Spas ji bo serdana Nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgiriya CSS-ê bi sînor e. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê di Internet Explorer-ê de neçalak bikin). Di vê navberê de, ji bo ku piştgiriya domdar misoger bikin, em ê malperê bêyî şêwaz û JavaScript-ê nîşan bidin.
Rêbazên nû yên îmmunolojîk û spektrometriya girseyî ji bo analîza tevlihev a olîgosakarîdên mayînde di stovera genim de ku bi AFEX-ê pêş-dermankirî ye. Biyomasa lîgnoselulozîk alternatîfek domdar a sotemeniyên fosîl e û bi berfirehî ji bo pêşxistina biyoteknolojiyan ji bo hilberîna hilberên wekî xwarin, xwarin, sotemenî û kîmyewî tê bikar anîn. Mifteya van teknolojiyan pêşxistina pêvajoyên pêşbaziya lêçûnê ye ji bo veguherandina karbohîdratên tevlihev ên di dîwarên şaneyên nebatan de hene bo şekirên hêsan ên wekî glukoz, ksîloz û arabînoz. Ji ber ku biyomasa lîgnoselulozîk pir serhişk e, divê ew bi hev re ji bo bidestxistina hilbera xwestî dermankirinên termokîmyayî (mînak, pilingkirina fîbera amonyakê (AFEX), asîdên zirav (DA), şilekên îyonîk (IL)) û dermankirinên biyolojîkî (mînak, hîdrolîza enzîmatîk û fermentasyona mîkrobî) re were derbas kirin. . Lêbelê, dema ku enzîmên fungî yên bazirganî di pêvajoya hîdrolîzê de têne bikar anîn, tenê 75-85% ji şekirên çareserker ên çêbûyî monosakarîd in, û 15-25% mayî olîgosakarîdên çareserker, dijwar in, ku her gav ji bo mîkroorganîzmayan peyda nabin. Berê, me bi serkeftî olîgosakarîdên serhişk ên çareserker bi karanîna tevlîheviyek ji kromatografiya veqetandin û derxistina mezinahiyê ya karbon û erdê diyatomî veqetand û paqij kir, û her weha taybetmendiyên wan ên astengkirina enzîmê lêkolîn kir. Me dît ku olîgosakarîdên ku guherînên asîda uronîk a metîlkirî ya pileya bilindtir a polîmerîzasyonê (DP) dihewînin, ji olîgosakarîdên DP-ya nizm û olîgosakarîdên bêalî dijwartir in ku bi tevliheviyên enzîmên bazirganî werin pêvajo kirin. Li vir em karanîna çend rêbazên din radigihînin, di nav de profîlkirina glîkanê bi karanîna antîkorên monoklonal (mAb) yên taybetî ji bo glîkanên biyomasa nebatan ji bo taybetmendiya girêdanên glîkanê di dîwarên hucreyên nebatan û hîdrolîzatên enzîmatîk de, îyonîzasyona desorpsiyona lazer a bi alîkariya matrîksê, spektrometriya girseyî ya dema firînê. . MALDI-TOF-MS) lûtkeyên teşhîsê yên agahdariya avahiyê bikar tîne ku bi spektroskopiyê piştî hilweşîna duyemîn a îyonên neyînî, kromatografiya gazê û spektrometriya girseyî (GC-MS) têne bidestxistin da ku girêdanên olîgosakarîd bi û bêyî derivatîzasyonê diyar bike. Ji ber mezinahiya piçûk a olîgosakarîdan (DP 4-20), karanîna van molekulan ji bo girêdana mAb û taybetmendiya wan dijwar e. Ji bo çareserkirina vê pirsgirêkê, me rêbazek nû ya bêmobîlîzasyona olîgosakarîd a li ser bingeha konjugasyona biyotîn bikar anî ku bi serkeftî piraniya olîgosakarîdên çareserker ên DP-ya kêm li ser rûyê mîkroplateyê nîşan kir, ku dûv re di pergalek mAb-ya bi derûdora bilind de ji bo analîza girêdana taybetî hate bikar anîn. Ev rêbaza nû dê di pêşerojê de pêşkeftina ceribandinên glîkomê yên bi derûdora bilind ên pêşkeftîtir hêsan bike ku dikarin ji bo veqetandin û karakterîzekirina olîgosakarîdên ku di nîşankerên biyolojîk de hene ji bo armancên teşhîsê werin bikar anîn.
Biyomasa lîgnoselulozîk, ku ji materyalên çandinî, daristanî, giya û darîn pêk tê, ji bo hilberîna hilberên biyo-bingeh, di nav de xwarin, xwarin, sotemenî û pêşengên kîmyewî ji bo hilberandina hilberên bi nirxek bilindtir, madeyek xav a potansiyel e1. Karbohîdrat (wek seluloz û hemîseluloz) ên ku di dîwarên şaneyên nebatan de hene, bi pêvajoya kîmyewî û biyotransformasyonê (wek hîdrolîza enzîmatîk û fermentasyona mîkrobî) têne depolîmerîzekirin û dibin monosakarîd. Pêş-dermankirinên hevpar berfirehkirina fîbera amonyakê (AFEX), asîda zirav (DA), şileya îyonîk (IL), û teqîna buharê (SE) vedihewîne, ku têkeliyek kîmyewî û germê bikar tînin da ku hilberîna lîgnoselulozê bi vekirina dîwarên şaneyên nebatan kêm bikin3,4. serhişkiya madeyê, 5. Hîdrolîza enzîmatîk bi barek hişk a bilind bi karanîna enzîmên bazirganî yên çalak ên ku karbohîdrat dihewînin (CAZymes) û fermentasyona mîkrobî bi karanîna hevîrtirşkên transgenîk an bakteriyan ji bo hilberandina sotemenî û kîmyewîyên biyo-bingeh 6 tê kirin.
CAZîmên di enzîmên bazirganî de ji tevlîheviyek tevlihev a enzîman pêk tên ku bi awayekî sinerjîk girêdanên tevlihev ên karbohîdrat-şekir diqetînin da ku monosakarîdan çêbikin2,7. Wekî ku me berê ragihand, tora tevlihev a polîmerên aromatîk ên lîgnînê bi karbohîdratan re wan pir dijwar dike, ku dibe sedema veguherîna şekir a netemam, ku 15-25% ji oligosakarîdên cinsî kom dike ku di dema hîdrolîza enzîmatîk a biyomasa pêş-dermankirî de nayên hilberandin. Ev pirsgirêkek hevpar e bi rêbazên pêş-dermankirina biyomasê yên cûrbecûr re. Hin sedemên vê tengasiyê astengkirina enzîmê di dema hîdrolîzê de, an nebûn an astên kêm ên enzîmên bingehîn ên bingehîn ên ku ji bo şikandina girêdanên şekir di biyomasa nebatan de hewce ne hene. Fêmkirina pêkhate û taybetmendiyên avahîsaziyê yên şekiran, wekî girêdanên şekir di oligosakarîdan de, dê ji me re bibe alîkar ku veguherîna şekir di dema hîdrolîzê de baştir bikin, pêvajoyên biyoteknolojîkî bi hilberên ji petrolê hatine wergirtin re pêşbaz bikin.
Diyar kirina avahiya karbohîdratan dijwar e û pêdivî bi tevlîheviyek ji rêbazan heye wekî kromatografiya şile (LC)11,12, spektroskopiya rezonansa manyetîk a navokî (NMR)13, elektroforeza kapîlar (CE)14,15,16 û spektrometriya girseyî (MS)17. hejdeh. Rêbazên MS yên wekî spektrometriya girseyî ya dema firînê bi desorpsiyona lazer û îyonîzasyonê bi karanîna matrîksê (MALDI-TOF-MS) rêbazek piralî ye ji bo destnîşankirina avahiyên karbohîdratan. Di demên dawî de, MS-ya tandem a Dissociation-Induced Collision-Induced (CID) ya adductên îyonên sodyûmê herî berfireh hatiye bikar anîn da ku şopa tiliyan a ku bi pozîsyonên girêdana olîgosakarîd, mîhengên anomerîk, rêzan û pozîsyonên şaxkirinê re têkildar in were destnîşankirin 20, 21.
Analîza glîkanê amûrek pir baş e ji bo naskirina kûr a girêdanên karbohîdratan22. Ev rêbaz antîkorên monoklonal (mAb) ên ku ji bo glîkana dîwarê şaneya nebatan têne rêve kirin wekî sondaj bikar tîne da ku girêdanên karbohîdratên tevlihev fam bike. Li çaraliyê cîhanê zêdetirî 250 mAb hene, ku li dijî gelek olîgosakarîdên xêzik û şaxkirî bi karanîna gelek sakarîdan hatine sêwirandin24. Çend mAb bi berfirehî hatine bikar anîn da ku avahî, pêkhate û guhertinên dîwarê şaneya nebatan diyar bikin, ji ber ku cûdahiyên girîng li gorî celebê şaneya nebatan, organ, temen, qonaxa pêşkeftinê û jîngeha mezinbûnê hene25,26. Di demên dawî de, ev rêbaz ji bo famkirina nifûsên vezîkulan di pergalên nebatan û heywanan de û rolên wan ên têkildar di veguhastina glîkanê de wekî ku ji hêla nîşankerên bin-hucreyî, qonaxên pêşkeftinê, an teşwîqên jîngehê ve têne destnîşankirin, û ji bo destnîşankirina çalakiya enzîmatîk hatiye bikar anîn. Hin ji avahiyên cuda yên glîkan û ksîlanan ên ku hatine destnîşankirin ev in: pektîn (P), ksîlan (X), mannan (M), ksîloglukan (XylG), glûkanên girêdana tevlihev (MLG), arabînoksîlan (ArbX), galaktomannan (GalG), asîda glûkuronîk-arabînoksîlan (GArbX) û arabîno-galaktan (ArbG)29.
Lêbelê, tevî van hemû hewildanên lêkolînê, tenê çend lêkolîn li ser xwezaya kombûna oligosakarîdan di dema hîdrolîza barkirina hişk a bilind (HSL) de, di nav de berdana oligosakarîdan, guhertinên dirêjahiya zincîra oligomerîk di dema hîdrolîzê de, polîmerên DP yên nizm ên cûrbecûr, û xêzên wan, hûr bûne. 30,31,32. Di vê navberê de, her çend analîza glîkanê wekî amûrek bikêrhatî ji bo analîzek berfireh a avahiya glîkanê derketiye holê jî, nirxandina oligosakarîdên DP yên nizm ên di avê de çareser dibin bi karanîna rêbazên antîkoran dijwar e. Olîgosakarîdên DP yên piçûktir ên bi giraniya molekulî ya kêmtir ji 5-10 kDa bi plakayên ELISA 33, 34 ve nayên girêdan û berî lêzêdekirina antîkorê têne şuştin.
Li vir, bo cara yekem, em ceribandinek ELISA li ser plakayên bi avidîn pêçayî bi karanîna antîkorên monoklonal nîşan didin, ku prosedurek biyotînîlasyonê ya yek-gavî ji bo olîgosakarîdên berxwedêr ên çareserker bi analîza glîkomê re dike yek. Nêzîkatiya me ya ji bo analîza glîkomê bi analîza girêdanên olîgosakarîdên temamker ên li ser bingeha MALDI-TOF-MS û GC-MS bi karanîna derivatîzasyona trîmetîlsîlîl (TMS) a pêkhateyên şekir ên hîdrolîzkirî ve hate pejirandin. Ev nêzîkatiya nûjen dikare di pêşerojê de wekî rêbazek bi hilberîna bilind were pêşve xistin û di lêkolînên biyomedîkî de serîlêdanek berfirehtir bibîne35.
Guhertinên piştî-wergerandinê yên enzîm û antîkoran, wekî glîkozîlasyon,36 bandorê li çalakiya wan a biyolojîk dikin. Bo nimûne, guhertinên di glîkozîlasyona proteînên serumê de roleke girîng di artrîta înflamatuar de dilîzin, û guhertinên di glîkozîlasyonê de wekî nîşankerên teşhîsê têne bikar anîn37. Di wêjeyê de hatiye ragihandin ku glîkanên cûrbecûr bi hêsanî di gelek nexweşiyan de xuya dibin, di nav de nexweşiyên înflamatuar ên kronîk ên rêça gastrointestinal û kezebê, enfeksiyonên vîrusî, penceşêrên hêkdank, memik û prostatê38,39,40. Fêmkirina avahiya glîkanan bi karanîna rêbazên ELISA yên glîkan ên li ser bingeha antîkoran dê baweriyek zêde di teşhîsa nexweşiyê de bêyî karanîna rêbazên MS-ya tevlihev peyda bike.
Lêkolîna me ya berê nîşan da ku olîgosakarîdên serhişk piştî pêşdermankirin û hîdrolîza enzîmatîk bê hîdrolîz man (Wêne 1). Di xebata me ya berê de, me rêbazek derxistina qonaxa zexm a komirê çalakkirî pêşxist da ku olîgosakarîdan ji hîdrolîzata genimê stover (ACSH) ya pêşdermankirî ya bi AFEX veqetînin. Piştî derxistin û veqetandina destpêkê, olîgosakarîd bi kromatografiya derxistina mezinahiyê (SEC) bêtir hatin parçekirin û li gorî giraniya molekulî hatin berhevkirin. Monomerên şekir û olîgomerên ku ji pêşdermankirinên cûda hatine berdan bi analîza pêkhateya şekir hatin analîzkirin. Dema ku naveroka olîgomerên şekir ên ku bi rêbazên pêşdermankirinê yên cûda hatine bidestxistin tê berhev kirin, hebûna olîgosakarîdên serhişk pirsgirêkek hevpar e di veguherîna biyomasê de bo monosakarîdan û dikare bibe sedema kêmbûna hilberîna şekir bi kêmî ve 10-15% û heta 18%. US. Ev rêbaz ji bo hilberîna mezintir a fraksiyonên olîgosakarîd tê bikar anîn. ACH-ya encam û fraksiyonên wê yên paşîn bi giraniyên molekulî yên cûda wekî materyalê ceribandinê ji bo taybetmendiya olîgosakarîdan di vê xebatê de hatin bikar anîn.
Piştî pêşdermankirin û hîdrolîza enzîmatîk, olîgosakarîdên domdar bê hîdrolîz man. Li vir (A) rêbazeke veqetandina olîgosakarîdan e ku tê de olîgosakarîd ji hîdrolîzata genimê ya pêşdermankirî ya bi AFEX (ACSH) bi karanîna nivînek pakkirî ya karbona çalakkirî û axa diatomaceous têne veqetandin; (B) Rêbaza veqetandina olîgosakarîdan. Olîgosakarîd bi kromatografiya derxistina mezinahiyê (SEC) bêtir hatin veqetandin; (C) Monomer û olîgomerên şekir ên ji pêşdermankirinên cûrbecûr hatine berdan (asîda şilkirî: DA, şileya îyonîk: IL û AFEX). Mercên hîdrolîza enzîmatîk: barkirina hişk a bilind a 25% (w/w) (bi qasî 8% barkirina glukan), hîdrolîza 96 demjimêran, barkirina enzîma bazirganî ya 20 mg/g (rêjeya Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) û (D) Monomer û olîgomerên şekir ên glukoz, ksîloz û arabînozê ji genimê ya pêşdermankirî ya bi AFEX (ACS) hatine berdan.
Analîza glîkanê ji bo analîzek berfireh a avahîsaziyê ya glîkanan di ekstraktên ji bermayiyên biyomasa hişk veqetandî de amûrek bikêrhatî derketiye holê. Lêbelê, sakarîdên di avê de çareser dibin bi karanîna vê rêbaza kevneşopî kêm têne temsîl kirin41 ji ber ku olîgosakarîdên giraniya molekulî ya kêm li ser plakayên ELISA dijwar e ku werin bêbandor kirin û berî lêzêdekirina antîkorê têne şuştin. Ji ber vê yekê, ji bo girêdana antîkorê û taybetmendiya wê, rêbazek biyotînîlasyonê ya yek-gavî hate bikar anîn da ku olîgosakarîdên çareserker û ne-lihevhatî li ser plakayên ELISA yên bi avidîn ve hatine pêçandin werin pêçandin. Ev rêbaz bi karanîna ACSH-ya me ya berê hatî hilberandin û perçeyek li ser bingeha giraniya wê ya molekulî (an jî pileya polîmerîzasyonê, DP) hate ceribandin. Biyotînîlasyona yek-gavî hate bikar anîn da ku girêdana olîgosakarîd bi zêdekirina biyotîn-LC-hîdrazîdê li dawiya kêmker a karbohîdratê zêde bike (Wêne 2). Di çareseriyê de, koma hemiasetal li dawiya kêmker bi koma hîdrazîdê ya biyotîn-LC-hîdrazîdê re reaksiyon dike da ku girêdanek hîdrazonê çêbike. Di hebûna ajana kêmker NaCNBH3 de, girêdana hîdrazonê vediguhere hilberek dawîn a biyotînîlkirî ya aram. Bi guhertina dawiya kêmkirina şekir, girêdana olîgosakarîdên DP-ya kêm bi plakayên ELISA-yê gengaz bû, û di lêkolîna me de ev yek li ser plakayên bi avidîn pêçayî bi karanîna mAb-ên armanckirî yên glîkan hate kirin.
Lêkolîna antîkorên monoklonal li ser bingeha ELISA ji bo olîgosakarîdên biyotînkirî. Li vir (A) biyotînîlasyona olîgosakarîdan û lêkolîna paşê ya ELISA bi mAb-ên armanckirî yên glîkan li ser plakayên pêçayî yên NeutrAvidin re têkel kirin û (B) prosedurek yek-gavî ji bo biyotînîlasyona berhemên reaksiyonê nîşan dide.
Plaqeyên bi avidînê pêçayî yên bi antîkorên olîgosakarîd-konjugasyonkirî dû re li antîkorên seretayî û duyemîn hatin zêdekirin û di navgînek hesas a ronahî û demê de hatin şuştin. Piştî ku girêdana antîkorê qediya, substrata TMB lê zêde bikin da ku plakeyê înkubasyon bikin. Di dawiyê de reaksiyon bi asîda sulfurîk hate rawestandin. Plaqeyên înkubasyonkirî bi karanîna xwendevanek ELISA hatin analîzkirin da ku hêza girêdana her antîkorê were destnîşankirin da ku girêdana xaçerê ya taybetî ya antîkorê were tespît kirin. Ji bo hûrgulî û parametreyên ceribandinê, li beşa têkildar "Materyal û Rêbaz" binêrin.
Em kêrhatîbûna vê rêbaza nû pêşxistî ji bo sepanên taybetî bi taybetmendiya olîgosakarîdên çareserker ên di ACSH de û her weha di fraksiyonên olîgosakarîdên xav û paqijkirî yên ji hîdrolîzatên lîgnoselulozîk veqetandî de nîşan didin. Wekî ku di Şekil 3 de tê xuyang kirin, ksîlanên herî gelemperî yên ku bi epîtopên guherandî yên di ACSH de bi karanîna rêbazên ceribandina glîkomê ya biyoasîlekirî hatine destnîşankirin bi gelemperî arabinogalaktanên uronic (U) an methyluronic (MeU) û pektîk in. Piraniya wan di lêkolîna me ya berê de li ser analîza glîkanên madeyên hişk ên ne-hîdrolîzkirî (UHS)43 jî hatine dîtin.
Tesbîtkirina epîtopên olîgosakarîd ên serhişk bi karanîna antîkorek monoklonal a ku ber bi glîkana dîwarê şaneyê ve tê rêve kirin. Fraksiyona "bêalî" fraksiyona ACN ye û fraksiyona "asîdî" fraksiyona FA ye. Sorên geştir li ser nexşeya germê naveroka epîtopê ya bilindtir nîşan didin, û şînên geştir paşxaneyek vala nîşan didin. Nirxên rengîn ên li ser pîvanê li ser nirxên OD yên xav ji bo formulasyonên N=2 ne. Epîtopên sereke yên ku ji hêla antîkoran ve têne nas kirin li rastê têne nîşandan.
Ev avahiyên ne-selûloz ji aliyê seluloz û hemîselûlazên herî gelemperî yên di tevliheviya enzîmên bazirganî ya ceribandî de, ku enzîmên bazirganî yên herî gelemperî têne bikar anîn jî di nav xwe de digire, nehatin parçekirin. Ji ber vê yekê, ji bo hîdrolîza wan enzîmên alîkar ên nû hewce ne. Bêyî enzîmên alîkar ên ne-selûloz ên pêwîst, ev girêdanên ne-selûloz rê li ber veguherîna tevahî bo monosakarîdan digirin, her çend polîmerên şekir ên dêûbav ên wan bi berfirehî di perçeyên kurttir de werin hîdrolîz kirin û bi karanîna tevliheviyên enzîmên bazirganî werin çareser kirin.
Lêkolîneke din a li ser belavbûna sînyalê û hêza girêdana wê nîşan da ku epîtopên girêdanê di fraksiyonên şekir ên DP-ya bilind (A, B, C, DP heta 20+) de ji fraksiyonên DP-ya nizm (D, E, F, DP) di dîmeran de kêmtir bûn (Wêne 1). Parçeyên asîdê di epîtopên ne-seluloz de ji parçeyên bêalî pirtir in. Ev diyarde bi şêweya ku di lêkolîna me ya berê de hatiye dîtin re lihevhatî ne, ku tê de DP-ya bilind û beşên asîdê li hember hîdrolîza enzîmatîk berxwedêrtir bûn. Ji ber vê yekê, hebûna epîtopên glîkanê yên ne-seluloz û guheztinên U û MeU dikare pir beşdarî aramiya olîgosakarîdan bibe. Divê were zanîn ku karîgeriya girêdan û tespîtkirinê dikare ji bo olîgosakarîdên DP-ya nizm pirsgirêk be, nemaze heke epîtop olîgosakarîdek dîmerîk an trîmerîk be. Ev dikare bi karanîna olîgosakarîdên bazirganî yên bi dirêjahiyên cûda were ceribandin, ku her yek tenê yek epîtopek heye ku bi mAb-ek taybetî ve girêdide.
Bi vî awayî, bikaranîna antîkorên taybetî yên avahiyê hin cureyên girêdanên serhildêr eşkere kir. Li gorî celebê antîkorê ku tê bikar anîn, şêweya girêdana guncaw, û hêza sînyala ku ew çêdike (herî zêde û herî kêm zêde), enzîmên nû dikarin werin destnîşankirin û bi nîv-hejmarî li tevliheviya enzîmê werin zêdekirin ji bo veguherîna glîko ya bêkêmasîtir. Bi analîza olîgosakarîdên ACSH wekî mînak, em dikarin ji bo her materyalê biyomasê databaseyek girêdanên glîkan biafirînin. Divê li vir were zanîn ku divê girêdana cûda ya antîkoran were hesibandin, û heke girêdana wan ne diyar be, ev ê dema ku sînyalên antîkorên cûda têne berhev kirin hin zehmetiyan biafirîne. Wekî din, berhevdana girêdanên glîkan dibe ku di navbera nimûneyan de ji bo heman antîkorê çêtirîn bixebite. Dûv re ev girêdanên serhişk dikarin bi databasa CAZyme ve werin girêdan, ku em dikarin ji wê enzîman nas bikin, enzîmên namzet hilbijêrin û enzîmên şikandina girêdanan biceribînin, an jî pergalên mîkrobî pêşve bibin da ku van enzîman ji bo karanîna di biyorefîneran de îfade bikin44.
Ji bo nirxandina ka rêbazên îmmunolojîk çawa rêbazên alternatîf ji bo taybetmendiya olîgosakarîdên giraniya molekulî ya kêm ên di hîdrolîzatên lîgnoselulozîk de temam dikin, me MALDI (Wêne 4, S1-S8) û analîza sakarîdên ji TMS-ê hatine wergirtin li ser bingeha GC-MS li ser heman beşa olîgosakarîd a panelê (Wêne 5) pêk anî. MALDI tê bikar anîn da ku were berhev kirin ka belavbûna girseyî ya molekulên olîgosakarîd bi avahiya armanckirî re li hev dike an na. Li ser wêne 4 MC-ya pêkhateyên bêalî ACN-A û ACN-B nîşan dide. Analîza ACN-A rêzek şekirên pentozê ji DP 4-8 (Wêne 4) heya DP 22 (Wêne S1) piştrast kir, ku giraniya wan bi olîgosakarîdên MeU-ksîlan re têkildar e. Analîza ACN-B rêzeya pentoz û glukoksîlan bi DP 8-15 piştrast kir. Di materyalên pêvek ên wekî Şekil S3 de, nexşeyên belavbûna girseya beşa asîdî ya FA-C rêzek şekirên pentozê yên bi (Me)U hatine guheztin nîşan didin ku DP-ya wan 8-15 e û bi ksîlanên guheztî yên ku di ceribandina mAb-ya li ser bingeha ELISA-yê de têne dîtin re lihevhatî ne. Epîtop lihevhatî ne.
Spektûreya MALDI-MS ya olîgosakarîdên çareserker ên nelihevhatî yên ku di ACS de hene. Li vir, (A) Fraksiyonên rêjeya giraniya kêm a ACN-A ku olîgosakarîdên glukuroksîlan ên bi asîda uronic methylated (DP 4-8) hatine guheztin û (B) olîgosakarîdên ksîlan û asîda uronic methylated ên ACN-B ku bi glukuroksîlan (DP 8-15) hatine guheztin, dihewîne.
Analîza pêkhateya bermayiya glîkanê ya olîgosakarîdên refrakter. Li vir (A) Pêkhateya sakarîda TMS ya fraksiyonên olîgosakarîd ên cûrbecûr ku bi karanîna analîza GC-MS hatine bidestxistin. (B) Strukturên şekirên cûrbecûr ên ji TMS-ê hatine wergirtin ên ku di olîgosakarîdan de hene. ACN - fraksiyona asetonîtrîl ku olîgosakarîdên bêalî dihewîne û FA - fraksiyona asîda ferulîk ku olîgosakarîdên asîd dihewîne.
Encamek din a balkêş ji analîza LC-MS ya fraksiyona olîgosakarîdê hat derxistin, wekî ku di Wêneya S9 de tê nîşandan (rêbaz dikarin di materyalê pêveka elektronîkî de werin dîtin). Parçeyên komên heksoz û -OAc di dema girêdana fraksiyona ACN-B de bi dubareyî hatin dîtin. Ev dîtin ne tenê parçebûna ku di analîza glîkom û MALDI-TOF de tê dîtin piştrast dike, lê di heman demê de agahdariyên nû li ser derivatîfên karbohîdratên potansiyel di bîyomasa lîgnoselulozîk a pêş-dermankirî de peyda dike.
Her wiha me pêkhateya şekir a fraksiyona olîgosakarîdê bi karanîna derivatîzasyona şekir a TMS analîz kir. Bi karanîna GC-MS, me pêkhateya şekirên neural (ne-derîvat) û asîdî (GluA û GalA) di fraksiyona olîgosakarîdê de diyar kir (Wêne 5). Asîda glukuronîk di pêkhateyên asîdî C û D de tê dîtin, di heman demê de asîda galakturonik di pêkhateyên asîdî A û B de tê dîtin, ku her du jî pêkhateyên DP-ya bilind ên şekirên asîdî ne. Ev encam ne tenê daneyên me yên ELISA û MALDI piştrast dikin, lê di heman demê de bi lêkolînên me yên berê yên li ser kombûna olîgosakarîdê re jî lihevhatî ne. Ji ber vê yekê, em bawer dikin ku rêbazên îmmunolojîk ên nûjen ên ku biyotînîlasyona olîgosakarîdan û ceribandina paşê ya ELISA bikar tînin ji bo tespîtkirina olîgosakarîdên serhildêr ên çareserker di nimûneyên biyolojîkî yên cûrbecûr de bes in.
Ji ber ku rêbazên ceribandina mAb-ê yên li ser bingeha ELISA-yê bi çend rêbazên cûda hatine pejirandin, me xwest ku potansiyela vê rêbaza nû ya hejmarî bêtir lêkolîn bikin. Du olîgosakarîdên bazirganî, olîgosakarîda ksîloheksakarîd (XHE) û 23-α-L-arabinofuranosîl-ksîlotrioz (A2XX), hatin kirîn û bi karanîna rêbazek nû ya mAb-ê ku glîkana dîwarê şaneyê hedef digire hatin ceribandin. Wêne 6 têkiliyek xêzik di navbera sînyala girêdana biyotînkirî û konsantrasyona logarîtmîk a konsantrasyona olîgosakarîd de nîşan dide, ku modelek adsorpsiyona Langmuir a gengaz pêşniyar dike. Di nav mAban de, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, û CCRC-M151 bi XHE re têkildar bûn, û CCRC-M108, CCRC-M109, û LM11 bi A2XX re li ser rêzek ji 1 nm heta 100 nano têkildar bûn. Ji ber hebûna sînorkirî ya antîkoran di dema ceribandinê de, ceribandinên sînorkirî bi her konsantrasyona olîgosakarîd hatin kirin. Divê li vir were zanîn ku hin antîkor bi heman olîgosakarîdê wekî substrat pir cûda bertek nîşan didin, dibe ku ji ber ku ew bi epîtopên hinekî cûda ve girêdidin û dikarin xwedî girêdanên pir cûda bin. Mekanîzma û bandorên naskirina rast a epîtopê dê pir tevlihevtir bin dema ku rêbaza mAb ya nû li ser nimûneyên rastîn were sepandin.
Du olîgosakarîdên bazirganî ji bo destnîşankirina rêjeya tespîtkirinê ya mAb-ên cihêreng ên ku armancê glîkan in hatin bikar anîn. Li vir, korelasyonên xêzikî bi rêjeya logarîtmîk a rêjeya olîgosakarîdê re qalibên adsorpsiyona Langmuir ji bo (A) XHE bi mAb û (B) A2XX bi mAb nîşan didin. Epîtopên têkildar avahiyên olîgosakarîdên bazirganî yên ku wekî substrat di ceribandinê de têne bikar anîn nîşan didin.
Bikaranîna antîkorên monoklonal ên armanckirî yên glîkan (analîza glîkokomîk an jî ceribandina mAb-ya li ser bingeha ELISA) amûrek bihêz e ji bo taybetmendiya kûr a piraniya glîkanên dîwarê şaneyê yên sereke ku biyomasa nebatan pêk tînin. Lêbelê, analîza glîkanê ya klasîk tenê glîkanên dîwarê şaneyê yên mezintir diyar dike, ji ber ku piraniya olîgosakarîdan li ser plakayên ELISA bi bandor nayên sabît kirin. Di vê lêkolînê de, genimê ku bi AFEX-ê pêş-dermankirî hatiye çandin bi enzîmatîk di rêjeyek bilind a hişk de hate hîdrolîz kirin. Analîza şekir ji bo destnîşankirina pêkhateya karbohîdratên dîwarê şaneyê yên serhildêr di hîdrolîzatê de hate bikar anîn. Lêbelê, analîza mAb-ê ya olîgosakarîdên piçûktir di hîdrolîzatan de kêm tê hesibandin, û amûrên din hewce ne ku bi bandor olîgosakarîdan li ser plakayên ELISA sabît bikin.
Em li vir rêbazeke nûjen û bibandor a bêmobîlîzasyona olîgosakarîdan ji bo ceribandina mAb radigihînin, bi hevberkirina bîotînîlasyona olîgosakarîdan û dûv re ceribandina ELISA li ser plakayên pêçayî yên NeutrAvidin™. Olîgosakarîdên biyotînîlkirî yên bêmobîlîzekirî ji bo antîkorê eleqeyek têr nîşan dan da ku tespîtkirina bilez û bibandor a olîgosakarîdên serhişk gengaz bike. Analîza pêkhateya van olîgosakarîdên serhişk li ser bingeha spektrometriya girseyî encamên vê nêzîkatiya nû ya ji bo îmmunoscreening piştrast kir. Bi vî rengî, ev lêkolîn nîşan didin ku têkeliya bîotînîlasyona olîgosakarîdan û ceribandina ELISA bi antîkorên monoklonal ên armanckirî yên glîkan dikare ji bo tespîtkirina girêdanên xaçerê di olîgosakarîdan de were bikar anîn û dikare bi berfirehî di lêkolînên din ên biyokîmyayî de were sepandin ku avahiya olîgosakarîdan diyar dikin.
Ev rêbaza profîlkirina glîkanê ya li ser bingeha biyotîn yekem rapor e ku dikare girêdanên karbohîdratên serhişk ên olîgosakarîdên çareserker di biyomasa nebatan de lêkolîn bike. Ev dibe alîkar ku meriv fêm bike çima hin beşên biyomasê di hilberîna biyosotemeniyê de ewqas serhişk in. Ev rêbaz valahiyek girîng di rêbazên analîza glîkomê de tijî dike û sepandina wê ji bo rêzek berfirehtir a substratan ji bilî olîgosakarîdên nebatan dirêj dike. Di pêşerojê de, dibe ku em robotîkê ji bo biyotînîlasyonê bikar bînin û rêbaza ku me pêşxistiye ji bo analîza rêjeya bilind a nimûneyan bi karanîna ELISA bikar bînin.
Qama ceh (CS) ku ji tovên hîbrîd ên Pioneer 33A14 hatiye çandin, di sala 2010an de ji Kramer Farms li Ray, Colorado hatiye berhevkirin. Bi destûra xwediyê erdê, ev biyomas dikare ji bo lêkolînê were bikar anîn. Nimûne di kîsikên zip-lock de, bi şilbûneke <%6, di germahiya odeyê de hatin hilanîn. Nimûne di kîsikên zip-lock de, bi şilbûneke <%6, di germahiya odeyê de hatin hilanîn. Comment Nimûne di kîsikên zîpkirî de, di germahiya odeyê de bi şilbûna ji %6 kêmtir, hişk û hişk hatin hilanîn.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Di pakêtê de ji bo têgihîştina temperaturê bi влажностью < 6%. Nimûne di nav kîsikên zîp de li germahiya odeyê û şilbûna < 6% têne hilanîn.Lêkolîn li gorî rêbernameyên herêmî û neteweyî bû. Analîza pêkhateyê bi karanîna protokola NREL hate kirin. Hat dîtin ku pêkhate ji %31.4 glukan, %18.7 ksîlan, %3.3 arabînan, %1.2 galaktan, %2.2 asetîl, %14.3 lîgnîn, %1.7 proteîn û %13.4 xîz pêk tê.
Cellic® CTec2 (138 mg proteîn/ml, lot VCNI 0001) tevlîheviyeke tevlihev a selulas, β-glukozîdaz û Cellic® HTec2 (157 mg proteîn/ml, lot VHN00001) ji Novozymes (Franklinton, NC, USA) ye. Multifect Pectinase® (72 mg proteîn/mL), tevlîheviyeke tevlihev a enzîmên hilweşîner ên pektînê, ji hêla DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) ve hatiye bexşandin. Têkeliya proteîna enzîmê bi texmînkirina naveroka proteînê (û derxistina beşdariya nîtrojena ne-proteîn) bi karanîna analîza nîtrojena Kjeldahl (rêbaza AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) hatiye destnîşankirin. Erdê Diatomaceous 545 ji EMD Millipore (Billerica, MA) hatiye kirîn. Karbona çalakkirî (DARCO, 100 mesh granul), Avicel (PH-101), ksîlana behîvê, û hemû kîmyewiyên din ji Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) hatin kirîn.
Pêş-dermankirina AFEX li GLBRC (Laboratoriya Lêkolînê ya Veguherîna Biyomasê, MSU, Lansing, MI, DYA) hate kirin. Pêş-dermankirin di 140°C de ji bo 15 hûrdeman hate kirin. Dema rûniştinê di rêjeya 1:1 amonyaka bêav û biyomasê de bi barkirina 60% (w/w) di reaktorek komirê ya pola zengarnegir de (Parr Instruments Company). 30 hûrdeman dom kir. Reaktor hat anîn 140°C û amonyak bi lez hate berdan, ku rê da biyomasê ku zû vegere germahiya odeyê. Pêkhateya stoverê ceh ê pêş-dermankirî yê AFEX (ACS) dişibiya ya stoverê ceh ê nehatî dermankirin (UT-CS).
ACSH ya madeyên hişk ên bilind 25% (w/w) (nêzîkî 8% barkirina dekstranê) wekî materyalek destpêkê ji bo hilberîna mezin a olîgosakarîdan hate amadekirin. Hîdrolîza enzîmatîk a ACS bi karanîna tevliheviyek enzîma bazirganî ya ku Cellic® Ctec2 10 mg proteîn/g glukan (di biyomasa pêş-dermankirî de), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteîn/g glukan, û Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) dihewîne, hate kirin. Hîdrolîza enzîmatîk di biyoreaktorek 5 lîtreyî de bi qebareya xebatê ya 3 lître, pH 4.8, 50°C û 250 rpm hate kirin. Piştî hîdrolîzê ji bo 96 demjimêran, hîdrolîzat bi santrifujkirinê di 6000 rpm de ji bo 30 hûrdeman û dûv re jî di 14000 rpm de ji bo 30 hûrdeman hate berhev kirin da ku madeyên hişk ên nehîdrolîzkirî werin rakirin. Dûre hîdrolîzat bi rêya qedehek fîlterê ya 0.22 mm ji bo parzûnkirina sterîl hat derbaskirin. Hîdrolîzata parzûnkirî di şûşeyên sterîl de di 4°C de hat hilanîn û dû re li ser karbonê hat parçekirin.
Analîza pêkhateya nimûneyên biyomasa li ser bingeha ekstraktê li gorî prosedurên analîza laboratîfê ya NREL: amadekirina nimûneyan ji bo analîza pêkhateyê (NREL/TP-510-42620) û destnîşankirina karbohîdratên avahîsazî û lîgnînê di biyomasê de (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analîza olîgosakarîdên herika hîdrolîzatê li ser pîvanek 2 ml bi karanîna rêbaza hîdrolîza asîdê ya li ser bingeha otoklav hate kirin. Nimûneya hîdrolîzatê bi 69.7 µl asîda sulfurîk a %72 di lûleyek çandiniyê ya bi qapaxa pêçayî ya 10 ml de tevlihev bikin û li ser maseyekê di 121°C de ji bo 1 demjimêran înkubasyon bikin, li ser qeşayê sar bikin û di şûşeyek kromatografiya şileya performansa bilind (HPLC) de parzûn bikin. Têkeliya olîgosakarîdan bi derxistina têkeliya monosakarîdan di nimûneya ne-hîdrolîzkirî de ji têkeliya tevahî ya şekir di nimûneya asîd-hîdrolîzkirî de hate destnîşankirin.
Têkeliyên glukoz, ksîloz û arabînozê di biyomasa asîd-hîdrolîzkirî de bi karanîna pergala Shimadzu HPLC-ê ya ku bi oto-nimûneyek, germkera stûnê, pompa îzokratîk, û detektora îndeksa refraksiyonê li ser stûnek Bio-Rad Aminex HPX-87H ve hatî sazkirin, hatin analîzkirin. Stûn di 50°C de hate parastin û bi 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 di nav avê de hate elutekirin.
Serpereşta hîdrolîzatê hate şilkirin û ji bo naveroka monomer û olîgosakarîdan hate analîzkirin. Şekirên monomerîk ên piştî hîdrolîza enzîmatîk hatine bidestxistin bi HPLC-ya ku bi stûnek Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P û stûnek parastina ax ve hatî sazkirin, hatin analîzkirin. Germahiya stûnê li 80°C hate parastin, av wekî qonaxa mobîl bi rêjeya herikîna 0.6 ml/min hate bikar anîn. Olîgosakarîd bi hîdrolîzê di asîda şilkirî de li 121°C li gorî rêbazên ku di refs. 41, 48, 49 de hatine vegotin, hatin destnîşankirin.
Analîza sakarîd li ser bermayiyên biyomasa xav, pêş-dermankirî ya AFEX û hemî ne-hîdrolîzkirî (tevî hilberîna ekstraktên dîwarê şaneyê yên rêzefîlm û ceribandina mAb-ya wan) bi karanîna prosedurên ku berê hatine vegotin 27, 43, 50, 51 hate kirin. Ji bo analîza glîkomê, bermayiyên materyalê dîwarê şaneya nebatan ên ku di alkolê de nayên çareserkirin ji bermayiyên biyomasê têne amadekirin û bi reagentên her ku diçe êrîşkartir ên wekî amonyûm oksalat (50 mM), sodyûm karbonat (50 mM û 0.5% w/v), CON. (1M û 4M, her du jî bi 1% w/v sodyûm borohîdrîd) û asîd klorît wekî ku berê hatiye vegotin 52,53, têne derxistina rêzefîlm. Dûv re ekstrakt li dijî panelek tevlihev a mAb50-an ku ber bi glîkana dîwarê şaneyê ve têne rêve kirin, ji ELISA re hatin derbas kirin, û reaksiyonên girêdana mAb wekî nexşeyek germê hatin pêşkêş kirin. mAb-ên ku glîkana dîwarê şaneya nebatan hedef digirin ji stokên laboratîfê (CCRC, JIM û rêzeya MAC) hatin kirîn.
Biyotînîlasyona yek-gavî ya olîgosakarîdan. Girêdana karbohîdratan bi bîotîn-LC-hîdrazîdê re bi karanîna prosedûra jêrîn hate kirin. Biyotîn-LC-hîdrazîd (4.6 mg/12 μmol) bi tevdan û germkirina tund li 65°C ji bo 1 deqîqeyê di dimetîl sulfoksîd (DMSO, 70 μl) de hate çareserkirin. Asîda asetîk a qeşasî (30 μl) hate zêdekirin û tevlihevî li ser sodyûm sîyanoborohîdrîd (6.4 mg/100 μmol) hate rijandin û piştî germkirina li 65°C ji bo nêzîkî 1 deqîqeyê bi tevahî hate çareserkirin. Dûv re, ji 5 heta 8 μl ji tevliheviya reaksiyonê li olîgosakarîda hişkkirî (1-100 nmol) hate zêdekirin da ku zêdehiyek molar a 10 qat an jî zêdetir a etîketê li ser dawiya kêmkirinê were bidestxistin. Reaksiyon di 65°C de ji bo 2 demjimêran hate kirin, piştî vê yekê nimûne tavilê hatin paqijkirin. Di ceribandinên nîşankirinê de bêyî kêmkirinê sodyûm sîyanoborohîdrîd nehat bikaranîn, û nimûne di 65°C de ji bo 2.5 saetan reaksiyon nîşan dan.
Pêçandin û şuştina nimûneyên olîgosakarîdên biyotînkirî bi ELISA. 25 μl nimûneyên biyotînkirî (100 μl ji her nimûneya konsantrekirî di 5 ml çareseriya tamponê ya 0.1 M Tris (TBS) de hatiye şilkirin) li her qulika plakaya bi avidîn pêçayî hatin zêdekirin. Qulikên kontrolê bi 50 μl biyotîn bi rêjeya 10 μg/ml di 0.1 M TBS de hatin pêçandin. Ava deîyonîzekirî wekî pêçek ji bo pîvandinên vala hat bikar anîn. Tablet 2 saetan di germahiya odeyê de di tariyê de hat înkubasyonkirin. Plakê 3 caran bi şîrê bê rûn ê %0.1 di 0.1 M TBS de bi karanîna bernameya hejmar 11 ji bo Grenier flat 3A bişon.
Zêdekirin û şuştina antîkorên seretayî. 40 µl antîkorê seretayî li her qulikê zêde bikin. Mîkroplateyê 1 saetê di germahiya odeyê de di tariyê de înkubasyonê bikin. Piştre plake 3 caran bi şîrê %0.1 di 0.1M TBS de bi karanîna bernameya şuştinê #11 ji bo Grenier Flat 3A hatin şuştin.
Antîkorê duyemîn lê zêde bike û bişo. 50 µl antîkorê duyemîn ê mişk/mişk (di nav şîrê %0.1 de di 0.1 M TBS de bi rêjeya 1:5000 hatiye şilkirin) li her qulikê zêde bike. Mîkroplatê 1 saetê di germahiya odeyê de di tariyê de înkubasyonê bike. Piştre mîkroplate 5 caran bi şîrê %0.1 di 0.1 M TBS de bi karanîna bernameya şuştina plakaya Grenier Flat 5A #12 hatin şuştin.
Zêdekirina substratê. 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) li substrata bingehîn zêde bikin (bi zêdekirina 2 dilopên tamponê, 3 dilopên TMB, 2 dilopên hîdrojen peroksîtê li 15 ml ava deîyonîzekirî). Substrata TMB amade bikin û berî karanînê bizivirînin). Mîkroplateyê 30 deqîqeyan di germahiya odeyê de înkubasyon bikin. Di tariyê de.
Gavê temam bike û tabletê bixwîne. 50 µl asîda sulfurîk a 1 N li her qulikê zêde bike û bi karanîna xwendevanek ELISA vegirtinê ji 450 heta 655 nm tomar bike.
Çareseriyên 1 mg/ml ji van analîtan di ava deyonîzekirî de amade bikin: arabînoz, ramnoz, fukoz, ksîloz, asîda galakturonik (GalA), asîda glukuronîk (GlcA), manoz, glukoz, galaktoz, laktoz, N-asetilmannosamîn (manNAc), N-asetilglukozamîn (glcNAc), N-asetilgalaktozamîn (galNAc), înozîtol (standarda navxweyî). Du standard bi zêdekirina çareseriyên şekir ên 1 mg/mL yên ku di Tabloya 1-ê de têne nîşandan hatin amadekirin. Nimûne têne cemidandin û li -80°C têne lîyofîlîzekirin heta ku hemî av were rakirin (bi gelemperî nêzîkî 12-18 demjimêran).
100–500 µg nimûneyê li lûleyên bi qapaxên pêçayî yên li ser hevsengiya analîtîk zêde bikin. Mîqdara lêzêdekirî tomar bikin. Çêtirîn e ku nimûne di rêjeyek diyarkirî ya çareserker de were helandin û wekî alîkotek şile li lûleyê were zêdekirin. Ji bo her lûleya nimûneyê 20 µl înozîtol 1 mg/ml wekî standardek navxweyî bikar bînin. Mîqdara standarda navxweyî ya ku li nimûneyê hatiye zêdekirin divê bi mîqdara standarda navxweyî ya ku li lûleya standard hatiye zêdekirin re wekhev be.
8 ml metanolê bêav têxin nav şûşeyek bi qapax. Piştre 4 ml çareseriya HCl ya metanolê ya 3 N, qapax bikin û bihejînin. Ev pêvajo avê bi kar nayne.
500 µl çareseriya metanolê ya HCl ya 1 M li nimûneyên olîgosakarîd û lûleyên TMS yên standard zêde bikin. Nimûne bi şev (168 demjimêr) di 80°C de di blokek termal de hatin înkubasyonkirin. Berhema metanolîzê bi karanîna manifoldek zuwakirinê di germahiya odeyê de zuwa bikin. 200 µl MeOH lê zêde bikin û dîsa zuwa bikin. Ev pêvajo du caran tê dubarekirin. 200 µl metanol, 100 µl pîrîdîn û 100 µl anhîdrîda asetîk li nimûneyê zêde bikin û baş tevlihev bikin. Nimûne di germahiya odeyê de 30 deqîqeyan hatin înkubasyonkirin û zuwa kirin. 200 µl metanol lê zêde bikin û dîsa zuwa bikin.
200 µl Tri-Sil lê zêde bikin û lûleyê bi qapaxê 20 deqîqeyan germ bikin. 80°C, paşê heta germahiya odeyê sar bikin. Ji bo zuwakirina nimûneyê heta bi qasî 50 µl, manifoldeke zuwakirinê bikar bînin. Girîng e ku were zanîn ku me nehişt ku nimûne bi tevahî zuwa bibin.
2 ml heksan lê zêde bikin û bi vortexkirinê baş tevlihev bikin. Serê pîpetên Pasteur (5-8 mm) bi perçeyek ji hirîya cam tijî bikin bi danîna hirîya cam li ser pîpetek bi qûtra 5-3/4 înç. Nimûne di 3000 g de ji bo 2 deqeyan hatin santrifujkirin. Her bermayiyên neçareserbar dihelin. Nimûneyê heta 100-150 µl hişk bikin. Qebareyek bi qasî 1 μl di germahiya destpêkê ya 80 °C û demek destpêkê ya 2.0 deqeyan de hate derzîkirin nav GC-MS (Tabloya 2).