. (glcNAc), N-ඇසිටිල්ගැලැක්ටෝසැමයින් (galNAc), ඉනොසිටෝල් (අභ්‍යන්තර ප්‍රමිතිය). වගුව 1 හි දක්වා ඇති 1 mg/mL සීනි ද්‍රාවණ එකතු කිරීමෙන් ප්‍රමිතීන් දෙකක් සකස් කරන ලදී. සියලුම ජලය ඉවත් කරන තෙක් (සාමාන්‍යයෙන් පැය 12-18 පමණ) සාම්පල -80°C දී ශීත කර ලයොෆිලීකරණය කරනු ලැබේ.
විශ්ලේෂණාත්මක ශේෂයක් මත ඉස්කුරුප්පු කැප් නල වලට සාම්පල 100–500 µg එකතු කරන්න. එකතු කළ ප්‍රමාණය සටහන් කරන්න. සාම්පලය නිශ්චිත ද්‍රාවක සාන්ද්‍රණයක දියකර ද්‍රව ඇල්කොහොල් ලෙස නළයට එකතු කිරීම වඩාත් සුදුසුය. සෑම සාම්පල නලයක් සඳහාම අභ්‍යන්තර ප්‍රමිතියක් ලෙස ඉනොසිටෝල් 1 mg/ml 20 µl භාවිතා කරන්න. නියැදියට එකතු කරන ලද අභ්‍යන්තර ප්‍රමිතියේ ප්‍රමාණය සම්මත නළයට එකතු කරන ලද අභ්‍යන්තර ප්‍රමිතියේ ප්‍රමාණයට සමාන විය යුතුය.
ඉස්කුරුප්පු කැප් කුප්පියකට නිර්ජලීය මෙතනෝල් මිලි ලීටර් 8 ක් එකතු කරන්න. ඉන්පසු 3 N. මෙතනොලික් HCl ද්‍රාවණයෙන් මිලි ලීටර් 4 ක්, ආවරණය කර සොලවන්න. මෙම ක්‍රියාවලියට ජලය භාවිතා නොවේ.
ඔලිගෝසැකරයිඩ සාම්පල සහ සම්මත TMS නල වලට 1 M HCl මෙතනෝල් ද්‍රාවණය 500 µl එකතු කරන්න. සාම්පල තාප බ්ලොක් එකක 80°C දී එක රැයකින් (පැය 168) පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. වියළන බහුවිධයක් භාවිතයෙන් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මෙතනොලිසිස් නිෂ්පාදනය වියළන්න. 200 µl MeOH එකතු කර නැවත වියළන්න. මෙම ක්‍රියාවලිය දෙවරක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරනු ලැබේ. සාම්පලයට මෙතනෝල් 200 µl, පිරිඩීන් 100 µl සහ ඇසිටික් ඇන්හයිඩ්‍රයිඩ් 100 µl එකතු කර හොඳින් මිශ්‍ර කරන්න. සාම්පල කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 30 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. වියළන ලදී. මෙතනෝල් 200 µl එකතු කර නැවත වියළන්න.
ට්‍රයි-සිල් 200 µl එකතු කර විනාඩි 20ක් රත් කළ ආවරණය සහිත නළය. 80°C, පසුව කාමර උෂ්ණත්වයට සිසිල් කරන්න. සාම්පලය ආසන්න වශයෙන් 50 µl පරිමාවකට වියළීමට වියළන බහුවිධයක් භාවිතා කරන්න. සාම්පල සම්පූර්ණයෙන්ම වියළීමට අපි ඉඩ නොදුන් බව සැලකිල්ලට ගැනීම වැදගත්ය.
හෙක්සේන් මිලි ලීටර් 2 ක් එකතු කර වෝටෙක්ස් කිරීමෙන් හොඳින් මිශ්‍ර කරන්න. 5-3/4 අඟල් විෂ්කම්භයකින් යුත් පයිප්පයක් මත වීදුරු ලොම් ඇතුළු කිරීමෙන් පාස්චර් පයිප්පවල කෙළවර (5-8 මි.මී.) වීදුරු ලොම් කැබැල්ලකින් පුරවන්න. සාම්පල 3000 ග්රෑම් හිදී මිනිත්තු 2 ක් කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. ඕනෑම දිය නොවන අපද්‍රව්‍ය අවක්ෂේප කරනු ලැබේ. සාම්පලය 100-150 µl දක්වා වියළන්න. 80 °C ආරම්භක උෂ්ණත්වයකදී සහ මිනිත්තු 2.0 ක ආරම්භක කාලයකදී (වගුව 2) GC-MS තුළට ආසන්න වශයෙන් 1 μl පරිමාවක් එන්නත් කරන ලදී.