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Nouvelles méthodes immunologiques et de spectrométrie de masse pour l'analyse complexe des oligosaccharides persistants dans les tiges de maïs prétraitées avec AFEX.La biomasse lignocellulosique est une alternative durable aux combustibles fossiles et est largement utilisée pour développer des biotechnologies pour la production de produits tels que les denrées alimentaires, les aliments pour animaux, les carburants et les produits chimiques.La clé de ces technologies est le développement de procédés compétitifs en termes de coûts pour convertir les glucides complexes présents dans les parois cellulaires des plantes en sucres simples tels que le glucose, le xylose et l'arabinose.Parce que la biomasse lignocellulosique est très tenace, elle doit être soumise à des traitements thermochimiques (par exemple, exfoliation des fibres d'ammoniaque (AFEX), acides dilués (DA), liquides ioniques (IL)) et des traitements biologiques (par exemple, hydrolyse enzymatique et fermentation microbienne) en combinaison pour obtenir le produit souhaité..Cependant, lorsque des enzymes fongiques commerciales sont utilisées dans le processus d'hydrolyse, seuls 75 à 85 % des sucres solubles formés sont des monosaccharides, et les 15 à 25 % restants sont des oligosaccharides solubles et insolubles, qui ne sont pas toujours disponibles pour les micro-organismes.Auparavant, nous avons isolé et purifié avec succès des oligosaccharides tenaces solubles à l'aide d'une combinaison de séparation du carbone et de terre de diatomées et de chromatographie d'exclusion stérique, et avons également étudié leurs propriétés inhibitrices enzymatiques.Nous avons découvert que les oligosaccharides contenant des substitutions d'acide uronique méthylé à haut degré de polymérisation (DP) sont plus difficiles à traiter avec des mélanges d'enzymes commerciaux que les oligosaccharides à faible DP et neutres.Nous rapportons ici l'utilisation de plusieurs méthodes supplémentaires, y compris le profilage des glycanes à l'aide d'anticorps monoclonaux (mAbs) spécifiques aux glycanes de la biomasse végétale pour caractériser les liaisons glycanes dans les parois cellulaires végétales et les hydrolysats enzymatiques, l'ionisation par désorption laser assistée par matrice, la spectrométrie de masse à temps de vol..MALDI-TOF-MS) utilise des pics de diagnostic informatifs sur la structure obtenus par spectroscopie après désintégration secondaire des ions négatifs, chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC-MS) pour caractériser les liaisons oligosaccharidiques avec et sans dérivatisation.En raison de la petite taille des oligosaccharides (DP 4–20), ces molécules sont difficiles à utiliser pour la liaison et la caractérisation des mAb.Pour surmonter ce problème, nous avons appliqué une nouvelle méthode d'immobilisation d'oligosaccharides à base de conjugaison de biotine qui a marqué avec succès la majorité des oligosaccharides solubles à faible DP sur la surface de la microplaque, qui a ensuite été utilisée dans un système mAb à haut débit pour une analyse de ligature spécifique.Cette nouvelle méthode facilitera le développement d'analyses de glycome à haut débit plus avancées à l'avenir qui peuvent être utilisées pour isoler et caractériser les oligosaccharides présents dans les biomarqueurs à des fins de diagnostic.
La biomasse lignocellulosique, composée de matières agricoles, forestières, herbacées et ligneuses, est une matière première potentielle pour la production de produits biosourcés, notamment des denrées alimentaires, des aliments pour animaux, des carburants et des précurseurs chimiques pour produire des produits à plus forte valeur1.Les glucides (tels que la cellulose et l'hémicellulose) présents dans les parois cellulaires végétales sont dépolymérisés en monosaccharides par traitement chimique et biotransformation (comme l'hydrolyse enzymatique et la fermentation microbienne).Les prétraitements courants comprennent l'expansion des fibres d'ammoniac (AFEX), l'acide dilué (DA), le liquide ionique (IL) et l'explosion à la vapeur (SE), qui utilisent une combinaison de produits chimiques et de chaleur pour réduire la production de lignocellulose en ouvrant les parois cellulaires des plantes3,4.l'entêtement de la matière, 5. L'hydrolyse enzymatique est effectuée à une charge élevée en solides en utilisant des enzymes commerciales contenant des glucides actifs (CAZymes) et une fermentation microbienne utilisant des levures ou des bactéries transgéniques pour produire des biocarburants et des produits chimiques 6 .
Les CAZymes dans les enzymes commerciales sont composées d'un mélange complexe d'enzymes qui clivent de manière synergique les liaisons glucides-sucre complexes pour former des monosaccharides2,7.Comme nous l'avons signalé précédemment, le réseau complexe de polymères aromatiques de lignine avec des glucides les rend très intraitables, ce qui conduit à une conversion incomplète des sucres, accumulant 15 à 25% d'oligosaccharides sexuels qui ne sont pas produits lors de l'hydrolyse enzymatique de la biomasse prétraitée.Il s'agit d'un problème courant avec diverses méthodes de prétraitement de la biomasse.Certaines raisons de ce goulot d'étranglement comprennent l'inhibition enzymatique pendant l'hydrolyse, ou l'absence ou les faibles niveaux d'enzymes essentielles essentielles qui sont nécessaires pour rompre les liaisons de sucre dans la biomasse végétale.Comprendre la composition et les caractéristiques structurelles des sucres, telles que les liaisons sucre dans les oligosaccharides, nous aidera à améliorer la conversion des sucres lors de l'hydrolyse, rendant les processus biotechnologiques compétitifs par rapport aux produits dérivés du pétrole.
La détermination de la structure des glucides est un défi et nécessite une combinaison de méthodes telles que la chromatographie liquide (LC)11,12, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)13, l'électrophorèse capillaire (CE)14,15,16 et la spectrométrie de masse (MS)17.,dix-huit.Les méthodes MS telles que la spectrométrie de masse à temps de vol avec désorption laser et ionisation à l'aide d'une matrice (MALDI-TOF-MS) sont une méthode polyvalente pour identifier les structures glucidiques.Récemment, le tandem MS à dissociation induite par collision (CID) des adduits d'ions sodium a été le plus largement utilisé pour identifier les empreintes digitales correspondant aux positions de fixation des oligosaccharides, aux configurations anomères, aux séquences et aux positions de ramification 20, 21 .
L'analyse des glycanes est un excellent outil pour l'identification en profondeur des liaisons glucidiques22.Cette méthode utilise des anticorps monoclonaux (mAbs) dirigés contre le glycane de la paroi cellulaire végétale comme sondes pour comprendre les liaisons glucidiques complexes.Plus de 250 mAb sont disponibles dans le monde, conçus contre divers oligosaccharides linéaires et ramifiés utilisant divers saccharides24.Plusieurs mAb ont été largement utilisés pour caractériser la structure, la composition et les modifications de la paroi cellulaire végétale, car il existe des différences significatives selon le type de cellule végétale, l'organe, l'âge, le stade de développement et l'environnement de croissance.Plus récemment, cette méthode a été utilisée pour comprendre les populations de vésicules dans les systèmes végétaux et animaux et leurs rôles respectifs dans le transport des glycanes, tels que déterminés par les marqueurs subcellulaires, les stades de développement ou les stimuli environnementaux, et pour déterminer l'activité enzymatique.Certaines des différentes structures de glycanes et de xylanes qui ont été identifiées comprennent la pectine (P), le xylane (X), le mannane (M), les xyloglucanes (XylG), les glucanes à liaisons mixtes (MLG), l'arabinoxylane (ArbX), le galactomannane (GalG), l'acide glucuronique-arabinoxylane (GArbX) et l'arabino-galactane (ArbG)29.
Cependant, malgré tous ces efforts de recherche, seules quelques études se sont concentrées sur la nature de l'accumulation d'oligosaccharides lors de l'hydrolyse à haute charge en solides (HSL), y compris la libération d'oligosaccharides, les changements de longueur de chaîne oligomère lors de l'hydrolyse, divers polymères à faible DP et leurs courbes.répartitions 30,31,32.Pendant ce temps, bien que l'analyse des glycanes se soit avérée être un outil utile pour une analyse complète de la structure des glycanes, il est difficile d'évaluer les oligosaccharides à faible DP solubles dans l'eau à l'aide de méthodes d'anticorps.Les oligosaccharides DP plus petits avec un poids moléculaire inférieur à 5-10 kDa ne se lient pas aux plaques ELISA 33, 34 et sont lavés avant l'ajout d'anticorps.
Ici, pour la première fois, nous démontrons un test ELISA sur des plaques recouvertes d'avidine à l'aide d'anticorps monoclonaux, combinant une procédure de biotinylation en une étape pour les oligosaccharides réfractaires solubles avec l'analyse du glycome.Notre approche de l'analyse du glycome a été validée par l'analyse basée sur MALDI-TOF-MS et GC-MS des liaisons oligosaccharidiques complémentaires à l'aide de la dérivatisation triméthylsilyle (TMS) des compositions de sucres hydrolysés.Cette approche innovante peut être développée en tant que méthode à haut débit à l'avenir et trouver une application plus large dans la recherche biomédicale35.
Les modifications post-traductionnelles des enzymes et des anticorps, comme la glycosylation36, affectent leur activité biologique.Par exemple, les modifications de la glycosylation des protéines sériques jouent un rôle important dans l'arthrite inflammatoire, et les modifications de la glycosylation sont utilisées comme marqueurs diagnostiques37.Divers glycanes ont été rapportés dans la littérature comme apparaissant facilement dans une variété de maladies, y compris les maladies inflammatoires chroniques du tractus gastro-intestinal et du foie, les infections virales, les cancers de l'ovaire, du sein et de la prostate38,39,40.Comprendre la structure des glycanes à l'aide de méthodes ELISA de glycanes à base d'anticorps fournira une confiance supplémentaire dans le diagnostic de la maladie sans l'utilisation de méthodes complexes de SEP.
Notre étude précédente a montré que les oligosaccharides tenaces restaient non hydrolysés après le prétraitement et l'hydrolyse enzymatique (Figure 1).Dans nos travaux publiés précédemment, nous avons développé une méthode d'extraction en phase solide au charbon actif pour isoler les oligosaccharides de l'hydrolysat de tiges de maïs prétraité à l'AFEX (ACSH)8.Après extraction et séparation initiales, les oligosaccharides ont été encore fractionnés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) et collectés par ordre de poids moléculaire.Les monomères et oligomères de sucre libérés à partir de divers prétraitements ont été analysés par analyse de la composition en sucre.Lorsque l'on compare la teneur en oligomères de sucre obtenus par diverses méthodes de prétraitement, la présence d'oligosaccharides tenaces est un problème courant dans la conversion de la biomasse en monosaccharides et peut entraîner une réduction du rendement en sucre d'au moins 10 à 15 % et même jusqu'à 18 %.NOUS.Cette méthode est utilisée pour la production à grande échelle de fractions d'oligosaccharides.L'ACH résultant et ses fractions ultérieures avec différents poids moléculaires ont été utilisés comme matériel expérimental pour la caractérisation des oligosaccharides dans ce travail.
Après prétraitement et hydrolyse enzymatique, les oligosaccharides persistants sont restés non hydrolysés.Ici (A) est une méthode de séparation d'oligosaccharides dans laquelle les oligosaccharides sont isolés de l'hydrolysat de canne de maïs prétraité AFEX (ACSH) à l'aide d'un lit garni de charbon actif et de terre de diatomées ;(B) Méthode de séparation des oligosaccharides.Les oligosaccharides ont ensuite été séparés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC);(C) Monomères et oligomères saccharidiques libérés de divers prétraitements (acide dilué : DA, liquide ionique : IL et AFEX).Conditions d'hydrolyse enzymatique : charge élevée en solides de 25 % (w/w) (environ 8 % de charge de glucane), 96 heures d'hydrolyse, 20 mg/g de charge enzymatique commerciale (ratio Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) et (D) Monomères de sucre et oligomères de glucose, xylose et arabinose libérés des tiges de maïs prétraitées AFEX (ACS).
L'analyse des glycanes s'est avérée être un outil utile pour une analyse structurelle complète des glycanes dans des extraits isolés à partir de résidus de biomasse solide.Cependant, les saccharides solubles dans l'eau sont sous-représentés en utilisant cette méthode traditionnelle41 car les oligosaccharides de faible poids moléculaire sont difficiles à immobiliser sur les plaques ELISA et sont lavés avant l'ajout d'anticorps.Par conséquent, pour la liaison et la caractérisation des anticorps, une méthode de biotinylation en une étape a été utilisée pour enrober des oligosaccharides solubles et non conformes sur des plaques ELISA recouvertes d'avidine.Cette méthode a été testée en utilisant notre ACSH précédemment produit et une fraction basée sur son poids moléculaire (ou degré de polymérisation, DP).La biotinylation en une étape a été utilisée pour augmenter l'affinité de liaison des oligosaccharides en ajoutant de la biotine-LC-hydrazide à l'extrémité réductrice du glucide (Fig. 2).En solution, le groupe hémiacétal à l'extrémité réductrice réagit avec le groupe hydrazide de la biotine-LC-hydrazide pour former une liaison hydrazone.En présence de l'agent réducteur NaCNBH3, la liaison hydrazone est réduite en un produit final biotinylé stable.Avec la modification de l'extrémité réductrice du sucre, la liaison d'oligosaccharides à faible DP aux plaques ELISA est devenue possible, et dans notre étude, cela a été fait sur des plaques revêtues d'avidine en utilisant des mAb ciblés sur les glycanes.
Criblage d'anticorps monoclonaux basé sur ELISA pour les oligosaccharides biotinylés.Ici (A) a combiné la biotinylation des oligosaccharides et le dépistage ELISA ultérieur avec des mAb ciblés sur les glycanes sur des plaques revêtues de NeutrAvidin et (B) montre une procédure en une étape pour la biotinylation des produits de réaction.
Des plaques revêtues d'avidine avec des anticorps conjugués à des oligosaccharides ont ensuite été ajoutées aux anticorps primaires et secondaires et lavées dans un milieu sensible à la lumière et au temps.Une fois la liaison des anticorps terminée, ajouter le substrat TMB pour incuber la plaque.La réaction a finalement été arrêtée avec de l'acide sulfurique.Les plaques incubées ont été analysées à l'aide d'un lecteur ELISA pour déterminer la force de liaison de chaque anticorps afin de détecter une réticulation spécifique à l'anticorps.Pour les détails et les paramètres de l'expérience, voir la section correspondante "Matériels et méthodes".
Nous démontrons l'utilité de cette méthode nouvellement développée pour des applications spécifiques en caractérisant les oligosaccharides solubles présents dans l'ACSH ainsi que dans les fractions oligosaccharidiques brutes et purifiées isolées à partir d'hydrolysats lignocellulosiques.Comme le montre la figure 3, les xylanes substitués par un épitope les plus courants identifiés dans l'ACSH à l'aide de méthodes de dosage du glycome bioacylé sont généralement les arabinogalactanes uroniques (U) ou méthyluroniques (MeU) et pectiques.La plupart d'entre eux ont également été retrouvés dans notre précédente étude sur l'analyse des glycanes des solides non hydrolysés (UHS)43.
Détection d'épitopes oligosaccharidiques récalcitrants à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre le glycane de la paroi cellulaire.La fraction « neutre » est la fraction ACN et la fraction « acide » est la fraction FA.Des rouges plus brillants sur la carte thermique indiquent une teneur en épitopes plus élevée et des bleus plus brillants indiquent un fond blanc.Les valeurs de couleur sur l'échelle sont basées sur les valeurs de DO brutes pour les formulations N=2.Les principaux épitopes reconnus par les anticorps sont représentés à droite.
Ces structures non cellulosiques n'ont pas pu être clivées par les cellulases et hémicellulases les plus courantes dans le mélange d'enzymes commerciales testé, qui comprend les enzymes commerciales les plus couramment utilisées.Par conséquent, de nouvelles enzymes auxiliaires sont nécessaires pour leur hydrolyse.Sans les enzymes accessoires non cellulosiques nécessaires, ces liaisons non cellulosiques empêchent une conversion complète en monosaccharides, même si leurs polymères de sucre parents sont largement hydrolysés en fragments plus courts et dissous à l'aide de mélanges enzymatiques commerciaux.
Une étude plus approfondie de la distribution du signal et de sa force de liaison a montré que les épitopes de liaison étaient plus faibles dans les fractions de sucre à DP élevé (A, B, C, DP jusqu'à 20+) que dans les fractions à faible DP (D, E, F, DP) dans les dimères) (Fig. 1).Les fragments acides sont plus courants dans les épitopes non cellulosiques que les fragments neutres.Ces phénomènes sont cohérents avec le schéma observé dans notre étude précédente, où les fractions DP et acide élevées étaient plus résistantes à l'hydrolyse enzymatique.Par conséquent, la présence d'épitopes de glycanes non cellulosiques et de substitutions U et MeU peut grandement contribuer à la stabilité des oligosaccharides.Il convient de noter que l'efficacité de la liaison et de la détection peut être problématique pour les oligosaccharides à faible DP, en particulier si l'épitope est un oligosaccharide dimère ou trimère.Cela peut être testé en utilisant des oligosaccharides commerciaux de différentes longueurs, chacun contenant un seul épitope qui se lie à un mAb spécifique.
Ainsi, l'utilisation d'anticorps spécifiques de structure a révélé certains types de liaisons récalcitrantes.Selon le type d'anticorps utilisé, le modèle de ligature approprié et la force du signal qu'il produit (le plus et le moins abondant), de nouvelles enzymes peuvent être identifiées et ajoutées semi-quantitativement au mélange d'enzymes pour une glycoconversion plus complète.En prenant l'analyse des oligosaccharides ACSH comme exemple, nous pouvons créer une base de données de liaisons glycanes pour chaque matériau de biomasse.Il convient de noter ici que l'affinité différente des anticorps doit être prise en compte, et si leur affinité est inconnue, cela créera certaines difficultés lors de la comparaison des signaux de différents anticorps.De plus, la comparaison des liaisons glycanes peut mieux fonctionner entre les échantillons pour le même anticorps.Ces liaisons tenaces peuvent ensuite être liées à la base de données CAZyme, à partir de laquelle nous pouvons identifier des enzymes, sélectionner des enzymes candidates et tester les enzymes de rupture de liaison, ou développer des systèmes microbiens pour exprimer ces enzymes à utiliser dans les bioraffineries44.
Pour évaluer comment les méthodes immunologiques complètent les méthodes alternatives de caractérisation des oligosaccharides de faible poids moléculaire présents dans les hydrolysats lignocellulosiques, nous avons effectué MALDI (Fig. 4, S1-S8) et l'analyse des saccharides dérivés de TMS basée sur GC-MS sur le même panel (Fig. 5) partie oligosaccharide.MALDI est utilisé pour comparer si la distribution de masse des molécules d'oligosaccharides correspond à la structure prévue.Sur la fig.4 montre le MC des composants neutres ACN-A et ACN-B.L'analyse ACN-A a confirmé une gamme de sucres pentoses allant de DP 4–8 (Fig. 4) à DP 22 (Fig. S1), dont les poids correspondent aux oligosaccharides MeU-xylane.L'analyse ACN-B a confirmé la série des pentoses et des glucoxylanes avec DP 8-15.Dans des documents supplémentaires tels que la figure S3, les cartes de distribution de masse des fractions acides FA-C montrent une gamme de sucres pentoses substitués (Me) U avec un DP de 8 à 15 qui sont compatibles avec les xylanes substitués trouvés dans le dépistage mAb basé sur ELISA.Les épitopes sont cohérents.
Spectre MALDI-MS d'oligosaccharides solubles non conformes présents dans l'ACS.Ici, (A) ACN-A fractions de faible poids contenant de l'acide uronique méthylé (DP 4-8) ont substitué des oligosaccharides de glucuroxylane et (B) ACN-B xylane et des oligosaccharides d'acide uronique méthylé substitués par du glucuroxylane (DP 8-15).
Analyse de la composition du résidu glycane d'oligosaccharides réfractaires.Ici (A) Composition de saccharides TMS de diverses fractions d'oligosaccharides obtenues par analyse GC-MS.(B) Structures de divers sucres dérivés de TMS présents dans les oligosaccharides.ACN - fraction d'acétonitrile contenant des oligosaccharides neutres et FA - fraction d'acide férulique contenant des oligosaccharides acides.
Une autre conclusion intéressante a été tirée de l'analyse LC-MS de la fraction oligosaccharidique, comme le montre la figure S9 (les méthodes peuvent être vues dans le matériel supplémentaire électronique).Des fragments de groupes hexose et -OAc ont été observés à plusieurs reprises pendant la ligature de la fraction ACN-B.Cette découverte confirme non seulement la fragmentation observée dans l'analyse du glycome et MALDI-TOF, mais fournit également de nouvelles informations sur les dérivés glucidiques potentiels dans la biomasse lignocellulosique prétraitée.
Nous avons également analysé la composition en sucre de la fraction oligosaccharidique à l'aide de la dérivation du sucre TMS.À l'aide de la GC-MS, nous avons déterminé la composition des sucres neuronaux (non dérivés) et acides (GluA et GalA) dans la fraction oligosaccharidique (Fig. 5).L'acide glucuronique se trouve dans les composants acides C et D, tandis que l'acide galacturonique se trouve dans les composants acides A et B, qui sont tous deux des composants à DP élevé des sucres acides.Ces résultats confirment non seulement nos données ELISA et MALDI, mais sont également cohérents avec nos études précédentes sur l'accumulation d'oligosaccharides.Par conséquent, nous pensons que les méthodes immunologiques modernes utilisant la biotinylation des oligosaccharides et le dépistage ELISA ultérieur sont suffisantes pour détecter les oligosaccharides récalcitrants solubles dans divers échantillons biologiques.
Étant donné que les méthodes de dépistage mAb basées sur ELISA ont été validées par plusieurs méthodes différentes, nous avons voulu explorer davantage le potentiel de cette nouvelle méthode quantitative.Deux oligosaccharides commerciaux, l'oligosaccharide xylohexasaccharide (XHE) et le 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ont été achetés et testés à l'aide d'une nouvelle approche mAb ciblant le glycane de la paroi cellulaire.La figure 6 montre une corrélation linéaire entre le signal de liaison biotinylé et la concentration logarithmique de la concentration d'oligosaccharide, suggérant un modèle d'adsorption de Langmuir possible.Parmi les mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 et CCRC-M151 étaient corrélés avec XHE, et CCRC-M108, CCRC-M109 et LM11 étaient corrélés avec A2XX sur une plage de 1 nm à 100 nanomètres.En raison de la disponibilité limitée d'anticorps au cours de l'expérience, des expériences limitées ont été réalisées avec chaque concentration d'oligosaccharide.Il convient de noter ici que certains anticorps réagissent très différemment au même oligosaccharide en tant que substrat, probablement parce qu'ils se lient à des épitopes légèrement différents et peuvent avoir des affinités de liaison très différentes.Les mécanismes et les implications de l'identification précise des épitopes seront beaucoup plus complexes lorsque la nouvelle approche mAb sera appliquée à de vrais échantillons.
Deux oligosaccharides commerciaux ont été utilisés pour déterminer la plage de détection de divers mAb ciblant les glycanes.Ici, les corrélations linéaires avec la concentration logarithmique de la concentration d'oligosaccharides indiquent les schémas d'adsorption de Langmuir pour (A) XHE avec mAb et (B) A2XX avec mAb.Les épitopes correspondants indiquent les structures des oligosaccharides commerciaux utilisés comme substrats dans le dosage.
L'utilisation d'anticorps monoclonaux ciblés sur les glycanes (analyse glycomique ou criblage de mAb basé sur ELISA) est un outil puissant pour la caractérisation en profondeur de la plupart des principaux glycanes de la paroi cellulaire qui composent la biomasse végétale.Cependant, l'analyse classique des glycanes ne caractérise que les glycanes de paroi cellulaire plus grands, car la plupart des oligosaccharides ne sont pas efficacement immobilisés sur les plaques ELISA.Dans cette étude, les cannes de maïs prétraitées à l'AFEX ont été hydrolysées par voie enzymatique à une teneur élevée en solides.L'analyse des sucres a été utilisée pour déterminer la composition des glucides récalcitrants de la paroi cellulaire dans l'hydrolysat.Cependant, l'analyse mAb des oligosaccharides plus petits dans les hydrolysats est sous-estimée et des outils supplémentaires sont nécessaires pour immobiliser efficacement les oligosaccharides sur les plaques ELISA.
Nous rapportons ici une méthode d'immobilisation d'oligosaccharides nouvelle et efficace pour le criblage de mAb en combinant la biotinylation d'oligosaccharides suivie d'un criblage ELISA sur des plaques revêtues de NeutrAvidin™.Les oligosaccharides biotinylés immobilisés ont montré une affinité suffisante pour l'anticorps pour permettre une détection rapide et efficace des oligosaccharides récalcitrants.L'analyse de la composition de ces oligosaccharides tenaces basée sur la spectrométrie de masse a confirmé les résultats de cette nouvelle approche d'immunocriblage.Ainsi, ces études démontrent que la combinaison de la biotinylation des oligosaccharides et du criblage ELISA avec des anticorps monoclonaux ciblés sur les glycanes peut être utilisée pour détecter les réticulations dans les oligosaccharides et peut être largement appliquée dans d'autres études biochimiques caractérisant la structure des oligosaccharides.
Cette méthode de profilage des glycanes à base de biotine est le premier rapport capable d'étudier les liaisons glucidiques récalcitrantes des oligosaccharides solubles dans la biomasse végétale.Cela aide à comprendre pourquoi certaines parties de la biomasse sont si têtues lorsqu'il s'agit de produire des biocarburants.Cette méthode comble une lacune importante dans les méthodes d'analyse du glycome et étend son application à une plus large gamme de substrats au-delà des oligosaccharides végétaux.À l'avenir, nous pourrions utiliser la robotique pour la biotinylation et utiliser la méthode que nous avons développée pour l'analyse à haut débit d'échantillons à l'aide d'ELISA.
La paille de maïs (CS) cultivée à partir de semences hybrides Pioneer 33A14 a été récoltée en 2010 à Kramer Farms à Ray, Colorado.Avec l'autorisation du propriétaire foncier, cette biomasse peut être utilisée pour la recherche. Les échantillons ont été conservés au sec < 6 % d'humidité dans des sacs à fermeture éclair à température ambiante. Les échantillons ont été conservés au sec < 6 % d'humidité dans des sacs à fermeture éclair à température ambiante. Plus de 6 % et moins de 6 % ой температуре. Les échantillons ont été stockés au sec à < 6 % d'humidité dans des sacs à fermeture éclair à température ambiante.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажност üю < 6 %. Les échantillons sont stockés dans des sacs à fermeture éclair à température ambiante avec une humidité < 6 %.L'étude était conforme aux directives locales et nationales.L'analyse de la composition a été réalisée en utilisant le protocole NREL.La composition s'est avérée contenir 31,4 % de glucane, 18,7 % de xylane, 3,3 % d'arabinane, 1,2 % de galactane, 2,2 % d'acétyle, 14,3 % de lignine, 1,7 % de protéine et 13,4 % de cendre.
Cellic® CTec2 (138 mg protéine/ml, lot VCNI 0001) est un mélange complexe de cellulase, β-glucosidase et Cellic® HTec2 (157 mg protéine/ml, lot VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg de protéine/mL), un mélange complexe d'enzymes dégradant la pectine, a été offert par DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, Californie, États-Unis).Les concentrations de protéines enzymatiques ont été déterminées en estimant la teneur en protéines (et en soustrayant la contribution de l'azote non protéique) à l'aide de l'analyse de l'azote de Kjeldahl (méthode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).La terre de diatomées 545 a été achetée chez EMD Millipore (Billerica, MA).Le charbon actif (DARCO, granulés de 100 mesh), l'Avicel (PH-101), le xylane de hêtre et tous les autres produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Le prétraitement AFEX a été effectué au GLBRC (Laboratoire de recherche sur la conversion de la biomasse, MSU, Lansing, MI, États-Unis).Le prétraitement a été effectué à 140°C pendant 15 minutes.46 temps de séjour à un rapport de 1:1 d'ammoniac anhydre à la biomasse à 60 % (p/p) de charge dans un réacteur discontinu de paillasse en acier inoxydable (Parr Instruments Company).Cela a pris 30 minutes.Le réacteur a été porté à 140°C et l'ammoniac s'est rapidement libéré, permettant à la biomasse de revenir rapidement à température ambiante.La composition des tiges de maïs prétraitées AFEX (ACS) était similaire à celle des tiges de maïs non traitées (UT-CS).
De l'ACSH à haute teneur en solides à 25 % (p/p) (environ 8 % de charge de dextrane) a été préparé comme matériau de départ pour la production à grande échelle d'oligosaccharides.L'hydrolyse enzymatique de l'ACS a été réalisée à l'aide d'un mélange d'enzymes commercial comprenant Cellic® Ctec2 10 mg de protéine/g de glucane (dans la biomasse prétraitée), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg de protéine/g de glucane et Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg de protéines/g de dextran.L'hydrolyse enzymatique a été effectuée dans un bioréacteur de 5 litres avec un volume de travail de 3 litres, pH 4,8, 50°C et 250 tr/min.Après hydrolyse pendant 96 heures, l'hydrolysat a été recueilli par centrifugation à 6 000 tr/min pendant 30 minutes puis à 14 000 tr/min pendant 30 minutes pour éliminer les solides non hydrolysés.L'hydrolysat a ensuite été soumis à une filtration stérile à travers un bécher à filtre de 0,22 mm.L'hydrolysat filtré a été conservé dans des flacons stériles à 4°C puis fractionné sur charbon.
Analyse de la composition des échantillons de biomasse à base d'extraits selon les procédures d'analyse du laboratoire NREL : préparation des échantillons pour l'analyse de la composition (NREL/TP-510-42620) et détermination des glucides structuraux et de la lignine dans la biomasse (NREL/TP-510 - 42618)47.
L'analyse des oligosaccharides du flux d'hydrolysat a été effectuée à l'échelle de 2 ml en utilisant une méthode d'hydrolyse acide à base d'autoclave.Mélanger l'échantillon d'hydrolysat avec 69,7 pi d'acide sulfurique à 72 % dans un tube de culture à bouchon à vis de 10 ml et incuber pendant 1 h sur une paillasse à 121 oC, refroidir sur de la glace et filtrer dans un flacon de chromatographie liquide haute performance (HPLC) .La concentration d'oligosaccharides a été déterminée en soustrayant la concentration de monosaccharides dans l'échantillon non hydrolysé de la concentration totale de sucre dans l'échantillon hydrolysé à l'acide.
Les concentrations de glucose, de xylose et d'arabinose dans la biomasse hydrolysée à l'acide ont été analysées à l'aide d'un système HPLC Shimadzu équipé d'un échantillonneur automatique, d'un réchauffeur de colonne, d'une pompe isocratique et d'un détecteur d'indice de réfraction sur une colonne Bio-Rad Aminex HPX-87H.La colonne a été maintenue à 50°C et éluée avec 0,6 ml/min de H2SO4 5 mM dans de l'eau.couler.
Le surnageant de l'hydrolysat a été dilué et analysé pour la teneur en monomère et en oligosaccharide.Les sucres monomères obtenus après hydrolyse enzymatique ont été analysés par HPLC équipée d'une colonne Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P et d'une colonne Ash Guard.La température de la colonne a été maintenue à 80°C, de l'eau a été utilisée comme phase mobile avec un débit de 0,6 ml/min.Les oligosaccharides ont été déterminés par hydrolyse dans un acide dilué à 121°C selon les méthodes décrites dans les réf.41, 48, 49.
L'analyse des saccharides a été effectuée sur des résidus de biomasse bruts, prétraités AFEX et tous non hydrolysés (y compris la production d'extraits de paroi cellulaire en série et leur criblage mAb) en utilisant les procédures décrites précédemment 27, 43, 50, 51 .Pour l'analyse du glycome, des résidus insolubles dans l'alcool de matériel de paroi cellulaire végétale sont préparés à partir de résidus de biomasse et soumis à une extraction en série avec des réactifs de plus en plus agressifs tels que l'oxalate d'ammonium (50 mM), le carbonate de sodium (50 mM et 0,5 % p/v), CON.(1M et 4M, tous deux avec 1 % p/v de borohydrure de sodium) et du chlorite acide comme décrit précédemment52,53.Les extraits ont ensuite été soumis à ELISA contre un panel complexe de mAb50 dirigés vers le glycane de la paroi cellulaire, et les réactions de liaison mAb ont été présentées sous forme de carte thermique.Les mAb ciblant le glycane de la paroi cellulaire végétale ont été achetés à partir de stocks de laboratoire (séries CCRC, JIM et MAC).
Biotinylation en une étape d'oligosaccharides.La conjugaison des glucides avec la biotine-LC-hydrazide a été réalisée en utilisant la procédure suivante.La biotine-LC-hydrazide (4,6 mg/12 μmol) a été dissoute dans du diméthylsulfoxyde (DMSO, 70 μl) par agitation vigoureuse et chauffage à 65°C pendant 1 min.De l'acide acétique glacial (30 ul) a été ajouté et le mélange a été versé sur du cyanoborohydrure de sodium (6,4 mg/100 umol) et complètement dissous après chauffage à 65°C pendant environ 1 minute.Ensuite, de 5 à 8 ul du mélange réactionnel ont été ajoutés à l'oligosaccharide séché (1-100 nmol) pour obtenir un excès molaire de 10 fois ou plus du marqueur sur l'extrémité réductrice.La réaction a été effectuée à 65°C pendant 2 h, après quoi les échantillons ont été immédiatement purifiés.Aucun cyanoborohydrure de sodium n'a été utilisé dans les expériences de marquage sans réduction, et les échantillons ont été mis à réagir à 65°C pendant 2,5 heures.
Revêtement ELISA et lavage d'échantillons d'oligosaccharides biotinylés.25 μl d'échantillons biotinylés (100 μl de chaque échantillon concentré dilué dans 5 ml de solution tampon Tris (TBS) 0,1 M) ont été ajoutés dans chaque puits de la plaque recouverte d'avidine.Les puits témoins ont été recouverts de 50 µl de biotine à une concentration de 10 µg/ml dans du TBS 0,1 M.De l'eau déionisée a été utilisée comme revêtement pour les mesures à blanc.Le comprimé a été incubé pendant 2 heures à température ambiante dans l'obscurité.Laver la plaque 3 fois avec du lait écrémé à 0,1 % dans du TBS 0,1 M en utilisant le programme no.11 pour Grenier plat 3A.
Addition et lavage des anticorps primaires.Ajouter 40 µl d'anticorps primaire dans chaque puits.Incuber la microplaque pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité.Les plaques ont ensuite été lavées 3 fois avec du lait à 0,1 % dans du TBS 0,1 M en utilisant le programme de lavage n° 11 pour Grenier Flat 3A.
Ajouter l'anticorps secondaire et laver.Ajouter 50 µl d'anticorps secondaire de souris/rat (dilué au 1/5000 dans du lait à 0,1 % dans du TBS à 0,1 M) dans chaque puits.Incuber la microplaque pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité.Les microplaques ont ensuite été lavées 5 fois avec du lait à 0,1 % dans du TBS 0,1 M en utilisant le programme de lavage de plaques Grenier Flat 5A #12.
Ajout d'un substrat.Ajouter 50 µl de 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) au substrat de base (en ajoutant 2 gouttes de tampon, 3 gouttes de TMB, 2 gouttes de peroxyde d'hydrogène à 15 ml d'eau déminéralisée).Préparez le substrat TMB.et vortexer avant utilisation).Incuber la microplaque à température ambiante pendant 30 minutes.Dans le noir.
Terminez l'étape et lisez la tablette.Ajouter 50 µl d'acide sulfurique 1 N dans chaque puits et enregistrer l'absorbance de 450 à 655 nm à l'aide d'un lecteur ELISA.
Préparer des solutions à 1 mg/ml de ces analytes dans de l'eau désionisée : arabinose, rhamnose, fucose, xylose, acide galacturonique (GalA), acide glucuronique (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acétylmannosamine (manNAc), N-acétylglucosamine .(glcNAc), N-acétylgalactosamine (galNAc), inositol (étalon interne).Deux étalons ont été préparés en ajoutant les solutions de sucre à 1 mg/ml présentées dans le tableau 1. Les échantillons sont congelés et lyophilisés à -80°C jusqu'à ce que toute l'eau soit éliminée (habituellement environ 12 à 18 heures).
Ajouter 100 à 500 µg d'échantillon dans des tubes à bouchon vissé sur une balance analytique.Enregistrez le montant ajouté.Il est préférable de dissoudre l'échantillon dans une concentration spécifique de solvant et de l'ajouter au tube sous forme d'aliquote liquide.Utiliser 20 µl d'inositol à 1 mg/ml comme étalon interne pour chaque tube d'échantillon.La quantité d'étalon interne ajoutée à l'échantillon doit être la même que la quantité d'étalon interne ajoutée au tube étalon.
Ajouter 8 ml de méthanol anhydre dans un flacon à bouchon à vis.Puis 4 ml d'une solution d'HCl méthanolique 3 N. bouchée et agitée.Ce procédé n'utilise pas d'eau.
Ajouter 500 ul de solution de méthanol HCl 1 M aux échantillons d'oligosaccharides et aux tubes TMS standard.Les échantillons ont été incubés pendant une nuit (168 heures) à 80°C dans un bloc thermique.Sécher le produit de méthanolyse à température ambiante à l'aide d'un collecteur de séchage.Ajouter 200 µl de MeOH et sécher à nouveau.Ce processus est répété deux fois.Ajouter 200 µl de méthanol, 100 µl de pyridine et 100 µl d'anhydride acétique à l'échantillon et bien mélanger.Les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant 30 minutes.et séché.Ajouter 200 µl de méthanol et sécher à nouveau.
Ajouter 200 µl de Tri-Sil et chauffer le tube bouché pendant 20 minutes.80°C, puis refroidi à température ambiante.Utilisez un collecteur de séchage pour sécher davantage l'échantillon jusqu'à un volume d'environ 50 µl.Il est important de noter que nous n'avons pas laissé les échantillons sécher complètement.
Ajouter 2 ml d'hexane et bien mélanger au vortex.Remplissez les pointes des pipettes Pasteur (5-8 mm) avec un morceau de laine de verre en insérant la laine de verre au-dessus d'une pipette de 5-3/4 pouces de diamètre.Les échantillons ont été centrifugés à 3000 g pendant 2 minutes.Tous les résidus insolubles sont précipités.Sécher l'échantillon à 100-150 µl.Un volume d'environ 1 μl a été injecté dans le GC-MS à une température initiale de 80 ° C et une durée initiale de 2, 0 minutes (tableau 2).