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Nouvelles méthodes immunologiques et de spectrométrie de masse pour l'analyse complexe des oligosaccharides persistants dans la paille de maïs prétraitée par AFEX. La biomasse lignocellulosique constitue une alternative durable aux combustibles fossiles et est largement utilisée pour le développement de biotechnologies destinées à la production d'aliments, d'aliments pour animaux, de biocarburants et de produits chimiques. La clé de ces technologies réside dans la mise au point de procédés compétitifs pour la conversion des glucides complexes présents dans les parois cellulaires végétales en sucres simples tels que le glucose, le xylose et l'arabinose. La biomasse lignocellulosique étant très résistante, elle doit être soumise à des traitements thermochimiques (par exemple, l'exfoliation des fibres à l'ammoniac (AFEX), les acides dilués (DA), les liquides ioniques (IL)) et biologiques (par exemple, l'hydrolyse enzymatique et la fermentation microbienne) combinés pour obtenir le produit désiré. Cependant, lorsque des enzymes fongiques commerciales sont utilisées dans le processus d'hydrolyse, seulement 75 à 85 % des sucres solubles formés sont des monosaccharides, les 15 à 25 % restants étant des oligosaccharides solubles et difficiles à hydrolyser, qui ne sont pas toujours accessibles aux micro-organismes. Précédemment, nous avons réussi à isoler et à purifier des oligosaccharides solubles récalcitrants en combinant la séparation sur carbone et terre de diatomées et la chromatographie d'exclusion stérique, et nous avons également étudié leurs propriétés inhibitrices enzymatiques. Nous avons constaté que les oligosaccharides présentant un degré de polymérisation (DP) élevé et des substitutions d'acide uronique méthylé sont plus difficiles à traiter avec des mélanges enzymatiques commerciaux que les oligosaccharides à faible DP et les oligosaccharides neutres. Nous présentons ici l'utilisation de plusieurs méthodes complémentaires, notamment le profilage des glycanes à l'aide d'anticorps monoclonaux (AcM) spécifiques des glycanes de la biomasse végétale pour caractériser les liaisons glycaniques dans les parois cellulaires végétales et les hydrolysats enzymatiques, ainsi que la spectrométrie de masse à temps de vol par désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF). La spectrométrie de masse MALDI-TOF (MALDI-TOF-MS) utilise des pics diagnostiques informatifs sur la structure, obtenus par spectroscopie après décroissance secondaire des ions négatifs, ainsi que par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), pour caractériser les liaisons oligosaccharidiques, avec ou sans dérivatisation. Du fait de leur petite taille (DP 4–20), les oligosaccharides sont difficiles à utiliser pour la liaison et la caractérisation des anticorps monoclonaux (mAb). Pour pallier cette difficulté, nous avons appliqué une nouvelle méthode d'immobilisation des oligosaccharides par conjugaison à la biotine. Cette méthode a permis de marquer avec succès la majorité des oligosaccharides solubles de faible DP sur la surface d'une microplaque, qui a ensuite été utilisée dans un système mAb à haut débit pour l'analyse de ligation spécifique. Cette nouvelle méthode facilitera le développement futur de tests glycomiques à haut débit plus performants, permettant d'isoler et de caractériser les oligosaccharides présents dans les biomarqueurs à des fins diagnostiques.
La biomasse lignocellulosique, composée de matières agricoles, forestières, herbacées et ligneuses, constitue une matière première potentielle pour la production de produits biosourcés, notamment des aliments pour animaux et adultes, des biocarburants et des précurseurs chimiques permettant la fabrication de produits à plus forte valeur ajoutée¹. Les glucides (tels que la cellulose et l'hémicellulose) présents dans les parois cellulaires végétales sont dépolymérisés en monosaccharides par traitement chimique et biotransformation (notamment par hydrolyse enzymatique et fermentation microbienne). Parmi les prétraitements courants, on peut citer l'expansion des fibres à l'ammoniac (AFEX), l'acide dilué (DA), les liquides ioniques (IL) et l'explosion à la vapeur (SE), qui utilisent une combinaison de produits chimiques et de chaleur pour réduire la production de lignocellulose en ouvrant les parois cellulaires végétales³,⁴. L'hydrolyse enzymatique est réalisée à forte concentration de matières solides à l'aide d'enzymes actives commerciales contenant des glucides (CAZymes), et la fermentation microbienne à l'aide de levures ou de bactéries transgéniques pour produire des biocarburants et des produits chimiques biosourcés⁶.
Les CAZymes présentes dans les enzymes commerciales sont composées d'un mélange complexe d'enzymes qui clivent de manière synergique les liaisons complexes glucides-sucres pour former des monosaccharides^2,7. Comme nous l'avons précédemment rapporté, le réseau complexe de polymères aromatiques de lignine associés aux glucides les rend très difficiles à traiter, ce qui entraîne une conversion incomplète des sucres et l'accumulation de 15 à 25 % d'oligosaccharides sériques non produits lors de l'hydrolyse enzymatique de la biomasse prétraitée. Ce problème est fréquent avec diverses méthodes de prétraitement de la biomasse. Parmi les causes de ce goulot d'étranglement figurent l'inhibition enzymatique pendant l'hydrolyse, ou l'absence ou la faible concentration d'enzymes essentielles nécessaires à la rupture des liaisons glucidiques dans la biomasse végétale. La compréhension de la composition et des caractéristiques structurales des sucres, notamment des liaisons glucidiques dans les oligosaccharides, permettra d'améliorer la conversion des sucres lors de l'hydrolyse et de rendre les procédés biotechnologiques compétitifs par rapport aux produits dérivés du pétrole.
La détermination de la structure des glucides est complexe et nécessite la combinaison de plusieurs méthodes, telles que la chromatographie liquide (CL)^11,12, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)¹³, l'électrophorèse capillaire (EC)^14,15,16 et la spectrométrie de masse (SM)^17,18. Les méthodes de SM, comme la spectrométrie de masse à temps de vol avec désorption et ionisation laser sur matrice (MALDI-TOF-MS), constituent une méthode polyvalente pour l'identification des structures glucidiques. Récemment, la spectrométrie de masse en tandem par dissociation induite par collisions (CID) des adduits d'ions sodium a été largement utilisée pour identifier les signatures spectrales correspondant aux positions de fixation des oligosaccharides, aux configurations anomériques, aux séquences et aux positions de ramification^20,21.
L'analyse des glycanes est un excellent outil pour l'identification approfondie des liaisons glucidiques²². Cette méthode utilise des anticorps monoclonaux (AcM) dirigés contre les glycanes de la paroi cellulaire végétale comme sondes pour comprendre les liaisons glucidiques complexes. Plus de 250 AcM sont disponibles dans le monde, conçus contre divers oligosaccharides linéaires et ramifiés à partir de différents saccharides²⁴. Plusieurs AcM ont été largement utilisés pour caractériser la structure, la composition et les modifications de la paroi cellulaire végétale, car il existe des différences significatives selon le type cellulaire, l'organe, l'âge, le stade de développement et l'environnement de croissance^25,26. Plus récemment, cette méthode a été utilisée pour comprendre les populations de vésicules dans les systèmes végétaux et animaux et leurs rôles respectifs dans le transport des glycanes, déterminés par des marqueurs subcellulaires, des stades de développement ou des stimuli environnementaux, ainsi que pour déterminer l'activité enzymatique. Certaines des différentes structures de glycanes et de xylanes qui ont été identifiées comprennent la pectine (P), le xylane (X), le mannane (M), les xyloglucanes (XylG), les glucanes à liaisons mixtes (MLG), l'arabinoxylane (ArbX), le galactomannane (GalG), l'acide glucuronique-arabinoxylane (GArbX) et l'arabino-galactane (ArbG)29.
Cependant, malgré tous ces efforts de recherche, seules quelques études se sont intéressées à la nature de l'accumulation des oligosaccharides lors de l'hydrolyse en milieu à forte charge solide (HSL), notamment la libération des oligosaccharides, les variations de longueur des chaînes oligomériques au cours de l'hydrolyse, divers polymères à faible degré de polymérisation (DP) et leurs courbes de distribution^30,31,32. Par ailleurs, bien que l'analyse des glycanes se soit révélée un outil précieux pour une analyse complète de leur structure, l'évaluation des oligosaccharides hydrosolubles à faible DP par des méthodes immunohistochimiques s'avère complexe. Les oligosaccharides de faible DP, dont la masse moléculaire est inférieure à 5-10 kDa, ne se lient pas aux plaques ELISA^33,34 et sont éliminés par lavage avant l'ajout des anticorps.
Nous présentons ici, pour la première fois, un test ELISA sur plaques recouvertes d'avidine utilisant des anticorps monoclonaux, combinant une biotinylation en une étape d'oligosaccharides réfractaires solubles et l'analyse du glycome. Notre approche d'analyse du glycome a été validée par MALDI-TOF-MS et GC-MS, grâce à l'analyse des liaisons oligosaccharidiques complémentaires par dérivatisation triméthylsilylée (TMS) des sucres hydrolysés. Cette approche innovante pourrait être développée en méthode à haut débit et trouver de nombreuses applications en recherche biomédicale³⁵.
Les modifications post-traductionnelles des enzymes et des anticorps, telles que la glycosylation³⁶, influencent leur activité biologique. Par exemple, les modifications de la glycosylation des protéines sériques jouent un rôle important dans les arthrites inflammatoires et sont utilisées comme marqueurs diagnostiques³⁷. Divers glycanes sont fréquemment retrouvés dans de nombreuses maladies, notamment les maladies inflammatoires chroniques du tube digestif et du foie, les infections virales, ainsi que les cancers de l'ovaire, du sein et de la prostate^38,39,40. La caractérisation de la structure des glycanes par des méthodes ELISA basées sur des anticorps permettra d'améliorer la fiabilité du diagnostic sans recourir à des techniques de spectrométrie de masse complexes.
Notre étude précédente a montré que des oligosaccharides récalcitrants restaient non hydrolysés après prétraitement et hydrolyse enzymatique (Figure 1). Dans nos travaux antérieurs, nous avons développé une méthode d'extraction en phase solide sur charbon actif pour isoler les oligosaccharides de l'hydrolysat de résidus de maïs prétraité par AFEX (ACSH)⁸. Après une première extraction et séparation, les oligosaccharides ont été fractionnés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) et collectés par ordre de masse moléculaire. Les monomères et oligomères de sucres libérés par les différents prétraitements ont été analysés par analyse de la composition en sucres. La présence d'oligomères de sucres, observée lors de la comparaison des teneurs obtenues par différentes méthodes de prétraitement, révèle que la présence d'oligosaccharides récalcitrants constitue un problème courant dans la conversion de la biomasse en monosaccharides et peut entraîner une réduction du rendement en sucres d'au moins 10 à 15 %, voire jusqu'à 18 %. Cette méthode est utilisée pour la production à grande échelle de fractions d'oligosaccharides. L'ACSH obtenu et ses fractions de différentes masses moléculaires ont servi de matériel expérimental pour la caractérisation des oligosaccharides dans cette étude.
Après prétraitement et hydrolyse enzymatique, les oligosaccharides persistants sont restés non hydrolysés. La figure (A) présente une méthode de séparation des oligosaccharides, isolés à partir d'un hydrolysat de résidus de maïs prétraité par AFEX (ACSH) à l'aide d'un lit garni de charbon actif et de terre de diatomées. La figure (B) décrit la méthode de séparation des oligosaccharides, qui ont ensuite été séparés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC). La figure (C) présente les monomères et oligomères de saccharides libérés après différents prétraitements (acide dilué : DA, liquide ionique : IL et AFEX). Les conditions d'hydrolyse enzymatique étaient les suivantes : forte concentration en solides de 25 % (m/m), soit environ 8 % de glucanes, durée d'hydrolyse de 96 heures et concentration enzymatique commerciale de 20 mg/g (ratio Ctec2:Htec2:MP-2:1:1). La figure (D) présente les monomères et oligomères de glucose, de xylose et d'arabinose libérés à partir de résidus de maïs prétraités par AFEX (ACS).
L'analyse des glycanes s'est révélée un outil précieux pour l'analyse structurale complète des glycanes dans les extraits de résidus de biomasse solide. Cependant, les saccharides hydrosolubles sont sous-représentés par cette méthode traditionnelle⁴¹ car les oligosaccharides de faible masse moléculaire sont difficiles à immobiliser sur les plaques ELISA et sont éliminés par lavage avant l'ajout des anticorps. Par conséquent, pour la liaison et la caractérisation des anticorps, une méthode de biotinylation en une étape a été utilisée pour fixer les oligosaccharides solubles et non conformables sur des plaques ELISA recouvertes d'avidine. Cette méthode a été testée avec notre ACSH précédemment produit et une fraction triée en fonction de sa masse moléculaire (ou de son degré de polymérisation, DP). La biotinylation en une étape a permis d'accroître l'affinité de liaison des oligosaccharides par l'ajout de biotine-LC-hydrazide à l'extrémité réductrice du glucide (Fig. 2). En solution, le groupe hémiacétal à l'extrémité réductrice réagit avec le groupe hydrazide de la biotine-LC-hydrazide pour former une liaison hydrazone. En présence de l'agent réducteur NaCNBH3, la liaison hydrazone est réduite en un produit final biotinylé stable. Grâce à la modification de l'extrémité réductrice du sucre, la fixation d'oligosaccharides à faible degré de polymérisation (DP) sur des plaques ELISA est devenue possible ; dans notre étude, cette fixation a été réalisée sur des plaques recouvertes d'avidine à l'aide d'anticorps monoclonaux (mAbs) ciblant les glycanes.
Criblage d'anticorps monoclonaux par ELISA pour les oligosaccharides biotinylés. (A) Biotinylation combinée des oligosaccharides et criblage ELISA subséquent avec des anticorps monoclonaux ciblant les glycanes sur plaques recouvertes de NeutrAvidine ; (B) Procédure en une étape pour la biotinylation des produits de réaction.
Des plaques recouvertes d'avidine et d'anticorps conjugués à des oligosaccharides ont ensuite été incubées avec des anticorps primaires et secondaires, puis lavées dans un milieu photosensible et sensible au temps. Après fixation complète des anticorps, le substrat TMB a été ajouté pour incuber la plaque. La réaction a finalement été stoppée par l'ajout d'acide sulfurique. Les plaques incubées ont été analysées à l'aide d'un lecteur ELISA afin de déterminer l'affinité de chaque anticorps et de détecter la réticulation spécifique des anticorps. Pour plus de détails et les paramètres de l'expérience, veuillez consulter la section « Matériels et méthodes ».
Nous démontrons l'utilité de cette nouvelle méthode pour des applications spécifiques en caractérisant les oligosaccharides solubles présents dans l'ACSH, ainsi que dans les fractions oligosaccharidiques brutes et purifiées isolées d'hydrolysats lignocellulosiques. Comme illustré sur la figure 3, les xylanes à substitution épitopique les plus fréquemment identifiés dans l'ACSH par des méthodes d'analyse du glycome bioacylé sont généralement des arabinogalactanes uroniques (U) ou méthyluroniques (MeU) et pectiques. La plupart d'entre eux avaient également été retrouvés dans notre étude précédente sur l'analyse des glycanes de solides non hydrolysés (UHS)⁴³.
Détection d'épitopes oligosaccharidiques récalcitrants à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre le glycanne de la paroi cellulaire. La fraction « neutre » correspond à la fraction ACN et la fraction « acide » à la fraction FA. Sur la carte thermique, les rouges plus vifs indiquent une forte concentration d'épitopes, tandis que les bleus plus vifs correspondent à un fond vierge. Les valeurs de couleur sont basées sur les valeurs de DO brutes pour les formulations N = 2. Les principaux épitopes reconnus par les anticorps sont indiqués à droite.
Ces structures non cellulosiques n'ont pas pu être clivées par les cellulases et hémicellulases les plus courantes présentes dans le mélange enzymatique commercial testé, qui comprend les enzymes commerciales les plus fréquemment utilisées. Par conséquent, de nouvelles enzymes auxiliaires sont nécessaires à leur hydrolyse. Sans ces enzymes accessoires non cellulosiques, ces liaisons non cellulosiques empêchent leur conversion complète en monosaccharides, même si leurs polymères de sucres initiaux sont fortement hydrolysés en fragments plus courts et dissous par les mélanges enzymatiques commerciaux.
L'étude approfondie de la distribution du signal et de son affinité de liaison a révélé que les épitopes de liaison étaient moins abondants dans les fractions de sucres à haut degré de polymérisation (DP) (A, B, C, DP jusqu'à 20+) que dans les fractions à faible DP (D, E, F, DP) (dans les dimères) (Fig. 1). Les fragments acides sont plus fréquents que les fragments neutres dans les épitopes non cellulosiques. Ces observations concordent avec les résultats de notre étude précédente, où les groupements à DP élevé et acides étaient plus résistants à l'hydrolyse enzymatique. Par conséquent, la présence d'épitopes glycaniques non cellulosiques et de substitutions U et MeU peut contribuer significativement à la stabilité des oligosaccharides. Il convient de noter que l'efficacité de liaison et de détection peut être problématique pour les oligosaccharides à faible DP, notamment si l'épitope est un oligosaccharide dimère ou trimère. Ce point peut être vérifié à l'aide d'oligosaccharides commerciaux de différentes longueurs, chacun contenant un seul épitope se liant à un anticorps monoclonal spécifique.
Ainsi, l'utilisation d'anticorps spécifiques de structure a révélé certains types de liaisons récalcitrantes. Selon le type d'anticorps utilisé, le motif de ligation approprié et l'intensité du signal produit (le plus ou le moins abondant), de nouvelles enzymes peuvent être identifiées et ajoutées semi-quantitativement au mélange enzymatique pour une glycoconversion plus complète. En prenant l'analyse des oligosaccharides ACSH comme exemple, nous pouvons créer une base de données des liaisons glycaniques pour chaque biomasse. Il convient de noter que l'affinité variable des anticorps doit être prise en compte et que, si elle est inconnue, la comparaison des signaux de différents anticorps peut s'avérer complexe. De plus, la comparaison des liaisons glycaniques est souvent plus pertinente entre échantillons utilisant le même anticorps. Ces liaisons récalcitrantes peuvent ensuite être intégrées à la base de données CAZyme, permettant d'identifier des enzymes, de sélectionner des enzymes candidates et de rechercher des enzymes capables de rompre les liaisons, ou encore de développer des systèmes microbiens pour exprimer ces enzymes en vue de leur utilisation dans les bioraffineries⁴⁴.
Afin d'évaluer la complémentarité des méthodes immunologiques et alternatives pour la caractérisation des oligosaccharides de faible masse moléculaire présents dans les hydrolysats lignocellulosiques, nous avons réalisé une analyse MALDI (Fig. 4, S1-S8) et une analyse des saccharides dérivés du TMS par GC-MS sur le même panel d'oligosaccharides (Fig. 5). La MALDI permet de vérifier si la distribution de masse des molécules d'oligosaccharides correspond à la structure attendue. La figure 4 présente la distribution de masse des composants neutres ACN-A et ACN-B. L'analyse d'ACN-A a confirmé la présence de pentoses de degré de polymérisation (DP) allant de 4 à 8 (Fig. 4) à DP 22 (Fig. S1), dont les masses correspondent à celles des oligosaccharides de MeU-xylane. L'analyse d'ACN-B a confirmé la présence de pentoses et de glucoxylanes de DP 8 à 15. Dans les documents complémentaires, comme la figure S3, les cartes de distribution de masse des groupements acides FA-C montrent une gamme de pentoses substitués par (Me)U avec un degré de polymérisation (DP) de 8 à 15, compatibles avec les xylanes substitués identifiés lors du criblage d'anticorps monoclonaux par ELISA. Les épitopes sont cohérents.
Spectre MALDI-MS des oligosaccharides solubles non conformes présents dans l'ACS. Ici, (A) fractions de faible poids moléculaire ACN-A contenant des oligosaccharides de glucuroxylane substitués par de l'acide uronique méthylé (DP 4-8) et (B) xylane ACN-B et oligosaccharides d'acide uronique méthylé substitués par du glucuroxylane (DP 8-15).
Analyse de la composition des résidus glycaniques d'oligosaccharides réfractaires. (A) Composition en saccharides TMS de différentes fractions d'oligosaccharides obtenues par analyse GC-MS. (B) Structures des différents sucres dérivés du TMS présents dans les oligosaccharides. ACN : fraction acétonitrile contenant des oligosaccharides neutres ; FA : fraction acide férulique contenant des oligosaccharides acides.
Une autre conclusion intéressante a été tirée de l'analyse LC-MS de la fraction oligosaccharidique, comme illustré dans la figure S9 (les méthodes sont décrites dans les données supplémentaires en ligne). Des fragments d'hexoses et de groupes -OAc ont été observés de manière répétée lors de la ligation de la fraction ACN-B. Ce résultat confirme non seulement la fragmentation observée lors des analyses du glycome et MALDI-TOF, mais apporte également de nouvelles informations sur les dérivés glucidiques potentiels présents dans la biomasse lignocellulosique prétraitée.
Nous avons également analysé la composition en sucres de la fraction oligosaccharidique par dérivatisation TMS. Par GC-MS, nous avons déterminé la composition en sucres neutres (non dérivés) et en sucres acides (GluA et GalA) de cette fraction (Fig. 5). L'acide glucuronique est présent dans les composants acides C et D, tandis que l'acide galacturonique est présent dans les composants acides A et B, tous deux étant des composants à haut degré de polymérisation (DP) des sucres acides. Ces résultats confirment non seulement nos données ELISA et MALDI, mais sont également cohérents avec nos études précédentes sur l'accumulation d'oligosaccharides. Par conséquent, nous estimons que les méthodes immunologiques modernes utilisant la biotinylation des oligosaccharides et le criblage ELISA subséquent sont suffisantes pour détecter les oligosaccharides solubles récalcitrants dans divers échantillons biologiques.
Les méthodes de criblage d'anticorps monoclonaux (AcM) basées sur la technique ELISA ayant été validées par plusieurs approches différentes, nous avons souhaité explorer plus avant le potentiel de cette nouvelle méthode quantitative. Deux oligosaccharides commerciaux, le xylohexasaccharide (XHE) et le 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ont été achetés et testés à l'aide d'une nouvelle approche par AcM ciblant les glycanes de la paroi cellulaire. La figure 6 montre une corrélation linéaire entre le signal de liaison biotinylé et le logarithme de la concentration d'oligosaccharide, suggérant un modèle d'adsorption de Langmuir. Parmi les AcM testés, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 et CCRC-M151 étaient corrélés au XHE, et CCRC-M108, CCRC-M109 et LM11 à l'A2XX, sur une gamme de concentrations allant de 1 nm à 100 nM. En raison de la disponibilité limitée des anticorps durant l'expérience, le nombre d'expériences réalisées pour chaque concentration d'oligosaccharide était limité. Il convient de noter ici que certains anticorps réagissent très différemment à un même oligosaccharide utilisé comme substrat, probablement parce qu'ils se lient à des épitopes légèrement différents et peuvent présenter des affinités de liaison très variables. Les mécanismes et les implications d'une identification précise des épitopes seront bien plus complexes lorsque la nouvelle approche par anticorps monoclonaux sera appliquée à des échantillons réels.
Deux oligosaccharides commerciaux ont été utilisés pour déterminer la plage de détection de différents anticorps monoclonaux (AcM) ciblant les glycanes. Les corrélations linéaires avec le logarithme de la concentration en oligosaccharide indiquent les profils d'adsorption de Langmuir pour (A) XHE avec l'AcM et (B) A2XX avec l'AcM. Les épitopes correspondants indiquent les structures des oligosaccharides commerciaux utilisés comme substrats dans le test.
L'utilisation d'anticorps monoclonaux ciblant les glycanes (analyse glycocomique ou criblage par anticorps monoclonaux par ELISA) est un outil puissant pour la caractérisation approfondie de la plupart des glycanes majeurs de la paroi cellulaire constituant la biomasse végétale. Cependant, l'analyse classique des glycanes ne caractérise que les glycanes de grande taille, car la plupart des oligosaccharides ne sont pas efficacement immobilisés sur les plaques ELISA. Dans cette étude, des résidus de maïs prétraités par AFEX ont été hydrolysés par voie enzymatique à forte teneur en matières sèches. L'analyse des sucres a permis de déterminer la composition des glucides récalcitrants de la paroi cellulaire dans l'hydrolysat. Toutefois, l'analyse par anticorps monoclonaux des oligosaccharides de petite taille dans les hydrolysats est sous-estimée, et des outils supplémentaires sont nécessaires pour immobiliser efficacement les oligosaccharides sur les plaques ELISA.
Nous présentons ici une méthode d'immobilisation d'oligosaccharides inédite et efficace pour le criblage d'anticorps monoclonaux (mAb), combinant la biotinylation d'oligosaccharides suivie d'un criblage ELISA sur plaques revêtues de NeutrAvidin™. Les oligosaccharides biotinylés immobilisés présentent une affinité suffisante pour l'anticorps, permettant une détection rapide et efficace d'oligosaccharides récalcitrants. L'analyse de la composition de ces oligosaccharides par spectrométrie de masse a confirmé les résultats de cette nouvelle approche d'immunocriblage. Ces travaux démontrent ainsi que la combinaison de la biotinylation d'oligosaccharides et du criblage ELISA avec des anticorps monoclonaux ciblant les glycanes peut être utilisée pour détecter les pontages dans les oligosaccharides et trouver de nombreuses applications dans d'autres études biochimiques caractérisant la structure des oligosaccharides.
Cette méthode de profilage des glycanes basée sur la biotinylation est la première à permettre l'étude des liaisons glucidiques récalcitrantes des oligosaccharides solubles dans la biomasse végétale. Elle contribue à comprendre pourquoi certaines parties de la biomasse sont si difficiles à convertir en biocarburants. Cette méthode comble une lacune importante dans les méthodes d'analyse du glycome et étend son application à une gamme plus large de substrats, au-delà des oligosaccharides végétaux. À l'avenir, nous pourrions utiliser la robotique pour la biotinylation et appliquer la méthode développée à l'analyse à haut débit d'échantillons par ELISA.
De la paille de maïs (PM) issue de semences hybrides Pioneer 33A14 a été récoltée en 2010 à la ferme Kramer de Ray, dans le Colorado. Avec l'autorisation du propriétaire, cette biomasse peut être utilisée à des fins de recherche. Les échantillons ont été conservés à sec (< 6 % d'humidité) dans des sacs à fermeture zip à température ambiante. Les échantillons ont été conservés à sec (< 6 % d'humidité) dans des sacs à fermeture zip à température ambiante. Les aliments peuvent contenir des aliments < 6 % dans des emballages à température ambiante. Les échantillons ont été conservés au sec, à une humidité inférieure à 6 %, dans des sacs à fermeture éclair à température ambiante.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% La température ambiante des paquets est inférieure à 6 %. Les échantillons sont conservés dans des sachets à fermeture éclair à température ambiante avec un taux d'humidité inférieur à 6 %.L'étude a respecté les directives locales et nationales. L'analyse de la composition a été réalisée selon le protocole NREL. La composition s'est avérée contenir 31,4 % de glucane, 18,7 % de xylane, 3,3 % d'arabinane, 1,2 % de galactane, 2,2 % d'acétyle, 14,3 % de lignine, 1,7 % de protéines et 13,4 % de cendres.
Cellic® CTec2 (138 mg de protéines/ml, lot VCNI 0001) est un mélange complexe de cellulase et de β-glucosidase. Cellic® HTec2 (157 mg de protéines/ml, lot VHN00001) provient de Novozymes (Franklinton, Caroline du Nord, États-Unis). La Multifect Pectinase® (72 mg de protéines/ml), un mélange complexe d'enzymes dégradant la pectine, a été fournie par DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, Californie, États-Unis). Les concentrations protéiques des enzymes ont été déterminées par estimation de la teneur en protéines (après soustraction de la contribution de l'azote non protéique) à l'aide de la méthode Kjeldahl (méthode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, New York, États-Unis). La terre de diatomées 545 a été achetée chez EMD Millipore (Billerica, Massachusetts, États-Unis). Le charbon actif (DARCO, granules de 100 mesh), l'Avicel (PH-101), le xylane de hêtre et tous les autres produits chimiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Le prétraitement AFEX a été réalisé au GLBRC (Laboratoire de recherche sur la conversion de la biomasse, MSU, Lansing, MI, États-Unis). Ce prétraitement a été effectué à 140 °C pendant 15 minutes, avec un temps de séjour de 46 minutes et un rapport ammoniac anhydre/biomasse de 1:1, à une charge de 60 % (m/m), dans un réacteur discontinu de paillasse en acier inoxydable (Parr Instruments Company). La réaction a duré 30 minutes. Le réacteur a ensuite été porté à 140 °C et l'ammoniac a été rapidement libéré, permettant à la biomasse de revenir rapidement à température ambiante. La composition de la paille de maïs prétraitée AFEX (ACS) était similaire à celle de la paille de maïs non traitée (UT-CS).
Un ACSH à haute teneur en solides (25 % p/p, soit environ 8 % de dextrane) a été préparé comme matière première pour la production à grande échelle d'oligosaccharides. L'hydrolyse enzymatique de l'ACSH a été réalisée à l'aide d'un mélange enzymatique commercial comprenant Cellic® Ctec2 (10 mg de protéines/g de glucane, dans la biomasse prétraitée), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC, 5 mg de protéines/g de glucane) et Multifect Pectinase (Genencor Inc, États-Unis). L'hydrolyse enzymatique a été effectuée dans un bioréacteur de 5 litres (volume utile de 3 litres), à pH 4,8, à 50 °C et à 250 tr/min. Après 96 heures d'hydrolyse, l'hydrolysat a été recueilli par centrifugation à 6 000 tr/min pendant 30 minutes, puis à 14 000 tr/min pendant 30 minutes afin d'éliminer les solides non hydrolysés. L'hydrolysat a ensuite été soumis à une filtration stérile à travers un bécher filtrant de 0,22 µm. L'hydrolysat filtré a été conservé dans des flacons stériles à 4 °C, puis fractionné sur charbon actif.
Analyse de la composition d'échantillons de biomasse à base d'extrait selon les procédures d'analyse de laboratoire du NREL : préparation des échantillons pour l'analyse de la composition (NREL/TP-510-42620) et détermination des glucides structuraux et de la lignine dans la biomasse (NREL/TP-510 – 42618)47.
L'analyse des oligosaccharides de l'hydrolysat a été réalisée sur un volume de 2 ml par hydrolyse acide en autoclave. L'échantillon d'hydrolysat a été mélangé à 69,7 µl d'acide sulfurique à 72 % dans un tube à culture de 10 ml à bouchon vissé, puis incubé pendant 1 h à 121 °C à température ambiante. Après refroidissement sur glace, la solution a été filtrée dans un flacon pour chromatographie liquide haute performance (HPLC). La concentration en oligosaccharides a été déterminée en soustrayant la concentration en monosaccharides de l'échantillon non hydrolysé de la concentration totale en sucres de l'échantillon hydrolysé.
Les concentrations de glucose, de xylose et d'arabinose dans la biomasse hydrolysée en milieu acide ont été analysées par HPLC (système Shimadzu) sur une colonne Bio-Rad Aminex HPX-87H. Cette colonne était équipée d'un passeur d'échantillons automatique, d'un four à colonne, d'une pompe isocratique et d'un détecteur d'indice de réfraction. La température de la colonne était maintenue à 50 °C et l'élution était réalisée avec un débit de 0,6 ml/min d'une solution aqueuse d'acide sulfurique 5 mM.
Le surnageant d'hydrolysat a été dilué et analysé pour déterminer sa teneur en monomères et en oligosaccharides. Les sucres monomères obtenus après hydrolyse enzymatique ont été analysés par HPLC à l'aide d'une colonne Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P et d'une colonne de garde. La température de la colonne a été maintenue à 80 °C et l'eau a été utilisée comme phase mobile avec un débit de 0,6 ml/min. Les oligosaccharides ont été dosés par hydrolyse en milieu acide dilué à 121 °C selon les méthodes décrites dans les références 41, 48 et 49.
L'analyse des saccharides a été réalisée sur les résidus de biomasse bruts, prétraités par AFEX et non hydrolysés (incluant la production d'extraits de parois cellulaires en série et leur criblage par anticorps monoclonaux) selon les procédures décrites précédemment^{27, 43, 50, 51}. Pour l'analyse du glycome, les résidus insolubles dans l'alcool de parois cellulaires végétales ont été préparés à partir des résidus de biomasse et soumis à une extraction en série avec des réactifs de plus en plus agressifs, tels que l'oxalate d'ammonium (50 mM), le carbonate de sodium (50 mM et 0,5 % p/v), CON (1 M et 4 M, contenant tous deux 1 % p/v de borohydrure de sodium) et le chlorite acide, comme décrit précédemment^{52, 53}. Les extraits ont ensuite été analysés par ELISA contre un panel complexe d'anticorps monoclonaux de 50 nucléotides dirigés contre les glycanes de la paroi cellulaire, et les réactions de liaison des anticorps monoclonaux ont été représentées sous forme de carte thermique. Les anticorps monoclonaux ciblant les glycanes de la paroi cellulaire végétale ont été achetés auprès de banques de laboratoire (séries CCRC, JIM et MAC).
Biotinylation en une étape d'oligosaccharides. La conjugaison des glucides avec la biotine-LC-hydrazide a été réalisée selon le protocole suivant. La biotine-LC-hydrazide (4,6 mg/12 µmol) a été dissoute dans du diméthylsulfoxyde (DMSO, 70 µl) sous agitation vigoureuse et chauffage à 65 °C pendant 1 min. De l'acide acétique glacial (30 µl) a été ajouté, et le mélange a été versé sur du cyanoborohydrure de sodium (6,4 mg/100 µmol) et dissous complètement après chauffage à 65 °C pendant environ 1 min. Ensuite, 5 à 8 µl du mélange réactionnel ont été ajoutés à l'oligosaccharide sec (1 à 100 nmol) afin d'obtenir un excès molaire de marqueur d'au moins 10 fois par rapport à l'extrémité réductrice. La réaction a été conduite à 65 °C pendant 2 h, après quoi les échantillons ont été immédiatement purifiés. Aucun cyanoborohydrure de sodium n'a été utilisé dans les expériences de marquage sans réduction, et les échantillons ont réagi à 65°C pendant 2,5 heures.
Préparation et lavage des échantillons d'oligosaccharides biotinylés pour ELISA. 25 μl d'échantillons biotinylés (100 μl de chaque échantillon concentré dilués dans 5 ml de tampon Tris 0,1 M (TBS)) ont été ajoutés dans chaque puits de la plaque recouverte d'avidine. Les puits témoins ont été recouverts de 50 μl de biotine à une concentration de 10 μg/ml dans du TBS 0,1 M. De l'eau déminéralisée a été utilisée comme revêtement pour les mesures à blanc. La plaque a été incubée pendant 2 heures à température ambiante et à l'obscurité. La plaque a été lavée 3 fois avec du lait écrémé à 0,1 % dans du TBS 0,1 M en utilisant le programme n° 11 pour la plaque Grenier 3A.
Ajout et lavage des anticorps primaires. Ajouter 40 µl d'anticorps primaire dans chaque puits. Incuber la microplaque pendant 1 heure à température ambiante et à l'obscurité. Laver ensuite les plaques 3 fois avec du lait à 0,1 % dans du tampon TBS 0,1 M, en utilisant le programme de lavage n° 11 pour Grenier Flat 3A.
Ajouter l'anticorps secondaire et laver. Ajouter 50 µl d'anticorps secondaire de souris/rat (dilué à 1:5000 dans du lait à 0,1 % dans du tampon TBS 0,1 M) dans chaque puits. Incuber la microplaque pendant 1 heure à température ambiante et à l'obscurité. Laver ensuite les microplaques 5 fois avec du lait à 0,1 % dans du tampon TBS 0,1 M en utilisant le programme de lavage n° 12 du système Grenier Flat 5A.
Ajout du substrat. Ajouter 50 µl de 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) au substrat de base (préparé en ajoutant 2 gouttes de tampon, 3 gouttes de TMB et 2 gouttes de peroxyde d'hydrogène à 15 ml d'eau déminéralisée). Préparer le substrat TMB et vortexer avant utilisation. Incuber la microplaque à température ambiante pendant 30 minutes, à l'abri de la lumière.
Terminez l'étape et lisez le contenu du comprimé. Ajoutez 50 µl d'acide sulfurique 1 N dans chaque puits et enregistrez l'absorbance de 450 à 655 nm à l'aide d'un lecteur ELISA.
Préparer des solutions à 1 mg/mL de ces analytes dans de l'eau déminéralisée : arabinose, rhamnose, fucose, xylose, acide galacturonique (GalA), acide glucuronique (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acétylmannosamine (manNAc), N-acétylglucosamine (glcNAc), N-acétylgalactosamine (galNAc), inositol (étalon interne). Deux solutions étalons ont été préparées par ajout des solutions de sucres à 1 mg/mL indiquées dans le tableau 1. Les échantillons sont congelés puis lyophilisés à -80 °C jusqu'à élimination complète de l'eau (généralement 12 à 18 heures).
Ajouter 100 à 500 µg d'échantillon dans des tubes à vis placés sur une balance analytique. Noter la quantité ajoutée. Il est préférable de dissoudre l'échantillon dans un solvant de concentration spécifique et de l'ajouter au tube sous forme d'aliquote liquide. Utiliser 20 µl d'inositol à 1 mg/ml comme étalon interne pour chaque tube contenant l'échantillon. La quantité d'étalon interne ajoutée à l'échantillon doit être identique à celle ajoutée au tube contenant l'étalon.
Introduire 8 ml de méthanol anhydre dans un flacon à bouchon à vis. Ajouter ensuite 4 ml de solution méthanolique d'HCl 3 N, refermer le flacon et agiter. Ce procédé ne nécessite pas d'eau.
Ajouter 500 µl d'une solution de méthanol à 1 M de HCl aux échantillons d'oligosaccharides et aux tubes TMS standard. Incuber les échantillons pendant une nuit (168 heures) à 80 °C dans un bloc thermique. Sécher le produit de méthanolyse à température ambiante à l'aide d'un évaporateur. Ajouter 200 µl de méthanol et sécher à nouveau. Répéter cette opération deux fois. Ajouter 200 µl de méthanol, 100 µl de pyridine et 100 µl d'anhydride acétique à l'échantillon et bien mélanger. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes, puis les sécher. Ajouter 200 µl de méthanol et sécher une dernière fois.
Ajouter 200 µl de Tri-Sil et chauffer le tube fermé par un bouchon à 80 °C pendant 20 minutes, puis laisser refroidir à température ambiante. Utiliser un collecteur de séchage pour réduire le volume de l'échantillon à environ 50 µl. Il est important de noter que les échantillons n'ont pas été laissés sécher complètement.
Ajouter 2 ml d'hexane et bien mélanger par vortexage. Remplir l'extrémité des pipettes Pasteur (5-8 mm) avec un morceau de laine de verre en l'insérant sur le dessus d'une pipette de 14,6 cm de diamètre. Centrifuger les échantillons à 3000 g pendant 2 minutes. Tout résidu insoluble précipite. Sécher l'échantillon jusqu'à un volume de 100-150 µl. Un volume d'environ 1 µl a été injecté dans le GC-MS à une température initiale de 80 °C et pendant une durée initiale de 2,0 minutes (Tableau 2).