Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
Nije immunologyske en massaspektrometryske metoaden foar komplekse analyze fan persistente oligosaccharides yn maisstover foarbehannele mei AFEX.Lignocellulose biomassa is in duorsum alternatyf foar fossile brânstoffen en wurdt in protte brûkt om biotechnologyen te ûntwikkeljen foar de produksje fan produkten lykas iten, feed, brânstoffen en gemikaliën.De kaai foar dizze technologyen is de ûntwikkeling fan kosten-konkurrearjende prosessen foar it konvertearjen fan komplekse koalhydraten oanwêzich yn plantselmuorren yn ienfâldige sûkers lykas glukoaze, xylose en arabinose.Om't lignocellulosyske biomassa tige eigensinnich is, moat it wurde ûnderwurpen wurde oan thermochemyske behannelingen (bgl. ammoniakfezelpeeling (AFEX), verdunde soeren (DA), ionyske floeistoffen (IL)) en biologyske behannelingen (bgl. enzymatyske hydrolyse en mikrobiële fermentaasje) yn kombinaasje om it winske produkt te krijen..Wannear't kommersjele fungal enzymen lykwols wurde brûkt yn it hydrolyseproses, binne mar 75-85% fan 'e foarme oplosbere sûkers monosaccharides, en de oerbleaune 15-25% binne oplosbere, intractable oligosaccharides, dy't net altyd beskikber binne foar mikro-organismen.Earder hawwe wy mei súkses isolearre en suvere oplosbere eigensinnige oligosaccharides mei help fan in kombinaasje fan koalstof en diatomaceous ierde skieding en grutte útsluting chromatography, en ek ûndersocht harren enzym inhibitory eigenskippen.Wy hawwe fûn dat oligosaccharides dy't in hegere graad fan polymerisaasje (DP) methylated uronic acid substitúsjes befetsje binne dreger te ferwurkjen mei kommersjele enzyme-mingen dan lege DP en neutrale oligosaccharides.Hjir melde wy it gebrûk fan ferskate ekstra metoaden, ynklusyf glycan profilearring mei monoklonale antykladen (mAbs) spesifyk foar plant biomassa glycans te karakterisearjen glycan obligaasjes yn plant sel muorren en enzymatyske hydrolysates, matrix-assistearre laser desorption ionisaasje, tiid-of-flight massa-spektrometrie..MALDI-TOF-MS) brûkt struktuer-ynformative diagnostyske peaks krigen troch spektroskopie nei sekundêr ferfal fan negative ioanen, gaschromatografy en massaspektrometry (GC-MS) om oligosaccharide-obligaasjes te karakterisearjen mei en sûnder derivatisaasje.Troch de lytse grutte fan oligosaccharides (DP 4-20) binne dizze molekulen lestich te brûken foar mAb-bining en karakterisaasje.Om dit probleem te oerwinnen, tapasten wy in nije biotine-konjugaasje-basearre oligosaccharide-ymmobilisaasjemetoade dy't de mearderheid fan lege DP-oplosbere oligosaccharides mei súkses markearre op it mikroplate-oerflak, dy't doe waard brûkt yn in mAb-systeem mei hege trochset foar spesifike ligaasjeanalyse.Dizze nije metoade sil de ûntwikkeling fasilitearje fan mear avansearre glycomeassays mei hege trochset yn 'e takomst dy't kinne wurde brûkt om oligosaccharides oanwêzich yn biomarkers te isolearjen en te karakterisearjen foar diagnostyske doelen.
Lignocellulosic biomassa, gearstald út lânbou, boskbou, gers en houtige materialen, is in potinsjele feedstock foar de produksje fan bio-basearre produkten, ynklusyf iten, feed, brânstof en gemyske foarrinners te produsearje hegere wearde produkten1.Koalhydraten (lykas cellulose en hemicellulose) oanwêzich yn plantselmuorren wurde depolymerisearre yn monosaccharides troch gemyske ferwurking en biotransformaasje (lykas enzymatyske hydrolyse en mikrobiële fermentaasje).Algemiene foarbehannelingen omfetsje ammoniakfezel-útwreiding (AFEX), verdunde soer (DA), ionyske floeistof (IL), en stoomeksploazje (SE), dy't in kombinaasje fan gemikaliën en waarmte brûke om de produksje fan lignocellulose te ferminderjen troch plantselmuorren te iepenjen3,4.stubbornness fan matearje, 5. Enzymatyske hydrolyse wurdt útfierd op in hege fêste loads mei help fan kommersjele aktive koalhydraat-befette enzymen (CAZymes) en microbial fermentation mei help fan transgene gisten of baktearjes te produsearje bio-basearre brânstoffen en gemikaliën 6 .
CAZymes yn kommersjele enzymen binne gearstald út in komplekse mingsel fan enzymen dy't synergistysk komplekse koalhydraat-sûker-obligaasjes spjalte om monosacchariden te foarmjen2,7.Lykas wy earder rapporteare, makket it komplekse netwurk fan aromaatyske polymers fan lignine mei koalhydraten har heul ûnbetrouber, wat liedt ta ûnfolsleine sûkerkonverzje, akkumulearje 15-25% fan seksoligosacchariden dy't net wurde produsearre tidens enzymatyske hydrolyse fan 'e foarbehannele biomassa.Dit is in mienskiplik probleem mei ferskate metoaden foar foarbehanneling fan biomassa.Guon redenen foar dit knelpunt omfetsje enzymremming by hydrolyse, as it ûntbrekken of lege nivo's fan essensjele essensjele enzymen dy't nedich binne om sûkerbânen yn plantbiomassa te brekken.Begryp fan 'e gearstalling en strukturele skaaimerken fan sûkers, lykas de sûkerbânen yn oligosacchariden, sil ús helpe om sûkerkonverzje te ferbetterjen tidens hydrolyse, wêrtroch biotechnologyske prosessen kosten-konkurrearjend meitsje mei petroleum-ôflaat produkten.
It bepalen fan de struktuer fan koalhydraten is útdaagjend en fereasket in kombinaasje fan metoaden lykas floeistofchromatografy (LC) 11,12, kearnmagnetyske resonânsjespektroskopy (NMR)13, kapillêre elektroforese (CE) 14,15,16 en massaspektrometrie (MS)17.,achttjin.MS-metoaden lykas tiid-of-flight massaspektrometry mei laser desorption en ionisaasje mei help fan in matrix (MALDI-TOF-MS) binne in alsidich metoade foar it identifisearjen fan koalhydraatstruktueren.Koartlyn is Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS fan natriumionaddukten it meast brûkt om fingerprinten te identifisearjen dy't oerienkomme mei oligosaccharide-oanhingposysjes, anomere konfiguraasjes, sekwinsjes en branchingposysjes 20, 21.
Glykananalyse is in poerbêst ark foar yngeande identifikaasje fan koalhydraatbindingen22.Dizze metoade brûkt monoklonale antykladen (mAbs) dy't rjochte binne op it planten fan selwandglycan as probes om komplekse koalhydraatferbiningen te begripen.Mear dan 250 mAbs binne wrâldwiid beskikber, ûntworpen tsjin ferskate lineêre en fertakke oligosaccharides mei ferskate saccharides24.Ferskate mAbs binne in soad brûkt om de struktuer, gearstalling en oanpassingen fan 'e plantselmuorre te karakterisearjen, om't d'r signifikante ferskillen binne ôfhinklik fan plantseltype, oargel, leeftyd, ûntwikkelingsstadium en groeiomjouwing25,26.Mear resint is dizze metoade brûkt om vesikelpopulaasjes yn plant- en diersystemen te begripen en har respektive rollen yn glycantransport lykas bepaald troch subcellulêre markers, ûntwikkelingsstadia, of miljeustimuli, en om enzymatyske aktiviteit te bepalen.Guon fan 'e ferskillende struktueren fan glycanen en xylanen dy't binne identifisearre omfetsje pektine (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucanen (XylG), mingde bonding glukanen (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbinoX) (GarbinoX) (GarbinoX) (Galanar.
Nettsjinsteande al dizze ûndersyksynspanningen hawwe mar in pear stúdzjes har rjochte op 'e aard fan oligosaccharide-akkumulaasje tidens hydrolyse mei hege fêste load (HSL), ynklusyf oligosaccharide-frijlitting, oligomere ketenlingte feroarings tidens hydrolyse, ferskate polymearen mei lege DP, en har bochten.distribúsjes 30,31,32.Undertusken, hoewol't glycan analyze hat bewiisd in v wêze in nuttich helpmiddel foar in wiidweidige analyze fan glycan struktuer, it is dreech om te evaluearjen wetter-oplosber lege DP oligosaccharides mei help fan antibody metoaden.Lytsere DP-oligosaccharides mei in molekulêre gewicht fan minder dan 5-10 kDa bine net oan ELISA-platen 33, 34 en wurde fuortwosken foardat antybody tafoeging.
Hjir demonstrearje wy foar it earst in ELISA-assay op avidin-coated platen mei monoklonale antykladen, kombinearjen fan in ien-stap biotinylaasjeproseduere foar oplosbere refractaire oligosaccharides mei glycoomanalyse.Us oanpak foar glycome-analyze waard falidearre troch MALDI-TOF-MS en GC-MS basearre analyse fan komplementêre oligosaccharide-keppelings mei trimethylsilyl (TMS) derivatisaasje fan hydrolysearre sûkerkomposysjes.Dizze ynnovative oanpak kin yn 'e takomst ûntwikkele wurde as in metoade mei hege trochslach en in bredere tapassing fine yn biomedysk ûndersyk35.
Post-translasjonele modifikaasjes fan enzymen en antykladen, lykas glycosylaasje,36 beynfloedzje har biologyske aktiviteit.Bygelyks, feroaringen yn glycosylaasje fan serumproteinen spylje in wichtige rol yn inflammatoire arthritis, en feroaringen yn glycosylaasje wurde brûkt as diagnostyske markers37.Ferskate glycanen binne rapportearre yn 'e literatuer om maklik te ferskinen yn in ferskaat oan sykten, ynklusyf chronike inflammatoare sykten fan' e maag-darmkanaal en lever, virale ynfeksjes, eierstok-, boarst- en prostaatkanker38,39,40.Begryp fan 'e struktuer fan glycanen mei help fan antybody-basearre glycan ELISA-metoaden sil ekstra fertrouwen leverje yn diagnoaze fan sykte sûnder it brûken fan komplekse MS-metoaden.
Us foarige stúdzje liet sjen dat eigensinnige oligosaccharides unhydrolysearre bleaunen nei foarbehanneling en enzymatyske hydrolyse (figuer 1).Yn ús earder publisearre wurk ûntwikkele wy in metoade foar ekstraksje fan aktive houtskoal yn fêste faze om oligosacchariden te isolearjen fan AFEX-foarbehannele maisstoverhydrolysaat (ACSH)8.Nei inisjele ekstraksje en skieding waarden de oligosaccharides fierder fraksjonearre troch grutte útslutingchromatografy (SEC) en sammele yn folchoarder fan molekulêre gewicht.Sûkermonomeren en oligomeren frijjûn fan ferskate foarbehannelingen waarden analysearre troch analyse fan sûkerkomposysje.By it fergelykjen fan de ynhâld fan sûker-oligomeren krigen troch ferskate metoaden foar foarbehanneling, is de oanwêzigens fan eigensinnige oligosaccharides in mienskiplik probleem yn 'e konverzje fan biomassa nei monosaccharides en kin liede ta in fermindering fan sûkeropbringst fan op syn minst 10-15% en sels oant 18%.ÚS.Dizze metoade wurdt brûkt foar fierdere grutskalige produksje fan oligosaccharide fraksjes.De resultearjende ACH en har folgjende fraksjes mei ferskillende molekulêre gewichten waarden brûkt as eksperiminteel materiaal foar de karakterisearring fan oligosaccharides yn dit wurk.
Nei foarbehanneling en enzymatyske hydrolyse bleaune persistente oligosaccharides unhydrolysearre.Hjir (A) is in oligosaccharide skieding metoade wêryn oligosaccharides wurde isolearre út AFEX-pretreated mais stover hydrolyzate (ACSH) mei help fan in ynpakt bêd fan aktivearre koalstof en diatomaceous ierde;(B) Metoade foar skieding fan oligosaccharides.De oligosaccharides waarden fierder skieden troch grutte útsluting chromatography (SEC);(C) Saccharide monomeren en oligomeren frijjûn fan ferskate foarbehannelingen (fertinne soer: DA, ionyske floeistof: IL en AFEX).Enzymatyske hydrolyse-betingsten: hege fêste laden fan 25% (w/w) (likernôch 8% glukanladen), 96 oeren hydrolyse, 20 mg / g kommersjele enzymlading (Ctec2: Htec2: MP-2: 1: 1 ratio) en (D) Sûkermonomeren en oligomeren fan glukoaze, preosexylose- en AFS-frijlitten fan AFS corn (AFS).
Glykananalyse hat bewiisd in nuttich helpmiddel te wêzen foar in wiidweidige strukturele analyze fan glycanen yn ekstrakten isolearre út fêste biomassa-residuen.Wetteroplosbere sakkariden wurde lykwols ûnderfertsjintwurdige mei dizze tradisjonele metoade41, om't oligosacchariden mei leech molekulêre gewicht lestich binne te immobilisearjen op ELISA-platen en wurde útwosken foardat antylichaam tafoeging.Dêrom, foar antybody bining en karakterisearring, in ien-stap biotinylation metoade waard brûkt om coat oplosbere, net-konforme oligosaccharides op avidin-coated ELISA platen.Dizze metoade waard hifke mei ús earder produsearre ACSH en in fraksje basearre op har molekulêre gewicht (as graad fan polymerisaasje, DP).Ien-stap biotinylaasje waard brûkt om oligosaccharide binende affiniteit te fergrutsjen troch it tafoegjen fan biotin-LC-hydrazide oan it ferminderjen fan 'e koalhydraat (figuer 2).Yn oplossing reagearret de hemiacetal-groep oan it ferminderjende ein mei de hydrazide-groep fan biotine-LC-hydrazide om in hydrazonbân te foarmjen.Yn 'e oanwêzigens fan' e reduksjemiddel NaCNBH3 wurdt de hydrazonbân fermindere ta in stabyl biotinylearre einprodukt.Mei de wiziging fan it sûkerreduktearjende ein waard bining fan oligosaccharides mei lege DP oan ELISA-platen mooglik, en yn ús stúdzje waard dit dien op avidin-coated platen mei glycan-rjochte mAbs.
Screening fan monoklonale antykladen basearre op ELISA foar biotinylearre oligosaccharides.Hjir (A) kombinearre biotinylaasje fan oligosaccharides en folgjende ELISA-screening mei glycan-rjochte mAbs op NeutrAvidin coated platen en (B) toant in ien-stap proseduere foar biotinylation fan reaksje produkten.
Avidin-coated platen mei oligosaccharide-konjugearre antykladen waarden dêrnei tafoege oan primêre en sekundêre antylders en wosken yn in ljocht- en tiidgefoel medium.Neidat antykodymbining foltôge is, foegje TMB-substraat ta om de plaat te inkubearjen.De reaksje waard úteinlik stoppe mei sulfuric acid.De ynkubearde platen waarden analysearre mei in ELISA-lêzer om de binende sterkte fan elk antykodym te bepalen om antylich-spesifike cross-linking te detektearjen.Foar details en parameters fan it eksperimint, sjoch de oerienkommende paragraaf "Materialen en metoaden".
Wy demonstrearje it nut fan dizze nij ûntwikkele metoade foar spesifike tapassingen troch karakterisearjen fan de oplosbere oligosaccharides oanwêzich yn ACSH lykas yn rûge en suvere oligosaccharide fraksjes isolearre út lignocellulosic hydrolysates.Lykas werjûn yn figuer 3, binne de meast foarkommende epitoop-substitute xylans identifisearre yn ACSH mei help fan bioacylated glycome assay metoaden meastentiids uronic (U) of methyluronic (MeU) en pektyske arabinogalactans.De measte fan harren waarden ek fûn yn ús foarige stúdzje oer de analyze fan glycanen fan net-hydrolysearre fêste stoffen (UHS)43.
Deteksje fan recalcitrante oligosaccharide-epitopen mei in monoklonaal antykodyk rjochte op 'e selwandglycan.De "neutrale" fraksje is de ACN fraksje en de "soere" fraksje is de FA fraksje.Hellere readen op 'e waarmtekaart jouwe hegere epitoopynhâld oan, en helderdere blues jouwe in lege eftergrûn oan.Kleurwearden op 'e skaal binne basearre op rauwe OD-wearden foar formulearringen N = 2.De wichtichste epitopen erkend troch de antykladen wurde rjochts werjûn.
Dizze net-cellulosestruktueren koenen net wurde knipt troch de meast foarkommende cellulases en hemicellulases yn it hifke kommersjele enzymgemik, dat de meast brûkte kommersjele enzymen omfettet.Dêrom binne nije helpenzymen nedich foar har hydrolyse.Sûnder de nedige net-cellulose-accessoire-enzymen foarkomme dizze net-cellulose-obligaasjes folsleine konverzje nei monosaccharides, sels as har âldere sûkerpolymeren wiidweidich hydrolysearre wurde yn koartere fragminten en oplost mei kommersjele enzymgemingen.
Fierdere stúdzje fan sinjaal distribúsje en syn binende sterkte liet sjen dat binende epitopen wiene leger yn hege DP sugar fraksjes (A, B, C, DP oant 20+) as yn lege DP fraksjes (D, E, F, DP) yn dimers) (Fig. 1).Soere fragminten binne faker yn net-cellulose epitopen as neutrale fragminten.Dizze ferskynsels binne yn oerienstimming mei it patroan dat is waarnommen yn ús foarige stúdzje, wêrby't hege DP en soere dielen mear resistint wiene foar enzymatyske hydrolyse.Dêrom kin de oanwêzigens fan net-cellulose glycan-epitopen en U- en MeU-substitúsjes in protte bydrage oan de stabiliteit fan 'e oligosacchariden.It moat opmurken wurde dat bindende en opspoaringseffisjinsje problematysk kin wêze foar oligosaccharides mei lege DP, benammen as de epitoop in dimearyske of trimearyske oligosaccharide is.Dit kin wurde hifke mei kommersjele oligosaccharides fan ferskate lingten, elk befettet mar ien epitoop dy't bynt oan in spesifike mAb.
Sa iepenbiere it gebrûk fan struktuerspesifike antylders bepaalde soarten wjerstânske obligaasjes.Ofhinklik fan it type antykodyk dat brûkt wurdt, it passende ligaasjepatroan, en de sterkte fan it sinjaal dat it produsearret (meast en minste oerfloedich), kinne nije enzymen wurde identifisearre en semi-kwantitatyf tafoege oan it enzymgemik foar mear folsleine glycokonverzje.Troch de analyze fan ACSH oligosaccharides as foarbyld te nimmen, kinne wy ​​in databank meitsje fan glycanobligaasjes foar elk biomassamateriaal.Dêrby moat opmurken wurde dat de ferskillende affiniteit fan antistoffen moatte wurde rekken holden, en as harren affiniteit is ûnbekend, dit sil meitsje bepaalde swierrichheden by it fergelykjen fan de sinjalen fan ferskillende antistoffen.Derneist kin fergeliking fan glycanobligaasjes it bêste wurkje tusken samples foar itselde antykodym.Dizze eigensinnige obligaasjes kinne dan wurde keppele oan de CAZyme-database, wêrfan wy enzymen kinne identifisearje, kandidaat-enzymen selektearje en testen foar bondingbrekkende enzymen, of mikrobiele systemen ûntwikkelje om dizze enzymen út te drukken foar gebrûk yn bioraffinaderijen44.
Om te evaluearjen hoe't immunologyske metoaden komplementearje alternative metoaden foar it karakterisearjen fan lege molekulêre gewicht oligosaccharides oanwêzich yn lignocellulosic hydrolysates, wy útfierd MALDI (Fig. 4, S1-S8) en analyze fan TMS-ôflaat saccharides basearre op GC-MS op itselde paniel (Fig. 5) oligosaccharide diel.MALDI wurdt brûkt om te fergelykjen oft de massaferdieling fan oligosaccharidemolekulen oerienkomt mei de bedoelde struktuer.Op fig.4 toant de MC fan 'e neutrale komponinten ACN-A en ACN-B.ACN-A-analyze befêstige in berik fan pentose-sûkers fariearjend fan DP 4-8 (fig. 4) oant DP 22 (fig. S1), waans gewichten oerienkomme mei MeU-xylan oligosaccharides.ACN-B-analyse befêstige de pentose- en glucoxylan-searje mei DP 8-15.Yn oanfoljend materiaal lykas figuer S3, FA-C soere groep massa distribúsjekaarten toane in berik fan (Me) U substituearre pentose sûkers mei in DP fan 8-15 dy't oerienkomme mei de ferfongen xylans fûn yn ELISA-basearre mAb screening.De epitopen binne konsekwint.
MALDI-MS spektrum fan oplosbere net-konforme oligosaccharides oanwêzich yn ACS.Hjir, (A) ACN-A leech gewicht berik fraksjes befetsje methylated uronzuur (DP 4-8) ferfongen glucuroxylan oligosaccharides en (B) ACN-B xylan en methylated uron acid oligosaccharides ferfongen troch glucuroxylan (DP 8-15).
Analyze fan 'e gearstalling fan' e glycanresidu fan refractaire oligosaccharides.Hjir (A) TMS saccharide gearstalling fan ferskate oligosaccharide fraksjes krigen mei GC-MS analyze.(B) Struktueren fan ferskate TMS-ôflaat sûkers oanwêzich yn oligosaccharides.ACN - acetonitril fraksje mei neutrale oligosaccharides en FA - ferulic acid fraksje mei acid oligosaccharides.
In oare nijsgjirrige konklúzje waard lutsen út 'e LC-MS-analyze fan' e oligosaccharidefraksje, lykas werjûn yn figuer S9 (metoaden kinne sjoen wurde yn it elektroanyske oanfoljende materiaal).Fragminten fan hexose- en -OAc-groepen waarden ferskate kearen waarnommen tidens de ligaasje fan 'e ACN-B-fraksje.Dizze fynst befêstiget net allinich de fragmintaasje waarnommen yn glycome en MALDI-TOF-analyse, mar jout ek nije ynformaasje oer potinsjele koalhydraatderivaten yn foarbehannele lignocellulosic biomassa.
Wy analysearren ek de sûkerkomposysje fan 'e oligosaccharidefraksje mei TMS-sûkerderivatisaasje.Mei GC-MS hawwe wy de gearstalling fan neurale (net-derivative) en soere sûkers (GluA en GalA) yn 'e oligosaccharidefraksje bepaald (figuer 5).Glucuronic acid wurdt fûn yn soere komponinten C en D, wylst galacturonic acid wurdt fûn yn soere komponinten A en B, dy't beide hege DP-komponinten binne fan soere sûkers.Dizze resultaten befêstigje net allinich ús ELISA- en MALDI-gegevens, mar binne ek yn oerienstimming mei ús eardere stúdzjes fan oligosaccharide-akkumulaasje.Dêrom leauwe wy dat moderne immunologyske metoaden dy't biotinylaasje fan oligosaccharides brûke en dêropfolgjende ELISA-screening genôch binne om oplosbere recalcitrante oligosaccharides te detektearjen yn ferskate biologyske samples.
Sûnt ELISA-basearre mAb-screeningmetoaden binne falidearre troch ferskate ferskillende metoaden, woene wy ​​it potensjeel fan dizze nije kwantitative metoade fierder ûndersykje.Twa kommersjele oligosaccharides, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) en 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), waarden kocht en hifke mei in nije mAb-oanpak dy't rjochte op 'e selwandglycan.Figuer 6 lit in lineêre korrelaasje sjen tusken it biotinylearre binende sinjaal en de logkonsintraasje fan oligosaccharide-konsintraasje, wat suggerearret op in mooglik Langmuir-adsorpsjemodel.Under de mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, en CCRC-M151 korrelearre mei XHE, en CCRC-M108, CCRC-M109, en LM11 korrelearre mei A2XX oer in berik fan 100n namno.Troch de beheinde beskikberens fan antykladen tidens it eksperimint waarden beheinde eksperiminten útfierd mei elke oligosaccharide-konsintraasje.Dêrby moat opmurken wurde dat guon antistoffen hiel oars reagearje op deselde oligosaccharide as substraat, nei alle gedachten om't se bine oan wat ferskillende epitopen en kin hawwe hiel ferskillende binende affiniteiten.De meganismen en gefolgen fan krekte epitoop-identifikaasje sille folle komplekser wêze as de nije mAb-oanpak wurdt tapast op echte samples.
Twa kommersjele oligosaccharides waarden brûkt om it deteksjeberik fan ferskate glycan-targeting mAbs te bepalen.Hjir, lineêre korrelaasjes mei log konsintraasje fan oligosaccharide konsintraasje jouwe Langmuir adsorption patroanen foar (A) XHE mei mAb en (B) A2XX mei mAb.De oerienkommende epitopen jouwe de struktueren oan fan 'e kommersjele oligosaccharides dy't brûkt wurde as substraten yn 'e assay.
It gebrûk fan glycan-rjochte monoklonale antykladen (glycokomyske analyse of ELISA-basearre mAb-screening) is in krêftich ark foar yngeande karakterisearring fan de measte fan 'e wichtichste selwandglycanen dy't plantbiomassa foarmje.Klassike glycananalyse karakterisearret lykwols allinich gruttere selwandglycanen, om't de measte oligosaccharides net effisjint ymmobilisearre wurde op ELISA-platen.Yn dizze stúdzje waard AFEX-foarbehannele maisstover enzymatysk hydrolysearre by in hege fêste ynhâld.Sûkeranalyse waard brûkt om de gearstalling fan wjerstânnige selwandkoalhydraten yn it hydrolysaat te bepalen.De mAb-analyse fan lytsere oligosaccharides yn hydrolysaten wurdt lykwols ûnderskat, en ekstra ark binne nedich om oligosaccharides effektyf op ELISA-platen te immobilisearjen.
Wy rapportearje hjir in nije en effisjinte metoade foar oligosaccharide-immobilisaasje foar mAb-screening troch kombinearjen fan oligosaccharide-biotinylaasje folge troch ELISA-screening op NeutrAvidin ™ coated platen.De ymmobilisearre biotinylearre oligosaccharides lieten foldwaande affiniteit sjen foar it antykodyk om rappe en effisjinte opspoaren fan wjerlizzende oligosacchariden mooglik te meitsjen.Analyse fan 'e gearstalling fan dizze eigensinnige oligosaccharides basearre op massaspektrometry befêstige de resultaten fan dizze nije oanpak foar immunoscreening.Sa litte dizze stúdzjes sjen dat de kombinaasje fan oligosaccharide-biotinylaasje en ELISA-screening mei glycan-rjochte monoklonale antykladen kin wurde brûkt om crosslinks yn oligosaccharides te detektearjen en kin breed wurde tapast yn oare biogemyske stúdzjes dy't de struktuer fan oligosacchariden karakterisearje.
Dizze metoade foar profilearjen fan glycan op biotine is it earste rapport dat yn steat is om de wjerstânnige koalhydraatferbiningen fan oplosbere oligosaccharides yn plantbiomassa te ûndersiikjen.Dit helpt te begripen wêrom't guon dielen fan biomassa sa koppich binne as it giet om produksje fan biobrânstof.Dizze metoade foltôget in wichtige gat yn glycoomanalysemetoaden en wreidet har tapassing út nei in breder skala oan substraten bûten plantoligosacchariden.Yn 'e takomst kinne wy ​​​​robotika brûke foar biotinylaasje en de metoade brûke dy't wy hawwe ûntwikkele foar analyse mei hege trochset fan samples mei ELISA.
Koarnstro (CS) groeid út Pioneer 33A14 hybride sied waard yn 2010 rispe fan Kramer Farms yn Ray, Kolorado.Mei tastimming fan de grûneigner kin dizze biomassa brûkt wurde foar ûndersyk. De samples waarden droech < 6% focht opslein yn zip-lock bags by keamertemperatuer. De samples waarden droech < 6% focht opslein yn zip-lock bags by keamertemperatuer. Ûntwikkelje sûchjes mei belestingen < 6% yn belestingen mei sûch-molnyske gearkomsten. Samples waarden opslein droech by <6% Feuchte yn zippered sekken by keamertemperatuer.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Ôfhinklik fan 'e belestingen mei in fermogen fan < 6%. Samples wurde opslein yn ritsen sekken by keamertemperatuer mei vochtigheid <6%.De stúdzje foldie oan lokale en nasjonale rjochtlinen.Komposysjeanalyse waard útfierd mei it NREL-protokol.De gearstalling waard fûn om 31,4% glucan, 18,7% xylan, 3,3% arabinan, 1,2% galactan, 2,2% acetyl, 14,3% lignine, 1,7% proteïne en 13,4% jiske te befetsjen.
Cellic® CTec2 (138 mg protein / ml, lot VCNI 0001) is in kompleks mingsel fan cellulase, β-glucosidase en Cellic® HTec2 (157 mg protein / ml, lot VHN00001) út Novozymes (Franklinton, NC, Feriene Steaten)).Multifect Pectinase® (72 mg proteïne / ml), in komplekse mingsel fan pektine-degradearjende enzymen, waard skonken troch DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, FS).Enzymeproteinkonsintraasjes waarden bepaald troch it skatten fan proteinynhâld (en subtrahearjen fan de bydrage fan net-proteinstikstof) mei Kjeldahl stikstofanalyse (AOAC-metoade 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatomaceous Earth 545 waard kocht fan EMD Millipore (Billerica, MA).Aktivearre koalstof (DARCO, 100 mesh korrels), Avicel (PH-101), beech xylan, en alle oare gemikaliën waarden kocht fan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX foarbehanneling waard útfierd by GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Pre-behanneling waard útfierd op 140 ° C. foar 15 minuten.46 ferbliuwstiid by 1: 1 ferhâlding fan wetterfrije ammoniak oant biomassa by 60% (w/w) laden yn in batchreaktor fan roestfrij stiel (Parr Instruments Company).It duorre 30 minuten.De reaktor waard op 140 ° C brocht en de ammoniak waard fluch frijlitten, wêrtroch't de biomassa fluch werom nei keamertemperatuer.De gearstalling fan AFEX pre-behannele corn stover (ACS) wie fergelykber mei dy fan untreated corn stover (UT-CS).
High solids ACSH 25% (w / w) (likernôch 8% dextran laden) waard taret as útgongspunt materiaal foar grutskalige produksje fan oligosaccharides.Enzymatyske hydrolyse fan ACS waard útfierd mei in kommersjeel enzymgemik, ynklusyf Cellic® Ctec2 10 mg protein / g glucan (yn foarbehannele biomassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein / g glucan, en Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg proteïne/g dextran.Enzymatyske hydrolyse waard útfierd yn in 5-liter bioreaktor mei in wurkfolum fan 3 liter, pH 4,8, 50 ° C en 250 rpm.Nei hydrolyse foar 96 oeren waard it hydrolysaat sammele troch centrifugaasje by 6000 rpm foar 30 minuten en dan by 14000 rpm foar 30 minuten om unhydrolysearre fêste stoffen te ferwiderjen.It hydrolysaat waard dêrnei ûnderwurpen oan sterile filtraasje troch in 0,22 mm filterbeker.It filtrearre hydrolysaat waard opslein yn sterile flessen by 4 ° C. en dan fraksjonearre op koalstof.
Analyse fan 'e gearstalling fan extract-basearre biomassa-monsters neffens NREL laboratoariumanalyseprosedueres: tarieding fan samples foar gearstallingsanalyze (NREL / TP-510-42620) en bepaling fan strukturele koalhydraten en lignine yn biomassa (NREL / TP-510 - 42618)47.
Oligosaccharide-analyse fan 'e hydrolysatstream waard útfierd op in skaal fan 2 ml mei in autoklaaf-basearre soere hydrolysemetoade.Mix it hydrolysaatmonster mei 69,7 µl 72% sulfursûr yn in 10 ml schroefdop-kultuerbuis en ynkubearje foar 1 h op in benchtop by 121 °C, koelje op iis en filterje yn in flesje mei hege prestaasjes floeistofchromatografy (HPLC).De konsintraasje fan oligosaccharides waard bepaald troch de konsintraasje fan monosaccharides yn 'e net-hydrolysearre stekproef te subtrahearjen fan' e totale sûkerkonsintraasje yn 'e soere-hydrolysearre stekproef.
Glukose-, xylose- en arabinose-konsintraasjes yn 'e soere hydrolysearre biomassa waarden analysearre mei in Shimadzu HPLC-systeem foarsjoen fan in autosampler, kolomheater, isokratyske pomp, en brekingsyndeksdetektor op in Bio-Rad Aminex HPX-87H-kolom.De kolom waard hâlden op 50 ° C en eluearre mei 0,6 ml / min 5 mM H2SO4 yn wetter.streame.
De supernatant fan it hydrolysat waard verdund en analysearre foar monomer- en oligosaccharide-ynhâld.Monomere sûkers krigen nei enzymatyske hydrolyse waarden analysearre troch HPLC útrist mei in Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolom en in ash guard kolom.De kolomtemperatuer waard hâlden op 80 ° C, wetter waard brûkt as de mobile faze mei in trochstreaming fan 0,6 ml / min.Oligosaccharides waarden bepaald troch hydrolyse yn verdunde soer by 121 ° C neffens de metoaden beskreaun yn refs.41, 48, 49.
Saccharide-analyze waard útfierd op rau, AFEX foarbehannele en alle net-hydrolysearre biomassa-residuen (ynklusyf produksje fan seriële sellenmuorre-ekstrakten en har mAb-screening) mei earder beskreaune prosedueres 27, 43, 50, 51.Foar glycoomanalyse wurde alkohol-ûnoplosbere resten fan plantselmuorremateriaal taret út biomassa-residuen en ûnderwurpen oan seriële ekstraksje mei hieltyd agressivere reagents lykas ammonium oxalate (50 mM), natriumkarbonaat (50 mM en 0,5% w / v), CON.(1M en 4M, beide mei 1% w / v natrium borohydride) en soere chlorite lykas earder beskreaun52,53.De ekstrakten waarden doe ûnderwurpen oan ELISA tsjin in kompleks paniel fan mAb50's rjochte op 'e selwandglycan, en de mAb-binende reaksjes waarden presintearre as in waarmtekaart.mAbs rjochte op plant sel muorre glycan waarden kocht út laboratoarium stocks (CCRC, JIM en MAC rige).
Ien-stap biotinylaasje fan oligosaccharides.De konjugaasje fan koalhydraten mei biotin-LC-hydrazide waard útfierd mei de folgjende proseduere.Biotin-LC-hydrazide (4,6 mg / 12 μmol) waard oplost yn dimethylsulfoxide (DMSO, 70 μl) troch krêftich roeren en ferwaarmjen op 65 ° C. foar 1 min.Glacial acetic acid (30 µl) waard tafoege en it mingsel waard getten op natrium cyanoborohydride (6.4 mg / 100 µmol) en folslein oplost nei ferwaarming op 65 ° C. foar likernôch 1 minút.Dêrnei waard fan 5 oant 8 μl fan it reaksjegemik tafoege oan it droege oligosaccharide (1-100 nmol) om in 10-fâldige of mear molêre oerskot fan it label te krijen oer it ferminderjende ein.De reaksje waard útfierd by 65 ° C foar 2 h, wêrnei't de samples fuortendaliks suvere waarden.Gjin sodium cyanoborohydride waard brûkt yn de labeling eksperiminten sûnder reduksje, en de samples waarden reagearre op 65 ° C. foar 2,5 oeren.
ELISA coating en waskjen fan samples fan biotinylated oligosaccharides.25 μl fan biotinylearre samples (100 μl fan elk konsintrearre probleem fertinne yn 5 ml fan 0.1 M Tris-bufferoplossing (TBS)) waarden tafoege oan elke put fan 'e avidin-coated plaat.Kontrôleputten waarden bedekt mei 50 μl biotine by in konsintraasje fan 10 μg / ml yn 0.1 M TBS.Deionisearre wetter waard brûkt as coating foar lege mjittingen.De tablet waard 2 oeren ynkubeare by keamertemperatuer yn it tsjuster.Waskje de plaat 3 kear mei 0,1% magere molke yn 0,1 M TBS mei programma nr.11 foar Grenier flat 3A.
Tafoeging en waskjen fan primêre antykladen.Foegje 40 µl primêr antykodyk ta oan elke put.Ynkubearje de mikroplaat foar 1 oere by keamertemperatuer yn it tsjuster.De platen waarden dan 3 kear wosken mei 0,1% molke yn 0,1M TBS mei waskprogramma #11 foar Grenier Flat 3A.
Foegje sekundêr antykodym ta en waskje.Foegje 50 µl mûs / rat sekundêr antykodym (1: 5000 verdund yn 0,1% molke yn 0,1 M TBS) ta oan elke put.Ynkubearje de mikroplaat foar 1 oere by keamertemperatuer yn it tsjuster.De mikroplaten waarden dan 5 kear wosken mei 0,1% molke yn 0,1 M TBS mei Grenier Flat 5A plaatwasprogramma #12.
It tafoegjen fan in substraat.Foegje 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ta oan it basissubstraat (troch 2 drippen buffer, 3 drippen TMB, 2 drippen wetterstofperoxide oan 15 ml deionisearre wetter ta te foegjen).Tariede de TMB substraat.en vortex foar gebrûk).Inkubearje de mikroplaat by keamertemperatuer foar 30 minuten.Yn it tsjuster.
Folje de stap en lês de tablet.Foegje 50 µl 1 N sulfuric acid ta oan elke put en registrearje de absorption fan 450 oant 655 nm mei in ELISA-lêzer.
Bereid 1 mg / ml oplossingen fan dizze analyten yn deionisearre wetter: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (ynterne standert).Twa standerts waarden taret troch it tafoegjen fan de 1 mg / mL sûker-oplossingen werjûn yn Tabel 1. Samples wurde beferzen en lyofilisearre by -80 ° C. oant alle wetter wurdt fuorthelle (meastentiids sawat 12-18 oeren).
Foegje 100-500 µg monster ta oan schroefdopbuizen op in analytysk lykwicht.Record it bedrach tafoege.It is it bêste om it probleem op te lossen yn in spesifike konsintraasje fan oplosmiddel en it ta te foegjen oan 'e buis as in floeibere aliquot.Brûk 20 µl fan 1 mg / ml inositol as ynterne standert foar elke stekproef.It bedrach fan ynterne standert tafoege oan it stekproef moat itselde wêze as it bedrach fan ynterne standert tafoege oan 'e standertbuis.
Foegje 8 ml wetterfrije methanol ta oan in flesse mei skroefdop.Dan 4 ml fan 3 N. methanolic HCl oplossing, capped en skodde.Dit proses brûkt gjin wetter.
Foegje 500 µl fan 1 M HCl methanol-oplossing ta oan de oligosaccharide-samples en standert TMS-buizen.Samples waarden incubated nachts (168 oeren) op 80 ° C. yn in termyske blok.Dry it methanolysisprodukt by keamertemperatuer mei in droege mannichfâld.Foegje 200 µl MeOH ta en droegje wer.Dit proses wurdt werhelle twa kear.Foegje 200 µl methanol, 100 µl pyridine en 100 µl acetic anhydride ta oan it probleem en mingje goed.Samples waarden ynkubeare by keamertemperatuer foar 30 minuten.en droech.Foegje 200 µl methanol ta en droegje wer.
Foegje 200 µl Tri-Sil ta en waarmte de buis foar 20 minuten.80 ° C, dan koele nei keamertemperatuer.Brûk in droege manifold om it monster fierder te droegjen oant in folume fan sawat 50 µl.It is wichtich om te notearjen dat wy de samples net folslein droech lieten.
Foegje 2 ml hexane ta en mingje goed troch vortexing.Folje de tips fan Pasteur-pipetten (5-8 mm) mei in stik glêswolle troch de glêswolle yn te setten boppe op in pipet mei in diameter fan 5-3/4 inch.Samples waarden sintrifuge by 3000 g foar 2 minuten.Alle ûnoplosbere resten wurde delset.Dryje it probleem oant 100-150 µl.In folume fan sawat 1 μl waard yn 'e GC-MS ynjeksje by in earste temperatuer fan 80 ° C en in earste tiid fan 2.0 minuten (tabel 2).