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AFEX로 전처리된 옥수수 줄기에 남아 있는 올리고당의 복합 분석을 위한 새로운 면역학적 및 질량 분석법. 리그노셀룰로스 바이오매스는 화석 연료를 대체할 수 있는 지속 가능한 자원으로, 식품, 사료, 연료 및 화학 물질과 같은 제품 생산을 위한 생명공학 기술 개발에 널리 사용됩니다. 이러한 기술의 핵심은 식물 세포벽에 존재하는 복합 탄수화물을 포도당, 자일로스, 아라비노스와 같은 단당류로 전환하는 비용 효율적인 공정을 개발하는 것입니다. 리그노셀룰로스 바이오매스는 매우 분해하기 어렵기 때문에 원하는 제품을 얻기 위해서는 열화학적 처리(예: 암모니아 섬유 박리(AFEX), 묽은 산(DA), 이온성 액체(IL))와 생물학적 처리(예: 효소 가수분해 및 미생물 발효)를 조합하여 적용해야 합니다. 그러나 상업용 진균 효소를 가수분해 공정에 사용할 경우, 생성되는 가용성 당의 75~85%만이 단당류이고 나머지 15~25%는 미생물이 이용하기 어려운 가용성 올리고당입니다. 저희는 이전에 탄소 및 규조토 분리와 크기 배제 크로마토그래피를 조합하여 가용성 난분해성 올리고당을 성공적으로 분리 및 정제하고, 이들의 효소 저해 특성을 연구했습니다. 그 결과, 중합도(DP)가 높은 메틸화 우론산 치환기를 포함하는 올리고당은 중합도가 낮거나 중성인 올리고당보다 상업용 효소 혼합물로 처리하기 더 어렵다는 것을 발견했습니다. 본 연구에서는 식물 세포벽 및 효소 가수분해물의 당 결합을 특성화하기 위해 식물 바이오매스 당에 특이적인 단클론 항체(mAb)를 이용한 당 프로파일링을 비롯한 여러 추가적인 방법을 보고합니다. MALDI-TOF-MS는 음이온의 2차 붕괴 후 분광법으로 얻은 구조 정보 제공형 진단 피크를 사용하며, 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)을 이용하여 유도체화 유무에 관계없이 올리고당 결합을 특성화합니다. 올리고당은 크기가 작기 때문에(중합도 4~20) mAb 결합 및 특성화에 사용하기 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 새로운 비오틴 접합 기반 올리고당 고정화 방법을 적용하여 마이크로플레이트 표면에 대부분의 저분자량 가용성 올리고당을 성공적으로 표지하였고, 이를 고처리량 단일클론항체 시스템에 적용하여 특이적 리게이션 분석을 수행했습니다. 이 새로운 방법은 향후 진단 목적의 바이오마커에 존재하는 올리고당을 분리 및 특성화하는 데 사용할 수 있는 더욱 발전된 고처리량 글리콤 분석법 개발을 촉진할 것입니다.
농업, 임업, 초목 및 목재 물질로 구성된 리그노셀룰로스 바이오매스는 식품, 사료, 연료 및 고부가가치 제품 생산을 위한 화학 전구체를 포함한 바이오 기반 제품 생산을 위한 잠재적 원료입니다.1 식물 세포벽에 존재하는 탄수화물(셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 등)은 화학적 처리 및 생물 변환(효소 가수분해 및 미생물 발효 등)을 통해 단당류로 분해됩니다. 일반적인 전처리에는 암모니아 섬유 팽창(AFEX), 묽은 산(DA), 이온성 액체(IL) 및 증기 폭발(SE)이 있으며, 이러한 방법은 화학 물질과 열을 조합하여 식물 세포벽을 열어 리그노셀룰로오스 생성을 감소시킵니다.3,4 효소 가수분해는 상업용 활성 탄수화물 함유 효소(CAZymes)를 사용하여 높은 고형물 부하에서 수행되며, 미생물 발효는 형질전환 효모 또는 박테리아를 사용하여 바이오 기반 연료 및 화학 물질을 생산합니다.6
상업용 효소에 사용되는 CAZymes는 복잡한 탄수화물-당 결합을 시너지 효과적으로 분해하여 단당류를 생성하는 효소들의 복합 혼합물로 구성됩니다.2,7 앞서 보고한 바와 같이, 리그닌의 방향족 중합체와 탄수화물의 복잡한 네트워크는 분해를 매우 어렵게 만들어 불완전한 당 전환을 초래하고, 전처리된 바이오매스의 효소 가수분해 과정에서 생성되지 않은 15~25%의 올리고당이 축적됩니다. 이는 다양한 바이오매스 전처리 방법에서 흔히 발생하는 문제입니다. 이러한 병목 현상의 원인으로는 가수분해 중 효소 저해 또는 식물 바이오매스의 당 결합을 분해하는 데 필요한 필수 효소의 부재 또는 낮은 수준 등이 있습니다. 올리고당의 당 결합과 같은 당의 구성 및 구조적 특성을 이해하면 가수분해 과정에서 당 전환율을 향상시켜 석유 유래 제품과 비용 경쟁력을 갖춘 생명공학 공정을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.
탄수화물의 구조를 결정하는 것은 어려운 일이며 액체 크로마토그래피(LC)11,12, 핵자기 공명 분광법(NMR)13, 모세관 전기영동(CE)14,15,16 및 질량 분석법(MS)17과 같은 여러 방법을 조합해야 합니다. 18. 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 및 이온화 비행시간 질량 분석법(MALDI-TOF-MS)과 같은 MS 방법은 탄수화물 구조를 식별하는 데 다용도로 사용됩니다. 최근에는 나트륨 이온 부가물의 충돌 유도 분해(CID) 탠덤 MS가 올리고당 부착 위치, 아노머 구성, 서열 및 분기 위치에 해당하는 지문을 식별하는 데 가장 널리 사용되고 있습니다.20, 21
글리칸 분석은 탄수화물 결합을 심층적으로 식별하는 데 매우 유용한 도구입니다.22 이 방법은 식물 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 단클론 항체(mAb)를 프로브로 사용하여 복잡한 탄수화물 결합을 이해합니다. 전 세계적으로 250개 이상의 mAb가 다양한 당류를 이용하여 다양한 선형 및 분지형 올리고당에 대해 설계되었습니다.24 여러 mAb가 식물 세포벽의 구조, 구성 및 변형을 특성화하는 데 널리 사용되어 왔는데, 이는 식물 세포 유형, 기관, 연령, 발달 단계 및 성장 환경에 따라 상당한 차이가 있기 때문입니다.25,26 최근에는 이 방법을 이용하여 식물 및 동물 시스템에서 소포체 집단과 세포 소기관 표지자, 발달 단계 또는 환경 자극에 따른 글리칸 수송에서의 각 역할을 이해하고 효소 활성을 측정하는 데 활용되고 있습니다. 확인된 글리칸 및 자일란의 다양한 구조에는 펙틴(P), 자일란(X), 만난(M), 자일로글루칸(XylG), 혼합 결합 글루칸(MLG), 아라비노자일란(ArbX), 갈락토만난(GalG), 글루쿠론산-아라비노자일란(GArbX) 및 아라비노-갈락탄(ArbG)29이 포함됩니다.
그러나 이러한 모든 연구 노력에도 불구하고, 올리고당 방출, 가수분해 중 올리고머 사슬 길이 변화, 다양한 저분자량(low DP) 중합체 및 그 분포 곡선을 포함하여 고형물 부하(HSL) 가수분해 중 올리고당 축적의 특성에 초점을 맞춘 연구는 소수에 불과합니다. 30,31,32 한편, 글리칸 분석은 글리칸 구조의 종합적인 분석에 유용한 도구임이 입증되었지만, 항체법을 사용하여 수용성 저분자량 올리고당을 평가하는 것은 어렵습니다. 분자량이 5-10 kDa 미만인 작은 분자량의 올리고당은 ELISA 플레이트에 결합하지 않고 33, 34 항체 첨가 전에 씻겨 나가기 때문입니다.
본 연구에서는 처음으로 단일클론 항체를 사용하여 아비딘 코팅 플레이트에서 ELISA 분석법을 시연하고, 가용성 난용성 올리고당에 대한 원스텝 비오틴화 절차와 글리콤 분석을 결합했습니다. 가수분해된 당 조성물의 트리메틸실릴(TMS) 유도체화를 이용한 상보적 올리고당 결합의 MALDI-TOF-MS 및 GC-MS 기반 분석을 통해 본 글리콤 분석법의 타당성을 검증했습니다. 이 혁신적인 접근법은 향후 고처리량 방법으로 개발되어 생의학 연구 분야에서 더욱 폭넓게 활용될 수 있을 것입니다.
효소와 항체의 번역 후 변형, 예를 들어 당화(glycosylation)36는 생물학적 활성에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 혈청 단백질의 당화 변화는 염증성 관절염에서 중요한 역할을 하며, 진단 지표로 사용됩니다37. 다양한 당류는 위장관 및 간의 만성 염증성 질환, 바이러스 감염, 난소암, 유방암, 전립선암을 포함한 다양한 질병에서 흔히 나타나는 것으로 문헌에 보고되어 있습니다38,39,40. 항체 기반 당류 ELISA 방법을 사용하여 당류의 구조를 이해하면 복잡한 질량 분석법(MS)을 사용하지 않고도 질병 진단의 정확도를 높일 수 있습니다.
이전 연구에서 우리는 전처리 및 효소 가수분해 후에도 가수분해되지 않은 올리고당이 남아 있음을 보여주었습니다(그림 1). 이전에 발표한 연구에서 우리는 AFEX 전처리된 옥수수 줄기 가수분해물(ACSH)8로부터 올리고당을 분리하기 위해 활성탄 고체상 추출법을 개발했습니다. 초기 추출 및 분리 후, 올리고당은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 추가적으로 분획하고 분자량 순으로 수집했습니다. 다양한 전처리에서 분리된 당 단량체와 올리고머는 당 성분 분석을 통해 분석했습니다. 다양한 전처리 방법으로 얻은 당 올리고머 함량을 비교했을 때, 잔류 올리고당의 존재는 바이오매스를 단당류로 전환하는 과정에서 흔히 발생하는 문제이며, 이로 인해 당 수율이 최소 10~15%에서 최대 18%까지 감소할 수 있습니다. 이 방법은 올리고당 분획의 대규모 생산에 활용될 수 있습니다. 본 연구에서는 생성된 ACH와 분자량이 다른 분획물들을 올리고당 특성 분석을 위한 실험 재료로 사용했습니다.
전처리 및 효소 가수분해 후에도 잔류 올리고당이 가수분해되지 않은 채 남아 있었다. (A) 활성탄과 규조토로 채워진 층을 이용하여 AFEX로 전처리한 옥수수 줄기 가수분해물(ACSH)에서 올리고당을 분리하는 올리고당 분리 방법; (B) 올리고당 분리 방법. 올리고당은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 추가적으로 분리하였다; (C) 다양한 전처리(희석산: DA, 이온성 액체: IL 및 AFEX)에서 방출된 당 단량체 및 올리고머. 효소 가수분해 조건: 고형물 함량 25%(w/w)(글루칸 함량 약 8%), 96시간 가수분해, 상업용 효소 20mg/g 첨가(Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 비율) 및 (D) AFEX 전처리된 옥수수 줄기(ACS)에서 방출된 포도당, 자일로스 및 아라비노스의 당 단량체 및 올리고머.
글리칸 분석은 고체 바이오매스 잔류물에서 분리된 추출물에 함유된 글리칸의 구조를 종합적으로 분석하는 데 유용한 도구임이 입증되었습니다. 그러나 이 전통적인 방법으로는 수용성 당류를 제대로 분석할 수 없습니다. 저분자량 올리고당은 ELISA 플레이트에 고정하기 어렵고 항체 첨가 전에 씻겨 나가기 때문입니다.41 따라서 항체 결합 및 특성 분석을 위해, 수용성 비정형 올리고당을 아비딘 코팅 ELISA 플레이트에 코팅하는 원스텝 비오틴화 방법을 사용했습니다. 이 방법은 이전에 생산한 ACSH와 분자량(또는 중합도, DP)에 따른 분획물을 사용하여 테스트했습니다. 원스텝 비오틴화는 탄수화물의 환원 말단에 비오틴-LC-하이드라지드를 첨가하여 올리고당 결합 친화도를 높이는 데 사용되었습니다(그림 2). 용액에서 환원 말단의 헤미아세탈기는 비오틴-LC-하이드라지드의 하이드라지드기와 반응하여 하이드라존 결합을 형성합니다. 환원제인 NaCNBH3의 존재 하에서, 하이드라존 결합은 안정적인 비오틴화된 최종 생성물로 환원됩니다. 당 환원 말단의 변형을 통해 저분자량 올리고당이 ELISA 플레이트에 결합하는 것이 가능해졌으며, 본 연구에서는 글리칸 표적 항체를 사용하여 아비딘 코팅 플레이트에서 이를 수행했습니다.
비오틴화된 올리고당에 대한 ELISA 기반 단클론 항체 스크리닝. (A)는 올리고당의 비오틴화와 이후 뉴트라비딘 코팅 플레이트에서 글리칸 표적 단클론 항체를 이용한 ELISA 스크리닝을 결합한 결과이고, (B)는 반응 생성물의 비오틴화를 위한 단일 단계 절차를 보여준다.
올리고당이 접합된 항체가 코팅된 아비딘 코팅 플레이트에 1차 및 2차 항체를 첨가하고, 빛과 시간에 민감한 용액으로 세척했습니다. 항체 결합이 완료되면 TMB 기질을 첨가하여 플레이트를 배양했습니다. 마지막으로 황산을 사용하여 반응을 중지시켰습니다. 배양된 플레이트를 ELISA 판독기를 사용하여 각 항체의 결합 강도를 측정하고 항체 특이적 교차결합을 검출했습니다. 실험의 세부 사항 및 매개변수는 "재료 및 방법" 부분을 참조하십시오.
본 연구에서는 ACSH에 존재하는 가용성 올리고당뿐만 아니라 리그노셀룰로스 가수분해물에서 분리한 조올리고당 및 정제올리고당 분획을 특성화함으로써 특정 응용 분야에서 이 새롭게 개발된 방법의 유용성을 입증합니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 생물학적 아실화 글리콤 분석법을 사용하여 ACSH에서 확인된 가장 흔한 에피토프 치환 자일란은 일반적으로 우론산(U) 또는 메틸우론산(MeU) 및 펙틴 아라비노갈락탄입니다. 이들 대부분은 비가수분해 고형물(UHS)의 글리칸 분석에 대한 이전 연구에서도 발견되었습니다.43
세포벽 글리칸에 대한 단일클론 항체를 사용하여 난분해성 올리고당 에피토프를 검출했습니다. "중성" 분획은 아세토니트릴(ACN) 분획이고, "산성" 분획은 포름산(FA) 분획입니다. 히트맵에서 붉은색이 밝을수록 에피토프 함량이 높고, 파란색이 밝을수록 배경이 비어 있음을 나타냅니다. 색상 값은 N=2 제형의 원시 OD 값을 기준으로 합니다. 항체가 인식하는 주요 에피토프는 오른쪽에 표시되어 있습니다.
이러한 비셀룰로스 구조는 시험에 사용된 시판 효소 혼합물(가장 일반적으로 사용되는 시판 효소들을 포함)에 있는 가장 흔한 셀룰라아제와 헤미셀룰라아제로는 분해되지 않았습니다. 따라서 이러한 구조의 가수분해를 위해서는 새로운 보조 효소가 필요합니다. 필요한 비셀룰로스 보조 효소가 없으면, 이러한 비셀룰로스 결합은 모체 당 중합체가 시판 효소 혼합물을 사용하여 더 짧은 조각으로 광범위하게 가수분해되고 용해되더라도 단당류로의 완전한 전환을 방해합니다.
신호 분포 및 결합 강도에 대한 추가 연구 결과, 고분자량 당 분획(A, B, C, DP 20 이상)에서 결합 에피토프의 수가 저분자량 분획(D, E, F, DP, 이량체)보다 적은 것으로 나타났습니다(그림 1). 비셀룰로스 에피토프에서는 중성 조각보다 산성 조각이 더 흔하게 발견됩니다. 이러한 현상은 이전 연구에서 관찰된 패턴과 일치하는데, 고분자량 및 산성 작용기가 효소 가수분해에 더 강한 저항성을 보였습니다. 따라서 비셀룰로스 글리칸 에피토프와 U 및 MeU 치환은 올리고당의 안정성에 크게 기여할 수 있습니다. 특히 에피토프가 이량체 또는 삼량체 올리고당인 경우, 저분자량 올리고당의 결합 및 검출 효율에 문제가 발생할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 이는 특정 단일클론항체에 결합하는 에피토프를 하나씩만 포함하는 다양한 길이의 상업용 올리고당을 사용하여 검증할 수 있습니다.
따라서 구조 특이적 항체를 사용하면 특정 유형의 난분해성 결합을 밝혀낼 수 있습니다. 사용된 항체의 종류, 적절한 리게이션 패턴, 그리고 생성되는 신호의 강도(가장 풍부하거나 가장 적은 신호)에 따라 새로운 효소를 식별하고 효소 혼합물에 반정량적으로 첨가하여 보다 완전한 당화 변환을 수행할 수 있습니다. ACSH 올리고당 분석을 예로 들면, 각 바이오매스 물질에 대한 당화 결합 데이터베이스를 구축할 수 있습니다. 여기서 항체의 친화도가 다르다는 점을 고려해야 하며, 친화도를 알 수 없는 경우 서로 다른 항체의 신호를 비교하는 데 어려움이 발생할 수 있습니다. 또한, 당화 결합 비교는 동일한 항체를 사용하는 경우 샘플 간에 가장 효과적일 수 있습니다. 이러한 난분해성 결합은 CAZyme 데이터베이스에 연결하여 효소를 식별하고, 후보 효소를 선택하고, 결합 분해 효소를 테스트하거나, 생물정제소에서 사용하기 위해 이러한 효소를 발현하는 미생물 시스템을 개발할 수 있습니다.
리그노셀룰로스 가수분해물에 존재하는 저분자량 올리고당을 특성화하는 데 있어 면역학적 방법이 다른 방법들을 어떻게 보완하는지 평가하기 위해, 동일한 패널(그림 5)의 올리고당 부분에 대해 MALDI(그림 4, S1-S8)와 GC-MS 기반의 TMS 유도 당류 분석을 수행했습니다. MALDI는 올리고당 분자의 질량 분포가 의도한 구조와 일치하는지 비교하는 데 사용됩니다. 그림 4는 중성 성분인 ACN-A와 ACN-B의 MC를 보여줍니다. ACN-A 분석 결과, DP 4~8(그림 4)에서 DP 22(그림 S1)에 이르는 다양한 펜토스 당이 확인되었으며, 이는 MeU-자일란 올리고당에 해당합니다. ACN-B 분석 결과, DP 8~15의 펜토스 및 글루코자일란 계열이 확인되었습니다. 그림 S3과 같은 보충 자료에서 FA-C 산성 작용기 질량 분포 지도는 ELISA 기반 mAb 스크리닝에서 발견된 치환된 자일란과 일치하는 DP가 8~15인 다양한 (Me)U 치환 펜토스 당을 보여줍니다. 에피토프는 일치합니다.
ACS에 존재하는 용해성 비준수 올리고당의 MALDI-MS 스펙트럼. 여기서, (A) 메틸화 우론산(DP 4-8)으로 치환된 글루쿠로자일란 올리고당을 함유하는 ACN-A 저분자량 분획과 (B) 자일란 및 글루쿠로자일란(DP 8-15)으로 치환된 메틸화 우론산 올리고당을 함유하는 ACN-B.
난분해성 올리고당의 글리칸 잔류물 조성 분석. (A) GC-MS 분석을 통해 얻은 다양한 올리고당 분획의 TMS 당 조성. (B) 올리고당에 존재하는 다양한 TMS 유래 당의 구조. ACN – 중성 올리고당을 함유하는 아세토니트릴 분획, FA – 산성 올리고당을 함유하는 페룰산 분획.
그림 S9에 나타낸 바와 같이 올리고당 분획의 LC-MS 분석에서 또 다른 흥미로운 결론이 도출되었습니다(방법은 전자 보충 자료에서 확인할 수 있습니다). ACN-B 분획의 연결 과정에서 헥소스 및 -OAc 그룹의 조각들이 반복적으로 관찰되었습니다. 이 결과는 글리콤 및 MALDI-TOF 분석에서 관찰된 조각화를 확인시켜 줄 뿐만 아니라, 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스에 존재할 수 있는 잠재적인 탄수화물 유도체에 대한 새로운 정보를 제공합니다.
또한 TMS 당 유도체화를 이용하여 올리고당 분획의 당 조성을 분석했습니다. GC-MS를 사용하여 올리고당 분획에서 중성(비유도체) 당과 산성 당(GluA 및 GalA)의 조성을 확인했습니다(그림 5). 글루쿠론산은 산성 성분 C와 D에서, 갈락투론산은 산성 성분 A와 B에서 발견되었으며, 이 두 성분은 모두 산성 당의 고분자량(DP) 성분입니다. 이러한 결과는 ELISA 및 MALDI 데이터와 일치할 뿐만 아니라, 올리고당 축적에 대한 이전 연구 결과와도 부합합니다. 따라서 올리고당의 비오틴화 및 후속 ELISA 스크리닝을 이용한 최신 면역학적 방법은 다양한 생물학적 시료에서 용해성 난분해성 올리고당을 검출하는 데 충분하다고 생각합니다.
ELISA 기반 mAb 스크리닝 방법은 여러 가지 다른 방법을 통해 검증되었으므로, 본 연구에서는 이 새로운 정량적 방법의 잠재력을 더욱 탐구하고자 했습니다. 시판되는 두 가지 올리고당인 자일로헥사사카라이드 올리고당(XHE)과 23-α-L-아라비노푸라노실-자일로트리오스(A2XX)를 구입하여 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 새로운 mAb 접근법을 사용하여 분석했습니다. 그림 6은 비오틴화된 결합 신호와 올리고당 농도의 로그값 사이에 선형 상관관계가 있음을 보여주며, 이는 랭뮤어 흡착 모델을 적용할 수 있음을 시사합니다. mAb 중 CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 및 CCRC-M151은 XHE와, CCRC-M108, CCRC-M109 및 LM11은 A2XX와 1nm에서 100nm 범위에서 상관관계를 보였습니다. 실험 중 항체 확보의 어려움으로 인해 각 올리고당 농도별로 제한된 실험만 수행할 수 있었습니다. 여기서 주목할 점은 일부 항체는 동일한 올리고당을 기질로 사용했을 때 매우 다른 반응을 보인다는 것입니다. 이는 항체가 결합하는 에피토프가 미묘하게 다르고 결합 친화도 또한 매우 다를 수 있기 때문으로 추정됩니다. 새로운 단일클론항체 접근법을 실제 시료에 적용할 경우, 정확한 에피토프 식별의 메커니즘과 의미는 훨씬 더 복잡해질 것입니다.
다양한 글리칸 표적 항체의 검출 범위를 결정하기 위해 두 가지 시판 올리고당을 사용했습니다. 여기서 올리고당 농도의 로그값과의 선형 상관관계는 (A) XHE와 항체, (B) A2XX와 항체에 대한 랑뮤어 흡착 패턴을 나타냅니다. 해당 에피토프는 분석에 기질로 사용된 시판 올리고당의 구조를 보여줍니다.
글리칸 표적 단일클론항체(글리코믹 분석 또는 ELISA 기반 단일클론항체 스크리닝)는 식물 바이오매스를 구성하는 주요 세포벽 글리칸 대부분을 심층적으로 특성화하는 강력한 도구입니다. 그러나 기존의 글리칸 분석은 대부분의 올리고당이 ELISA 플레이트에 효율적으로 고정되지 않기 때문에 큰 세포벽 글리칸만 분석할 수 있습니다. 본 연구에서는 AFEX 전처리된 옥수수 줄기를 고형분 함량이 높은 조건에서 효소 가수분해했습니다. 가수분해물에 함유된 난분해성 세포벽 탄수화물의 조성을 확인하기 위해 당 분석을 수행했습니다. 하지만 가수분해물에 함유된 작은 올리고당에 대한 단일클론항체 분석은 과소평가되어 있으며, 올리고당을 ELISA 플레이트에 효과적으로 고정하기 위한 추가적인 도구가 필요합니다.
본 연구에서는 올리고당 비오틴화와 NeutrAvidin™ 코팅 플레이트를 이용한 ELISA 스크리닝을 결합한 새롭고 효율적인 올리고당 고정화 방법을 보고합니다. 고정화된 비오틴화 올리고당은 항체에 대한 충분한 친화성을 보여 난치성 올리고당을 신속하고 효율적으로 검출할 수 있었습니다. 질량 분석법을 이용한 이러한 난치성 올리고당의 조성 분석은 본 면역 스크리닝 접근법의 효과를 입증했습니다. 따라서, 본 연구는 올리고당 비오틴화와 글리칸 표적 단일클론 항체를 이용한 ELISA 스크리닝의 조합이 올리고당 내 가교결합을 검출하는 데 사용될 수 있으며, 올리고당 구조 특성화와 관련된 다른 생화학 연구에도 폭넓게 적용될 수 있음을 보여줍니다.
본 비오틴 기반 글리칸 프로파일링 방법은 식물 바이오매스 내 수용성 올리고당의 난분해성 탄수화물 결합을 분석할 수 있는 최초의 보고입니다. 이는 바이오연료 생산 시 바이오매스의 일부 구성 요소가 왜 그렇게 분해되기 어려운지 이해하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 글리콤 분석 방법의 중요한 공백을 메우고 식물 올리고당을 넘어 더 넓은 범위의 기질에 적용할 수 있도록 합니다. 향후에는 로봇 기술을 활용하여 비오틴화를 수행하고, 본 연구에서 개발한 방법을 ELISA를 이용한 고처리량 시료 분석에 적용할 수 있을 것으로 기대합니다.
파이오니어 33A14 잡종 종자에서 재배한 옥수수 줄기(CS)는 2010년 콜로라도주 레이에 있는 크레이머 농장에서 수확되었습니다. 토지 소유주의 허가를 받아 이 바이오매스는 연구 목적으로 사용할 수 있습니다. 시료는 수분 함량 6% 미만의 건조한 상태로 지퍼백에 넣어 실온에서 보관했습니다. 시료는 수분 함량 6% 미만의 건조한 상태로 지퍼백에 넣어 실온에서 보관했습니다. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. 시료는 습도 6% 미만의 건조한 상태로 지퍼백에 넣어 실온에서 보관했습니다.제품은 室温下以干燥< 6% 의 물분율이 自封袋中입니다.제품 재고가 室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностьу < 6%. 시료는 지퍼백에 넣어 습도 6% 미만의 실온에서 보관합니다.본 연구는 지역 및 국가 지침을 준수했습니다. 성분 분석은 NREL 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. 분석 결과, 글루칸 31.4%, 자일란 18.7%, 아라비난 3.3%, 갈락탄 1.2%, 아세틸 2.2%, 리그닌 14.3%, 단백질 1.7%, 회분 13.4%가 함유되어 있는 것으로 나타났습니다.
Cellic® CTec2(단백질 138mg/ml, 제조번호 VCNI 0001)는 셀룰라아제, β-글루코시다아제의 복합 혼합물이며, Cellic® HTec2(단백질 157mg/ml, 제조번호 VHN00001)는 Novozymes(미국 노스캐롤라이나주 프랭클린턴)에서 공급받았습니다. 펙틴 분해 효소의 복합 혼합물인 Multifect Pectinase®(단백질 72mg/ml)는 DuPont Industrial Biosciences(미국 캘리포니아주 팔로알토)에서 기증받았습니다. 효소 단백질 농도는 킬달 질소 분석법(AOAC 방법 2001.11, 미국 뉴욕주 이타카 Dairy One Cooperative Inc.)을 사용하여 단백질 함량을 측정하고 비단백질 질소의 기여도를 빼서 결정했습니다. 규조토 545는 EMD Millipore(미국 매사추세츠주 빌러리카)에서 구입했습니다. 활성탄(DARCO, 100메쉬 과립), 아비셀(PH-101), 너도밤나무 자일란 및 기타 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했습니다.
AFEX 전처리는 GLBRC(미시간 주립대학교 바이오매스 전환 연구소, 랜싱, 미시간, 미국)에서 수행되었습니다. 전처리는 스테인리스강 벤치탑 배치 반응기(Parr Instruments Company)에서 무수 암모니아와 바이오매스를 1:1 비율로, 바이오매스를 60%(w/w) 투입하여 140°C에서 15분 동안 진행되었습니다. 반응기 온도를 140°C로 올리면 암모니아가 빠르게 방출되고, 바이오매스는 신속하게 실온으로 돌아왔습니다. AFEX 전처리된 옥수수 줄기(ACS)의 조성은 전처리되지 않은 옥수수 줄기(UT-CS)와 유사했습니다.
올리고당 대량 생산을 위한 출발 물질로 고형분 함량이 높은 ACSH 25%(w/w)(덱스트란 약 8% 함유)를 제조하였다. ACSH의 효소 가수분해는 Cellic® Ctec2(10mg 단백질/g 글루칸, 전처리된 바이오매스 기준), Htec2(Novozymes, Franklinton, NC, 5mg 단백질/g 글루칸), 그리고 Multifect Pectinase(Genencor Inc, USA, 5mg 단백질/g 덱스트란)를 포함하는 상용 효소 혼합물을 사용하여 수행하였다. 효소 가수분해는 5리터 바이오리액터에서 작동 용량 3리터, pH 4.8, 온도 50°C, 회전 속도 250rpm 조건으로 진행하였다. 96시간 동안 가수분해한 후, 가수분해물을 6000rpm에서 30분간, 그리고 다시 14000rpm에서 30분간 원심분리하여 미가수분해 고형물을 제거하였다. 그런 다음 가수분해물을 0.22mm 필터 비커를 사용하여 무균 여과하였다. 여과된 가수분해물은 무균 병에 담아 4°C에서 보관한 후 활성탄을 이용하여 분획하였다.
NREL 실험실 분석 절차에 따른 추출물 기반 바이오매스 시료의 구성 분석: 구성 분석을 위한 시료 준비(NREL/TP-510-42620) 및 바이오매스 내 구조 탄수화물 및 리그닌 측정(NREL/TP-510-42618)47.
가수분해물의 올리고당 분석은 오토클레이브 기반 산 가수분해법을 이용하여 2ml 규모로 수행하였다. 가수분해물 시료를 10ml 스크류 캡 배양관에 넣고 72% 황산 69.7µl를 첨가한 후, 실온에서 121°C로 1시간 동안 배양하고, 얼음 위에서 냉각시킨 후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 바이알에 여과하였다. 올리고당 농도는 산 가수분해된 시료의 총 당 농도에서 가수분해되지 않은 시료의 단당류 농도를 빼서 구하였다.
산 가수분해된 바이오매스 내 포도당, 자일로스, 아라비노스 농도는 자동 시료 주입기, 컬럼 히터, 등용매 펌프, 굴절률 검출기가 장착된 시마즈 HPLC 시스템(Bio-Rad Aminex HPX-87H 컬럼 사용)을 이용하여 분석하였다. 컬럼 온도는 50°C로 유지하였고, 5 mM H2SO4 수용액을 0.6 ml/min의 유속으로 용출하였다.
가수분해 상등액을 희석하여 단량체 및 올리고당 함량을 분석하였다. 효소 가수분해 후 얻은 단량체는 Bio-Rad(Hercules, CA) Aminex HPX-87P 컬럼과 회분 방지 컬럼이 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였다. 컬럼 온도는 80°C로 유지하였고, 이동상으로는 물을 사용하였으며 유속은 0.6 ml/min이었다. 올리고당은 참고문헌 41, 48, 49에 기술된 방법에 따라 121°C에서 묽은 산으로 가수분해하여 정량하였다.
원료, AFEX 전처리 및 모든 비가수분해 바이오매스 잔류물(연속 세포벽 추출물 생산 및 mAb 스크리닝 포함)에 대한 당류 분석은 이전에 설명된 절차 27, 43, 50, 51을 사용하여 수행되었습니다. 글리콤 분석을 위해 바이오매스 잔류물로부터 식물 세포벽 물질의 알코올 불용성 잔류물을 준비하고, 이전에 설명된 바와 같이 옥살산암모늄(50 mM), 탄산나트륨(50 mM 및 0.5% w/v), CON(1M 및 4M, 모두 1% w/v 수소화붕소나트륨 함유) 및 아염소산나트륨과 같은 점진적으로 강해지는 시약을 사용하여 연속 추출을 수행했습니다.52,53 추출물은 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 복합 mAb50 패널에 대한 ELISA를 수행했으며, mAb 결합 반응은 히트맵으로 나타냈습니다. 식물 세포벽 글리칸을 표적으로 하는 mAb는 실험실 재고(CCRC, JIM 및 MAC 시리즈)에서 구입했습니다.
올리고당의 원스텝 비오틴화. 탄수화물과 비오틴-LC-히드라지드의 접합은 다음 절차에 따라 수행되었다. 비오틴-LC-히드라지드(4.6 mg/12 μmol)를 디메틸설폭사이드(DMSO, 70 μl)에 넣고 격렬하게 교반하면서 65°C에서 1분간 가열하여 용해시켰다. 빙초산(30 μl)을 첨가하고, 혼합물을 시아노붕수소화나트륨(6.4 mg/100 μmol)에 부어 65°C에서 약 1분간 가열하여 완전히 용해시켰다. 그런 다음, 반응 혼합물 5~8 μl를 건조된 올리고당(1~100 nmol)에 첨가하여 환원 말단에 대해 표지자가 10배 이상 몰 과량으로 존재하도록 했다. 반응은 65°C에서 2시간 동안 진행하였고, 반응 후 즉시 시료를 정제하였다. 환원 과정을 거치지 않은 표지 실험에서는 시아노붕수소화나트륨을 사용하지 않았으며, 시료는 65°C에서 2.5시간 동안 반응시켰다.
비오틴화 올리고당 시료의 ELISA 코팅 및 세척. 비오틴화 시료 25 μl(각 농축 시료 100 μl를 0.1 M Tris 완충 용액(TBS) 5 ml에 희석)를 아비딘 코팅된 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 대조군 웰에는 0.1 M TBS에 10 μg/ml 농도로 용해된 비오틴 50 μl를 코팅하였다. 공시험에는 탈이온수를 코팅제로 사용하였다. 플레이트를 실온에서 암실에 2시간 동안 배양하였다. Grenier flat 3A의 프로그램 번호 11을 사용하여 0.1 M TBS에 0.1% 탈지유를 첨가한 용액으로 플레이트를 3회 세척하였다.
일차 항체 첨가 및 세척. 각 웰에 일차 항체 40 µl를 첨가합니다. 마이크로플레이트를 실온에서 어두운 곳에 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 Grenier Flat 3A의 세척 프로그램 #11을 사용하여 0.1M TBS에 0.1% 탈지유를 첨가한 용액으로 플레이트를 3회 세척합니다.
이차 항체를 첨가하고 세척합니다. 각 웰에 마우스/랫트 이차 항체(0.1M TBS에 0.1% 탈지유를 첨가하여 1:5000으로 희석) 50µl를 첨가합니다. 마이크로플레이트를 실온에서 어두운 곳에 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 Grenier Flat 5A 플레이트 세척 프로그램 #12를 사용하여 0.1M TBS에 0.1% 탈지유를 첨가한 용액으로 5회 세척합니다.
기질 첨가. 기본 기질(탈이온수 15ml에 완충액 2방울, TMB 3방울, 과산화수소 2방울을 첨가하여 제조)에 3,3′,5,5′-테트라메틸벤지딘(TMB) 50µl를 첨가합니다. (TMB 기질을 준비하고 사용 전에 볼텍싱합니다.) 마이크로플레이트를 실온에서 30분 동안 암실에서 배양합니다.
단계를 완료하고 정제를 읽으십시오. 각 웰에 1N 황산 50µl를 첨가하고 ELISA 판독기를 사용하여 450~655nm 범위에서 흡광도를 측정하십시오.
탈이온수에 아라비노스, 람노스, 푸코스, 자일로스, 갈락투론산(GalA), 글루쿠론산(GlcA), 만노스, 글루코스, 갈락토스, 락토스, N-아세틸만노사민(manNAc), N-아세틸글루코사민(glcNAc), N-아세틸갈락토사민(galNAc), 이노시톨(내부 표준물질)을 각각 1 mg/ml 농도로 용해시켜 표준 용액 두 개를 제조하였다. 표 1에 제시된 1 mg/mL 농도의 당 용액을 첨가하여 두 개의 표준 용액을 제조하였다. 시료는 -80°C에서 동결건조하여 모든 수분을 제거하였다(일반적으로 약 12-18시간 소요).
분석용 저울을 사용하여 스크류 캡 튜브에 시료 100~500 µg을 넣고 첨가량을 기록합니다. 시료를 특정 농도의 용매에 녹여 액체 형태로 튜브에 첨가하는 것이 가장 좋습니다. 각 시료 튜브에 1 mg/ml 이노시톨 용액 20 µl를 내부 표준물질로 사용합니다. 시료에 첨가하는 내부 표준물질의 양은 표준 튜브에 첨가하는 내부 표준물질의 양과 동일해야 합니다.
스크류 캡이 있는 바이알에 무수 메탄올 8ml를 넣습니다. 그런 다음 3N 메탄올성 HCl 용액 4ml를 넣고 뚜껑을 닫은 후 흔들어 줍니다. 이 과정에는 물이 사용되지 않습니다.
올리고당 시료와 표준 TMS 튜브에 1 M HCl 메탄올 용액 500 µl를 첨가합니다. 시료를 항온 블록에서 80°C로 하룻밤(168시간) 동안 배양합니다. 건조 매니폴드를 사용하여 메탄올 분해 생성물을 실온에서 건조합니다. 메탄올 200 µl를 첨가하고 다시 건조합니다. 이 과정을 두 번 반복합니다. 시료에 메탄올 200 µl, 피리딘 100 µl, 아세트산 무수물 100 µl를 첨가하고 잘 섞습니다. 시료를 실온에서 30분 동안 배양한 후 건조합니다. 메탄올 200 µl를 첨가하고 다시 건조합니다.
Tri-Sil 200 µl를 첨가하고 뚜껑을 닫은 튜브를 80°C에서 20분간 가열한 후 실온으로 식힙니다. 건조 매니폴드를 사용하여 시료를 약 50 µl의 부피가 될 때까지 추가로 건조합니다. 시료를 완전히 건조시키지 않았다는 점에 유의해야 합니다.
헥산 2ml를 첨가하고 볼텍싱하여 잘 혼합합니다. 직경 5-3/4인치(14.5cm)의 파스퇴르 피펫(5-8mm) 끝에 유리솜을 채워 넣습니다. 시료를 3000g에서 2분간 원심분리합니다. 불용성 잔류물은 침전됩니다. 시료를 100-150µl로 건조합니다. 약 1µl를 GC-MS에 주입하고 초기 온도 80°C, 초기 시간 2.0분으로 설정하여 분석합니다(표 2).