Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydi.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScript-ni ishlatmasdan taqdim etamiz.
AFEX bilan oldindan ishlangan makkajo'xori pechkasidagi turg'un oligosakkaridlarni kompleks tahlil qilish uchun yangi immunologik va mass-spektrometrik usullar.Lignoselülozik biomassa fotoalbom yoqilg'ilarga barqaror alternativ hisoblanadi va oziq-ovqat, ozuqa, yoqilg'i va kimyoviy moddalar kabi mahsulotlarni ishlab chiqarish uchun biotexnologiyalarni ishlab chiqishda keng qo'llaniladi.Ushbu texnologiyalarning kaliti o'simlik hujayralari devorlarida mavjud bo'lgan murakkab uglevodlarni glyukoza, ksiloza va arabinoza kabi oddiy shakarlarga aylantirish uchun raqobatbardosh jarayonlarni ishlab chiqishdir.Lignoselülozik biomassa juda o'jar bo'lganligi sababli, kerakli mahsulotni olish uchun termokimyoviy ishlov berish (masalan, ammiak tolasi eksfoliatsiyasi (AFEX), suyultirilgan kislotalar (DA), ion suyuqliklar (IL)) va biologik davolash (masalan, fermentativ gidroliz va mikrobial fermentatsiya) bilan birgalikda amalga oshirilishi kerak..Biroq, gidroliz jarayonida tijoriy qo'ziqorin fermentlaridan foydalanilganda, hosil bo'lgan eruvchan qandlarning atigi 75-85% monosaxaridlar, qolgan 15-25% esa mikroorganizmlar uchun har doim ham mavjud bo'lmagan eriydigan, chidab bo'lmaydigan oligosaxaridlardir.Ilgari biz eruvchan o'jar oligosakkaridlarni uglerod va diatomli tuproqni ajratish va o'lchamni istisno qilish xromatografiyasining kombinatsiyasidan foydalangan holda muvaffaqiyatli ajratib oldik va tozaladik, shuningdek, ularning ferment inhibitiv xususiyatlarini o'rgandik.Biz yuqori darajada polimerizatsiya (DP) metillangan uron kislotasini almashtirishni o'z ichiga olgan oligosakkaridlarni past DP va neytral oligosakkaridlarga qaraganda tijorat fermenti aralashmalari bilan qayta ishlash qiyinroq ekanligini aniqladik.Bu erda biz bir nechta qo'shimcha usullardan foydalanish haqida xabar beramiz, shu jumladan o'simlik hujayralari devorlari va fermentativ gidrolizatlardagi glikan bog'lanishlarini tavsiflash uchun o'simlik biomassa glikanlariga xos monoklonal antikorlar (mAbs) yordamida glikan profilini aniqlash, matritsa yordamida lazer desorbtsiyasini ionlash, parvoz vaqtining massa-spektrometriyasi..MALDI-TOF-MS) manfiy ionlarning ikkilamchi yemirilishidan so'ng spektroskopiya yo'li bilan olingan strukturaviy-informatsion diagnostika cho'qqilaridan, gaz xromatografiyasi va massa spektrometriyasidan (GC-MS) oligosakkarid bog'lanishlarini derivatizatsiya bilan va hosil bo'lmagan holda tavsiflash uchun foydalanadi.Oligosakkaridlarning kichik o'lchamlari (DP 4-20) tufayli bu molekulalarni mAb bog'lash va tavsiflash uchun ishlatish qiyin.Ushbu muammoni bartaraf etish uchun biz biotin konjugatsiyasiga asoslangan oligosakkaridlarni immobilizatsiya qilishning yangi usulini qo'lladik, u mikroplastinka yuzasida past DP eriydigan oligosakkaridlarning ko'pchiligini muvaffaqiyatli belgiladi, keyinchalik u maxsus ligatsiya tahlili uchun yuqori o'tkazuvchanlik mAb tizimida ishlatilgan.Ushbu yangi usul kelajakda diagnostika maqsadlarida biomarkerlarda mavjud bo'lgan oligosakkaridlarni ajratish va tavsiflash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan yanada rivojlangan yuqori o'tkazuvchanlik glikom tahlillarini ishlab chiqishga yordam beradi.
Qishloq xo'jaligi, o'rmon xo'jaligi, o't va yog'ochli materiallardan tashkil topgan lignoselülozik biomassa bio-asosli mahsulotlar, shu jumladan oziq-ovqat, ozuqa, yoqilg'i va yuqori qiymatli mahsulotlarni ishlab chiqarish uchun kimyoviy prekursorlarni ishlab chiqarish uchun potentsial xom ashyo hisoblanadi.O'simlik hujayralari devorlarida mavjud bo'lgan uglevodlar (tsellyuloza va gemitsellyuloza kabi) kimyoviy ishlov berish va biotransformatsiya (masalan, fermentativ gidroliz va mikrobial fermentatsiya) orqali monosaxaridlarga depolimerlanadi.Umumiy dastlabki muolajalar ammiak tolasini kengaytirish (AFEX), suyultirilgan kislota (DA), ionli suyuqlik (IL) va bug 'portlashini (SE) o'z ichiga oladi, ular o'simlik hujayra devorlarini ochish orqali lignoselüloz ishlab chiqarishni kamaytirish uchun kimyoviy moddalar va issiqlik kombinatsiyasidan foydalanadilar3,4.materiyaning o'jarligi, 5. Enzimatik gidroliz tijorat faol uglevod o'z ichiga olgan fermentlar (CAZymes) va bio-asoslangan yoqilg'i va kimyoviy moddalar ishlab chiqarish uchun transgenik xamirturush yoki bakteriyalar yordamida mikrobial fermentatsiya yordamida yuqori qattiq yuk amalga oshiriladi 6 .
Tijorat fermentlaridagi CAZimlar monosaxaridlarni hosil qilish uchun murakkab uglevod-shakar bog'larini sinergetik ravishda parchalaydigan fermentlarning murakkab aralashmasidan iborat2,7.Avval xabar qilganimizdek, ligninning uglevodlar bilan aromatik polimerlarining murakkab tarmog'i ularni juda chidab bo'lmas holga keltiradi, bu esa shakarning to'liq konversiyasiga olib keladi, oldindan ishlangan biomassaning fermentativ gidrolizi paytida hosil bo'lmaydigan jinsiy oligosakkaridlarning 15-25% ni to'playdi.Bu turli xil biomassani oldindan tozalash usullarida keng tarqalgan muammo.Ushbu to'siqning ba'zi sabablari gidroliz paytida ferment inhibisyonu yoki o'simlik biomassasida shakar aloqalarini buzish uchun zarur bo'lgan muhim fermentlarning yo'qligi yoki past darajalarini o'z ichiga oladi.Oligosakkaridlardagi shakar birikmalari kabi shakarlarning tarkibi va strukturaviy xususiyatlarini tushunish gidroliz paytida shakar konversiyasini yaxshilashga yordam beradi va biotexnologik jarayonlarni neftdan olingan mahsulotlar bilan raqobatbardosh qiladi.
Uglevodlarning tuzilishini aniqlash qiyin va suyuq xromatografiya (LC)11,12, yadro magnit-rezonans spektroskopiyasi (NMR)13, kapillyar elektroforez (CE)14,15,16 va massa spektrometriyasi (MS)17 kabi usullarning kombinatsiyasini talab qiladi., o'n sakkiz.Matritsa (MALDI-TOF-MS) yordamida lazer desorbsiyasi va ionlash bilan parvoz vaqtining massa spektrometriyasi kabi MS usullari uglevod tuzilmalarini aniqlashning ko'p qirrali usuli hisoblanadi.So'nggi paytlarda natriy ion qo'shimchalarining Collision Induced Dissociation (CID) tandem MS 20, 21 oligosakaridlarni biriktirish pozitsiyalariga, anomerik konfiguratsiyalarga, ketma-ketliklarga va dallanma pozitsiyalariga mos keladigan barmoq izlarini aniqlash uchun eng keng tarqalgan.
Glikan tahlili uglevod aloqalarini chuqur aniqlash uchun ajoyib vositadir22.Bu usul murakkab uglevod aloqalarini tushunish uchun problar sifatida o'simlik hujayra devori glikaniga yo'naltirilgan monoklonal antikorlardan (mAbs) foydalanadi.250 dan ortiq mAb butun dunyo bo'ylab mavjud bo'lib, ular turli xil saxaridlardan foydalangan holda turli chiziqli va tarvaqaylab ketgan oligosakkaridlarga qarshi ishlab chiqilgan24.O'simlik hujayra devorining tuzilishi, tarkibi va modifikatsiyasini tavsiflash uchun bir nechta mAblar keng qo'llaniladi, chunki o'simlik hujayrasi turi, organi, yoshi, rivojlanish bosqichi va o'sish muhitiga qarab sezilarli farqlar mavjud25,26.So'nggi paytlarda bu usul o'simlik va hayvon tizimlarida pufakchalar populyatsiyasini va ularning hujayra osti belgilari, rivojlanish bosqichlari yoki atrof-muhit stimullari bilan belgilanadigan glikan tashishdagi tegishli rollarini tushunish va fermentativ faollikni aniqlash uchun ishlatilgan.Aniqlangan glikanlar va ksilanlarning turli xil tuzilmalariga pektin (P), ksilan (X), mannan (M), ksiloglyukanlar (XylG), aralash bog'langan glyukanlar (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomannan (GalG), glyukuron kislotasi-arabinoksilan (GalG), glyukuron kislotasi-arabinoksilan (GAbino)akt (GAbino) kiradi.
Biroq, bu barcha tadqiqot harakatlariga qaramasdan, faqat bir nechta tadqiqotlar yuqori qattiq moddalar yuki (HSL) gidroliz paytida oligosakkaridlarning to'planishi tabiatiga, jumladan oligosakkaridlarning ajralib chiqishiga, gidroliz paytida oligomerik zanjir uzunligi o'zgarishiga, turli xil past DP polimerlariga va ularning egri chiziqlariga qaratilgan.taqsimotlar 30,31,32.Ayni paytda, glikan tahlili glikan tuzilishini har tomonlama tahlil qilish uchun foydali vosita ekanligi isbotlangan bo'lsa-da, antikor usullari yordamida suvda eruvchan past DP oligosakkaridlarini baholash qiyin.Molekulyar og'irligi 5-10 kDa dan kam bo'lgan kichikroq DP oligosakkaridlari Elishay 33, 34 plitalari bilan bog'lanmaydi va antikor qo'shilishidan oldin yuviladi.
Bu erda birinchi marta eriydigan refrakter oligosakkaridlar uchun bir bosqichli biotinilatsiya jarayonini glikom tahlili bilan birlashtirgan monoklonal antikorlardan foydalangan holda avidin bilan qoplangan plitalarda Elishay tahlilini namoyish qilamiz.Glikom tahliliga bo'lgan yondashuvimiz MALDI-TOF-MS va GC-MS asosidagi gidrolizlangan shakar kompozitsiyalarining trimetilsilil (TMS) derivatizatsiyasidan foydalangan holda qo'shimcha oligosakkarid aloqalarining tahlili bilan tasdiqlangan.Ushbu innovatsion yondashuv kelajakda yuqori samarali usul sifatida ishlab chiqilishi va biotibbiyot tadqiqotlarida kengroq qo'llanilishi mumkin35.
Fermentlar va antikorlarning translatsiyadan keyingi modifikatsiyalari, masalan, glikozillanish36, ularning biologik faolligiga ta'sir qiladi.Masalan, yallig'lanishli artritda qon zardobi oqsillari glikozillanishining o'zgarishi muhim rol o'ynaydi va diagnostik belgilar sifatida glikozillanishning o'zgarishi qo'llaniladi37.Adabiyotda turli glikanlar turli kasalliklarda, jumladan, oshqozon-ichak trakti va jigarning surunkali yallig'lanish kasalliklarida, virusli infektsiyalarda, tuxumdonlar, ko'krak va prostata saratonlarida osongina paydo bo'lishi haqida xabar berilgan38,39,40.Antikorga asoslangan glikan Elishay usullari yordamida glikanlarning tuzilishini tushunish murakkab MS usullaridan foydalanmasdan kasallik tashxisiga qo'shimcha ishonchni ta'minlaydi.
Oldingi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, o'jar oligosakkaridlar oldindan ishlov berish va fermentativ gidrolizdan keyin gidrolizlanmagan (1-rasm).Ilgari chop etilgan ishimizda biz AFEX bilan oldindan ishlov berilgan makkajo'xori gidrolizatidan (ACSH)8 oligosakkaridlarni ajratib olish uchun faollashtirilgan ko'mirning qattiq fazali ekstraksiya usulini ishlab chiqdik.Dastlabki ekstraksiya va ajratilgandan so'ng, oligosakkaridlar o'lchamni istisno qilish xromatografiyasi (SEC) orqali qo'shimcha fraktsiyalarga bo'lindi va molekulyar og'irlik tartibida yig'ildi.Har xil oldindan ishlov berishdan chiqarilgan shakar monomerlari va oligomerlari shakar tarkibi tahlili bilan tahlil qilindi.Turli xil dastlabki ishlov berish usullari bilan olingan shakar oligomerlarining tarkibini solishtirganda, o'jar oligosakkaridlarning mavjudligi biomassani monosaxaridlarga aylantirishda keng tarqalgan muammo bo'lib, shakar hosildorligini kamida 10-15% va hatto 18% gacha pasayishiga olib kelishi mumkin.BIZ.Bu usul oligosakkarid fraksiyalarini yanada keng miqyosda ishlab chiqarish uchun ishlatiladi.Olingan ACH va uning turli molekulyar og'irlikdagi keyingi fraktsiyalari bu ishda oligosakkaridlarni tavsiflash uchun eksperimental material sifatida ishlatilgan.
Oldindan ishlov berish va fermentativ gidrolizdan so'ng, turg'un oligosakkaridlar gidrolizlanmagan holda qoldi.Bu erda (A) oligosakkaridlarni ajratish usuli bo'lib, unda oligosakkaridlar faollashtirilgan uglerod va diatomli tuproqdan foydalangan holda AFEX bilan oldindan ishlangan makkajo'xori gidrolizatidan (ACSH) ajratiladi;B) Oligosakkaridlarni ajratish usuli.Oligosakkaridlar o'lchamlarini istisno qilish xromatografiyasi (SEC) bilan yana ajratilgan;(C) Har xil oldindan ishlov berishdan chiqarilgan saxarid monomerlari va oligomerlari (suyultirilgan kislota: DA, ionli suyuqlik: IL va AFEX).Enzimatik gidroliz sharoitlari: yuqori qattiq moddalar yuklanishi 25% (w/w) (taxminan 8% glyukan yuklanishi), 96 soat gidroliz, 20 mg/g tijorat fermenti yuklanishi (Ctec2: Htec2: MP-2: 1: 1 nisbat) va (D) shakar monomerlari va AF-dan chiqarilgan kortrebinoza va oligomerlar, glyukoza preparatlangan oligomerlar. ACS).
Glikan tahlili qattiq biomassa qoldiqlaridan ajratilgan ekstraktlardagi glikanlarni kompleks strukturaviy tahlil qilish uchun foydali vosita ekanligi isbotlangan.Shu bilan birga, suvda eruvchan saxaridlar ushbu an'anaviy usul yordamida kam ifodalanadi41, chunki past molekulyar og'irlikdagi oligosakkaridlar Elishay plastinkalarida immobilizatsiya qilish qiyin va antikor qo'shilishidan oldin yuviladi.Shuning uchun, antikorlarni bog'lash va tavsiflash uchun eriydigan, mos kelmaydigan oligosakkaridlarni avidin bilan qoplangan ELISA plitalari bilan qoplash uchun bir bosqichli biotinilatsiya usuli qo'llanildi.Ushbu usul bizning avval ishlab chiqarilgan ACSH va uning molekulyar og'irligiga (yoki polimerizatsiya darajasi, DP) asoslangan fraktsiya yordamida sinovdan o'tkazildi.Uglevodning qaytaruvchi uchiga biotin-LC-gidrazid qo'shib, oligosakkaridlarning bog'lanish yaqinligini oshirish uchun bir bosqichli biotinillash ishlatilgan (2-rasm).Eritmada reduktsiya uchidagi hemiatsetal guruhi biotin-LC-gidrazidning gidrazid guruhi bilan reaksiyaga kirishib, gidrazon bog'ini hosil qiladi.NaCNBH3 kamaytiruvchi agenti ishtirokida gidrazon aloqasi barqaror biotinlangan yakuniy mahsulotga kamayadi.Shakarni kamaytiradigan uchining modifikatsiyasi bilan past DP oligosakkaridlarini Elishay plitalari bilan bog'lash mumkin bo'ldi va bizning tadqiqotimizda bu glikan maqsadli mAbs yordamida avidin bilan qoplangan plitalarda amalga oshirildi.
Biotinlangan oligosakkaridlar uchun Elishay asosidagi monoklonal antikorlarni skrining qilish.Bu erda (A) oligosakkaridlarning birgalikda biotinilatsiyasi va keyinchalik NeutrAvidin bilan qoplangan plitalardagi glikan-maqsadli mAblar bilan Elishay skriningi va (B) reaksiya mahsulotlarini biotinillashning bir bosqichli tartibini ko'rsatadi.
Keyin oligosakkarid bilan birlashtirilgan antikorlarga ega avidin bilan qoplangan plitalar birlamchi va ikkilamchi antikorlarga qo'shildi va yorug'lik va vaqtga sezgir muhitda yuvildi.Antikor bog'lanishi tugallangach, plastinkani inkubatsiya qilish uchun TMB substratini qo'shing.Reaktsiya nihoyat sulfat kislota bilan to'xtatildi.Antikorga xos o'zaro bog'lanishni aniqlash uchun har bir antikorning bog'lanish kuchini aniqlash uchun inkubatsiya qilingan plitalar ELISA o'quvchi yordamida tahlil qilindi.Tajribaning tafsilotlari va parametrlari uchun "Materiallar va usullar" bo'limiga qarang.
Biz ushbu yangi ishlab chiqilgan usulning ACSH tarkibida mavjud bo'lgan eruvchan oligosakkaridlarni, shuningdek, lignoselülozik gidrolizatlardan ajratilgan xom va tozalangan oligosakkarid fraktsiyalarini tavsiflash orqali aniq ilovalar uchun foydaliligini ko'rsatamiz.3-rasmda ko'rsatilganidek, ACSHda bioatsillangan glikom tahlil usullari yordamida aniqlangan eng keng tarqalgan epitop o'rnini bosuvchi ksilanlar odatda uronik (U) yoki metiluron (MeU) va pektik arabinogalaktanlardir.Ularning aksariyati gidrolizlanmagan qattiq moddalarning glikanlarini tahlil qilish bo'yicha oldingi tadqiqotimizda ham topilgan (UHS)43.
Hujayra devori glikaniga yo'naltirilgan monoklonal antikor yordamida rekalsitrant oligosakkarid epitoplarini aniqlash."Neytral" fraktsiya ACN fraktsiyasi va "kislotali" fraktsiya FA fraktsiyasidir.Issiqlik xaritasidagi yorqinroq qizil ranglar yuqori epitop tarkibini, yorqinroq ko'k ranglar esa bo'sh fonni bildiradi.Shkaladagi rang qiymatlari N = 2 formulalari uchun xom OD qiymatlariga asoslanadi.Antikorlar tomonidan tan olingan asosiy epitoplar o'ng tomonda ko'rsatilgan.
Ushbu tsellyuloza bo'lmagan tuzilmalarni eng ko'p ishlatiladigan tijoriy fermentlarni o'z ichiga olgan sinovdan o'tgan tijorat fermenti aralashmasidagi eng keng tarqalgan tsellyulazalar va gemitsellyulazlar tomonidan parchalanib bo'lmaydi.Shuning uchun ularning gidrolizlanishi uchun yangi yordamchi fermentlar talab qilinadi.Kerakli tsellyuloza bo'lmagan qo'shimcha fermentlarsiz, bu tsellyuloza bo'lmagan aloqalar monosaxaridlarga to'liq aylanishini oldini oladi, hatto ularning asosiy shakar polimerlari qisqaroq bo'laklarga keng gidrolizlangan va tijorat fermenti aralashmalari yordamida eritilgan bo'lsa ham.
Signal taqsimotini va uning bog'lanish kuchini keyingi o'rganish shuni ko'rsatdiki, bog'lovchi epitoplar yuqori DP shakar fraktsiyalarida (A, B, C, DP 20+ gacha) past DP fraktsiyalariga (D, E, F, DP) nisbatan dimerlarda) (1-rasm).Kislota bo'laklari tsellyuloza bo'lmagan epitoplarda neytral bo'laklarga qaraganda ko'proq uchraydi.Ushbu hodisalar bizning oldingi tadqiqotimizda kuzatilgan naqshga mos keladi, bu erda yuqori DP va kislota qismlari fermentativ gidrolizga ko'proq chidamli edi.Shuning uchun tsellyuloza bo'lmagan glikan epitoplarining mavjudligi va U va MeU almashtirishlari oligosakkaridlarning barqarorligiga katta hissa qo'shishi mumkin.Shuni ta'kidlash kerakki, past DP oligosakkaridlar uchun ulanish va aniqlash samaradorligi muammoli bo'lishi mumkin, ayniqsa epitop dimerik yoki trimerik oligosakkarid bo'lsa.Buni har xil uzunlikdagi tijorat oligosakkaridlari yordamida tekshirish mumkin, ularning har biri ma'lum bir mAb bilan bog'langan faqat bitta epitopni o'z ichiga oladi.
Shunday qilib, tuzilishga xos antikorlardan foydalanish ma'lum turdagi rekalsitant aloqalarni aniqladi.Amaldagi antikor turiga, tegishli bog'lanish sxemasiga va u ishlab chiqaradigan signalning kuchiga qarab (eng ko'p va eng kam miqdorda) yangi fermentlarni aniqlash va to'liqroq glikokonversiya qilish uchun ferment aralashmasiga yarim miqdoriy qo'shilishi mumkin.Misol tariqasida ACSH oligosakkaridlari tahlilini olib, biz har bir biomassa materiali uchun glikan aloqalari bazasini yaratishimiz mumkin.Bu erda shuni ta'kidlash kerakki, antikorlarning turli xil yaqinligini hisobga olish kerak va agar ularning yaqinligi noma'lum bo'lsa, bu turli antikorlarning signallarini solishtirishda ma'lum qiyinchiliklarni keltirib chiqaradi.Bundan tashqari, glikan aloqalarini taqqoslash bir xil antikor uchun namunalar orasida eng yaxshi ishlashi mumkin.Keyinchalik bu o'jar aloqalar CAZyme ma'lumotlar bazasiga ulanishi mumkin, undan biz fermentlarni aniqlashimiz, nomzod fermentlarni tanlashimiz va bog'lanishni buzuvchi fermentlarni sinab ko'rishimiz yoki biorefineriyalarda foydalanish uchun ushbu fermentlarni ifodalash uchun mikrobial tizimlarni ishlab chiqishimiz mumkin44.
Immunologik usullar lignoselülozik gidrolizatlarda mavjud bo'lgan past molekulyar og'irlikdagi oligosakkaridlarni tavsiflashning muqobil usullarini qanday to'ldirishini baholash uchun biz MALDI (4-rasm, S1-S8) va xuddi shu panelda (5-rasm) oligosaccharide qismida GC-MS asosida TMS olingan saxaridlarni tahlil qildik.MALDI oligosakkarid molekulalarining massa taqsimoti mo'ljallangan tuzilishga mos kelishini solishtirish uchun ishlatiladi.Shaklda.4 ACN-A va ACN-B neytral komponentlarining MC ni ko'rsatadi.ACN-A tahlili DP 4-8 (4-rasm) dan DP 22 (S1-rasm) gacha bo'lgan bir qator pentoza shakarlarini tasdiqladi, ularning og'irligi MeU-ksilan oligosakkaridlariga to'g'ri keladi.ACN-B tahlili pentoza va glyukoksilan seriyasini DP 8-15 bilan tasdiqladi.S3-rasm kabi qo'shimcha materialda FA-C kislotali qismi massasini taqsimlash xaritalari Elishay asosidagi mAb skriningida topilgan almashtirilgan ksilanlar bilan mos keladigan DP 8-15 bo'lgan (Me)U bilan almashtirilgan pentoza shakarlari oralig'ini ko'rsatadi.Epitoplar izchil.
ACSda mavjud bo'lgan eruvchan mos kelmaydigan oligosakkaridlarning MALDI-MS spektri.Bu erda (A) metillangan uron kislotasi (DP 4-8) o'z ichiga olgan past og'irlikdagi ACN-A fraktsiyalari glyukuroksilan oligosakkaridlari va (B) ACN-B ksilan va glyukuroksilan (DP 8-15) bilan almashtirilgan metillangan uron kislotasi oligosakkaridlari almashtirildi.
O'tga chidamli oligosakkaridlarning glikan qoldig'i tarkibini tahlil qilish.Bu erda (A) GC-MS tahlili yordamida olingan turli oligosakkarid fraksiyalarining TMS saxarid tarkibi.(B) Oligosakkaridlarda mavjud bo'lgan turli xil TMS hosil bo'lgan shakarlarning tuzilmalari.ACN - neytral oligosakkaridlarni o'z ichiga olgan asetonitril fraktsiyasi va FA - kislota oligosakkaridlarini o'z ichiga olgan ferul kislotasi fraktsiyasi.
S9-rasmda ko'rsatilganidek, oligosakkarid fraktsiyasining LC-MS tahlilidan yana bir qiziqarli xulosa chiqarildi (usullarni elektron qo'shimcha materialda ko'rish mumkin).ACN-B fraktsiyasini bog'lashda geksoz va -OAc guruhlari fragmentlari qayta-qayta kuzatilgan.Bu topilma nafaqat glikoma va MALDI-TOF tahlilida kuzatilgan parchalanishni tasdiqlaydi, balki oldindan ishlangan lignoselülozik biomassadagi potentsial uglevod hosilalari haqida yangi ma'lumotlarni ham beradi.
Shuningdek, biz TMS shakar derivatizatsiyasi yordamida oligosakkarid fraktsiyasining shakar tarkibini tahlil qildik.GC-MS dan foydalanib, biz oligosakkarid fraktsiyasida neyron (loyiq bo'lmagan) va kislotali shakar (GluA va GalA) tarkibini aniqladik (5-rasm).Glyukuron kislotasi C va D kislotali komponentlarida, galakturon kislotasi esa kislotali shakarlarning yuqori DP komponentlari bo'lgan A va B kislotali komponentlarida mavjud.Ushbu natijalar nafaqat bizning ELISA va MALDI ma'lumotlarimizni tasdiqlaydi, balki oligosakkaridlarning to'planishi bo'yicha oldingi tadqiqotlarimizga ham mos keladi.Shu sababli, biz oligosakkaridlarning biotinilatsiyasidan foydalangan holda zamonaviy immunologik usullar va keyingi Elishay skriningi turli biologik namunalarda eruvchan rekalsitran oligosakkaridlarni aniqlash uchun etarli deb hisoblaymiz.
Elishay asosidagi mAb skrining usullari bir necha xil usullar bilan tasdiqlanganligi sababli, biz ushbu yangi miqdoriy usulning imkoniyatlarini yanada o'rganmoqchi edik.Ikkita tijorat oligosakkaridlari, ksiloheksakarid oligosakkarid (XHE) va 23-a-L-arabinofuranosil-ksilotrioz (A2XX) sotib olingan va hujayra devori glikaniga qaratilgan yangi mAb yondashuvi yordamida sinovdan o'tkazilgan.6-rasmda biotinlangan bog'lanish signali va oligosakkarid kontsentratsiyasining log kontsentratsiyasi o'rtasidagi chiziqli korrelyatsiya ko'rsatilgan, bu Langmuir adsorbsion modelini taklif qiladi.mAblar orasida CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 va CCRC-M151 XHE bilan o'zaro bog'langan va CCRC-M108, CCRC-M109 va LM11 A2XX bilan na10nm oralig'ida korrelyatsiya qilgan.Tajriba davomida antikorlarning cheklanganligi sababli, har bir oligosakkarid konsentratsiyasi bilan cheklangan tajribalar o'tkazildi.Bu erda shuni ta'kidlash kerakki, ba'zi antikorlar substrat sifatida bir xil oligosakkaridga juda boshqacha munosabatda bo'ladi, chunki ular bir oz boshqacha epitoplar bilan bog'lanadi va juda boshqacha bog'lanish yaqinliklariga ega bo'lishi mumkin.Haqiqiy namunalarga yangi mAb yondashuvi qo'llanilganda epitopni aniq aniqlash mexanizmlari va oqibatlari ancha murakkab bo'ladi.
Turli xil glikan-maqsadli mAblarni aniqlash diapazonini aniqlash uchun ikkita tijorat oligosakkaridlari ishlatilgan.Bu erda oligosakkarid kontsentratsiyasining log kontsentratsiyasi bilan chiziqli korrelyatsiyalar (A) mAb bilan XHE va (B) mAb bilan A2XX uchun Langmuir adsorbsiya naqshlarini ko'rsatadi.Tegishli epitoplar tahlilda substrat sifatida ishlatiladigan tijorat oligosakkaridlarning tuzilmalarini ko'rsatadi.
Glikan maqsadli monoklonal antikorlardan foydalanish (glikokomik tahlil yoki Elishay asosidagi mAb skriningi) o'simlik biomassasini tashkil etuvchi asosiy hujayra devori glikanlarining ko'pchiligini chuqur tavsiflash uchun kuchli vositadir.Biroq, klassik glikan tahlili faqat kattaroq hujayra devori glikanlarini tavsiflaydi, chunki ko'pchilik oligosakkaridlar ELISA plitalarida samarali immobilizatsiya qilinmaydi.Ushbu tadqiqotda AFEX bilan oldindan ishlangan makkajo'xori pechkasi yuqori qattiq moddalar tarkibida fermentativ gidrolizlangan.Shakar tahlili gidrolizatdagi rekalsitran hujayra devori uglevodlarining tarkibini aniqlash uchun ishlatilgan.Biroq, gidrolizatlardagi kichikroq oligosakkaridlarning mAb tahlili etarli darajada baholanmagan va Elishay plitalaridagi oligosakkaridlarni samarali immobilizatsiya qilish uchun qo'shimcha vositalar kerak.
Biz bu yerda NeutrAvidin ™ bilan qoplangan plitalarda oligosakkarid biotinilatsiyasini, so'ngra Elishay skriningini birlashtirish orqali mAb skriningi uchun oligosakkaridlarni immobilizatsiya qilishning yangi va samarali usuli haqida xabar beramiz.Immobilizatsiyalangan biotinillangan oligosakkaridlar rekalsitant oligosakkaridlarni tez va samarali aniqlash uchun antikorga etarlicha yaqinlikni ko'rsatdi.Mass-spektrometriyaga asoslangan ushbu o'jar oligosakkaridlarning tarkibini tahlil qilish immunoskriningga yangi yondashuv natijalarini tasdiqladi.Shunday qilib, ushbu tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, oligosakkaridlarning biotinilatsiyasi va Elishay skriningining glikan-maqsadli monoklonal antikorlar bilan kombinatsiyasi oligosakkaridlardagi o'zaro bog'lanishlarni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin va oligosakkaridlarning tuzilishini tavsiflovchi boshqa biokimyoviy tadqiqotlarda keng qo'llanilishi mumkin.
Ushbu biotinga asoslangan glikan profilini aniqlash usuli o'simlik biomassasida eriydigan oligosakkaridlarning uglevodli birikmalarini o'rganishga qodir bo'lgan birinchi hisobotdir.Bu biomassaning ba'zi qismlari bioyoqilg'i ishlab chiqarishda nima uchun juda qaysar ekanligini tushunishga yordam beradi.Bu usul glikomani tahlil qilish usullarida muhim bo'shliqni to'ldiradi va uni o'simlik oligosakkaridlaridan tashqari kengroq substratlarga qo'llashni kengaytiradi.Kelajakda biz biotinilatsiya uchun robototexnikadan foydalanishimiz va Elishay yordamida namunalarni yuqori o'tkazuvchanlik tahlili uchun ishlab chiqqan usuldan foydalanishimiz mumkin.
Pioneer 33A14 gibrid urug'laridan yetishtirilgan makkajo'xori somoni (CS) 2010 yilda Kolorado shtatining Rey shahridagi Kramer fermalaridan yig'ib olingan.Yer egasining ruxsati bilan ushbu biomassa tadqiqot uchun ishlatilishi mumkin. Namunalar quruq <6% namlikda zip-qulf qoplarida xona haroratida saqlangan. Namunalar quruq <6% namlikda zip-qulf qoplarida xona haroratida saqlangan. Obraztsy xranilis suximi pri vlajnosti < 6% v paketax s zastejkoy-molniey pri komnatnoy harorate. Namunalar fermuarli sumkalarda xona haroratida <6% namlikda quruq holda saqlangan.língíngíngíngíngíníní< 6% língíngíngíngíngíngíngíngíng.língíngíngíngíngíní< 6% Obraztsy xranyat v paketax s zastejkoy-molniey pri komnatnoy harorate s vlajnostyu < 6%. Namunalar fermuarli qoplarda xona haroratida, namligi 6% dan kam boʻlmagan joyda saqlanadi.Tadqiqot mahalliy va milliy ko'rsatmalarga mos keldi.Kompozitsion tahlil NREL protokoli yordamida amalga oshirildi.Tarkibida 31,4% glyukan, 18,7% ksilan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktan, 2,2% asetil, 14,3% lignin, 1,7% oqsil va 13,4% kul borligi aniqlandi.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) Novozymes (Franklinton, NC, AQSh) tsellyulazasi, b-glyukosidaza va Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) ning murakkab aralashmasidir.Multifect Pectinase® (72 mg protein/ml), pektinni parchalovchi fermentlarning murakkab aralashmasi DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, AQSH) tomonidan hadya qilingan.Ferment oqsili kontsentratsiyasi Kjeldahl azot tahlili (AOAC usuli 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, AQSh) yordamida oqsil tarkibini baholash (va protein bo'lmagan azot hissasini ayirish) yo'li bilan aniqlandi.Diatomli tuproq 545 EMD Millipore (Billerica, MA) dan sotib olingan.Faollashgan uglerod (DARCO, 100 mesh granulalar), Avicel (PH-101), olxa ksilan va boshqa barcha kimyoviy moddalar Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO) sotib olingan.
AFEXni oldindan davolash GLBRC da (Biomassani aylantirish tadqiqot laboratoriyasi, MSU, Lansing, MI, AQSh) amalga oshirildi.Oldindan ishlov berish 140 ° C da 15 daqiqa davomida amalga oshirildi.Zanglamaydigan po'latdan yasalgan dastgohli reaktorda (Parr Instruments Company) 60% (w/w) yuklanganda suvsiz ammiakning biomassaga 1:1 nisbatida 46 turish vaqti.30 daqiqa davom etdi.Reaktor 140 ° C ga keltirildi va ammiak tezda ajralib chiqdi, bu esa biomassani tezda xona haroratiga qaytarish imkonini berdi.AFEX oldindan ishlangan makkajo'xori pechining (ACS) tarkibi ishlov berilmagan makkajo'xori pechining (UT-CS) tarkibiga o'xshash edi.
Yuqori qattiq moddalar ACSH 25% (w/w) (taxminan 8% dekstran yuklanishi) oligosakkaridlarni keng miqyosda ishlab chiqarish uchun boshlang'ich material sifatida tayyorlangan.ACS ning fermentativ gidrolizi savdo fermenti aralashmasi yordamida amalga oshirildi, jumladan Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glyukan (oldindan ishlov berilgan biomassada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glyukan va Multifect Pectinase (Genencor Inc, AQSH).).), 5 mg protein/g dekstran.Enzimatik gidroliz 5 litrli bioreaktorda ish hajmi 3 litr, pH 4,8, 50 ° C va 250 aylanish tezligida amalga oshirildi.96 soat davomida gidrolizdan so'ng gidrolizat gidrolizlanmagan qattiq moddalarni olib tashlash uchun 6000 aylanish tezligida 30 daqiqa va keyin 14000 aylanish tezligida 30 daqiqa davomida santrifüjlash orqali yig'ildi.Keyin gidrolizat 0,22 mm filtrli stakan orqali steril filtrlashdan o'tkazildi.Filtrlangan gidrolizat steril shishalarda 4 ° C da saqlanadi va keyin uglerodda fraksiyalanadi.
NREL laboratoriya tahlili protseduralari bo'yicha ekstrakt asosidagi biomassa namunalari tarkibini tahlil qilish: kompozitsiyani tahlil qilish uchun namunalar tayyorlash (NREL/TP-510-42620) va biomassadagi strukturaviy uglevodlar va ligninni aniqlash (NREL/TP-510 – 42618)47.
Gidrolizat oqimining oligosakkarid tahlili avtoklavga asoslangan kislota gidroliz usuli yordamida 2 ml miqyosda o'tkazildi.Gidrolizat namunasini 69,7 µl 72% sulfat kislota bilan 10 ml vintli qopqoqli kulturaga aralashtiring va stol ustida 121 °C da 1 soat davomida inkubatsiya qiling, muz ustida sovutib, yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) flakoniga filtrlang.Oligosakkaridlarning kontsentratsiyasi kislota gidrolizlangan namunadagi umumiy shakar konsentratsiyasidan gidrolizlanmagan namunadagi monosaxaridlar konsentratsiyasini ayirish yo'li bilan aniqlandi.
Kislota gidrolizlangan biomassadagi glyukoza, ksiloza va arabinoza kontsentratsiyasi Bio-Rad Aminex HPX-87H ustunida avtonamuna oluvchi, ustunli isitgich, izokratik nasos va sinishi indeksi detektori bilan jihozlangan Shimadzu HPLC tizimi yordamida tahlil qilindi.Ustun 50 ° C da saqlanadi va suvda 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 bilan elutildi.oqim.
Gidrolizat supernatant suyultirildi va monomer va oligosakkarid tarkibi uchun tahlil qilindi.Enzimatik gidrolizdan so'ng olingan monomerik shakarlar Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ustuni va kul himoyasi ustuni bilan jihozlangan HPLC tomonidan tahlil qilindi.Ustun harorati 80 ° C darajasida saqlanadi, suv 0,6 ml / min oqim tezligi bilan mobil faza sifatida ishlatilgan.Oligosakkaridlar 121 ° C da suyultirilgan kislotada gidroliz yo'li bilan refsda tasvirlangan usullarga muvofiq aniqlandi.41, 48, 49.
Xom, AFEX bilan oldindan ishlangan va barcha gidrolizlanmagan biomassa qoldiqlarida (shu jumladan, ketma-ket hujayra devori ekstraktlarini ishlab chiqarish va ularning mAb skriningi) saxarid tahlili ilgari tasvirlangan 27, 43, 50, 51 protseduralari yordamida amalga oshirildi.Glikomani tahlil qilish uchun o'simlik hujayra devori materialining spirtda erimaydigan qoldiqlari biomassa qoldiqlaridan tayyorlanadi va ammoniy oksalat (50 mM), natriy karbonat (50 mM va 0,5% w/v), CON kabi tobora agressiv reagentlar bilan ketma-ket ekstraktsiyaga duchor bo'ladi.(1M va 4M, ikkalasi ham 1% natriy borgidrid bilan) va ilgari tavsiflangan kislota xlorit52,53.Keyin ekstraktlar hujayra devori glikaniga yo'naltirilgan mAb50s kompleks paneliga qarshi Elishay ta'siridan o'tkazildi va mAb bog'lanish reaktsiyalari issiqlik xaritasi sifatida taqdim etildi.O'simlik hujayra devori glikaniga qaratilgan mAblar laboratoriya zahiralaridan (CCRC, JIM va MAC seriyali) sotib olindi.
Oligosakkaridlarning bir bosqichli biotinillanishi.Uglevodlarni biotin-LC-gidrazid bilan konjugatsiya qilish quyidagi protsedura yordamida amalga oshirildi.Biotin-LC-gidrazid (4,6 mg/12 mkmol) dimetil sulfoksidda (DMSO, 70 mkl) kuchli aralashtirish va 65°C da 1 daqiqa qizdirish orqali eritildi.Muzlik sirka kislotasi (30 µl) qo‘shildi va aralashma natriy siyanoborogidrid (6,4 mg/100 µmol) ustiga quyiladi va 65°C da taxminan 1 daqiqa qizdirilgandan so‘ng to‘liq eritiladi.Keyin quritilgan oligosakkaridga (1-100 nmol) 5 dan 8 mkl gacha reaktsiya aralashmasi qo'shildi, bu yorliqning 10 baravar yoki undan ko'p molyar ortiqcha miqdorini kamaytirish uchun.Reaktsiya 65 ° C da 2 soat davomida amalga oshirildi, shundan so'ng namunalar darhol tozalandi.Natriy siyanoborogidrid yorliqlash tajribalarida qisqartirilmasdan ishlatilmadi va namunalar 65 ° C da 2,5 soat davomida reaksiyaga kirishdi.
ELISA qoplamasi va biotinlangan oligosakkaridlar namunalarini yuvish.25 mkl biotinlangan namunalar (5 ml 0,1 M Tris bufer eritmasida (TBS) suyultirilgan har bir konsentrlangan namunadan 100 mkl) avidin bilan qoplangan plastinkaning har bir qudug'iga qo'shildi.Nazorat quduqlari 0,1 M TBSda 10 mkg/ml konsentratsiyada 50 mkl biotin bilan qoplangan.Bo'sh o'lchovlar uchun qoplama sifatida deionlashtirilgan suv ishlatilgan.Planshet qorong'i joyda xona haroratida 2 soat davomida inkubatsiya qilindi.Plitani dastur № dan foydalanib 0,1 M TBSda 0,1% yog'siz sut bilan 3 marta yuving.Grenier kvartirasi 3A uchun 11.
Birlamchi antikorlarni qo'shish va yuvish.Har bir quduqqa 40 mkl asosiy antikor qo'shing.Mikroplastinkani qorong'i joyda xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qiling.Keyin plitalar Grenier Flat 3A uchun №11 yuvish dasturi yordamida 0,1 M TBS da 0,1% sut bilan 3 marta yuvildi.
Ikkilamchi antikor qo'shing va yuving.Har bir quduqqa 50 µl sichqon/kalamush ikkilamchi antikor qo‘shing (0,1 M TBSda 0,1% sutda 1:5000 nisbatda suyultiriladi).Mikroplastinkani qorong'i joyda xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qiling.Keyin mikroplastinkalar Grenier Flat 5A plastinka yuvish dasturi #12 yordamida 0,1 M TBS da 0,1% sut bilan 5 marta yuvildi.
Substrat qo'shish.Asosiy substratga 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) qo‘shing (15 ml deionizatsiyalangan suvga 2 tomchi bufer, 3 tomchi TMB, 2 tomchi vodorod periks qo‘shib).TMB substratini tayyorlang.va ishlatishdan oldin vorteks).Mikroplastinkani xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.Qorong'ida.
Bosqichni bajaring va planshetni o'qing.Har bir quduqqa 50 µl 1 n sulfat kislota qo‘shing va ELISA o‘quvchi yordamida 450 dan 655 nm gacha absorbansni qayd qiling.
Ushbu tahlil qiluvchi moddalarning 1 mg/ml deionlangan suvda eritmalarini tayyorlang: arabinoza, ramnoz, fukoza, ksiloza, galakturon kislotasi (GalA), glyukuron kislotasi (GlcA), mannoz, glyukoza, galaktoza, laktoza, N-atsetilmannozamin (manNAclu), N-kozamin.(glcNAc), N-asetilgalaktozamin (galNAc), inositol (ichki standart).1-jadvalda ko'rsatilgan 1 mg/ml shakar eritmalarini qo'shib ikkita standart tayyorlandi. Namunalar muzlatiladi va -80 ° C da liyofilizatsiya qilinadi. Barcha suv olinmaguncha (odatda taxminan 12-18 soat).
Analitik tarozida qopqoqli naychalarga 100-500 mkg namuna qo'shing.Qo'shilgan miqdorni yozib oling.Namunani ma'lum bir erituvchi konsentratsiyasida eritib, uni suyuqlik alikvoti sifatida naychaga qo'shish yaxshidir.Har bir namuna trubkasi uchun ichki standart sifatida 20 µl 1 mg/ml inositoldan foydalaning.Namunaga qo'shilgan ichki standart miqdori standart naychaga qo'shilgan ichki standart miqdori bilan bir xil bo'lishi kerak.
Burama qopqoqli flakonga 8 ml suvsiz metanol qo'shing.Keyin 4 ml 3 N. metanolik HCl eritmasi, qopqog'i yopiladi va chayqatiladi.Bu jarayonda suv ishlatilmaydi.
Oligosakkarid namunalari va standart TMS naychalariga 500 µl 1 M HCl metanol eritmasi qo‘shing.Namunalar bir kechada (168 soat) 80 ° C da termal blokda inkubatsiya qilindi.Metanoliz mahsulotini quritish kollektori yordamida xona haroratida quriting.200 µl MeOH qo‘shing va yana quriting.Bu jarayon ikki marta takrorlanadi.Namunaga 200 µl metanol, 100 µl piridin va 100 µl sirka angidrid qo‘shing va yaxshilab aralashtiring.Namunalar xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi.va quritilgan.200 µl metanol qo‘shing va yana quriting.
200 µl Tri-Sil qo‘shing va yopilgan trubkani 20 daqiqa davomida qizdiring.80 ° C, keyin xona haroratiga qadar sovutiladi.Namunani taxminan 50 µl hajmgacha quritish uchun quritish manifoldidan foydalaning.Shuni ta'kidlash kerakki, biz namunalarni to'liq quritishga ruxsat bermadik.
2 ml geksan qo'shing va vorteks bilan yaxshilab aralashtiriladi.Pasteur pipetkalarining (5-8 mm) uchlarini 5-3/4 dyuym diametrli pipetka ustiga shisha yünü solib, shisha jun bo'lagi bilan to'ldiring.Namunalar 3000 g da 2 daqiqa davomida santrifüj qilindi.Har qanday erimaydigan qoldiqlar cho'kadi.Namunani 100-150 µl gacha quriting.Taxminan 1 mkl hajm GC-MS ga 80 °C boshlang'ich haroratda va 2,0 daqiqalik boshlang'ich vaqtda yuborilgan (2-jadval).