ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงผลเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
วิธีการทางภูมิคุ้มกันวิทยาและสเปกโทรเมตรีมวลแบบใหม่สำหรับการวิเคราะห์เชิงซ้อนของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่คงตัวในซังข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดด้วย AFEX ชีวมวลลิกโนเซลลูโลสเป็นทางเลือกที่ยั่งยืนแทนเชื้อเพลิงฟอสซิลและถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพเพื่อการผลิตผลิตภัณฑ์ต่างๆ เช่น อาหาร อาหารสัตว์ เชื้อเพลิง และสารเคมี หัวใจสำคัญของเทคโนโลยีเหล่านี้คือการพัฒนากระบวนการที่มีต้นทุนแข่งขันได้สำหรับการเปลี่ยนคาร์โบไฮเดรตเชิงซ้อนที่มีอยู่ในผนังเซลล์พืชให้เป็นน้ำตาลอย่างง่าย เช่น กลูโคส ไซโลส และอะราบิโนส เนื่องจากชีวมวลลิกโนเซลลูโลสมีความดื้อรั้นมาก จึงต้องผ่านการบำบัดทางเคมีด้วยความร้อน (เช่น การลอกเส้นใยด้วยแอมโมเนีย (AFEX) กรดเจือจาง (DA) ของเหลวไอออนิก (IL)) และการบำบัดทางชีวภาพ (เช่น การไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์และการหมักจุลินทรีย์) ร่วมกันเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ อย่างไรก็ตาม เมื่อใช้เอนไซม์จากเชื้อราเชิงพาณิชย์ในกระบวนการไฮโดรไลซิส น้ำตาลที่ละลายน้ำได้ที่เกิดขึ้นจะมีเพียง 75-85% เท่านั้นที่เป็นโมโนแซ็กคาไรด์ ส่วนที่เหลืออีก 15-25% เป็นโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้แต่ย่อยสลายยาก ซึ่งจุลินทรีย์ไม่สามารถนำไปใช้ได้เสมอไป ก่อนหน้านี้ เราประสบความสำเร็จในการแยกและทำให้บริสุทธิ์โอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้แต่ย่อยสลายยาก โดยใช้การแยกด้วยคาร์บอนและไดอะตอมไมต์ร่วมกับการโครมาโทกราฟีแบบแยกขนาด และยังได้ศึกษาคุณสมบัติการยับยั้งเอนไซม์ของโอลิโกแซ็กคาไรด์เหล่านั้นด้วย เราพบว่าโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีระดับการพอลิเมอไรเซชัน (DP) สูงและมีหมู่เมทิลยูโรนิกแอซิดนั้น ย่อยสลายยากกว่าด้วยเอนไซม์ผสมเชิงพาณิชย์ เมื่อเทียบกับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มี DP ต่ำและโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่เป็นกลาง ในที่นี้เราได้รายงานการใช้วิธีการเพิ่มเติมหลายวิธี รวมถึงการวิเคราะห์โปรไฟล์ไกลแคนโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAbs) ที่จำเพาะต่อไกลแคนในชีวมวลพืช เพื่อระบุลักษณะพันธะไกลแคนในผนังเซลล์พืชและสารไฮโดรไลเสตจากเอนไซม์ การวิเคราะห์มวลสารด้วยเทคนิค MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) ซึ่งใช้พีควินิจฉัยที่ให้ข้อมูลโครงสร้างที่ได้จากสเปกโทรสโกปีหลังจากการสลายตัวทุติยภูมิของไอออนลบ และการวิเคราะห์มวลสารด้วยเทคนิค GC-MS (gas chromatography and mass spectrometry) เพื่อระบุลักษณะพันธะโอลิโกแซ็กคาไรด์ทั้งแบบที่มีและไม่มีการดัดแปลงโครงสร้าง เนื่องจากโอลิโกแซ็กคาไรด์มีขนาดเล็ก (DP 4–20) โมเลกุลเหล่านี้จึงยากต่อการนำมาใช้สำหรับการจับและการระบุลักษณะของ mAb เพื่อแก้ไขปัญหานี้ เราได้ประยุกต์ใช้วิธีการตรึงโอลิโกแซ็กคาไรด์แบบใหม่โดยใช้การเชื่อมต่อไบโอติน ซึ่งสามารถติดฉลากโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ที่มีค่า DP ต่ำส่วนใหญ่บนพื้นผิวไมโครเพลทได้สำเร็จ จากนั้นจึงนำไปใช้ในระบบ mAb ที่มีประสิทธิภาพสูงสำหรับการวิเคราะห์การเชื่อมต่อจำเพาะ วิธีการใหม่นี้จะช่วยอำนวยความสะดวกในการพัฒนาการทดสอบไกลโคมที่มีประสิทธิภาพสูงในอนาคต ซึ่งสามารถนำไปใช้ในการแยกและระบุลักษณะของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีอยู่ในไบโอมาร์กเกอร์เพื่อวัตถุประสงค์ในการวินิจฉัยโรคได้
ชีวมวลลิกโนเซลลูโลส ซึ่งประกอบด้วยวัสดุทางการเกษตร ป่าไม้ หญ้า และไม้ เป็นวัตถุดิบที่มีศักยภาพสำหรับการผลิตผลิตภัณฑ์ชีวภาพ รวมถึงอาหาร อาหารสัตว์ เชื้อเพลิง และสารตั้งต้นทางเคมีเพื่อผลิตผลิตภัณฑ์ที่มีมูลค่าสูงขึ้น1 คาร์โบไฮเดรต (เช่น เซลลูโลสและเฮมิเซลลูโลส) ที่มีอยู่ในผนังเซลล์พืชจะถูกย่อยสลายเป็นโมโนแซ็กคาไรด์โดยกระบวนการทางเคมีและการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพ (เช่น การไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์และการหมักโดยจุลินทรีย์) การเตรียมการเบื้องต้นที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ การขยายเส้นใยด้วยแอมโมเนีย (AFEX) กรดเจือจาง (DA) ของเหลวไอออนิก (IL) และการระเบิดด้วยไอน้ำ (SE) ซึ่งใช้สารเคมีและความร้อนร่วมกันเพื่อลดการผลิตลิกโนเซลลูโลสโดยการเปิดผนังเซลล์พืช3,4 ความดื้อรั้นของสสาร 5. การไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ดำเนินการที่ภาระของแข็งสูงโดยใช้เอนไซม์ที่มีคาร์โบไฮเดรตที่ออกฤทธิ์เชิงพาณิชย์ (CAZymes) และการหมักจุลินทรีย์โดยใช้ยีสต์หรือแบคทีเรียที่ดัดแปลงพันธุกรรมเพื่อผลิตเชื้อเพลิงและสารเคมีชีวภาพ 6
เอนไซม์ CAZymes ในเอนไซม์เชิงพาณิชย์ประกอบด้วยส่วนผสมที่ซับซ้อนของเอนไซม์ที่ทำงานร่วมกันเพื่อสลายพันธะคาร์โบไฮเดรต-น้ำตาลที่ซับซ้อนเพื่อสร้างโมโนแซ็กคาไรด์2,7 ดังที่เราได้รายงานไปก่อนหน้านี้ โครงข่ายที่ซับซ้อนของพอลิเมอร์อะโรมาติกของลิกนินกับคาร์โบไฮเดรตทำให้ยากต่อการจัดการ ซึ่งนำไปสู่การเปลี่ยนน้ำตาลที่ไม่สมบูรณ์ ทำให้เกิดการสะสมของโอลิโกแซ็กคาไรด์ 15-25% ที่ไม่ได้ผลิตขึ้นระหว่างการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ของชีวมวลที่ผ่านการปรับสภาพเบื้องต้น นี่เป็นปัญหาทั่วไปในวิธีการปรับสภาพชีวมวลต่างๆ สาเหตุบางประการของปัญหาคอขวดนี้ ได้แก่ การยับยั้งเอนไซม์ระหว่างการไฮโดรไลซิส หรือการขาดหายไปหรือระดับต่ำของเอนไซม์ที่จำเป็นต่อการสลายพันธะน้ำตาลในชีวมวลพืช การทำความเข้าใจองค์ประกอบและลักษณะโครงสร้างของน้ำตาล เช่น พันธะน้ำตาลในโอลิโกแซ็กคาไรด์ จะช่วยให้เราปรับปรุงการเปลี่ยนน้ำตาลระหว่างการไฮโดรไลซิส ทำให้กระบวนการทางเทคโนโลยีชีวภาพมีต้นทุนที่แข่งขันได้กับผลิตภัณฑ์ที่ได้จากปิโตรเลียม
การกำหนดโครงสร้างของคาร์โบไฮเดรตเป็นเรื่องท้าทายและต้องใช้การผสมผสานวิธีการต่างๆ เช่น โครมาโทกราฟีของเหลว (LC)11,12, สเปกโทรสโกปีเรโซแนนซ์แม่เหล็กนิวเคลียร์ (NMR)13, อิเล็กโทรโฟเรซิสแบบแคปิลลารี (CE)14,15,16 และแมสสเปกโทรเมตรี (MS)17,18 วิธีการ MS เช่น แมสสเปกโทรเมตรีแบบไทม์ออฟไฟลต์ด้วยการดูดซับและการแตกตัวเป็นไอออนด้วยเลเซอร์โดยใช้เมทริกซ์ (MALDI-TOF-MS) เป็นวิธีการที่หลากหลายสำหรับการระบุโครงสร้างของคาร์โบไฮเดรต เมื่อเร็วๆ นี้ การใช้ MS แบบคู่ขนานด้วยการแยกตัวที่เกิดจากการชน (CID) ของโซเดียมไอออนแอดดักต์ได้รับการใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดในการระบุลายนิ้วมือที่สอดคล้องกับตำแหน่งการยึดติดของโอลิโกแซ็กคาไรด์ การกำหนดค่าอะโนเมอริก ลำดับ และตำแหน่งการแตกแขนง 20, 21
การวิเคราะห์ไกลแคนเป็นเครื่องมือที่ยอดเยี่ยมสำหรับการระบุพันธะคาร์โบไฮเดรตอย่างละเอียด22 วิธีนี้ใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAbs) ที่มุ่งเป้าไปที่ไกลแคนของผนังเซลล์พืชเป็นตัวตรวจสอบเพื่อทำความเข้าใจการเชื่อมโยงคาร์โบไฮเดรตที่ซับซ้อน มี mAbs มากกว่า 250 ชนิดที่พร้อมใช้งานทั่วโลก ซึ่งได้รับการออกแบบมาเพื่อต่อต้านโอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงเส้นและแบบแตกแขนงต่างๆ โดยใช้แซ็กคาไรด์หลายชนิด24 mAbs หลายชนิดถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อกำหนดลักษณะโครงสร้าง องค์ประกอบ และการดัดแปลงของผนังเซลล์พืช เนื่องจากมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์พืช อวัยวะ อายุ ระยะการพัฒนา และสภาพแวดล้อมการเจริญเติบโต25,26 เมื่อไม่นานมานี้ วิธีนี้ถูกนำมาใช้เพื่อทำความเข้าใจประชากรของเวสิเคิลในระบบพืชและสัตว์ และบทบาทของเวสิเคิลเหล่านั้นในการขนส่งไกลแคนตามที่กำหนดโดยเครื่องหมายระดับเซลล์ ระยะการพัฒนา หรือสิ่งกระตุ้นจากสิ่งแวดล้อม และเพื่อกำหนดกิจกรรมของเอนไซม์ โครงสร้างที่แตกต่างกันบางส่วนของไกลแคนและไซแลนที่ได้รับการระบุ ได้แก่ เพคติน (P), ไซแลน (X), แมนแนน (M), ไซโลกลูแคน (XylG), กลูแคนพันธะผสม (MLG), อาราบิโนไซแลน (ArbX), กาแลคโตแมนแนน (GalG), กรดกลูคูโรนิก-อาราบิโนไซแลน (GArbX) และอาราบิโน-กาแลคแทน (ArbG)29
อย่างไรก็ตาม แม้จะมีการวิจัยมากมาย แต่ก็มีเพียงไม่กี่งานวิจัยที่มุ่งเน้นไปที่ลักษณะของการสะสมของโอลิโกแซ็กคาไรด์ระหว่างการไฮโดรไลซิสที่มีปริมาณของแข็งสูง (HSL) รวมถึงการปลดปล่อยโอลิโกแซ็กคาไรด์ การเปลี่ยนแปลงความยาวของสายโซ่โอลิโกเมอร์ระหว่างการไฮโดรไลซิส โพลิเมอร์ DP ต่ำต่างๆ และเส้นโค้งการกระจายตัวของพวกมัน 30,31,32 ในขณะเดียวกัน แม้ว่าการวิเคราะห์ไกลแคนจะพิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์โครงสร้างไกลแคนอย่างครอบคลุม แต่ก็ยากที่จะประเมินโอลิโกแซ็กคาไรด์ DP ต่ำที่ละลายน้ำได้โดยใช้วิธีการแอนติบอดี โอลิโกแซ็กคาไรด์ DP ขนาดเล็กที่มีน้ำหนักโมเลกุลน้อยกว่า 5-10 kDa จะไม่จับกับแผ่น ELISA 33, 34 และจะถูกชะล้างออกไปก่อนที่จะเติมแอนติบอดี
ในงานวิจัยนี้ เราได้สาธิตการทดสอบ ELISA บนแผ่นเคลือบอะวิดินโดยใช้แอนติบอดีโมโนโคลนอลเป็นครั้งแรก โดยผสมผสานขั้นตอนการไบโอติไนเลชันแบบขั้นตอนเดียวสำหรับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายได้และทนต่อการสลายตัวเข้ากับการวิเคราะห์ไกลโคม วิธีการวิเคราะห์ไกลโคมของเราได้รับการตรวจสอบความถูกต้องโดยการวิเคราะห์พันธะโอลิโกแซ็กคาไรด์เสริมโดยใช้ MALDI-TOF-MS และ GC-MS โดยใช้การดัดแปลงไตรเมทิลไซลิล (TMS) ขององค์ประกอบน้ำตาลที่ถูกไฮโดรไลซ์ แนวทางใหม่นี้สามารถพัฒนาเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพสูงในอนาคตและนำไปประยุกต์ใช้ในงานวิจัยทางการแพทย์ได้อย่างกว้างขวางยิ่งขึ้น35
การดัดแปลงหลังการแปลของเอนไซม์และแอนติบอดี เช่น การเติมหมู่ไกลโคซิล (glycosylation)36 ส่งผลต่อกิจกรรมทางชีวภาพของพวกมัน ตัวอย่างเช่น การเปลี่ยนแปลงในการเติมหมู่ไกลโคซิลของโปรตีนในซีรั่มมีบทบาทสำคัญในโรคข้ออักเสบ และการเปลี่ยนแปลงในการเติมหมู่ไกลโคซิลยังถูกใช้เป็นเครื่องหมายวินิจฉัยโรค37 มีรายงานในวรรณกรรมว่าไกลแคนชนิดต่างๆ ปรากฏขึ้นได้ง่ายในโรคต่างๆ รวมถึงโรคอักเสบเรื้อรังของระบบทางเดินอาหารและตับ การติดเชื้อไวรัส มะเร็งรังไข่ มะเร็งเต้านม และมะเร็งต่อมลูกหมาก38,39,40 การทำความเข้าใจโครงสร้างของไกลแคนโดยใช้วิธี ELISA ไกลแคนแบบใช้แอนติบอดีจะช่วยเพิ่มความมั่นใจในการวินิจฉัยโรคโดยไม่ต้องใช้วิธี MS ที่ซับซ้อน
การศึกษาครั้งก่อนของเราแสดงให้เห็นว่าโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อรั้นยังคงไม่ถูกไฮโดรไลซ์หลังจากการปรับสภาพเบื้องต้นและการไฮโดรไลซ์ด้วยเอนไซม์ (รูปที่ 1) ในงานวิจัยที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ เราได้พัฒนาวิธีการสกัดแบบเฟสของแข็งด้วยถ่านกัมมันต์เพื่อแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ออกจากไฮโดรไลเซตของซังข้าวโพดที่ผ่านการปรับสภาพเบื้องต้นด้วย AFEX (ACSH)8 หลังจากสกัดและแยกเบื้องต้นแล้ว โอลิโกแซ็กคาไรด์จะถูกแยกส่วนเพิ่มเติมโดยโครมาโทกราฟีแบบแยกตามขนาด (SEC) และรวบรวมตามลำดับน้ำหนักโมเลกุล โมโนเมอร์และโอลิโกเมอร์ของน้ำตาลที่ปลดปล่อยออกมาจากการปรับสภาพเบื้องต้นต่างๆ จะถูกวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์องค์ประกอบของน้ำตาล เมื่อเปรียบเทียบปริมาณของโอลิโกเมอร์ของน้ำตาลที่ได้จากวิธีการปรับสภาพเบื้องต้นต่างๆ การมีอยู่ของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อรั้นเป็นปัญหาทั่วไปในการเปลี่ยนชีวมวลเป็นโมโนแซ็กคาไรด์ และอาจนำไปสู่การลดผลผลิตน้ำตาลอย่างน้อย 10-15% และอาจสูงถึง 18% วิธีการนี้ใช้สำหรับการผลิตเศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ในปริมาณมากต่อไป ACH ที่ได้และเศษส่วนย่อยที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่างกันถูกนำมาใช้เป็นวัสดุทดลองสำหรับการวิเคราะห์ลักษณะเฉพาะของโอลิโกแซ็กคาไรด์ในงานวิจัยนี้
หลังจากการเตรียมการเบื้องต้นและการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ โอลิโกแซ็กคาไรด์ที่คงอยู่ยังคงไม่ถูกไฮโดรไลซิส ในภาพ (A) คือวิธีการแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ โดยแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ออกจากไฮโดรไลเสตของซังข้าวโพดที่ผ่านการเตรียมการเบื้องต้นด้วย AFEX (ACSH) โดยใช้ชั้นของถ่านกัมมันต์และดินเบา (B) วิธีการแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ โอลิโกแซ็กคาไรด์ถูกแยกเพิ่มเติมด้วยโครมาโทกราฟีแบบแยกตามขนาด (SEC) (C) โมโนเมอร์และโอลิโกเมอร์ของแซ็กคาไรด์ที่ปลดปล่อยออกมาจากการเตรียมการเบื้องต้นแบบต่างๆ (กรดเจือจาง: DA, ของเหลวไอออนิก: IL และ AFEX) เงื่อนไขการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์: ความเข้มข้นของของแข็งสูงถึง 25% (w/w) (ความเข้มข้นของกลูแคนประมาณ 8%), การไฮโดรไลซิส 96 ชั่วโมง, ความเข้มข้นของเอนไซม์เชิงพาณิชย์ 20 มก./กรัม (อัตราส่วน Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) และ (D) โมโนเมอร์และโอลิโกเมอร์ของน้ำตาลกลูโคส ไซโลส และอะราบิโนสที่ปลดปล่อยออกมาจากซังข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้าด้วย AFEX (ACS)
การวิเคราะห์ไกลแคนได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์โครงสร้างไกลแคนอย่างครอบคลุมในสารสกัดที่แยกได้จากกากชีวมวลแข็ง อย่างไรก็ตาม แซคคาไรด์ที่ละลายน้ำได้นั้นมีปริมาณน้อยเมื่อใช้วิธีการแบบดั้งเดิมนี้41 เนื่องจากโอลิโกแซคคาไรด์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำนั้นยากที่จะตรึงบนแผ่น ELISA และจะถูกชะล้างออกไปก่อนการเติมแอนติบอดี ดังนั้น เพื่อการจับและการจำแนกลักษณะของแอนติบอดี จึงใช้วิธีการไบโอติไนเลชันแบบขั้นตอนเดียวเพื่อเคลือบโอลิโกแซคคาไรด์ที่ละลายน้ำได้และไม่เป็นไปตามข้อกำหนดบนแผ่น ELISA ที่เคลือบด้วยอะวิดิน วิธีนี้ได้รับการทดสอบโดยใช้ ACSH ที่ผลิตขึ้นก่อนหน้านี้ของเราและเศษส่วนตามน้ำหนักโมเลกุล (หรือระดับการพอลิเมอไรเซชัน, DP) การไบโอติไนเลชันแบบขั้นตอนเดียวถูกใช้เพื่อเพิ่มความสัมพันธ์ในการจับโอลิโกแซคคาไรด์โดยการเพิ่มไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์ที่ปลายรีดิวซิงของคาร์โบไฮเดรต (รูปที่ 2) ในสารละลาย หมู่เฮมิอะซีทัลที่ปลายด้านรีดิวซิงจะทำปฏิกิริยากับหมู่ไฮดราไซด์ของไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์เพื่อสร้างพันธะไฮดราโซน ในสภาวะที่มีสารรีดิวซิงเอเจนต์ NaCNBH3 พันธะไฮดราโซนจะถูกรีดิวซ์เป็นผลิตภัณฑ์สุดท้ายที่มีไบโอตินิลเลตอย่างเสถียร ด้วยการดัดแปลงปลายด้านรีดิวซิงของน้ำตาล ทำให้สามารถจับกับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มี DP ต่ำบนแผ่น ELISA ได้ และในการศึกษาของเรานี้ได้ทำบนแผ่นเคลือบอะวิดินโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมายไปที่ไกลแคน
การคัดกรองแอนติบอดีโมโนโคลนอลโดยใช้ ELISA สำหรับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ติดไบโอติน ในภาพ (A) แสดงการรวมการติดไบโอตินของโอลิโกแซ็กคาไรด์และการคัดกรอง ELISA ในภายหลังด้วย mAbs ที่กำหนดเป้าหมายไกลแคนบนแผ่นเคลือบ NeutrAvidin และ (B) แสดงขั้นตอนเดียวสำหรับการติดไบโอตินของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา
จากนั้นจึงเติมแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิลงในเพลทที่เคลือบด้วยอะวิดินซึ่งมีแอนติบอดีที่เชื่อมต่อกับโอลิโกแซ็กคาไรด์ แล้วล้างด้วยตัวกลางที่ไวต่อแสงและเวลา หลังจากที่แอนติบอดีจับกับเพลทเสร็จสมบูรณ์แล้ว ให้เติมสารตั้งต้น TMB เพื่อบ่มเพลท สุดท้ายจึงหยุดปฏิกิริยาด้วยกรดซัลฟิวริก นำเพลทที่บ่มแล้วไปวิเคราะห์โดยใช้เครื่องอ่าน ELISA เพื่อหาความแข็งแรงของการจับของแอนติบอดีแต่ละชนิดเพื่อตรวจจับการเชื่อมโยงแบบจำเพาะของแอนติบอดี สำหรับรายละเอียดและพารามิเตอร์ของการทดลอง โปรดดูส่วนที่เกี่ยวข้อง “วัสดุและวิธีการ”
เราได้สาธิตประโยชน์ของวิธีการที่พัฒนาขึ้นใหม่นี้สำหรับการใช้งานเฉพาะด้าน โดยการระบุลักษณะของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ซึ่งมีอยู่ใน ACSH รวมถึงในส่วนของโอลิโกแซ็กคาไรด์ดิบและบริสุทธิ์ที่แยกได้จากไฮโดรไลเสตของลิกโนเซลลูโลส ดังแสดงในรูปที่ 3 ไซแลนที่มีการแทนที่อีพิโทปที่พบได้บ่อยที่สุดใน ACSH โดยใช้วิธีการวิเคราะห์ไกลโคมแบบไบโออะซิเลต มักจะเป็นอะราบิโนกาแลคแทนชนิดยูโรนิก (U) หรือเมทิลยูโรนิก (MeU) และเพกติก ซึ่งส่วนใหญ่ก็พบในงานวิจัยก่อนหน้านี้ของเราเกี่ยวกับการวิเคราะห์ไกลแคนของของแข็งที่ไม่ผ่านการไฮโดรไลซิส (UHS)43 เช่นกัน
การตรวจจับอีพิโทปของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อต่อการแยกโดยใช้แอนติบอดีโมโนโคลนอลที่มุ่งเป้าไปที่ไกลแคนของผนังเซลล์ ส่วน "เป็นกลาง" คือส่วน ACN และส่วน "เป็นกรด" คือส่วน FA สีแดงที่สว่างกว่าในแผนภูมิความร้อนแสดงถึงปริมาณอีพิโทปที่สูงกว่า และสีน้ำเงินที่สว่างกว่าแสดงถึงพื้นหลังว่างเปล่า ค่าสีบนมาตราส่วนอ้างอิงจากค่า OD ดิบสำหรับสูตร N=2 อีพิโทปหลักที่แอนติบอดีรู้จักแสดงอยู่ทางด้านขวา
โครงสร้างที่ไม่ใช่เซลลูโลสเหล่านี้ไม่สามารถถูกย่อยสลายได้ด้วยเอนไซม์เซลลูเลสและเฮมิเซลลูเลสที่พบได้ทั่วไปในส่วนผสมของเอนไซม์เชิงพาณิชย์ที่ทดสอบ ซึ่งรวมถึงเอนไซม์เชิงพาณิชย์ที่ใช้กันทั่วไป ดังนั้นจึงจำเป็นต้องใช้เอนไซม์เสริมใหม่สำหรับการไฮโดรไลซิส หากปราศจากเอนไซม์เสริมที่ไม่ใช่เซลลูโลสที่จำเป็น พันธะที่ไม่ใช่เซลลูโลสเหล่านี้จะขัดขวางการเปลี่ยนไปเป็นโมโนแซ็กคาไรด์อย่างสมบูรณ์ แม้ว่าพอลิเมอร์น้ำตาลดั้งเดิมจะถูกไฮโดรไลซิสอย่างกว้างขวางเป็นชิ้นส่วนที่สั้นลงและละลายโดยใช้ส่วนผสมของเอนไซม์เชิงพาณิชย์แล้วก็ตาม
จากการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับการกระจายตัวของสัญญาณและความแข็งแรงของการจับตัว พบว่าการจับตัวของอีพิโทปนั้นต่ำกว่าในกลุ่มน้ำตาลที่มี DP สูง (A, B, C, DP สูงถึง 20+) เมื่อเทียบกับกลุ่มที่มี DP ต่ำ (D, E, F, DP ในรูปไดเมอร์) (รูปที่ 1) ชิ้นส่วนที่เป็นกรดพบได้บ่อยกว่าในอีพิโทปที่ไม่ใช่เซลลูโลสเมื่อเทียบกับชิ้นส่วนที่เป็นกลาง ปรากฏการณ์เหล่านี้สอดคล้องกับรูปแบบที่สังเกตได้ในการศึกษาครั้งก่อนของเรา ซึ่งพบว่ากลุ่มที่มี DP สูงและกลุ่มที่เป็นกรดมีความทนทานต่อการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์มากกว่า ดังนั้น การมีอยู่ของอีพิโทปไกลแคนที่ไม่ใช่เซลลูโลสและการแทนที่ด้วย U และ MeU สามารถช่วยเพิ่มความเสถียรของโอลิโกแซ็กคาไรด์ได้อย่างมาก ควรสังเกตว่าประสิทธิภาพในการจับตัวและการตรวจจับอาจเป็นปัญหาสำหรับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มี DP ต่ำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งหากอีพิโทปเป็นโอลิโกแซ็กคาไรด์แบบไดเมอร์หรือไตรเมอร์ สามารถทดสอบได้โดยใช้โอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์ที่มีความยาวต่างกัน โดยแต่ละชนิดจะมีอีพิโทปเพียงหนึ่งเดียวที่จับกับโมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAb) จำเพาะ
ดังนั้น การใช้แอนติบอดีที่มีโครงสร้างจำเพาะจึงเผยให้เห็นพันธะที่ดื้อต่อการสลายตัวบางประเภท ขึ้นอยู่กับชนิดของแอนติบอดีที่ใช้ รูปแบบการเชื่อมต่อที่เหมาะสม และความแรงของสัญญาณที่สร้างขึ้น (มากที่สุดและน้อยที่สุด) สามารถระบุเอนไซม์ใหม่และเพิ่มลงในส่วนผสมของเอนไซม์ในปริมาณกึ่งเชิงปริมาณเพื่อให้การเปลี่ยนไกลแคนสมบูรณ์ยิ่งขึ้น ยกตัวอย่างเช่น การวิเคราะห์โอลิโกแซ็กคาไรด์ ACSH เราสามารถสร้างฐานข้อมูลของพันธะไกลแคนสำหรับวัสดุชีวมวลแต่ละชนิดได้ ควรสังเกตว่าควรคำนึงถึงความสัมพันธ์ที่แตกต่างกันของแอนติบอดี และหากไม่ทราบความสัมพันธ์ของแอนติบอดี จะทำให้เกิดความยากลำบากบางประการเมื่อเปรียบเทียบสัญญาณของแอนติบอดีที่แตกต่างกัน นอกจากนี้ การเปรียบเทียบพันธะไกลแคนอาจได้ผลดีที่สุดระหว่างตัวอย่างสำหรับแอนติบอดีชนิดเดียวกัน จากนั้นพันธะที่ดื้อรั้นเหล่านี้สามารถเชื่อมโยงกับฐานข้อมูล CAZyme ซึ่งเราสามารถระบุเอนไซม์ เลือกเอนไซม์ที่เป็นไปได้ และทดสอบเอนไซม์ที่ทำลายพันธะ หรือพัฒนาระบบจุลินทรีย์เพื่อแสดงเอนไซม์เหล่านี้เพื่อใช้ในโรงกลั่นชีวภาพ44
เพื่อประเมินว่าวิธีการทางภูมิคุ้มกันวิทยาช่วยเสริมวิธีการอื่น ๆ ในการจำแนกลักษณะของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำที่พบในไฮโดรไลเสตของลิกโนเซลลูโลสอย่างไร เราจึงทำการวิเคราะห์ MALDI (รูปที่ 4, S1-S8) และการวิเคราะห์แซ็กคาไรด์ที่ได้จาก TMS โดยใช้ GC-MS บนแผงเดียวกัน (รูปที่ 5) ในส่วนของโอลิโกแซ็กคาไรด์ MALDI ใช้เพื่อเปรียบเทียบว่าการกระจายมวลของโมเลกุลโอลิโกแซ็กคาไรด์ตรงกับโครงสร้างที่ต้องการหรือไม่ รูปที่ 4 แสดง MC ของส่วนประกอบที่เป็นกลาง ACN-A และ ACN-B การวิเคราะห์ ACN-A ยืนยันว่ามีน้ำตาลเพนโทสหลายช่วงตั้งแต่ DP 4–8 (รูปที่ 4) ถึง DP 22 (รูปที่ S1) ซึ่งน้ำหนักสอดคล้องกับโอลิโกแซ็กคาไรด์ MeU-xylan การวิเคราะห์ ACN-B ยืนยันว่ามีเพนโทสและกลูโคไซแลนหลายชุดที่มี DP 8-15 ในเอกสารเสริม เช่น รูปที่ S3 แผนที่การกระจายมวลของหมู่กรด FA-C แสดงให้เห็นช่วงของน้ำตาลเพนโทสที่ถูกแทนที่ด้วย (Me)U ที่มี DP 8-15 ซึ่งสอดคล้องกับไซแลนที่ถูกแทนที่ที่พบในการคัดกรอง mAb โดยใช้ ELISA อีพิโทปมีความสอดคล้องกัน
สเปกตรัม MALDI-MS ของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ไม่เป็นไปตามข้อกำหนดที่ละลายได้ใน ACS โดย (A) ACN-A เศษส่วนช่วงน้ำหนักต่ำที่มีกรดเมทิลยูโรนิก (DP 4-8) แทนที่ด้วยโอลิโกแซ็กคาไรด์กลูคูโรไซแลน และ (B) ACN-B ไซแลนและโอลิโกแซ็กคาไรด์กรดเมทิลยูโรนิกที่แทนที่ด้วยกลูคูโรไซแลน (DP 8-15)
การวิเคราะห์องค์ประกอบของสารตกค้างไกลแคนของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ทนต่อการย่อยสลาย ในภาพนี้ (A) องค์ประกอบของแซ็กคาไรด์ TMS ของเศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่างๆ ที่ได้จากการวิเคราะห์ด้วย GC-MS (B) โครงสร้างของน้ำตาลที่ได้จาก TMS ต่างๆ ที่มีอยู่ในโอลิโกแซ็กคาไรด์ ACN – เศษส่วนอะซีโตไนไตรล์ที่มีโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่เป็นกลาง และ FA – เศษส่วนกรดเฟรูลิกที่มีโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่เป็นกรด
ข้อสรุปที่น่าสนใจอีกประการหนึ่งได้มาจากการวิเคราะห์ LC-MS ของส่วนประกอบโอลิโกแซ็กคาไรด์ ดังแสดงในรูปที่ S9 (วิธีการสามารถดูได้ในเอกสารเสริมอิเล็กทรอนิกส์) พบชิ้นส่วนของเฮกโซสและกลุ่ม -OAc ซ้ำๆ ในระหว่างการเชื่อมต่อส่วนประกอบ ACN-B การค้นพบนี้ไม่เพียงแต่ยืนยันการแตกตัวที่สังเกตได้ในการวิเคราะห์ไกลโคมและ MALDI-TOF เท่านั้น แต่ยังให้ข้อมูลใหม่เกี่ยวกับอนุพันธ์คาร์โบไฮเดรตที่มีศักยภาพในชีวมวลลิกโนเซลลูโลสที่ผ่านการปรับสภาพแล้วอีกด้วย
นอกจากนี้ เรายังวิเคราะห์องค์ประกอบของน้ำตาลในส่วนของโอลิโกแซ็กคาไรด์โดยใช้การดัดแปลงน้ำตาลด้วย TMS โดยใช้ GC-MS เราได้กำหนดองค์ประกอบของน้ำตาลที่เป็นกลาง (ไม่ผ่านการดัดแปลง) และน้ำตาลที่เป็นกรด (GluA และ GalA) ในส่วนของโอลิโกแซ็กคาไรด์ (รูปที่ 5) พบกรดกลูคูโรนิกในส่วนประกอบที่เป็นกรด C และ D ในขณะที่พบกรดกาแลคทูโรนิกในส่วนประกอบที่เป็นกรด A และ B ซึ่งทั้งสองเป็นส่วนประกอบที่มี DP สูงของน้ำตาลที่เป็นกรด ผลลัพธ์เหล่านี้ไม่เพียงแต่ยืนยันข้อมูล ELISA และ MALDI ของเราเท่านั้น แต่ยังสอดคล้องกับการศึกษาการสะสมของโอลิโกแซ็กคาไรด์ก่อนหน้านี้ของเราด้วย ดังนั้น เราเชื่อว่าวิธีการทางภูมิคุ้มกันวิทยาที่ทันสมัยโดยใช้การไบโอติไนเลชันของโอลิโกแซ็กคาไรด์และการคัดกรอง ELISA ในภายหลังนั้นเพียงพอที่จะตรวจจับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายได้และทนต่อการย่อยสลายในตัวอย่างทางชีวภาพต่างๆ
เนื่องจากวิธีการคัดกรอง mAb ที่ใช้ ELISA ได้รับการตรวจสอบความถูกต้องโดยวิธีการต่างๆ หลายวิธีแล้ว เราจึงต้องการสำรวจศักยภาพของวิธีการเชิงปริมาณแบบใหม่นี้เพิ่มเติม เราได้ซื้อโอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์สองชนิด ได้แก่ ไซโลเฮกซาแซ็กคาไรด์โอลิโกแซ็กคาไรด์ (XHE) และ 23-α-L-อะราบิโนฟูราโนซิล-ไซโลไตรโอส (A2XX) มาทดสอบโดยใช้แนวทาง mAb แบบใหม่ที่กำหนดเป้าหมายไปที่ไกลแคนของผนังเซลล์ รูปที่ 6 แสดงความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างสัญญาณการจับของไบโอติไนเลตกับลอการิทึมของความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์ ซึ่งชี้ให้เห็นถึงแบบจำลองการดูดซับแบบ Langmuir ที่เป็นไปได้ ในบรรดาโมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAb) นั้น CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 และ CCRC-M151 มีความสัมพันธ์กับ XHE ในขณะที่ CCRC-M108, CCRC-M109 และ LM11 มีความสัมพันธ์กับ A2XX ในช่วงขนาด 1 นาโนเมตรถึง 100 นาโนเมตร เนื่องจากมีแอนติบอดีจำกัดในระหว่างการทดลอง จึงทำการทดลองกับความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์แต่ละระดับได้ในจำนวนจำกัด ควรสังเกตว่าแอนติบอดีบางชนิดทำปฏิกิริยากับโอลิโกแซ็กคาไรด์ชนิดเดียวกันแตกต่างกันมาก สันนิษฐานว่าเนื่องจากแอนติบอดีเหล่านั้นจับกับอีพิโทปที่แตกต่างกันเล็กน้อยและมีค่าความสัมพันธ์ในการจับที่แตกต่างกันมาก กลไกและผลกระทบของการระบุอีพิโทปอย่างแม่นยำจะมีความซับซ้อนมากขึ้นเมื่อนำวิธีการใช้ mAb แบบใหม่ไปใช้กับตัวอย่างจริง
มีการใช้โอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์สองชนิดเพื่อกำหนดช่วงการตรวจจับของโมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAb) ที่กำหนดเป้าหมายไกลแคนต่างๆ ในที่นี้ ความสัมพันธ์เชิงเส้นกับลอการิทึมของความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์บ่งชี้ถึงรูปแบบการดูดซับแบบแลงมัวร์สำหรับ (A) XHE กับ mAb และ (B) A2XX กับ mAb อีพิโทปที่สอดคล้องกันบ่งชี้ถึงโครงสร้างของโอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์ที่ใช้เป็นสารตั้งต้นในการทดสอบ
การใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมายไปที่ไกลแคน (การวิเคราะห์ไกลโคมีกส์หรือการคัดกรอง mAb แบบ ELISA) เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการจำแนกลักษณะเชิงลึกของไกลแคนผนังเซลล์หลักส่วนใหญ่ที่ประกอบขึ้นเป็นชีวมวลของพืช อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ไกลแคนแบบดั้งเดิมจะจำแนกลักษณะเฉพาะของไกลแคนผนังเซลล์ขนาดใหญ่เท่านั้น เนื่องจากโอลิโกแซ็กคาไรด์ส่วนใหญ่ไม่สามารถตรึงบนแผ่น ELISA ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในการศึกษาครั้งนี้ ซังข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดด้วย AFEX ถูกไฮโดรไลซ์ด้วยเอนไซม์ที่ความเข้มข้นของของแข็งสูง การวิเคราะห์น้ำตาลถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดองค์ประกอบของคาร์โบไฮเดรตผนังเซลล์ที่ทนทานในสารไฮโดรไลเซต อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ mAb ของโอลิโกแซ็กคาไรด์ขนาดเล็กในสารไฮโดรไลเซตนั้นถูกประเมินค่าต่ำเกินไป และจำเป็นต้องมีเครื่องมือเพิ่มเติมเพื่อตรึงโอลิโกแซ็กคาไรด์บนแผ่น ELISA อย่างมีประสิทธิภาพ
ในรายงานนี้ เราได้นำเสนอวิธีการตรึงโอลิโกแซ็กคาไรด์แบบใหม่และมีประสิทธิภาพสำหรับการคัดกรองโมโนโคลนอลแอนติบอดี โดยการรวมการไบโอติไนเลชันของโอลิโกแซ็กคาไรด์ตามด้วยการคัดกรอง ELISA บนแผ่นเคลือบ NeutrAvidin™ โอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ตรึงด้วยไบโอติไนเลชันแสดงความสัมพันธ์กับแอนติบอดีได้ดีพอที่จะตรวจจับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อด้านได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ การวิเคราะห์องค์ประกอบของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อด้านเหล่านี้โดยใช้แมสสเปกโทรเมตรีได้ยืนยันผลลัพธ์ของวิธีการคัดกรองภูมิคุ้มกันแบบใหม่นี้ ดังนั้น การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการรวมกันของการไบโอติไนเลชันของโอลิโกแซ็กคาไรด์และการคัดกรอง ELISA ด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมายไปที่ไกลแคนสามารถใช้ตรวจจับการเชื่อมโยงข้ามในโอลิโกแซ็กคาไรด์ได้ และสามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้อย่างกว้างขวางในการศึกษาทางชีวเคมีอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับลักษณะโครงสร้างของโอลิโกแซ็กคาไรด์
วิธีการวิเคราะห์โครงสร้างไกลแคนโดยใช้ไบโอตินนี้เป็นรายงานฉบับแรกที่สามารถตรวจสอบพันธะคาร์โบไฮเดรตที่ดื้อด้านของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ในชีวมวลพืช ซึ่งช่วยให้เข้าใจว่าเหตุใดชีวมวลบางส่วนจึงดื้อด้านเมื่อนำไปผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพ วิธีนี้เติมเต็มช่องว่างที่สำคัญในวิธีการวิเคราะห์ไกลโคม และขยายการประยุกต์ใช้ไปยังสารตั้งต้นที่หลากหลายมากขึ้นนอกเหนือจากโอลิโกแซ็กคาไรด์ของพืช ในอนาคต เราอาจใช้หุ่นยนต์ในการไบโอติไนเลชัน และใช้วิธีการที่เราพัฒนาขึ้นสำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างจำนวนมากโดยใช้ ELISA
ฟางข้าวโพด (CS) ที่ปลูกจากเมล็ดพันธุ์ลูกผสม Pioneer 33A14 ถูกเก็บเกี่ยวในปี 2010 จากฟาร์ม Kramer ในเมือง Ray รัฐโคโลราโด โดยได้รับอนุญาตจากเจ้าของที่ดินแล้ว สามารถนำชีวมวลนี้ไปใช้ในการวิจัยได้ ตัวอย่างถูกเก็บรักษาในสภาพแห้ง โดยมีความชื้นน้อยกว่า 6% ในถุงซิปล็อกที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างถูกเก็บรักษาในสภาพแห้ง โดยมีความชื้นน้อยกว่า 6% ในถุงซิปล็อกที่อุณหภูมิห้อง Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. ตัวอย่างถูกเก็บรักษาในที่แห้ง โดยมีความชื้นต่ำกว่า 6% ในถุงซิปล็อกที่อุณหภูมิห้อง样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. ตัวอย่างจะถูกเก็บไว้ในถุงซิปที่อุณหภูมิห้องและความชื้นต่ำกว่า 6%การศึกษาครั้งนี้เป็นไปตามแนวทางปฏิบัติระดับท้องถิ่นและระดับชาติ การวิเคราะห์องค์ประกอบดำเนินการโดยใช้โปรโตคอลของ NREL พบว่าองค์ประกอบประกอบด้วยกลูแคน 31.4%, ไซแลน 18.7%, อาราบินาน 3.3%, กาแลคแทน 1.2%, อะเซทิล 2.2%, ลิกนิน 14.3%, โปรตีน 1.7% และเถ้า 13.4%
Cellic® CTec2 (138 มก. โปรตีน/มล. ล็อต VCNI 0001) เป็นส่วนผสมที่ซับซ้อนของเซลลูเลส, β-กลูโคซิเดส และ Cellic® HTec2 (157 มก. โปรตีน/มล. ล็อต VHN00001) จาก Novozymes (แฟรงคลินตัน, นอร์ทแคโรไลนา, สหรัฐอเมริกา) Multifect Pectinase® (72 มก. โปรตีน/มล.) ซึ่งเป็นส่วนผสมที่ซับซ้อนของเอนไซม์ย่อยสลายเพคติน ได้รับบริจาคจาก DuPont Industrial Biosciences (พาโลอัลโต, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ความเข้มข้นของโปรตีนในเอนไซม์ถูกกำหนดโดยการประมาณปริมาณโปรตีน (และหักส่วนของไนโตรเจนที่ไม่ใช่โปรตีนออก) โดยใช้การวิเคราะห์ไนโตรเจนแบบ Kjeldahl (วิธี AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., อิธากา, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) ดินเบา 545 ซื้อจาก EMD Millipore (บิลเลอริกา, แมสซาชูเซตส์) ถ่านกัมมันต์ (DARCO, เม็ดขนาด 100 เมช), Avicel (PH-101), ไซแลนจากไม้บีช และสารเคมีอื่นๆ ทั้งหมด ซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์ รัฐมิสซูรี)
การปรับสภาพเบื้องต้นด้วยวิธี AFEX ดำเนินการที่ GLBRC (ห้องปฏิบัติการวิจัยการแปลงชีวมวล มหาวิทยาลัยรัฐมิชิแกน แลนซิง รัฐมิชิแกน สหรัฐอเมริกา) การปรับสภาพเบื้องต้นดำเนินการที่อุณหภูมิ 140°C เป็นเวลา 15 นาที โดยมีอัตราส่วนแอมโมเนียปราศจากน้ำต่อชีวมวล 1:1 ที่ความเข้มข้น 60% (w/w) ในเครื่องปฏิกรณ์แบบตั้งโต๊ะสแตนเลส (บริษัท Parr Instruments) ใช้เวลา 30 นาที จากนั้นจึงเพิ่มอุณหภูมิเครื่องปฏิกรณ์เป็น 140°C และปล่อยแอมโมเนียออกมาอย่างรวดเร็ว ทำให้ชีวมวลกลับสู่อุณหภูมิห้องได้อย่างรวดเร็ว องค์ประกอบของซังข้าวโพดที่ผ่านการปรับสภาพเบื้องต้นด้วยวิธี AFEX (ACS) คล้ายคลึงกับซังข้าวโพดที่ไม่ผ่านการปรับสภาพ (UT-CS)
เตรียม ACSH ที่มีปริมาณของแข็งสูง 25% (w/w) (ปริมาณเดกซ์แทรนประมาณ 8%) เป็นวัตถุดิบตั้งต้นสำหรับการผลิตโอลิโกแซ็กคาไรด์ในปริมาณมาก ทำการไฮโดรไลซิส ACS ด้วยเอนไซม์ผสมเชิงพาณิชย์ ซึ่งประกอบด้วย Cellic® Ctec2 10 มก. โปรตีน/กรัมกลูแคน (ในชีวมวลที่ผ่านการปรับสภาพแล้ว), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC) 5 มก. โปรตีน/กรัมกลูแคน และ Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) 5 มก. โปรตีน/กรัมเดกซ์แทรน ทำการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ในไบโอรีแอคเตอร์ขนาด 5 ลิตร โดยมีปริมาตรใช้งาน 3 ลิตร, pH 4.8, อุณหภูมิ 50°C และความเร็วรอบ 250 รอบต่อนาที หลังจากไฮโดรไลซิสเป็นเวลา 96 ชั่วโมง ได้ทำการแยกสารไฮโดรไลเซตโดยการปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 6000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 30 นาที แล้วปั่นเหวี่ยงต่อที่ความเร็ว 14000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 30 นาที เพื่อกำจัดของแข็งที่ไม่ผ่านการไฮโดรไลซิส จากนั้นจึงนำสารไฮโดรไลเซตไปกรองด้วยตัวกรองแบบปลอดเชื้อขนาด 0.22 มิลลิเมตร เก็บสารไฮโดรไลเซตที่กรองแล้วในขวดปลอดเชื้อที่อุณหภูมิ 4°C แล้วจึงทำการแยกส่วนประกอบโดยใช้ถ่านกัมมันต์
การวิเคราะห์องค์ประกอบของตัวอย่างชีวมวลที่สกัดตามขั้นตอนการวิเคราะห์ของห้องปฏิบัติการ NREL: การเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์องค์ประกอบ (NREL/TP-510-42620) และการหาปริมาณคาร์โบไฮเดรตเชิงโครงสร้างและลิกนินในชีวมวล (NREL/TP-510 – 42618)47
การวิเคราะห์โอลิโกแซ็กคาไรด์ในกระแสไฮโดรไลเซตดำเนินการในปริมาณ 2 มิลลิลิตร โดยใช้วิธีการไฮโดรไลซิสด้วยกรดโดยใช้เครื่องออโตเคลฟ ผสมตัวอย่างไฮโดรไลเซตกับกรดซัลฟิวริก 72% ปริมาณ 69.7 ไมโครลิตร ในหลอดเพาะเลี้ยงขนาด 10 มิลลิลิตรที่มีฝาปิดแบบเกลียว และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงบนโต๊ะที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส จากนั้นทำให้เย็นลงด้วยน้ำแข็งและกรองลงในหลอดสำหรับโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) ความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์ถูกกำหนดโดยการลบความเข้มข้นของโมโนแซ็กคาไรด์ในตัวอย่างที่ไม่ผ่านการไฮโดรไลซิสออกจากความเข้มข้นของน้ำตาลทั้งหมดในตัวอย่างที่ผ่านการไฮโดรไลซิสด้วยกรด
วิเคราะห์ความเข้มข้นของกลูโคส ไซโลส และอะราบิโนสในชีวมวลที่ผ่านการไฮโดรไลซิสด้วยกรดโดยใช้ระบบ HPLC ของ Shimadzu ที่ติดตั้งเครื่องป้อนตัวอย่างอัตโนมัติ เครื่องทำความร้อนคอลัมน์ ปั๊มแบบไอโซแครติก และเครื่องตรวจจับดัชนีการหักเหของแสง บนคอลัมน์ Bio-Rad Aminex HPX-87H รักษาอุณหภูมิของคอลัมน์ไว้ที่ 50°C และชะล้างด้วยสารละลาย 5 mM H2SO4 ในน้ำที่อัตราการไหล 0.6 มล./นาที
สารละลายไฮโดรไลเซตส่วนบนถูกเจือจางและวิเคราะห์หาปริมาณโมโนเมอร์และโอลิโกแซ็กคาไรด์ น้ำตาลโมโนเมอร์ที่ได้หลังจากการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ถูกวิเคราะห์โดย HPLC ที่ติดตั้งคอลัมน์ Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P และคอลัมน์ป้องกันเถ้า อุณหภูมิของคอลัมน์ถูกควบคุมไว้ที่ 80°C ใช้น้ำเป็นเฟสเคลื่อนที่ด้วยอัตราการไหล 0.6 มล./นาที โอลิโกแซ็กคาไรด์ถูกกำหนดโดยการไฮโดรไลซิสในกรดเจือจางที่ 121°C ตามวิธีการที่อธิบายไว้ในเอกสารอ้างอิง 41, 48, 49
การวิเคราะห์แซคคาไรด์ดำเนินการกับชีวมวลดิบ ชีวมวลที่ผ่านการบำบัดด้วย AFEX และชีวมวลที่ไม่ผ่านการไฮโดรไลซิสทั้งหมด (รวมถึงการผลิตสารสกัดผนังเซลล์แบบอนุกรมและการคัดกรอง mAb) โดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 27, 43, 50, 51 สำหรับการวิเคราะห์ไกลโคม กากของวัสดุผนังเซลล์พืชที่ไม่ละลายในแอลกอฮอล์จะถูกเตรียมจากชีวมวลและนำไปสกัดแบบอนุกรมด้วยรีเอเจนต์ที่มีความรุนแรงเพิ่มขึ้น เช่น แอมโมเนียมออกซาเลต (50 mM) โซเดียมคาร์บอเนต (50 mM และ 0.5% w/v) CON (1M และ 4M ทั้งสองชนิดมีโซเดียมโบโรไฮไดรด์ 1% w/v) และกรดคลอไรต์ ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้52,53 จากนั้นสารสกัดจะถูกนำไปทำ ELISA กับแผง mAb50 ที่ซับซ้อนซึ่งมุ่งเป้าไปที่ไกลแคนของผนังเซลล์ และปฏิกิริยาการจับของ mAb จะแสดงเป็นแผนที่ความร้อน โมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAbs) ที่กำหนดเป้าหมายไกลแคนของผนังเซลล์พืช ได้รับการจัดซื้อจากคลังของห้องปฏิบัติการ (ซีรี่ส์ CCRC, JIM และ MAC)
การไบโอติไนเลชันแบบขั้นตอนเดียวของโอลิโกแซ็กคาไรด์ การเชื่อมต่อคาร์โบไฮเดรตกับไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์ ดำเนินการโดยใช้ขั้นตอนต่อไปนี้ ไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์ (4.6 มก./12 ไมโครโมล) ถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO, 70 ไมโครลิตร) โดยการคนอย่างแรงและให้ความร้อนที่ 65°C เป็นเวลา 1 นาที เติมกรดอะซิติกเข้มข้น (30 ไมโครลิตร) และเทส่วนผสมลงบนโซเดียมไซยาโนโบโรไฮไดรด์ (6.4 มก./100 ไมโครโมล) และละลายให้หมดหลังจากให้ความร้อนที่ 65°C ประมาณ 1 นาที จากนั้น เติมส่วนผสมของปฏิกิริยา 5 ถึง 8 ไมโครลิตรลงในโอลิโกแซ็กคาไรด์แห้ง (1-100 นาโนโมล) เพื่อให้ได้ปริมาณโมลของฉลากที่มากกว่าปลายรีดิวซิง 10 เท่าขึ้นไป ปฏิกิริยาเกิดขึ้นที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากนั้นตัวอย่างจะถูกทำให้บริสุทธิ์ทันที ไม่มีการใช้โซเดียมไซยาโนโบโรไฮไดรด์ในการทดลองติดฉลากโดยไม่ใช้การรีดิวซ์ และตัวอย่างจะทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 2.5 ชั่วโมง
การเคลือบและการล้างตัวอย่างโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ติดไบโอตินสำหรับ ELISA เติมตัวอย่างที่ติดไบโอติน 25 ไมโครลิตร (ตัวอย่างเข้มข้นแต่ละตัวอย่าง 100 ไมโครลิตร เจือจางในสารละลายบัฟเฟอร์ Tris 0.1 M (TBS) 5 มิลลิลิตร) ลงในแต่ละหลุมของเพลทที่เคลือบด้วยอะวิดิน หลุมควบคุมเคลือบด้วยไบโอติน 50 ไมโครลิตร ที่ความเข้มข้น 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ใน TBS 0.1 M ใช้น้ำปราศจากไอออนในการเคลือบสำหรับการวัดค่าว่าง บ่มเพลทเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืด ล้างเพลท 3 ครั้งด้วยนมพร่องมันเนย 0.1% ใน TBS 0.1 M โดยใช้โปรแกรมหมายเลข 11 สำหรับแผ่น Grenier 3A
การเติมและการล้างแอนติบอดีหลัก เติมแอนติบอดีหลัก 40 µl ลงในแต่ละหลุม บ่มไมโครเพลทเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืด จากนั้นล้างเพลท 3 ครั้งด้วยนม 0.1% ใน TBS 0.1M โดยใช้โปรแกรมล้างหมายเลข 11 สำหรับ Grenier Flat 3A
เติมแอนติบอดีรองและล้าง เติมแอนติบอดีรองจากหนู/หนูแรท (เจือจาง 1:5000 ในนม 0.1% ใน TBS 0.1 M) จำนวน 50 µl ลงในแต่ละหลุม บ่มไมโครเพลทเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืด จากนั้นล้างไมโครเพลท 5 ครั้งด้วยนม 0.1% ใน TBS 0.1 M โดยใช้โปรแกรมล้างเพลท Grenier Flat 5A หมายเลข 12
การเติมสารตั้งต้น เติม 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) 50 µl ลงในสารตั้งต้นพื้นฐาน (โดยการเติมบัฟเฟอร์ 2 หยด, TMB 3 หยด, ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 2 หยด ลงในน้ำปราศจากไอออน 15 ml) เตรียมสารตั้งต้น TMB และเขย่าให้เข้ากันก่อนใช้งาน บ่มไมโครเพลทที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที ในที่มืด
ทำตามขั้นตอนให้เสร็จสมบูรณ์และอ่านฉลาก เติมกรดซัลฟิวริก 1 N ปริมาณ 50 µl ลงในแต่ละหลุม และบันทึกค่าการดูดกลืนแสงในช่วง 450 ถึง 655 nm โดยใช้เครื่องอ่าน ELISA
เตรียมสารละลายความเข้มข้น 1 มก./มล. ของสารวิเคราะห์เหล่านี้ในน้ำปราศจากไอออน: อาราบิโนส, แรมโนส, ฟูโคส, ไซโลส, กรดกาแลคทูโรนิก (GalA), กรดกลูคูโรนิก (GlcA), แมนโนส, กลูโคส, กาแลคโตส, แลคโตส, เอ็น-อะเซทิลแมนโนซามีน (manNAc), เอ็น-อะเซทิลกลูโคซามีน (glcNAc), เอ็น-อะเซทิลกาแลคโตซามีน (galNAc), อิโนซิทอล (สารมาตรฐานภายใน) เตรียมสารมาตรฐานสองชนิดโดยการเติมสารละลายน้ำตาลความเข้มข้น 1 มก./มล. ตามที่แสดงในตารางที่ 1 นำตัวอย่างไปแช่แข็งและทำให้แห้งด้วยวิธีแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80°C จนกว่าน้ำจะระเหยออกไปหมด (โดยปกติประมาณ 12-18 ชั่วโมง)
เติมตัวอย่าง 100–500 ไมโครกรัมลงในหลอดทดลองแบบมีฝาปิดเกลียวบนเครื่องชั่งวิเคราะห์ บันทึกปริมาณที่เติมลงไป ควรละลายตัวอย่างในตัวทำละลายที่มีความเข้มข้นที่กำหนด แล้วเติมลงในหลอดทดลองทีละส่วน ใช้สารละลายอิโนซิทอล 1 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร ปริมาณ 20 ไมโครลิตร เป็นสารมาตรฐานภายในสำหรับแต่ละหลอดตัวอย่าง ปริมาณสารมาตรฐานภายในที่เติมลงในตัวอย่างต้องเท่ากับปริมาณสารมาตรฐานภายในที่เติมลงในหลอดมาตรฐาน
เติมเมทานอลปราศจากน้ำ 8 มิลลิลิตรลงในขวดฝาเกลียว จากนั้นเติมสารละลายไฮโดรคลอไรด์ในเมทานอลเข้มข้น 3 N จำนวน 4 มิลลิลิตร ปิดฝาและเขย่า กระบวนการนี้ไม่ใช้น้ำ
เติมสารละลายเมทานอล HCl 1 M ปริมาณ 500 µl ลงในตัวอย่างโอลิโกแซ็กคาไรด์และหลอด TMS มาตรฐาน บ่มตัวอย่างข้ามคืน (168 ชั่วโมง) ที่อุณหภูมิ 80°C ในเครื่องควบคุมอุณหภูมิ ทำให้ผลิตภัณฑ์เมทานอลไลซิสแห้งที่อุณหภูมิห้องโดยใช้เครื่องอบแห้ง เติม MeOH 200 µl แล้วทำให้แห้งอีกครั้ง ทำซ้ำกระบวนการนี้สองครั้ง เติมเมทานอล 200 µl, ไพริดีน 100 µl และอะซิติกแอนไฮไดรด์ 100 µl ลงในตัวอย่างแล้วผสมให้เข้ากัน บ่มตัวอย่างที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที แล้วทำให้แห้ง เติมเมทานอล 200 µl แล้วทำให้แห้งอีกครั้ง
เติม Tri-Sil 200 µl ลงในหลอดทดลองที่ปิดฝาแล้ว และให้ความร้อนเป็นเวลา 20 นาที ที่อุณหภูมิ 80°C จากนั้นปล่อยให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้อง ใช้เครื่องอบแห้งเพื่อทำให้ตัวอย่างแห้งต่อไปจนเหลือปริมาตรประมาณ 50 µl สิ่งสำคัญที่ควรทราบคือ เราไม่ได้ปล่อยให้ตัวอย่างแห้งสนิท
เติมเฮกเซน 2 มิลลิลิตร แล้วผสมให้เข้ากันโดยใช้เครื่องปั่นเหวี่ยง เติมใยแก้วลงในปลายปิเปตต์ปาสเตอร์ (5-8 มิลลิเมตร) โดยเสียบใยแก้วไว้ด้านบนของปิเปตต์ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 5-3/4 นิ้ว นำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยงที่ 3000 g เป็นเวลา 2 นาที กากที่ไม่ละลายจะตกตะกอน ทำให้ตัวอย่างแห้งจนเหลือปริมาตร 100-150 ไมโครลิตร ฉีดตัวอย่างปริมาตรประมาณ 1 ไมโครลิตร เข้าสู่เครื่อง GC-MS ที่อุณหภูมิเริ่มต้น 80 °C และเวลาเริ่มต้น 2.0 นาที (ตารางที่ 2)