Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Nye immunologiske og massespektrometriske metoder for kompleks analyse av persistente oligosakkarider i maisstover forbehandlet med AFEX.Lignocelluloseholdig biomasse er et bærekraftig alternativ til fossilt brensel og brukes mye til å utvikle bioteknologier for produksjon av produkter som mat, fôr, drivstoff og kjemikalier.Nøkkelen til disse teknologiene er utviklingen av kostnadskonkurransedyktige prosesser for å konvertere komplekse karbohydrater som finnes i plantecellevegger til enkle sukkerarter som glukose, xylose og arabinose.Fordi lignocelluloseholdig biomasse er svært gjenstridig, må den utsettes for termokjemiske behandlinger (f.eks. ammoniakkfibereksfoliering (AFEX), fortynnede syrer (DA), ioniske væsker (IL)) og biologiske behandlinger (f.eks. enzymatisk hydrolyse og mikrobiell gjæring) i kombinasjon for å oppnå ønsket produkt..Men når kommersielle soppenzymer brukes i hydrolyseprosessen, er bare 75-85% av de løselige sukkerene som dannes monosakkarider, og de resterende 15-25% er løselige, vanskelige oligosakkarider, som ikke alltid er tilgjengelige for mikroorganismer.Tidligere har vi vellykket isolert og renset oppløselige gjenstridige oligosakkarider ved å bruke en kombinasjon av karbon- og diatoméjordseparasjon og størrelseseksklusjonskromatografi, og også undersøkt deres enzymhemmende egenskaper.Vi har funnet at oligosakkarider som inneholder høyere grad av polymerisasjon (DP) metylerte uronsyresubstitusjoner er vanskeligere å behandle med kommersielle enzymblandinger enn lav-DP og nøytrale oligosakkarider.Her rapporterer vi bruken av flere tilleggsmetoder, inkludert glykanprofilering ved bruk av monoklonale antistoffer (mAbs) spesifikke for plantebiomasseglykaner for å karakterisere glykanbindinger i plantecellevegger og enzymatiske hydrolysater, matriseassistert laserdesorpsjonionisering, time-of-flight massespektrometri..MALDI-TOF-MS) bruker strukturinformative diagnostiske topper oppnådd ved spektroskopi etter sekundært henfall av negative ioner, gasskromatografi og massespektrometri (GC-MS) for å karakterisere oligosakkaridbindinger med og uten derivatisering.På grunn av den lille størrelsen på oligosakkaridene (DP 4–20), er disse molekylene vanskelige å bruke for mAb-binding og karakterisering.For å overvinne dette problemet brukte vi en ny biotinkonjugasjonsbasert oligosakkarid-immobiliseringsmetode som vellykket merket flertallet av lav-DP-løselige oligosakkarider på mikroplateoverflaten, som deretter ble brukt i et høykapasitets mAb-system for spesifikk ligasjonsanalyse.Denne nye metoden vil lette utviklingen av mer avanserte glykomanalyser med høy gjennomstrømning i fremtiden som kan brukes til å isolere og karakterisere oligosakkarider som finnes i biomarkører for diagnostiske formål.
Lignocelluloseholdig biomasse, sammensatt av landbruk, skogbruk, gress og trematerialer, er et potensielt råmateriale for produksjon av biobaserte produkter, inkludert mat, fôr, drivstoff og kjemiske forløpere for å produsere produkter med høyere verdi1.Karbohydrater (som cellulose og hemicellulose) som finnes i plantecellevegger, depolymeriseres til monosakkarider ved kjemisk prosessering og biotransformasjon (som enzymatisk hydrolyse og mikrobiell gjæring).Vanlige forbehandlinger inkluderer ammoniakkfiberekspansjon (AFEX), fortynnet syre (DA), ionisk væske (IL) og dampeksplosjon (SE), som bruker en kombinasjon av kjemikalier og varme for å redusere lignocelluloseproduksjonen ved å åpne plantecellevegger3,4.stoffets stahet, 5. Enzymatisk hydrolyse utføres ved høy tørrstoffmengde ved bruk av kommersielle enzymer som inneholder aktive karbohydrater (CAZymer) og mikrobiell gjæring ved bruk av transgene gjær eller bakterier for å produsere biobasert brensel og kjemikalier 6 .
CAZymer i kommersielle enzymer er sammensatt av en kompleks blanding av enzymer som synergistisk spalter komplekse karbohydrat-sukkerbindinger for å danne monosakkarider2,7.Som vi rapporterte tidligere, gjør det komplekse nettverket av aromatiske polymerer av lignin med karbohydrater dem svært vanskelige å behandle, noe som fører til ufullstendig sukkeromdannelse, og akkumulerer 15-25% av sex-oligosakkarider som ikke produseres under enzymatisk hydrolyse av den forbehandlede biomassen.Dette er et vanlig problem med ulike biomasseforbehandlingsmetoder.Noen årsaker til denne flaskehalsen inkluderer enzymhemming under hydrolyse, eller fravær eller lave nivåer av essensielle enzymer som kreves for å bryte sukkerbindinger i plantebiomasse.Å forstå sammensetningen og de strukturelle egenskapene til sukker, som sukkerbindingene i oligosakkarider, vil hjelpe oss med å forbedre sukkeromdannelsen under hydrolyse, noe som gjør bioteknologiske prosesser kostnadskonkurransedyktige med petroleumsavledede produkter.
Å bestemme strukturen til karbohydrater er utfordrende og krever en kombinasjon av metoder som væskekromatografi (LC)11,12, kjernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR)13, kapillærelektroforese (CE)14,15,16 og massespektrometri (MS)17.,atten.MS-metoder som time-of-flight massespektrometri med laserdesorpsjon og ionisering ved bruk av en matrise (MALDI-TOF-MS) er en allsidig metode for å identifisere karbohydratstrukturer.Nylig har Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS av natriumionaddukter blitt mest brukt for å identifisere fingeravtrykk som tilsvarer oligosakkaridfesteposisjoner, anomere konfigurasjoner, sekvenser og forgreningsposisjoner 20, 21.
Glykananalyse er et utmerket verktøy for dybdeidentifikasjon av karbohydratbindinger22.Denne metoden bruker monoklonale antistoffer (mAbs) rettet mot plantecelleveggglykan som prober for å forstå komplekse karbohydratbindinger.Mer enn 250 mAbs er tilgjengelig over hele verden, designet mot ulike lineære og forgrenede oligosakkarider ved bruk av ulike sakkarider24.Flere mAbs har blitt mye brukt for å karakterisere strukturen, sammensetningen og modifikasjonene av plantecelleveggen, da det er betydelige forskjeller avhengig av plantecelletype, organ, alder, utviklingsstadium og vekstmiljø25,26.Mer nylig har denne metoden blitt brukt til å forstå vesikkelpopulasjoner i plante- og dyresystemer og deres respektive roller i glykantransport som bestemt av subcellulære markører, utviklingsstadier eller miljøstimuli, og for å bestemme enzymatisk aktivitet.Noen av de forskjellige strukturene til glykaner og xylaner som er identifisert inkluderer pektin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglukaner (XylG), blandede bindingsglukaner (MLG), arabinoksylan (ArbX), galaktomannan (GalG), glukuronsyre-arabinoksylan (GArbinoX) og 2-galanar.
Til tross for all denne forskningsinnsatsen, har imidlertid bare noen få studier fokusert på arten av oligosakkaridakkumulering under hydrolyse med høy faststoffbelastning (HSL), inkludert frigjøring av oligosakkarid, endringer i oligomere kjedelengde under hydrolyse, forskjellige polymerer med lav DP og deres kurver.fordelinger 30,31,32.I mellomtiden, selv om glykananalyse har vist seg å være et nyttig verktøy for en omfattende analyse av glykanstruktur, er det vanskelig å evaluere vannløselige lav-DP-oligosakkarider ved bruk av antistoffmetoder.Mindre DP-oligosakkarider med en molekylvekt på mindre enn 5-10 kDa binder seg ikke til ELISA-plater 33, 34 og vaskes bort før antistofftilsetning.
Her demonstrerer vi for første gang en ELISA-analyse på avidinbelagte plater ved bruk av monoklonale antistoffer, og kombinerer en ett-trinns biotinyleringsprosedyre for løselige ildfaste oligosakkarider med glykomanalyse.Vår tilnærming til glykomanalyse ble validert av MALDI-TOF-MS og GC-MS basert analyse av komplementære oligosakkaridbindinger ved bruk av trimetylsilyl (TMS) derivatisering av hydrolyserte sukkersammensetninger.Denne innovative tilnærmingen kan utvikles som en høykapasitetsmetode i fremtiden og finne bredere anvendelse i biomedisinsk forskning35.
Post-translasjonelle modifikasjoner av enzymer og antistoffer, slik som glykosylering,36 påvirker deres biologiske aktivitet.For eksempel spiller endringer i glykosylering av serumproteiner en viktig rolle ved inflammatorisk artritt, og endringer i glykosylering brukes som diagnostiske markører37.Ulike glykaner er rapportert i litteraturen å lett opptre i en rekke sykdommer, inkludert kroniske inflammatoriske sykdommer i mage-tarmkanalen og leveren, virusinfeksjoner, eggstokkreft, brystkreft og prostatakreft38,39,40.Å forstå strukturen til glykaner ved bruk av antistoffbaserte glykan ELISA-metoder vil gi ytterligere tillit til sykdomsdiagnostikk uten bruk av komplekse MS-metoder.
Vår forrige studie viste at gjenstridige oligosakkarider forble uhydrolyserte etter forbehandling og enzymatisk hydrolyse (figur 1).I vårt tidligere publiserte arbeid utviklet vi en fastfaseekstraksjonsmetode med aktivt kull for å isolere oligosakkarider fra AFEX-forbehandlet maisstoverhydrolysat (ACSH)8.Etter innledende ekstraksjon og separasjon ble oligosakkaridene ytterligere fraksjonert ved størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) og samlet i rekkefølge etter molekylvekt.Sukkermonomerer og -oligomerer frigjort fra forskjellige forbehandlinger ble analysert ved sukkersammensetningsanalyse.Når man sammenligner innholdet av sukkeroligomerer oppnådd ved ulike forbehandlingsmetoder, er tilstedeværelsen av gjenstridige oligosakkarider et vanlig problem ved konvertering av biomasse til monosakkarider og kan føre til en reduksjon i sukkerutbytte på minst 10-15 % og til og med opptil 18 %.OSS.Denne metoden brukes for videre produksjon i stor skala av oligosakkaridfraksjoner.Den resulterende ACH og dens påfølgende fraksjoner med forskjellige molekylvekter ble brukt som eksperimentelt materiale for karakterisering av oligosakkarider i dette arbeidet.
Etter forbehandling og enzymatisk hydrolyse forble persistente oligosakkarider uhydrolyserte.Her (A) er en oligosakkarid-separasjonsmetode der oligosakkarider isoleres fra AFEX-forbehandlet maisstoverhydrolysat (ACSH) ved bruk av et pakket lag av aktivert karbon og diatoméjord;(B) Metode for separering av oligosakkarider.Oligosakkaridene ble ytterligere separert ved størrelseseksklusjonskromatografi (SEC);(C) Sakkaridmonomerer og -oligomerer frigjort fra forskjellige forbehandlinger (fortynnet syre: DA, ionisk væske: IL og AFEX).Enzymatiske hydrolyseforhold: høy tørrstoffbelastning på 25 % (vekt/vekt) (omtrent 8 % glukanbelastning), 96 timers hydrolyse, 20 mg/g kommersiell enzymbelastning (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1-forhold) og (D) Sukkermonomerer og oligomerer av glukose, preosexylose-frigitt AF-korn og EX stover-frigitt fra AF.
Glykananalyse har vist seg å være et nyttig verktøy for en omfattende strukturell analyse av glykaner i ekstrakter isolert fra faste biomasserester.Imidlertid er vannløselige sakkarider underrepresentert ved bruk av denne tradisjonelle metoden41 fordi lavmolekylære oligosakkarider er vanskelige å immobilisere på ELISA-plater og vaskes ut før antistofftilsetning.For antistoffbinding og karakterisering ble derfor en ett-trinns biotinyleringsmetode brukt for å belegge løselige, ikke-kompatible oligosakkarider på avidin-belagte ELISA-plater.Denne metoden ble testet ved å bruke vår tidligere produserte ACSH og en fraksjon basert på dens molekylvekt (eller polymerisasjonsgrad, DP).Ett-trinns biotinylering ble brukt for å øke oligosakkaridbindingsaffiniteten ved å tilsette biotin-LC-hydrazid til den reduserende enden av karbohydratet (fig. 2).I løsning reagerer hemiacetalgruppen i den reduserende enden med hydrazidgruppen til biotin-LC-hydrazid for å danne en hydrazonbinding.I nærvær av reduksjonsmidlet NaCNBH3 reduseres hydrazonbindingen til et stabilt biotinylert sluttprodukt.Med modifiseringen av den sukkerreduserende enden ble binding av lav-DP-oligosakkarider til ELISA-plater mulig, og i vår studie ble dette gjort på avidin-belagte plater ved bruk av glykanmålrettede mAbs.
Screening av monoklonale antistoffer basert på ELISA for biotinylerte oligosakkarider.Her (A) kombinert biotinylering av oligosakkarider og påfølgende ELISA-screening med glykanmålrettede mAbs på NeutrAvidin-belagte plater og (B) viser en ett-trinns prosedyre for biotinylering av reaksjonsprodukter.
Avidin-belagte plater med oligosakkarid-konjugerte antistoffer ble deretter tilsatt primære og sekundære antistoffer og vasket i et lys- og tidsfølsomt medium.Etter at antistoffbindingen er fullført, tilsett TMB-substrat for å inkubere platen.Reaksjonen ble til slutt stoppet med svovelsyre.De inkuberte platene ble analysert ved bruk av en ELISA-leser for å bestemme bindingsstyrken til hvert antistoff for å detektere antistoffspesifikk kryssbinding.For detaljer og parametere for eksperimentet, se den tilsvarende delen "Materialer og metoder".
Vi demonstrerer nytten av denne nyutviklede metoden for spesifikke bruksområder ved å karakterisere de løselige oligosakkaridene som er tilstede i ACSH, så vel som i rå og rensede oligosakkaridfraksjoner isolert fra lignocellulosehydrolysater.Som vist i figur 3 er de vanligste epitop-substituerte xylanene identifisert i ACSH ved bruk av bioacylerte glykomanalysemetoder vanligvis uroniske (U) eller metyluroniske (MeU) og pektiske arabinogalaktaner.De fleste av dem ble også funnet i vår tidligere studie om analyse av glykaner av ikke-hydrolyserte faste stoffer (UHS)43.
Påvisning av gjenstridige oligosakkaridepitoper ved bruk av et monoklonalt antistoff rettet mot celleveggglykanen.Den "nøytrale" fraksjonen er ACN-fraksjonen og den "sure" fraksjonen er FA-fraksjonen.Lysere rødt på varmekartet indikerer høyere epitopinnhold, og lysere blåfarger indikerer en tom bakgrunn.Fargeverdier på skalaen er basert på rå OD-verdier for formuleringer N=2.Hovedepitopene gjenkjent av antistoffene er vist til høyre.
Disse ikke-cellulosestrukturene kunne ikke spaltes av de vanligste cellulasene og hemicellulasene i den testede kommersielle enzymblandingen, som inkluderer de mest brukte kommersielle enzymene.Derfor kreves det nye hjelpeenzymer for deres hydrolyse.Uten de nødvendige hjelpeenzymer som ikke er cellulose, forhindrer disse ikke-cellulosebindingene fullstendig omdannelse til monosakkarider, selv om deres foreldresukkerpolymerer i stor grad hydrolyseres til kortere fragmenter og oppløses ved bruk av kommersielle enzymblandinger.
Videre undersøkelse av signaldistribusjon og dens bindingsstyrke viste at bindingsepitoper var lavere i sukkerfraksjoner med høy DP (A, B, C, DP opp til 20+) enn i fraksjoner med lav DP (D, E, F, DP) i dimerer) (fig. 1).Syrefragmenter er mer vanlige i ikke-celluloseepitoper enn nøytrale fragmenter.Disse fenomenene er i samsvar med mønsteret observert i vår forrige studie, der høy DP og syredeler var mer motstandsdyktige mot enzymatisk hydrolyse.Derfor kan tilstedeværelsen av ikke-celluloseglykanepitoper og U- og MeU-substitusjoner i stor grad bidra til stabiliteten til oligosakkaridene.Det skal bemerkes at bindings- og deteksjonseffektivitet kan være problematisk for oligosakkarider med lav DP, spesielt hvis epitopen er et dimert eller trimert oligosakkarid.Dette kan testes ved bruk av kommersielle oligosakkarider av forskjellige lengder, som hver inneholder bare én epitop som binder seg til en spesifikk mAb.
Dermed avslørte bruken av strukturspesifikke antistoffer visse typer gjenstridige bindinger.Avhengig av typen antistoff som brukes, passende ligasjonsmønster og styrken på signalet det produserer (mest og minst rikelig), kan nye enzymer identifiseres og tilsettes semikvantitativt til enzymblandingen for mer fullstendig glykokonvertering.Ved å ta analysen av ACSH-oligosakkarider som et eksempel, kan vi lage en database med glykanbindinger for hvert biomassemateriale.Det skal her bemerkes at den forskjellige affiniteten til antistoffer bør tas i betraktning, og hvis deres affinitet er ukjent, vil dette skape visse vanskeligheter når man sammenligner signalene til forskjellige antistoffer.I tillegg kan sammenligning av glykanbindinger fungere best mellom prøver for samme antistoff.Disse gjenstridige bindingene kan deretter kobles til CAZyme-databasen, hvorfra vi kan identifisere enzymer, velge kandidatenzymer og teste for bindingsbrytende enzymer, eller utvikle mikrobielle systemer for å uttrykke disse enzymene for bruk i bioraffinerier44.
For å evaluere hvordan immunologiske metoder utfyller alternative metoder for å karakterisere lavmolekylære oligosakkarider som finnes i lignocellulosehydrolysater, utførte vi MALDI (fig. 4, S1-S8) og analyse av TMS-avledede sakkarider basert på GC-MS på samme panel (fig. 5) oligosakkariddel.MALDI brukes til å sammenligne om massefordelingen av oligosakkaridmolekyler samsvarer med den tiltenkte strukturen.På fig.4 viser MC av de nøytrale komponentene ACN-A og ACN-B.ACN-A-analyse bekreftet en rekke pentosesukker fra DP 4–8 (fig. 4) til DP 22 (fig. S1), hvis vekt tilsvarer MeU-xylanoligosakkarider.ACN-B-analyse bekreftet pentose- og glukoxylan-serien med DP 8-15.I tilleggsmateriale som figur S3, viser FA-C sure delmassefordelingskart en rekke (Me)U-substituerte pentosesukkere med en DP på ​​8-15 som er i samsvar med de substituerte xylanene funnet i ELISA-basert mAb-screening.Epitopene er konsistente.
MALDI-MS spektrum av løselige ikke-kompatible oligosakkarider tilstede i ACS.Her, (A) ACN-A lavvektsfraksjoner som inneholder metylert uronsyre (DP 4-8) substituerte glukuroksylanoligosakkarider og (B) ACN-B xylan og metylerte uronsyreoligosakkarider substituert med glukuroksylan (DP 8-15).
Analyse av sammensetningen av glykanresten av ildfaste oligosakkarider.Her (A) TMS-sakkaridsammensetning av forskjellige oligosakkaridfraksjoner oppnådd ved bruk av GC-MS-analyse.(B) Strukturer av forskjellige TMS-avledede sukkerarter tilstede i oligosakkarider.ACN – acetonitrilfraksjon som inneholder nøytrale oligosakkarider og FA – ferulinsyrefraksjon som inneholder sure oligosakkarider.
En annen interessant konklusjon ble trukket fra LC-MS-analysen av oligosakkaridfraksjonen, som vist i figur S9 (metoder kan sees i det elektroniske tilleggsmaterialet).Fragmenter av heksose- og -OAc-grupper ble gjentatte ganger observert under ligering av ACN-B-fraksjonen.Dette funnet bekrefter ikke bare fragmenteringen observert i glykom- og MALDI-TOF-analyse, men gir også ny informasjon om potensielle karbohydratderivater i forbehandlet lignocelluloseholdig biomasse.
Vi analyserte også sukkersammensetningen til oligosakkaridfraksjonen ved å bruke TMS sukkerderivatisering.Ved å bruke GC-MS bestemte vi sammensetningen av nevrale (ikke-derivater) og sure sukkerarter (GluA og GalA) i oligosakkaridfraksjonen (fig. 5).Glukuronsyre finnes i sure komponentene C og D, mens galakturonsyre finnes i sure komponentene A og B, som begge er komponenter med høy DP i sure sukkerarter.Disse resultatene bekrefter ikke bare våre ELISA- og MALDI-data, men er også i samsvar med våre tidligere studier av oligosakkaridakkumulering.Derfor tror vi at moderne immunologiske metoder som bruker biotinylering av oligosakkarider og påfølgende ELISA-screening er tilstrekkelig for å oppdage løselige gjenstridige oligosakkarider i ulike biologiske prøver.
Siden ELISA-baserte mAb-screeningsmetoder har blitt validert av flere forskjellige metoder, ønsket vi å utforske potensialet til denne nye kvantitative metoden ytterligere.To kommersielle oligosakkarider, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) og 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ble kjøpt og testet ved bruk av en ny mAb-tilnærming rettet mot celleveggglykanen.Figur 6 viser en lineær korrelasjon mellom det biotinylerte bindingssignalet og log-konsentrasjonen av oligosakkaridkonsentrasjon, noe som antyder en mulig Langmuir-adsorpsjonsmodell.Blant mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 og CCRC-M151 korrelerte med XHE, og CCRC-M108, CCRC-M109 og LM11 korrelerte med A2XX over et område på 100n namno.På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av antistoffer under eksperimentet, ble det utført begrensede eksperimenter med hver oligosakkaridkonsentrasjon.Det skal her bemerkes at noen antistoffer reagerer veldig forskjellig på det samme oligosakkaridet som et substrat, antagelig fordi de binder seg til litt forskjellige epitoper og kan ha svært forskjellige bindingsaffiniteter.Mekanismene og implikasjonene av nøyaktig epitopidentifikasjon vil være mye mer komplekse når den nye mAb-tilnærmingen brukes på ekte prøver.
To kommersielle oligosakkarider ble brukt for å bestemme deteksjonsområdet for forskjellige glykanmålrettede mAbs.Her indikerer lineære korrelasjoner med log-konsentrasjon av oligosakkaridkonsentrasjon Langmuir-adsorpsjonsmønstre for (A) XHE med mAb og (B) A2XX med mAb.De tilsvarende epitopene indikerer strukturene til de kommersielle oligosakkaridene som brukes som substrater i analysen.
Bruken av glykanmålrettede monoklonale antistoffer (glykokomisk analyse eller ELISA-basert mAb-screening) er et kraftig verktøy for dybdekarakterisering av de fleste av de viktigste celleveggglykanene som utgjør plantebiomasse.Imidlertid karakteriserer klassisk glykananalyse bare glykaner med større cellevegg, da de fleste oligosakkarider ikke er effektivt immobilisert på ELISA-plater.I denne studien ble AFEX-forbehandlet maisstover enzymatisk hydrolysert ved et høyt tørrstoffinnhold.Sukkeranalyse ble brukt for å bestemme sammensetningen av gjenstridige celleveggkarbohydrater i hydrolysatet.Imidlertid er mAb-analyse av mindre oligosakkarider i hydrolysater undervurdert, og ytterligere verktøy er nødvendig for å effektivt immobilisere oligosakkarider på ELISA-plater.
Vi rapporterer her en ny og effektiv oligosakkaridimmobiliseringsmetode for mAb-screening ved å kombinere oligosakkaridbiotinylering etterfulgt av ELISA-screening på NeutrAvidin™-belagte plater.De immobiliserte biotinylerte oligosakkaridene viste tilstrekkelig affinitet for antistoffet til å muliggjøre rask og effektiv påvisning av gjenstridige oligosakkarider.Analyse av sammensetningen av disse gjenstridige oligosakkaridene basert på massespektrometri bekreftet resultatene av denne nye tilnærmingen til immunscreening.Dermed viser disse studiene at kombinasjonen av oligosakkaridbiotinylering og ELISA-screening med glykanmålrettede monoklonale antistoffer kan brukes til å oppdage tverrbindinger i oligosakkarider og kan brukes mye i andre biokjemiske studier som karakteriserer strukturen til oligosakkarider.
Denne biotinbaserte glykanprofileringsmetoden er den første rapporten som er i stand til å undersøke de gjenstridige karbohydratbindingene til løselige oligosakkarider i plantebiomasse.Dette bidrar til å forstå hvorfor enkelte deler av biomassen er så sta når det kommer til produksjon av biodrivstoff.Denne metoden fyller et viktig gap i glykomanalysemetoder og utvider anvendelsen til et bredere spekter av substrater utover planteoligosakkarider.I fremtiden vil vi kanskje bruke robotikk for biotinylering og bruke metoden vi har utviklet for high-throughput analyse av prøver ved hjelp av ELISA.
Maishalm (CS) dyrket fra Pioneer 33A14 hybridfrø ble høstet i 2010 fra Kramer Farms i Ray, Colorado.Med tillatelse fra grunneier kan denne biomassen brukes til forskning. Prøvene ble lagret tørt < 6 % fuktighet i zip-lock poser i romtemperatur. Prøvene ble lagret tørt < 6 % fuktighet i zip-lock poser i romtemperatur. Tilbyr brukere med elektrisitet < 6 % av forbrukere med forbruksbaserte systemer. Prøver ble lagret tørt ved <6 % fuktighet i poser med glidelås ved romtemperatur.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Optimal drift av forbruksvarer med < 6 %. Prøver oppbevares i glidelåsposer i romtemperatur med fuktighet < 6 %.Studien fulgte lokale og nasjonale retningslinjer.Sammensetningsanalyse ble utført ved bruk av NREL-protokollen.Sammensetningen ble funnet å inneholde 31,4 % glukan, 18,7 % xylan, 3,3 % arabinan, 1,2 % galaktan, 2,2 % acetyl, 14,3 % lignin, 1,7 % protein og 13,4 % aske.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) er en kompleks blanding av cellulase, β-glukosidase og Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) fra Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg protein/ml), en kompleks blanding av pektinnedbrytende enzymer, ble donert av DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Enzymproteinkonsentrasjoner ble bestemt ved å estimere proteininnhold (og trekke fra bidraget av ikke-proteinnitrogen) ved bruk av Kjeldahl-nitrogenanalyse (AOAC-metode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatoméjord 545 ble kjøpt fra EMD Millipore (Billerica, MA).Aktivt karbon (DARCO, 100 mesh granulat), Avicel (PH-101), bøk xylan og alle andre kjemikalier ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-forbehandling ble utført ved GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Forbehandling ble utført ved 140°C i 15 minutter.46 oppholdstid ved 1:1 forhold mellom vannfri ammoniakk og biomasse ved 60 % (vekt/vekt) lasting i en batchreaktor av rustfritt stål (Parr Instruments Company).Det tok 30 minutter.Reaktoren ble brakt til 140°C og ammoniakken ble raskt frigjort, slik at biomassen raskt kunne gå tilbake til romtemperatur.Sammensetningen av AFEX pre-treated corn stover (ACS) var lik den for ubehandlet corn stover (UT-CS).
ACSH 25 % (vekt/vekt) med høyt tørrstoffinnhold (ca. 8 % dekstranbelastning) ble fremstilt som et utgangsmateriale for produksjon av oligosakkarider i stor skala.Enzymatisk hydrolyse av ACS ble utført ved bruk av en kommersiell enzymblanding inkludert Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (i forbehandlet biomasse), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan og Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg protein/g dekstran.Enzymatisk hydrolyse ble utført i en 5-liters bioreaktor med et arbeidsvolum på 3 liter, pH 4,8, 50°C og 250 rpm.Etter hydrolyse i 96 timer ble hydrolysatet samlet ved sentrifugering ved 6000 rpm i 30 minutter og deretter ved 14000 rpm i 30 minutter for å fjerne uhydrolyserte faste stoffer.Hydrolysatet ble deretter utsatt for sterilfiltrering gjennom et 0,22 mm filterbeger.Det filtrerte hydrolysatet ble lagret i sterile flasker ved 4°C og deretter fraksjonert på karbon.
Analyse av sammensetningen av ekstraktbaserte biomasseprøver i henhold til NREL laboratorieanalyseprosedyrer: klargjøring av prøver for sammensetningsanalyse (NREL/TP-510-42620) og bestemmelse av strukturelle karbohydrater og lignin i biomasse (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosakkaridanalyse av hydrolysatstrømmen ble utført i en 2 ml skala ved bruk av en autoklavbasert syrehydrolysemetode.Bland hydrolysatprøven med 69,7 µl 72 % svovelsyre i et 10 ml skrukorkkulturrør og inkuber i 1 time på en benketopp ved 121 °C, avkjøl på is og filtrer inn i et hetteglass med høy ytelse med væskekromatografi (HPLC).Konsentrasjonen av oligosakkarider ble bestemt ved å trekke konsentrasjonen av monosakkarider i den ikke-hydrolyserte prøven fra den totale sukkerkonsentrasjonen i den syrehydrolyserte prøven.
Glukose-, xylose- og arabinosekonsentrasjoner i den syrehydrolyserte biomassen ble analysert ved bruk av et Shimadzu HPLC-system utstyrt med en autosampler, kolonnevarmer, isokratisk pumpe og brytningsindeksdetektor på en Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonne.Kolonnen ble holdt ved 50°C og eluert med 0,6 ml/min 5 mM H2S04 i vann.strømme.
Hydrolysatsupernatanten ble fortynnet og analysert for monomer- og oligosakkaridinnhold.Monomere sukkere oppnådd etter enzymatisk hydrolyse ble analysert ved HPLC utstyrt med en Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonne og en askebeskyttelseskolonne.Kolonnetemperaturen ble holdt ved 80°C, vann ble brukt som mobil fase med en strømningshastighet på 0,6 ml/min.Oligosakkarider ble bestemt ved hydrolyse i fortynnet syre ved 121°C i henhold til metodene beskrevet i ref.41, 48, 49.
Sakkaridanalyse ble utført på rå, AFEX-forbehandlede og alle ikke-hydrolyserte biomasserester (inkludert produksjon av seriecelleveggekstrakter og deres mAb-screening) ved bruk av tidligere beskrevne prosedyrer 27, 43, 50, 51.For glykomanalyse fremstilles alkoholuløselige rester av plantecelleveggmateriale fra biomasserester og utsettes for serieekstraksjon med stadig mer aggressive reagenser som ammoniumoksalat (50 mM), natriumkarbonat (50 mM og 0,5 % w/v), CON.(1M og 4M, begge med 1% vekt/volum natriumborhydrid) og syrekloritt som tidligere beskrevet52,53.Ekstraktene ble deretter utsatt for ELISA mot et komplekst panel av mAb50s rettet mot celleveggglykanet, og mAb-bindingsreaksjonene ble presentert som et varmekart.mAbs rettet mot plantecelleveggglykan ble kjøpt fra laboratorieaksjer (CCRC, JIM og MAC-serien).
Ett-trinns biotinylering av oligosakkarider.Konjugeringen av karbohydrater med biotin-LC-hydrazid ble utført ved å bruke følgende prosedyre.Biotin-LC-hydrazid (4,6 mg/12 μmol) ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO, 70 μl) ved kraftig omrøring og oppvarming ved 65°C i 1 min.Iseddik (30 ul) ble tilsatt og blandingen ble helt på natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 µmol) og fullstendig oppløst etter oppvarming ved 65°C i ca. 1 minutt.Deretter ble fra 5 til 8 μl av reaksjonsblandingen tilsatt til det tørkede oligosakkaridet (1-100 nmol) for å oppnå et 10 ganger eller mer molart overskudd av markøren over den reduserende enden.Reaksjonen ble utført ved 65°C i 2 timer, hvoretter prøvene umiddelbart ble renset.Ingen natriumcyanoborhydrid ble brukt i merkeeksperimentene uten reduksjon, og prøvene ble omsatt ved 65°C i 2,5 timer.
ELISA-belegg og vasking av prøver av biotinylerte oligosakkarider.25 μl biotinylerte prøver (100 μl av hver konsentrert prøve fortynnet i 5 ml 0,1 M Tris-bufferløsning (TBS)) ble tilsatt hver brønn på den avidinbelagte platen.Kontrollbrønner ble belagt med 50 μl biotin i en konsentrasjon på 10 μg/ml i 0,1 M TBS.Avionisert vann ble brukt som belegg for blankmålinger.Tabletten ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur i mørket.Vask platen 3 ganger med 0,1 % skummet melk i 0,1 M TBS med programnr.11 for Grenier leilighet 3A.
Tilsetning og vasking av primære antistoffer.Tilsett 40 µl primært antistoff til hver brønn.Inkuber mikroplaten i 1 time ved romtemperatur i mørket.Platene ble deretter vasket 3 ganger med 0,1 % melk i 0,1 M TBS ved bruk av vaskeprogram #11 for Grenier Flat 3A.
Tilsett sekundært antistoff og vask.Tilsett 50 µl mus/rotte sekundært antistoff (fortynnet 1:5000 i 0,1 % melk i 0,1 M TBS) til hver brønn.Inkuber mikroplaten i 1 time ved romtemperatur i mørket.Mikroplatene ble deretter vasket 5 ganger med 0,1 % melk i 0,1 M TBS ved bruk av Grenier Flat 5A platevaskeprogram #12.
Legge til et underlag.Tilsett 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametylbenzidin (TMB) til basissubstratet (ved å tilsette 2 dråper buffer, 3 dråper TMB, 2 dråper hydrogenperoksid til 15 ml avionisert vann).Klargjør TMB-substratet.og vortex før bruk).Inkuber mikroplaten ved romtemperatur i 30 minutter.I mørket.
Fullfør trinnet og les nettbrettet.Tilsett 50 µl 1 N svovelsyre til hver brønn og registrer absorbansen fra 450 til 655 nm med en ELISA-leser.
Forbered 1 mg/ml løsninger av disse analyttene i avionisert vann: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galakturonsyre (GalA), glukuronsyre (GlcA), mannose, glukose, galaktose, laktose, N-acetylmannosamin (manNAc), N-acetylglukosamin.(glcNAc), N-acetylgalaktosamin (galNAc), inositol (intern standard).To standarder ble fremstilt ved å tilsette 1 mg/ml sukkerløsninger vist i tabell 1. Prøver fryses og frysetørkes ved -80°C inntil alt vann er fjernet (vanligvis ca. 12-18 timer).
Tilsett 100–500 µg prøve til rør med skrukork på en analytisk balanse.Registrer beløpet som er lagt til.Det er best å løse opp prøven i en spesifikk konsentrasjon av løsemiddel og legge den til røret som en flytende alikvot.Bruk 20 µl 1 mg/ml inositol som intern standard for hvert prøverør.Mengden intern standard tilsatt prøven må være den samme som mengden intern standard tilsatt standardrøret.
Tilsett 8 ml vannfri metanol til et hetteglass med skrukork.Deretter 4 ml 3 N metanolisk HCl-løsning, tildekket og ristet.Denne prosessen bruker ikke vann.
Tilsett 500 µl 1 M HCl-metanolløsning til oligosakkaridprøvene og standard TMS-rør.Prøver ble inkubert over natten (168 timer) ved 80°C i en termisk blokk.Tørk metanolyseproduktet ved romtemperatur ved bruk av en tørkemanifold.Tilsett 200 µl MeOH og tørk igjen.Denne prosessen gjentas to ganger.Tilsett 200 µl metanol, 100 µl pyridin og 100 µl eddiksyreanhydrid til prøven og bland godt.Prøver ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter.og tørket.Tilsett 200 µl metanol og tørk igjen.
Tilsett 200 µl Tri-Sil og varm opp røret i 20 minutter.80°C, deretter avkjølt til romtemperatur.Bruk en tørkemanifold for å tørke prøven ytterligere til et volum på ca. 50 µl.Det er viktig å merke seg at vi ikke lot prøvene tørke helt.
Tilsett 2 ml heksan og bland godt ved å virvle.Fyll tuppene på Pasteur-pipettene (5-8 mm) med et stykke glassull ved å sette glassullen på toppen av en pipette med en diameter på 5-3/4 tommer.Prøver ble sentrifugert ved 3000 g i 2 minutter.Eventuelle uløselige rester utfelles.Tørk prøven til 100-150 µl.Et volum på omtrent 1 μl ble injisert i GC-MS ved en starttemperatur på 80 °C og en starttid på 2,0 minutter (tabell 2).