Spas ji bo serdana Nature.com.Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgirîya CSS-ê sînordar e.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Di vê navberê de, ji bo misogerkirina piştgirîya domdar, em ê malperê bê şêwaz û JavaScript pêşkêş bikin.
Rêbazên nû yên immunolojîk û spektrometrî yên girseyî ji bo analîza tevlihev a oligosakarîdên domdar ên di stûyê ceh de ku bi AFEX-ê ve hatî derman kirin.Biomasa lignocellulosic alternatîfek domdar e ji bo sotemeniyên fosîlî û bi berfirehî ji bo pêşxistina biyoteknolojiyên ji bo hilberîna hilberên wekî xwarin, xwarin, sotemenî û kîmyewî tê bikar anîn.Mifteya van teknolojiyên pêşveçûna pêvajoyên lêçûn-hevrikî ye ji bo veguhertina karbohîdartên tevlihev ên ku di dîwarên hucreya nebatê de hene li şekirên hêsan ên wekî glukoz, xylose û arabinose.Ji ber ku biomasa lignocellulosic pir serhişk e, divê ew bi dermankirinên termokîmyawî (mînak, jêbirina fîbera ammonyakê (AFEX), asîdên hûrkirî (DA), şilavên îyonî (IL)) û dermankirinên biyolojîkî (mînak, hîdrolîza enzîmatîk û fermentasyona mîkrobial) bi hev re were kirin da ku hilbera xwestinê were bidestxistin..Lêbelê, dema ku di pêvajoya hîdrolîzê de enzîmên fungî yên bazirganî têne bikar anîn, tenê 75-85% ji şekirên çareserkirî yên ku têne çêkirin monosakarîd in, û 15-25% yên mayî jî oligosakarîdên bêçare û bêserûber in, ku her gav ji mîkroorganîzmeyan re peyda nabin.Berê, me oligosakarîdên serhişk ên çareserker bi serfirazî veqetandin û paqij kirin ku bi karanîna hevberdana veqetandina erda karbon û diatomê û kromatografiya dûrxistina mezinbûnê, û her weha taybetmendiyên wan ên astengkirina enzîmê jî lêkolîn kirin.Me dît ku oligosakarîdên ku dereceya bilind a polîmerîzasyonê (DP) veguheztinên asîda uronîk a methylated dihewîne, ji oligosakarîdên DP yên nizm û bêalî re dijwartir e ku meriv bi tevlihevên enzîmê yên bazirganî re were xebitandin.Li vir em karanîna gelek awayên pêvek rapor dikin, di nav de profîla glycan bi karanîna antîpotên monoklonal (mAbs) yên taybetî yên glycansên biomasa nebatê ji bo karakterîzekirina girêdanên glycan ên di dîwarên hucreya nebatê û hîdrolîzên enzîmatîk de, îyonîzasyona desorbasyona lazerê ya bi alîkariya matrixê, spektrometriya girseyî ya dema-firînê..MALDI-TOF-MS) lûtkeyên tespîtkirinê yên struktur-agahdar ên ku ji hêla spektroskopiyê ve piştî hilweşîna duyemîn a îyonên neyînî, kromatografiya gazê û spektrometriya girseyî (GC-MS) hatine wergirtin bikar tîne da ku girêdanên oligosaccharide bi û bê derivatîzasyon diyar bike.Ji ber mezinahiya piçûk a oligosaccharides (DP 4-20), karanîna van molekulan ji bo girêdana mAb û taybetmendiyê dijwar e.Ji bo ku em vê pirsgirêkê derbas bikin, me rêbazek nû ya bêmobilîzasyona oligosaccharîdê ya li ser bingeha biotinê bicîh kir ku bi serfirazî piraniya oligosakarîdên kêm-çareser ên DP-yê li ser rûyê mîkroplateyê bi serketî nîşan da, ku dûv re di pergalek mAb-ê ya bilind de ji bo analîzkirina lîgakirinê ya taybetî hate bikar anîn.Ev rêbaza nû dê di pêşerojê de pêşkeftina pêşkeftinên pêşkeftî yên asta glycome ya ku dikare were bikar anîn ji bo veqetandin û taybetmendiya oligosaccharîdên ku di biyomarkeran de hene ji bo mebestên tespîtkirinê hêsan bike.
Biomasa lîgnocellulosic, ku ji materyalên çandinî, daristanî, giya û daristanî pêk tê, ji bo hilberîna hilberên biyo-bingeh, di nav wan de xwarin, xwarin, sotemenî û pêşgirên kîmyewî ji bo hilberandina hilberên bi nirxek bilindtir, xwarinek potansiyel e.Karbohîdratên (wek seluloz û hemîcelluloz) ku di dîwarên şaneya nebatê de hene, bi pêvajoya kîmyewî û biyotransformasyonê (wekî hîdrolîza enzîmatîk û fermentasyona mîkrobial) di monosakarîdan de têne depolîmerîzekirin.Pêş-dermankirinên hevpar berfirehkirina fîbera ammonia (AFEX), asîda dilteng (DA), şilava îyonî (IL), û teqîna hilmê (SE) ye, ku bi vekirina dîwarên hucreya nebatê ve berhevokek kîmyewî û germê bikar tînin da ku hilberîna lignocellulose kêm bikin3,4.serhişkiya maddeyê, 5. Hîdrolîza enzîmatîk bi bargiraniya zexm a bilind bi karanîna enzîmên bazirganî yên karbohîdratên çalak (CAZymes) û fermentasyona mîkrobial bi karanîna hevîrtirşkên transjenîk an bakteriyan ji bo hilberîna sotemenî û kîmyewî yên biyo-bingeh pêk tê 6 .
CAZymên di enzîmên bazirganî de ji tevliheviyek tevlihev a enzîman pêk tê ku bi hevrêzî girêdanên tevlihev ên karbohîdrat-şekir diqetînin û monosakarîdan çêdikin2,7.Wekî ku me berê jî ragihand, tora tevlihev a polîmerên bîhnxweş ên lînînê yên bi karbohîdartan re wan pir bêserûber dike, ku dibe sedema veguheztina şekirê netemam, berhevkirina 15-25% ji oligosakarîdên zayendî yên ku di dema hîdrolîza enzîmatîk a biomasa pêşdibistanê de nayên hilberandin.Ev pirsgirêkek hevpar e ku bi rêbazên cuda yên pêşîlêgirtina biomassê re ye.Hin sedemên vê tengahiyê astengkirina enzîmê di dema hîdrolîzê de, an nebûn an kêmbûna enzîmên bingehîn ên bingehîn ên ku ji bo şikandina bendên şekirê di biomasa nebatê de hewce ne.Fêmkirina pêkhate û taybetmendiyên avahîsaziya şekiran, mîna girêdanên şekir ên di oligosakarîdan de, dê ji me re bibe alîkar ku di dema hîdrolîzê de veguheztina şekir baştir bikin, û pêvajoyên biyoteknolojîkî bi hilberên ku ji neftê hatine wergirtin re hevrikî bikin.
Tesbîtkirina strukturên karbohîdartan dijwar e û pêdivî bi berhevokek rêbazên wekî kromatografiya şil (LC) 11,12, spektroskopiya rezonansa magnetîkî ya nukleerî (NMR) 13, elektroforeziya kapîlar (CE) 14,15,16 û spektrometriya girseyî (MS)17 heye.,hejdeh.Rêbazên MS-ê yên wekî spektrometriya girseyî ya dema-firînê bi desorbkirina lazer û îyonîzasyonê bi karanîna matrixê (MALDI-TOF-MS) ji bo naskirina strukturên karbohîdartan rêbazek pirreng e.Di van demên dawîn de, MS-ya zêdekirina îyonên sodyûmê tandema Veqetandina Bi Pevçûn (CID) bi gelemperî ji bo naskirina şopên tiliyên ku bi pozîsyonên girêdana oligosaccharide, vesazkirinên anomerîk, rêzik, û pozîsyonên şaxkirinê re têkildar in têne bikar anîn 20, 21.
Analîzkirina Glycan amûrek hêja ye ji bo tespîtkirina kûr a girêdanên karbohîdartan22.Ev rêbaz antîbodên monoklonal (mAbs) bikar tîne ku ji bo glycan dîwarê hucreyê nebatî wekî lêpirsînan bikar tîne da ku têkiliyên karbohîdartên tevlihev fam bike.Zêdetirî 250 mAb li çaraliyê cîhanê peyda dibin, ku li dijî cûrbecûr oligosakarîdên xêz û şax bi karanîna sakkarîdên cihêreng hatine sêwirandin24.Gelek mAb bi berfirehî hatine bikar anîn da ku avahî, pêkhatin û guheztinên dîwarê şaneya nebatê diyar bikin, ji ber ku li gorî celebê şaneya nebatê, organ, temen, qonaxa pêşkeftinê û hawîrdora mezinbûnê cûdahiyên girîng hene25,26.Di van demên dawî de, ev rêbaz ji bo têgihîştina nifûsa vezîkulê di pergalên nebat û heywanan de û rola wan a têkildar di veguheztina glycan de wekî ku ji hêla nîşangirên subcellular, qonaxên pêşkeftinê, an teşwîqên hawîrdorê ve têne destnîşankirin, û ji bo destnîşankirina çalakiya enzîmatîk tê bikar anîn.Hin strukturên cihêreng ên glycans û xylans ên ku hatine nas kirin ev in pektîn (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glukanên pêwendiya tevlihev (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glukuronîk asîda-arabinoxylan (GArb-Xgala) aGA rb-galactan (GArb-galactylan)9.
Lêbelê, tevî van hemî hewildanên lêkolînê, tenê çend lêkolîn li ser cewherê berhevkirina oligosaccharide di dema hîdrolîza barkêşiya zirav (HSL) de, tevî berdana oligosaccharide, guheztina dirêjahiya zincîra oligomerîk di dema hîdrolîzê de, cûrbecûr polîmerên nizm ên DP, û kelûpelên wan sekinîne.belavkirin 30,31,32.Di vê navberê de, her çend analîza glycan îsbat kiriye ku ji bo analîzek berfireh a avahiya glycan amûrek bikêr e, lê dijwar e ku meriv oligosakarîdên kêm DP yên ku di avê de çareser dibin bi karanîna rêbazên antîpodê binirxînin.Olîgosakarîdên DP yên piçûk ên bi giraniya molekularî ya kêmtir ji 5-10 kDa bi lewheyên ELISA 33, 34 ve girê nadin û berî lê zêdekirina antîbody têne şûştin.
Li vir, ji bo cara yekem, em ceribandinek ELISA-yê li ser lewheyên pêçandî yên avîdîn bi karanîna antîpên monoklonal nîşan didin, ku pêvajoyek biotinîlasyonê ya yek-gavekî ji bo oligosakarîdên rezîl ên çareserker bi analîza glycome re berhev dikin.Nêzîkatiya me ya ji analîza glycome re ji hêla analîza MALDI-TOF-MS û GC-MS ve ya girêdayî girêdanên oligosaccharide yên temamker ve bi karanîna derivatîzasyona trimethylsilyl (TMS) ya pêkhateyên şekirê hîdrolîzkirî ve hate pejirandin.Ev nêzîkatiya nûjen dikare di pêşerojê de wekî rêbazek berbelavtir were pêşve xistin û di lêkolîna biyolojîkî de serîlêdana berfirehtir bibîne35.
Guhertinên piştî wergerandinê yên enzîm û antîkoran, wek glycosylation,36 bandorê li çalakiya wan a biyolojîk dike.Mînakî, guhertinên di glycosylation proteînên serumê de rolek girîng di gewrîta înflamatuar de dilîze, û guhertinên di glycosylation de wekî nîşankerên tespîtkirinê têne bikar anîn37.Di wêjeyê de glycansên cihêreng hatine ragihandin ku bi hêsanî di cûrbecûr nexweşiyan de têne xuyang kirin, di nav de nexweşiyên înflamatuar ên kronîk ên rîya gastrointestinal û kezebê, enfeksiyonên vîrus, kansera hêkdankê, pêsîrê, û prostatê38,39,40.Fêmkirina strukturên glycans bi karanîna rêbazên glycan-based antîpodî ELISA dê di teşhîsa nexweşiyê de bêyî karanîna awayên tevlihev ên MS-ê pêbaweriyek zêde peyda bike.
Lêkolîna meya berê destnîşan kir ku oligosakarîdên serhişk piştî dermankirin û hîdrolîza enzîmatîk bêhîdrolîz mane (Wêne 1).Di xebata meya ku berê hatî weşandin de, me rêbazek derxistina qonaxa zexm ya komirê ya çalakkirî pêşxist da ku oligosaccharîdên ji hîdrolîzate stûyê kevçîyê (ACSH)8-ê ku ji AFEX-ê ve hatî derman kirin veqetînin.Piştî derxistin û veqetandina destpêkê, oligosakarîd ji hêla kromatografiya dûrxistina mezinbûnê (SEC) ve bêtir hatin perçe kirin û li gorî giraniya molekulî hatin berhev kirin.Monomerên şekir û oligomerên ku ji pêşdibistanên cihêreng hatine berdan bi analîza pêkhateya şekir ve hatine analîz kirin.Dema ku naveroka oligomerên şekirê ku bi awayên cûrbecûr dermankirinê têne wergirtin berhev dikin, hebûna oligosakarîdên serhişk di veguheztina biomasê bo monosakarîd de pirsgirêkek hevpar e û dikare bibe sedema kêmbûna hilberîna şekir bi kêmî ve 10-15% û hetta 18%.ME.Ev rêbaz ji bo hilberîna mezin a fraksiyonên oligosaccharide tê bikar anîn.Di vê xebatê de ACH-ya encam û perçeyên wê yên paşîn ên bi giraniya molekularî ya cihêreng wekî materyalek ceribandinê ji bo karakterîzekirina oligosaccharides têne bikar anîn.
Piştî dermankirinê û hîdrolîza enzîmatîk, oligosakarîdên domdar bêhîdrolîz man.Li vir (A) rêbazek veqetandina oligosaccharîdê ye ku tê de oligosakarîd ji hîdrolîzata stover a ceyranê (ACSH)-ya AFEX-pêşvekirî hatî veqetandin, bi karanîna nivînek pakkirî ya karbona aktîfkirî û axa diatomê tê veqetandin;(B) Rêbaza veqetandina oligosaccharides.Olîgosakkarîd ji hêla kromatografiya dûrxistina mezinbûnê (SEC) ve bêtir ji hev hatin veqetandin;(C) Monomerên sakarîd û oligomerên ku ji pêşdibistanên cihêreng têne berdan (asîda rijandin: DA, şilava îyonîk: IL û AFEX).Şert û mercên hîdrolîza enzîmayê: barkirina madeyên hişk ên 25% (w/w) (nêzîkî 8% barkirina glukanê), hîdrolîz 96 saetan, barkirina enzîmê ya bazirganî 20 mg/g (rêjeya Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) û (D) monomerên şekir û glucoaranyl xixên prensîb ên şekir û glucoaranyl-xortox, glucoaranyl. ser (ACS).
Analîzkirina glycan îsbat kiriye ku ji bo analîzek avahîsaziyek berfireh a glycansên di ekstraktên ku ji bermahiyên biomasa hişk têne veqetandin de amûrek bikêr e.Lêbelê, sakkarîdên ku di avê de têne çareser kirin bi karanîna vê rêbaza kevneşopî kêm têne temsîl kirin41 ji ber ku oligosakarîdên bi giraniya molekularî ya kêm li ser lewheyên ELISA-yê neguhêzbar zehmet e û berî lê zêdekirina antîpodê têne şûştin.Ji ber vê yekê, ji bo girêdana antîpodê û taybetmendîkirinê, rêbazek biotinîlasyonê ya yek-gavekî hate bikar anîn da ku oligosaccharîdên çareserker, ne lihevhatî li ser lewheyên ELISA-yên pêçandî yên avidîn werin pêçan.Ev rêbaz bi karanîna ACSH-ya meya berê hatî hilberandin û perçeyek li ser bingeha giraniya molekularî (an asta polîmerîzasyonê, DP) hate ceribandin.Biotinîlasyona yek-gavekî hate bikar anîn da ku pêwendiya girêdana oligosaccharîdê zêde bike bi zêdekirina biotin-LC-hîdrazîdê li dawiya kêmkirina karbohîdratê (Hêl. 2).Di çareseriyê de, koma hemiacetal li dawiya kêmker bi koma hîdrazîdê ya biotin-LC-hîdrazîdê re reaksiyonê dike ku girêdanek hîdrazonê çêbike.Di hebûna kargêrê kêmker NaCNBH3 de, girêdana hîdrazonê berbi hilberek dawîn a biotinylated domdar tê kêm kirin.Bi guheztina dawiya kêmkirina şekirê, girêdana oligosakarîdên nizm DP bi lewheyên ELISA re mimkun bû, û di lêkolîna me de ev li ser lewheyên pêçandî yên avîdîn bi karanîna mAbên glycan-armanc hate kirin.
Ji bo oligosaccharîdên biotinylated vedîtina antîkorên monoklonal ên li ser bingeha ELISA.Li vir (A) biotînîlasyona hevgirtî ya oligosaccharides û paşerojê vekolîna ELISA bi mAb-armancên glycan ên li ser lewheyên pêçandî yên NeutrAvidin û (B) ji bo biotinîlasyona hilberên reaksiyonê pêvajoyek yek-gavekî nîşan dide.
Dûv re lewheyên pêçandî yên avîdîn ên bi antîkorên oligosaccharide-conjugated li antîbodên seretayî û duyemîn hatin zêdekirin û di navgînek hesas a ronahiyê û demê de hatin şûştin.Piştî ku girêdana antîpodê qediya, substratê TMB lê zêde bikin da ku plakaya inkub bikin.Di dawiyê de reaksiyonê bi asîda sulfurîk hate rawestandin.Plateyên inkubatkirî bi karanîna xwendevanek ELISA ve hatin analîz kirin da ku hêza girêdana her antîpodê diyar bike da ku girêdana xaçerê ya antî-taybet tespît bike.Ji bo hûrgulî û pîvanên ceribandinê, li beşa têkildar "Materyal û Rêbaz" binêre.
Em karanîna vê rêbaza nû ya pêşkeftî ji bo serîlêdanên taybetî bi karakterîzekirina oligosakarîdên çareserker ên ku di ACSH de û her weha di fraksîyonên oligosakarîdên xav û paqijkirî yên ji hîdrolîzên lîgnocellulosic veqetandî de destnîşan dikin.Wekî ku di Figure 3 de tê xuyang kirin, xylansên herî gelemperî yên ku epîtop-cîgirkirî di ACSH-ê de bi karanîna rêbazên ceribandina glycomeya bioasîlated têne nas kirin bi gelemperî uronic (U) an methyluronic (MeU) û arabinogalactans pectic in.Piraniya wan jî di lêkolîna meya berê de li ser analîzkirina glycansên hişk ên ne-hîdrolîzkirî (UHS)43 hatin dîtin.
Tespîtkirina epîtopên oligosaccharîdê yên nerazî bi karanîna antîpotek monoklonal a ku berbi glycana dîwarê hucreyê ve tê rêve kirin.Parçeya "bêalî" perçeya ACN ye û beşa "asîdî" perçeya FA ye.Sorên geştir li ser nexşeya germahiyê naveroka epîtopê ya bilindtir destnîşan dikin, û şînên geş paşpirtikek vala nîşan dide.Nirxên rengîn ên li ser pîvanê ji bo formulasyonên N=2 li gorî nirxên OD-ya xav in.Epîtopên sereke yên ku ji hêla antîbodîyan ve têne nas kirin li rastê têne xuyang kirin.
Van strukturên ne-selulozî nekarîn ji hêla cellulases û hemîcellulazên herî gelemperî ve di tevliheviya enzîma bazirganî ya ceribandinê de, ku enzîmên bazirganî yên herî gelemperî têne bikar anîn, werin veqetandin.Ji ber vê yekê, ji bo hîdrolîza wan enzîmên alîkar ên nû hewce ne.Bêyî enzîmên pêveber ên ne-selulozî, van girêdanên ne-seluloz pêşî li veguheztina tam a monosakarîdê digirin, hetta ku polîmerên şekirê yên dêûbav bi berfirehî li perçeyên kurttir têne hîdrolîz kirin û bi karanîna tevliheviyên enzîmê yên bazirganî têne hilweşandin.
Zêdetir lêkolîna belavkirina sînyalê û hêza wê ya girêdanê nîşan da ku epîtopên girêdanê di fraksîyonên şekirê DP yên bilind (A, B, C, DP heya 20+) de ji fraksîyonên DP yên nizm (D, E, F, DP) di dimeran de kêmtir bûn) (Hêl. 1).Parçeyên asîdê di epîtopên ne-seluloz de ji perçeyên bêalî zêdetir in.Van diyardeyan bi şêwaza ku di lêkolîna meya berê de hatî dîtin re hevaheng in, ku li wir beşên bilind ên DP û asîd li hember hîdrolîza enzîmatîk bêtir berxwedêr bûn.Ji ber vê yekê, hebûna epîtopên glycan ên ne-seluloz û veguheztinên U û MeU dikare pir beşdarî aramiya oligosaccharides bike.Pêdivî ye ku were zanîn ku karbidestiya girêdan û tespîtkirinê ji bo oligosakarîdên kêm DP dikare pirsgirêk be, nemaze heke epîtop oligosakarîdek dimerîk an trimerîk be.Ev dikare bi karanîna oligosakarîdên bazirganî yên bi dirêjahiya cûda were ceribandin, ku her yek tenê yek epîtopek heye ku bi mAbek taybetî ve girêdide.
Ji ber vê yekê, karanîna antîbodên struktur-taybetî hin cûreyên girêdanên nerazî eşkere kirin.Li gorî celebê antîpodê ku tê bikar anîn, şêwaza girêdana guncan, û hêza sînyala ku ew hildiberîne (herî û hindiktirîn zêde), enzîmên nû dikarin bêne nas kirin û ji bo glîkoveguheztinek bêkêmasî bi nîv-hejmarî li tevliheviya enzîmê werin zêdekirin.Analîzkirina ACSH oligosaccharides wekî nimûne, em dikarin ji bo her materyalek biomassê databasek girêdanên glycan biafirînin.Li vir divê were zanîn ku pêdivî ye ku têkilbûna cihêreng a antîkoran li ber çavan were girtin, û heke hevalbendiya wan ne diyar be, ev ê di berhevdana nîşaneyên antîpotên cûda de hin dijwariyan çêbike.Wekî din, berhevdana girêdanên glycan dibe ku di navbera nimûneyan de ji bo heman antibody çêtirîn bixebite.Dûv re ev girêdanên serhişk dikarin bi databasa CAZyme-yê ve werin girêdan, ku em dikarin enzîman jê re nas bikin, enzîmên berendam hilbijêrin û enzîmên şikandina girêdanê biceribînin, an pergalên mîkrobial pêşve bibin da ku van enzîman ji bo karanîna di biorefîneriyan de diyar bikin44.
Ji bo ku em binirxînin ka rêbazên immunolojîk çawa rêbazên alternatîf ji bo karakterîzekirina oligosakarîdên bi giraniya molekulî ya kêm ku di hîdrolîzên lîgnocellulosic de hene temam dikin, me MALDI (Hêjî. 4, S1-S8) û analîza sakarîdên ji TMS-ê yên ku li ser bingeha GC-MS-ê li ser heman panelê (Wêne. 5) oligosaccharide pêk anîn.MALDI tê bikar anîn da ku berhev bikin ka belavkirina girseyî ya molekulên oligosaccharide bi strukturên armanckirî re têkildar e.Li ser hêjîrê.4 MC-ya hêmanên bêalî ACN-A û ACN-B nîşan dide.Analîza ACN-A rêzek şekirên pentozê yên ku ji DP 4-8 (Hêjî. 4) heya DP 22 (Hêjî. S1) pêk tê piştrast kir, ku giraniya wan bi oligosakarîdên MeU-xylan re têkildar e.Analîza ACN-B rêzikên pentose û glucoxylan bi DP 8-15 piştrast kir.Di materyalên pêvek ên wekî Figure S3 de, nexşeyên belavkirina girseyê ya beşa asîdî ya FA-C rêzek şekirên pentozê yên cîgir (Me)U bi DP-ya 8-15 nîşan dide ku bi xylansên cîgir ên ku di vekolandina mAb-a-based ELISA de têne peyda kirin re hevaheng in.Epîtopên hevgirtî ne.
Spectruma MALDI-MS ya oligosakarîdên ne-lihevhatî yên çareserkirî yên di ACS de hene.Li vir, (A) ACN-A fraksiyonên rêza giraniya nizm a ku di nav wan de asîda uronîk a methylated (DP 4-8) oligosaccharides glucuroxylan û (B) ACN-B xylan û oligosakarîdên asîda uronîk a methylated ku bi glukuroxylan (DP 8-15) veguhezîne cîh digirin.
Analîza pêkhatina bermayiya glycan a oligosakarîdên rezîl.Li vir (A) pêkhateya sakarîdê TMS-ê ya perçeyên cihêreng ên oligosaccharide ku bi karanîna analîza GC-MS ve hatî wergirtin.(B) Strukturên cûrbecûr şekirên ku ji TMS-ê têne derxistin di oligosaccharides de hene.ACN - beşa acetonitrile ya ku oligosakarîdên bêalî vedihewîne û FA - beşa asîda ferulic ku oligosakarîdên asîdê vedihewîne.
Encamek din a balkêş ji analîza LC-MS ya beşa oligosaccharide hate derxistin, wekî ku di Figure S9 de tê xuyang kirin (rêbaz dikarin di materyalê pêvek elektronîkî de werin dîtin).Parçeyên komên hexose û -OAc di dema girêdana beşa ACN-B de gelek caran hatin dîtin.Ev vedîtin ne tenê perçebûna ku di analîza glycome û MALDI-TOF de tê dîtin piştrast dike, lê di heman demê de agahdariya nû di derheqê derûvên karbohîdartan ên potansiyel ên di biomasa lîgnocellulosîk de ya pêşîn de jî peyda dike.
Me di heman demê de pêkhateya şekirê ya beşa oligosaccharide bi karanîna derivatkirina şekirê TMS analîz kir.Bi karanîna GC-MS, me pêkhateya şekirên neuralî (ne-derîvative) û asîdî (GluA û GalA) di beşa oligosaccharide de diyar kir (Hêjî. 5).Glucuronic acid di hêmanên asîd C û D de, dema ku galakturonîk di pêkhateyên asîdî A û B de tê dîtin, ku her du jî pêkhateyên DP yên şekirên asîdî ne.Van encam ne tenê daneyên me yên ELISA û MALDI piştrast dikin, lê di heman demê de bi lêkolînên me yên berê yên berhevkirina oligosaccharide re jî hevaheng in.Ji ber vê yekê, em bawer dikin ku rêbazên immunolojîk ên nûjen ên ku bi biotinîlasyona oligosaccharides û paşerojê vekolîna ELISA-yê bikar tînin ji bo tespîtkirina oligosaccharides recalcitrant di cûrbecûr nimûneyên biyolojîkî de bes in.
Ji ber ku rêbazên pîvazkirina mAb-a-based ELISA bi gelek awayên cihêreng hatine pejirandin, me xwest ku em potansiyela vê rêbaza nû ya hêjmarî bêtir vekolin.Du oligosaccharîdên bazirganî, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) û 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), hatin kirîn û ceribandin bi karanîna nêzîkatiyek nû ya mAb ku glycan dîwarê hucreyê dike armanc.Wêneyê 6 têkiliyek xêzikî di navbera nîşana girêdana biotinylated û berhevoka têketinê ya oligosaccharide de nîşan dide, ku modelek adsorpsiyonê ya Langmuir ya gengaz pêşniyar dike.Di nav mAbs de, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, û CCRC-M151 bi XHE re têkildar in, û CCRC-M108, CCRC-M109, û LM11 bi A2XX nm di navberek na11 de têkildar in.Ji ber hebûna tixûbdar a antîbodîyan di dema ceribandinê de, ceribandinên sînorkirî bi her konsantreya oligosaccharide re hatin kirin.Li vir pêdivî ye ku were zanîn ku hin antîpod bi heman oligosaccharide wekî substrat re pir cûda reaksiyon dikin, dibe ku ji ber ku ew bi epîtopên piçekî cûda ve girêdidin û dikarin xwedan girêdanên girêdanê yên pir cûda bin.Dema ku nêzîkatiya mAb-a nû li ser nimûneyên rastîn were sepandin, mekanîzma û encamên nasîna epîtopê ya rast dê pir tevlihevtir be.
Du oligosaccharîdên bazirganî ji bo destnîşankirina rêza tespîtkirina mAbên cihêreng ên glycan-armanc hatine bikar anîn.Li vir, têkiliyên xêzikî bi berhevoka têketinê ya giraniya oligosaccharide re qalibên adsorbasyona Langmuir ji bo (A) XHE bi mAb û (B) A2XX bi mAb re destnîşan dikin.Epîtopên têkildar strukturên oligosakarîdên bazirganî yên ku di ceribandinê de wekî substrat têne bikar anîn destnîşan dikin.
Bikaranîna antîbodên monoklonal ên armanckirî yên glycan (analîzkirina glycocomic an venêrana mAb-a-based ELISA) amûrek hêzdar e ji bo taybetmendiya kûr a piraniya glycansên dîwarê hucreya sereke yên ku biomasa nebatê pêk tînin.Lêbelê, analîza glycan a klasîk tenê glycansên dîwarê hucreyê yên mezin diyar dike, ji ber ku piraniya oligosaccharîdên bi bandor li ser lewheyên ELISA-yê nayên bêbandor kirin.Di vê lêkolînê de, stûyê goştê ku bi AFEX-ê ve hatî derman kirin bi naverokek hişk a bilind bi enzîmatîkî hate hîdrolîz kirin.Ji bo destnîşankirina pêkhatina karbohîdartên dîwarê hucreyê yên nerazî yên di hîdrolîzetê de analîza şekir hate bikar anîn.Lêbelê, analîza mAb ya oligosakarîdên piçûktir ên di hîdrolîzatan de kêm tê texmîn kirin, û amûrên din jî hewce ne ku bi bandorkerî oligosakarîdên li ser lewheyên ELISA-yê bêbandor bikin.
Em li vir rêgezek bêhêzkirina oligosaccharîdê ya nû û bikêr ji bo vekolîna mAb bi berhevkirina biotinîlasyona oligosaccharide û dûv re li dû pîvazkirina ELISA li ser lewheyên pêçandî NeutrAvidin™ radigihînin.Olîgosakarîdên biotinylated ên bêbandor têra xwe têra xwe ji antîpotê re nîşan dan da ku tespîtkirina bilez û bikêrhatî ya oligosakarîdên nerazî bike.Analîza pêkhatina van oligosakarîdên serhişk ên li ser bingeha spektrometrîya girseyî encamên vê nêzîkatiya nû ya immunoscreening piştrast kir.Ji ber vê yekê, van lêkolînan destnîşan dikin ku berhevoka biotinîlasyona oligosaccharide û vekolîna ELISA bi antîpên monoklonal ên armanckirî yên glycan re dikare were bikar anîn da ku di oligosaccharides de girêdanên xaçê were tespît kirin û dikare bi berfirehî di lêkolînên biyokîmyayî yên din ên ku avahiya oligosaccharides diyar dikin de were sepandin.
Ev rêbaza profîlkirina glycan-a-based biotin yekem raport e ku karibe li ser girêdanên karbohîdratên nerazî yên oligosakarîdên çareserker ên di biomasa nebatê de lêkolîn bike.Ev dibe alîkar ku meriv fêm bike ka çima hin beşên biomasê ew qas serhişk in dema ku ew tê ser hilberîna biyofuelê.Ev rêbaz di metodên analîzkirina glycome de valahiyek girîng tije dike û sepana xwe ji olîgosakarîdên nebatî wêdetir li cûrbecûr substratan dirêj dike.Di pêşerojê de, dibe ku em robotîk ji bo biotinîlasyonê bikar bînin û rêbaza ku me ji bo analîzkirina asta bilind a nimûneyên ku bi karanîna ELISA ve hatî pêşve xistin bikar bînin.
Kevirê ceh (CS) ku ji tovên hîbrîd ên Pioneer 33A14 hatî mezin kirin di sala 2010-an de ji Farms Kramer li Ray, Colorado hate berhev kirin.Bi destûra xwediyê zeviyê, ev biomass dikare ji bo lêkolînê were bikar anîn. Nimûne zuwa < 6% şilbûn di çenteyên zip-lock de di germahiya odeyê de hatin hilanîn. Nimûne zuwa < 6% şilbûn di çenteyên zip-lock de di germahiya odeyê de hatin hilanîn. Comment Nimûne di germahiya odeyê de di bin germahiya %6-ê de hişk hatin hilanîn.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Di pakêtê de ji bo têgihîştina temperaturê bi влажностью < 6%. Nimûne di tûrikên zipperê de li germahiya odeyê bi nemiya <6% têne hilanîn.Lêkolîn li gorî rêgezên herêmî û neteweyî pêk hat.Analîza pêkhatî bi karanîna protokola NREL hate kirin.Di berhevokê de 31,4% glukan, 18,7% xylan, 3,3% arabinan, 1,2% galactan, 2,2% acetyl, 14,3% lignin, 1,7% proteîn û 13,4% ash hat dîtin.
Cellic® CTec2 (138 mg proteîn / ml, pir VCNI 0001) tevliheviyek tevlihev a cellulase, β-glucosidase û Cellic® HTec2 (157 mg proteîn / ml, pir VHN00001) ji Novozymes (Franklinton, NC, USA) ye.Multifect Pectinase® (72 mg proteîn / mL), tevliheviyek tevlihev a enzîmên hilweşandina pectin, ji hêla DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) ve hate dayîn.Girêdanên proteîna enzîmê bi nirxandina naveroka proteînê (û jêkirina tevkariya nîtrojenê ne-proteîn) bi karanîna analîza nîtrojenê Kjeldahl (rêbaza AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) hate destnîşankirin.Erdê Diatomaceous 545 ji EMD Millipore (Billerica, MA) hate kirîn.Karbona aktîfkirî (DARCO, granulên 100 mesh), Avicel (PH-101), xylana behîv, û hemî kîmyewî yên din ji Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) hatin kirîn.
Pêş-dermankirina AFEX li GLBRC (Laboratoriya Lêkolînê ya Veguheztina Biomass, MSU, Lansing, MI, USA) hate kirin.Pêş-tedawî li 140 ° C. ji bo 15 deqîqeyan hate kirin.46 dema rûniştinê bi rêjeya 1:1 ammonyaya bêhîdro ber bi biomasê ve bi 60% (w/w) barkirin di reaktorek hevîrê ya polayê zengarnegir (Parr Instruments Parr).30 deqe girt.Reaktor hat gihandin 140°C û amonyak bi lez hat berdan, hişt ku biyomass zû vegere germahiya odeyê.Pêkhateya AFEX-ê ya kulikê ya pêş-tedawîkirî (ACS) dişibihe ya stûyê goştê nehatî dermankirin (UT-CS).
Zêdebûna hişk ACSH 25% (w/w) (nêzîkî 8% barkirina dekstranê) wekî materyalek destpêkê ji bo hilberîna mezin a oligosaccharides hate amadekirin.Hîdrolîza enzîmatîk a ACS bi karanîna tevliheviyek enzîmê ya bazirganî, di nav de Cellic® Ctec2 10 mg proteîn / g glukan (di biomasa pêşdibistanê de), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteîn / g glukan, û Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) hate kirin.).), 5 mg proteîn/g dekstran.Hîdrolîza enzîmatîk di bioreaktorek 5 lîtreyî de bi qebareya xebatê 3 lître, pH 4,8, 50°C û 250 rpm hate kirin.Piştî hîdrolîzkirina 96 saetan, hîdrolîzate bi santrîfugê di 6000 rpm de 30 hûrdem û dûv re jî di 14000 rpm de 30 hûrdeman hate berhev kirin da ku hişkên nehîdrolîzkirî werin rakirin.Dûv re hîdrolîzat di nav kaseyek parzûnê ya 0,22 mm de ji parzûna sterîl re hate derbas kirin.Hîdrolîza parzûnkirî di şûşeyên sterîl de di 4°C de hate hilanîn û dûv re li ser karbonê hate perçekirin.
Analîzkirina pêkhateya nimûneyên biomasê yên li ser bingeha jêgirtinê li gorî prosedurên analîza laboratîfê ya NREL: Amadekirina nimûneyan ji bo analîza berhevokê (NREL/TP-510-42620) û destnîşankirina karbohîdartên strukturel û lînîn di biomasê de (NREL/TP-510 - 42618)47.
Analîza oligosakarîdê ya herikîna hîdrolîzatê li ser pîvanek 2 ml bi karanîna rêbazek hîdrolîza asîdê ya bingehîn-otoclave hate kirin.Nimûneya hîdrolîzatê bi 69,7 μl 72% asîda sulfurîk re di lûleke çandê ya 10 ml de bi kulmekê tevlihev bikin û 1 saetan li ser banek di germahiya 121 °C de bihêlin, li ser qeşayê sar bikin û di şûşeyek kromatografiya şil a bi performansa bilind (HPLC) de fîl bikin.Giraniya oligosakarîdan bi derxistina tansiyona monosakarîdên di nimûneya nehîdrolîzkirî de ji tevheviya şekirê di nimûneya hîdrolîzkirî de hate destnîşankirin.
Giraniyên glukoz, xyloz û arabinozê yên di biomasa hîdrolîzkirî ya asîdê de bi karanîna pergalek Shimadzu HPLC ya ku bi otosampler, germkerê stûnê, pompeya îsokratîk, û detektorek nîşana refraksiyonê ya li ser stûnek Bio-Rad Aminex HPX-87H ve hatî vekolîn kirin.Stûn di 50°C de hat parastin û bi 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 di avê de hat avêtin.herrikîn.
Supernatantê hîdrolîzatê hate rijandin û ji bo naveroka monomer û oligosaccharide hate analîz kirin.Şekirên monomerîk ên ku piştî hîdrolîza enzîmatîk hatin bidestxistin, ji hêla HPLC-ê ve bi stûnek Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P û stûnek parastinê ya ash ve hatî vekolîn kirin.Germahiya stûnê di 80 ° C de hate parastin, av wekî qonaxa mobîl bi rêjeya herikîna 0,6 ml / min hate bikar anîn.Olîgosakarîd bi hîdrolîzê di asîdê dilop di 121 ° C de li gorî rêbazên ku di refs de têne diyar kirin têne destnîşankirin.41, 48, 49.
Analîzkirina sakarîdê li ser xav, AFEX-ya pêş-tedawîkirî û hemî bermahiyên biomasa ne-hîdrolîzkirî (di nav de hilberandina jêderkên dîwarê hucreya rêzikî û vekolîna wan a mAb) bi karanîna prosedurên ku berê hatine destnîşan kirin 27, 43, 50, 51 hate kirin.Ji bo analîza glycome, bermahiyên ku di alkolê de nayê çareser kirin ji materyalê dîwarê hucreya nebatê ji bermahiyên biomassê têne amadekirin û bi reagentên ku her ku diçe tundtir dibin, wekî amonyum oxalate (50 mM), karbonat sodyûm (50 mM û 0,5% w/v), CON, têne derxistin.(1M û 4M, her du jî bi 1% w/v sodyûm borohydride) û klorît asîdê wekî ku berê hatî destnîşan kirin52,53.Dûv re vekêşan li dijî panelek tevlihev a mAb50-ê ku ber bi glycana dîwarê hucreyê ve hatî rêve kirin, ji ELISA re hate kirin, û reaksiyonên girêdana mAb wekî nexşeyek germê hate pêşkêş kirin.mAbên ku glycana dîwarê hucreya nebatê armanc dikin ji stokên laboratîfê (CCRC, JIM û rêzikên MAC) hatin kirîn.
Biotinîlasyona yek-gavekî ya oligosaccharides.Tevlihevkirina karbohîdartan bi biotin-LC-hydrazide bi karanîna prosedûra jêrîn hate kirin.Biotin-LC-hydrazide (4,6 mg / 12 μmol) di dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) de bi tevlêdana xurt û germkirina 65 ° C. ji bo 1 min.Asîda acetîk a cemedî (30 µl) hat zêdekirin û tevlihevî hate rijandin li ser sodyûm sîanoborohîdrîdê (6,4 mg/100 μmol) û piştî germkirina li 65 ° C. bi qasî 1 hûrdeman bi tevahî hate hilweşandin.Dûv re, ji 5 heta 8 μl tevliheviya reaksiyonê li oligosaccharide ya hişkkirî (1-100 nmol) hate zêdekirin da ku li ser dawiya kêmkerê 10 qat an jî zêdetir molarî zêde bibe.Reaksîyon 2 saetan li 65 ° C hate kirin, piştî ku nimûne tavilê hatin paqij kirin.No sodyûm cyanoborohydride di ceribandinên etîketkirinê de bêyî kêmkirinê nehat bikar anîn, û nimûneyên 2,5 demjimêran di 65 ° C. de bertek nîşan dan.
Çêkirina ELISA û şuştina nimûneyên oligosakarîdên biotinylated.25 μl nimûneyên biotinylated (100 μl ji her nimûneya konsantrekirî ya ku di 5 ml çareseriya tampon a 0,1 M Tris (TBS) de hatî rijandin) li her kaniyek plakaya avidîn-pêçandî hatin zêdekirin.Kevirên kontrolê bi 50 μl biotin bi giraniya 10 μg / ml di 0.1 M TBS de hatin pêçan.Ji bo pîvandinên vala ava deionîzekirî wekî pêçek hate bikar anîn.Tablet 2 saetan li germahiya odeyê di tariyê de hate înkubakirin.Bi bernameya nimreya 0,1 M TBS, plakê 3 caran bi şîrê kêmkirî %0,1 bişon.11 ji bo daîreya Grenier 3A.
Zêdekirin û şuştina antîkorên seretayî.Li her bîrekê 40 μl antîbodya seretayî zêde bikin.Mîkroplateyê 1 saetê li germahiya odeyê di tariyê de bihelînin.Dûv re lewheyên 3 caran bi 0,1% şîr di 0,1 M TBS de bi karanîna bernameya şuştinê #11 ji bo Grenier Flat 3A hatin şûştin.
Antîpîdê duyemîn lê zêde bikin û bişon.Li her bîrekê 50 μl antîpota duyemîn a mişk/mişk (1:5000 di 0,1% şîr de di 0,1 M TBS de hatî rijandin) zêde bikin.Mîkroplateyê 1 saetê li germahiya odeyê di tariyê de bihelînin.Dûv re mîkroplate 5 caran bi 0,1% şîr di 0,1 M TBS de bi karanîna bernameya şuştina plakaya Grenier Flat 5A #12 hatin şûştin.
Zêdekirina substrate.50 µl 3,3', 5,5'-tetrametîlbenzîdîn (TMB) li substrata bingehê zêde bikin (bi zêdekirina 2 dilop tampon, 3 dilop TMB, 2 dilop peroksîta hîdrojenê li 15 ml ava deyonîzekirî).Substratê TMB amade bikin.û berî bikar bînin vortex).Mîkroplate 30 hûrdeman li germahiya odeyê bixin.Di tariyê de.
Gav biqedînin û tabletê bixwînin.50 μl asîda sulfurîk a 1 N li her bîrekê zêde bikin û bi karanîna xwendevanek ELISA vegirtinê ji 450 heta 655 nm tomar bikin.
1 mg/ml çareseriyên van analîzan di ava deyonîzekirî de amade bikin: arabînoz, rhamnoz, fucoz, xylose, asîda galakturonîk (GalA), asîda glukuronîk (GlcA), manoz, glîkoz, galaktoz, laktoz, N-acetylmannosamine (manNAc.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (standard navxweyî).Bi zêdekirina 1 mg/ml çareseriyên şekir ên ku di tabloya 1-ê de têne xuyang kirin, du standard hatin amade kirin. Nimûne di -80° C. de têne cemidandin û lîofîlîz kirin heya ku hemî av bê rakirin (bi gelemperî 12-18 demjimêran).
100–500 μg nimûneyê li ser lûleyên kapê yên li ser hevsengiyek analîtîk bişewitînin.Mîqdara zêdekirî tomar bikin.Çêtir e ku nimûneyê di konsantreyek taybetî ya helwêstê de bihelînin û wê wekî aliqutek şil li boriyê zêde bikin.Ji bo her lûleya nimûneyê 20 μl 1 mg/ml inositol wekî standardek hundurîn bikar bînin.Mîqdara standarda navxweyî ya ku li nimûneyê hatî zêdekirin divê bi qasî pîvana standarda navxweyî ya ku li lûleya standard hatî zêdekirin be.
8 ml metanolê bêhîd li şûşeyek qepaxekê zêde bikin.Dûv re 4 ml ji 3 N. metanolîk HCl çareserî, girtin û hejandin.Ev pêvajo avê bikar nayîne.
500 µl ji 1 M çareseriya metanolê ya HCl li nimûneyên oligosaccharide û lûleyên TMS yên standard zêde bikin.Nimûne di şevekê de (168 saetan) di 80 ° C. de di bloka termal de hatin avêtin.Hilbera metanolîzê li germahiya odeyê bi karanîna pirçek hişkkirinê hişk bikin.200 μl MeOH lê zêde bikin û dîsa hişk bikin.Ev pêvajo du caran tê dubare kirin.200 µl metanol, 100 µl pyridine û 100 µl anhydride acetic li nimûneyê zêde bikin û baş tevlihev bikin.Nimûne 30 hûrdeman li germahiya odeyê hatin înkubakirin.û ziwa kirin.200 µl metanol lê zêde bikin û dîsa hişk bikin.
200 µl Tri-Sil lê zêde bikin û 20 hûrdeman lûleya germkirinê lê zêde bikin.80 ° C, paşê li germahiya odeyê sar kirin.Kulîlkek hişkkirinê bikar bînin da ku nimûneyê bi qasî 50 µl zuwa bikin.Hêjayî gotinê ye ku me nehişt ku nimûne bi tevahî hişk bibin.
2 ml hexane lê zêde bikin û bi vorteksê baş tevlihev bikin.Tîpên pîpetên Pasteur (5-8 mm) bi pariyek hiriya camê dagirtin û hiriya camê têxin serê pîpetek 5-3/4 înç.Nimûne di 3000 g ji bo 2 deqeyan santrîfuj kirin.Her bermahiyên ku nayên çareser kirin têne barkirin.Nimûneyê bi 100-150 μl hişk bike.Hêjmarek bi qasî 1 μl di germahiya destpêkê ya 80 °C û dema destpêkê ya 2.0 hûrdeman de di GC-MS de hate derzî kirin (Table 2).