ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
วิธีการใหม่ทางภูมิคุ้มกันวิทยาและแมสสเปกโตรเมตริกสำหรับการวิเคราะห์ที่ซับซ้อนของโอลิโกแซ็กคาไรด์ถาวรในเตาข้าวโพดที่ปรับสภาพด้วย AFEXชีวมวลลิกโนเซลลูโลสเป็นทางเลือกที่ยั่งยืนสำหรับเชื้อเพลิงฟอสซิล และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพสำหรับการผลิตผลิตภัณฑ์ต่างๆ เช่น อาหาร อาหารสัตว์ เชื้อเพลิง และสารเคมีกุญแจสำคัญของเทคโนโลยีเหล่านี้คือการพัฒนากระบวนการที่คุ้มค่าสำหรับการเปลี่ยนคาร์โบไฮเดรตเชิงซ้อนที่มีอยู่ในผนังเซลล์ของพืชให้เป็นน้ำตาลเชิงเดี่ยว เช่น กลูโคส ไซโลส และอะราบิโนสเนื่องจากชีวมวลลิกโนเซลลูโลสนั้นดื้อมาก จึงต้องผ่านการบำบัดด้วยความร้อน (เช่น การขัดผิวด้วยแอมโมเนีย (AFEX) กรดเจือจาง (DA) ของเหลวไอออนิก (IL)) และการบำบัดทางชีวภาพ (เช่น การย่อยสลายด้วยเอนไซม์และการหมักด้วยจุลินทรีย์) ร่วมกันเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ.อย่างไรก็ตาม เมื่อใช้เอนไซม์จากเชื้อราในเชิงพาณิชย์ในกระบวนการไฮโดรไลซิส จะมีน้ำตาลที่ละลายน้ำได้เพียง 75-85% เท่านั้นที่เป็นโมโนแซ็กคาไรด์ และอีก 15-25% ที่เหลือเป็นโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ยาก ซึ่งจุลินทรีย์ไม่สามารถหาได้เสมอไปก่อนหน้านี้ เราประสบความสำเร็จในการแยกและทำให้บริสุทธิ์โอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อรั้นที่ละลายน้ำได้โดยใช้การผสมผสานระหว่างการแยกคาร์บอนและดินเบาและโครมาโตกราฟีการแยกตามขนาด และยังตรวจสอบคุณสมบัติการยับยั้งเอนไซม์ของพวกมันด้วยเราพบว่าโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีการแทนที่กรดยูริกเมทิลเลตในระดับที่สูงขึ้น (DP) นั้นยากต่อการประมวลผลด้วยเอนไซม์ผสมเชิงพาณิชย์มากกว่า DP ต่ำและโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่เป็นกลางที่นี่เรารายงานการใช้วิธีการเพิ่มเติมหลายวิธี รวมถึงการทำโปรไฟล์ไกลแคนโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAbs) ที่จำเพาะต่อไกลแคนชีวมวลของพืชเพื่อกำหนดลักษณะของพันธะไกลแคนในผนังเซลล์พืชและเอนไซม์ไฮโดรไลเสต ไอออนไนซ์ด้วยเลเซอร์ช่วยเมทริกซ์.MALDI-TOF-MS) ใช้พีคการวินิจฉัยที่ให้ข้อมูลเชิงโครงสร้างที่ได้รับจากสเปกโทรสโกปีหลังการสลายตัวของไอออนลบ, แก๊สโครมาโตกราฟี และแมสสเปกโตรเมทรี (GC-MS) เพื่อระบุลักษณะของพันธะโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีและไม่มีอนุพันธ์เนื่องจากโอลิโกแซ็กคาไรด์มีขนาดเล็ก (DP 4–20) โมเลกุลเหล่านี้จึงยากต่อการนำไปใช้จับ mAb และแสดงลักษณะเฉพาะเพื่อแก้ปัญหานี้ เราได้ใช้วิธีการตรึงโอลิโกแซ็กคาไรด์โดยใช้ไบโอตินคอนจูเกตแบบใหม่ ซึ่งประสบความสำเร็จในการติดฉลากโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ DP ต่ำส่วนใหญ่บนพื้นผิวไมโครเพลท ซึ่งจากนั้นจึงนำไปใช้ในระบบ mAb ปริมาณงานสูงสำหรับการวิเคราะห์ลิเกชันเฉพาะวิธีการใหม่นี้จะช่วยอำนวยความสะดวกในการพัฒนาชุดตรวจไกลโคมปริมาณงานสูงขั้นสูงในอนาคต ซึ่งสามารถใช้แยกและระบุลักษณะของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีอยู่ในไบโอมาร์คเกอร์เพื่อวัตถุประสงค์ในการวินิจฉัย
มวลชีวภาพประเภทลิกโนเซลลูโลสประกอบด้วยวัสดุทางการเกษตร ป่าไม้ หญ้า และไม้ เป็นวัตถุดิบที่มีศักยภาพสำหรับการผลิตผลิตภัณฑ์ชีวภาพ ซึ่งรวมถึงอาหาร อาหารสัตว์ เชื้อเพลิง และสารเคมีตั้งต้นเพื่อผลิตผลิตภัณฑ์ที่มีมูลค่าสูงขึ้น1คาร์โบไฮเดรต (เช่น เซลลูโลสและเฮมิเซลลูโลส) ที่มีอยู่ในผนังเซลล์ของพืชจะถูกแยกพอลิเมอร์เป็นโมโนแซ็กคาไรด์โดยกระบวนการทางเคมีและการเปลี่ยนรูปทางชีวภาพ (เช่น การย่อยด้วยเอนไซม์และการหมักด้วยจุลินทรีย์)การบำบัดเบื้องต้นทั่วไป ได้แก่ การขยายเส้นใยแอมโมเนีย (AFEX) กรดเจือจาง (DA) ของเหลวไอออนิก (IL) และการระเบิดด้วยไอน้ำ (SE) ซึ่งใช้สารเคมีและความร้อนร่วมกันเพื่อลดการผลิตลิกโนเซลลูโลสโดยการเปิดผนังเซลล์ของพืช3,4ความดื้อรั้นของสสาร 5. การไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ดำเนินการที่ปริมาณของแข็งสูงโดยใช้เอนไซม์ที่ประกอบด้วยคาร์โบไฮเดรตที่ใช้งานเชิงพาณิชย์ (CAZymes) และการหมักจุลินทรีย์โดยใช้ยีสต์หรือแบคทีเรียดัดแปรพันธุกรรมเพื่อผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพและสารเคมี 6
CAZymes ในเอนไซม์เชิงพาณิชย์ประกอบด้วยส่วนผสมที่ซับซ้อนของเอนไซม์ที่ประสานพันธะคาร์โบไฮเดรต-น้ำตาลที่ซับซ้อนเข้าด้วยกันเพื่อสร้างโมโนแซ็กคาไรด์2,7ดังที่เราได้รายงานไปก่อนหน้านี้ โครงข่ายที่ซับซ้อนของอะโรมาติกโพลิเมอร์ของลิกนินกับคาร์โบไฮเดรตทำให้พวกมันยากที่จะควบคุม ซึ่งนำไปสู่การเปลี่ยนน้ำตาลที่ไม่สมบูรณ์ โดยสะสม 15-25% ของโอลิโกแซ็กคาไรด์เพศที่ไม่ได้ผลิตระหว่างการย่อยด้วยเอนไซม์ของมวลชีวภาพที่ผ่านการบำบัดแล้วนี่เป็นปัญหาทั่วไปในการปรับสภาพมวลชีวภาพด้วยวิธีต่างๆเหตุผลบางประการสำหรับปัญหาคอขวดนี้ ได้แก่ การยับยั้งเอนไซม์ระหว่างการไฮโดรไลซิส หรือการขาดหรือระดับเอนไซม์ที่จำเป็นที่จำเป็นต่อการทำลายพันธะน้ำตาลในมวลชีวภาพของพืชการทำความเข้าใจเกี่ยวกับองค์ประกอบและลักษณะโครงสร้างของน้ำตาล เช่น พันธะน้ำตาลในโอลิโกแซ็กคาไรด์ จะช่วยปรับปรุงการเปลี่ยนน้ำตาลในระหว่างการไฮโดรไลซิส ทำให้กระบวนการทางเทคโนโลยีชีวภาพสามารถแข่งขันด้านต้นทุนกับผลิตภัณฑ์ที่ได้จากปิโตรเลียมได้
การกำหนดโครงสร้างของคาร์โบไฮเดรตเป็นสิ่งที่ท้าทายและต้องใช้วิธีการต่างๆ ร่วมกัน เช่น โครมาโตกราฟีของเหลว (LC)11,12, นิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์สเปกโทรสโกปี (NMR)13, คาพิลลารีอิเล็กโตรโฟรีซิส (CE)14,15,16 และแมสสเปกโทรเมตรี (MS)17,สิบแปดวิธี MS เช่น แมสสเปกโตรเมทรีแบบ time-of-flight พร้อมการสลายด้วยเลเซอร์และไอออไนเซชันโดยใช้เมทริกซ์ (MALDI-TOF-MS) เป็นวิธีการที่หลากหลายสำหรับการระบุโครงสร้างคาร์โบไฮเดรตเมื่อเร็ว ๆ นี้ MS ของโซเดียมไอออน adducts ที่เกิดจากการชนกัน (Collision-Induced Dissociation - CID) ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางที่สุดในการระบุรอยนิ้วมือที่สอดคล้องกับตำแหน่งการติดของโอลิโกแซ็กคาไรด์ การกำหนดค่าแบบอะโนเมอริก ลำดับ และตำแหน่งการแตกแขนง 20, 21
การวิเคราะห์ไกลแคนเป็นเครื่องมือที่ยอดเยี่ยมสำหรับการระบุเชิงลึกของพันธะคาร์โบไฮเดรต22วิธีนี้ใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAbs) ที่ส่งไปยังไกลแคนที่ผนังเซลล์ของพืชเป็นโพรบเพื่อทำความเข้าใจการเชื่อมโยงคาร์โบไฮเดรตที่ซับซ้อนมีมากกว่า 250 mAbs ทั่วโลก ออกแบบมาสำหรับโอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงเส้นและแตกแขนงต่างๆ โดยใช้แซ็กคาไรด์ต่างๆ24มีการใช้ mAb หลายตัวอย่างกว้างขวางในการระบุลักษณะโครงสร้าง องค์ประกอบ และการดัดแปลงผนังเซลล์พืช เนื่องจากมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์พืช อวัยวะ อายุ ระยะการพัฒนา และสภาพแวดล้อมการเจริญเติบโต25,26เมื่อเร็วๆ นี้ วิธีนี้ถูกนำมาใช้เพื่อทำความเข้าใจประชากรตุ่มน้ำในระบบพืชและสัตว์ และบทบาทตามลำดับในการขนส่งไกลแคนตามที่กำหนดโดยเครื่องหมายเซลล์ย่อย ระยะการพัฒนา หรือสิ่งเร้าในสิ่งแวดล้อม และเพื่อกำหนดกิจกรรมของเอนไซม์โครงสร้างที่แตกต่างกันของไกลแคนและไซแลนที่ได้รับการระบุ ได้แก่ เพคติน (P), ไซแลน (X), แมนแนน (M), ไซล็อกลูแคน (XylG), กลูแคนที่มีพันธะผสม (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG) , glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) และ arabino-galactan (ArbG)29
อย่างไรก็ตาม แม้จะมีความพยายามในการวิจัยทั้งหมดเหล่านี้ แต่ก็มีการศึกษาเพียงไม่กี่ชิ้นเท่านั้นที่มุ่งเน้นไปที่ธรรมชาติของการสะสมโอลิโกแซ็กคาไรด์ในระหว่างการไฮโดรไลซิสที่มีของแข็งสูง (HSL) ซึ่งรวมถึงการปลดปล่อยโอลิโกแซ็กคาไรด์ การเปลี่ยนแปลงของความยาวสายโอลิโกเมอริกระหว่างการไฮโดรไลซิส โพลิเมอร์ DP ต่ำต่างๆ และเส้นโค้งของพวกมันการแจกแจง 30,31,32.ในขณะเดียวกัน แม้ว่าการวิเคราะห์ไกลแคนได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์โครงสร้างไกลแคนอย่างครอบคลุม แต่ก็เป็นการยากที่จะประเมินโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มี DP ต่ำที่ละลายน้ำได้โดยใช้วิธีแอนติบอดีโอลิโกแซ็กคาไรด์ DP ที่เล็กกว่าที่มีน้ำหนักโมเลกุลน้อยกว่า 5-10 kDa ไม่จับกับแผ่น ELISA 33, 34 และถูกชะล้างออกไปก่อนการเติมแอนติบอดี
ที่นี่ เป็นครั้งแรกที่เราสาธิตการทดสอบ ELISA บนเพลตที่เคลือบด้วยอะวิดินโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี ซึ่งเป็นการรวมกระบวนการไบโอทินิเลชันแบบขั้นตอนเดียวสำหรับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ทนไฟที่ละลายน้ำได้เข้ากับการวิเคราะห์ไกลโคมวิธีการวิเคราะห์ไกลโคมของเราได้รับการตรวจสอบความถูกต้องโดยการวิเคราะห์ MALDI-TOF-MS และ GC-MS ของการเชื่อมโยงโอลิโกแซ็กคาไรด์เสริมโดยใช้อนุพันธ์ไตรเมทิลไซลิล (TMS) ขององค์ประกอบน้ำตาลไฮโดรไลซ์แนวทางที่เป็นนวัตกรรมนี้สามารถพัฒนาเป็นวิธีการที่ให้ปริมาณงานสูงในอนาคต และค้นหาการใช้งานที่กว้างขึ้นในการวิจัยทางชีวการแพทย์35
การดัดแปลงหลังการแปลของเอนไซม์และแอนติบอดี เช่น ไกลโคซิเลชัน36 ส่งผลต่อฤทธิ์ทางชีวภาพของพวกมันตัวอย่างเช่น การเปลี่ยนแปลงของไกลโคซิเลชันของโปรตีนในซีรั่มมีบทบาทสำคัญในโรคข้ออักเสบ และการเปลี่ยนแปลงของไกลโคซิเลชันจะถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้การวินิจฉัยไกลแคนหลายชนิดได้รับการรายงานในเอกสารว่าปรากฏในโรคต่างๆ ได้ง่าย รวมทั้งโรคอักเสบเรื้อรังของระบบทางเดินอาหารและตับ การติดเชื้อไวรัส มะเร็งรังไข่ เต้านม และมะเร็งต่อมลูกหมาก38,39,40การทำความเข้าใจโครงสร้างของ glycans โดยใช้วิธี ELISA ของ glycan ที่ใช้แอนติบอดีจะเพิ่มความมั่นใจในการวินิจฉัยโรคโดยไม่ต้องใช้วิธี MS ที่ซับซ้อน
การศึกษาก่อนหน้าของเราแสดงให้เห็นว่าโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ปากแข็งยังคงไม่ถูกไฮโดรไลซ์หลังจากผ่านการปรับสภาพและไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ (รูปที่ 1)ในผลงานที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ เราได้พัฒนาวิธีการสกัดด้วยถ่านกัมมันต์ในเฟสของแข็งเพื่อแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ออกจากข้าวโพดสเตปเปอร์ไฮโดรไลเสต (ACSH)8 ที่ผ่านการบำบัดด้วย AFEXหลังจากการสกัดและการแยกขั้นต้น โอลิโกแซ็กคาไรด์จะถูกแยกส่วนเพิ่มเติมโดยโครมาโตกราฟีแบบแยกตามขนาด (SEC) และรวบรวมตามลำดับน้ำหนักโมเลกุลวิเคราะห์โมโนเมอร์น้ำตาลและโอลิโกเมอร์ที่ปล่อยออกมาจากการปรับสภาพต่างๆ โดยการวิเคราะห์องค์ประกอบของน้ำตาลเมื่อเปรียบเทียบปริมาณโอลิโกเมอร์ของน้ำตาลที่ได้จากวิธีการปรับสภาพแบบต่างๆ การมีโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ปากแข็งเป็นปัญหาทั่วไปในการเปลี่ยนมวลชีวภาพเป็นโมโนแซ็กคาไรด์ และอาจทำให้ผลผลิตน้ำตาลลดลงอย่างน้อย 10-15% และมากถึง 18%เรา.วิธีนี้ใช้สำหรับการผลิตเศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ในปริมาณมากACH ที่เป็นผลลัพธ์และเศษส่วนตามมาที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่างกันถูกนำมาใช้เป็นวัสดุทดลองสำหรับการวิเคราะห์ลักษณะของโอลิโกแซ็กคาไรด์ในงานนี้
หลังจากปรับสภาพและไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์แล้ว โอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ยังคงอยู่จะยังคงไม่ถูกไฮโดรไลซิสที่นี่ (A) เป็นวิธีการแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่แยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ออกจากข้าวโพดสเตปเปอร์ไฮโดรไลเสต (ACSH) ที่ผ่านการบำบัดด้วย AFEX โดยใช้ถ่านกัมมันต์และดินเบา(B) วิธีการแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์โอลิโกแซ็กคาไรด์ถูกแยกเพิ่มเติมโดยโครมาโตกราฟีแบบแยกขนาด (SEC);(C) โมโนเมอร์แซคคาไรด์และโอลิโกเมอร์ที่ปล่อยออกมาจากการปรับสภาพต่างๆ (กรดเจือจาง: DA, ของเหลวไอออนิก: IL และ AFEX)สภาวะไฮโดรไลซิสของเอนไซม์: ปริมาณของแข็งสูง 25% (w/w) (ปริมาณกลูแคนประมาณ 8%) ไฮโดรไลซิส 96 ชั่วโมง เอนไซม์เชิงพาณิชย์ 20 มก./กรัม (อัตราส่วน Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) และ ( D) น้ำตาลโมโนเมอร์และโอลิโกเมอร์ของกลูโคส ไซโลส และอะราบิโนสที่ปล่อยออกมาจากเตาข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดด้วย AFEX (ACS)
การวิเคราะห์ไกลแคนได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์โครงสร้างที่ครอบคลุมของไกลแคนในสารสกัดที่แยกได้จากกากชีวมวลที่เป็นของแข็งอย่างไรก็ตาม แซคคาไรด์ที่ละลายน้ำได้มีอยู่น้อยเกินไปโดยใช้วิธีดั้งเดิมนี้ เนื่องจากโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำยากที่จะตรึงบนเพลต ELISA และถูกชะล้างออกก่อนที่จะเติมแอนติบอดีดังนั้น สำหรับการจับและลักษณะเฉพาะของแอนติบอดี จึงใช้วิธีไบโอทินิเลชันแบบขั้นตอนเดียวเพื่อเคลือบโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้และไม่สอดคล้องกันบนเพลต ELISA ที่เคลือบด้วยอะวิดินวิธีนี้ได้รับการทดสอบโดยใช้ ACSH ที่เราผลิตขึ้นก่อนหน้านี้และเศษส่วนตามน้ำหนักโมเลกุล (หรือระดับของพอลิเมอไรเซชัน, DP)การใช้ biotinylation แบบขั้นตอนเดียวเพื่อเพิ่มความสัมพันธ์ในการจับกับโอลิโกแซ็กคาไรด์โดยการเติมไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์ไปยังส่วนท้ายรีดิวซ์ของคาร์โบไฮเดรต (รูปที่ 2)ในสารละลาย กลุ่มเฮมิแอซีทัลที่ปลายรีดิวซ์จะทำปฏิกิริยากับกลุ่มไฮดราไซด์ของไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์เพื่อสร้างพันธะไฮดราโซนเมื่อมีตัวรีดิวซ์ NaCNBH3 พันธะไฮดราโซนจะถูกรีดิวซ์เป็นผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายที่มีไบโอตินที่เสถียรด้วยการดัดแปลงปลายรีดิวซ์น้ำตาล การจับของโอลิโกแซ็กคาไรด์ DP ต่ำกับเพลต ELISA จึงเป็นไปได้ และในการศึกษาของเราสิ่งนี้ทำบนเพลตที่เคลือบด้วยอะวิดินโดยใช้ mAb ที่กำหนดเป้าหมายไกลแคน
การคัดกรองโมโนโคลนอลแอนติบอดีโดยใช้ ELISA เพื่อหาโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีไบโอทินิเลตที่นี่ (A) รวมไบโอทินิลเลชันของโอลิโกแซ็กคาไรด์และการคัดกรองด้วย ELISA ที่ตามมาด้วย mAbs ที่กำหนดเป้าหมายเป็นไกลแคนบนเพลตเคลือบ NeutrAvidin และ (B) แสดงขั้นตอนเดียวสำหรับไบโอทินิลเลชันของผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยา
เพลตที่เคลือบอะวิดินด้วยโอลิโกแซ็กคาไรด์-คอนจูเกตแอนติบอดีจึงถูกเติมลงในแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิและล้างในตัวกลางที่ไวต่อแสงและเวลาหลังจากการจับแอนติบอดีเสร็จสิ้น ให้เติมสารตั้งต้น TMB เพื่อบ่มเพลตในที่สุดปฏิกิริยาก็หยุดลงด้วยกรดซัลฟิวริกเพลตที่บ่มถูกวิเคราะห์โดยใช้เครื่องอ่าน ELISA เพื่อกำหนดความแข็งแรงในการจับของแอนติบอดีแต่ละตัวเพื่อตรวจหาการเชื่อมโยงข้ามที่จำเพาะต่อแอนติบอดีสำหรับรายละเอียดและพารามิเตอร์ของการทดสอบ โปรดดูส่วน "วัสดุและวิธีการ" ที่เกี่ยวข้อง
เราแสดงให้เห็นถึงประโยชน์ของวิธีการที่พัฒนาขึ้นใหม่นี้สำหรับการใช้งานเฉพาะโดยการจำแนกโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ใน ACSH เช่นเดียวกับเศษโอลิโกแซ็กคาไรด์ดิบและบริสุทธิ์ที่แยกได้จากไฮโดรไลเสตลิกโนเซลลูโลสดังที่แสดงในรูปที่ 3 ไซแลนที่ถูกแทนที่ด้วยอีพิโทปที่พบมากที่สุดที่ระบุใน ACSH โดยใช้วิธีวิเคราะห์ไกลโคมด้วยไบโออะซิเลตมักจะเป็นยูโรนิก (U) หรือเมทิลูโรนิก (MeU) และเพคติก อะราบิโนกาแลคแทนส่วนใหญ่ยังพบในการศึกษาก่อนหน้าของเราเกี่ยวกับการวิเคราะห์ไกลแคนของของแข็งที่ไม่ผ่านการไฮโดรไลซ์ (UHS)43
การตรวจหาอีพิโทปโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อรั้นโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ส่งตรงไปยังไกลแคนที่ผนังเซลล์เศษส่วน "เป็นกลาง" คือเศษส่วน ACN และเศษส่วน "ที่เป็นกรด" คือเศษส่วน FAสีแดงที่สว่างกว่าในแผนที่ความร้อนแสดงถึงเนื้อหาของ epitope ที่สูงขึ้น และสีน้ำเงินที่สว่างกว่าแสดงว่าพื้นหลังว่างเปล่าค่าสีบนสเกลจะขึ้นอยู่กับค่า OD ดิบสำหรับสูตร N=2อีพิโทปหลักที่แอนติบอดีจดจำได้แสดงไว้ทางด้านขวา
โครงสร้างที่ไม่ใช่เซลลูโลสเหล่านี้ไม่สามารถแยกออกได้โดยเซลลูเลสและเฮมิเซลลูโลสที่พบมากที่สุดในส่วนผสมของเอนไซม์เชิงพาณิชย์ที่ผ่านการทดสอบ ซึ่งรวมถึงเอนไซม์เชิงพาณิชย์ที่ใช้บ่อยที่สุดดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีเอนไซม์เสริมใหม่สำหรับการไฮโดรไลซิสหากไม่มีเอ็นไซม์เสริมที่ไม่ใช่เซลลูโลสที่จำเป็น พันธะที่ไม่ใช่เซลลูโลสเหล่านี้จะป้องกันการเปลี่ยนเป็นโมโนแซ็กคาไรด์โดยสมบูรณ์ แม้ว่าโพลิเมอร์น้ำตาลของพวกมันจะถูกไฮโดรไลซ์เป็นชิ้นส่วนที่สั้นกว่าและละลายโดยใช้ส่วนผสมของเอนไซม์เชิงพาณิชย์
การศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับการกระจายสัญญาณและความแข็งแรงในการจับของมันแสดงให้เห็นว่าอีพิโทปที่มีผลผูกพันนั้นมีค่าต่ำกว่าในเศษส่วนน้ำตาล DP สูง (A, B, C, DP ถึง 20+) มากกว่าในเศษส่วนที่มี DP ต่ำ (D, E, F, DP) ในไดเมอร์) (รูปที่ 1)เศษกรดพบได้ทั่วไปในอีพิโทปที่ไม่ใช่เซลลูโลสมากกว่าเศษที่เป็นกลางปรากฏการณ์เหล่านี้สอดคล้องกับรูปแบบที่สังเกตในการศึกษาก่อนหน้าของเรา โดยที่ DP สูงและมอยอิตีของกรดมีความทนทานต่อการไฮโดรไลซิสของเอนไซม์มากกว่าดังนั้นการมีอยู่ของอีพิโทปไกลแคนที่ไม่ใช่เซลลูโลสและการแทนที่ของ U และ MeU สามารถมีส่วนช่วยอย่างมากต่อความเสถียรของโอลิโกแซ็กคาไรด์ควรสังเกตว่าประสิทธิภาพการจับและการตรวจจับอาจเป็นปัญหาสำหรับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มี DP ต่ำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งหากอีพิโทปเป็นโอลิโกแซ็กคาไรด์แบบไดเมอริกหรือไตรเมอร์สามารถทดสอบได้โดยใช้โอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์ที่มีความยาวต่างกัน โดยแต่ละชนิดมีอีพิโทปเพียงตัวเดียวที่จับกับ mAb เฉพาะ
ดังนั้น การใช้แอนติบอดีเฉพาะโครงสร้างจึงเผยให้เห็นพันธะที่ดื้อรั้นบางประเภทขึ้นอยู่กับชนิดของแอนติบอดีที่ใช้ รูปแบบ ligation ที่เหมาะสม และความแรงของสัญญาณที่สร้าง (มากที่สุดและน้อยที่สุด) สามารถระบุและเติมเอนไซม์ใหม่แบบกึ่งปริมาณลงในส่วนผสมของเอนไซม์เพื่อให้ได้ไกลโคคอนเวอร์ชันที่สมบูรณ์ยิ่งขึ้นจากตัวอย่างการวิเคราะห์ ACSH โอลิโกแซ็กคาไรด์ เราสามารถสร้างฐานข้อมูลของพันธะไกลแคนสำหรับวัสดุชีวมวลแต่ละชนิดได้ควรสังเกตที่นี่ว่าควรคำนึงถึงความสัมพันธ์ที่แตกต่างกันของแอนติบอดีด้วย และหากไม่ทราบความสัมพันธ์กัน จะทำให้เกิดความยากลำบากบางอย่างเมื่อเปรียบเทียบสัญญาณของแอนติบอดีที่แตกต่างกันนอกจากนี้ การเปรียบเทียบพันธะไกลแคนอาจทำงานได้ดีที่สุดระหว่างตัวอย่างสำหรับแอนติบอดีเดียวกันพันธะที่ดื้อรั้นเหล่านี้สามารถเชื่อมโยงกับฐานข้อมูล CAZyme ซึ่งเราสามารถระบุเอ็นไซม์ เลือกเอ็นไซม์ที่เป็นตัวเลือก และทดสอบเอ็นไซม์ทำลายพันธะ หรือพัฒนาระบบจุลินทรีย์เพื่อแสดงเอ็นไซม์เหล่านี้เพื่อใช้ในโรงกลั่นชีวภาพ44
เพื่อประเมินว่าวิธีการทางภูมิคุ้มกันช่วยเสริมวิธีการทางเลือกในการจำแนกโอลิโกแซ็กคาไรด์น้ำหนักโมเลกุลต่ำที่มีอยู่ในลิกโนเซลลูโลสไฮโดรไลเสตได้อย่างไร เราดำเนินการ MALDI (รูปที่ 4, S1-S8) และการวิเคราะห์แซคคาไรด์ที่ได้จาก TMS ตาม GC-MS บนแผงเดียวกัน (รูปที่ 5) ส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์MALDI ใช้เพื่อเปรียบเทียบว่าการกระจายมวลของโมเลกุลโอลิโกแซ็กคาไรด์ตรงกับโครงสร้างที่ต้องการหรือไม่บนมะเดื่อ4 แสดง MC ของส่วนประกอบที่เป็นกลาง ACN-A และ ACN-Bการวิเคราะห์ ACN-A ยืนยันช่วงของน้ำตาลเพนโทสตั้งแต่ DP 4–8 (รูปที่ 4) ถึง DP 22 (รูปที่ S1) ซึ่งมีน้ำหนักสอดคล้องกับ MeU-xylan oligosaccharidesการวิเคราะห์ ACN-B ยืนยันซีรีส์เพนโทสและกลูโคซีแลนด้วย DP 8-15ในวัสดุเสริม เช่น รูปที่ S3 แผนที่การกระจายมวลของมอยอิตีที่เป็นกรดของ FA-C แสดงช่วงของน้ำตาลเพนโทสที่ถูกแทนที่ (Me)U ด้วย DP 8-15 ที่สอดคล้องกับไซแลนที่ถูกแทนที่ซึ่งพบในการคัดกรอง mAb ที่ใช้ ELISAepitopes มีความสอดคล้องกัน
สเปกตรัมของ MALDI-MS ของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำไม่ได้ซึ่งมีอยู่ใน ACSที่นี่ (A) ACN-A เศษส่วนที่มีช่วงน้ำหนักต่ำที่มีกรดเมทิลเลตยูโรนิก (DP 4-8) แทนที่กลูคูโรซีแลนโอลิโกแซคคาไรด์ และ (B) ไซแลน ACN-B และโอลิโกแซ็กคาไรด์ของกรดยูริกเมทิลเลตที่ถูกแทนที่ด้วยกลูคูโรซีแลน (DP 8-15)
การวิเคราะห์องค์ประกอบของสารตกค้างไกลแคนของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ทนไฟที่นี่ (A) องค์ประกอบของแซคคาไรด์ TMS ของเศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่างๆ ที่ได้จากการวิเคราะห์ GC-MS(B) โครงสร้างของน้ำตาลที่ได้จาก TMS ต่างๆ ที่มีอยู่ในโอลิโกแซ็กคาไรด์ACN – เศษส่วน acetonitrile ที่มีโอลิโกแซ็กคาไรด์เป็นกลาง และ FA – เศษส่วนของกรดเฟรูลิกที่มีโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่เป็นกรด
ข้อสรุปที่น่าสนใจอีกประการหนึ่งมาจากการวิเคราะห์ LC-MS ของเศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ ดังแสดงในรูปที่ S9 (สามารถดูวิธีการได้ในวัสดุเสริมอิเล็กทรอนิกส์)ชิ้นส่วนของกลุ่มเฮกโซสและ -OAc ถูกสังเกตซ้ำหลายครั้งในระหว่างการแยกส่วน ACN-Bการค้นพบนี้ไม่เพียงยืนยันการแยกส่วนที่พบในการวิเคราะห์ไกลโคมและ MALDI-TOF เท่านั้น แต่ยังให้ข้อมูลใหม่เกี่ยวกับอนุพันธ์คาร์โบไฮเดรตที่มีศักยภาพในชีวมวลลิกโนเซลลูโลสที่ผ่านการบำบัดแล้ว
นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์องค์ประกอบน้ำตาลของเศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์โดยใช้ TMS อนุพันธ์ของน้ำตาลเมื่อใช้ GC-MS เรากำหนดองค์ประกอบของระบบประสาท (ไม่มีอนุพันธ์) และน้ำตาลที่เป็นกรด (GluA และ GalA) ในเศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ (รูปที่ 5)กรดกลูคูโรนิกพบได้ในส่วนประกอบที่เป็นกรด C และ D ในขณะที่กรดกาแลคทูโรนิกพบได้ในส่วนประกอบที่เป็นกรด A และ B ซึ่งทั้งสองอย่างนี้เป็นส่วนประกอบที่มี DP สูงของน้ำตาลที่เป็นกรดผลลัพธ์เหล่านี้ไม่เพียงแต่ยืนยันข้อมูล ELISA และ MALDI ของเราเท่านั้น แต่ยังสอดคล้องกับการศึกษาการสะสมโอลิโกแซ็กคาไรด์ก่อนหน้านี้ของเราด้วยดังนั้นเราจึงเชื่อว่าวิธีการทางภูมิคุ้มกันวิทยาสมัยใหม่ที่ใช้ไบโอตินิเลชันของโอลิโกแซ็กคาไรด์และการตรวจคัดกรองด้วยวิธี ELISA ภายหลังนั้นเพียงพอที่จะตรวจหาโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อรั้นที่ละลายน้ำได้ในตัวอย่างทางชีววิทยาต่างๆ
เนื่องจากวิธีการคัดกรอง mAb ที่ใช้ ELISA ได้รับการตรวจสอบโดยวิธีการต่างๆ หลายวิธี เราจึงต้องการที่จะสำรวจเพิ่มเติมถึงศักยภาพของวิธีการเชิงปริมาณแบบใหม่นี้โอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์สองตัวคือ xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) และ 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) ถูกซื้อและทดสอบโดยใช้วิธีการ mAb ใหม่ที่กำหนดเป้าหมายไปที่ผนังเซลล์ glycanรูปที่ 6 แสดงความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างสัญญาณจับไบโอทินิลและความเข้มข้นของบันทึกของความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์ ซึ่งบ่งชี้ถึงแบบจำลองการดูดซับของแลงเมียร์ที่เป็นไปได้ในบรรดา mAbs นั้น CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 และ CCRC-M151 มีความสัมพันธ์กับ XHE และ CCRC-M108, CCRC-M109 และ LM11 มีความสัมพันธ์กับ A2XX ในช่วง 1 นาโนเมตรถึง 100 นาโนเมตรเนื่องจากความพร้อมใช้งานของแอนติบอดีที่จำกัดในระหว่างการทดลอง การทดลองที่จำกัดจึงถูกดำเนินการกับความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์แต่ละชนิดควรสังเกตที่นี่ว่าแอนติบอดีบางตัวทำปฏิกิริยาแตกต่างกันมากกับโอลิโกแซ็กคาไรด์ชนิดเดียวกันในฐานะสารตั้งต้น สันนิษฐานว่าเป็นเพราะพวกมันจับกับเอพิโทปที่แตกต่างกันเล็กน้อยและสามารถมีความสัมพันธ์ในการจับที่แตกต่างกันมากกลไกและความหมายของการระบุ epitope ที่แม่นยำจะซับซ้อนมากขึ้นเมื่อใช้วิธี mAb ใหม่กับตัวอย่างจริง
โอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์สองตัวถูกใช้เพื่อกำหนดช่วงการตรวจจับของ mAb ที่กำหนดเป้าหมายไกลแคนต่างๆที่นี่ ความสัมพันธ์เชิงเส้นกับบันทึกความเข้มข้นของความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์บ่งชี้รูปแบบการดูดซับ Langmuir สำหรับ (A) XHE กับ mAb และ (B) A2XX กับ mAbอีพิโทปที่สอดคล้องกันบ่งชี้ถึงโครงสร้างของโอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์ที่ใช้เป็นสารตั้งต้นในการวิเคราะห์
การใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมายไกลแคน (การวิเคราะห์ไกลโคโคมิกหรือการคัดกรอง mAb ที่ใช้ ELISA) เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการวิเคราะห์ลักษณะเชิงลึกของไกลแคนที่ผนังเซลล์หลักส่วนใหญ่ที่ประกอบกันเป็นมวลชีวภาพของพืชอย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ไกลแคนแบบคลาสสิกจะแสดงลักษณะของไกลแคนที่ผนังเซลล์ขนาดใหญ่เท่านั้น เนื่องจากโอลิโกแซ็กคาไรด์ส่วนใหญ่ไม่ได้ถูกตรึงอย่างมีประสิทธิภาพบนเพลต ELISAในการศึกษานี้เตาข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดด้วย AFEX ถูกไฮโดรไลซ์ด้วยเอนไซม์ที่ปริมาณของแข็งสูงการวิเคราะห์น้ำตาลถูกนำมาใช้เพื่อหาองค์ประกอบของคาร์โบไฮเดรตที่ผนังเซลล์ที่ดื้อรั้นในไฮโดรไลเสตอย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ mAb ของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีขนาดเล็กกว่าในไฮโดรไลเสตนั้นประเมินต่ำเกินไป และจำเป็นต้องมีเครื่องมือเพิ่มเติมเพื่อทำให้โอลิโกแซ็กคาไรด์ตรึงบนเพลต ELISA อย่างมีประสิทธิภาพ
เรารายงานวิธีการตรึงโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่แปลกใหม่และมีประสิทธิภาพสำหรับการคัดกรอง mAb โดยการรวมโอลิโกแซ็กคาไรด์ไบโอทินิเลชันตามด้วยการคัดกรอง ELISA บนแผ่นเคลือบ NeutrAvidin™โอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ตรึงด้วยไบโอทินิลที่ตรึงไว้แสดงความสัมพันธ์ที่เพียงพอสำหรับแอนติบอดีเพื่อให้สามารถตรวจหาโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อรั้นได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพการวิเคราะห์องค์ประกอบของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อรั้นเหล่านี้โดยอาศัยแมสสเปกโตรเมตรียืนยันผลลัพธ์ของวิธีการใหม่ในการคัดกรองภูมิคุ้มกันดังนั้น การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการรวมกันของ oligosaccharide biotinylation และ ELISA screening กับ glycan-targeted monoclonal antibodies สามารถใช้เพื่อตรวจหา crosslinks ใน oligosaccharides และสามารถนำไปใช้อย่างกว้างขวางในการศึกษาทางชีวเคมีอื่นๆ ที่แสดงลักษณะโครงสร้างของ oligosaccharides
วิธีการทำโปรไฟล์ไกลแคนที่ใช้ไบโอตินนี้เป็นรายงานฉบับแรกที่สามารถตรวจสอบพันธะคาร์โบไฮเดรตที่ดื้อรั้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ในชีวมวลของพืชสิ่งนี้ช่วยให้เข้าใจว่าทำไมชีวมวลบางส่วนจึงดื้อรั้นเมื่อต้องนำมาผลิตเป็นเชื้อเพลิงชีวภาพวิธีนี้ช่วยเติมเต็มช่องว่างที่สำคัญในวิธีการวิเคราะห์ไกลโคมและขยายการใช้งานไปยังสารตั้งต้นที่กว้างขึ้นนอกเหนือจากโอลิโกแซ็กคาไรด์จากพืชในอนาคต เราอาจใช้วิทยาการหุ่นยนต์สำหรับการสังเคราะห์ทางชีวภาพ และใช้วิธีการที่เราพัฒนาขึ้นสำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างปริมาณงานสูงโดยใช้ ELISA
ฟางข้าวโพด (CS) ที่ปลูกจากเมล็ดพันธุ์ลูกผสม Pioneer 33A14 ถูกเก็บเกี่ยวในปี 2010 จาก Kramer Farms ในเมืองเรย์ รัฐโคโลราโดเมื่อได้รับอนุญาตจากเจ้าของที่ดินแล้ว ชีวมวลนี้สามารถนำไปใช้ในการวิจัยได้ เก็บตัวอย่างที่แห้งความชื้น < 6% ในถุงซิปล็อคที่อุณหภูมิห้อง เก็บตัวอย่างที่แห้งความชื้น < 6% ในถุงซิปล็อคที่อุณหภูมิห้อง Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. เก็บตัวอย่างแห้งที่ความชื้น <6% ในถุงซิปล็อกที่อุณหภูมิห้อง样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. เก็บตัวอย่างในถุงซิปที่อุณหภูมิห้องที่มีความชื้น < 6%การศึกษาสอดคล้องกับแนวทางท้องถิ่นและระดับชาติการวิเคราะห์องค์ประกอบดำเนินการโดยใช้โปรโตคอล NRELองค์ประกอบพบว่ามีกลูแคน 31.4% ไซแลน 18.7% อาราบิแนน 3.3% กาแล็กแทน 1.2% อะซิติล 2.2% ลิกนิน 14.3% โปรตีน 1.7% และเถ้า 13.4%
Cellic® CTec2 (โปรตีน 138 มก./มล. ล็อต VCNI 0001) เป็นส่วนผสมเชิงซ้อนของเซลลูเลส β-กลูโคซิเดส และ Cellic® HTec2 (โปรตีน 157 มก./มล. ล็อต VHN00001) จากโนโวไซม์ (แฟรงคลินตัน รัฐนอร์ทแคโรไลนา สหรัฐอเมริกา))Multifect Pectinase® (โปรตีน 72 มก./มล.) ซึ่งเป็นส่วนผสมที่ซับซ้อนของเอนไซม์ย่อยสลายเพคติน ได้รับบริจาคโดย DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA)ความเข้มข้นของโปรตีนของเอนไซม์ถูกกำหนดโดยการประมาณปริมาณโปรตีน (และลบการมีส่วนร่วมของไนโตรเจนที่ไม่ใช่โปรตีน) โดยใช้การวิเคราะห์ไนโตรเจนแบบเจลดาห์ล (วิธี AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA)ดินเบา 545 ซื้อจาก EMD Millipore (Billerica, MA)ถ่านกัมมันต์ (DARCO, 100 เมชแกรนูล), Avicel (PH-101), บีชไซแลน และสารเคมีอื่นๆ ทั้งหมดถูกซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์, มิสซูรี่)
การปรับสภาพ AFEX ดำเนินการที่ GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA)การบำบัดล่วงหน้าดำเนินการที่อุณหภูมิ 140° C เป็นเวลา 15 นาที46 เวลาพักตัวที่อัตราส่วน 1:1 ของแอมโมเนียปราศจากน้ำต่อมวลชีวภาพที่โหลด 60% (w/w) ในเครื่องปฏิกรณ์แบบแบตช์ท็อปสเตนเลสสตีล (Parr Instruments Company)ใช้เวลา 30 นาทีเครื่องปฏิกรณ์ถูกนำไปที่อุณหภูมิ 140°C และแอมโมเนียถูกปล่อยออกมาอย่างรวดเร็ว ทำให้ชีวมวลกลับสู่อุณหภูมิห้องได้อย่างรวดเร็วส่วนประกอบของเตาเผาข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดของ AFEX (ACS) มีความคล้ายคลึงกับส่วนประกอบของเตาเผาข้าวโพดที่ไม่ผ่านการบำบัด (UT-CS)
เตรียม ACSH ของแข็งสูง 25% (w/w) (โหลดเดกซ์แทรนประมาณ 8%) เป็นวัสดุตั้งต้นสำหรับการผลิตโอลิโกแซ็กคาไรด์ในปริมาณมากการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ของ ACS ดำเนินการโดยใช้ส่วนผสมของเอนไซม์เชิงพาณิชย์ ได้แก่ Cellic® Ctec2 โปรตีน 10 มก./ก. กลูแคน (ในชีวมวลที่ผ่านการบำบัด), Htec2 (โนโวไซม์, แฟรงคลินตัน, NC), โปรตีน 5 มก./ก. กลูแคน และ Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA)).), โปรตีน 5 มก./กรัม เดกซ์แทรนการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ดำเนินการในถังปฏิกรณ์ชีวภาพขนาด 5 ลิตรที่มีปริมาตรการทำงาน 3 ลิตร, pH 4.8, 50°C และ 250 รอบต่อนาทีหลังจากการไฮโดรไลซิสเป็นเวลา 96 ชั่วโมง ไฮโดรไลเสตจะถูกรวบรวมโดยการปั่นแยกที่ 6,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาที และจากนั้นที่ 14,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาทีเพื่อกำจัดของแข็งที่ไม่ผ่านการไฮโดรไลซิสจากนั้นไฮโดรไลเสตจะถูกกรองแบบปลอดเชื้อผ่านบีกเกอร์ตัวกรองขนาด 0.22 มม.ไฮโดรไลเสตที่กรองแล้วถูกเก็บไว้ในขวดปลอดเชื้อที่อุณหภูมิ 4°ซ แล้วแยกส่วนบนคาร์บอน
การวิเคราะห์องค์ประกอบของตัวอย่างสารชีวมวลที่ใช้สารสกัดตามขั้นตอนการวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการของ NREL: การเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์องค์ประกอบ (NREL/TP-510-42620) และการวิเคราะห์คาร์โบไฮเดรตเชิงโครงสร้างและลิกนินในสารชีวมวล (NREL/TP-510 – 42618)47
การวิเคราะห์โอลิโกแซ็กคาไรด์ของกระแสไฮโดรไลเสตดำเนินการในระดับ 2 มล. โดยใช้วิธีไฮโดรไลซิสด้วยกรดที่ใช้หม้อนึ่งฆ่าเชื้อผสมตัวอย่างไฮโดรไลเสตกับกรดซัลฟิวริก 72% 69.7 ไมโครลิตรในหลอดเพาะเลี้ยงที่มีฝาเกลียวขนาด 10 มล. และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงบนโต๊ะบนโต๊ะที่อุณหภูมิ 121 °C ทำให้เย็นบนน้ำแข็งและกรองลงในขวดโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC)ความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์ถูกกำหนดโดยการลบความเข้มข้นของโมโนแซ็กคาไรด์ในตัวอย่างที่ไม่ถูกไฮโดรไลซ์ออกจากความเข้มข้นของน้ำตาลทั้งหมดในตัวอย่างที่ไฮโดรไลซ์ด้วยกรด
ความเข้มข้นของกลูโคส ไซโลส และอะราบิโนสในสารชีวมวลที่ไฮโดรไลซ์ด้วยกรดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ระบบ Shimadzu HPLC ซึ่งติดตั้งเครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติ เครื่องทำความร้อนคอลัมน์ ปั๊มไอโซคราติก และเครื่องตรวจจับดัชนีการหักเหของแสงบนคอลัมน์ Bio-Rad Aminex HPX-87Hคอลัมน์ถูกรักษาไว้ที่ 50°C และชะด้วย 0.6 มล./นาที 5 มิลลิโมลาร์ H2SO4 ในน้ำไหล.
ส่วนลอยเหนือตะกอนไฮโดรไลเสตถูกเจือจางและวิเคราะห์หาปริมาณโมโนเมอร์และโอลิโกแซ็กคาไรด์น้ำตาลโมโนเมอร์ที่ได้รับหลังจากการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ถูกวิเคราะห์โดย HPLC พร้อมกับคอลัมน์ Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P และคอลัมน์ป้องกันเถ้าอุณหภูมิคอลัมน์ถูกคงไว้ที่ 80°C น้ำถูกใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่ด้วยอัตราการไหล 0.6 มล./นาทีโอลิโกแซ็กคาไรด์ถูกกำหนดโดยการไฮโดรไลซิสในกรดเจือจางที่ 121°C ตามวิธีการที่อธิบายไว้ในการอ้างอิง41, 48, 49.
การวิเคราะห์แซคคาไรด์ดำเนินการกับวัตถุดิบ สารชีวมวลที่ไม่ผ่านกระบวนการ AFEX ดิบ และสารชีวมวลที่ไม่ผ่านการไฮโดรไลซ์ทั้งหมด (รวมถึงการผลิตสารสกัดผนังเซลล์แบบอนุกรมและการคัดกรอง mAb) โดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 27, 43, 50, 51สำหรับการวิเคราะห์ไกลโคม สารตกค้างที่ไม่ละลายในแอลกอฮอล์ของวัสดุผนังเซลล์พืชจะถูกเตรียมจากสารชีวมวลและผ่านการสกัดแบบอนุกรมด้วยรีเอเจนต์ที่มีฤทธิ์รุนแรงมากขึ้น เช่น แอมโมเนียมออกซาเลต (50 mM) โซเดียมคาร์บอเนต (50 mM และ 0.5% w/v), CON(1M และ 4M ทั้งที่มีโซเดียมบอโรไฮไดรด์ 1% w/v) และแอซิดคลอไรต์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้52,53จากนั้น สารสกัดถูกนำไปใช้กับ ELISA กับแผงเชิงซ้อนของ mAb50s ที่ส่งไปยังไกลแคนที่ผนังเซลล์ และปฏิกิริยาการจับ mAb ถูกแสดงเป็นแผนที่ความร้อนซื้อ mAbs ที่กำหนดเป้าหมายไกลแคนที่ผนังเซลล์พืชจากคลังห้องปฏิบัติการ (ซีรี่ส์ CCRC, JIM และ MAC)
biotinylation ขั้นตอนเดียวของ oligosaccharidesการผันคำกริยาของคาร์โบไฮเดรตด้วยไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์ได้ดำเนินการโดยใช้ขั้นตอนต่อไปนี้ไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์ (4.6 มก./12 ไมโครโมล) ถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO, 70 ไมโครลิตร) โดยการกวนอย่างแรงและทำให้ร้อนที่ 65°ซ เป็นเวลา 1 นาทีกรดเกลเซียลอะซิติก (30 ไมโครลิตร) ถูกเติมและของผสมถูกเทลงบนโซเดียม ไซยาโนโบโรไฮไดรด์ (6.4 มก./100 ไมโครโมล) และละลายอย่างสมบูรณ์หลังจากให้ความร้อนที่ 65°ซ เป็นเวลาประมาณ 1 นาทีจากนั้น เติมส่วนผสมของปฏิกิริยาตั้งแต่ 5 ถึง 8 ไมโครลิตรลงในโอลิโกแซ็กคาไรด์แห้ง (1-100 นาโนโมล) เพื่อให้ได้ฉลากที่เกินจากโมลาร์ 10 เท่าหรือมากกว่าที่ปลายรีดิวซ์ปฏิกิริยาถูกดำเนินการที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากนั้นตัวอย่างถูกทำให้บริสุทธิ์ทันทีไม่มีการใช้โซเดียมไซยาโนโบโรไฮไดรด์ในการทดลองติดฉลากโดยไม่มีการลดลง และตัวอย่างถูกทำปฏิกิริยาที่ 65° C เป็นเวลา 2.5 ชั่วโมง
การเคลือบด้วย ELISA และการล้างตัวอย่างของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีไบโอทินิเลตตัวอย่าง biotinylated 25 ไมโครลิตร (100 ไมโครลิตรของตัวอย่างเข้มข้นแต่ละตัวอย่างเจือจางใน 5 มล. ของสารละลายบัฟเฟอร์ Tris 0.1 M Tris (TBS)) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมของแผ่นเคลือบอะวิดินหลุมควบคุมถูกเคลือบด้วยไบโอติน 50 ไมโครลิตรที่ความเข้มข้น 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรใน 0.1 M TBSน้ำปราศจากไอออนถูกใช้เป็นสารเคลือบสำหรับการวัดเปล่าแท็บเล็ตถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืดล้างจาน 3 ครั้งด้วยนมพร่องมันเนย 0.1% ใน 0.1 M TBS โดยใช้โปรแกรมหมายเลข11 สำหรับ Grenier แฟลต 3A
การเติมและการล้างแอนติบอดีหลักเติมแอนติบอดีปฐมภูมิ 40 ไมโครลิตรลงในแต่ละหลุมบ่มไมโครเพลทเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืดจานถูกล้าง 3 ครั้งด้วยนม 0.1% ใน 0.1M TBS โดยใช้โปรแกรมล้าง #11 สำหรับ Grenier Flat 3A
เพิ่มแอนติบอดีทุติยภูมิและล้างเติมแอนติบอดีทุติยภูมิของหนูเมาส์/หนูแรท 50 µl (เจือจาง 1:5000 ในนม 0.1% ใน 0.1 M TBS) ในแต่ละหลุมบ่มไมโครเพลทเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืดจากนั้น ล้างไมโครเพลท 5 ครั้งด้วยนม 0.1% ใน 0.1 M TBS โดยใช้โปรแกรมล้างจาน Grenier Flat 5A #12
การเพิ่มพื้นผิวเติม 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) 50 µl ลงในเบสซับสเตรต (โดยเติมบัฟเฟอร์ 2 หยด, TMB 3 หยด, ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 2 หยด ต่อน้ำปราศจากไอออน 15 มล.)เตรียมพื้นผิว TMBและน้ำวนก่อนใช้งาน)บ่มไมโครเพลทที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาทีในที่มืด.
ทำตามขั้นตอนและอ่านแท็บเล็ตเติมกรดซัลฟิวริก 1 N 50 µl ลงในแต่ละหลุมและบันทึกค่าการดูดกลืนแสงตั้งแต่ 450 ถึง 655 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่าน ELISA
เตรียมสารละลาย 1 มก./มล. ของสารวิเคราะห์เหล่านี้ในน้ำปราศจากไอออน: อะราบิโนส, แรมโนส, ฟูโคส, ไซโลส, กรดกาแลกทูโรนิก (GalA), กรดกลูคูโรนิก (GlcA), แมนโนส, กลูโคส, กาแลคโตส, แลคโตส, N-อะซีติลแมนโนซามีน (manNAc), N-อะซิทิลกลูโคซามีน(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), อิโนซิทอล (มาตรฐานภายใน)มีการเตรียมสองมาตรฐานโดยการเติมสารละลายน้ำตาล 1 มก./มล. ที่แสดงในตารางที่ 1 ตัวอย่างถูกแช่แข็งและทำให้แห้งที่อุณหภูมิ -80° C จนกว่าน้ำทั้งหมดจะถูกเอาออก (ปกติประมาณ 12-18 ชั่วโมง)
เติมตัวอย่าง 100–500 µg ลงในหลอดฝาเกลียวบนเครื่องชั่งเชิงวิเคราะห์บันทึกจำนวนเงินที่เพิ่มเป็นการดีที่สุดที่จะละลายตัวอย่างในตัวทำละลายที่มีความเข้มข้นเฉพาะ และเพิ่มลงในหลอดเป็นของเหลวใช้อิโนซิทอล 1 มก./มล. 20 ไมโครลิตร เป็นมาตรฐานภายในสำหรับหลอดตัวอย่างแต่ละหลอดปริมาณมาตรฐานภายในที่เติมลงในตัวอย่างต้องเท่ากับปริมาณมาตรฐานภายในที่เติมลงในหลอดมาตรฐาน
เติมเมทานอลปราศจากน้ำ 8 มล. ลงในขวดที่มีฝาเกลียวจากนั้น สารละลาย HCl 3 N. เมทานอล 4 มล. ปิดฝาและเขย่ากระบวนการนี้ไม่ใช้น้ำ
เติมสารละลายเมทานอล HCl 1 M 500 µl ลงในตัวอย่างโอลิโกแซ็กคาไรด์และหลอด TMS มาตรฐานตัวอย่างถูกบ่มข้ามคืน (168 ชั่วโมง) ที่ 80°ซ ในบล็อกระบายความร้อนทำให้ผลิตภัณฑ์เมทาโนไลซิสแห้งที่อุณหภูมิห้องโดยใช้ท่อร่วมในการทำให้แห้งเติม MeOH 200 µl แล้วทำให้แห้งอีกครั้งกระบวนการนี้ซ้ำสองครั้งเติมเมทานอล 200 µl, pyridine 100 µl และ acetic anhydride 100 µl ลงในตัวอย่างและผสมให้เข้ากันตัวอย่างถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาทีและทำให้แห้งเติมเมทานอล 200 µl แล้วทำให้แห้งอีกครั้ง
เติม Tri-Sil 200 µl และหลอดปิดด้วยความร้อนเป็นเวลา 20 นาที80°C แล้วทำให้เย็นลงที่อุณหภูมิห้องใช้ท่อร่วมในการทำให้แห้งเพื่อทำให้ตัวอย่างแห้งมากขึ้นเป็นปริมาตรประมาณ 50 µlโปรดทราบว่าเราไม่ได้ปล่อยให้ตัวอย่างแห้งสนิท
เติมเฮกเซน 2 มล. แล้วผสมให้เข้ากันด้วยการวอร์เท็กซ์เติมใยแก้วที่ปลายปิเปต Pasteur (5-8 มม.) โดยใส่ใยแก้วที่ด้านบนของปิเปตขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 5-3/4 นิ้วตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 3000 กรัม เป็นเวลา 2 นาทีสารตกค้างที่ไม่ละลายน้ำจะตกตะกอนทำให้ตัวอย่างแห้งเหลือ 100-150 µlปริมาตรประมาณ 1 ไมโครลิตรถูกฉีดเข้าไปใน GC-MS ที่อุณหภูมิเริ่มต้นที่ 80 °C และเวลาเริ่มต้นที่ 2.0 นาที (ตารางที่ 2)