Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS qo'llab-quvvatlashi cheklangan. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, uzluksiz qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptsiz renderlaymiz.
AFEX bilan oldindan ishlov berilgan makkajo'xori pechida turg'un oligosaxaridlarni kompleks tahlil qilish uchun yangi immunologik va mass-spektrometrik usullar. Lignotsellyuloza biomassasi qazilma yoqilg'ilarga barqaror alternativa bo'lib, oziq-ovqat, ozuqa, yoqilg'i va kimyoviy moddalar kabi mahsulotlarni ishlab chiqarish uchun biotexnologiyalarni ishlab chiqishda keng qo'llaniladi. Ushbu texnologiyalarning kaliti o'simlik hujayra devorlarida mavjud bo'lgan murakkab uglevodlarni glyukoza, ksiloza va arabinoza kabi oddiy shakarlarga aylantirish uchun raqobatbardosh jarayonlarni ishlab chiqishdir. Lignotsellyuloza biomassasi juda o'jar bo'lgani uchun, kerakli mahsulotni olish uchun uni termokimyoviy ishlov berish (masalan, ammiak tolasini tozalash (AFEX), suyultirilgan kislotalar (DA), ion suyuqliklari (IL)) va biologik ishlov berish (masalan, fermentativ gidroliz va mikrobial fermentatsiya) bilan birgalikda qo'llash kerak. Biroq, gidroliz jarayonida tijorat zamburug'li fermentlar ishlatilganda, hosil bo'lgan eruvchan shakarlarning atigi 75-85% monosaxaridlar, qolgan 15-25% esa mikroorganizmlar uchun har doim ham mavjud bo'lmagan eruvchan, erimaydigan oligosakkaridlardir. Ilgari biz uglerod va diatomli yerni ajratish va o'lchamlarni chiqarib tashlash xromatografiyasi kombinatsiyasidan foydalangan holda eruvchan o'jar oligosakkaridlarni muvaffaqiyatli ajratib oldik va tozaladik, shuningdek, ularning fermentlarni inhibe qilish xususiyatlarini o'rgandik. Biz yuqori darajadagi polimerizatsiya (DP) metillangan uron kislotasi o'rnini bosuvchi oligosakkaridlarni past DP va neytral oligosakkaridlarga qaraganda tijorat ferment aralashmalari bilan qayta ishlash qiyinroq ekanligini aniqladik. Bu yerda biz bir nechta qo'shimcha usullardan, jumladan, o'simlik hujayra devorlarida glikan bog'lanishlarini tavsiflash uchun o'simlik biomassasi glikanlariga xos monoklonal antikorlar (mAbs) yordamida glikan profilini yaratish va fermentativ gidrolizatlar, matritsa yordamida lazer desorbsiyasi ionizatsiyasi, parvoz vaqti mass-spektrometriyasidan foydalanish haqida xabar beramiz. . MALDI-TOF-MS) oligosaxarid bog'lanishlarini hosilalanish bilan va hosilalanmasdan tavsiflash uchun manfiy ionlarning ikkilamchi parchalanishidan keyin spektroskopiya, gaz xromatografiyasi va massa spektrometriyasi (GC-MS) orqali olingan strukturaviy-informatsion diagnostika cho'qqilaridan foydalanadi. Oligosaxaridlarning kichik o'lchamlari (DP 4–20) tufayli bu molekulalarni mAb bog'lanishi va tavsiflash uchun ishlatish qiyin. Ushbu muammoni hal qilish uchun biz mikroplastinka yuzasida past DP eruvchan oligosaxaridlarning ko'pchiligini muvaffaqiyatli belgilagan yangi biotin konjugatsiyaga asoslangan oligosaxarid immobilizatsiya usulini qo'lladik, keyinchalik u maxsus ligatsiya tahlili uchun yuqori o'tkazuvchanlikdagi mAb tizimida qo'llanildi. Ushbu yangi usul kelajakda diagnostika maqsadlarida biomarkerlarda mavjud bo'lgan oligosaxaridlarni ajratish va tavsiflash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan yanada rivojlangan yuqori o'tkazuvchanlikdagi glikom tahlillarini ishlab chiqishga yordam beradi.
Qishloq xo'jaligi, o'rmon xo'jaligi, o't va yog'och materiallaridan tashkil topgan lignosellyuloza biomassasi yuqori qiymatli mahsulotlar ishlab chiqarish uchun oziq-ovqat, ozuqa, yoqilg'i va kimyoviy prekursorlar kabi bioasosli mahsulotlar ishlab chiqarish uchun potentsial xom ashyo hisoblanadi1. O'simlik hujayra devorlarida mavjud bo'lgan uglevodlar (masalan, tsellyuloza va gemitsellyuloza) kimyoviy ishlov berish va biotransformatsiya (masalan, fermentativ gidroliz va mikrobial fermentatsiya) orqali monosaxaridlarga depolimerlanadi. Keng tarqalgan dastlabki ishlov berishlarga ammiak tolasining kengayishi (AFEX), suyultirilgan kislota (DA), ion suyuqligi (IL) va bug' portlashi (SE) kiradi, ular o'simlik hujayra devorlarini ochish orqali lignosellyuloza ishlab chiqarishni kamaytirish uchun kimyoviy moddalar va issiqlik kombinatsiyasidan foydalanadi3,4. moddaning o'jarligi, 5. Enzimatik gidroliz tijorat faol uglevod o'z ichiga olgan fermentlar (CAZymes) va bioasosli yoqilg'i va kimyoviy moddalar ishlab chiqarish uchun transgen xamirturushlar yoki bakteriyalar yordamida mikrobial fermentatsiya yordamida yuqori qattiq moddalar yukida amalga oshiriladi6.
Tijorat fermentlaridagi CAZimlar monosaxaridlarni hosil qilish uchun murakkab uglevod-shakar bog'lanishlarini sinergik ravishda parchalaydigan fermentlarning murakkab aralashmasidan iborat2,7. Avvalroq xabar berganimizdek, ligninning uglevodlar bilan aromatik polimerlarining murakkab tarmog'i ularni juda qiyinlashtiradi, bu esa shakarning to'liq konversiyasiga olib keladi, oldindan ishlov berilgan biomassaning fermentativ gidrolizi paytida hosil bo'lmaydigan 15-25% jinsiy oligosakkaridlarni to'playdi. Bu turli biomassani oldindan ishlov berish usullari bilan bog'liq keng tarqalgan muammo. Ushbu to'siqning ba'zi sabablari gidroliz paytida fermentlarning inhibatsiyasi yoki o'simlik biomassasida shakar bog'lanishlarini uzish uchun zarur bo'lgan muhim muhim fermentlarning yo'qligi yoki past darajasini o'z ichiga oladi. Oligosakkaridlardagi shakar bog'lanishlari kabi shakarlarning tarkibi va strukturaviy xususiyatlarini tushunish gidroliz paytida shakar konversiyasini yaxshilashga yordam beradi va biotexnologik jarayonlarni neftdan olingan mahsulotlar bilan raqobatbardosh qiladi.
Uglevodlarning tuzilishini aniqlash qiyin va suyuq xromatografiya (LC)11,12, yadro magnit-rezonans spektroskopiyasi (NMR)13, kapillyar elektroforez (CE)14,15,16 va mass-spektrometriya (MS)17 kabi usullarning kombinatsiyasini talab qiladi. ,18. Lazer desorbsiyasi va matritsa (MALDI-TOF-MS) yordamida ionlash bilan parvoz vaqti massa spektrometriyasi kabi MS usullari uglevod tuzilmalarini aniqlashning ko'p qirrali usuli hisoblanadi. Yaqinda natriy ion qo'shimchalarining to'qnashuv natijasida dissotsiatsiya (CID) tandem MS oligosakkarid birikma pozitsiyalariga, anomer konfiguratsiyalarga, ketma-ketliklarga va tarmoqlanish pozitsiyalariga mos keladigan barmoq izlarini aniqlash uchun eng keng qo'llanilmoqda 20, 21.
Glikan tahlili uglevod bog'lanishlarini chuqur aniqlash uchun ajoyib vositadir22. Ushbu usul murakkab uglevod bog'lanishlarini tushunish uchun o'simlik hujayra devori glikaniga yo'naltirilgan monoklonal antikorlardan (mAbs) zond sifatida foydalanadi. Dunyo bo'ylab 250 dan ortiq mAbs mavjud bo'lib, ular turli xil saxaridlardan foydalangan holda turli chiziqli va tarmoqlangan oligosakkaridlarga qarshi ishlab chiqilgan24. O'simlik hujayra devorining tuzilishi, tarkibi va modifikatsiyasini tavsiflash uchun bir nechta mAbs keng qo'llanilgan, chunki o'simlik hujayrasi turiga, organiga, yoshiga, rivojlanish bosqichiga va o'sish muhitiga qarab sezilarli farqlar mavjud25,26. Yaqinda bu usul o'simlik va hayvon tizimlaridagi vesikulalar populyatsiyasini va ularning subhujayra markerlari, rivojlanish bosqichlari yoki atrof-muhit stimullari tomonidan aniqlangan glikan tashishdagi tegishli rolini tushunish va fermentativ faollikni aniqlash uchun ishlatilgan. Aniqlangan glikanlar va ksilanlarning turli tuzilmalariga pektin (P), ksilan (X), mannan (M), ksiloglukanlar (XylG), aralash bog'langan glyukanlar (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomannan (GalG), glyukuron kislotasi-arabinoksilan (GArbX) va arabino-galaktan (ArbG) kiradi.
Biroq, ushbu tadqiqot ishlariga qaramay, faqat bir nechta tadqiqotlar yuqori qattiq moddalar yuki (HSL) gidrolizi paytida oligosaxaridlarning to'planish tabiatiga, jumladan, oligosaxaridlarning ajralib chiqishi, gidroliz paytida oligomer zanjir uzunligining o'zgarishi, turli xil past DP polimerlari va ularning egri chiziqlariga qaratilgan. taqsimotlar 30,31,32. Shu bilan birga, glikan tahlili glikan tuzilishini har tomonlama tahlil qilish uchun foydali vosita ekanligi isbotlangan bo'lsa-da, antikor usullari yordamida suvda eriydigan past DP oligosaxaridlarini baholash qiyin. Molekulyar og'irligi 5-10 kDa dan kam bo'lgan kichikroq DP oligosaxaridlari ELISA plitalariga 33, 34 bog'lanmaydi va antikor qo'shilishidan oldin yuvilib ketadi.
Bu yerda biz birinchi marta monoklonal antikorlardan foydalangan holda avidin bilan qoplangan plastinkalarda ELISA tahlilini namoyish etamiz, bunda eruvchan refrakter oligosakkaridlar uchun bir bosqichli biotinilatsiya protsedurasi glikom tahlili bilan birlashtiriladi. Glikom tahliliga yondashuvimiz gidrolizlangan shakar tarkibini trimetilsilil (TMS) hosilasi yordamida MALDI-TOF-MS va GC-MS asosidagi komplementar oligosakkarid bog'lanishlarini tahlil qilish orqali tasdiqlandi. Ushbu innovatsion yondashuv kelajakda yuqori samarali usul sifatida ishlab chiqilishi va biotibbiyot tadqiqotlarida kengroq qo'llanilishini topishi mumkin35.
Fermentlar va antitelolarning translyatsion modifikatsiyalari, masalan, glikozillanish,36 ularning biologik faolligiga ta'sir qiladi. Masalan, zardob oqsillarining glikozillanishidagi o'zgarishlar yallig'lanish artritida muhim rol o'ynaydi va glikozillanishdagi o'zgarishlar diagnostik marker sifatida ishlatiladi37. Adabiyotlarda turli xil glikanlar oshqozon-ichak trakti va jigarning surunkali yallig'lanish kasalliklari, virusli infeksiyalar, tuxumdon, ko'krak va prostata saratoni kabi turli kasalliklarda osongina paydo bo'lishi haqida xabar berilgan38,39,40. Antitelo asosidagi glikan ELISA usullari yordamida glikanlarning tuzilishini tushunish murakkab MS usullaridan foydalanmasdan kasallik tashxisida qo'shimcha ishonchni ta'minlaydi.
Oldingi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, o'jar oligosaxaridlar oldindan ishlov berish va fermentativ gidrolizdan keyin gidrolizlanmagan holda qoladi (1-rasm). Avval nashr etilgan ishimizda biz AFEX bilan oldindan ishlov berilgan makkajo'xori stover gidrolizatidan (ACSH)8 oligosaxaridlarni ajratib olish uchun faollashtirilgan ko'mir qattiq fazali ekstraksiya usulini ishlab chiqdik. Dastlabki ekstraksiya va ajratishdan so'ng, oligosaxaridlar o'lchamni chiqarib tashlash xromatografiyasi (SEC) yordamida qo'shimcha fraktsiyalandi va molekulyar og'irlik tartibida to'plandi. Turli xil oldindan ishlov berishdan ajralib chiqqan shakar monomerlari va oligomerlari shakar tarkibini tahlil qilish orqali tahlil qilindi. Turli xil oldindan ishlov berish usullari bilan olingan shakar oligomerlarining tarkibini taqqoslaganda, o'jar oligosaxaridlarning mavjudligi biomassani monosaxaridlarga aylantirishda keng tarqalgan muammo bo'lib, shakar hosildorligini kamida 10-15% ga va hatto 18% gacha kamaytirishi mumkin. AQSh. Ushbu usul oligosaxarid fraktsiyalarini yanada keng miqyosda ishlab chiqarish uchun qo'llaniladi. Olingan ACH va undan keyingi turli molekulyar og'irliklarga ega fraksiyalar ushbu ishda oligosakkaridlarni tavsiflash uchun eksperimental material sifatida ishlatilgan.
Oldindan ishlov berish va fermentativ gidrolizdan so'ng, turg'un oligosaxaridlar gidrolizlanmagan holda qoldi. Bu yerda (A) oligosaxaridlarni ajratish usuli bo'lib, unda oligosaxaridlar AFEX bilan oldindan ishlov berilgan makkajo'xori gidrolizatidan (ACSH) faollashtirilgan uglerod va diatomli tuproq qatlami yordamida ajratib olinadi; (B) Oligosaxaridlarni ajratish usuli. Oligosaxaridlar o'lchamlarni ajratish xromatografiyasi (SEC) yordamida qo'shimcha ravishda ajratildi; (C) Turli xil oldindan ishlov berishlardan ajralib chiqqan saxarid monomerlari va oligomerlari (suyultirilgan kislota: DA, ionli suyuqlik: IL va AFEX). Enzimatik gidroliz sharoitlari: 25% (w/w) qattiq moddalarning yuqori miqdori (taxminan 8% glyukan yuklanishi), 96 soatlik gidroliz, 20 mg/g tijorat ferment yuklanishi (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 nisbati) va (D) AFEX oldindan ishlov berilgan makkajo'xori pechidan (ACS) ajralib chiqadigan glyukoza, ksiloza va arabinozning shakar monomerlari va oligomerlari.
Glikan tahlili qattiq biomassa qoldiqlaridan ajratilgan ekstraktlardagi glikanlarning kompleks strukturaviy tahlili uchun foydali vosita ekanligi isbotlangan. Biroq, suvda eriydigan saxaridlar ushbu an'anaviy usul yordamida kam ifodalangan41, chunki past molekulyar og'irlikdagi oligosakkaridlarni ELISA plastinkalarida immobilizatsiya qilish qiyin va antikor qo'shilishidan oldin yuvib tashlanadi. Shuning uchun, antikorlarni bog'lash va tavsiflash uchun avidin bilan qoplangan ELISA plastinkalarida eriydigan, mos kelmaydigan oligosakkaridlarni qoplash uchun bir bosqichli biotinilatsiya usuli qo'llanildi. Bu usul biz ilgari ishlab chiqargan ACSH va uning molekulyar og'irligiga (yoki polimerlanish darajasiga, DP) asoslangan fraksiya yordamida sinovdan o'tkazildi. Bir bosqichli biotinilatsiya uglevodning qaytaruvchi uchiga biotin-LC-gidrazid qo'shish orqali oligosakkaridlarning bog'lanish yaqinligini oshirish uchun qo'llanildi (2-rasm). Eritmada qaytaruvchi uchidagi gemiatsetal guruh biotin-LC-gidrazidning gidrazid guruhi bilan reaksiyaga kirishib, gidrazon bog'lanishini hosil qiladi. NaCNBH3 qaytaruvchi agenti ishtirokida gidrazon bog'lanishi barqaror biotinlangan oxirgi mahsulotga qaytariladi. Shakarni qaytaruvchi uchining modifikatsiyasi bilan past DP oligosakkaridlarini ELISA plastinkalariga bog'lash mumkin bo'ldi va bizning tadqiqotimizda bu glikanga yo'naltirilgan mAbs yordamida avidin bilan qoplangan plastinkalarda amalga oshirildi.
Biotinlangan oligosakkaridlar uchun ELISA asosida monoklonal antikorlarni skrining qilish. Bu yerda (A) oligosakkaridlarning birgalikda biotinillanishi va keyinchalik NeutrAvidin bilan qoplangan plastinkalarda glikanga yo'naltirilgan mAbs bilan ELISA skriningi va (B) reaksiya mahsulotlarini biotinillashning bir bosqichli protsedurasi ko'rsatilgan.
Keyin oligosakkarid bilan bog'langan antikorlarga ega avidin bilan qoplangan plastinkalar birlamchi va ikkilamchi antikorlarga qo'shildi va yorug'likka va vaqtga sezgir muhitda yuvildi. Antikorlar bilan bog'lanish tugagandan so'ng, plastinkani inkubatsiya qilish uchun TMB substratini qo'shing. Reaksiya nihoyat sulfat kislota bilan to'xtatildi. Inkubatsiya qilingan plastinkalar antikorlarga xos o'zaro bog'lanishni aniqlash uchun har bir antikorning bog'lanish kuchini aniqlash uchun ELISA o'quvchi yordamida tahlil qilindi. Tajriba tafsilotlari va parametrlari uchun tegishli "Materiallar va usullar" bo'limiga qarang.
Biz ushbu yangi ishlab chiqilgan usulning ACSH tarkibidagi eruvchan oligosakkaridlarni, shuningdek, lignosellyuloza gidrolizatlaridan ajratib olingan xom va tozalangan oligosakkarid fraktsiyalarini tavsiflash orqali ma'lum ilovalar uchun foydaliligini namoyish etamiz. 3-rasmda ko'rsatilganidek, bioatsillangan glikom tahlil usullari yordamida ACSH tarkibida aniqlangan eng keng tarqalgan epitop bilan almashtirilgan ksilanlar odatda uron (U) yoki metiluron (MeU) va pektik arabinogalaktanlardir. Ularning aksariyati gidrolizlanmagan qattiq moddalar (UHS) glikanlarini tahlil qilish bo'yicha avvalgi tadqiqotimizda ham topilgan edi43.
Hujayra devori glikaniga yo'naltirilgan monoklonal antikor yordamida itoatsiz oligosaxarid epitoplarini aniqlash. "Neytral" fraktsiya ACN fraktsiyasi va "kislotali" fraktsiya FA fraktsiyasidir. Issiqlik xaritasidagi yorqinroq qizil ranglar epitopning yuqori miqdorini, yorqinroq ko'klar esa bo'sh fonni ko'rsatadi. Masshtabdagi rang qiymatlari N=2 formulalari uchun xom OD qiymatlariga asoslangan. Antikorlar tomonidan tan olingan asosiy epitoplar o'ng tomonda ko'rsatilgan.
Ushbu tsellyuloza bo'lmagan tuzilmalarni sinovdan o'tkazilgan tijorat fermentlari aralashmasidagi eng keng tarqalgan tsellyuloza va gemitsellyulazalar, jumladan, eng ko'p ishlatiladigan tijorat fermentlari bilan parchalab bo'lmadi. Shuning uchun, ularning gidrolizi uchun yangi yordamchi fermentlar talab qilinadi. Kerakli tsellyuloza bo'lmagan yordamchi fermentlarsiz, bu tsellyuloza bo'lmagan bog'lanishlar, hatto ularning asosiy shakar polimerlari qisqaroq bo'laklarga keng miqyosda gidrolizlanib, tijorat fermentlari aralashmalari yordamida erigan bo'lsa ham, monosaxaridlarga to'liq aylanishiga to'sqinlik qiladi.
Signal tarqalishi va uning bog'lanish kuchini keyingi o'rganish shuni ko'rsatdiki, bog'lanish epitoplari yuqori DP shakar fraktsiyalarida (A, B, C, DP 20+ gacha) past DP fraktsiyalariga (D, E, F, DP) nisbatan dimerlarda pastroq bo'lgan (1-rasm). Kislota fragmentlari tsellyuloza bo'lmagan epitoplarda neytral fragmentlarga qaraganda ko'proq uchraydi. Bu hodisalar avvalgi tadqiqotimizda kuzatilgan naqshga mos keladi, bunda yuqori DP va kislota qismlari fermentativ gidrolizga ko'proq chidamli edi. Shuning uchun, tsellyuloza bo'lmagan glikan epitoplari va U va MeU almashtirishlarining mavjudligi oligosakkaridlarning barqarorligiga katta hissa qo'shishi mumkin. Shuni ta'kidlash kerakki, bog'lanish va aniqlash samaradorligi past DP oligosakkaridlari uchun muammoli bo'lishi mumkin, ayniqsa epitop dimerik yoki trimerik oligosakkarid bo'lsa. Buni turli uzunlikdagi tijorat oligosakkaridlari yordamida sinab ko'rish mumkin, ularning har biri ma'lum bir mAb ga bog'lanadigan faqat bitta epitopni o'z ichiga oladi.
Shunday qilib, strukturaga xos antikorlardan foydalanish ba'zi turdagi itoatsiz bog'lanishlarni aniqladi. Qo'llaniladigan antikor turiga, tegishli bog'lanish naqshiga va u ishlab chiqaradigan signal kuchiga (eng ko'p va eng kam miqdorda) qarab, yangi fermentlarni aniqlash va to'liq glikokonversiya uchun ferment aralashmasiga yarim miqdoriy ravishda qo'shish mumkin. Misol tariqasida ACSH oligosakkaridlarini tahlil qilib, biz har bir biomassa materiali uchun glikan bog'lanishlari ma'lumotlar bazasini yaratishimiz mumkin. Bu yerda shuni ta'kidlash kerakki, antikorlarning turlicha yaqinligini hisobga olish kerak va agar ularning yaqinligi noma'lum bo'lsa, bu turli antikorlarning signallarini taqqoslashda ma'lum qiyinchiliklarni keltirib chiqaradi. Bundan tashqari, glikan bog'lanishlarini taqqoslash bir xil antikor uchun namunalar o'rtasida eng yaxshi ishlashi mumkin. Keyin bu o'jar bog'lanishlarni CAZyme ma'lumotlar bazasiga ulash mumkin, undan biz fermentlarni aniqlashimiz, nomzod fermentlarni tanlashimiz va bog'lanishni buzuvchi fermentlarni sinab ko'rishimiz yoki biorefinery zavodlarida foydalanish uchun ushbu fermentlarni ifodalash uchun mikrobial tizimlarni ishlab chiqishimiz mumkin44.
Immunologik usullar lignosellyuloza gidrolizatlarida mavjud bo'lgan past molekulyar og'irlikdagi oligosakkaridlarni tavsiflashning muqobil usullarini qanday to'ldirishini baholash uchun biz MALDI (4-rasm, S1-S8) va GC-MS asosida TMS dan olingan saxaridlarni bir xil panelda (5-rasm) oligosakkarid qismida tahlil qildik. MALDI oligosakkarid molekulalarining massa taqsimoti mo'ljallangan tuzilishga mos kelishini taqqoslash uchun ishlatiladi. 4-rasmda ACN-A va ACN-B neytral komponentlarining MC ko'rsatilgan. ACN-A tahlili DP 4-8 (4-rasm) dan DP 22 (S1-rasm) gacha bo'lgan pentoza shakarlarining diapazonini tasdiqladi, ularning og'irliklari MeU-ksilan oligosakkaridlariga mos keladi. ACN-B tahlili DP 8-15 bilan pentoza va glyukoksilan qatorini tasdiqladi. S3-rasm kabi qo'shimcha materiallarda FA-C kislotali qism massa taqsimoti xaritalarida ELISA asosidagi mAb skriningida topilgan almashtirilgan ksilanlarga mos keladigan DP 8-15 ga teng bo'lgan (Me)U almashtirilgan pentoza shakarlari diapazoni ko'rsatilgan. Epitoplar izchil.
ACSda mavjud bo'lgan eruvchan, mos kelmaydigan oligosakkaridlarning MALDI-MS spektri. Bu yerda, (A) metillangan uron kislotasini (DP 4-8) almashtirilgan glyukuroksilen oligosakkaridlarini o'z ichiga olgan ACN-A past og'irlik diapazonidagi fraksiyalar va (B) glyukuroksilen bilan almashtirilgan ACN-B ksilan va metillangan uron kislotasi oligosakkaridlari (DP 8-15).
Refrakter oligosaxaridlarning glikan qoldig'i tarkibini tahlil qilish. Bu yerda (A) GC-MS tahlili yordamida olingan turli oligosaxarid fraktsiyalarining TMS saxarid tarkibi. (B) Oligosaxaridlarda mavjud bo'lgan turli TMS dan olingan shakarlarning tuzilmalari. ACN – neytral oligosaxaridlarni o'z ichiga olgan asetonitril fraksiyasi va FA – kislota oligosaxaridlarini o'z ichiga olgan ferul kislotasi fraksiyasi.
S9-rasmda ko'rsatilganidek, oligosaxarid fraksiyasining LC-MS tahlilidan yana bir qiziqarli xulosa chiqarildi (usullarni elektron qo'shimcha materialda ko'rish mumkin). ACN-B fraksiyasini bog'lash paytida geksoza va -OAc guruhlarining fragmentlari bir necha bor kuzatildi. Bu topilma nafaqat glikom va MALDI-TOF tahlilida kuzatilgan parchalanishni tasdiqlaydi, balki oldindan ishlov berilgan lignosellyuloza biomassasidagi potentsial uglevod hosilalari haqida yangi ma'lumotlarni ham beradi.
Shuningdek, biz TMS shakar hosilasi yordamida oligosakkarid fraksiyasining shakar tarkibini tahlil qildik. GC-MS yordamida biz oligosakkarid fraksiyasida neyral (hosil bo'lmagan) va kislotali shakarlarning (GluA va GalA) tarkibini aniqladik (5-rasm). Glyukuron kislotasi C va D kislotali komponentlarida, galakturon kislotasi esa A va B kislotali komponentlarida uchraydi, ularning ikkalasi ham kislotali shakarlarning yuqori DP komponentlari hisoblanadi. Bu natijalar nafaqat bizning ELISA va MALDI ma'lumotlarimizni tasdiqlaydi, balki oligosakkaridlarning to'planishi bo'yicha avvalgi tadqiqotlarimizga ham mos keladi. Shuning uchun, biz oligosakkaridlarning biotinilatsiyasi va keyingi ELISA skriningidan foydalangan holda zamonaviy immunologik usullar turli biologik namunalarda eriydigan kaltsitrant oligosakkaridlarni aniqlash uchun etarli deb hisoblaymiz.
ELISA asosidagi mAb skrining usullari bir nechta turli usullar bilan tasdiqlanganligi sababli, biz ushbu yangi miqdoriy usulning salohiyatini yanada chuqurroq o'rganishni xohladik. Ikkita tijorat oligosakkaridlari, ksilogeksasaxarid oligosakkarid (XHE) va 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotrioza (A2XX) sotib olindi va hujayra devori glikanini nishonga olgan yangi mAb yondashuvi yordamida sinovdan o'tkazildi. 6-rasmda biotinlangan bog'lanish signali va oligosakkaridning log konsentratsiyasi o'rtasidagi chiziqli korrelyatsiya ko'rsatilgan, bu esa mumkin bo'lgan Langmuir adsorbsiya modelini ko'rsatadi. mAbs orasida CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 va CCRC-M151 XHE bilan, CCRC-M108, CCRC-M109 va LM11 esa 1 nm dan 100 nanogacha bo'lgan diapazonda A2XX bilan korrelyatsiya qilingan. Tajriba davomida antitelolarning mavjudligi cheklanganligi sababli, har bir oligosakkarid konsentratsiyasi bilan cheklangan tajribalar o'tkazildi. Bu yerda shuni ta'kidlash kerakki, ba'zi antitelolar substrat sifatida bir xil oligosakkaridga juda boshqacha reaksiyaga kirishadi, ehtimol ular biroz boshqacha epitoplarga bog'lanadi va juda boshqacha bog'lanishga ega bo'lishi mumkin. Yangi mAb yondashuvi haqiqiy namunalarga qo'llanilganda epitopni aniq aniqlash mexanizmlari va oqibatlari ancha murakkabroq bo'ladi.
Turli glikanlarni nishonga oluvchi mAbs larning aniqlash diapazonini aniqlash uchun ikkita tijorat oligosaxaridlari ishlatilgan. Bu yerda, oligosaxarid konsentratsiyasining log konsentratsiyasi bilan chiziqli korrelyatsiyalar (A) mAb bilan XHE va (B) mAb bilan A2XX uchun Langmuir adsorbsiya naqshlarini ko'rsatadi. Tegishli epitoplar tahlilda substrat sifatida ishlatiladigan tijorat oligosaxaridlarining tuzilishini ko'rsatadi.
Glikanga yo'naltirilgan monoklonal antikorlardan foydalanish (glikokomik tahlil yoki ELISA asosidagi mAb skriningi) o'simlik biomassasini tashkil etuvchi asosiy hujayra devori glikanlarining ko'pchiligini chuqur tavsiflash uchun kuchli vositadir. Biroq, klassik glikan tahlili faqat kattaroq hujayra devori glikanlarini tavsiflaydi, chunki ko'pgina oligosakkaridlar ELISA plitalarida samarali immobilizatsiya qilinmaydi. Ushbu tadqiqotda AFEX bilan oldindan ishlov berilgan makkajo'xori pecheri yuqori qattiq moddalar miqdorida fermentativ gidrolizlandi. Gidrolizat tarkibidagi itoatsiz hujayra devori uglevodlarining tarkibini aniqlash uchun shakar tahlili qo'llanildi. Biroq, gidrolizatlardagi kichikroq oligosakkaridlarning mAb tahlili kam baholanadi va ELISA plitalarida oligosakkaridlarni samarali immobilizatsiya qilish uchun qo'shimcha vositalar kerak.
Biz bu yerda NeutrAvidin™ qoplangan plastinkalarida oligosakkarid biotinilatsiyasini va undan keyin ELISA skriningini birlashtirish orqali mAb skriningi uchun yangi va samarali oligosakkarid immobilizatsiya usulini taqdim etamiz. Immobilizatsiya qilingan biotinillangan oligosakkaridlar antikor uchun yetarli darajada yaqinlikni ko'rsatdi, bu esa itoatsiz oligosakkaridlarni tez va samarali aniqlash imkonini beradi. Ushbu o'jar oligosakkaridlarning tarkibini massa spektrometriyasi asosida tahlil qilish immunskriningga ushbu yangi yondashuv natijalarini tasdiqladi. Shunday qilib, ushbu tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, oligosakkarid biotinilatsiyasi va ELISA skriningining glikanga yo'naltirilgan monoklonal antikorlar bilan kombinatsiyasi oligosakkaridlardagi o'zaro bog'liqliklarni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin va oligosakkaridlarning tuzilishini tavsiflovchi boshqa biokimyoviy tadqiqotlarda keng qo'llanilishi mumkin.
Ushbu biotin asosidagi glikan profillash usuli o'simlik biomassasidagi eruvchan oligosakkaridlarning itoatsiz uglevod bog'lanishlarini o'rganishga qodir birinchi hisobotdir. Bu bioyoqilg'i ishlab chiqarishga kelganda biomassaning ba'zi qismlari nima uchun bunchalik o'jar ekanligini tushunishga yordam beradi. Ushbu usul glikom tahlil usullaridagi muhim bo'shliqni to'ldiradi va uni o'simlik oligosakkaridlaridan tashqari kengroq substratlarga ham qo'llashni kengaytiradi. Kelajakda biz biotinilatsiya uchun robototexnikadan foydalanishimiz va ELISA yordamida namunalarni yuqori samarali tahlil qilish uchun ishlab chiqqan usulimizdan foydalanishimiz mumkin.
Pioneer 33A14 gibrid urug'laridan yetishtirilgan makkajo'xori somoni (KS) 2010-yilda Kolorado shtatining Rey shahridagi Kramer fermalaridan yig'ib olingan. Yer egasining ruxsati bilan ushbu biomassadan tadqiqot uchun foydalanish mumkin. Namunalar xona haroratida zip-lock paketlarda quruq holda < 6% namlikda saqlandi. Namunalar xona haroratida zip-lock paketlarda quruq holda < 6% namlikda saqlandi. Obraztsy xranilis suximi pri vlajnosti < 6% v paketax s zastejkoy-molniey pri komnatnoy harorate. Namunalar xona haroratida fermuarli paketlarda <6% namlikda quruq holda saqlandi.língíngíngíngíngíngíní< 6% língíngíngíngíngíngíngíng.língíngíngíngíngíní< 6% Obraztsy xranyat v paketax s zastejkoy-molniey pri komnatnoy harorate s vlajnostyu < 6%. Namunalar fermuarli paketlarda xona haroratida namlik < 6% bo'lgan joyda saqlanadi.Tadqiqot mahalliy va milliy ko'rsatmalarga muvofiq bo'ldi. Tarkibiy tahlil NREL protokoli yordamida o'tkazildi. Tarkibida 31,4% glyukan, 18,7% ksilan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktan, 2,2% asetil, 14,3% lignin, 1,7% oqsil va 13,4% kul borligi aniqlandi.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, partiya VCNI 0001) Novozymes (Franklinton, NC, AQSh) dan olingan tsellyulaza, β-glyukozidaza va Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, partiya VHN00001) ning murakkab aralashmasidir. Pektin parchalovchi fermentlarning murakkab aralashmasi bo'lgan Multifect Pectinase® (72 mg protein/ml) DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, AQSh) tomonidan xayriya qilindi. Ferment oqsili konsentratsiyasi Kjeldahl azot tahlili (AOAC usuli 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, AQSh) yordamida oqsil miqdorini baholash (va oqsil bo'lmagan azotning hissasini ayirish) orqali aniqlandi. Diatomaceous earth 545 EMD Millipore (Billerica, MA) dan sotib olindi. Faollashtirilgan uglerod (DARCO, 100 mesh granulalari), Avicel (PH-101), olxa ksilan va boshqa barcha kimyoviy moddalar Sigma-Aldrich (Sent-Luis, MO) dan sotib olindi.
AFEX oldindan ishlov berish GLBRC (Biomassa konversiyasini o'rganish laboratoriyasi, MSU, Lansing, MI, AQSh) da amalga oshirildi. Dastlabki ishlov berish 140°C da 15 daqiqa davomida amalga oshirildi. Zanglamaydigan po'latdan yasalgan stol usti reaktorida (Parr Instruments Company) 60% (w/w) yuklamada suvsiz ammiakning biomassaga 1:1 nisbatida 46 daqiqa turdi. Bu 30 daqiqa davom etdi. Reaktor 140°C ga keltirildi va ammiak tezda ajralib chiqdi, bu esa biomassaning tezda xona haroratiga qaytishiga imkon berdi. AFEX oldindan ishlov berilgan makkajo'xori pechining (ACS) tarkibi ishlov berilmagan makkajo'xori pechining (UT-CS) tarkibiga o'xshash edi.
Oligosaxaridlarni keng miqyosda ishlab chiqarish uchun boshlang'ich material sifatida yuqori qattiq moddalar ACSH 25% (w/w) (taxminan 8% dekstran yuklamasi) tayyorlandi. ACS ning fermentativ gidrolizi Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glyukan (oldindan ishlov berilgan biomassada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glyukan va Multifect Pectinase (Genencor Inc, AQSh) ni o'z ichiga olgan tijorat ferment aralashmasi yordamida amalga oshirildi. Enzimatik gidroliz 3 litr ish hajmi, pH 4.8, 50°C va 250 rpm bo'lgan 5 litrli bioreaktorda amalga oshirildi. 96 soat davomida gidrolizdan so'ng, gidrolizat gidrolizlanmagan qattiq moddalarni olib tashlash uchun 6000 rpm tezlikda 30 daqiqa davomida va keyin 14000 rpm tezlikda 30 daqiqa davomida santrifugalash orqali to'plandi. Keyin gidrolizat 0,22 mm filtr stakani orqali steril filtrlashga uchratildi. Filtrlangan gidrolizat steril idishlarda 4°C da saqlandi va keyin uglerodda fraktsiyalandi.
NREL laboratoriya tahlil protseduralariga muvofiq ekstrakt asosidagi biomassa namunalarining tarkibini tahlil qilish: tarkib tahlili uchun namunalarni tayyorlash (NREL/TP-510-42620) va biomassadagi strukturaviy uglevodlar va ligninni aniqlash (NREL/TP-510 – 42618)47.
Gidrolizat oqimining oligosakkarid tahlili avtoklav asosidagi kislota gidroliz usuli yordamida 2 ml shkala bo'yicha o'tkazildi. Gidrolizat namunasini 10 ml vintli qopqoqli kultura naychasida 69,7 µl 72% sulfat kislota bilan aralashtiring va 121 °C da stol ustida 1 soat davomida inkubatsiya qiling, muz ustida sovuting va yuqori samarali suyuq xromatografiya (HPLC) flakoniga filtrlang. Oligosakkaridlarning konsentratsiyasi kislota-gidrolizlangan namunadagi umumiy shakar konsentratsiyasidan gidrolizlanmagan namunadagi monosaxaridlar konsentratsiyasini ayirish orqali aniqlandi.
Kislota gidrolizlangan biomassadagi glyukoza, ksiloza va arabinoza konsentratsiyalari Bio-Rad Aminex HPX-87H ustunidagi avtosampler, ustunli isitgich, izokratik nasos va sinish ko'rsatkichi detektori bilan jihozlangan Shimadzu HPLC tizimi yordamida tahlil qilindi. Ustun 50°C haroratda ushlab turildi va suv oqimida 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 bilan elyutlandi.
Gidrolizat ustki qatlami suyultirildi va monomer va oligosaxarid miqdori tahlil qilindi. Fermentativ gidrolizdan so'ng olingan monomer shakarlar Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ustuni va kul himoyasi ustuni bilan jihozlangan HPLC yordamida tahlil qilindi. Ustun harorati 80°C da saqlandi, suv harakatlanuvchi faza sifatida 0,6 ml/min oqim tezligi bilan ishlatildi. Oligosaxaridlar 41, 48, 49-havolalarda tasvirlangan usullarga muvofiq 121°C da suyultirilgan kislotada gidroliz orqali aniqlandi.
Saxarid tahlili xom, AFEX oldindan ishlov berilgan va barcha gidrolizlanmagan biomassa qoldiqlarida (shu jumladan, ketma-ket hujayra devori ekstraktlarini ishlab chiqarish va ularning mAb skriningi) avval tasvirlangan 27, 43, 50, 51 protseduralari yordamida o'tkazildi. Glikom tahlili uchun o'simlik hujayra devori materialining spirtda erimaydigan qoldiqlari biomassa qoldiqlaridan tayyorlanadi va avval tasvirlanganidek, ammoniy oksalat (50 mM), natriy karbonat (50 mM va 0,5% w/v), CON (1M va 4M, ikkalasi ham 1% w/v natriy borohidrid bilan) va kislota xlorit kabi tobora agressiv reagentlar bilan ketma-ket ekstraksiyaga uchraydi52,53. Keyin ekstraktlar hujayra devori glikaniga yo'naltirilgan mAb50s kompleks paneliga qarshi ELISAga duchor qilindi va mAb bog'lanish reaksiyalari issiqlik xaritasi sifatida taqdim etildi. O'simlik hujayra devori glikaniga qaratilgan mAblar laboratoriya zaxiralaridan (CCRC, JIM va MAC seriyalari) sotib olindi.
Oligosakkaridlarning bir bosqichli biotinillanishi. Uglevodlarni biotin-LC-gidrazid bilan konjugatsiya qilish quyidagi protsedura yordamida amalga oshirildi. Biotin-LC-gidrazid (4,6 mg/12 mkmol) dimetil sulfoksidda (DMSO, 70 mkl) kuchli aralashtirish va 65°C da 1 daqiqa davomida qizdirish orqali eritildi. Muzlik sirka kislotasi (30 mkl) qo'shildi va aralashma natriy siyanoborohidridga (6,4 mg/100 mkmol) quyildi va 65°C da taxminan 1 daqiqa davomida qizdirilgandan so'ng to'liq eritildi. Keyin, quritilgan oligosakkaridga (1-100 nmol) reaksiya aralashmasining 5 dan 8 mkl gacha qo'shilib, yorliqning qaytaruvchi uchidan 10 baravar yoki undan ko'p molyar ortiqcha miqdori olindi. Reaksiya 65°C da 2 soat davomida olib borildi, shundan so'ng namunalar darhol tozalandi. Natriy siyanoborohidridini qayta tiklashsiz etiketlash tajribalarida ishlatilmadi va namunalar 65°C da 2,5 soat davomida reaksiyaga kirishdi.
Biotinlangan oligosakkaridlar namunalarini ELISA bilan qoplash va yuvish. Avidin bilan qoplangan plastinkaning har bir qudug'iga 25 mkl biotinlangan namunalar (har bir konsentrlangan namunadan 100 mkl 5 ml 0,1 M Tris bufer eritmasida (TBS) suyultirildi) qo'shildi. Nazorat qudug'lari 0,1 M TBS da 10 mkg/ml konsentratsiyada 50 mkl biotin bilan qoplandi. Bo'sh o'lchovlar uchun qoplama sifatida deionlangan suv ishlatilgan. Tabletka xona haroratida qorong'i joyda 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. Grenier flat 3A uchun 11-sonli dastur yordamida plastinkani 0,1 M TBS da 0,1% yog'sizlantirilgan sut bilan 3 marta yuving.
Birlamchi antitelolarni qo'shish va yuvish. Har bir chuqurchaga 40 µl birlamchi antitelo qo'shing. Mikroplastinkani xona haroratida qorong'i joyda 1 soat davomida inkubatsiya qiling. Keyin plastinalar Grenier Flat 3A uchun 11-yuvish dasturi yordamida 0,1% sut bilan 0,1 M TBS da 3 marta yuvildi.
Ikkilamchi antitelo qo'shing va yuving. Har bir chuqurchaga 50 µl sichqon/kalamush ikkilamchi antitelosini (0,1 M TBS da 0,1% sutda 1:5000 suyultirilgan) qo'shing. Mikroplastinkani xona haroratida qorong'i joyda 1 soat davomida inkubatsiya qiling. Keyin mikroplastinkalar Grenier Flat 5A plastinka yuvish dasturi №12 yordamida 0,1% sut bilan 0,1 M TBS da 5 marta yuvildi.
Substrat qo'shish. Asosiy substratga 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) qo'shing (15 ml deionizatsiyalangan suvga 2 tomchi bufer, 3 tomchi TMB, 2 tomchi vodorod peroksid qo'shish orqali). TMB substratini tayyorlang. Ishlatishdan oldin aralashtiring. Mikroplastinkani xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Qorong'ida.
Bosqichni bajaring va planshetni o'qing. Har bir chuqurchaga 50 µl 1 N sulfat kislota qo'shing va ELISA o'quvchi yordamida 450 dan 655 nm gacha bo'lgan absorbsiyani yozib oling.
Ushbu analitlarning 1 mg/ml eritmalarini deionizatsiyalangan suvda tayyorlang: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksiloza, galakturon kislotasi (GalA), glyukuron kislotasi (GlcA), mannoza, glyukoza, galaktoza, laktoza, N-atsetilmannozamin (manNAc), N-atsetilglyukozamin. (glcNAc), N-atsetilgalaktozamin (galNAc), inozitol (ichki standart). 1-jadvalda ko'rsatilgan 1 mg/ml shakar eritmalarini qo'shish orqali ikkita standart tayyorlandi. Namunalar barcha suv olib tashlanguncha (odatda taxminan 12-18 soat) -80°C da muzlatiladi va liofilizatsiya qilinadi.
Analitik tarozida vintli qopqoqli naychalarga 100–500 µg namuna qo'shing. Qo'shilgan miqdorni yozib oling. Namunani ma'lum bir konsentratsiyadagi erituvchida eritib, uni naychaga suyuq alikvot sifatida qo'shish yaxshidir. Har bir namuna naychasi uchun ichki standart sifatida 20 µl 1 mg/ml inozitoldan foydalaning. Namunaga qo'shilgan ichki standart miqdori standart naychaga qo'shilgan ichki standart miqdoriga teng bo'lishi kerak.
Vintli qopqoqli flakonga 8 ml suvsiz metanol qo'shing. Keyin 4 ml 3 N metanolli HCl eritmasini qo'shing, qopqoq bilan yoping va chayqating. Bu jarayonda suv ishlatilmaydi.
Oligosaxarid namunalari va standart TMS naychalariga 500 µl 1 M HCl metanol eritmasini qo'shing. Namunalar 80°C da bir kechada (168 soat) termal blokda inkubatsiya qilindi. Metanoliz mahsulotini xona haroratida quritish manifoldu yordamida quriting. 200 µl MeOH qo'shing va yana quriting. Bu jarayon ikki marta takrorlanadi. Namunaga 200 µl metanol, 100 µl piridin va 100 µl sirka angidridini qo'shing va yaxshilab aralashtiring. Namunalar xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va quritildi. 200 µl metanol qo'shing va yana quriting.
200 µl Tri-Sil qo'shing va qopqoqli naychani 20 daqiqa davomida qizdiring. 80°C, keyin xona haroratiga qadar sovuting. Namunani taxminan 50 µl hajmgacha quritish uchun quritish kollektoridan foydalaning. Shuni ta'kidlash kerakki, biz namunalarning to'liq qurishiga yo'l qo'ymadik.
2 ml geksan qo'shing va vortekslash orqali yaxshilab aralashtiring. Pasteur pipetkalarining uchlarini (5-8 mm) shisha jun bo'lagi bilan to'ldiring, shisha junni 5-3/4 dyuym diametrli pipetka ustiga qo'ying. Namunalar 3000 g da 2 daqiqa davomida santrifuga qilindi. Erimaydigan qoldiqlar cho'ktiriladi. Namunani 100-150 µl gacha quriting. Taxminan 1 µl hajmdagi mahsulot GC-MS ga 80 °C boshlang'ich haroratda va 2,0 daqiqa boshlang'ich vaqt davomida yuborildi (2-jadval).