Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Nye immunologiske og massespektrometriske metoder for kompleks analyse av persistente oligosakkarider i maisstøv forbehandlet med AFEX. Lignocellulosebiomasse er et bærekraftig alternativ til fossilt brensel og er mye brukt til å utvikle bioteknologi for produksjon av produkter som mat, fôr, drivstoff og kjemikalier. Nøkkelen til disse teknologiene er utviklingen av kostnadseffektive prosesser for å omdanne komplekse karbohydrater som finnes i plantecellevegger til enkle sukkerarter som glukose, xylose og arabinose. Fordi lignocellulosebiomasse er svært sta, må den utsettes for termokjemiske behandlinger (f.eks. ammoniakkfibereksfoliering (AFEX), fortynnede syrer (DA), ioniske væsker (IL)) og biologiske behandlinger (f.eks. enzymatisk hydrolyse og mikrobiell fermentering) i kombinasjon for å oppnå det ønskede produktet. Når kommersielle soppenzymer brukes i hydrolyseprosessen, er imidlertid bare 75–85 % av de løselige sukkerartene som dannes monosakkarider, og de resterende 15–25 % er løselige, vanskelige oligosakkarider, som ikke alltid er tilgjengelige for mikroorganismer. Tidligere har vi med hell isolert og renset løselige, gjenstridige oligosakkarider ved hjelp av en kombinasjon av karbon- og kiselgurseparasjon og størrelseseksklusjonskromatografi, og også undersøkt deres enzymhemmende egenskaper. Vi har funnet ut at oligosakkarider som inneholder metylerte uronsyresubstitusjoner med høyere polymerisasjonsgrad (DP) er vanskeligere å bearbeide med kommersielle enzymblandinger enn oligosakkarider med lav DP og nøytrale oligosakkarider. Her rapporterer vi bruken av flere tilleggsmetoder, inkludert glykanprofilering ved bruk av monoklonale antistoffer (mAb) spesifikke for plantebiomasseglykaner for å karakterisere glykanbindinger i plantecellevegger og enzymatiske hydrolysater, matriksassistert laserdesorpsjonisering, time-of-flight massespektrometri. MALDI-TOF-MS) bruker strukturinformative diagnostiske topper oppnådd ved spektroskopi etter sekundær nedbrytning av negative ioner, gasskromatografi og massespektrometri (GC-MS) for å karakterisere oligosakkaridbindinger med og uten derivatisering. På grunn av den lille størrelsen på oligosakkaridene (DP 4–20), er disse molekylene vanskelige å bruke til mAb-binding og karakterisering. For å overvinne dette problemet, anvendte vi en ny biotinkonjugeringsbasert oligosakkarid-immobiliseringsmetode som med hell merket majoriteten av lav-DP-løselige oligosakkarider på mikroplateoverflaten, som deretter ble brukt i et høykapasitets mAb-system for spesifikk ligeringsanalyse. Denne nye metoden vil legge til rette for utvikling av mer avanserte høykapasitets glykomanalyser i fremtiden som kan brukes til å isolere og karakterisere oligosakkarider som finnes i biomarkører for diagnostiske formål.
Lignocellulosebiomasse, bestående av landbruks-, skogbruks-, gress- og treholdige materialer, er et potensielt råstoff for produksjon av biobaserte produkter, inkludert mat, fôr, drivstoff og kjemiske forløpere for å produsere produkter med høyere verdi1. Karbohydrater (som cellulose og hemicellulose) som finnes i plantecellevegger depolymeriseres til monosakkarider ved kjemisk prosessering og biotransformasjon (som enzymatisk hydrolyse og mikrobiell fermentering). Vanlige forbehandlinger inkluderer ammoniakkfiberekspansjon (AFEX), fortynnet syre (DA), ionisk væske (IL) og dampeksplosjon (SE), som bruker en kombinasjon av kjemikalier og varme for å redusere lignocelluloseproduksjonen ved å åpne plantecellevegger3,4. 5. Enzymatisk hydrolyse utføres ved høy fasthetsbelastning ved bruk av kommersielle aktive karbohydratholdige enzymer (CAZymer) og mikrobiell fermentering ved bruk av transgene gjær eller bakterier for å produsere biobaserte drivstoff og kjemikalier6.
CAZymer i kommersielle enzymer er sammensatt av en kompleks blanding av enzymer som synergistisk spalter komplekse karbohydrat-sukkerbindinger for å danne monosakkarider2,7. Som vi rapporterte tidligere, gjør det komplekse nettverket av aromatiske polymerer av lignin med karbohydrater dem svært vanskelige å håndtere, noe som fører til ufullstendig sukkeromdannelse, og akkumulerer 15–25 % av kjønnsoligosakkaridene som ikke produseres under enzymatisk hydrolyse av den forbehandlede biomassen. Dette er et vanlig problem med ulike forbehandlingsmetoder for biomasse. Noen årsaker til denne flaskehalsen inkluderer enzymhemming under hydrolyse, eller fravær eller lave nivåer av essensielle enzymer som kreves for å bryte sukkerbindinger i plantebiomasse. Å forstå sammensetningen og de strukturelle egenskapene til sukkerarter, slik som sukkerbindingene i oligosakkarider, vil hjelpe oss med å forbedre sukkeromdannelsen under hydrolyse, noe som gjør bioteknologiske prosesser kostnadseffektive med petroleumsavledede produkter.
Å bestemme strukturen til karbohydrater er utfordrende og krever en kombinasjon av metoder som væskekromatografi (LC)11,12, kjernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR)13, kapillærelektroforese (CE)14,15,16 og massespektrometri (MS)17. ,atten. MS-metoder som time-of-flight-massespektrometri med laserdesorpsjon og ionisering ved bruk av en matrise (MALDI-TOF-MS) er en allsidig metode for å identifisere karbohydratstrukturer. Nylig har kollisjonsindusert dissosiasjon (CID) tandem MS av natriumionaddukter blitt mest brukt for å identifisere fingeravtrykk som korresponderer med oligosakkaridfesteposisjoner, anomere konfigurasjoner, sekvenser og forgreningsposisjoner 20, 21.
Glykananalyse er et utmerket verktøy for grundig identifisering av karbohydratbindinger22. Denne metoden bruker monoklonale antistoffer (mAbs) rettet mot glykan i plantecelleveggen som sonder for å forstå komplekse karbohydratbindinger. Mer enn 250 mAbs er tilgjengelige over hele verden, designet mot forskjellige lineære og forgrenede oligosakkarider ved bruk av forskjellige sakkarider24. Flere mAbs har blitt mye brukt for å karakterisere strukturen, sammensetningen og modifikasjonene av plantecelleveggen, da det er betydelige forskjeller avhengig av plantecelletype, organ, alder, utviklingsstadium og vekstmiljø25,26. Nylig har denne metoden blitt brukt til å forstå vesikkelpopulasjoner i plante- og dyresystemer og deres respektive roller i glykantransport som bestemt av subcellulære markører, utviklingsstadier eller miljøstimuli, og for å bestemme enzymatisk aktivitet. Noen av de forskjellige strukturene til glykaner og xylaner som har blitt identifisert inkluderer pektin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglukaner (XylG), blandede bindingsglukaner (MLG), arabinoxylan (ArbX), galaktomannan (GalG), glukuronsyre-arabinoxylan (GArbX) og arabino-galaktan (ArbG)29.
Til tross for all denne forskningsinnsatsen har imidlertid bare noen få studier fokusert på arten av oligosakkarid-akkumulering under hydrolyse med høy faststoffmengde (HSL), inkludert frigjøring av oligosakkarid, endringer i oligomere kjedelengde under hydrolyse, ulike polymerer med lav DP og deres kurver. 30,31,32. Selv om glykananalyse har vist seg å være et nyttig verktøy for en omfattende analyse av glykanstrukturen, er det vanskelig å evaluere vannløselige oligosakkarider med lav DP ved hjelp av antistoffmetoder. Mindre DP-oligosakkarider med en molekylvekt på mindre enn 5–10 kDa binder seg ikke til ELISA-plater 33, 34 og vaskes bort før tilsetning av antistoff.
Her demonstrerer vi for første gang en ELISA-analyse på avidin-belagte plater ved bruk av monoklonale antistoffer, som kombinerer en ett-trinns biotinyleringsprosedyre for løselige refraktære oligosakkarider med glykomanalyse. Vår tilnærming til glykomanalyse ble validert ved MALDI-TOF-MS og GC-MS-basert analyse av komplementære oligosakkaridbindinger ved bruk av trimetylsilyl (TMS)-derivatisering av hydrolyserte sukkerblandinger. Denne innovative tilnærmingen kan utvikles som en høykapasitetsmetode i fremtiden og finne bredere anvendelse innen biomedisinsk forskning35.
Posttranslasjonelle modifikasjoner av enzymer og antistoffer, som glykosylering,36 påvirker deres biologiske aktivitet. For eksempel spiller endringer i glykosylering av serumproteiner en viktig rolle ved inflammatorisk artritt, og endringer i glykosylering brukes som diagnostiske markører37. Ulike glykaner har blitt rapportert i litteraturen å lett forekomme ved en rekke sykdommer, inkludert kroniske inflammatoriske sykdommer i mage-tarmkanalen og leveren, virusinfeksjoner, eggstokkreft, brystkreft og prostatakreft38,39,40. Å forstå strukturen til glykaner ved hjelp av antistoffbaserte glykan-ELISA-metoder vil gi ytterligere sikkerhet i sykdomsdiagnose uten bruk av komplekse MS-metoder.
Vår tidligere studie viste at sta oligosakkarider forble uhydrolysert etter forbehandling og enzymatisk hydrolyse (figur 1). I vårt tidligere publiserte arbeid utviklet vi en fastfaseekstraksjonsmetode med aktivt kull for å isolere oligosakkarider fra AFEX-forbehandlet maisstøvhydrolysat (ACSH)8. Etter innledende ekstraksjon og separasjon ble oligosakkaridene ytterligere fraksjonert ved størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) og samlet inn i rekkefølge etter molekylvekt. Sukkermonomerer og oligomerer frigjort fra ulike forbehandlinger ble analysert ved sukkersammensetningsanalyse. Når man sammenligner innholdet av sukkeroligomerer oppnådd ved ulike forbehandlingsmetoder, er tilstedeværelsen av sta oligosakkarider et vanlig problem i omdannelsen av biomasse til monosakkarider, og kan føre til en reduksjon i sukkerutbytte på minst 10–15 % og til og med opptil 18 %. Denne metoden brukes til videre storskala produksjon av oligosakkaridfraksjoner. Den resulterende ACH og dens påfølgende fraksjoner med forskjellige molekylvekter ble brukt som eksperimentelt materiale for karakterisering av oligosakkarider i dette arbeidet.
Etter forbehandling og enzymatisk hydrolyse forble persistente oligosakkarider uhydrolysert. Her er (A) en oligosakkaridseparasjonsmetode der oligosakkarider isoleres fra AFEX-forbehandlet maisstøvhydrolysat (ACSH) ved bruk av et pakket sjikt av aktivt karbon og kiselgur; (B) Metode for separasjon av oligosakkarider. Oligosakkaridene ble videre separert ved størrelseseksklusjonskromatografi (SEC); (C) Sakkaridmonomerer og oligomerer frigjort fra ulike forbehandlinger (fortynnet syre: DA, ionisk væske: IL og AFEX). Enzymatiske hydrolysebetingelser: høyt tørrstoffinnhold på 25 % (v/v) (omtrent 8 % glukaninnhold), 96 timers hydrolyse, 20 mg/g kommersiell enzyminnhold (Ctec2:Htec2:MP-forhold 2:1:1) og (D) Sukkermonomerer og oligomerer av glukose, xylose og arabinose frigjort fra AFEX-forbehandlet maisstøv (ACS).
Glykananalyse har vist seg å være et nyttig verktøy for en omfattende strukturell analyse av glykaner i ekstrakter isolert fra faste biomasserester. Vannløselige sakkarider er imidlertid underrepresentert ved bruk av denne tradisjonelle metoden41 fordi oligosakkarider med lav molekylvekt er vanskelige å immobilisere på ELISA-plater og vaskes ut før tilsetning av antistoff. Derfor ble en ett-trinns biotinyleringsmetode brukt for å belegge løselige, ikke-kompatible oligosakkarider på avidin-belagte ELISA-plater for antistoffbinding og karakterisering. Denne metoden ble testet ved bruk av vår tidligere produserte ACSH og en fraksjon basert på dens molekylvekt (eller polymerisasjonsgrad, DP). Ett-trinns biotinylering ble brukt for å øke oligosakkaridbindingsaffiniteten ved å tilsette biotin-LC-hydrazid til den reduserende enden av karbohydratet (fig. 2). I løsning reagerer hemiacetalgruppen ved den reduserende enden med hydrazidgruppen til biotin-LC-hydrazid for å danne en hydrazonbinding. I nærvær av reduksjonsmiddelet NaCNBH3 reduseres hydrazonbindingen til et stabilt biotinylert sluttprodukt. Med modifikasjonen av den sukkerreduserende enden ble binding av oligosakkarider med lav DP til ELISA-plater mulig, og i vår studie ble dette gjort på avidin-belagte plater ved bruk av glykan-målrettede mAbs.
Screening av monoklonale antistoffer basert på ELISA for biotinylerte oligosakkarider. Her (A) kombinert biotinylering av oligosakkarider og påfølgende ELISA-screening med glykan-målrettede mAb-er på NeutrAvidin-belagte plater og (B) viser en ett-trinns prosedyre for biotinylering av reaksjonsprodukter.
Avidinbelagte plater med oligosakkaridkonjugerte antistoffer ble deretter tilsatt primære og sekundære antistoffer og vasket i et lys- og tidsfølsomt medium. Etter at antistoffbindingen var fullført, tilsattes TMB-substrat for å inkubere platen. Reaksjonen ble til slutt stoppet med svovelsyre. De inkuberte platene ble analysert ved hjelp av en ELISA-leser for å bestemme bindingsstyrken til hvert antistoff for å detektere antistoffspesifikk tverrbinding. For detaljer og parametere for eksperimentet, se den tilsvarende delen «Materialer og metoder».
Vi demonstrerer nytten av denne nyutviklede metoden for spesifikke anvendelser ved å karakterisere de løselige oligosakkaridene som finnes i ACSH, så vel som i rå og rensede oligosakkaridfraksjoner isolert fra lignocellulosehydrolysater. Som vist i figur 3, er de vanligste epitopsubstituerte xylanene identifisert i ACSH ved bruk av bioacylerte glykomanalysemetoder vanligvis uronsyre (U) eller metyluronsyre (MeU) og pektinsyrearabinogalaktaner. De fleste av dem ble også funnet i vår tidligere studie om analyse av glykaner fra ikke-hydrolyserte faste stoffer (UHS)43.
Deteksjon av gjenstridige oligosakkarid-epitoper ved bruk av et monoklonalt antistoff rettet mot celleveggglykanet. Den "nøytrale" fraksjonen er ACN-fraksjonen og den "sure" fraksjonen er FA-fraksjonen. Lysere rødfarger på varmekartet indikerer høyere epitopinnhold, og lysere blåfarger indikerer en blank bakgrunn. Fargeverdiene på skalaen er basert på rå OD-verdier for formuleringer N=2. De viktigste epitopene som gjenkjennes av antistoffene vises til høyre.
Disse ikke-cellulosestrukturene kunne ikke spaltes av de vanligste cellulasene og hemicellulasene i den testede kommersielle enzymblandingen, som inkluderer de mest brukte kommersielle enzymene. Derfor kreves det nye hjelpeenzymer for hydrolysen deres. Uten de nødvendige ikke-cellulose-tilleggsenzymene forhindrer disse ikke-cellulosebindingene fullstendig omdannelse til monosakkarider, selv om deres opprinnelige sukkerpolymerer hydrolyseres i stor grad til kortere fragmenter og løses opp ved bruk av kommersielle enzymblandinger.
Videre studier av signalfordeling og bindingsstyrke viste at bindingsepitoper var lavere i sukkerfraksjoner med høy DP (A, B, C, DP opptil 20+) enn i fraksjoner med lav DP (D, E, F, DP) i dimerer (fig. 1). Syrefragmenter er vanligere i ikke-celluloseepitoper enn nøytrale fragmenter. Disse fenomenene er i samsvar med mønsteret observert i vår tidligere studie, hvor høy DP og syreenheter var mer motstandsdyktige mot enzymatisk hydrolyse. Derfor kan tilstedeværelsen av ikke-celluloseglykanepitoper og U- og MeU-substitusjoner i stor grad bidra til stabiliteten til oligosakkaridene. Det bør bemerkes at bindings- og deteksjonseffektivitet kan være problematisk for oligosakkarider med lav DP, spesielt hvis epitopen er et dimerisk eller trimerisk oligosakkarid. Dette kan testes ved bruk av kommersielle oligosakkarider av forskjellige lengder, som hver bare inneholder én epitop som binder seg til et spesifikt mAb.
Bruken av strukturspesifikke antistoffer avdekket dermed visse typer gjenstridige bindinger. Avhengig av typen antistoff som brukes, det passende ligeringsmønsteret og styrken på signalet det produserer (mest og minst rikelig), kan nye enzymer identifiseres og tilsettes semi-kvantitativt til enzymblandingen for mer fullstendig glykokonvertering. Ved å ta analysen av ACSH-oligosakkarider som et eksempel, kan vi lage en database med glykanbindinger for hvert biomassemateriale. Det bør bemerkes her at den forskjellige affiniteten til antistoffer bør tas i betraktning, og hvis deres affinitet er ukjent, vil dette skape visse vanskeligheter når man sammenligner signalene til forskjellige antistoffer. I tillegg kan sammenligning av glykanbindinger fungere best mellom prøver for det samme antistoffet. Disse gjenstridige bindingene kan deretter kobles til CAZyme-databasen, hvorfra vi kan identifisere enzymer, velge kandidatenzymer og teste for bindingsbrytende enzymer, eller utvikle mikrobielle systemer for å uttrykke disse enzymene for bruk i bioraffinerier44.
For å evaluere hvordan immunologiske metoder utfyller alternative metoder for karakterisering av oligosakkarider med lav molekylvekt som finnes i lignocellulosehydrolysater, utførte vi MALDI (fig. 4, S1-S8) og analyse av TMS-avledede sakkarider basert på GC-MS på samme panel (fig. 5) oligosakkariddel. MALDI brukes til å sammenligne om massefordelingen av oligosakkaridmolekyler samsvarer med den tiltenkte strukturen. Fig. 4 viser MC for de nøytrale komponentene ACN-A og ACN-B. ACN-A-analyse bekreftet et område av pentosesukkerarter fra DP 4–8 (fig. 4) til DP 22 (fig. S1), hvis vekter tilsvarer MeU-xylan-oligosakkarider. ACN-B-analyse bekreftet pentose- og glukoxylanserien med DP 8–15. I tilleggsmateriale som figur S3 viser FA-C-surmolekylmassefordelingskart et utvalg av (Me)U-substituerte pentosesukkerarter med en DP på ​​8–15 som er konsistente med de substituerte xylanene funnet i ELISA-basert mAb-screening. Epitopene er konsistente.
MALDI-MS-spektrum av løselige, ikke-kompatible oligosakkarider tilstede i ACS. Her (A) ACN-A-fraksjoner med lavt vektområde som inneholder metylert uronsyre (DP 4-8) substituerte med glukuroksylan-oligosakkarider og (B) ACN-B-xylan og metylerte uronsyre-oligosakkarider substituert med glukuroksylan (DP 8-15).
Analyse av sammensetningen av glykanresten i refraktære oligosakkarider. Her (A) TMS-sakkaridsammensetningen av forskjellige oligosakkaridfraksjoner oppnådd ved hjelp av GC-MS-analyse. (B) Strukturer av forskjellige TMS-avledede sukkerarter som finnes i oligosakkarider. ACN – acetonitrilfraksjon som inneholder nøytrale oligosakkarider og FA – ferulsyrefraksjon som inneholder syre-oligosakkarider.
En annen interessant konklusjon ble trukket fra LC-MS-analysen av oligosakkaridfraksjonen, som vist i figur S9 (metoder kan sees i det elektroniske tilleggsmaterialet). Fragmenter av heksose- og -OAc-grupper ble gjentatte ganger observert under ligering av ACN-B-fraksjonen. Dette funnet bekrefter ikke bare fragmenteringen observert i glykom- og MALDI-TOF-analyse, men gir også ny informasjon om potensielle karbohydratderivater i forbehandlet lignocellulosebiomasse.
Vi analyserte også sukkersammensetningen i oligosakkaridfraksjonen ved hjelp av TMS-sukkerderivatisering. Ved hjelp av GC-MS bestemte vi sammensetningen av nevrale (ikke-derivative) og sure sukkerarter (GluA og GalA) i oligosakkaridfraksjonen (fig. 5). Glukuronsyre finnes i de sure komponentene C og D, mens galakturonsyre finnes i de sure komponentene A og B, som begge er komponenter med høy DP i sure sukkerarter. Disse resultatene bekrefter ikke bare våre ELISA- og MALDI-data, men er også i samsvar med våre tidligere studier av oligosakkaridakkumulering. Derfor mener vi at moderne immunologiske metoder som bruker biotinylering av oligosakkarider og påfølgende ELISA-screening er tilstrekkelige for å oppdage løselige, gjenstridige oligosakkarider i ulike biologiske prøver.
Siden ELISA-baserte mAb-screeningsmetoder har blitt validert av flere forskjellige metoder, ønsket vi å utforske potensialet til denne nye kvantitative metoden ytterligere. To kommersielle oligosakkarider, xyloheksasakkarid-oligosakkarid (XHE) og 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ble kjøpt inn og testet ved hjelp av en ny mAb-tilnærming rettet mot celleveggglykanen. Figur 6 viser en lineær korrelasjon mellom det biotinylerte bindingssignalet og logaritmisk konsentrasjon av oligosakkaridkonsentrasjon, noe som tyder på en mulig Langmuir-adsorpsjonsmodell. Blant mAb-ene korrelerte CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 og CCRC-M151 med XHE, og CCRC-M108, CCRC-M109 og LM11 korrelerte med A2XX over et område fra 1 nm til 100 nano. På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av antistoffer under eksperimentet, ble det utført begrensede eksperimenter med hver oligosakkaridkonsentrasjon. Det bør bemerkes her at noen antistoffer reagerer svært forskjellig på det samme oligosakkaridet som substrat, antagelig fordi de binder seg til litt forskjellige epitoper og kan ha svært ulik bindingsaffinitet. Mekanismene og implikasjonene for nøyaktig epitopidentifisering vil være mye mer komplekse når den nye mAb-tilnærmingen brukes på virkelige prøver.
To kommersielle oligosakkarider ble brukt til å bestemme deteksjonsområdet for ulike glykan-målrettede mAb-er. Her indikerer lineære korrelasjoner med log-konsentrasjonen av oligosakkaridkonsentrasjonen Langmuir-adsorpsjonsmønstre for (A) XHE med mAb og (B) A2XX med mAb. De tilsvarende epitoper indikerer strukturene til de kommersielle oligosakkaridene som ble brukt som substrater i analysen.
Bruken av glykan-målrettede monoklonale antistoffer (glykokomisk analyse eller ELISA-basert mAb-screening) er et kraftig verktøy for grundig karakterisering av de fleste av de viktigste celleveggglykanene som utgjør plantebiomasse. Klassisk glykananalyse karakteriserer imidlertid bare større celleveggglykaner, ettersom de fleste oligosakkarider ikke immobiliseres effektivt på ELISA-plater. I denne studien ble AFEX-forbehandlet maisstøv enzymatisk hydrolysert ved et høyt tørrstoffinnhold. Sukkeranalyse ble brukt til å bestemme sammensetningen av gjenstridige celleveggkarbohydrater i hydrolysatet. Imidlertid er mAb-analyse av mindre oligosakkarider i hydrolysater undervurdert, og ytterligere verktøy er nødvendig for å effektivt immobilisere oligosakkarider på ELISA-plater.
Vi rapporterer her en ny og effektiv oligosakkarid-immobiliseringsmetode for mAb-screening ved å kombinere oligosakkaridbiotinylering etterfulgt av ELISA-screening på NeutrAvidin™-belagte plater. De immobiliserte biotinylerte oligosakkaridene viste tilstrekkelig affinitet for antistoffet til å muliggjøre rask og effektiv deteksjon av gjenstridige oligosakkarider. Analyse av sammensetningen av disse gjenstridige oligosakkaridene basert på massespektrometri bekreftet resultatene av denne nye tilnærmingen til immunscreening. Dermed viser disse studiene at kombinasjonen av oligosakkaridbiotinylering og ELISA-screening med glykan-målrettede monoklonale antistoffer kan brukes til å detektere tverrbindinger i oligosakkarider og kan brukes i stor grad i andre biokjemiske studier som karakteriserer strukturen til oligosakkarider.
Denne biotinbaserte glykanprofileringsmetoden er den første rapporten som er i stand til å undersøke de gjenstridige karbohydratbindingene til løselige oligosakkarider i plantebiomasse. Dette bidrar til å forstå hvorfor noen deler av biomassen er så gjenstridige når det gjelder produksjon av biodrivstoff. Denne metoden fyller et viktig gap i glykomanalysemetoder og utvider anvendelsen til et bredere spekter av substrater utover planteoligosakkarider. I fremtiden kan vi bruke robotikk til biotinylering og bruke metoden vi har utviklet for høykapasitetsanalyse av prøver ved hjelp av ELISA.
Maisstrå (CS) dyrket fra Pioneer 33A14 hybridfrø ble høstet i 2010 fra Kramer Farms i Ray, Colorado. Med grunneierens tillatelse kan denne biomassen brukes til forskning. Prøvene ble oppbevart tørt < 6 % fuktighet i glidelåsposer i romtemperatur. Prøvene ble oppbevart tørt < 6 % fuktighet i glidelåsposer i romtemperatur. Tilbyr brukere med elektrisitet < 6 % av forbrukere med forbruksbaserte systemer. Prøvene ble oppbevart tørt ved <6 % luftfuktighet i poser med glidelås ved romtemperatur.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Optimal drift av forbruksvarer med < 6 %. Prøvene oppbevares i glidelåsposer ved romtemperatur med en fuktighet på < 6 %.Studien var i samsvar med lokale og nasjonale retningslinjer. Sammensetningsanalyse ble utført ved hjelp av NREL-protokollen. Sammensetningen inneholdt 31,4 % glukan, 18,7 % xylan, 3,3 % arabinan, 1,2 % galaktan, 2,2 % acetyl, 14,3 % lignin, 1,7 % protein og 13,4 % aske.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) er en kompleks blanding av cellulase, β-glukosidase og Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) fra Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg protein/ml), en kompleks blanding av pektinnedbrytende enzymer, ble donert av DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Enzymproteinkonsentrasjoner ble bestemt ved å estimere proteininnholdet (og trekke fra bidraget av ikke-proteinnitrogen) ved bruk av Kjeldahl-nitrogenanalyse (AOAC-metode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Kiselgur 545 ble kjøpt fra EMD Millipore (Billerica, MA). Aktivt kull (DARCO, 100 mesh granulat), Avicel (PH-101), bøk xylan og alle andre kjemikalier ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-forbehandling ble utført ved GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Forbehandlingen ble utført ved 140 °C i 15 minutter. 46 oppholdstid ved et forhold på 1:1 mellom vannfri ammoniakk og biomasse ved 60 % (w/w) belastning i en benktop-batchreaktor i rustfritt stål (Parr Instruments Company). Det tok 30 minutter. Reaktoren ble brakt til 140 °C, og ammoniakken ble raskt frigjort, slik at biomassen raskt returnerte til romtemperatur. Sammensetningen av AFEX-forbehandlet maisstøv (ACS) var lik den til ubehandlet maisstøv (UT-CS).
ACSH med høyt tørrstoffinnhold 25 % (w/w) (omtrent 8 % dekstranmengde) ble fremstilt som utgangsmateriale for storskalaproduksjon av oligosakkarider. Enzymatisk hydrolyse av ACS ble utført ved bruk av en kommersiell enzymblanding inkludert Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (i forbehandlet biomasse), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan og Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg protein/g dekstran. Enzymatisk hydrolyse ble utført i en 5-liters bioreaktor med et arbeidsvolum på 3 liter, pH 4,8, 50 °C og 250 rpm. Etter hydrolyse i 96 timer ble hydrolysatet samlet opp ved sentrifugering ved 6000 rpm i 30 minutter og deretter ved 14000 rpm i 30 minutter for å fjerne uhydrolyserte faste stoffer. Hydrolysatet ble deretter sterilfiltrert gjennom et 0,22 mm filterbegerglass. Det filtrerte hydrolysatet ble lagret i sterile flasker ved 4 °C og deretter fraksjonert på kull.
Analyse av sammensetningen av ekstraktbaserte biomasseprøver i henhold til NRELs laboratorieanalyseprosedyrer: klargjøring av prøver for sammensetningsanalyse (NREL/TP-510-42620) og bestemmelse av strukturelle karbohydrater og lignin i biomasse (NREL/TP-510–42618)47.
Oligosakkaridanalyse av hydrolysatstrømmen ble utført på en 2 ml skala ved bruk av en autoklavbasert syrehydrolysemetode. Bland hydrolysatprøven med 69,7 µl 72 % svovelsyre i et 10 ml skrukork-kulturrør og inkuber i 1 time på en benk ved 121 °C, avkjøl på is og filtrer over i et høytrykksvæskekromatografi-ampulle (HPLC). Konsentrasjonen av oligosakkarider ble bestemt ved å subtrahere konsentrasjonen av monosakkarider i den ikke-hydrolyserte prøven fra den totale sukkerkonsentrasjonen i den syrehydrolyserte prøven.
Glukose-, xylose- og arabinosekonsentrasjoner i den syrehydrolyserte biomassen ble analysert ved hjelp av et Shimadzu HPLC-system utstyrt med en autosampler, kolonnevarmer, isokratisk pumpe og brytningsindeksdetektor på en Bio-Rad Aminex HPX-87H-kolonne. Kolonnen ble holdt ved 50 °C og eluert med 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 i vann.
Hydrolysatsupernatanten ble fortynnet og analysert for monomer- og oligosakkaridinnhold. Monomere sukkerarter oppnådd etter enzymatisk hydrolyse ble analysert ved HPLC utstyrt med en Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P-kolonne og en askebeskyttelseskolonne. Kolonnetemperaturen ble holdt ved 80 °C, vann ble brukt som mobil fase med en strømningshastighet på 0,6 ml/min. Oligosakkarider ble bestemt ved hydrolyse i fortynnet syre ved 121 °C i henhold til metodene beskrevet i ref. 41, 48, 49.
Sakkaridanalyse ble utført på rå, AFEX-forbehandlede og alle ikke-hydrolyserte biomasserester (inkludert produksjon av serielle celleveggekstrakter og deres mAb-screening) ved bruk av tidligere beskrevne prosedyrer 27, 43, 50, 51. For glykomanalyse fremstilles alkoholuløselige rester av plantecelleveggmateriale fra biomasserester og underkastes serieekstraksjon med stadig mer aggressive reagenser som ammoniumoksalat (50 mM), natriumkarbonat (50 mM og 0,5 % w/v), CON. (1M og 4M, begge med 1 % w/v natriumborhydrid) og syrekloritt som tidligere beskrevet 52,53. Ekstraktene ble deretter utsatt for ELISA mot et komplekst panel av mAb50-er rettet mot celleveggglykanen, og mAb-bindingsreaksjonene ble presentert som et varmekart. mAb-er rettet mot plantecelleveggglykan ble kjøpt fra laboratorielagre (CCRC-, JIM- og MAC-serien).
Ett-trinns biotinylering av oligosakkarider. Konjugeringen av karbohydrater med biotin-LC-hydrazid ble utført ved hjelp av følgende prosedyre. Biotin-LC-hydrazid (4,6 mg/12 μmol) ble løst opp i dimetylsulfoksid (DMSO, 70 μl) ved kraftig omrøring og oppvarming ved 65 °C i 1 minutt. Iseddik (30 μl) ble tilsatt, og blandingen ble helt over natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 μmol) og fullstendig løst opp etter oppvarming ved 65 °C i omtrent 1 minutt. Deretter ble fra 5 til 8 μl av reaksjonsblandingen tilsatt det tørkede oligosakkaridet (1-100 nmol) for å oppnå et 10 ganger eller mer molart overskudd av markøren i forhold til den reduserende enden. Reaksjonen ble utført ved 65 °C i 2 timer, hvoretter prøvene ble umiddelbart renset. Natriumcyanoborhydrid ble ikke brukt i merkeforsøkene uten reduksjon, og prøvene ble reagert ved 65 °C i 2,5 timer.
ELISA-belegg og vask av prøver av biotinylerte oligosakkarider. 25 μl biotinylerte prøver (100 μl av hver konsentrerte prøve fortynnet i 5 ml 0,1 M Tris-bufferløsning (TBS)) ble tilsatt hver brønn i den avidinbelagte platen. Kontrollbrønnene ble belagt med 50 μl biotin i en konsentrasjon på 10 μg/ml i 0,1 M TBS. Avionisert vann ble brukt som belegg for blindmålinger. Tabletten ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur i mørket. Vask platen 3 ganger med 0,1 % skummet melk i 0,1 M TBS ved bruk av program nr. 11 for Grenier flat 3A.
Tilsetning og vask av primære antistoffer. Tilsett 40 µl primært antistoff til hver brønn. Inkuber mikroplaten i 1 time ved romtemperatur i mørket. Platene ble deretter vasket 3 ganger med 0,1 % melk i 0,1 M TBS ved bruk av vaskeprogram nr. 11 for Grenier Flat 3A.
Tilsett sekundært antistoff og vask. Tilsett 50 µl sekundært mus/rotte-antistoff (fortynnet 1:5000 i 0,1 % melk i 0,1 M TBS) til hver brønn. Inkuber mikroplaten i 1 time ved romtemperatur i mørket. Mikroplatene ble deretter vasket 5 ganger med 0,1 % melk i 0,1 M TBS ved bruk av Grenier Flat 5A platevaskeprogram nr. 12.
Tilsetning av substrat. Tilsett 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametylbenzidin (TMB) til basissubstratet (ved å tilsette 2 dråper buffer, 3 dråper TMB, 2 dråper hydrogenperoksid til 15 ml avionisert vann). Klargjør TMB-substratet og virvles før bruk). Inkuber mikroplaten ved romtemperatur i 30 minutter. I mørket.
Fullfør trinnet og les av tabletten. Tilsett 50 µl 1 N svovelsyre til hver brønn og registrer absorbansen fra 450 til 655 nm ved hjelp av en ELISA-avleser.
Lag 1 mg/ml løsninger av disse analyttene i avionisert vann: arabinose, rhamnose, fukose, xylose, galakturonsyre (GalA), glukuronsyre (GlcA), mannose, glukose, galaktose, laktose, N-acetylmannosamin (manNAc), N-acetylglukosamin (glcNAc), N-acetylgalaktosamin (galNAc), inositol (intern standard). To standarder ble fremstilt ved å tilsette 1 mg/ml sukkerløsningene vist i tabell 1. Prøvene fryses og frysetørkes ved -80 °C til alt vann er fjernet (vanligvis ca. 12–18 timer).
Tilsett 100–500 µg prøve til skrukorkrør på en analysevekt. Noter mengden som er tilsatt. Det er best å løse opp prøven i en spesifikk konsentrasjon av løsemiddel og tilsette den til røret som en flytende alikvot. Bruk 20 µl av 1 mg/ml inositol som intern standard for hvert prøverør. Mengden intern standard som tilsettes prøven må være den samme som mengden intern standard som tilsettes standardrøret.
Tilsett 8 ml vannfri metanol til et hetteglass med skrukork. Deretter tilsettes 4 ml 3 N metanolisk HCl-løsning, lukkes og ristes. Denne prosessen bruker ikke vann.
Tilsett 500 µl 1 M HCl-metanolløsning til oligosakkaridprøvene og standard TMS-rør. Prøvene ble inkubert over natten (168 timer) ved 80 °C i en termisk blokk. Tørk metanolyseproduktet ved romtemperatur ved hjelp av en tørkemanifold. Tilsett 200 µl MeOH og tørk igjen. Denne prosessen gjentas to ganger. Tilsett 200 µl metanol, 100 µl pyridin og 100 µl eddiksyreanhydrid til prøven og bland godt. Prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter og tørket. Tilsett 200 µl metanol og tørk igjen.
Tilsett 200 µl Tri-Sil og varm på røret med kork i 20 minutter. La det varmes opp til 80 °C, og avkjøles deretter til romtemperatur. Bruk en tørkemanifold til å tørke prøven ytterligere til et volum på omtrent 50 µl. Det er viktig å merke seg at vi ikke lot prøvene tørke helt.
Tilsett 2 ml heksan og bland godt ved å virvle. Fyll spissene på Pasteur-pipetter (5–8 mm) med et stykke glassull ved å sette glassullen oppå en pipette med en diameter på 5,3/4 tommer. Prøvene ble sentrifugert ved 3000 g i 2 minutter. Eventuelle uoppløselige rester utfelles. Tørk prøven til 100–150 µl. Et volum på omtrent 1 µl ble injisert i GC-MS ved en starttemperatur på 80 °C og en starttid på 2,0 minutter (tabell 2).