Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Ulanylýan brauzer wersiýaňyzyň çäkli CSS goldawy bar.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Şol aralykda, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript bolmazdan hödürläris.
AFEX bilen taýýarlanan mekgejöwen ammaryndaky dowamly oligosakkaridleri çylşyrymly derňemek üçin täze immunologiki we köpçülikleýin spektrometrik usullar.“Lignocellulosic biomass” gazylyp alynýan ýangyçlara durnukly alternatiwadyr we azyk, iýmit, ýangyç we himiýa ýaly önümleri öndürmek üçin biotehnologiýalary ösdürmek üçin giňden ulanylýar.Bu tehnologiýalaryň açary ösümlik öýjük diwarlarynda bar bolan çylşyrymly uglewodlary glýukoza, ksiloza we arabinoza ýaly ýönekeý şekerlere öwürmek üçin çykdajyly bäsdeşlik proseslerini ösdürmekdir.Lignoselluloziki biomassanyň gaty boýnugy sebäpli, islenýän önümi almak üçin termokimiki bejergilere (mysal üçin ammiak süýüminiň siňdirilmegi (AFEX), suwuk kislotalar (DA), ion suwuklyklary (IL)) we biologiki bejergiler (mysal üçin ferment gidrolizi we mikrob fermentasiýasy) berilmelidir..Şeýle-de bolsa, gidroliz prosesinde täjirçilik kömelek fermentleri ulanylanda, emele gelýän şekerleriň diňe 75-85% -i monosakaridler, galan 15-25% -i mikroorganizmler üçin elmydama elýeterli däl, eräp bolmaýan oligosakkaridlerdir.Ozal uglerod we diatomazly ýer bölünişi we ululygy aýyrmak hromatografiýasynyň kombinasiýasyny ulanyp, eräp gidýän berk oligosakkaridleri üstünlikli izolýasiýa etdik we arassaladyk, şeýle hem fermentleriň inhibitor häsiýetlerini derňedik.Has ýokary derejeli polimerizasiýa (DP) metilleşdirilen uron kislotasynyň ornuny tutýan oligosakkaridleriň pes DP we bitarap oligosakkaridlere garanyňda täjir ferment fermentleri bilen işlemek has kyndygyny anykladyk.Bu ýerde ösümlik öýjük diwarlarynda we ferment gidrolizatlarynda, matrisa goldawly lazer desorpsiýa ionlaşmagy, uçuş wagtynda köpçülik spektrometriýasynda ösümlik biomassik glikanlary üçin monoklonal antikorlary (mAbs) ulanyp, glikan profilini ulanmak ýaly birnäçe goşmaça usulyň ulanylandygyny habar berýäris..MALDI-TOF-MS) negatiw ionlaryň, gaz hromatografiýasynyň we köpçülik spektrometriýasynyň (GC-MS) ikinji derejeli çüýremeginden soň spektroskopiýa arkaly alnan gurluş-maglumat beriji anyklaýyş piklerini ulanýar, oligosakkarid baglanyşyklaryny derwisizleşdirmezden we häsiýetlendirmek üçin.Oligosakkaridleriň (DP 4–20) kiçi göwrümi sebäpli bu molekulalary mAb baglanyşdyrmak we häsiýetlendirmek üçin ulanmak kyn.Bu meseläni ýeňip geçmek üçin mikroplatyň üstünde pes DP ereýän oligosakkaridleriň köpüsini üstünlikli bellän täze biotin konýugasiýa esasly oligosakkarid immobilizasiýa usulyny ulandyk, soňra bolsa ýokary baglanşyk derňewi üçin ýokary geçiş mAb ulgamynda ulanyldy.Bu täze usul, geljekde diagnostika maksatlary üçin biomarkerlerde bar bolan oligosakkaridleri izolirlemek we häsiýetlendirmek üçin ulanyp boljak has ýokary ýokary geçişli glikom analizleriniň ösüşini ýeňilleşdirer.
Oba hojalygy, tokaý hojalygy, ot we agaç materiallaryndan düzülen “Lignocellulosic biomass”, has gymmatly önümleri öndürmek üçin azyk, iýmit, ýangyç we himiki prekursorlary goşmak bilen bio esasly önümleri öndürmek üçin potensial iýmitdir1.Ösümlik öýjük diwarlarynda bar bolan uglewodlar (sellýuloza we gemiselluloza ýaly) himiki gaýtadan işlemek we biotransformasiýa (ferment gidrolizi we mikrob fermentasiýasy ýaly) monosakaridlere bölünýär.Öňden gelýän bejergiler ammiak süýüminiň giňelmegini (AFEX), suwuk kislotany (DA), ion suwuklygyny (IL) we bug öýjüginiň diwarlaryny açmak bilen lignoselluloza önümçiligini azaltmak üçin himiki maddalaryň we ýylylygyň birleşmesini ulanýan bug partlamasyny (SE) öz içine alýar.fermentleriň gidrolizi, bio esasly ýangyç we himiki serişdeleri öndürmek üçin transgen hamyrmaýalaryny ýa-da bakteriýalary ulanyp, täjirçilik uglewodlary öz içine alýan fermentleri (CAZymes) we mikrob fermentasiýasyny ulanyp, gaty gaty ýükde amala aşyrylýar.
Söwda fermentlerindäki CAZymlar, monosakaridleri emele getirmek üçin çylşyrymly uglewod-şeker baglanyşyklaryny sinergistik taýdan bölýän fermentleriň çylşyrymly garyndysyndan durýar.Öň habar berşimiz ýaly, uglewodlar bilen ligniniň aromatiki polimerleriniň çylşyrymly ulgamy, olary ýokary derejede täsir edip bilmeýär, bu bolsa şekeriň doly öwrülmegine sebäp bolýar, öňünden kesgitlenen biomassanyň ferment gidrolizi wagtynda öndürilmeýän jyns oligosakkaridleriniň 15-25% -ini ýygnaýar.Bu dürli biomassany öňüni alyş usullary bilen umumy mesele.Bu bökdençligiň käbir sebäplerine gidroliz wagtynda fermentleriň inhibisiýasy ýa-da ösümlik biomassasyndaky şeker baglanyşyklaryny döwmek üçin zerur fermentleriň ýoklugy ýa-da pes derejesi degişlidir.Oligosakkaridlerdäki şeker baglanyşyklary ýaly şekerleriň düzümine we gurluş aýratynlyklaryna düşünmek, gidroliz wagtynda şekeriň öwrülmegini gowulaşdyrmaga kömek eder, biotehnologiki amallary nebit öndürýän önümler bilen bäsdeşlige ukyply eder.
Uglewodlaryň gurluşyny kesgitlemek kyn we suwuk hromatografiýa (LC) 11,12, ýadro magnit-rezonans spektroskopiýasy (NMR) 13, kapilýar elektroforez (CE) 14,15,16 we köpçülik spektrometri (MS) 17 ýaly usullaryň utgaşdyrylmagyny talap edýär., on sekizLazer desorpsiýasy bilen uçuş wagtynda köpçülikleýin spektrometriýa we matrisa (MALDI-TOF-MS) ulanyp ionlaşdyrmak ýaly MS usullary uglewod gurluşlaryny kesgitlemek üçin köpugurly usuldyr.Recentlyakynda, natriý ion garyndylarynyň çaknyşmagyna sebäp bolan bölünme (CID) tandemi MS, oligosakkarid birikdirme pozisiýalaryna, anomeriki konfigurasiýalara, yzygiderlilige we şahanyň pozisiýalaryna laýyk gelýän barmak yzlaryny kesgitlemek üçin iň giňden ulanyldy.
Glikan derňewi uglewod baglanyşyklaryny çuňňur kesgitlemek üçin ajaýyp guraldyr22.Bu usul, çylşyrymly uglewod baglanyşyklaryna düşünmek üçin öýjük diwary glikany ekmäge gönükdirilen monoklonal antikorlary (mAbs) ulanýar.Dürli sakaridleri ulanyp, dürli çyzykly we şahaly oligosakkaridlere garşy döredilen dünýäde 250 mAbs-dan gowrak bar.Birnäçe mAbs ösümlik öýjük diwarynyň gurluşyny, düzümini we üýtgemelerini häsiýetlendirmek üçin giňden ulanyldy, sebäbi ösümlik öýjükleriniň görnüşine, organyna, ýaşyna, ösüş etabyna we ösüş gurşawyna baglylykda düýpli tapawutlar25,26.Recentlyaňy-ýakynda bu usul ösümlik we haýwan ulgamlaryndaky wezikulanyň populýasiýasyna we öýjükli bellikler, ösüş etaplary ýa-da daşky gurşaw stimullary bilen kesgitlenýän glikan transportynda degişli rollaryna düşünmek we ferment işjeňligini kesgitlemek üçin ulanyldy.Glikanlaryň we ksilanlaryň dürli gurluşlarynyň arasynda pektin (P), ksilan (X), mannan (M), ksiloglukanlar (XylG), garyşyk glýukanlar (MLG), arabinoksilanlar (ArbX), galaktomannanlar (GalG), glýukuron kislotasy-arabinoksilanlar (GArbXan) we arabino-galaktanlar bar.
Şeýle-de bolsa, bu gözlegleriň hemmesine garamazdan, diňe birnäçe gözlegde, oligosakkaridiň goýberilmegi, gidroliz wagtynda oligomer zynjyrynyň uzynlygy, dürli pes DP polimerleri we egrileri ýaly ýokary gaty ýükli (HSL) gidroliz wagtynda oligosakkaridiň toplanmagynyň tebigatyna ünsi jemledi.paýlamalary 30,31,32.Şol bir wagtyň özünde, glikan derňewi glikan gurluşyny hemmetaraplaýyn seljermek üçin peýdaly guraldygyny subut eden hem bolsa, antikor usullaryny ulanyp, suwda erän pes DP oligosakkaridlerine baha bermek kyn.Molekulýar agramy 5-10 kDa-dan az bolan kiçi DP oligosakkaridleri 33, 34 ELISA plitalary bilen baglanyşmaýar we antikor goşulmazdan ozal ýuwulýar.
Bu ýerde ilkinji gezek monoklonal antikorlary ulanyp, awidin bilen örtülen tabaklarda ELISA barlagyny görkezýäris, erginli refrakter oligosakkaridler üçin bir basgançakly biotinilýasiýa prosedurasyny glikom derňewi bilen birleşdirýäris.Glikom derňewine bolan çemeleşmämiz, gidrolizlenen şeker düzümleriniň trimetilsilil (TMS) derwizasiýasyny ulanyp, goşmaça oligosakkarid baglanyşyklarynyň MALDI-TOF-MS we GC-MS esasly derňewi bilen tassyklandy.Bu innowasiýa çemeleşmesi, geljekde ýokary geçiş usuly hökmünde ösdürilip we biomedikal gözleglerde has giň amaly tapyp bolar35.
Glikozilasiýa ýaly fermentleriň we antikorlaryň terjimeden soňky üýtgemeleri, olaryň biologiki işjeňligine täsir edýär.Mysal üçin, serum beloklarynyň glikozilasiýasynyň üýtgemegi, çişme artritinde möhüm rol oýnaýar we glikozilasiýanyň üýtgemegi diagnostika bellikleri hökmünde ulanylýar37.Edebiýatda aşgazan-içege we bagryň dowamly çişme keselleri, wirus ýokançlyklary, ýumurtgalyk, döş we prostat keselleri ýaly dürli kesellerde aňsatlyk bilen ýüze çykjakdygy habar berildi.Antikor esasly glikan ELISA usullaryny ulanyp, glikanlaryň gurluşyna düşünmek, çylşyrymly MS usullaryny ulanmazdan kesel diagnozyna goşmaça ynam döreder.
Öňki gözlegimiz, öňüni alyş we ferment gidrolizinden soň boýnujy oligosakkaridleriň suwsuz galandygyny görkezdi (1-nji surat).Öň neşir edilen işimizde, oligosakkaridleri AFEX-den taýýarlanan mekgejöwen ammary gidrolizatyndan (ACSH) 8-den izolirlemek üçin işjeňleşdirilen kömür gaty fazaly çykarmak usulyny taýýarladyk.Ilki çykarylandan we aýrylandan soň, oligosakkaridler ululykdan çykarmak hromatografiýasy (SEC) bilen hasam bölünip, molekulýar agramy boýunça ýygnaldy.Dürli öňünden aýdylýan şeker monomerleri we oligomerler şeker düzüminiň derňewi arkaly seljerildi.Dürli öňüni alyş usullary bilen alnan şeker oligomerleriniň mazmunyny deňeşdireniňde, berk oligosakkaridleriň bolmagy biomassanyň monosakaridlere öwrülmeginde umumy mesele bolup, şekeriň hasyllylygynyň azyndan 10-15%, hatda 18% -e çenli azalmagyna sebäp bolup biler.ABŞ.Bu usul oligosakkarid fraksiýalaryny has uly göwrümli öndürmek üçin ulanylýar.Alnan ACH we dürli molekulýar agramly soňraky fraksiýalary bu eserde oligosakkaridleri häsiýetlendirmek üçin synag materialy hökmünde ulanyldy.
Öňünden taýýarlanyş we ferment gidrolizinden soň, dowamly oligosakkaridler suwsuz galdy.Bu ýerde (A) oligosakkaridleri bölmek usuly bolup, oligosakkaridler AFEX-den öňünden taýýarlanan mekgejöwen saklaýjy gidrolizatdan (ACSH) işjeňleşdirilen uglerod we diatomaz toprakly gaplanan krowaty ulanyp izolirlenýär;(B) Oligosakkaridleri bölmegiň usuly.Oligosakkaridler ululygy aýyrmak hromatografiýasy (SEC) bilen hasam bölünipdi;(C) Sakarid monomerleri we oligomerler dürli görnüşlerden (suwuklandyrylan kislota: DA, ion suwuklygy: IL we AFEX).Enzimatik gidroliz şertleri: 25% (w / w) (takmynan 8% glýukan ýüklemek), 96 sagat gidroliz, 20 mg / g täjirçilik ferment ýüklemek (Ctec2: Htec2: MP-2: 1: 1 gatnaşygy) we (D) Şeker monomerleri we glýukoza, ksiloza we arabinoza AFEX öňünden bejerilen mekgejöweniň aşagyndan çykarylýar.
Glikan derňewi, gaty biomassanyň galyndylaryndan izolirlenen ekstraktlardaky glikanlary hemmetaraplaýyn gurluş derňewi üçin peýdaly guraldygyny subut etdi.Şeýle-de bolsa, suwda erän sakaridler bu adaty usuldan peýdalanylmaýar41, sebäbi pes molekulaly oligosakkaridleri ELISA plitalarynda herekete getirmek kyn we antikor goşulmazdan ozal ýuwulýar.Şonuň üçin antikorlary baglanyşdyrmak we häsiýetlendirmek üçin awidin bilen örtülen ELISA plitalarynda erän, laýyk gelmeýän oligosakkaridleri örtmek üçin bir basgançakly biotinilýasiýa usuly ulanyldy.Bu usul ozal öndürilen ACSH we molekulýar agramyna (ýa-da polimerizasiýa derejesine, DP) esaslanan bölek ulanyp synag edildi.Uglewodyň azalýan ujuna biotin-LC-gidrazid goşup, oligosakkaridiň ýakynlygyny ýokarlandyrmak üçin bir basgançakly biotinilýasiýa ulanyldy (2-nji surat).Çözüwde, azalýan ujundaky ýarymasetal topar biotin-LC-gidrazidiň gidrazid topary bilen reaksiýa berip, gidrazon baglanyşygyny emele getirýär.NaCNBH3 azaldýan serişdäniň barlygynda gidrazon baglanyşygy durnukly biotinilleşdirilen ahyrky önüme öwrülýär.Şekeriň azaldylýan ujunyň üýtgemegi bilen pes DP oligosakkaridleri ELISA plitalaryna baglamak mümkin boldy we biziň gözlegimizde bu glikan maksatly mAbs ulanyp, awidin bilen örtülen tabaklarda geçirildi.
Biotinilleşdirilen oligosakkaridler üçin ELISA esasly monoklonal antikorlary barlamak.Bu ýerde (A) oligosakkaridleriň biotinilýasiýasy we soňraky ELISA barlagy NeutrAvidin örtükli plastinkalarda glikan maksatly mAbs bilen birleşdirilýär we (B) reaksiýa önümleriniň biotinilýasiýasynyň bir basgançakly prosedurasy görkezilýär.
Oligosakkarid-konýugirlenen antikorlary bolan awidin bilen örtülen plitalar soňra esasy we ikinji derejeli antikorlara goşuldy we ýeňil we wagt duýgur gurşawda ýuwuldy.Antikor baglanyşygy gutaransoň, tabagy inkubasiýa etmek üçin TMB substratyny goşuň.Reaksiýa ahyrsoňy kükürt kislotasy bilen saklandy.Inkubirlenen plitalar, antikorlara mahsus baglanyşygy kesgitlemek üçin her bir antikoryň baglaýjy güýjüni kesgitlemek üçin ELISA okyjysynyň kömegi bilen derňeldi.Synagyň jikme-jiklikleri we parametrleri üçin degişli “Materiallar we usullar” bölümine serediň.
ACSH-de bar bolan ereýän oligosakkaridleri, şeýle hem lignoselluloziki gidrolizatlardan izolirlenen çig we arassalanan oligosakkarid fraksiýalaryny häsiýetlendirmek arkaly täze işlenip düzülen usulyň peýdalydygyny görkezýäris.3-nji suratda görkezilişi ýaly, bioasilleşdirilen glikom barlag usullaryny ulanyp, ACSH-de kesgitlenen iň köp ýaýran epitopyň ornuny tutýan kylanlar adatça uroniki (U) ýa-da metiluroniki (MeU) we pektiki arabinogalaktanlardyr.Olaryň köpüsi, gidrolizlenmedik gaty jisimleriň (UHS) 43 glikanlaryny seljermek boýunça öňki gözlegimizde hem tapyldy.
Öýjük diwary glikana gönükdirilen monoklonal antikor ulanyp, gaýtadan işleýän oligosakkarid epitoplaryny kesgitlemek.“Bitarap” fraksiýa ACN fraksiýasy, “kislotaly” fraksiýa FA fraksiýasydyr.Heatylylyk kartasyndaky açyk gyzyllar epitopyň has ýokarydygyny, açyk gök reňkler bolsa boş fonuny görkezýär.Masştabdaky reňk bahalary N = 2 formulalary üçin çig OD bahalaryna esaslanýar.Antikorlar tarapyndan tanalýan esasy epitoplar sagda görkezilýär.
Bu sellýuloza däl gurluşlar, iň köp ulanylýan täjirçilik fermentlerini öz içine alýan synag täjir ferment garyndysynda iň köp ýaýran sellýulazalar we gemisellulazlar bilen ýapylyp bilinmedi.Şonuň üçin gidroliz üçin täze kömekçi fermentler zerurdyr.Zerur sellýuloza däl aksesuar fermentleri bolmazdan, bu sellýuloza däl baglanyşyklar, ene şeker polimerleri has gysga böleklere gidrolizlenip, täjirçilik ferment garyndylary bilen dargadylsa-da, monosakaridlere doly öwrülmeginiň öňüni alýar.
Signalyň paýlanyşyny we onuň baglanyşdyryjy güýjüni has giňişleýin öwrenmek, baglanyşdyryjy epitoplaryň ýokary DP şeker fraksiýalarynda (A, B, C, DP 20+ çenli) pes DP fraksiýalaryna (D, E, F, DP) pesdigini görkezdi (1-nji surat).Kislota bölekleri, sellýuloza däl epitoplarda bitarap böleklere garanyňda has ýygy duş gelýär.Bu hadysalar, ýokary DP we kislota moietleriniň ferment gidrolizine has çydamly bolan öňki gözlegimizde görlen nagyş bilen gabat gelýär.Şonuň üçin sellýuloza däl glikan epitoplarynyň we U we MeU çalyşmalarynyň bolmagy oligosakkaridleriň durnuklylygyna ep-esli goşant goşup biler.Baglamak we ýüze çykarmak netijeliliginiň pes DP oligosakkaridleri üçin kynçylyk döredip biljekdigini bellemelidiris, esasanam epitop dimeriki ýa-da trimerik oligosakkarid bolsa.Muny dürli uzynlykdaky täjirçilik oligosakkaridleri ulanyp synap bolýar, hersinde belli bir mAb bilen baglanyşdyrýan diňe bir epitop bar.
Şeýlelik bilen, gurluşa mahsus antikorlaryň ulanylmagy gaýtadan hasaplanylýan baglanyşyklaryň käbir görnüşlerini ýüze çykardy.Ulanylýan antikorlaryň görnüşine, degişli baglanyş usulyna we öndürýän signalyň berkligine (iň az we köp) baglylykda täze fermentleri kesgitläp we has doly glikokonversiýa üçin ferment garyndysyna ýarym mukdarda goşup bolýar.Mysal hökmünde ACSH oligosakkaridleriniň derňewini alyp, her biomassiýa materialy üçin glikan baglanyşyklarynyň maglumatlar binýadyny döredip bileris.Bu ýerde antikorlaryň dürli ýakynlygyny göz öňünde tutmalydygyny, ýakynlygy näbelli bolsa, dürli antikorlaryň signallaryny deňeşdireniňde belli bir kynçylyk döredjekdigini bellemelidiris.Mundan başga-da, glikan baglanyşyklaryny deňeşdirmek, şol bir antikor üçin nusgalaryň arasynda has gowy işläp biler.Soňra bu berk baglanyşyklar, CAZyme maglumatlar bazasy bilen baglanyşyp biler, ondan fermentleri kesgitläp bileris, dalaşgär fermentlerini saýlap bileris we baglanyşyk fermentlerini synap bileris ýa-da biorefinariýalarda ulanmak üçin bu fermentleri aňlatmak üçin mikrob ulgamlaryny ösdürip bileris44.
Immunologiki usullaryň lignoselluloziki gidrolizatlarda bar bolan pes molekulaly oligosakkaridleri häsiýetlendirmek üçin alternatiw usullary nädip doldurýandygyny bahalandyrmak üçin MALDI (4-nji surat, S1-S8) we şol bir paneldäki GC-MS esasly TMS-den alnan sakaridleri seljerdik (5-nji surat) oligosakkarid böleginde.MALDI oligosakkarid molekulalarynyň köpçülikleýin paýlanyşynyň göz öňünde tutulan gurluşa laýyk gelýändigini deňeşdirmek üçin ulanylýar.Injirde.4 ACN-A we ACN-B bitarap komponentleriniň MC-ni görkezýär.ACN-Analiz, agramy MeU-kylan oligosakkaridlere gabat gelýän DP 4–8 (4-nji surat) -dan DP 22 (S1 surat) aralygynda pentoza şekerleriniň bir toparyny tassyklady.ACN-B derňewi DP 8-15 bilen pentoza we glýuksilan seriýasyny tassyklady.S3-nji surat ýaly goşmaça materiallarda, FA-C kislotaly joşgunly köpçülikleýin paýlanyş kartalarynda, ELISA esasly mAb barlagynda tapylan ksilanlara laýyk gelýän DP 8-15 bilen çalşylýan pentoza şekerleriniň bir topary görkezilýär.Epitoplar yzygiderli.
ACS-de bar bolan erginli oligosakkaridleriň MALDI-MS spektri.Bu ýerde, (A) ACN-Metilleşdirilen uron kislotasyny (DP 4-8) öz içine alýan pes agramly fraksiýalar, glýukuroksilan oligosakkaridleri we (B) ACN-B kylan we glýukuroksilan (DP 8-15) bilen çalşylan metilleşdirilen uron kislotasy oligosakkaridleri öz içine alýar.
Döwülýän oligosakkaridleriň glikan galyndysynyň düzüminiň derňewi.Bu ýerde (A) GC-MS derňewi arkaly alnan dürli oligosakkarid fraksiýalarynyň TMS sakarid düzümi.(B) Oligosakkaridlerde bar bolan dürli TMS-den alnan şekerleriň gurluşlary.ACN - bitarap oligosakkaridleri öz içine alýan asetonitril fraksiýasy we FA - kislotaly oligosakkaridleri öz içine alýan ferul turşusy fraksiýasy.
Anotherene-de bir gyzykly netije, S9-njy suratda görkezilişi ýaly, oligosakkarid fraksiýasynyň LC-MS derňewinden alyndy (usullary elektroniki goşmaça materialda görüp bolýar).Geksoza we -OAc toparlarynyň bölekleri ACN-B fraksiýasynyň baglanyşygy wagtynda birnäçe gezek syn edildi.Bu tapyndy, diňe bir glikomda we MALDI-TOF derňewinde syn edilen bölekleri tassyklamak bilen çäklenmän, öňünden taýýarlanan lignoselluloziki biomassada uglewod emele gelmegi barada täze maglumatlary berýär.
Şeýle hem, TMS şeker derwizasiýasyny ulanyp, oligosakkarid fraksiýasynyň şeker düzümini analiz etdik.GC-MS ulanyp, oligosakkarid fraksiýasynda nerw (emele gelmeýän) we kislotaly şekerleriň (GluA we GalA) düzümini kesgitledik (5-nji surat).Glýukuron kislotasy C we D kislotaly komponentlerde, galakturon kislotasy A we B kislotaly komponentlerde bolýar, bularyň ikisi hem kislotaly şekeriň ýokary DP düzüm bölekleridir.Bu netijeler diňe bir ELISA we MALDI maglumatlarymyzy tassyklaman, eýsem oligosakkaridiň toplanmagy baradaky öňki gözleglerimize hem laýyk gelýär.Şol sebäpden, oligosakkaridleriň biotinilýasiýasyny we soňraky ELISA barlagyny ulanyp, häzirki zaman immunologiki usullaryň dürli biologiki nusgalarda eräp gidýän oligosakkaridleri ýüze çykarmak üçin ýeterlikdigine ynanýarys.
ELISA esasly mAb barlag usullary birnäçe dürli usul bilen tassyklanansoň, bu täze mukdar usulynyň potensialyny has giňişleýin öwrenmek isledik.Iki sany täjirçilik oligosakkarid, ksilheksasaxarid oligosakkarid (XHE) we 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotrioza (A2XX), öýjük diwary glikany nyşana alýan täze mAb çemeleşmesi bilen satyn alyndy we synag edildi.6-njy suratda biotinilleşdirilen baglanyşyk signaly bilen oligosakkarid konsentrasiýasynyň gündelik konsentrasiýasynyň arasynda çyzykly arabaglanyşyk görkezilýär, bu Langmuiriň adsorbsion modelini görkezýär.MAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, we CCRC-M151 XHE bilen korrelýasiýa, CCRC-M108, CCRC-M109 we LM11 A2XX bilen 1 nm 100 nano aralygynda korrelýasiýa edildi.Synag wagtynda antikorlaryň çäkli bolmagy sebäpli, her oligosakkarid konsentrasiýasy bilen çäkli synaglar geçirildi.Bu ýerde käbir antikorlaryň substrat bilen birmeňzeş oligosakkaridiň garşysyna başgaça reaksiýa bildirýändigini bellemelidiris, sebäbi birneme epitoplara bagly bolup, biri-birine bagly bolup biler.Epitope takyk kesgitlemegiň mehanizmleri we netijeleri täze mAb çemeleşmesi hakyky nusgalarda ulanylanda has çylşyrymly bolar.
Iki sany glikan nyşana alýan mAbs-iň tapyş diapazonyny kesgitlemek üçin iki sany täjirçilik oligosakkarid ulanyldy.Bu ýerde, oligosakkarid konsentrasiýasynyň gündelik konsentrasiýasy bilen çyzykly korrelýasiýa (A) XHE üçin mAb bilen we (B) A2XX üçin Langmuir adsorbsion nagyşlaryny görkezýär.Degişli epitoplar analizde substrat hökmünde ulanylýan täjirçilik oligosakkaridleriň gurluşlaryny görkezýär.
Glikana gönükdirilen monoklonal antikorlaryň ulanylmagy (glikokomiki derňew ýa-da ELISA esasly mAb barlagy) ösümlik biomassasyny emele getirýän esasy öýjük diwar glikanlarynyň köpüsini çuňňur häsiýetlendirmek üçin güýçli guraldyr.Şeýle-de bolsa, nusgawy glikan derňewi has uly öýjükli diwar glikanlaryny häsiýetlendirýär, sebäbi oligosakkaridleriň köpüsi ELISA plitalarynda täsirli hereketsiz galýar.Bu gözlegde, AFEX-den öňünden taýýarlanan mekgejöwen ammary, gaty gaty mukdarda ferment taýdan gidroliz edildi.Şeker derňewi, gidrolizatdaky öýjükli diwar uglewodlarynyň düzümini kesgitlemek üçin ulanyldy.Şeýle-de bolsa, gidrolizatlardaky kiçi oligosakkaridleriň mAb analizine kembaha garalýar we ELISA plitalarynda oligosakkaridleri täsirli herekete getirmek üçin goşmaça gurallar zerurdyr.
Bu ýerde oligosakkarid biotinilýasiýasyny birleşdirip, NeutrAvidin ™ örtükli plitalarda ELISA barlagyndan soň mAb barlagy üçin täze we täsirli oligosakkarid immobilizasiýa usuly barada habar berýäris.Göçürilmedik biotinilleşdirilen oligosakkaridler, gaýtadan ulanylýan oligosakkaridleri çalt we netijeli tapmaga mümkinçilik bermek üçin antikor üçin ýeterlik ýakynlygy görkezdi.Köpçülik spektrometriýa esaslanýan bu gödek oligosakkaridleriň düzüminiň seljermesi immunoskrinasiýa bu täze çemeleşmäniň netijelerini tassyklady.Şeýlelik bilen, bu gözlegler oligosakkarid biotinilýasiýasynyň we ELISA barlagynyň glikan maksatly monoklonal antikorlary bilen birleşmeginiň, oligosakkaridlerdäki baglanyşyklary kesgitlemek üçin ulanylyp bilinjekdigini we oligosakkaridleriň gurluşyny häsiýetlendirýän beýleki biohimiki gözleglerde giňden ulanylyp bilinjekdigini görkezýär.
Bu biotine esaslanýan glikan profil usuly, ösümlik biomassasynda ereýän oligosakkaridleriň gaýtadan hasaplanýan uglewod baglanyşyklaryny derňemäge ukyply ilkinji hasabatdyr.Bu, bio-ýangyç öndürmek meselesinde biomassanyň käbir bölekleriniň näme üçin beýle berk däldigine düşünmäge kömek edýär.Bu usul glikom derňew usullarynda möhüm boşlugy doldurýar we ulanylyşyny ösümlik oligosakkaridlerinden has giň substratlara giňeldýär.Geljekde biotinilýasiýa üçin robotlary ulanyp bileris we ELISA ulanyp, nusgalary ýokary geçiş derňewi üçin döreden usulymyzy ulanyp bileris.
Pioneer 33A14 gibrid tohumlaryndan ösdürilip ýetişdirilen mekgejöwen sypaly (CS) 2010-njy ýylda Kolorado ştatynyň Reý şäherindäki Kramer fermalarynda ýygnaldy.Owner eýesiniň rugsady bilen bu biomassany gözleg üçin ulanyp bolýar. Nusgalar otag temperaturasynda zip gulp haltalarynda gury <6% çyglyk bilen saklandy. Nusgalar otag temperaturasynda zip gulp haltalarynda gury <6% çyglyk bilen saklandy. Об чинцы хранились сухим при влажности <6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной шее. Nusgalar otag temperaturasynda fermuar haltalarda <6% çyglylykda gury ýagdaýda saklandy.6 在 室温 下 干燥 6 6 6% 6 6 6 6 6样品 在 室温 下 以 干燥 <6% Об кацы хранят в пакетх с застежкой-молнией при комнатной че с влажностью <6%. Nusgalar çyglylyk <6% bilen otag temperaturasynda fermuar haltalarynda saklanýar.Gözleg ýerli we milli görkezmelere laýyk geldi.Kompozisiýa derňewi NREL protokolynyň kömegi bilen geçirildi.Kompozisiýada 31,4% glýukan, 18,7% kylan, 3,3% arabin, 1,2% galaktan, 2,2% asetil, 14,3% lignin, 1,7% belok we 13 4% kül bar.
Cellic® CTec2 (138 mg belok / ml, lot VCNI 0001), Nowozimlerden (Franklinton, NC, ABŞ) sellýulaza, β-glýukozidaza we Cellic® HTec2 (157 mg belok / ml, köp VHN00001) çylşyrymly garyndydyr.Pektin zaýalanýan fermentleriň çylşyrymly garyndysy bolan “Multifect Pectinase®” (72 mg protein / mL) DuPont Industrial Biosciences tarapyndan berildi (Palo Alto, CA, ABŞ).Ferment belogynyň konsentrasiýasy, Kjeldahl azot derňewini (AOAC usuly 2001.11, Süýt Bir Kooperatiw Inc, Ithaca, NY, ABŞ) beloklaryň düzümine baha bermek (we belok däl azotyň goşandyny aýyrmak) arkaly kesgitlenildi.Diatomaceous 545 EMD Millipore (Billerica, MA) -dan satyn alyndy.Işjeňleşdirilen uglerod (DARCO, 100 mesh granulasy), Awisel (PH-101), bug kylan we beýleki himiki maddalar Sigma-Aldrihden (Sent-Luis, MO) satyn alyndy.
AFEX öňüni alyş GLBRC-de (Biomassany öwürmek gözleg laboratoriýasy, MSU, Lansing, MI, ABŞ) geçirildi.Öňünden bejermek 140 ° C-de 15 minutlap geçirildi.46 poslamaýan polat oturgyç partiýa reaktoryna (Parr Instruments Company) 60% (w / w) suwuk ammiak bilen biomassanyň gatnaşygy 1: 1-de.30 minut gerek boldy.Reaktor 140 ° C-e getirildi we ammiak çalt çykaryldy, bu biomassanyň otag temperaturasyna çalt gaýdyp gelmegine mümkinçilik berdi.AFEX öňünden bejerilen mekgejöwen ammarynyň (ACS) düzümi bejerilmedik mekgejöwen ammaryna (UT-CS) meňzeýärdi.
Igokary gaty ACSH 25% (w / w) (takmynan 8% dekstran ýüklemek) oligosakkaridleri uly göwrümli öndürmek üçin başlangyç material hökmünde taýýarlandy.ACS-iň ferment gidrolizi, Cellic® Ctec2 10 mg belok / g glýukan (öňünden kesgitlenen biomassada), Htec2 (Nowozimler, Franklinton, NC), 5 mg belok / g glýukan we Multifekt Pektinaza (Genencor Inc, ABŞ) ýaly täjir ferment garyndysyny ulanmak arkaly geçirildi.).), 5 mg belok / g dekstran.Enzimatik gidroliz, iş göwrümi 3 litr, pH 4,8, 50 ° C we 250 aýlawly 5 litrlik bioreaktorda geçirildi.96 sagat gidrolizden soň, gidrolizat 6000 aýlawda 30 minutda sentrifugasiýa bilen, soň bolsa 14000 aýlawda 30 minutlap, gidrolizlenmedik gatylary aýyrmak üçin ýygnaldy.Soňra gidrolizat 0,22 mm süzgüçli pyçak arkaly steril süzgüçlere sezewar edildi.Süzülen gidrolizat 4 ° C derejesinde steril çüýşelerde saklandy we soňra ugleroda bölek edildi.
NREL laboratoriýa derňew proseduralaryna laýyklykda ekstrakt esasly biomassanyň nusgalarynyň derňewi: kompozisiýa derňewi üçin nusgalary taýýarlamak (NREL / TP-510-42620) we biomassada düzümli uglewodlary we lignini kesgitlemek (NREL / TP-510 - 42618) 47.
Gidrolizat akymynyň oligosakkarid derňewi, awtoklaw esasly kislota gidroliz usuly bilen 2 ml şkalada geçirildi.Gidrolizat nusgasyny 10 ml nurbat gapagy medeniýet turbasynda 69,7 µl 72% kükürt kislotasy bilen garyşdyryň we 121 ° C derejesinde skameýkada 1 sagat inkubasiýa ediň, buzda sowadyň we ýokary öndürijilikli suwuk hromatografiýa (HPLC) flakonyna süzüň.Oligosakkaridleriň konsentrasiýasy, gidrolizlenmedik nusgadaky monosakaridleriň konsentrasiýasyny kislota-gidrolizlenen nusgadaky umumy şeker konsentrasiýasyndan aýyrmak arkaly kesgitlenildi.
Kislota gidrolizlenen biomassadaky glýukoza, ksiloza we arabinoza konsentrasiýalary, Bio-Rad Aminex HPX-87H sütüninde awtosampler, sütün gyzdyryjy, izokratik nasos we refraktiw görkeziji detektor bilen enjamlaşdyrylan Şimadzu HPLC ulgamy arkaly derňeldi.Sütün 50 ° C derejesinde saklandy we 0,6 ml / min 5 mM H2SO4 suwda uzaldyldy.akymy.
Gidrolizat adatdan daşary tebigaty monomer we oligosakkaridiň düzümi üçin suwuklandyryldy we analiz edildi.Enzimatiki gidrolizden soň alnan monomer şekerler, Bio-Rad (Gerkules, CA) Aminex HPX-87P sütüni we kül gorag sütüni bilen enjamlaşdyrylan HPLC tarapyndan derňeldi.Sütüniň temperaturasy 80 ° C derejesinde saklandy, suw akym tizligi 0,6 ml / min bolan göçme faza hökmünde ulanyldy.Oligosakkaridler, reflarda beýan edilen usullara laýyklykda 121 ° C derejesinde suwuk kislotadaky gidroliz bilen kesgitlenildi.41, 48, 49.
Sakarid derňewi, çig, AFEX öňünden bejerilen we gidrolizlenmedik biomassanyň galyndylarynyň hemmesinde (öýjükli diwar ekstraktlaryny öndürmek we olaryň mAb barlagyny goşmak bilen) öň beýan edilen 27, 43, 50, 51 proseduralary ulanyp geçirildi.Glikom derňewi üçin ösümlik öýjük diwar materialynyň alkogolda eremeýän galyndylary biomassanyň galyndylaryndan taýýarlanylýar we ammiak oksalat (50 mM), natriý karbonat (50 mM we 0,5% w / v), CON ýaly agressiw reagentler bilen yzygiderli çykarylýar.(1M we 4M, ikisinde-de 1% w / v natriý borohidrid) we öň beýan edilişi ýaly kislota hlorit.Soňra göçürmeler öýjük diwary glikana gönükdirilen mAb50-leriň çylşyrymly paneline garşy ELISA sezewar edildi we mAb baglanyşdyryjy reaksiýalar ýylylyk kartasy hökmünde görkezildi.Ösümlik öýjük diwary glikany nyşana alýan mAbs laboratoriýa aksiýalaryndan (CCRC, JIM we MAC seriýalary) satyn alyndy.
Oligosakkaridleriň bir basgançakly biotinilýasiýasy.Uglewodlaryň biotin-LC-gidrazid bilen birleşmegi aşakdaky prosedura arkaly amala aşyryldy.Biotin-LC-gidrazid (4,6 mg / 12 olmol) dimetil sulfoksidde (DMSO, 70 μl) güýçli garyşdyrmak we 1 minut 65 ° C gyzdyrmak arkaly eritildi.Aýaz sirkelik kislotasy (30 µl) goşuldy we garyndy natriý sianoborohidridiň üstüne (6,4 mg / 100 olmol) guýuldy we 65 ° C-de 1 minut töweregi gyzdyrylandan soň doly erdi.Soňra, guradylan oligosakkaridiň (1-100 nmol) 5-8 μl reaksiýa garyndysy, belligiň azalýan ujundan 10 esse ýa-da ondan köp mukdarda artykmaçlyk almak üçin goşuldy.Reaksiýa 65 sagatda 2 sagatda geçirildi, şondan soň nusgalar derrew arassalandy.Etiketleme synaglarynda hiç hili natriý sianoborohidrid ulanylmazdan ulanylmady we nusgalar 65 ° C-den 2,5 sagat reaksiýa berildi.
ELISA örtügi we biotinilleşdirilen oligosakkaridleriň nusgalaryny ýuwmak.Awidin bilen örtülen plastinanyň her guýusyna 25 ml biotinilleşdirilen nusgalar (5 ml 0,1 M Tris bufer ergininde (TBS) 5 ml suwuklandyrylan her konsentrirlenen nusganyň 100 μl) goşuldy.Dolandyryş guýulary 0,1 M TBS-de 10 μg / ml konsentrasiýasynda 50 μl biotin bilen örtüldi.Deionizirlenen suw boş ölçegler üçin örtük hökmünde ulanyldy.Planşet garaňkyda otag temperaturasynda 2 sagat inkubasiýa edildi.Programmany ulanyp, 0,1 M TBS-de 0,1% süýtli süýt bilen tabagy 3 gezek ýuwuň.Grenier 3A üçin 11
Esasy antikorlary goşmak we ýuwmak.Her guýa 40 µl esasy antikor goşuň.Mikroplaty garaňkyda otag temperaturasynda 1 sagat inkubasiýa ediň.Soňra tabaklar Grenier Flat 3A üçin 1111 ýuwmak programmasyny ulanyp, 0,1M TBS-de 0,1% süýt bilen 3 gezek ýuwuldy.
Ikinji derejeli antikor goşuň we ýuwuň.Her guýa 50 µl syçan / syçanyň ikinji derejeli antikoryny goşuň (0,1% TBS-de 0,1% süýtde 1: 5000 suwuklandyrylýar).Mikroplaty garaňkyda otag temperaturasynda 1 sagat inkubasiýa ediň.Soňra mikroplatlar 12 gezek Grenier Flat 5A plastinka ýuwmak programmasyny ulanyp, 0,1 M TBS-de 0,1% süýt bilen 5 gezek ýuwuldy.
Substrat goşmak.Esasy substrata 50 µl 3,3 ′, 5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) goşuň (2 damja bufer, 3 damja TMB, 2 damja wodorod peroksid 15 ml deionizirlenen suwa goşuň).TMB substratyny taýýarlaň.we ulanmazdan ozal worteks).Mikroplatany otag temperaturasynda 30 minut inkubasiýa ediň.Garaňkyda.
Stepdimleri tamamlaň we planşedi okaň.Her guýa 50 Nl 1 kükürt kislotasy goşuň we ELISA okyjysyny ulanyp, 450-den 655 nm-e çenli siňdirişi ýazga alyň.
Bu analitikleriň deionizirlenen suwda 1 mg / ml erginlerini taýýarlaň: arabinoza, rhamnoza, fukoza, ksiloza, galakturon kislotasy (GalA), glýukuron kislotasy (GlcA), mannoza, glýukoza, galaktoza, laktoza, N-asetilmannosamin (manNAc), N-asetilglukosamin.(glcNAc), N-asetilgalaktosamin (galNAc), inozitol (içki standart).Iki standart 1-nji tablisada görkezilen 1 mg / mL şeker erginlerini goşmak bilen taýýarlandy, nusgalar ähli suw aýrylýança (adatça 12-18 sagat) doňup, -80 ° C derejesinde lofilizasiýa edilýär.
Analitik deňagramlylykda gapak turbalaryna 100-500 µg nusga goşuň.Goşulan mukdary ýazga alyň.Nusgany erginleriň belli bir konsentrasiýasynda eredip, suwuk alikot hökmünde turba goşmak iň gowusydyr.Her nusga turba üçin içerki standart hökmünde 20 µl 1 mg / ml inozitol ulanyň.Mysal üçin goşulan içerki standartyň mukdary, adaty turba goşulan içerki standartyň mukdary bilen deň bolmaly.
Buraw şkafyna 8 ml suwuk metanol goşuň.Soňra 4 ml 3 N. metanolik HCl ergini, gaplanan we silkilen.Bu amal suw ulanmaýar.
Oligosakkarid nusgalaryna we adaty TMS turbalaryna 500 µl 1 M HCl metanol erginini goşuň.Nusgalar bir gije (168 sagat) 80 ° C-de termiki blokda saklandy.Metanoliz önümini guradyjy manifoldy ulanyp, otag temperaturasynda guradyň.200 µl MeOH goşuň we gaýtadan guradyň.Bu amal iki gezek gaýtalanýar.Mysal üçin 200 µl metanol, 100 µl piridin we 100 µl sirkelik angidrid goşuň we gowy garmaly.Nusgalar otag temperaturasynda 30 minut inkubasiýa edildi.we guradyldy.200 µl metanol goşuň we gaýtadan guradyň.
200 µl Tri-Sil we 20 minutlap gyzdyrylan turba goşuň.80 ° C, soňra otag temperaturasyna sowadyldy.Mysallary takmynan 50 µl mukdarda guratmak üçin guradyjy manifoldy ulanyň.Nusgalaryň doly guramagyna ýol bermändigimizi bellemelidiris.
2 ml heksan goşuň we worteksing bilen gowy garmaly.Paster turbalarynyň uçlaryny (5-8 mm) aýna ýüňi 5-3 / 4 dýuým diametrli turbanyň üstünde goýup, aýna ýüň bölegi bilen dolduryň.Nusgalar 3000 g 2 minutda merkezden gaçyryldy.Islendik eräp bilmeýän galyndylar çökýär.Nusgany 100-150 µl çenli guradyň.Takmynan 1 μl göwrüm GC-MS başlangyç temperaturada 80 ° C we başlangyç wagty 2,0 minutda sanjym edildi (2-nji tablisa).