Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் CSS ஆதரவு குறைவாக உள்ளது.சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்).இதற்கிடையில், தொடர்ந்து ஆதரவை உறுதிப்படுத்த, தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் வழங்குவோம்.
கார்ன் ஸ்டோவரில் நிலையான ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் சிக்கலான பகுப்பாய்விற்கான புதிய நோயெதிர்ப்பு மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரிக் முறைகள் AFEX உடன் முன்கூட்டியே சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன.லிக்னோசெல்லுலோசிக் பயோமாஸ் என்பது புதைபடிவ எரிபொருட்களுக்கு ஒரு நிலையான மாற்றாகும் மற்றும் உணவு, தீவனம், எரிபொருள்கள் மற்றும் இரசாயனங்கள் போன்ற பொருட்களின் உற்பத்திக்கான உயிரி தொழில்நுட்பங்களை உருவாக்க பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.தாவர செல் சுவர்களில் இருக்கும் சிக்கலான கார்போஹைட்ரேட்டுகளை குளுக்கோஸ், சைலோஸ் மற்றும் அராபினோஸ் போன்ற எளிய சர்க்கரைகளாக மாற்றுவதற்கான செலவு-போட்டி செயல்முறைகளை உருவாக்குவதே இந்த தொழில்நுட்பங்களின் திறவுகோலாகும்.லிக்னோசெல்லுலோசிக் பயோமாஸ் மிகவும் பிடிவாதமாக இருப்பதால், அது தெர்மோகெமிக்கல் சிகிச்சைகளுக்கு உட்படுத்தப்பட வேண்டும் (எ.கா., அம்மோனியா ஃபைபர் எக்ஸ்ஃபோலியேஷன் (AFEX), நீர்த்த அமிலங்கள் (DA), அயனி திரவங்கள் (IL)) மற்றும் உயிரியல் சிகிச்சைகள் (எ.கா. நொதி ஹைட்ரோலிசிஸ் மற்றும் நுண்ணுயிர் நொதித்தல்) இணைந்து விரும்பிய பொருளைப் பெற வேண்டும்..இருப்பினும், வணிக பூஞ்சை நொதிகள் நீராற்பகுப்பு செயல்பாட்டில் பயன்படுத்தப்படும் போது, ​​உருவாகும் கரையக்கூடிய சர்க்கரைகளில் 75-85% மட்டுமே மோனோசாக்கரைடுகள் ஆகும், மீதமுள்ள 15-25% கரையக்கூடிய, கரையாத ஒலிகோசாக்கரைடுகள், அவை நுண்ணுயிரிகளுக்கு எப்போதும் கிடைக்காது.முன்னதாக, கார்பன் மற்றும் டயட்டோமேசியஸ் எர்த் பிரிப்பு மற்றும் அளவு விலக்கு குரோமடோகிராஃபி ஆகியவற்றின் கலவையைப் பயன்படுத்தி கரையக்கூடிய பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளை வெற்றிகரமாக தனிமைப்படுத்தி சுத்திகரித்துள்ளோம், மேலும் அவற்றின் நொதி தடுப்பு பண்புகளையும் ஆராய்ந்தோம்.குறைந்த டிபி மற்றும் நடுநிலை ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் காட்டிலும் அதிக அளவிலான பாலிமரைசேஷன் (டிபி) மெத்திலேட்டட் யூரோனிக் அமில மாற்றுகளைக் கொண்ட ஒலிகோசாக்கரைடுகள் வணிக நொதி கலவைகளுடன் செயலாக்குவது மிகவும் கடினம் என்பதை நாங்கள் கண்டறிந்துள்ளோம்.தாவர செல் சுவர்கள் மற்றும் நொதி ஹைட்ரோலைசேட்டுகளில் கிளைக்கான் பிணைப்புகள், மேட்ரிக்ஸ்-உதவி லேசர் டிஸார்ப்ஷன் அயனியாக்கம், டைம்-ஆஃப்-ஃப்ளைட் மாஸ்-ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி ஆகியவற்றில் கிளைக்கான் பிணைப்புகளை வகைப்படுத்த, தாவர உயிரணு கிளைக்கான்களுக்கு குறிப்பிட்ட மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளை (எம்ஏபிஎஸ்) பயன்படுத்தி கிளைக்கான் விவரக்குறிப்பு உட்பட பல கூடுதல் முறைகளைப் பயன்படுத்துவதை இங்கே நாங்கள் தெரிவிக்கிறோம்..MALDI-TOF-MS) ஆனது ஒலிகோசாக்கரைடு பிணைப்புகளை வழித்தோன்றலுடன் மற்றும் இல்லாமல் வகைப்படுத்த, எதிர்மறை அயனிகள், வாயு குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (GC-MS) ஆகியவற்றின் இரண்டாம் நிலை சிதைவுக்குப் பிறகு ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி மூலம் பெறப்பட்ட கட்டமைப்பு-தகவல் கண்டறியும் சிகரங்களைப் பயன்படுத்துகிறது.ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் (DP 4-20) சிறிய அளவு காரணமாக, இந்த மூலக்கூறுகள் mAb பிணைப்பு மற்றும் குணாதிசயத்திற்குப் பயன்படுத்துவது கடினம்.இந்தச் சிக்கலைச் சமாளிக்க, மைக்ரோபிளேட் மேற்பரப்பில் குறைந்த டிபி கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பெரும்பகுதியை வெற்றிகரமாக லேபிளிடப்பட்ட புதிய பயோட்டின் ஒருங்கிணைப்பு-அடிப்படையிலான ஒலிகோசாக்கரைடு அசையாமை முறையைப் பயன்படுத்தினோம்.இந்த புதிய முறை எதிர்காலத்தில் மிகவும் மேம்பட்ட உயர் செயல்திறன் கிளைகோம் மதிப்பீடுகளை உருவாக்க உதவுகிறது, இது கண்டறியும் நோக்கங்களுக்காக பயோமார்க்ஸில் இருக்கும் ஒலிகோசாக்கரைடுகளை தனிமைப்படுத்தவும் வகைப்படுத்தவும் பயன்படுகிறது.
லிக்னோசெல்லுலோசிக் பயோமாஸ், விவசாயம், வனவியல், புல் மற்றும் மரப் பொருட்களால் ஆனது, உணவு, தீவனம், எரிபொருள் மற்றும் இரசாயன முன்னோடிகள் உள்ளிட்ட உயிர் அடிப்படையிலான பொருட்களின் உற்பத்திக்கான சாத்தியமான மூலப்பொருளாகும்.தாவர செல் சுவர்களில் இருக்கும் கார்போஹைட்ரேட்டுகள் (செல்லுலோஸ் மற்றும் ஹெமிசெல்லுலோஸ் போன்றவை) இரசாயன செயலாக்கம் மற்றும் உயிர் உருமாற்றம் (என்சைம் ஹைட்ரோலிசிஸ் மற்றும் நுண்ணுயிர் நொதித்தல் போன்றவை) மூலம் மோனோசாக்கரைடுகளாக டிபாலிமரைஸ் செய்யப்படுகின்றன.பொதுவான முன்-சிகிச்சைகளில் அம்மோனியா ஃபைபர் விரிவாக்கம் (AFEX), நீர்த்த அமிலம் (DA), அயனி திரவம் (IL) மற்றும் நீராவி வெடிப்பு (SE) ஆகியவை அடங்கும், இவை தாவர செல் சுவர்களைத் திறப்பதன் மூலம் லிக்னோசெல்லுலோஸ் உற்பத்தியைக் குறைக்க இரசாயனங்கள் மற்றும் வெப்பத்தின் கலவையைப் பயன்படுத்துகின்றன3,4.பொருளின் பிடிவாதம், 5. என்சைமடிக் நீராற்பகுப்பு வணிகச் செயலில் உள்ள கார்போஹைட்ரேட்-கொண்ட என்சைம்கள் (CAZymes) மற்றும் நுண்ணுயிர் நொதித்தல் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி உயிர் அடிப்படையிலான எரிபொருள்கள் மற்றும் இரசாயனங்கள் ஆகியவற்றை உருவாக்குவதற்கு டிரான்ஸ்ஜெனிக் ஈஸ்ட்கள் அல்லது பாக்டீரியாவைப் பயன்படுத்தி அதிக திடப்பொருள் சுமையில் மேற்கொள்ளப்படுகிறது 6 .
வணிக நொதிகளில் உள்ள CAZymes நொதிகளின் சிக்கலான கலவையால் ஆனது, அவை சிக்கலான கார்போஹைட்ரேட்-சர்க்கரை பிணைப்புகளை ஒன்றிணைத்து மோனோசாக்கரைடுகளை உருவாக்குகின்றன.நாங்கள் முன்பே தெரிவித்தது போல், கார்போஹைட்ரேட்டுகளுடன் கூடிய லிக்னின் நறுமண பாலிமர்களின் சிக்கலான நெட்வொர்க் அவற்றை மிகவும் சிக்கலாக்குகிறது, இது முழுமையற்ற சர்க்கரை மாற்றத்திற்கு வழிவகுக்கிறது, 15-25% பாலின ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் குவிக்கிறது.இது பல்வேறு உயிர்ம முன் சிகிச்சை முறைகளில் பொதுவான பிரச்சனையாகும்.இந்த இடையூறுக்கான சில காரணங்களில் நீராற்பகுப்பின் போது என்சைம் தடுப்பு, அல்லது தாவர உயிரியில் சர்க்கரைப் பிணைப்புகளை உடைக்கத் தேவையான அத்தியாவசிய அத்தியாவசிய நொதிகள் இல்லாதது அல்லது குறைந்த அளவு ஆகியவை அடங்கும்.ஒலிகோசாக்கரைடுகளில் உள்ள சர்க்கரைப் பிணைப்புகள் போன்ற சர்க்கரைகளின் கலவை மற்றும் கட்டமைப்பு பண்புகளைப் புரிந்துகொள்வது, நீராற்பகுப்பின் போது சர்க்கரை மாற்றத்தை மேம்படுத்த உதவுகிறது, மேலும் பெட்ரோலியம்-பெறப்பட்ட பொருட்களுடன் உயிரி தொழில்நுட்ப செயல்முறைகளை செலவு-போட்டியாக மாற்றுகிறது.
கார்போஹைட்ரேட்டுகளின் கட்டமைப்பை தீர்மானிப்பது சவாலானது மற்றும் திரவ குரோமடோகிராபி (LC)11,12, அணு காந்த அதிர்வு நிறமாலை (NMR)13, கேபிலரி எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் (CE)14,15,16 மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (MS)17 போன்ற முறைகளின் கலவை தேவைப்படுகிறது.,பதினெட்டு.கார்போஹைட்ரேட் கட்டமைப்புகளை அடையாளம் காண்பதற்கான ஒரு பல்துறை முறையாகும், அதாவது மேட்ரிக்ஸை (MALDI-TOF-MS) பயன்படுத்தி லேசர் டிஸார்ப்ஷன் மற்றும் அயனியாக்கம் கொண்ட விமானத்தின் நேர மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி போன்ற MS முறைகள்.சமீபத்தில், ஒலிகோசாக்கரைடு இணைப்பு நிலைகள், அனோமெரிக் கட்டமைப்புகள், வரிசைகள் மற்றும் கிளை நிலைகள் 20, 21 ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடைய கைரேகைகளை அடையாளம் காண சோடியம் அயன் சேர்க்கைகளின் மோதினால் தூண்டப்பட்ட விலகல் (CID) டேன்டெம் MS மிகவும் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
கார்போஹைட்ரேட் பிணைப்புகளை ஆழமாக அடையாளம் காண கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு ஒரு சிறந்த கருவியாகும்.இந்த முறையானது சிக்கலான கார்போஹைட்ரேட் இணைப்புகளைப் புரிந்துகொள்வதற்கான ஆய்வுகளாக செல் சுவர் கிளைக்கானை இயக்குவதற்கு இயக்கப்பட்ட மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளை (mAbs) பயன்படுத்துகிறது.250 mAbs க்கும் அதிகமானவை உலகளவில் கிடைக்கின்றன, பல்வேறு சாக்கரைடுகளைப் பயன்படுத்தி பல்வேறு நேரியல் மற்றும் கிளைத்த ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு எதிராக வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது24.தாவர உயிரணு வகை, உறுப்பு, வயது, வளர்ச்சி நிலை மற்றும் வளர்ச்சி சூழல் ஆகியவற்றைப் பொறுத்து குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகள் இருப்பதால், தாவர செல் சுவரின் அமைப்பு, கலவை மற்றும் மாற்றங்களை வகைப்படுத்த பல mAbs பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.மிக சமீபத்தில், இந்த முறையானது தாவர மற்றும் விலங்கு அமைப்புகளில் உள்ள வெசிகல் மக்கள்தொகை மற்றும் கிளைக்கான் போக்குவரத்தில் அவற்றின் பங்குகளை துணைக் குறிப்பான்கள், வளர்ச்சி நிலைகள் அல்லது சுற்றுச்சூழல் தூண்டுதல்களால் தீர்மானிக்கப்படுகிறது மற்றும் நொதி செயல்பாட்டை தீர்மானிக்க பயன்படுத்தப்படுகிறது.பெக்டின் (பி), சைலான் (எக்ஸ்), மன்னன் (எம்), சைலோக்ளுக்கன்ஸ் (எக்சில்ஜி), கலப்பு பாண்ட் குளுக்கான்கள் (எம்எல்ஜி), அராபினாக்சிலான் (ஆர்பிஎக்ஸ்), கேலக்டோமன்னன் (கால்ஜி) , குளுகுரோபினாக்சிலான் (ஜிஏராபினாக்சிலான் ஆசிட்) (ஜிஏராபினாக்சிலான் ஆசிட்) ஆகியவை அடங்கும். 9.
இருப்பினும், இந்த ஆராய்ச்சி முயற்சிகள் அனைத்தையும் மீறி, ஒலிகோசாக்கரைடு வெளியீடு, நீராற்பகுப்பின் போது ஒலிகோமெரிக் சங்கிலி நீள மாற்றங்கள், பல்வேறு குறைந்த DP பாலிமர்கள் மற்றும் அவற்றின் வளைவுகள் உட்பட, அதிக திடப்பொருள் சுமை (HSL) நீராற்பகுப்பின் போது ஒலிகோசாக்கரைடு திரட்சியின் தன்மையில் சில ஆய்வுகள் மட்டுமே கவனம் செலுத்தியுள்ளன.விநியோகங்கள் 30,31,32.இதற்கிடையில், கிளைக்கான் கட்டமைப்பின் விரிவான பகுப்பாய்விற்கு கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு ஒரு பயனுள்ள கருவியாக நிரூபிக்கப்பட்டாலும், ஆன்டிபாடி முறைகளைப் பயன்படுத்தி நீரில் கரையக்கூடிய குறைந்த டிபி ஒலிகோசாக்கரைடுகளை மதிப்பிடுவது கடினம்.5-10 kDa க்கும் குறைவான மூலக்கூறு எடை கொண்ட சிறிய DP ஒலிகோசாக்கரைடுகள் ELISA தகடுகள் 33, 34 உடன் பிணைக்கப்படுவதில்லை மற்றும் ஆன்டிபாடி சேர்ப்பதற்கு முன் கழுவப்படுகின்றன.
இங்கே, முதன்முறையாக, கரையக்கூடிய பயனற்ற ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கான கிளைகோம் பகுப்பாய்வோடு ஒரு-படி பயோடைனிலேஷன் செயல்முறையை ஒருங்கிணைத்து, மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி அவிடின்-பூசப்பட்ட தட்டுகளில் ELISA மதிப்பீட்டை நாங்கள் காட்டுகிறோம்.கிளைகோம் பகுப்பாய்விற்கான எங்கள் அணுகுமுறை MALDI-TOF-MS மற்றும் GC-MS அடிப்படையிலான பகுப்பாய்வின் மூலம் சரிபார்க்கப்பட்டது, இது ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்பட்ட சர்க்கரை கலவைகளின் ட்ரைமெதில்சிலில் (டிஎம்எஸ்) வழித்தோன்றலைப் பயன்படுத்தி நிரப்பு ஒலிகோசாக்கரைடு இணைப்புகள்.இந்த புதுமையான அணுகுமுறை எதிர்காலத்தில் உயர்-செயல்திறன் முறையாக உருவாக்கப்படலாம் மற்றும் உயிரியல் மருத்துவ ஆராய்ச்சியில் பரந்த பயன்பாட்டைக் காணலாம்35.
கிளைகோசைலேஷன் போன்ற நொதிகள் மற்றும் ஆன்டிபாடிகளின் மொழிபெயர்ப்புக்கு பிந்தைய மாற்றங்கள் அவற்றின் உயிரியல் செயல்பாட்டை பாதிக்கின்றன.எடுத்துக்காட்டாக, சீரம் புரதங்களின் கிளைகோசைலேஷனில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் அழற்சி கீல்வாதத்தில் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன, மேலும் கிளைகோசைலேஷனில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் கண்டறியும் குறிப்பான்களாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.இரைப்பை குடல் மற்றும் கல்லீரலின் நாள்பட்ட அழற்சி நோய்கள், வைரஸ் தொற்றுகள், கருப்பை, மார்பகம் மற்றும் புரோஸ்டேட் புற்றுநோய்கள் உட்பட பல்வேறு நோய்களில் பல்வேறு கிளைக்கான்கள் உடனடியாக தோன்றுவதாக இலக்கியங்களில் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது38,39,40.ஆன்டிபாடி அடிப்படையிலான கிளைக்கான் ELISA முறைகளைப் பயன்படுத்தி கிளைக்கான்களின் கட்டமைப்பைப் புரிந்துகொள்வது சிக்கலான MS முறைகளைப் பயன்படுத்தாமல் நோய் கண்டறிதலில் கூடுதல் நம்பிக்கையை வழங்கும்.
எங்கள் முந்தைய ஆய்வில், பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகள் முன் சிகிச்சை மற்றும் நொதி நீராற்பகுப்புக்குப் பிறகு நீராற்பகுப்பு செய்யப்படாமல் இருப்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 1).எங்கள் முன்னர் வெளியிடப்பட்ட வேலையில், AFEX-முன்சிகிச்சை செய்யப்பட்ட கார்ன் ஸ்டோவர் ஹைட்ரோலைசேட் (ACSH)8 இலிருந்து ஒலிகோசாக்கரைடுகளை தனிமைப்படுத்த செயல்படுத்தப்பட்ட கரி திட-கட்ட பிரித்தெடுக்கும் முறையை நாங்கள் உருவாக்கியுள்ளோம்.ஆரம்ப பிரித்தெடுத்தல் மற்றும் பிரித்தலுக்குப் பிறகு, ஒலிகோசாக்கரைடுகள் அளவு விலக்கு குரோமடோகிராபி (SEC) மூலம் மேலும் பிரிக்கப்பட்டு மூலக்கூறு எடையின் வரிசையில் சேகரிக்கப்பட்டன.சர்க்கரை மோனோமர்கள் மற்றும் ஒலிகோமர்கள் பல்வேறு முன் சிகிச்சைகளில் இருந்து வெளியிடப்பட்டது சர்க்கரை கலவை பகுப்பாய்வு மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.பல்வேறு முன் சிகிச்சை முறைகள் மூலம் பெறப்பட்ட சர்க்கரை ஒலிகோமர்களின் உள்ளடக்கத்தை ஒப்பிடும் போது, ​​பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் இருப்பு உயிரியலை மோனோசாக்கரைடுகளாக மாற்றுவதில் ஒரு பொதுவான பிரச்சனையாகும், மேலும் இது சர்க்கரை விளைச்சலை குறைந்தது 10-15% மற்றும் 18% வரை குறைக்க வழிவகுக்கும்.எங்களுக்கு.ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னங்களின் பெரிய அளவிலான உற்பத்திக்கு இந்த முறை பயன்படுத்தப்படுகிறது.இந்த வேலையில் ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் குணாதிசயத்திற்கான சோதனைப் பொருளாக பல்வேறு மூலக்கூறு எடைகள் கொண்ட ACH மற்றும் அதன் அடுத்தடுத்த பின்னங்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன.
முன் சிகிச்சை மற்றும் நொதி நீராற்பகுப்புக்குப் பிறகு, தொடர்ந்து ஒலிகோசாக்கரைடுகள் நீராற்பகுப்பு செய்யப்படாமல் இருந்தன.இங்கே (A) ஒரு ஒலிகோசாக்கரைடு பிரிப்பு முறையாகும், இதில் ஒலிகோசாக்கரைடுகள் AFEX-முன்சிகிச்சை செய்யப்பட்ட கார்ன் ஸ்டோவர் ஹைட்ரோலைசேட் (ACSH) இலிருந்து செயல்படுத்தப்பட்ட கார்பன் மற்றும் டயட்டோமேசியஸ் பூமியின் நிரம்பிய படுக்கையைப் பயன்படுத்தி தனிமைப்படுத்தப்படுகின்றன;(B) ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பிரிப்பதற்கான முறை.ஒலிகோசாக்கரைடுகள் அளவு விலக்கு குரோமடோகிராபி (SEC) மூலம் மேலும் பிரிக்கப்பட்டன;(C) சாக்கரைடு மோனோமர்கள் மற்றும் ஒலிகோமர்கள் பல்வேறு முன் சிகிச்சைகளில் இருந்து வெளியிடப்பட்டது (நீர்த்த அமிலம்: DA, அயனி திரவம்: IL மற்றும் AFEX).நொதி நீராற்பகுப்பு நிலைமைகள்: 25% (w/w) அதிக திடப்பொருள் ஏற்றுதல் (தோராயமாக 8% குளுக்கன் ஏற்றுதல்), 96 மணிநேர நீராற்பகுப்பு, 20 mg/g வணிக நொதி ஏற்றுதல் (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 விகிதம்) மற்றும் (D) சுகர் மோனோமர்கள் மற்றும் க்லுகோரோஸ்-எக்ஸ்-இலிருந்து வெளியிடப்பட்டது. ated corn stover (ACS).
கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு என்பது திடமான உயிரி எச்சங்களிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட கிளைக்கான்களின் விரிவான கட்டமைப்பு பகுப்பாய்வுக்கான பயனுள்ள கருவியாக நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது.இருப்பினும், இந்த பாரம்பரிய முறையைப் பயன்படுத்தி நீரில் கரையக்கூடிய சாக்கரைடுகள் குறைவாகவே குறிப்பிடப்படுகின்றன, ஏனெனில் குறைந்த மூலக்கூறு எடை ஒலிகோசாக்கரைடுகள் ELISA தகடுகளில் அசையாமல் இருப்பது கடினம் மற்றும் ஆன்டிபாடி சேர்ப்பதற்கு முன் கழுவப்படுகிறது.எனவே, ஆன்டிபாடி பிணைப்பு மற்றும் குணாதிசயத்திற்கு, அவிடின்-பூசப்பட்ட ELISA தட்டுகளில் கரையக்கூடிய, இணக்கமற்ற ஒலிகோசாக்கரைடுகளை பூசுவதற்கு ஒரு-படி பயோடைனிலேஷன் முறை பயன்படுத்தப்பட்டது.இந்த முறை எங்களின் முன்னர் தயாரிக்கப்பட்ட ACSH மற்றும் அதன் மூலக்கூறு எடை (அல்லது பாலிமரைசேஷன் அளவு, DP) அடிப்படையில் ஒரு பகுதியைப் பயன்படுத்தி சோதிக்கப்பட்டது.கார்போஹைட்ரேட்டின் (படம் 2) குறைக்கும் முடிவில் பயோட்டின்-எல்சி-ஹைட்ராசைடைச் சேர்ப்பதன் மூலம் ஒலிகோசாக்கரைடு பிணைப்புத் தொடர்பை அதிகரிக்க ஒரு-படி பயோட்டினிலேஷன் பயன்படுத்தப்பட்டது.கரைசலில், குறைக்கும் முடிவில் உள்ள ஹெமியாசெட்டல் குழு, பயோட்டின்-எல்சி-ஹைட்ராசைட்டின் ஹைட்ராசைடு குழுவுடன் வினைபுரிந்து ஒரு ஹைட்ராசோன் பிணைப்பை உருவாக்குகிறது.குறைக்கும் முகவர் NaCNBH3 முன்னிலையில், ஹைட்ராசோன் பிணைப்பு நிலையான பயோடைனிலேட்டட் இறுதிப் பொருளாகக் குறைக்கப்படுகிறது.சர்க்கரை குறைக்கும் முடிவை மாற்றியமைப்பதன் மூலம், குறைந்த டிபி ஒலிகோசாக்கரைடுகளை ELISA தட்டுகளுடன் பிணைப்பது சாத்தியமானது, மேலும் எங்கள் ஆய்வில் இது கிளைக்கான்-இலக்கு mAbs ஐப் பயன்படுத்தி அவிடின்-பூசப்பட்ட தட்டுகளில் செய்யப்பட்டது.
பயோடைனிலேட்டட் ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு ELISA அடிப்படையிலான மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளின் திரையிடல்.இங்கே (A) ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் ஒருங்கிணைந்த பயோடைனிலேஷன் மற்றும் நியூட்ராஅவிடின் பூசப்பட்ட தட்டுகளில் கிளைக்கான்-இலக்கு mAbs உடன் ELISA ஸ்கிரீனிங் மற்றும் (B) எதிர்வினை தயாரிப்புகளின் பயோடைனிலேஷனுக்கான ஒரு-படி செயல்முறையைக் காட்டுகிறது.
ஒலிகோசாக்கரைடு-இணைந்த ஆன்டிபாடிகளுடன் அவிடின் பூசப்பட்ட தட்டுகள் பின்னர் முதன்மை மற்றும் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளில் சேர்க்கப்பட்டு ஒளி மற்றும் நேரத்தை உணர்திறன் கொண்ட ஊடகத்தில் கழுவப்பட்டன.ஆன்டிபாடி பிணைப்பு முடிந்ததும், தட்டை அடைகாக்க TMB அடி மூலக்கூறைச் சேர்க்கவும்.எதிர்வினை இறுதியாக சல்பூரிக் அமிலத்துடன் நிறுத்தப்பட்டது.ஆன்டிபாடி-குறிப்பிட்ட குறுக்கு-இணைப்பைக் கண்டறிய ஒவ்வொரு ஆன்டிபாடியின் பிணைப்பு வலிமையைத் தீர்மானிக்க எலிசா ரீடரைப் பயன்படுத்தி அடைகாக்கப்பட்ட தட்டுகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.பரிசோதனையின் விவரங்கள் மற்றும் அளவுருக்களுக்கு, "பொருட்கள் மற்றும் முறைகள்" என்ற தொடர்புடைய பகுதியைப் பார்க்கவும்.
ACSH இல் உள்ள கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகள் மற்றும் லிக்னோசெல்லுலோசிக் ஹைட்ரோலைசேட்களிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட கச்சா மற்றும் சுத்திகரிக்கப்பட்ட ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னங்களில் உள்ள கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளை வகைப்படுத்துவதன் மூலம் குறிப்பிட்ட பயன்பாடுகளுக்கு புதிதாக உருவாக்கப்பட்ட இந்த முறையின் பயன்பாட்டை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம்.படம் 3 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, பயோசைலேட்டட் கிளைகோம் மதிப்பீட்டு முறைகளைப் பயன்படுத்தி ACSH இல் அடையாளம் காணப்பட்ட மிகவும் பொதுவான எபிடோப்-பதிலீடு செய்யப்பட்ட சைலான்கள் பொதுவாக யூரோனிக் (U) அல்லது மெத்திலூரோனிக் (MeU) மற்றும் பெக்டிக் அராபினோகலக்டான்கள் ஆகும்.அவற்றில் பெரும்பாலானவை ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்படாத திடப்பொருட்களின் (UHS) கிளைக்கான்களின் பகுப்பாய்வு பற்றிய எங்கள் முந்தைய ஆய்வில் கண்டறியப்பட்டன.
செல் சுவர் கிளைகானுக்கு இயக்கப்பட்ட ஒரு மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடியைப் பயன்படுத்தி மறுசுழற்சி ஒலிகோசாக்கரைடு எபிடோப்களைக் கண்டறிதல்."நடுநிலை" பின்னம் ACN பின்னம் மற்றும் "அமில" பின்னம் FA பின்னமாகும்.ஹீட்மேப்பில் உள்ள பிரகாசமான சிவப்பு நிறங்கள் அதிக எபிடோப் உள்ளடக்கத்தைக் குறிக்கின்றன, மேலும் பிரகாசமான நீல நிறங்கள் வெற்று பின்னணியைக் குறிக்கின்றன.அளவிலான வண்ண மதிப்புகள் N=2 சூத்திரங்களுக்கான மூல OD மதிப்புகளை அடிப்படையாகக் கொண்டவை.ஆன்டிபாடிகளால் அங்கீகரிக்கப்பட்ட முக்கிய எபிடோப்கள் வலதுபுறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன.
இந்த செல்லுலோஸ் அல்லாத கட்டமைப்புகளை சோதனை செய்யப்பட்ட வணிக நொதி கலவையில் உள்ள மிகவும் பொதுவான செல்லுலேஸ்கள் மற்றும் ஹெமிசெல்லுலேஸ்கள் மூலம் பிளவுபடுத்த முடியவில்லை, இதில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் வணிக நொதிகள் அடங்கும்.எனவே, அவற்றின் நீராற்பகுப்புக்கு புதிய துணை நொதிகள் தேவைப்படுகின்றன.தேவையான செல்லுலோஸ் அல்லாத துணை நொதிகள் இல்லாமல், இந்த செல்லுலோஸ் அல்லாத பிணைப்புகள் மோனோசாக்கரைடுகளாக முழுமையாக மாற்றப்படுவதைத் தடுக்கின்றன, அவற்றின் தாய் சர்க்கரை பாலிமர்கள் அதிக அளவில் நீராற்பகுப்பு செய்யப்பட்டாலும், வணிக நொதி கலவைகளைப் பயன்படுத்தி கரைக்கப்பட்டாலும் கூட.
சிக்னல் விநியோகம் மற்றும் அதன் பிணைப்பு வலிமை பற்றிய கூடுதல் ஆய்வு, டைமர்களில் குறைந்த டிபி பின்னங்களை (டி, ஈ, எஃப், டிபி) விட அதிக டிபி சர்க்கரை பின்னங்களில் (ஏ, பி, சி, டிபி வரை 20+ வரை) பைண்டிங் எபிடோப்கள் குறைவாக இருப்பதைக் காட்டுகிறது (படம். 1).நடுநிலை துண்டுகளை விட செல்லுலோஸ் அல்லாத எபிடோப்களில் அமிலத் துண்டுகள் அதிகம் காணப்படுகின்றன.இந்த நிகழ்வுகள் எங்கள் முந்தைய ஆய்வில் காணப்பட்ட வடிவத்துடன் ஒத்துப்போகின்றன, அங்கு உயர் DP மற்றும் அமிலத் தொகுதிகள் நொதி நீராற்பகுப்புக்கு மிகவும் எதிர்ப்புத் தெரிவிக்கின்றன.எனவே, செல்லுலோஸ் அல்லாத கிளைக்கான் எபிடோப்கள் மற்றும் U மற்றும் MeU மாற்றுகளின் இருப்பு ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் நிலைத்தன்மைக்கு பெரிதும் பங்களிக்கும்.குறைந்த டிபி ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு, குறிப்பாக எபிடோப் ஒரு டைமெரிக் அல்லது ட்ரைமெரிக் ஒலிகோசாக்கரைடுகளாக இருந்தால், பிணைப்பு மற்றும் கண்டறிதல் செயல்திறன் சிக்கலாக இருக்கும் என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.வெவ்வேறு நீளங்களின் வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பயன்படுத்தி இது சோதிக்கப்படலாம், ஒவ்வொன்றும் ஒரு குறிப்பிட்ட mAb உடன் பிணைக்கும் ஒரு எபிடோப்பை மட்டுமே கொண்டுள்ளது.
இவ்வாறு, கட்டமைப்பு-குறிப்பிட்ட ஆன்டிபாடிகளின் பயன்பாடு சில வகையான மறுசீரமைப்பு பிணைப்புகளை வெளிப்படுத்தியது.பயன்படுத்தப்படும் ஆன்டிபாடியின் வகை, பொருத்தமான பிணைப்பு முறை மற்றும் அது உருவாக்கும் சிக்னலின் வலிமை (மிகவும் குறைவானது) ஆகியவற்றைப் பொறுத்து, புதிய நொதிகள் அடையாளம் காணப்பட்டு, முழுமையான கிளைகோகன்வெர்ஷனுக்காக நொதி கலவையில் அரை-அளவாக சேர்க்கப்படும்.உதாரணமாக ACSH ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பகுப்பாய்வை எடுத்துக் கொண்டால், ஒவ்வொரு உயிர்மப் பொருளுக்கும் கிளைக்கான் பிணைப்புகளின் தரவுத்தளத்தை உருவாக்கலாம்.ஆன்டிபாடிகளின் வெவ்வேறு தொடர்புகள் கணக்கில் எடுத்துக்கொள்ளப்பட வேண்டும் என்பதையும், அவற்றின் தொடர்பு தெரியவில்லை என்றால், வெவ்வேறு ஆன்டிபாடிகளின் சிக்னல்களை ஒப்பிடும் போது இது சில சிரமங்களை உருவாக்கும் என்பதை இங்கே கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.கூடுதலாக, கிளைக்கான் பிணைப்புகளின் ஒப்பீடு அதே ஆன்டிபாடிக்கான மாதிரிகளுக்கு இடையில் சிறப்பாகச் செயல்படலாம்.இந்த பிடிவாதமான பிணைப்புகள் பின்னர் CAZyme தரவுத்தளத்துடன் இணைக்கப்படலாம், அதில் இருந்து நாம் நொதிகளை அடையாளம் காணலாம், வேட்பாளர் என்சைம்களைத் தேர்ந்தெடுக்கலாம் மற்றும் பிணைப்பை உடைக்கும் என்சைம்களை சோதிக்கலாம் அல்லது இந்த நொதிகளை பயோரிஃபைனரிகளில் பயன்படுத்த நுண்ணுயிர் அமைப்புகளை உருவாக்கலாம்.
லிக்னோசெல்லுலோசிக் ஹைட்ரோலைசேட்டுகளில் உள்ள குறைந்த மூலக்கூறு எடை ஒலிகோசாக்கரைடுகளை வகைப்படுத்துவதற்கான மாற்று முறைகளை நோயெதிர்ப்பு முறைகள் எவ்வாறு பூர்த்தி செய்கின்றன என்பதை மதிப்பிடுவதற்கு, MALDI (படம். 4, S1-S8) மற்றும் அதே குழுவில் GC-MS அடிப்படையில் TMS-பெறப்பட்ட சாக்கரைடுகளை பகுப்பாய்வு செய்தோம் (படம். 5) பகுதி oligos.ஒலிகோசாக்கரைடு மூலக்கூறுகளின் வெகுஜன விநியோகம் நோக்கம் கொண்ட கட்டமைப்புடன் பொருந்துகிறதா என்பதை ஒப்பிடுவதற்கு MALDI பயன்படுத்தப்படுகிறது.அத்திப்பழத்தில்.4 நடுநிலை கூறுகளான ACN-A மற்றும் ACN-B ஆகியவற்றின் MC ஐக் காட்டுகிறது.ACN-A பகுப்பாய்வு, DP 4–8 (Fig. 4) இலிருந்து DP 22 (Fig. S1) வரையிலான பென்டோஸ் சர்க்கரைகளின் வரம்பை உறுதிப்படுத்தியது, அதன் எடைகள் MeU-xylan ஒலிகோசாக்கரைடுகளுடன் ஒத்துப்போகின்றன.ACN-B பகுப்பாய்வு DP 8-15 உடன் பெண்டோஸ் மற்றும் குளுக்கோக்சிலன் தொடர்களை உறுதிப்படுத்தியது.படம் S3 போன்ற துணைப் பொருட்களில், FA-C அமிலத் தொகுதி வெகுஜன விநியோக வரைபடங்கள் ELISA-அடிப்படையிலான mAb ஸ்கிரீனிங்கில் காணப்படும் மாற்று சைலான்களுடன் ஒத்துப்போகும் 8-15 DP உடன் (Me)U மாற்று பென்டோஸ் சர்க்கரைகளின் வரம்பைக் காட்டுகின்றன.எபிடோப்கள் சீரானவை.
ACS இல் இருக்கும் கரையக்கூடிய இணக்கமற்ற ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் MALDI-MS ஸ்பெக்ட்ரம்.இங்கே, (A) மெத்திலேட்டட் யூரோனிக் அமிலம் (DP 4-8) கொண்ட ACN-A குறைந்த எடை வரம்பு பின்னங்கள் குளுகுராக்சிலான் ஒலிகோசாக்கரைடுகள் மற்றும் (B) ACN-B சைலான் மற்றும் மெத்திலேட்டட் யூரோனிக் அமில ஒலிகோசாக்கரைடுகள் (DPP8-15) உடன் மாற்றப்பட்டது.
பயனற்ற ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கிளைக்கான் எச்சத்தின் கலவையின் பகுப்பாய்வு.இங்கே (A) GC-MS பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்ட பல்வேறு ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னங்களின் TMS சாக்கரைடு கலவை.(B) ஒலிகோசாக்கரைடுகளில் உள்ள பல்வேறு டிஎம்எஸ்-பெறப்பட்ட சர்க்கரைகளின் கட்டமைப்புகள்.ACN - நடுநிலை ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கொண்ட அசிட்டோனிட்ரைல் பின்னம் மற்றும் அமில ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கொண்ட FA - ஃபெருலிக் அமிலப் பின்னம்.
படம் S9 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னத்தின் LC-MS பகுப்பாய்விலிருந்து மற்றொரு சுவாரஸ்யமான முடிவு எடுக்கப்பட்டது (முறைகளை மின்னணு துணைப் பொருளில் காணலாம்).ACN-B பின்னத்தின் பிணைப்பின் போது ஹெக்ஸோஸ் மற்றும் -OAc குழுக்களின் துண்டுகள் மீண்டும் மீண்டும் காணப்பட்டன.இந்த கண்டுபிடிப்பு கிளைகோம் மற்றும் MALDI-TOF பகுப்பாய்வில் காணப்பட்ட துண்டு துண்டாக இருப்பதை உறுதிப்படுத்துவது மட்டுமல்லாமல், முன்கூட்டியே சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட லிக்னோசெல்லுலோசிக் பயோமாஸில் சாத்தியமான கார்போஹைட்ரேட் வழித்தோன்றல்கள் பற்றிய புதிய தகவல்களையும் வழங்குகிறது.
டிஎம்எஸ் சர்க்கரை வழித்தோன்றலைப் பயன்படுத்தி ஒலிகோசாக்கரைடு பகுதியின் சர்க்கரை கலவையையும் நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம்.GC-MS ஐப் பயன்படுத்தி, ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னத்தில் (படம் 5) நரம்பியல் (வழித்தோன்றல் அல்லாத) மற்றும் அமில சர்க்கரைகள் (GluA மற்றும் GalA) கலவையை நாங்கள் தீர்மானித்தோம்.குளுகுரோனிக் அமிலம் C மற்றும் D அமிலக் கூறுகளில் காணப்படுகிறது, அதே சமயம் கேலக்டூரோனிக் அமிலம் A மற்றும் B அமிலக் கூறுகளில் காணப்படுகிறது, இவை இரண்டும் அமில சர்க்கரையின் உயர் DP கூறுகளாகும்.இந்த முடிவுகள் எங்கள் ELISA மற்றும் MALDI தரவை உறுதிப்படுத்துவது மட்டுமல்லாமல், ஒலிகோசாக்கரைடு திரட்சியின் முந்தைய ஆய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகின்றன.எனவே, ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பயோடைனிலேஷனைப் பயன்படுத்தும் நவீன நோயெதிர்ப்பு முறைகள் மற்றும் அதைத் தொடர்ந்து ELISA ஸ்கிரீனிங் ஆகியவை பல்வேறு உயிரியல் மாதிரிகளில் கரையக்கூடிய மறுசீரமைப்பு ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கண்டறிய போதுமானவை என்று நாங்கள் நம்புகிறோம்.
ELISA-அடிப்படையிலான mAb ஸ்கிரீனிங் முறைகள் பல்வேறு முறைகளால் சரிபார்க்கப்பட்டதால், இந்த புதிய அளவு முறையின் திறனை மேலும் ஆராய விரும்புகிறோம்.இரண்டு வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகள், சைலோஹெக்சாசாக்கரைடு ஒலிகோசாக்கரைடு (XHE) மற்றும் 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), செல் சுவர் கிளைக்கானைக் குறிவைத்து புதிய mAb அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தி வாங்கப்பட்டு சோதிக்கப்பட்டன.படம் 6 பயோடைனிலேட்டட் பிணைப்பு சமிக்ஞைக்கும் ஒலிகோசாக்கரைடு செறிவின் பதிவு செறிவுக்கும் இடையே ஒரு நேரியல் தொடர்பைக் காட்டுகிறது, இது சாத்தியமான லாங்முயர் உறிஞ்சுதல் மாதிரியைக் குறிக்கிறது.mAbs இல், CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, மற்றும் CCRC-M151 ஆகியவை XHE உடன் தொடர்புடையவை, மேலும் CCRC-M108, CCRC-M109 மற்றும் LM11 ஆகியவை A2X0n வரையிலான வரம்பில் A2X0n வரை தொடர்புடையவை.பரிசோதனையின் போது ஆன்டிபாடிகள் குறைவாக இருப்பதால், ஒவ்வொரு ஒலிகோசாக்கரைடு செறிவுடனும் வரையறுக்கப்பட்ட பரிசோதனைகள் செய்யப்பட்டன.சில ஆன்டிபாடிகள் அதே ஒலிகோசாக்கரைடுக்கு அடி மூலக்கூறாக மிகவும் வித்தியாசமாக வினைபுரிகின்றன என்பதை இங்கே கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும், ஏனெனில் அவை சற்று வித்தியாசமான எபிடோப்களுடன் பிணைப்பதால் மற்றும் மிகவும் வேறுபட்ட பிணைப்புத் தொடர்புகளைக் கொண்டிருக்கலாம்.புதிய mAb அணுகுமுறை உண்மையான மாதிரிகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படும்போது துல்லியமான எபிடோப் அடையாளத்தின் வழிமுறைகள் மற்றும் தாக்கங்கள் மிகவும் சிக்கலானதாக இருக்கும்.
பல்வேறு கிளைக்கான்-இலக்கு mAbs கண்டறிதல் வரம்பை தீர்மானிக்க இரண்டு வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகள் பயன்படுத்தப்பட்டன.இங்கே, ஒலிகோசாக்கரைடு செறிவின் பதிவு செறிவுடனான நேரியல் தொடர்புகள் (A) XHE mAb மற்றும் (B) A2XX உடன் mAb க்கான லாங்முயர் உறிஞ்சுதல் வடிவங்களைக் குறிக்கிறது.தொடர்புடைய எபிடோப்கள் மதிப்பீட்டில் அடி மூலக்கூறுகளாகப் பயன்படுத்தப்படும் வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கட்டமைப்புகளைக் குறிக்கின்றன.
கிளைக்கான்-இலக்கு மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளின் பயன்பாடு (கிளைகோகோமிக் பகுப்பாய்வு அல்லது ELISA-அடிப்படையிலான mAb ஸ்கிரீனிங்) தாவர உயிரிகளை உருவாக்கும் பெரும்பாலான முக்கிய செல் சுவர் கிளைக்கான்களின் ஆழமான குணாதிசயத்திற்கான ஒரு சக்திவாய்ந்த கருவியாகும்.இருப்பினும், கிளாசிக்கல் கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு பெரிய செல் சுவர் கிளைக்கான்களை மட்டுமே வகைப்படுத்துகிறது, ஏனெனில் பெரும்பாலான ஒலிகோசாக்கரைடுகள் ELISA தட்டுகளில் திறமையாக அசையாது.இந்த ஆய்வில், AFEX-முன்சிகிச்சை செய்யப்பட்ட கார்ன் ஸ்டவர் அதிக திடப்பொருள் உள்ளடக்கத்தில் நொதியாக நீராற்பகுப்பு செய்யப்பட்டது.ஹைட்ரோலைசேட்டில் உள்ள மறுசெயல் செல் சுவர் கார்போஹைட்ரேட்டுகளின் கலவையை தீர்மானிக்க சர்க்கரை பகுப்பாய்வு பயன்படுத்தப்பட்டது.இருப்பினும், ஹைட்ரோலைசேட்டுகளில் உள்ள சிறிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் mAb பகுப்பாய்வு குறைத்து மதிப்பிடப்பட்டுள்ளது, மேலும் ELISA தட்டுகளில் ஒலிகோசாக்கரைடுகளை திறம்பட அசைக்க கூடுதல் கருவிகள் தேவைப்படுகின்றன.
நியூட்ராஅவிடின்™ பூசப்பட்ட தகடுகளில் ELISA திரையிடலைத் தொடர்ந்து ஒலிகோசாக்கரைடு பயோடைனிலேஷனை இணைப்பதன் மூலம் mAb ஸ்கிரீனிங்கிற்கான ஒரு புதிய மற்றும் திறமையான ஒலிகோசாக்கரைடு அசையாமை முறையை நாங்கள் இங்கு புகாரளிக்கிறோம்.அசையாத பயோட்டினைலேட்டட் ஒலிகோசாக்கரைடுகள், மறுசீரமைப்பு ஒலிகோசாக்கரைடுகளை விரைவாகவும் திறமையாகவும் கண்டறிவதற்கு ஆன்டிபாடிக்கு போதுமான தொடர்பைக் காட்டியது.மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரியின் அடிப்படையில் இந்த பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கலவை பற்றிய பகுப்பாய்வு, இம்யூனோஸ்கிரீனிங்கிற்கான இந்த புதிய அணுகுமுறையின் முடிவுகளை உறுதிப்படுத்தியது.எனவே, இந்த ஆய்வுகள் ஒலிகோசாக்கரைடுகளில் உள்ள குறுக்கு இணைப்புகளைக் கண்டறிய, ஒலிகோசாக்கரைடு பயோட்டினிலேஷன் மற்றும் கிளைக்கான்-இலக்கு மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளுடன் ELISA ஸ்கிரீனிங் ஆகியவற்றின் கலவையைப் பயன்படுத்தலாம் மற்றும் ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கட்டமைப்பைக் குறிக்கும் பிற உயிர்வேதியியல் ஆய்வுகளில் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படலாம் என்பதை நிரூபிக்கிறது.
இந்த பயோட்டின் அடிப்படையிலான கிளைக்கான் விவரக்குறிப்பு முறையானது தாவர உயிரியில் கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் மறுசுழற்சி கார்போஹைட்ரேட் பிணைப்புகளை ஆராயும் திறன் கொண்ட முதல் அறிக்கையாகும்.உயிரி எரிபொருள் உற்பத்திக்கு வரும்போது உயிரியின் சில பகுதிகள் ஏன் மிகவும் பிடிவாதமாக இருக்கின்றன என்பதைப் புரிந்துகொள்ள இது உதவுகிறது.இந்த முறை கிளைகோம் பகுப்பாய்வு முறைகளில் ஒரு முக்கியமான இடைவெளியை நிரப்புகிறது மற்றும் அதன் பயன்பாட்டை தாவர ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு அப்பால் பரந்த அளவிலான அடி மூலக்கூறுகளுக்கு விரிவுபடுத்துகிறது.எதிர்காலத்தில், நாம் பயோட்டினிலேஷனுக்காக ரோபோட்டிக்ஸைப் பயன்படுத்தலாம் மற்றும் எலிசாவைப் பயன்படுத்தி மாதிரிகளின் உயர்-செயல்திறன் பகுப்பாய்வுக்காக நாங்கள் உருவாக்கிய முறையைப் பயன்படுத்தலாம்.
முன்னோடி 33A14 கலப்பின விதைகளிலிருந்து வளர்க்கப்படும் சோள வைக்கோல் (CS) 2010 இல் கொலராடோவில் உள்ள ரேயில் உள்ள கிராமர் பண்ணையில் இருந்து அறுவடை செய்யப்பட்டது.நில உரிமையாளரின் அனுமதியுடன், இந்த உயிரியலை ஆராய்ச்சிக்கு பயன்படுத்தலாம். அறை வெப்பநிலையில் ஜிப்-லாக் பைகளில் மாதிரிகள் உலர்ந்த <6% ஈரப்பதத்தில் சேமிக்கப்பட்டன. அறை வெப்பநிலையில் ஜிப்-லாக் பைகளில் மாதிரிகள் உலர்ந்த <6% ஈரப்பதத்தில் சேமிக்கப்பட்டன. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежkoy-молнией при комнатной темпер. அறை வெப்பநிலையில் ஜிப்பர் செய்யப்பட்ட பைகளில் <6% ஈரப்பதத்தில் மாதிரிகள் உலர்ந்த நிலையில் சேமிக்கப்பட்டன.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежkoy-Molniey pri comnatnoy temperaturre s влажностью < 6%. 6% ஈரப்பதத்துடன் அறை வெப்பநிலையில் மாதிரிகள் ஜிப்பர் பைகளில் சேமிக்கப்படுகின்றன.இந்த ஆய்வு உள்ளூர் மற்றும் தேசிய வழிகாட்டுதல்களுடன் இணங்கியது.NREL நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி கலவை பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.கலவையில் 31.4% குளுக்கன், 18.7% சைலான், 3.3% அராபினன், 1.2% கேலக்டன், 2.2% அசிடைல், 14.3% லிக்னின், 1.7% புரதம் மற்றும் 13. 4% சாம்பல் உள்ளது.
Cellic® CTec2 (138 mg புரதம்/மிலி, நிறைய VCNI 0001) என்பது நோவோசைம்ஸ் (Franklinton, NC, USA) இலிருந்து செல்லுலேஸ், β-குளுக்கோசிடேஸ் மற்றும் Cellic® HTec2 (157 mg புரதம்/மிலி, நிறைய VHN00001) ஆகியவற்றின் சிக்கலான கலவையாகும்.மல்டிஃபெக்ட் பெக்டினேஸ்® (72 mg புரதம்/mL), பெக்டின் சிதைக்கும் என்சைம்களின் சிக்கலான கலவை, DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) மூலம் நன்கொடையாக வழங்கப்பட்டது.Kjeldahl நைட்ரஜன் பகுப்பாய்வு (AOAC முறை 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) ஐப் பயன்படுத்தி புரத உள்ளடக்கத்தை (மற்றும் புரதம் அல்லாத நைட்ரஜனின் பங்களிப்பைக் கழிப்பதன் மூலம்) என்சைம் புரதச் செறிவு தீர்மானிக்கப்பட்டது.டயட்டோமேசியஸ் எர்த் 545 இஎம்டி மில்லிபோரிடமிருந்து (பில்லெரிகா, எம்ஏ) வாங்கப்பட்டது.செயல்படுத்தப்பட்ட கார்பன் (DARCO, 100 கண்ணி துகள்கள்), அவிசெல் (PH-101), பீச் சைலான் மற்றும் பிற அனைத்து இரசாயனங்களும் Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) இலிருந்து வாங்கப்பட்டன.
AFEX முன் சிகிச்சை GLBRC இல் செய்யப்பட்டது (பயோமாஸ் கன்வெர்ஷன் ரிசர்ச் லேபரட்டரி, MSU, Lansing, MI, USA).முன் சிகிச்சை 140 ° C. 15 நிமிடங்களுக்கு மேற்கொள்ளப்பட்டது.46 வதிவிட நேரம் 1:1 விகிதத்தில் அன்ஹைட்ரஸ் அம்மோனியா மற்றும் பயோமாஸ் 60% (w/w) இல் ஸ்டெயின்லெஸ் ஸ்டீல் பெஞ்ச்டாப் பேட்ச் ரியாக்டரில் (Parr இன்ஸ்ட்ரூமென்ட்ஸ் கம்பெனி) ஏற்றப்படுகிறது.இது 30 நிமிடங்கள் எடுத்தது.அணுஉலை 140°C க்கு கொண்டு வரப்பட்டது மற்றும் அம்மோனியா விரைவாக வெளியிடப்பட்டது, இதனால் உயிர்ப்பொருளானது அறை வெப்பநிலைக்கு விரைவாக திரும்ப அனுமதிக்கிறது.AFEX ப்ரீ-ட்ரீட் செய்யப்பட்ட கார்ன் ஸ்டோவரின் (ACS) கலவையானது, சிகிச்சையளிக்கப்படாத சோள ஸ்டவரை (UT-CS) போலவே இருந்தது.
அதிக திடப்பொருட்களான ACSH 25% (w/w) (தோராயமாக 8% டெக்ஸ்ட்ரான் ஏற்றுதல்) ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பெரிய அளவிலான உற்பத்திக்கான தொடக்கப் பொருளாகத் தயாரிக்கப்பட்டது.Cellic® Ctec2 10 mg புரதம்/g குளுக்கன் (முன்சிகிச்சை செய்யப்பட்ட உயிரியில்), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg புரதம்/g glucan மற்றும் Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) உள்ளிட்ட வணிக நொதி கலவையைப் பயன்படுத்தி ACS இன் நொதி நீர்ப்பகுப்பு செய்யப்பட்டது.)), 5 மிகி புரதம் / கிராம் டெக்ஸ்ட்ரான்.3 லிட்டர், pH 4.8, 50°C மற்றும் 250 rpm வேலை அளவு கொண்ட 5-லிட்டர் உயிரியக்கத்தில் நொதி நீராற்பகுப்பு மேற்கொள்ளப்பட்டது.96 மணிநேரம் நீராற்பகுப்புக்குப் பிறகு, ஹைட்ரோலைசேட் 6000 ஆர்பிஎம்மில் 30 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு மூலம் சேகரிக்கப்பட்டது, பின்னர் 14000 ஆர்பிஎம்மில் 30 நிமிடங்களுக்கு ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்படாத திடப்பொருள்களை அகற்றும்.ஹைட்ரோலைசேட் பின்னர் 0.22 மிமீ வடிகட்டி பீக்கர் மூலம் மலட்டு வடிகட்டலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டது.வடிகட்டப்பட்ட ஹைட்ரோலைசேட் 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் மலட்டு பாட்டில்களில் சேமிக்கப்பட்டு பின்னர் கார்பனில் பிரிக்கப்பட்டது.
NREL ஆய்வக பகுப்பாய்வு நடைமுறைகளின்படி பிரித்தெடுத்தல்-சார்ந்த உயிரி மாதிரிகளின் கலவையின் பகுப்பாய்வு: கலவை பகுப்பாய்வுக்கான மாதிரிகள் தயாரித்தல் (NREL/TP-510-42620) மற்றும் உயிரியில் உள்ள கட்டமைப்பு கார்போஹைட்ரேட்டுகள் மற்றும் லிக்னின் (NREL/TP-510 - 42618)47.
ஹைட்ரோலைசேட் ஸ்ட்ரீமின் ஒலிகோசாக்கரைடு பகுப்பாய்வு ஆட்டோகிளேவ் அடிப்படையிலான அமில நீராற்பகுப்பு முறையைப் பயன்படுத்தி 2 மில்லி அளவில் செய்யப்பட்டது.ஹைட்ரோலைசேட் மாதிரியை 69.7 µl 72% சல்பூரிக் அமிலத்துடன் 10 மில்லி ஸ்க்ரூ கேப் கல்ச்சர் குழாயில் கலந்து 121 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் பெஞ்ச்டாப்பில் 1 மணிநேரம் அடைகாத்து, ஐஸ் மீது குளிர்வித்து, உயர் செயல்திறன் கொண்ட திரவ குரோமடோகிராபி (HPLC) குப்பியில் வடிகட்டவும்.ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் செறிவு, அமில-ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்பட்ட மாதிரியில் உள்ள மொத்த சர்க்கரை செறிவில் இருந்து ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்படாத மாதிரியில் உள்ள மோனோசாக்கரைடுகளின் செறிவைக் கழிப்பதன் மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது.
அமில நீராற்பகுப்பு உயிரியில் உள்ள குளுக்கோஸ், சைலோஸ் மற்றும் அராபினோஸ் செறிவுகள், ஷிமாட்ஸு HPLC அமைப்பைப் பயன்படுத்தி ஆய்வு செய்யப்பட்டதுநெடுவரிசை 50 டிகிரி செல்சியஸில் பராமரிக்கப்பட்டு 0.6 மிலி/நிமிடம் 5 எம்எம் எச்2எஸ்ஓ4 தண்ணீரில் நீக்கப்பட்டது.ஓட்டம்.
ஹைட்ரோலைசேட் சூப்பர்நேட்டண்ட் மோனோமர் மற்றும் ஒலிகோசாக்கரைடு உள்ளடக்கத்திற்காக நீர்த்தப்பட்டு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.நொதி நீராற்பகுப்புக்குப் பிறகு பெறப்பட்ட மோனோமெரிக் சர்க்கரைகள் HPLC ஆல் பயோ-ராட் (ஹெர்குலஸ், CA) அமினெக்ஸ் HPX-87P நெடுவரிசை மற்றும் ஒரு சாம்பல் பாதுகாப்பு நிரலுடன் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.நெடுவரிசை வெப்பநிலை 80 ° C இல் பராமரிக்கப்பட்டது, நீர் 0.6 மில்லி / நிமிடம் ஓட்ட விகிதத்துடன் மொபைல் கட்டமாக பயன்படுத்தப்பட்டது.ஒலிகோசாக்கரைடுகள் refs இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ள முறைகளின்படி 121 ° C இல் நீர்த்த அமிலத்தில் நீராற்பகுப்பு மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது.41, 48, 49.
முன்பு விவரிக்கப்பட்ட நடைமுறைகள் 27, 43, 50, 51 ஐப் பயன்படுத்தி, மூல, AFEX முன்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மற்றும் அனைத்து ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்படாத உயிரி எச்சங்கள் (தொடர் செல் சுவர் சாறுகளின் உற்பத்தி மற்றும் அவற்றின் mAb திரையிடல் உட்பட) மீது சாக்கரைடு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.கிளைகோம் பகுப்பாய்விற்காக, தாவர செல் சுவர் பொருளின் ஆல்கஹால்-கரையாத எச்சங்கள் உயிரி எச்சங்களிலிருந்து தயாரிக்கப்பட்டு, அம்மோனியம் ஆக்சலேட் (50 mM), சோடியம் கார்பனேட் (50 mM மற்றும் 0.5% w/v), CON போன்ற பெருகிய முறையில் ஆக்கிரமிப்பு வினைகளுடன் தொடர் பிரித்தெடுத்தலுக்கு உட்படுத்தப்படுகின்றன.(1M மற்றும் 4M, இரண்டும் 1% w/v சோடியம் போரோஹைட்ரைடு) மற்றும் அமில குளோரைட் முன்பு விவரிக்கப்பட்டது52,53.சாறுகள் பின்னர் செல் சுவர் கிளைகானுக்கு இயக்கப்பட்ட mAb50களின் சிக்கலான பேனலுக்கு எதிராக ELISA க்கு உட்படுத்தப்பட்டன, மேலும் mAb பிணைப்பு எதிர்வினைகள் வெப்ப வரைபடமாக வழங்கப்பட்டன.தாவர செல் சுவர் கிளைகானை குறிவைக்கும் mAbs ஆய்வக பங்குகளில் (CCRC, JIM மற்றும் MAC தொடர்) வாங்கப்பட்டது.
ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் ஒரு-படி பயோடைனிலேஷன்.கார்போஹைட்ரேட்டுகளை பயோட்டின்-எல்சி-ஹைட்ராசைடுடன் இணைப்பது பின்வரும் செயல்முறையைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) டைமிதில் சல்பாக்சைடில் (DMSO, 70 μl) தீவிரமாக கிளறி 1 நிமிடம் 65° C. வெப்பப்படுத்துவதன் மூலம் கரைக்கப்பட்டது.பனிப்பாறை அசிட்டிக் அமிலம் (30 µl) சேர்க்கப்பட்டு, கலவையானது சோடியம் சயனோபோரோஹைட்ரைடில் (6.4 mg/100 µmol) ஊற்றப்பட்டு, சுமார் 1 நிமிடம் 65° C. வெப்பநிலையில் சூடுபடுத்திய பின் முழுமையாகக் கரைக்கப்பட்டது.பின்னர், 5 முதல் 8 μl வரையிலான எதிர்வினை கலவையானது உலர்ந்த ஒலிகோசாக்கரைடில் (1-100 nmol) சேர்க்கப்பட்டு, குறைக்கும் முடிவில் லேபிளின் 10 மடங்கு அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட மோலார் மிகுதியைப் பெறுகிறது.எதிர்வினை 2 மணிநேரத்திற்கு 65 ° C இல் மேற்கொள்ளப்பட்டது, அதன் பிறகு மாதிரிகள் உடனடியாக சுத்திகரிக்கப்பட்டன.சோடியம் சயனோபோரோஹைட்ரைடு குறைப்பு இல்லாமல் லேபிளிங் சோதனைகளில் பயன்படுத்தப்படவில்லை, மேலும் மாதிரிகள் 2.5 மணிநேரத்திற்கு 65 ° C. இல் வினைபுரிந்தன.
எலிசா பூச்சு மற்றும் பயோட்டினிலேட்டட் ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் மாதிரிகளை கழுவுதல்.25 μl பயோடைனிலேட்டட் மாதிரிகள் (ஒவ்வொரு செறிவூட்டப்பட்ட மாதிரியின் 100 μl 5 மில்லி 0.1 M டிரிஸ் பஃபர் கரைசலில் (டிபிஎஸ்) நீர்த்தப்பட்டது) அவிடின் பூசப்பட்ட தட்டின் ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் சேர்க்கப்பட்டது.கட்டுப்பாட்டு கிணறுகள் 0.1 M TBS இல் 10 μg/ml என்ற செறிவில் 50 μl பயோட்டின் பூசப்பட்டது.வெற்று அளவீடுகளுக்கு டீயோனைஸ் செய்யப்பட்ட நீர் ஒரு பூச்சாக பயன்படுத்தப்பட்டது.மாத்திரை இருட்டில் அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது.நிரல் எண்ணைப் பயன்படுத்தி 0.1 M TBS இல் 0.1% கொழுப்பு நீக்கப்பட்ட பாலைக் கொண்டு தட்டை 3 முறை கழுவவும்.Grenier பிளாட் 3Aக்கு 11.
முதன்மை ஆன்டிபாடிகளின் சேர்த்தல் மற்றும் கழுவுதல்.ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 40 μl முதன்மை ஆன்டிபாடியைச் சேர்க்கவும்.இருட்டில் அறை வெப்பநிலையில் மைக்ரோ பிளேட்டை 1 மணிநேரம் அடைகாக்கவும்.க்ரேனியர் பிளாட் 3Aக்கு வாஷ் புரோகிராம் #11ஐப் பயன்படுத்தி 0.1எம் டிபிஎஸ்ஸில் 0.1% பாலுடன் தட்டுகள் 3 முறை கழுவப்பட்டன.
இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியைச் சேர்த்து கழுவவும்.ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 50 µl சுட்டி/எலி இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியை (0.1% பாலில் 1:5000 நீர்த்த 0.1 M TBS) சேர்க்கவும்.இருட்டில் அறை வெப்பநிலையில் மைக்ரோ பிளேட்டை 1 மணிநேரம் அடைகாக்கவும்.மைக்ரோபிளேட்டுகள் 0.1 M TBS இல் 0.1% பாலுடன் 5 முறை க்ரெனியர் பிளாட் 5A பிளேட் வாஷ் நிரல் #12 ஐப் பயன்படுத்தி கழுவப்பட்டன.
அடி மூலக்கூறு சேர்த்தல்.50 µl இன் 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) அடி மூலக்கூறில் சேர்க்கவும் (2 துளிகள் தாங்கல், 3 துளிகள் TMB, 2 துளிகள் ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு 15 மில்லி டீயோனைஸ்டு நீரில் சேர்ப்பதன் மூலம்).TMB அடி மூலக்கூறைத் தயாரிக்கவும்.மற்றும் பயன்பாட்டிற்கு முன் சுழல்).மைக்ரோ பிளேட்டை அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கவும்.இருட்டில்.
படியை முடித்து டேப்லெட்டைப் படிக்கவும்.ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 50 µl 1 N சல்பூரிக் அமிலத்தைச் சேர்த்து, ELISA ரீடரைப் பயன்படுத்தி 450 முதல் 655 nm வரை உறிஞ்சுதலைப் பதிவு செய்யவும்.
டீயோனைஸ் செய்யப்பட்ட நீரில் இந்த பகுப்பாய்வுகளின் 1 mg/ml கரைசல்களைத் தயாரிக்கவும்: அராபினோஸ், ரம்னோஸ், ஃபுகோஸ், சைலோஸ், கேலக்டுரோனிக் அமிலம் (GalA), குளுகுரோனிக் அமிலம் (GlcA), மேனோஸ், குளுக்கோஸ், கேலக்டோஸ், லாக்டோஸ், N-அசிடைல்மன்னோசமைன் (NA-acetylmannosamine.(glcNAc), N-அசிடைல்கலக்டோசமைன் (galNAc), இனோசிட்டால் (உள் தரநிலை).அட்டவணை 1 இல் காட்டப்பட்டுள்ள 1 mg/mL சர்க்கரை கரைசல்களைச் சேர்ப்பதன் மூலம் இரண்டு தரநிலைகள் தயாரிக்கப்பட்டன. அனைத்து நீரும் அகற்றப்படும் வரை (பொதுவாக சுமார் 12-18 மணிநேரம்) மாதிரிகள் -80° C. இல் உறைந்து லியோபிலைஸ் செய்யப்படுகின்றன.
பகுப்பாய்வு சமநிலையில் ஸ்க்ரூ கேப் குழாய்களுக்கு 100-500 μg மாதிரியைச் சேர்க்கவும்.சேர்க்கப்பட்ட தொகையை பதிவு செய்யவும்.ஒரு குறிப்பிட்ட செறிவு கரைப்பானில் மாதிரியைக் கரைத்து, அதை குழாயில் ஒரு திரவ அலிகோடாகச் சேர்ப்பது சிறந்தது.ஒவ்வொரு மாதிரி குழாய்க்கும் 20 µl இன் 1 mg/ml inositol ஒரு உள் தரமாக பயன்படுத்தவும்.மாதிரியில் சேர்க்கப்படும் உள் தரத்தின் அளவு, நிலையான குழாயில் சேர்க்கப்படும் உள் தரத்தின் அளவு போலவே இருக்க வேண்டும்.
ஒரு திருகு தொப்பி குப்பியில் 8 மில்லி அன்ஹைட்ரஸ் மெத்தனால் சேர்க்கவும்.பிறகு 4 மிலி 3 N. மெத்தனாலிக் HCl கரைசலை மூடி, அசைக்கவும்.இந்த செயல்முறை தண்ணீரைப் பயன்படுத்துவதில்லை.
ஒலிகோசாக்கரைடு மாதிரிகள் மற்றும் நிலையான TMS குழாய்களில் 500 µl 1 M HCl மெத்தனால் கரைசலை சேர்க்கவும்.மாதிரிகள் ஒரே இரவில் (168 மணிநேரம்) 80° C. வெப்பநிலையில் வெப்பத் தொகுதியில் அடைக்கப்பட்டுள்ளன.உலர்த்தும் பன்மடங்கு பயன்படுத்தி அறை வெப்பநிலையில் மெத்தனாலிசிஸ் தயாரிப்பை உலர்த்தவும்.200 µl MeOH ஐ சேர்த்து மீண்டும் உலர்த்தவும்.இந்த செயல்முறை இரண்டு முறை மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்படுகிறது.மாதிரியில் 200 μl மெத்தனால், 100 μl பைரிடின் மற்றும் 100 μl அசிட்டிக் அன்ஹைட்ரைடு சேர்த்து நன்கு கலக்கவும்.மாதிரிகள் அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாத்தன.மற்றும் உலர்ந்த.200 μl மெத்தனால் சேர்த்து மீண்டும் உலர வைக்கவும்.
200 μl ட்ரை-சில் மற்றும் மூடிய குழாயை 20 நிமிடங்கள் சூடாக்கவும்.80 டிகிரி செல்சியஸ், பின்னர் அறை வெப்பநிலையில் குளிர்விக்கப்படுகிறது.தோராயமாக 50 µl அளவுக்கு மாதிரியை மேலும் உலர்த்துவதற்கு உலர்த்தும் பன்மடங்கு பயன்படுத்தவும்.மாதிரிகள் முழுமையாக உலர அனுமதிக்கவில்லை என்பதை கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.
2 மில்லி ஹெக்ஸேன் சேர்த்து சுழல் மூலம் நன்கு கலக்கவும்.5-3/4 அங்குல விட்டம் கொண்ட பைப்பெட்டின் மேல் கண்ணாடி கம்பளியைச் செருகுவதன் மூலம் பாஸ்டர் பைப்பெட்டுகளின் (5-8 மிமீ) நுனிகளை கண்ணாடி கம்பளியால் நிரப்பவும்.மாதிரிகள் 2 நிமிடங்களுக்கு 3000 கிராம் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டன.எந்த கரையாத எச்சங்களும் வீழ்படிந்துள்ளன.மாதிரியை 100-150 μl வரை உலர்த்தவும்.ஏறத்தாழ 1 μl அளவு GC-MS இல் 80 °C இன் ஆரம்ப வெப்பநிலையிலும், ஆரம்ப நேரத்தில் 2.0 நிமிடங்களிலும் செலுத்தப்பட்டது (அட்டவணை 2).