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AFEX로 전처리된 옥수수대에서 지속성 올리고당의 복잡한 분석을 위한 새로운 면역학적 및 질량 분석 방법.목질계 바이오매스는 화석 연료에 대한 지속 가능한 대안이며 식품, 사료, 연료 및 화학 물질과 같은 제품 생산을 위한 생명 공학 개발에 널리 사용됩니다.이러한 기술의 핵심은 식물 세포벽에 존재하는 복합 탄수화물을 포도당, 자일로스 및 아라비노스와 같은 단순당으로 전환하기 위한 비용 경쟁력 있는 공정의 개발입니다.목질계 바이오매스는 매우 단단하기 때문에 원하는 제품을 얻기 위해서는 열화학적 처리(예: 암모니아 섬유 박리(AFEX), 묽은 산(DA), 이온성 액체(IL)) 및 생물학적 처리(예: 효소 가수분해 및 미생물 발효)를 함께 수행해야 합니다..그러나 상업적인 진균 효소를 가수분해 공정에 사용하면 형성된 가용성 당의 75-85%만이 단당류이고 나머지 15-25%는 수용성 난치성 올리고당으로 미생물이 항상 이용할 수 있는 것은 아닙니다.이전에 우리는 탄소와 규조토 분리 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합을 사용하여 가용성 완고한 올리고당을 성공적으로 분리 및 정제했으며 효소 억제 특성도 조사했습니다.더 높은 중합도(DP) 메틸화 우론산 치환체를 포함하는 올리고당은 낮은 DP 및 중성 올리고당보다 시판되는 효소 블렌드로 처리하기가 더 어렵다는 것을 발견했습니다.여기서 우리는 식물 세포벽 및 효소 가수분해물에서 글리칸 결합을 특성화하기 위해 식물 바이오매스 글리칸에 특이적인 단클론 항체(mAb)를 사용하는 글리칸 프로파일링, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화, 비행 시간 질량 분석법을 포함한 몇 가지 추가 방법의 사용을 보고합니다..MALDI-TOF-MS)는 음이온의 2차 붕괴 후 분광법, 가스 크로마토그래피 및 질량 분석법(GC-MS)으로 얻은 구조 정보 진단 피크를 사용하여 유도체화 유무에 관계없이 올리고당 결합을 특성화합니다.올리고당(DP 4–20)은 크기가 작기 때문에 이러한 분자는 mAb 결합 및 특성화에 사용하기 어렵습니다.이 문제를 극복하기 위해 마이크로플레이트 표면에 대부분의 낮은 DP 수용성 올리고당을 성공적으로 표지한 새로운 비오틴 접합 기반 올리고당 고정화 방법을 적용한 다음 특정 결찰 분석을 위해 고처리량 mAb 시스템에 사용했습니다.이 새로운 방법은 진단 목적으로 바이오마커에 존재하는 올리고당을 분리하고 특성화하는 데 사용할 수 있는 미래의 고급 고처리량 글리코메 분석의 개발을 촉진할 것입니다.
농업, 임업, 잔디 및 목질 재료로 구성된 목질계 바이오매스는 고부가가치 제품을 생산하기 위한 식품, 사료, 연료 및 화학 전구체를 포함한 바이오 기반 제품 생산을 위한 잠재적 공급원료입니다1.식물 세포벽에 존재하는 탄수화물(예: 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스)은 화학적 처리 및 생체 변환(예: 효소 가수분해 및 미생물 발효)에 의해 단당류로 해중합됩니다.일반적인 전처리에는 암모니아 섬유 확장(AFEX), 묽은 산(DA), 이온성 액체(IL) 및 증기 폭발(SE)이 포함되며, 화학 물질과 열의 조합을 사용하여 식물 세포벽을 열어 리그노셀룰로오스 생산을 줄입니다3,4.물질의 완고함, 5. 효소 가수분해는 상업적 활성 탄수화물 함유 효소(CAZymes)를 사용하여 높은 고형물 부하에서 수행되며 바이오 기반 연료 및 화학 물질을 생산하기 위해 트랜스제닉 효모 또는 박테리아를 사용하는 미생물 발효가 수행됩니다 6 .
상용 효소의 CAZymes는 복잡한 탄수화물-당 결합을 상승적으로 절단하여 단당류를 형성하는 효소의 복잡한 혼합물로 구성됩니다2,7.우리가 이전에 보고한 바와 같이, 탄수화물과 함께 리그닌의 방향족 폴리머의 복잡한 네트워크는 그것들을 매우 다루기 어렵게 만들고, 이는 불완전한 당 전환으로 이어지고, 전처리된 바이오매스의 효소적 가수분해 동안 생성되지 않는 성 올리고당의 15-25%를 축적합니다.이것은 다양한 바이오매스 전처리 방법에서 흔히 발생하는 문제입니다.이 병목 현상의 몇 가지 이유는 가수분해 중 효소 억제 또는 식물 바이오매스에서 당 결합을 끊는 데 필요한 필수 필수 효소의 부재 또는 낮은 수준을 포함합니다.올리고당의 당 결합과 같은 당의 구성 및 구조적 특성을 이해하면 가수분해 중 당 전환을 개선하여 생명 공학 공정을 석유 유래 제품과 비용 경쟁력 있게 만들 수 있습니다.
탄수화물의 구조를 결정하는 것은 어렵고 액체 크로마토그래피(LC)11,12, 핵 자기 공명 분광법(NMR)13, 모세관 전기영동(CE)14,15,16 및 질량 분석법(MS)17과 같은 방법의 조합이 필요합니다.,십팔.매트릭스(MALDI-TOF-MS)를 사용한 레이저 탈착 및 이온화를 통한 비행 시간형 질량 분석법과 같은 MS 방법은 탄수화물 구조를 식별하기 위한 다목적 방법입니다.최근에 나트륨 이온 부가물의 충돌 유도 해리(CID) 직렬 MS는 올리고당 부착 위치, 아노머 구성, 서열 및 분지 위치에 해당하는 지문을 식별하는 데 가장 널리 사용되었습니다 20, 21 .
글리칸 분석은 탄수화물 결합을 심층적으로 식별하기 위한 훌륭한 도구입니다22.이 방법은 복잡한 탄수화물 연결을 이해하기 위한 프로브로 식물 세포벽 글리칸에 대한 단클론 항체(mAb)를 사용합니다.다양한 당류24를 사용하여 다양한 선형 및 분지형 올리고당에 대해 설계된 250개 이상의 mAb가 전 세계적으로 사용 가능합니다.식물 세포 유형, 기관, 연령, 발달 단계 및 성장 환경25,26에 따라 상당한 차이가 있기 때문에 여러 mAb가 식물 세포벽의 구조, 구성 및 변형을 특성화하는 데 널리 사용되었습니다.보다 최근에 이 방법은 식물 및 동물 시스템의 소포 인구와 세포하 마커, 발달 단계 또는 환경 자극에 의해 결정된 글리칸 수송에서의 각각의 역할을 이해하고 효소 활성을 결정하는 데 사용되었습니다.확인된 글리칸 및 자일란의 다른 구조에는 펙틴(P), 자일란(X), 만난(M), 자일로글루칸(XylG), 혼합 결합 글루칸(MLG), 아라비노자일란(ArbX), 갈락토만난(GalG), 글루쿠론산-아라비자일란(GArbX) 및 아라비노-갈락탄(ArbG)29이 포함됩니다.
그러나 이러한 모든 연구 노력에도 불구하고 올리고당 방출, 가수분해 중 올리고머 사슬 길이 변화, 다양한 저 DP 폴리머 및 곡선을 포함하여 높은 고형물 부하(HSL) 가수분해 동안 올리고당 축적의 특성에 초점을 맞춘 연구는 소수에 불과합니다.분포 30,31,32.한편, 글리칸 분석은 글리칸 구조의 포괄적인 분석에 유용한 도구임이 입증되었지만 항체 방법을 사용하여 수용성 저DP 올리고당을 평가하는 것은 어렵습니다.분자량이 5-10kDa 미만인 더 작은 DP 올리고당은 ELISA 플레이트 33, 34에 결합하지 않으며 항체 추가 전에 세척됩니다.
여기에서 처음으로 단일 클론 항체를 사용하여 아비딘 코팅 플레이트에서 ELISA 분석을 시연하고 용해성 내화성 올리고당에 대한 1단계 비오티닐화 절차와 글리코메 분석을 결합합니다.글리코메 분석에 대한 우리의 접근 방식은 가수분해된 설탕 조성물의 트리메틸실릴(TMS) 유도체화를 사용하여 상보적인 올리고당 결합의 MALDI-TOF-MS 및 GC-MS 기반 분석에 의해 검증되었습니다.이 혁신적인 접근 방식은 미래에 처리량이 많은 방법으로 개발될 수 있으며 생물 의학 연구35에서 더 넓은 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다.
글리코실화와 같은 효소 및 항체의 번역 후 변형36은 생물학적 활성에 영향을 미칩니다.예를 들어, 혈청 단백질의 글리코실화 변화는 염증성 관절염에서 중요한 역할을 하며, 글리코실화 변화는 진단 마커로 사용됩니다37.다양한 글리칸이 위장관 및 간의 만성 염증성 질환, 바이러스 감염, 난소암, 유방암 및 전립선암을 비롯한 다양한 질병에 쉽게 나타나는 것으로 문헌에 보고되었습니다38,39,40.항체 기반 글리칸 ELISA 방법을 사용하여 글리칸의 구조를 이해하면 복잡한 MS 방법을 사용하지 않고도 질병 진단에 대한 추가적인 확신을 얻을 수 있습니다.
우리의 이전 연구는 완고한 올리고당이 전처리 및 효소적 가수분해 후에 가수분해되지 않은 채로 남아 있음을 보여주었습니다(그림 1).이전에 발표된 작업에서 AFEX 전처리된 옥수수 스토버 가수분해물(ACSH)8에서 올리고당을 분리하는 활성탄 고체상 추출 방법을 개발했습니다.초기 추출 및 분리 후, 올리고당을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 추가로 분획하고 분자량 순으로 수집하였다.다양한 전처리에서 방출되는 당 단량체 및 올리고머를 당 조성 분석으로 분석하였다.다양한 전처리 방법으로 얻은 당 올리고머의 함량을 비교할 때 완고한 올리고당의 존재는 바이오매스를 단당류로 전환하는 일반적인 문제이며 설탕 수율을 최소 10-15%, 심지어 최대 18%까지 감소시킬 수 있습니다.우리를.이 방법은 올리고당 분획의 추가 대규모 생산에 사용됩니다.생성된 ACH 및 다른 분자량을 가진 후속 분획물은 이 작업에서 올리고당의 특성화를 위한 실험 재료로 사용되었습니다.
전처리 및 효소적 가수분해 후, 지속성 올리고당은 가수분해되지 않은 상태로 남아 있었습니다.여기서 (A)는 활성탄과 규조토의 충전층을 사용하여 AFEX-전처리된 옥수숫대 가수분해물(ACSH)로부터 올리고당을 분리하는 올리고당 분리 방법이다;(B) 올리고당의 분리 방법.올리고당류는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 추가로 분리되었다;(C) 다양한 전처리에서 방출된 당류 단량체 및 올리고머(희석산: DA, 이온성 액체: IL 및 AFEX).효소적 가수분해 조건: 25%(w/w)의 고형분 로딩(약 8% 글루칸 로딩), 96시간 가수분해, 20mg/g 상업적 효소 로딩(Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 비율) 및 (D) AFEX 전처리 옥수수대(ACS)에서 방출된 글루코스, 자일로스 및 아라비노스의 올리고머 및 올리고머.
글리칸 분석은 고체 바이오매스 잔류물에서 분리된 추출물에서 글리칸의 포괄적인 구조 분석에 유용한 도구임이 입증되었습니다.그러나 저분자량 올리고당은 ELISA 플레이트에 고정하기 어렵고 항체 추가 전에 세척되기 때문에 수용성 당류는 이 전통적인 방법41을 사용하여 과소 표현됩니다.따라서, 항체 결합 및 특성화를 위해, 아비딘-코팅된 ELISA 플레이트 상에 수용성 비순응 올리고당류를 코팅하기 위해 1단계 비오티닐화 방법을 사용하였다.이 방법은 이전에 생산된 ACSH와 분자량(또는 중합도, DP)을 기준으로 한 분획을 사용하여 테스트되었습니다.탄수화물의 환원 말단에 비오틴-LC-히드라지드를 첨가하여 올리고당 결합 친화도를 증가시키기 위해 1단계 비오티닐화를 사용했습니다(그림 2).용액에서 환원 말단의 헤미아세탈 그룹은 비오틴-LC-하이드라지드의 하이드라지드 그룹과 반응하여 하이드라존 결합을 형성합니다.환원제 NaCNBH3가 존재하면 히드라존 결합이 안정한 비오티닐화 최종 생성물로 환원됩니다.당 환원 말단의 변형으로 ELISA 플레이트에 대한 낮은 DP 올리고당의 결합이 가능해졌으며, 본 연구에서는 글리칸 표적 mAb를 사용하여 아비딘 코팅된 플레이트에서 수행되었습니다.
biotinylated oligosaccharides에 대한 ELISA를 기반으로 한 단일 클론 항체의 스크리닝.여기에서 (A) 올리고당의 조합된 비오티닐화 및 NeutrAvidin 코팅된 플레이트에서 글리칸 표적 mAb를 사용한 후속 ELISA 스크리닝 및 (B) 반응 생성물의 비오티닐화를 위한 1단계 절차를 보여줍니다.
올리고당이 결합된 항체가 포함된 Avidin 코팅 플레이트를 1차 및 2차 항체에 첨가하고 빛과 시간에 민감한 배지에서 세척했습니다.항체 결합이 완료된 후 TMB 기판을 추가하여 플레이트를 배양합니다.최종적으로 황산으로 반응을 정지시켰다.배양된 플레이트를 ELISA 판독기를 사용하여 분석하여 항체 특이적 가교를 검출하기 위해 각 항체의 결합 강도를 결정하였다.실험의 세부 사항 및 매개 변수는 해당 섹션 "재료 및 방법"을 참조하십시오.
우리는 리그노셀룰로스 가수분해물로부터 분리된 원유 및 정제된 올리고당 분획뿐만 아니라 ACSH에 존재하는 수용성 올리고당을 특성화하여 특정 응용 분야에 대해 이 새로 개발된 방법의 유용성을 입증합니다.그림 3에서 볼 수 있듯이 바이오아실화 글리코메 분석 방법을 사용하여 ACSH에서 확인된 가장 일반적인 에피토프 대체 자일란은 일반적으로 우론(U) 또는 메틸우론(MeU) 및 펙틴 아라비노갈락탄입니다.이들 중 대부분은 가수분해되지 않은 고체(UHS)의 글리칸 분석에 대한 이전 연구에서도 발견되었습니다43.
세포벽 글리칸에 대한 단클론 항체를 사용한 다루기 힘든 올리고당 에피토프의 검출."중성" 부분은 ACN 부분이고 "산성" 부분은 FA 부분입니다.히트맵에서 더 밝은 빨간색은 더 높은 에피토프 함량을 나타내고 더 밝은 파란색은 빈 배경을 나타냅니다.스케일의 색상 값은 제형 N=2에 대한 원시 OD 값을 기반으로 합니다.항체가 인식하는 주요 에피토프는 오른쪽에 표시됩니다.
이러한 비 셀룰로스 구조는 가장 일반적으로 사용되는 상업용 효소를 포함하는 테스트된 상업용 효소 혼합물에서 가장 일반적인 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제에 의해 절단될 수 없습니다.따라서 가수분해를 위해서는 새로운 보조 효소가 필요하다.필요한 비셀룰로오스 보조 효소가 없으면 이러한 비셀룰로오스 결합은 모당 중합체가 더 짧은 조각으로 광범위하게 가수분해되고 상업용 효소 혼합물을 사용하여 용해되더라도 단당류로의 완전한 전환을 방지합니다.
신호 분포 및 결합 강도에 대한 추가 연구는 결합 에피토프가 이합체에서 낮은 DP 분율(D, E, F, DP)보다 높은 DP 당 분율(A, B, C, DP 최대 20+)에서 더 낮다는 것을 보여주었습니다(그림 1).산성 단편은 중성 단편보다 비셀룰로오스 에피토프에서 더 일반적입니다.이러한 현상은 이전 연구에서 관찰된 패턴과 일치하며, 여기서 높은 DP 및 산 모이어티는 효소 가수분해에 더 저항적이었습니다.따라서 비셀룰로오스 글리칸 에피토프와 U 및 MeU 치환의 존재는 올리고당의 안정성에 크게 기여할 수 있습니다.특히 에피토프가 이량체 또는 삼량체 올리고당인 경우 낮은 DP 올리고당에 대해 결합 및 검출 효율이 문제가 될 수 있다는 점에 유의해야 합니다.이것은 각각 특정 mAb에 결합하는 하나의 에피토프만 포함하는 다양한 길이의 상업용 올리고당을 사용하여 테스트할 수 있습니다.
따라서 구조 특이적 항체를 사용하면 특정 유형의 저항성 결합이 드러났습니다.사용된 항체의 유형, 적절한 결찰 패턴 및 그것이 생성하는 신호의 강도(가장 많거나 가장 적음)에 따라 새로운 효소를 확인하고 반정량적으로 효소 혼합물에 첨가하여 보다 완전한 글리코전환을 할 수 있습니다.ACSH 올리고당의 분석을 예로 들어 각 바이오매스 물질에 대한 글리칸 결합의 데이터베이스를 만들 수 있습니다.여기에서 항체의 서로 다른 친화력을 고려해야 하며 친화력을 알 수 없는 경우 서로 다른 항체의 신호를 비교할 때 특정 어려움이 발생한다는 점에 유의해야 합니다.또한 글리칸 결합의 비교는 동일한 항체에 대한 샘플 간에 가장 잘 작동할 수 있습니다.그런 다음 이러한 완고한 결합을 CAZyme 데이터베이스에 연결하여 효소를 식별하고, 후보 효소를 선택하고, 결합 파괴 효소를 테스트하거나, 바이오리파이너리에서 사용하기 위해 이러한 효소를 발현하는 미생물 시스템을 개발할 수 있습니다44.
면역학적 방법이 리그노셀룰로스 가수분해물에 존재하는 저분자량 올리고당을 특성화하기 위한 대체 방법을 어떻게 보완하는지 평가하기 위해 동일한 패널에서 MALDI(그림 4, S1-S8) 및 GC-MS를 기반으로 한 TMS 유래 당류 분석을 수행했습니다(그림 5) 올리고당 부분.MALDI는 올리고당 분자의 질량 분포가 의도한 구조와 일치하는지 여부를 비교하는 데 사용됩니다.무화과에.도 4는 중성 성분 ACN-A 및 ACN-B의 MC를 나타낸다.ACN-A 분석은 DP 4-8(그림 4)에서 DP 22(그림 S1)까지 범위의 오탄당 범위를 확인했으며, 무게는 MeU-자일란 올리고당에 해당합니다.ACN-B 분석은 DP 8-15와 오탄당 및 글루코자일란 시리즈를 확인했습니다.그림 S3과 같은 보충 자료에서 FA-C 산성 모이어티 질량 분포 지도는 ELISA 기반 mAb 스크리닝에서 발견된 치환된 자일란과 일치하는 DP가 8-15인 (Me)U 치환 오탄당의 범위를 보여줍니다.에피토프는 일치합니다.
ACS에 존재하는 수용성 비준수 올리고당의 MALDI-MS 스펙트럼.여기서, (A) ACN-A 저중량 범위 분획은 메틸화 우론산(DP 4-8) 치환된 글루쿠로자일란 올리고당 및 (B) ACN-B 자일란 및 글루쿠로자일란으로 치환된 메틸화 우론산 올리고당(DP 8-15)을 함유한다.
내화성 올리고당의 글리칸 잔기 조성 분석.여기서 (A) GC-MS 분석을 사용하여 얻은 다양한 올리고당 분획의 TMS 당류 조성.(B) 올리고당에 존재하는 다양한 TMS 유래 당의 구조.ACN – 중성 올리고당을 포함하는 아세토니트릴 분획 및 FA – 산성 올리고당을 포함하는 페룰산 분획.
그림 S9에 표시된 것처럼 올리고당 분획의 LC-MS 분석에서 또 다른 흥미로운 결론을 도출했습니다(방법은 전자 보충 자료에서 볼 수 있음).ACN-B 분획을 연결하는 동안 hexose 및 -OAc 그룹의 단편이 반복적으로 관찰되었습니다.이 발견은 glycome 및 MALDI-TOF 분석에서 관찰된 단편화를 확인할 뿐만 아니라 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스에서 잠재적인 탄수화물 유도체에 대한 새로운 정보를 제공합니다.
또한 TMS 당 유도체화를 이용하여 올리고당 분획의 당 조성을 분석하였다.GC-MS를 사용하여 올리고당 분획에서 신경(비유도체) 및 산성 당(GluA 및 GalA)의 조성을 결정했습니다(그림 5).글루쿠론산은 산성 성분 C와 D에서 발견되는 반면 갈락투론산은 산성 성분 A와 B에서 발견되며 둘 다 산성 당의 높은 DP 성분입니다.이러한 결과는 ELISA 및 MALDI 데이터를 확인할 뿐만 아니라 올리고당 축적에 대한 이전 연구와도 일치합니다.따라서 우리는 올리고당의 비오티닐화 및 후속 ELISA 스크리닝을 사용하는 현대 면역학적 방법이 다양한 생물학적 샘플에서 수용성 난분해성 올리고당을 검출하기에 충분하다고 믿습니다.
ELISA 기반 mAb 스크리닝 방법은 여러 가지 다른 방법으로 검증되었으므로 이 새로운 정량 방법의 잠재력을 더 탐구하고 싶었습니다.2개의 상용 올리고당인 xylohexasaccharide oligosaccharide(XHE) 및 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose(A2XX)를 구입하여 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 새로운 mAb 접근법을 사용하여 테스트했습니다.그림 6은 biotinylated 바인딩 신호와 올리고당 농도의 로그 농도 사이의 선형 상관 관계를 보여 주며 가능한 Langmuir 흡착 모델을 제안합니다.mAb 중에서 CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 및 CCRC-M151은 XHE와 상관관계가 있었고, CCRC-M108, CCRC-M109 및 LM11은 A2XX와 1 nm ~ 100 nano의 범위에서 상관관계가 있었습니다.실험 중 항체의 제한된 가용성으로 인해 각 올리고당 농도로 제한된 실험을 수행했습니다.여기에서 일부 항체는 기질로서 동일한 올리고당에 매우 다르게 반응한다는 점에 유의해야 합니다. 아마도 항체는 약간 다른 에피토프에 결합하고 매우 다른 결합 친화도를 가질 수 있기 때문입니다.정확한 에피토프 식별의 메커니즘과 의미는 새로운 mAb 접근법이 실제 샘플에 적용될 때 훨씬 더 복잡해질 것입니다.
다양한 글리칸-표적 mAb의 검출 범위를 결정하기 위해 2개의 상업용 올리고당을 사용했습니다.여기서, 올리고당 농도의 로그 농도와의 선형 상관관계는 (A) mAb가 있는 XHE 및 (B) mAb가 있는 A2XX에 대한 Langmuir 흡착 패턴을 나타냅니다.해당 에피토프는 분석에서 기질로 사용되는 상업용 올리고당의 구조를 나타냅니다.
글리칸 표적 단클론 항체(글리코믹 분석 또는 ELISA 기반 mAb 스크리닝)의 사용은 식물 바이오매스를 구성하는 대부분의 주요 세포벽 글리칸의 심층 특성화를 위한 강력한 도구입니다.그러나 고전적인 글리칸 분석은 대부분의 올리고당이 ELISA 플레이트에 효율적으로 고정되지 않기 때문에 더 큰 세포벽 글리칸만을 특성화합니다.이 연구에서 AFEX 전처리된 옥수수 대는 고형분 함량에서 효소적으로 가수분해되었습니다.당 분석은 가수분해물에서 다루기 힘든 세포벽 탄수화물의 조성을 결정하는 데 사용되었습니다.그러나 가수분해물에서 더 작은 올리고당의 mAb 분석은 과소 평가되었으며 ELISA 플레이트에 올리고당을 효과적으로 고정하기 위해서는 추가 도구가 필요합니다.
NeutrAvidin™ 코팅 플레이트에서 올리고당 비오티닐화와 ELISA 스크리닝을 결합하여 mAb 스크리닝을 위한 새롭고 효율적인 올리고당 고정화 방법을 보고합니다.고정된 비오티닐화 올리고당은 항체에 대한 충분한 친화성을 나타내어 다루기 힘든 올리고당을 신속하고 효율적으로 검출할 수 있습니다.질량 분석법을 기반으로 완고한 올리고당의 구성을 분석한 결과 면역 스크리닝에 대한 이 새로운 접근 방식의 결과가 확인되었습니다.따라서, 이러한 연구는 올리고당 비오티닐화 및 ELISA 스크리닝과 글리칸 표적 단클론 항체의 조합이 올리고당의 가교를 검출하는 데 사용될 수 있고 올리고당의 구조를 특성화하는 다른 생화학적 연구에 널리 적용될 수 있음을 입증합니다.
이 비오틴 기반 글리칸 프로파일링 방법은 식물 바이오매스에서 수용성 올리고당의 다루기 힘든 탄수화물 결합을 조사할 수 있는 최초의 보고서입니다.이것은 바이오연료 생산과 관련하여 바이오매스의 일부가 왜 그렇게 완고한지 이해하는 데 도움이 됩니다.이 방법은 글리코메 분석 방법의 중요한 격차를 메우고 식물 올리고당을 넘어 더 넓은 범위의 기질로 적용을 확장합니다.미래에 우리는 biotinylation에 로봇 공학을 사용하고 ELISA를 사용하여 샘플의 높은 처리량 분석을 위해 개발한 방법을 사용할 수 있습니다.
Pioneer 33A14 잡종 종자에서 자란 옥수수 짚(CS)은 2010년 콜로라도 레이의 Kramer Farms에서 수확되었습니다.토지 소유자의 허가를 받아 이 바이오매스는 연구에 사용될 수 있습니다. 샘플은 실온에서 지퍼백에 6% 미만의 건조 상태로 보관되었습니다. 샘플은 실온에서 지퍼백에 6% 미만의 건조 상태로 보관되었습니다. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-molнией при комнатной температуре. 샘플은 실온에서 지퍼가 달린 백에 6% 미만의 습도로 건조한 상태로 보관했습니다.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-molнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. 샘플은 습도 < 6%의 실온에서 지퍼백에 보관됩니다.이 연구는 지역 및 국가 지침을 준수했습니다.구성 분석은 NREL 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다.조성물은 31.4% 글루칸, 18.7% 자일란, 3.3% 아라비난, 1.2% 갈락탄, 2.2% 아세틸, 14.3% 리그닌, 1.7% 단백질 및 13.4% 회분을 함유하는 것으로 밝혀졌다.
Cellic® CTec2(138mg 단백질/ml, 로트 VCNI 0001)는 Novozymes(Franklinton, NC, USA)의 셀룰라아제, β-글루코시다아제 및 Cellic® HTec2(157mg 단백질/ml, 로트 VHN00001)의 복합 혼합물입니다.펙틴 분해 효소의 복합 혼합물인 Multifect Pectinase®(72mg 단백질/mL)는 DuPont Industrial Biosciences(Palo Alto, CA, USA)에서 기증했습니다.효소 단백질 농도는 Kjeldahl 질소 분석(AOAC 방법 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA)을 사용하여 단백질 함량을 추정하고(및 비단백질 질소의 기여도를 빼서) 결정했습니다.규조토 545는 EMD Millipore(Billerica, MA)에서 구입했습니다.활성 탄소(DARCO, 100 메쉬 과립), Avicel(PH-101), 너도밤나무 자일란 및 기타 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했습니다.
AFEX 전처리는 GLBRC(Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA)에서 수행되었습니다.전처리는 140℃에서 15분 동안 수행하였다.46 스테인레스강 벤치탑 배치 반응기(Parr Instruments Company)에서 60%(w/w) 로딩에서 무수 암모니아 대 바이오매스의 1:1 비율에서 체류 시간.30분이 걸렸습니다.반응기는 140°C가 되었고 암모니아가 빠르게 방출되어 바이오매스가 빠르게 실온으로 돌아왔습니다.AFEX 전처리 옥수수대(ACS)의 조성은 미처리 옥수수대(UT-CS)의 조성과 유사했습니다.
고형분 ACSH 25%(w/w)(약 8% 덱스트란 로딩)를 올리고당의 대규모 생산을 위한 출발 물질로 준비했습니다.ACS의 효소적 가수분해는 Cellic® Ctec2 10mg 단백질/g 글루칸(전처리된 바이오매스 내), Htec2(Novozymes, Franklinton, NC), 5mg 단백질/g 글루칸 및 Multifect Pectinase(Genencor Inc, USA)를 포함하는 상업적 효소 혼합물을 사용하여 수행되었습니다.).), 5 mg 단백질/g 덱스트란.효소 가수분해는 작업 부피가 3리터인 5리터 생물 반응기, pH 4.8, 50°C 및 250rpm에서 수행되었습니다.96시간 동안 가수분해한 후, 가수분해물을 6000rpm에서 30분 동안 원심분리한 다음 14000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 가수분해되지 않은 고형물을 제거하였다.이어서 가수분해물을 0.22mm 필터 비이커를 통해 멸균 여과하였다.여과된 가수분해물을 4℃에서 멸균 병에 보관한 후 탄소 상에서 분별하였다.
NREL 실험실 분석 절차에 따른 추출물 기반 바이오매스 시료의 조성 분석: 조성 분석을 위한 시료 준비(NREL/TP-510-42620) 및 바이오매스의 구조적 탄수화물 및 리그닌 결정(NREL/TP-510 – 42618)47.
가수분해물 스트림의 올리고당 분석은 오토클레이브 기반 산 가수분해 방법을 사용하여 2 ml 규모로 수행되었습니다.가수 분해물 샘플을 10ml 스크류 캡 배양 튜브에 72% 황산 69.7μl와 혼합하고 121°C에서 벤치탑에서 1시간 동안 배양하고 얼음으로 식힌 다음 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 바이알로 여과합니다.올리고당의 농도는 산가수분해 시료의 전체 당 농도에서 가수분해되지 않은 시료의 단당류 농도를 빼서 결정하였다.
산 가수분해된 바이오매스의 글루코스, 자일로스 및 아라비노스 농도는 Autosampler, 컬럼 히터, 등용매 펌프 및 굴절률 검출기가 장착된 Shimadzu HPLC 시스템을 사용하여 Bio-Rad Aminex HPX-87H 컬럼에서 분석했습니다.컬럼을 50°C로 유지하고 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 in water로 용출했습니다.흐름.
가수분해물 상청액을 희석하고 단량체 및 올리고당 함량에 대해 분석하였다.효소 가수분해 후 얻은 단량체 당을 Bio-Rad(Hercules, CA) Aminex HPX-87P 컬럼 및 애쉬 가드 컬럼이 장착된 HPLC로 분석했습니다.컬럼 온도는 80°C로 유지되었고 물은 0.6 ml/min의 유속으로 이동상으로 사용되었습니다.올리고당은 refs.41, 48, 49.
당류 분석은 이전에 설명한 절차 27, 43, 50, 51을 사용하여 가공되지 않은 AFEX 전처리 및 모든 가수분해되지 않은 바이오매스 잔류물(직렬 세포벽 추출물 및 mAb 스크리닝 생산 포함)에 대해 수행되었습니다.글리코메 분석을 위해 식물 세포벽 물질의 알코올 불용성 잔류물은 바이오매스 잔류물로부터 준비되고 암모늄 옥살레이트(50mM), 탄산나트륨(50mM 및 0.5% w/v), CON과 같은 점점 더 공격적인 시약으로 연속 추출됩니다.(1M 및 4M, 둘 다 1% w/v 수소화붕소나트륨 포함) 및 이전에 설명한 산성 아염소산염52,53.그런 다음 추출물을 세포벽 글리칸에 대한 mAb50의 복합 패널에 대해 ELISA에 적용하고 mAb 결합 반응을 열 지도로 표시했습니다.식물 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 mAbs는 실험실 재고(CCRC, JIM 및 MAC 시리즈)에서 구입했습니다.
올리고당의 1단계 비오티닐화.비오틴-LC-하이드라자이드와 탄수화물의 컨쥬게이션은 다음 절차를 사용하여 수행되었습니다.비오틴-LC-히드라지드(4.6mg/12μmol)를 65℃에서 1분 동안 격렬하게 교반하고 가열하여 디메틸 설폭사이드(DMSO, 70μl)에 용해시켰다.빙초산(30 ㎕)을 첨가하고 혼합물을 시아노보로하이드라이드 나트륨(6.4 mg/100 μmol)에 붓고 65℃에서 약 1분 동안 가열한 후 완전히 용해시켰다.그 다음, 5 내지 8 μl의 반응 혼합물을 건조된 올리고당(1-100 nmol)에 첨가하여 환원 말단에 대한 라벨의 10배 이상의 몰 과량을 얻었다.반응을 65℃에서 2시간 동안 수행한 후, 샘플을 즉시 정제하였다.나트륨 시아노보로하이드라이드는 환원 없이 라벨링 실험에 사용되지 않았으며, 샘플은 65℃에서 2.5시간 동안 반응되었다.
Biotinylated oligosaccharides 샘플의 ELISA 코팅 및 세척.25 μl의 비오티닐화된 샘플(5 ml의 0.1 M Tris 완충 용액(TBS)에 희석된 각 농축 샘플 100 μl)을 아비딘-코팅된 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.대조군 웰을 0.1 M TBS에서 10 μg/ml의 농도로 50 μl의 비오틴으로 코팅하였다.블랭크 측정을 위한 코팅으로 탈이온수를 사용했습니다.정제를 암실 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.프로그램 번호를 사용하여 0.1M TBS에서 0.1% 탈지유로 플레이트를 3회 세척합니다.Grenier 플랫 3A의 경우 11번.
1차 항체의 추가 및 세척.각 웰에 기본 항체 40 μl를 추가합니다.어둠 속에서 실온에서 1시간 동안 마이크로플레이트를 배양합니다.그런 다음 플레이트를 Grenier Flat 3A용 세척 프로그램 #11을 사용하여 0.1M TBS 중 0.1% 우유로 3회 세척했습니다.
이차 항체를 추가하고 세척합니다.마우스/쥐 이차 항체(0.1 M TBS의 0.1% 우유에 1:5000 희석) 50 μl를 각 웰에 추가합니다.어둠 속에서 실온에서 1시간 동안 마이크로플레이트를 배양합니다.그런 다음 마이크로플레이트를 Grenier Flat 5A 플레이트 세척 프로그램 #12를 사용하여 0.1M TBS의 0.1% 우유로 5회 세척했습니다.
기판 추가.기본 기질에 3,3′,5,5′-테트라메틸벤지딘(TMB) 50 μl를 추가합니다(완충액 2방울, TMB 3방울, 과산화수소 2방울을 탈이온수 15ml에 첨가).TMB 기판을 준비합니다.그리고 사용하기 전에 소용돌이).마이크로플레이트를 실온에서 30분 동안 배양합니다.어두운 데에서.
단계를 완료하고 태블릿을 읽으십시오.각 웰에 1N 황산 50μl를 첨가하고 ELISA 판독기를 사용하여 450~655nm에서 흡광도를 기록합니다.
아라비노스, 람노스, 푸코스, 자일로스, 갈락투론산(GalA), 글루쿠론산(GlcA), 만노스, 포도당, 갈락토스, 락토스, N-아세틸만노사민(manNAc), N-아세틸글루코사민 등 탈이온수에서 이러한 분석물의 1 mg/ml 용액을 준비합니다.(glcNAc), N-아세틸갈락토사민(galNAc), 이노시톨(내부 표준).표 1에 나타낸 1 mg/mL 당 용액을 첨가하여 2개의 표준을 제조하였다. 샘플을 동결시키고 모든 물이 제거될 때까지 -80℃에서 동결건조시켰다(보통 약 12-18시간).
분석 저울의 스크류 캡 튜브에 100–500µg의 시료를 추가합니다.추가된 금액을 기록합니다.샘플을 특정 농도의 용매에 녹이고 액체 부분 표본으로 튜브에 추가하는 것이 가장 좋습니다.각 샘플 튜브의 내부 표준으로 1 mg/ml 이노시톨 20 μl를 사용하십시오.샘플에 추가된 내부 표준의 양은 표준 튜브에 추가된 내부 표준의 양과 같아야 합니다.
스크류 캡 바이알에 무수 메탄올 8ml를 추가합니다.그런 다음 4ml의 3N. methanolic HCl 용액을 마개로 덮고 흔듭니다.이 과정은 물을 사용하지 않습니다.
올리고당 샘플 및 표준 TMS 튜브에 1M HCl 메탄올 용액 500 μl를 추가합니다.샘플을 열 블록에서 80℃에서 밤새(168시간) 인큐베이션하였다.건조 매니폴드를 사용하여 실온에서 메탄올 분해 제품을 건조시킵니다.MeOH 200µl를 추가하고 다시 건조합니다.이 과정은 두 번 반복됩니다.샘플에 메탄올 200 μl, 피리딘 100 μl, 아세트산 무수물 100 μl를 넣고 잘 섞는다.샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.그리고 건조.200 µl의 메탄올을 넣고 다시 건조시킵니다.
200µl의 Tri-Sil을 추가하고 20분 동안 가열 캡핑된 튜브를 추가합니다.80°C, 그 후 실온으로 냉각.건조 매니폴드를 사용하여 시료를 약 50µl의 부피로 더 건조시킵니다.샘플을 완전히 건조시키지 않았다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
2ml의 헥산을 첨가하고 볼텍싱하여 잘 섞는다.직경 5-3/4인치 피펫 위에 유리솜을 삽입하여 파스퇴르 피펫(5-8mm)의 팁을 유리솜 조각으로 채웁니다.샘플을 3000g에서 2분 동안 원심분리했습니다.불용성 잔류물이 침전됩니다.샘플을 100-150 μl로 건조시킵니다.약 1μl의 부피를 초기 온도 80°C 및 초기 시간 2.0분에서 GC-MS에 주입했습니다(표 2).