Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз колдонуп жаткан серепчинин версиясы чектелген CSS колдоосуна ээ.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Ал ортодо, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
AFEX менен алдын ала иштетилген жүгөрү мешиндеги туруктуу олигосахариддерди комплекстүү анализдөө үчүн жаңы иммунологиялык жана масс-спектрометриялык методдор.Лигноцеллюлоздук биомасса казылып алынган отунга туруктуу альтернатива болуп саналат жана тамак-аш, тоют, күйүүчү май жана химиялык заттар сыяктуу азыктарды өндүрүү үчүн биотехнологияларды өнүктүрүү үчүн кеңири колдонулат.Бул технологиялардын ачкычы өсүмдүк клеткасынын дубалдарында бар татаал карбонгидраттарды глюкоза, ксилоза жана арабиноза сыяктуу жөнөкөй кантка айландыруу үчүн атаандаштыкка жөндөмдүү процесстерди иштеп чыгуу болуп саналат.Лигноцеллюлоздук биомасса өтө өжөр болгондуктан, керектүү продуктуну алуу үчүн термохимиялык процедуралардан (мисалы, аммиак буласын эксфолиациялоо (AFEX), суюлтулган кислоталар (DA), иондук суюктуктар (IL)) жана биологиялык дарылоодон (мисалы, ферменттик гидролиз жана микробдук ачытуу) айкалыштыруудан өтүшү керек..Бирок, гидролиз процессинде коммерциялык грибоктук ферменттерди колдонгондо, пайда болгон эрүүчү канттардын 75-85% гана моносахариддер, ал эми калган 15-25% микроорганизмдер үчүн дайыма эле боло бербеген эрүүчү, туруштук бере албаган олигосахариддер.Буга чейин биз көмүртектүү жана диатомдуу жерди бөлүү жана өлчөмдү алып салуу хроматографиясынын айкалышынын жардамы менен эрүүчү өжөр олигосахариддерди ийгиликтүү бөлүп алып, тазаладык, ошондой эле алардын ферменттерди ингибитордук касиеттерин изилдедик.Биз полимеризациянын (ДП) жогорку даражасын камтыган олигосахариддерди метилдештирилген урон кислотасын алмаштырууну төмөн DP жана нейтралдуу олигосахариддерге караганда коммерциялык фермент аралашмасы менен иштетүү кыйыныраак экенин аныктадык.Бул жерде биз бир нече кошумча ыкмаларды, анын ичинде өсүмдүк клеткасынын дубалындагы гликан байланыштарын жана ферменттик гидролизаттарды мүнөздөш үчүн өсүмдүк биомассасынын гликандарына мүнөздүү моноклоналдык антителолорду (mAbs) колдонуу менен гликан профилин түзүүнү, матрицанын жардамы менен лазердик десорбцияны иондоштурууну, учуу убактысынын масс-спектрометриясын колдонобуз..MALDI-TOF-MS) олигосахариддик байланыштарды туундуруу менен жана туундусуз мүнөздөлөө үчүн терс иондордун экинчилик ажыроосунан кийин спектроскопия менен алынган структуралык-маалыматтык диагностикалык чокуларды, газ хроматографиясын жана масс-спектрометрияны (GC-MS) колдонот.Олигосахариддердин (ДП 4–20) кичинекей өлчөмүнөн улам, бул молекулаларды мАб байланышы жана мүнөздөмөлөрү үчүн колдонуу кыйын.Бул көйгөйдү чечүү үчүн биз биотин конъюгациясына негизделген олигосахариддерди иммобилизациялоонун жаңы ыкмасын колдондук, ал микропластинанын бетинде төмөн эрүүчү олигосахариддердин көпчүлүгүн ийгиликтүү белгилөөдө, ал андан кийин конкреттүү ligation анализи үчүн жогорку өткөрүү жөндөмдүүлүгү mAb системасында колдонулган.Бул жаңы ыкма диагностикалык максаттар үчүн биомаркерлерде бар олигосахариддерди бөлүп алуу жана мүнөздөш үчүн колдонулушу мүмкүн болгон келечекте өнүккөн жогорку өткөрүмдүүлүк гликом анализдерин иштеп чыгууга көмөктөшөт.
Айыл чарба, токой чарбасы, чөп жана жыгач материалдардан турган лигноцеллюлоздук биомасса био-негизделген продуктыларды, анын ичинде тамак-аш, тоют, отун жана химиялык прекурсорлорду өндүрүү үчүн потенциалдуу чийки зат болуп саналат1.Өсүмдүк клеткасынын капталында болгон углеводдор (мисалы, целлюлоза жана гемицеллюлоза) химиялык кайра иштетүү жана биотрансформация (мисалы, ферменттик гидролиз жана микробдук ачытуу) аркылуу моносахариддерге деполимеризацияланат.Common алдын ала дарылоо өсүмдүк клетка дубалдарын ачуу аркылуу лигноцеллюлоза өндүрүшүн азайтуу үчүн химиялык заттардын жана жылуулуктун айкалышы колдонулган аммиак жипчесин кеңейтүү (AFEX), суюлтулган кислота (DA), иондук суюктук (IL) жана буу жарылуу (SE) камтыйт3,4.заттын өжөрлүгү, 5. Ферменттүү гидролиз коммерциялык активдүү углевод камтыган ферменттерди (CAZymes) жана био-негизделген күйүүчү майларды жана химиялык заттарды өндүрүү үчүн трансгендик ачыткыларды же бактерияларды колдонуу менен микробдук ачытууну колдонуу менен жогорку катуу жүктө жүргүзүлөт.
Коммерциялык ферменттердеги CAZymes моносахариддерди пайда кылуу үчүн татаал углевод-кант байланыштарын синергетикалык жактан ажыратуучу ферменттердин татаал аралашмасынан турат2,7.Мурда маалымдалгандай, лигниндин углеводдор менен ароматтык полимерлеринин комплекстүү тармагы аларды өтө чыдамсыз кылат, бул канттын толук эмес конверсиясына алып келет, алдын ала иштетилген биомассанын ферментативдик гидролизинде өндүрүлбөгөн 15-25% жыныстык олигосахариддерди топтойт.Бул ар кандай биомассаны алдын ала тазалоо ыкмалары менен жалпы көйгөй болуп саналат.Бул тоскоолдуктун кээ бир себептерине гидролиз учурунда ферменттердин бөгөт коюусу же өсүмдүк биомассасындагы кант байланыштарын бузуу үчүн зарыл болгон маанилүү энзимдердин жоктугу же төмөн деңгээли кирет.Олигосахариддердеги кант байланыштары сыяктуу канттардын курамын жана структуралык мүнөздөмөлөрүн түшүнүү бизге гидролиз учурунда канттын конверсиясын жакшыртууга жардам берип, биотехнологиялык процесстерди мунайдан алынган продуктылар менен атаандашууга жөндөмдүү кылат.
Углеводдордун түзүлүшүн аныктоо татаал жана суюк хроматография (LC)11,12, ядролук магниттик-резонанстык спектроскопия (ЯМР)13, капиллярдык электрофорез (CE)14,15,16 жана масс-спектрометрия (MS)17 сыяктуу ыкмалардын айкалышын талап кылат.,он сегиз.Матрицаны (MALDI-TOF-MS) колдонуу менен лазердик десорбция жана иондоштуруу менен учуу убактысынын масс-спектрометриясы сыяктуу MS методдору карбонгидрат структураларын аныктоонун ар тараптуу ыкмасы болуп саналат.Жакында эле, натрий ионунун кошулмаларынын кагылышуусунан келип чыккан диссоциация (CID) тандеми MS олигосахариддик тиркеме орундарына, аномердик конфигурацияларга, ырааттуулукка жана бутактануу орундарына 20, 21 ылайыктуу манжа изин аныктоо үчүн кеңири колдонулган.
Гликан анализи углевод байланыштарын терең аныктоо үчүн эң сонун курал болуп саналат22.Бул ыкма татаал карбонгидрат байланыштарын түшүнүү үчүн зонд катары өсүмдүк клетка дубалынын гликанына багытталган моноклоналдык антителолорду (mAbs) колдонот.250 мАбдан ашык дүйнө жүзү боюнча жеткиликтүү, алар ар кандай сахариддерди колдонгон ар кандай сызыктуу жана тармакталган олигосахариддерге каршы иштелип чыккан.Өсүмдүк клеткасынын түрүнө, органына, жашына, өнүгүү стадиясына жана өсүү чөйрөсүнө25,26 жараша олуттуу айырмачылыктар бар болгондуктан, бир нече мАблар өсүмдүк клеткасынын дубалынын түзүлүшүн, курамын жана өзгөртүүлөрүн мүнөздөш үчүн кеңири колдонулган.Жакында эле, бул ыкма өсүмдүк жана жаныбарлар системаларындагы везикула популяцияларын жана алардын гликан ташуудагы тиешелүү ролдорун түшүнүү үчүн, ошондой эле субклеткалык маркерлер, өнүгүү этаптары же экологиялык стимулдар менен аныкталып, ферменттик активдүүлүктү аныктоо үчүн колдонулган.Идентификацияланган гликандар менен ксиландардын ар кандай түзүмдөрүнүн айрымдарына пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюкандар (XylG), аралаш байланыш глюкандары (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкурон кислотасы-арабиноксилан (ArbX), глюкурон кислотасы-арабиноксилан (Gabino) жана араб2) кирет.
Бирок, бардык бул изилдөө аракеттерине карабастан, бир нече гана изилдөөлөр жогорку катуу жүк (HSL) гидролиз учурунда олигосахариддердин топтолушу мүнөзүнө багытталган, анын ичинде олигосахариддердин чыгарылышын, гидролиз учурунда олигомердик чынжырдын узундугун өзгөртүү, ар кандай төмөн DP полимерлери жана алардын ийри сызыктары.бөлүштүрүү 30,31,32.Ошол эле учурда, гликан анализи гликан түзүмүн комплекстүү талдоо үчүн пайдалуу курал экенин далилдеди, бирок антитело ыкмаларын колдонуу менен сууда эрүүчү төмөн DP олигосахариддерин баалоо кыйын.Молекулярдык салмагы 5-10 кДадан азыраак DP олигосахариддери ELISA 33, 34 плиталары менен байланышпайт жана антитело кошулганга чейин жууп кетишет.
Бул жерде, биринчи жолу, биз glycome талдоо эрүүчү отко чыдамдуу олигосахариддер үчүн бир кадам biotinylation жол-жобосун айкалыштыруу, моноклоналдык антителолорду колдонуу менен avidin менен капталган плиталар боюнча ELISA анализин көрсөтөт.Биздин гликом анализине болгон мамилебиз MALDI-TOF-MS жана GC-MS негизиндеги толуктоочу олигосахариддик байланыштарды триметилсилил (TMS) гидролизделген кант курамын туундуруу аркылуу талдоо аркылуу тастыкталды.Бул инновациялык ыкма келечекте жогорку өндүрүмдүүлүк ыкмасы катары иштелип чыгып, биомедициналык изилдөөдө кеңири колдонулушу мүмкүн35.
Ферменттердин жана антителолордун пост-трансляциялык модификациялары, мисалы, гликозилдөө36 алардын биологиялык активдүүлүгүнө таасирин тийгизет.Мисалы, сезгенүү артритинде кан сывороткасынын белокторунун гликозиляциясынын өзгөрүшү маанилүү роль ойнойт, ал эми диагностикалык маркерлер катары гликозиляциянын өзгөрүшү колдонулат37.Ар кандай гликандар ар кандай ооруларда, анын ичинде ичеги-карын трактынын жана боордун өнөкөт сезгенүү ооруларында, вирустук инфекцияларда, энелик бездин, эмчектин жана простата безинин рактарында оңой эле пайда болоору адабияттарда айтылган.Антителолорго негизделген гликан ИФА ыкмаларын колдонуу менен гликандардын түзүмүн түшүнүү татаал MS ыкмаларын колдонбостон, оорунун диагностикасына кошумча ишенимди камсыз кылат.
Биздин мурунку изилдөөбүз өжөр олигосахариддер алдын ала тазалоодон жана ферменттик гидролизден кийин гидролизденбей калганын көрсөттү (1-сүрөт).Биздин мурда жарыяланган ишибизде, биз AFEX менен алдын ала иштетилген жүгөрү күйгүзүүчү гидролизаттан (ACSH)8 олигосахариддерди бөлүп алуу үчүн активдүү көмүрдүн катуу фазалуу экстракция ыкмасын иштеп чыктык.Баштапкы экстракциядан жана бөлүнгөндөн кийин, олигосахариддер андан ары өлчөмдү алып салуу хроматографиясы (SEC) менен фракциялаштырылды жана молекулярдык салмак боюнча чогултулду.Ар кандай алдын ала тазалоодон чыккан канттын мономерлери жана олигомерлери канттын курамын талдоо жолу менен талдоого алынган.Ар кандай алдын ала тазалоо ыкмалары менен алынган кант олигомерлеринин курамын салыштырганда өжөр олигосахариддердин болушу биомассаны моносахариддерге айландыруудагы кеңири таралган көйгөй болуп саналат жана канттын түшүмдүүлүгүнүн кеминде 10-15%, ал тургай 18%ке чейин төмөндөшүнө алып келиши мүмкүн.АКШ.Бул ыкма олигосахариддик фракцияларды андан ары масштабдуу өндүрүү үчүн колдонулат.Алынган ACH жана анын ар кандай молекулярдык салмагы менен кийинки фракциялары бул иште олигосахариддердин мүнөздөмөлөрү үчүн эксперименталдык материал катары колдонулган.
Алдын ала тазалоодон жана ферменттик гидролизден кийин туруктуу олигосахариддер гидролизденбей калган.Бул жерде (A) олигосахариддерди бөлүү ыкмасы болуп саналат, анда олигосахариддер AFEX менен алдын ала иштетилген жүгөрү күйгүзүүчү гидролизаттан (ACSH) активдештирилген көмүрдүн жана диатомдуу жердин пакеттелген төшөгүн колдонуу менен бөлүнүп алынат;(B) Олигосахариддерди бөлүү ыкмасы.Олигосахариддер андан ары өлчөмдү алып салуу хроматографиясы (SEC) менен бөлүнгөн;(C) Ар кандай алдын ала тазалоодон бошотулган сахарид мономерлери жана олигомерлер (суюлтулган кислота: DA, иондук суюктук: IL жана AFEX).Ферменттик гидролиздин шарттары: катуу заттардын 25% жүктөө (болжол менен 8% глюкан жүктөө), 96 сааттык гидролиз, 20 мг/г коммерциялык ферментти жүктөө (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 катышы) жана (D) Кант мономерлери жана глюкозадан бөлүнүп чыккан корребиноза жана стоилозадан глюкоза жана олигомерлер. ACS).
Гликандык анализ катуу биомассанын калдыктарынан бөлүнүп алынган экстракттардагы гликандарды комплекстүү структуралык анализдөө үчүн пайдалуу курал болуп чыкты.Бирок, сууда эрүүчү сахариддер бул салттуу ыкманы колдонуу менен аз көрсөтүлөт41, анткени төмөнкү молекулалык салмактагы олигосахариддер ELISA пластинкаларында кыймылсыздануу кыйын жана антитело кошулганга чейин жуулат.Ошондуктан, антителолорду байланыштыруу жана мүнөздөмөлөө үчүн, эрүүчү, шайкеш келбеген олигосахариддерди avidin менен капталган ELISA плиталарына каптоо үчүн бир кадамдуу биотинилдөө ыкмасы колдонулган.Бул ыкма биздин мурда өндүрүлгөн ACSH жана анын молекулярдык салмагына (же полимерлөө даражасына, DP) негизделген фракцияны колдонуу менен сыналган.Бир кадам biotinylation углевод кыскартуу учуна биотин-LC-гидразиди кошуу менен oligosacharide милдеттүү жакындыгын жогорулатуу үчүн колдонулган (сүрөт. 2).Эритмеде редукциялоочу учундагы гемиацеталдык топ биотин-LC-гидразиддин гидразиддик тобу менен реакцияга кирип, гидразон байланышын түзөт.NaCNBH3 калыбына келтирүүчү агенттин катышуусунда гидразон байланышы туруктуу биотинделген акыркы продуктка чейин төмөндөйт.Кантты азайтуучу учу модификациялоо менен, аз DP олигосахариддерин ELISA плиталарына байланыштыруу мүмкүн болуп калды жана биздин изилдөөбүздө бул гликан-максаттуу mAbs аркылуу авидин менен капталган плиталарда жасалды.
биотинилденген олигосахариддер үчүн ELISA негизинде моноклоналдык антителолордун скрининги.Бул жерде (A) NeutrAvidin капталган плиталар боюнча гликан-максаттуу mAbs менен oligosaccharides жана кийинки ELISA скрининг бириккен биотинилденген жана (B) реакция азыктарын биотинилдөө үчүн бир кадам жол-жобосун көрсөтөт.
Андан кийин олигосахарид-конъюгацияланган антителолору бар авидин менен капталган плиталар баштапкы жана экинчилик антителолорго кошулуп, жарыкка жана убакытка сезгич чөйрөдө жуулчу.Антитело байланышы аяктагандан кийин, плитаны инкубациялоо үчүн TMB субстратын кошуңуз.Реакция акыры күкүрт кислотасы менен токтотулду.Инкубацияланган плиталар антитело-спецификалык кайчылаш байланышты аныктоо үчүн ар бир антителонун байланыш күчүн аныктоо үчүн ELISA окугучунун жардамы менен анализденди.Эксперименттин чоо-жайы жана параметрлери үчүн "Материалдар жана методдор" деген тиешелүү бөлүмдү караңыз.
Биз бул жаңы иштелип чыккан методдун пайдалуулугун ACSHда, ошондой эле лигноцеллюлоздук гидролизаттардан бөлүнүп алынган чийки жана тазаланган олигосахариддерде бар эрүүчү олигосахариддерди мүнөздөп, конкреттүү колдонуу үчүн көрсөтөбүз.3-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, биоацилденген гликомду анализдөө ыкмаларын колдонуу менен ACSHда аныкталган эң кеңири таралган эпитоп менен алмаштырылган ксиландар, адатта, урондук (U) же метилурондук (MeU) жана пектиктик арабиногалактандар.Алардын көбү гидролиздебеген катуу заттардын (UHS)43 гликандарынын анализи боюнча биздин мурунку изилдөөбүздө табылган.
Клетка дубалынын гликанына багытталган моноклоналдык антитело аркылуу рекалцитранттуу олигосахарид эпитопторун аныктоо."Нейтралдуу" фракция ACN фракциясы жана "кислота" фракциясы - FA фракциясы.Жылуулук картасында ачык кызыл түстөр эпитоптун жогорку мазмунун, ал эми ачык көк түс бош фонду көрсөтөт.Шкаладагы түстүү маанилер N=2 формулалары үчүн чийки OD маанилерине негизделген.Антителолор тарабынан таанылган негизги эпитоптор оң жакта көрсөтүлгөн.
Бул целлюлоза эмес түзүмдөрдү эң көп колдонулган коммерциялык ферменттерди камтыган сыналган коммерциялык фермент аралашмасындагы эң кеңири таралган целлюлазалар жана гемицеллюлазалар ажырата алган жок.Ошондуктан, алардын гидролизи үчүн жаңы көмөкчү ферменттер талап кылынат.Керектүү эмес целлюлоза кошумча ферменттери жок, бул целлюлоза эмес байланыштар, алардын ата-эне кант полимерлери кыска фрагменттерге кеңири гидролизденип, коммерциялык фермент аралашмаларын колдонуу менен эриген күндө да, моносахариддерге толук айланышына жол бербейт.
Сигналдын бөлүштүрүлүшүн жана анын бириктирүү күчүн андан ары изилдөө көрсөткөндөй, байланыш эпитоптору димерлерде аз DP фракцияларына (D, E, F, DP) караганда жогорку DP кант фракцияларында (A, B, C, DP 20+ чейин) төмөн болгон (сүрөт. 1).Кислота фрагменттери нейтралдуу фрагменттерге караганда целлюлоза эмес эпитоптордо көбүрөөк кездешет.Бул көрүнүштөр биздин мурунку изилдөөбүздө байкалган үлгүгө шайкеш келет, мында жогорку DP жана кислота бөлүктөр ферментативдик гидролизге туруктуураак болгон.Демек, целлюлоза эмес гликан эпитопторунун жана U жана MeU алмаштырууларынын болушу олигосахариддердин туруктуулугуна чоң салым кошо алат.Бул милдеттүү жана аныктоо натыйжалуулугу эпитоп dimeric же тримердик олигосахарид болуп саналат, өзгөчө, төмөн DP oligosaccharides үчүн көйгөйлүү болушу мүмкүн экенин белгилей кетүү керек.Бул ар кандай узундуктагы коммерциялык олигосахариддердин жардамы менен сыналышы мүмкүн, ар биринде белгилүү бир мАб менен байланышкан бир гана эпитоп бар.
Ошентип, структура-спецификалык антителолорду колдонуу баш ийбеген байланыштардын айрым түрлөрүн ачты.Колдонулган антителонун түрүнө, ылайыктуу лигация үлгүсүнө жана ал чыгарган сигналдын күчүнө (көпчүлүк жана эң аз) жараша жаңы ферменттерди аныктоого жана толук гликоконверсия үчүн ферменттин аралашмасына жарым-сандык түрдө кошууга болот.Мисал катары ACSH олигосахариддеринин анализин алып, биз ар бир биомасса материалы үчүн гликан байланыштарынын маалымат базасын түзө алабыз.Бул жерде белгилей кетүүчү нерсе, антителолордун ар кандай жакындыгы эске алынышы керек, эгерде алардын жакындыгы белгисиз болсо, бул ар кандай антителолордун сигналдарын салыштырганда белгилүү бир кыйынчылыктарды жаратат.Мындан тышкары, гликан байланыштарын салыштыруу бир эле антитело үчүн үлгүлөрдүн ортосунда жакшы иштеши мүмкүн.Андан кийин бул өжөр байланыштарды CAZyme маалымат базасына байланыштырса болот, андан биз ферменттерди аныктай алабыз, талапкер ферменттерди тандай алабыз жана байланышты бузуучу ферменттерди сынай алабыз же биорефинарияларда колдонуу үчүн бул ферменттерди экспрессиялоо үчүн микробдук системаларды иштеп чыга алабыз44.
иммунологиялык ыкмалары lignocellulosic hydrolysates бар төмөн молекулярдык салмактагы oligosaccharides мүнөздөө үчүн альтернатива ыкмаларын толуктап кантип баа берүү үчүн, биз MALDI (сүрөт. 4, S1-S8) жана ошол эле панелинде GC-MS негизинде TMS алынган saccharides талдоо (сүрөт. 5) oligoscharide бөлүгү.MALDI олигосахариддердин молекулаларынын массалык бөлүштүрүлүшү болжолдонгон түзүлүшкө дал келээрин салыштыруу үчүн колдонулат.fig боюнча.4 ACN-A жана ACN-B нейтралдуу компоненттеринин МКсын көрсөтөт.ACN-A талдоо салмагы MeU-xylan oligosaccharides туура келет DP 4-8 (сүрөт. 4) чейин DP 22 (сүрөт. S1) чейин пентоза канттарынын бир катар тастыктады.ACN-B анализи DP 8-15 менен пентоза жана глюкоксилан сериясын тастыктады.Сүрөт S3 сыяктуу кошумча материалда, FA-C кислоталык бөлүгүнүн массасын бөлүштүрүү карталары ELISA негизиндеги mAb скринингинде табылган алмаштырылган ксиландарга шайкеш келген DP 8-15 менен (Me)U алмаштырылган пентоза канттарынын диапазонун көрсөтөт.Эпитоптор ырааттуу.
MALDI-MS спектри АБКда бар эрүүчү шайкеш келбеген олигосахариддердин.Бул жерде, (A) ACN-A methylated урон кислотасы (DP 4-8) камтыган аз салмак диапазону фракциялары алмаштырылган glucuroxylan oligosaccharides жана (B) ACN-B ксилан жана glucuroxylan (DP 8-15) менен алмаштырылган methylated урон кислотасы oligosacharides.
Отко чыдамдуу олигосахариддердин гликан калдыктарынын курамын талдоо.Бул жерде (A) GC-MS анализин колдонуу менен алынган ар кандай олигосахариддик фракциялардын TMS сахариддик курамы.(B) oligosaccharides бар ар кандай TMS-алынган кант структуралары.ACN – нейтралдуу олигосахариддерди камтыган ацетонитрилдик фракция жана FA – кислота олигосахариддерди камтыган ферул кислотасы фракциясы.
Дагы бир кызыктуу тыянак S9-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, олигосахариддик фракциянын LC-MS анализинен жасалган (ыкмаларды электрондук кошумча материалдан көрүүгө болот).Гексоза жана -OAc топторунун фрагменттери ACN-B бөлүкчөсүн байлаган учурда бир нече жолу байкалган.Бул табылга гликом жана MALDI-TOF анализинде байкалган фрагментацияны тастыктабастан, ошондой эле алдын ала иштетилген лигноцеллюлоздук биомассадагы потенциалдуу углеводдун туундулары жөнүндө жаңы маалыматтарды берет.
Биз ошондой эле TMS канттын туундусун колдонуу менен олигосахариддик фракциянын кант курамын талдадык.GC-MS колдонуп, олигосахариддик фракциядагы нейрондук (туунду эмес) жана кислоталуу канттардын (GluA жана GalA) курамын аныктадык (5-сүрөт).Глюкурон кислотасы C жана D кислоталуу компоненттеринде, ал эми галактурон кислотасы А жана В кислоталуу компоненттеринде кездешет, экөө тең кислоталуу канттардын жогорку DP компоненттери.Бул жыйынтыктар биздин ELISA жана MALDI маалыматтарын тастыктабастан, ошондой эле олигосахариддердин топтолушу боюнча мурунку изилдөөлөрүбүзгө дал келет.Ошондуктан, биз олигосахариддердин биотинилдештирүүсүн жана андан кийинки ELISA скринингин колдонуу менен заманбап иммунологиялык методдор ар кандай биологиялык үлгүлөрдөгү эрүүчү рекалцитрант олигосахариддерди аныктоо үчүн жетиштүү деп эсептейбиз.
ELISA негизделген mAb скрининг ыкмалары бир нече ар кандай ыкмалар менен тастыкталган болгондуктан, биз мындан ары бул жаңы сандык ыкманын мүмкүнчүлүктөрүн изилдөө үчүн келген.Эки коммерциялык олигосахариддер, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) жана 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) сатылып алынган жана клетка дубалынын гликанына багытталган жаңы mAb ыкмасын колдонуу менен сыналган.6-сүрөт биотинилденген байланыш сигналы менен олигосахариддердин концентрациясынын лог концентрациясынын ортосундагы сызыктуу корреляцияны көрсөтөт, бул мүмкүн болгон Лангмюр адсорбциялык моделин сунуштайт.mAbлардын арасында CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 жана CCRC-M151 XHE менен корреляцияланган, ал эми CCRC-M108, CCRC-M109 жана LM11 A2XX менен na10nm диапазонунда корреляцияланган.Эксперимент учурунда антителолордун чектелген болушуна байланыштуу ар бир олигосахарид концентрациясы менен чектелген эксперименттер жүргүзүлдү.Бул жерде белгилей кетүүчү нерсе, кээ бир антителолор субстрат катары бир эле олигосахаридге такыр башкача реакция кылышат, анткени алар бир аз башкача эпитоптор менен байланышат жана такыр башка туташтыруу жакындыктарына ээ болушу мүмкүн.Жаңы mAb ыкмасы чыныгы үлгүлөргө колдонулганда эпитопторду так аныктоонун механизмдери жана кесепеттери алда канча татаал болот.
Эки коммерциялык олигосахариддер ар кандай гликандарды максаттуу мАбдарды аныктоо диапазонун аныктоо үчүн колдонулган.Бул жерде олигосахариддердин концентрациясынын лог концентрациясы менен сызыктуу корреляциялар (A) XHE mAb менен жана (B) A2XX үчүн mAb үчүн Ленгмюр адсорбциясынын үлгүлөрүн көрсөтөт.Тиешелүү эпитоптор анализде субстрат катары колдонулган коммерциялык олигосахариддердин структураларын көрсөтөт.
Гликан-максаттуу моноклоналдык антителолорду колдонуу (гликокомикалык анализ же ELISA негизиндеги mAb скрининги) өсүмдүк биомассасын түзгөн негизги клетка дубалынын гликандарынын көбүн тереңдетилген мүнөздөмө үчүн күчтүү курал болуп саналат.Бирок, классикалык гликан анализи чоңураак клетка дубалынын гликандарын гана мүнөздөйт, анткени көпчүлүк олигосахариддер ELISA плиталарында эффективдүү иммобилизацияланбайт.Бул изилдөөдө, AFEX менен алдын ала иштетилген жүгөрү плитасы жогорку катуу заттардын курамында ферменттик гидролиздешти.Кант анализи гидролизаттагы рекалцитранттуу клетка дубалынын углеводдорунун курамын аныктоо үчүн колдонулган.Бирок, гидролизаттардагы майда олигосахариддердин мАб анализи бааланбайт жана ELISA плиталарында олигосахариддерди эффективдүү иммобилизациялоо үчүн кошумча куралдар керек.
Биз бул жерде олигосахариддердин биотинилдештирүүсүн, андан кийин NeutrAvidin ™ капталган плиталарда ELISA скринингин айкалыштыруу аркылуу mAb скринингинин жаңы жана эффективдүү олигосахаридди иммобилизациялоо ыкмасын билдиребиз.Иммобилизацияланган биотинилденген олигосахариддер антитело үчүн жетиштүү жакындыкты көрсөттү, бул рекалцитранттуу олигосахариддерди тез жана натыйжалуу аныктоого мүмкүндүк берет.Масс-спектрометриянын негизинде бул өжөр олигосахариддердин курамын талдоо иммуноскринингге бул жаңы мамиленин натыйжаларын тастыктады.Ошентип, бул изилдөөлөр гликан-максаттуу моноклоналдык антителолор менен олигосахариддердин биотинилдештирүүсүнүн жана ELISA скринингинин айкалышы олигосахариддердеги кайчылаш байланыштарды аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүн экендигин жана олигосахариддердин түзүлүшүн мүнөздөгөн башка биохимиялык изилдөөлөрдө кеңири колдонулушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Бул биотинге негизделген гликан профилин түзүү ыкмасы өсүмдүк биомассасындагы эрүүчү олигосахариддердин катаал карбонгидрат байланыштарын изилдөөгө жөндөмдүү биринчи отчет.Бул биоотун өндүрүүгө келгенде биомассанын кээ бир бөлүктөрү эмне үчүн ушунчалык өжөр экенин түшүнүүгө жардам берет.Бул ыкма гликомду анализдөө ыкмаларындагы маанилүү боштукту толтурат жана аны өсүмдүк олигосахариддеринен тышкары дагы кеңири спектрге колдонууну кеңейтет.Келечекте биз биотинилдөө үчүн робототехниканы колдонушубуз мүмкүн жана ELISA аркылуу үлгүлөрдү жогорку өндүрүмдүүлүктү талдоо үчүн биз иштеп чыккан ыкманы колдонушубуз мүмкүн.
Pioneer 33A14 гибрид уруктарынан өстүрүлгөн жүгөрү саман (CS) 2010-жылы Колорадо штатынын Рей шаарындагы Крамер фермаларынан жыйналган.Жер ээсинин уруксаты менен бул биомассаны изилдөө үчүн колдонсо болот. Үлгүлөр кургак <6% нымдуулукта бөлмө температурасында zip-lock каптарда сакталган. Үлгүлөр кургак <6% нымдуулукта бөлмө температурасында zip-lock каптарда сакталган. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае. Үлгүлөр кургак, <6% нымдуулукта бөлмө температурасында сыдырма каптарга салынган.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае с влажностью < 6%. Үлгүлөр нымдуулугу < 6% болгон бөлмө температурасында сыдырма баштыктарда сакталат.Изилдөө жергиликтүү жана улуттук колдонмолорго ылайык келген.Композициялык талдоо NREL протоколун колдонуу менен жүргүзүлгөн.Курамында 31,4% глюкан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% белок жана 13,4% күл бар экени аныкталган.
Cellic® CTec2 (138 мг протеин/мл, лот VCNI 0001) — Novozymes компаниясынан (Franklinton, NC, АКШ) целлюлаза, β-глюкозидаза жана Cellic® HTec2 (157 мг протеин/мл, лот VHN00001) комплекстүү аралашмасы.Multifect Pectinase® (72 мг протеин/мл), пектинди деградациялоочу ферменттердин татаал аралашмасы DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) тарабынан берилген.Фермент протеининин концентрациясы протеиндин мазмунун баалоо (жана белок эмес азоттун салымын алып салуу) менен Kjeldahl азоттук анализин колдонуу менен аныкталган (AOAC ыкмасы 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Диатомдуу жер 545 EMD Millipore (Billerica, MA) компаниясынан сатылып алынган.Активдештирилген көмүр (DARCO, 100 тор гранулдары), Avicel (PH-101), бук ксилан жана башка бардык химиялык заттар Сигма-Олдрихтен (Сент-Луис, МО) сатылып алынган.
AFEX алдын ала дарылоо GLBRC (Биомассаны өзгөртүү изилдөө лабораториясы, MSU, Lansing, MI, АКШ) жүргүзүлгөн.Алдын ала дарылоо 15 мүнөт 140 ° C. жүзөгө ашырылат.46 дат баспас болоттон жасалган стенддик пакеттик реактордо (Parr Instruments Company) жүктөөдө 1:1 суусуз аммиактын биомассага 60% (w/w) катышында болуу убактысы.30 мүнөткө созулду.Реактор 140°Сге чейин жеткирилип, аммиак тездик менен чыгарылып, биомассаны тез бөлмө температурасына кайтарууга мүмкүндүк берди.AFEX алдын ала иштетилген жүгөрү мешинин (ACS) курамы тазаланбаган жүгөрү мешинин (UT-CS) курамына окшош болгон.
Жогорку катуу заттар ACSH 25% (w/w) (болжол менен 8% декстран жүктөө) олигосахариддердин масштабдуу өндүрүшү үчүн баштапкы материал катары даярдалган.ACSтин ферменттик гидролизи Cellic® Ctec2 10 мг протеин/г глюкан (алдын ала иштетилген биомассада), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг протеин/г глюкан жана Multifect Pectinase (Genecor Inc, АКШ) камтыган коммерциялык фермент аралашмасын колдонуу менен аткарылды.).), 5 мг протеин/г декстран.Ферменттүү гидролиз 5 литрлик биореактордо иштөө көлөмү 3 литр, рН 4,8, 50°С жана 250 об/мин ылдамдыкта жүргүзүлгөн.Гидролизден 96 саат өткөндөн кийин гидролизат центрифугалоо жолу менен 6000 айн/мин 30 мүнөткө, андан кийин 14000 айн/мин 30 мүнөткө гидролизденбеген катуу заттарды алып салуу үчүн чогултулду.Андан кийин гидролизат 0,22 мм фильтр стакан аркылуу стерилдүү фильтрациядан өткөрүлдү.Фильтрленген гидролизат стерилдүү бөтөлкөлөргө салып 4°С температурада сакталып, андан кийин көмүртекте фракциялаштырылган.
NREL лабораториялык талдоо жол-жоболоруна ылайык экстракт негизиндеги биомассанын үлгүлөрүнүн курамын талдоо: курамын талдоо үчүн үлгүлөрдү даярдоо (NREL/TP-510-42620) жана биомассадагы структуралык углеводдорду жана лигнинди аныктоо (NREL/TP-510 – 42618)47.
Гидролизат агымынын олигосахариддик анализи 2 мл шкалада автоклав негизиндеги кислота гидролиз ыкмасын колдонуу менен жүргүзүлгөн.Гидролизат үлгүсүн 69,7 мкл 72% күкүрт кислотасы менен 10 мл бурагыч капкак түтүкчөсүнө аралаштырыңыз жана столдун үстүндө 121 °C температурада 1 саат инкубациялаңыз, музда муздатып, жогорку натыйжалуу суюк хроматография (HPLC) флаконуна чыпкалаңыз.Олигосахариддердин концентрациясы кислота-гидролизденген үлгүдөгү канттын жалпы концентрациясынан гидролизделбеген үлгүдөгү моносахариддердин концентрациясын алып салуу жолу менен аныкталды.
Кислота гидролизделген биомассадагы глюкозанын, ксилозанын жана арабинозанын концентрациялары Bio-Rad Aminex HPX-87H мамычасында автосалгыч, колонна жылыткычы, изократиялык насос жана сынуу көрсөткүчүнүн детектору менен жабдылган Shimadzu HPLC тутумунун жардамы менен анализденди.Колонна 50°C температурада кармалып, суудагы 0,6 мл/мин 5 мМ H2SO4 менен элюталанган.агым.
Гидролизаттын үстүнкү заты суюлтулган жана мономер жана олигосахариддердин курамына талданган.Ферменттүү гидролизден кийин алынган мономердик канттар Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P колонкасы жана күл коргоочу мамыча менен жабдылган HPLC тарабынан талданды.Колоннадагы температура 80°Сде сакталып, кыймылдуу фаза катары суу 0,6 мл/мин агымы менен колдонулган.Олигосахариддер 121°С суюлтулган кислотада гидролиз жолу менен аныкталды.41, 48, 49.
Сахариддин талдоо чийки, AFEX алдын ала мамиле жана бардык гидролизденген эмес биомасса калдыктары (анын ичинде сериялык клетка дубалынын үзүндүлөрүн өндүрүү жана алардын мАб скрининг) мурда сүрөттөлгөн жол-жоболорду 27, 43, 50, 51 колдонуу менен аткарылган.Гликомду анализдөө үчүн өсүмдүк клеткасынын дубалынын материалынын спиртте эрибеген калдыктары биомасса калдыктарынан даярдалат жана аммоний оксалаты (50 мМ), натрий карбонаты (50 мМ жана 0,5% в/в), КОН сыяктуу барган сайын агрессивдүү реагенттер менен сериялык экстракцияга дуушар болушат.(1M жана 4M, экөө тең 1% с/а натрий боргидриди менен) жана кислота хлорит мурда сүрөттөлгөндөй52,53.Андан кийин экстрактылар клетка дубалынын гликанына багытталган mAb50s комплекстүү панелине каршы ИФАдан өткөрүлдү жана mAb байланыш реакциялары жылуулук картасы катары көрсөтүлдү.Өсүмдүк клеткасынын дубалынын гликанына багытталган mAbs лабораториялык запастардан (CCRC, JIM жана MAC сериялары) сатылып алынган.
Олигосахариддердин бир баскычтуу биотинилдеши.Биотин-LC-гидразид менен углеводдорду конъюгациялоо төмөнкү процедураны колдонуу менен аткарылган.Биотин-LC-гидразиди (4,6 мг/12 мкмоль) диметил сульфоксидде (DMSO, 70 мкл) катуу аралаштыруу жана 65° С ысытуу менен 1 мүнөт эриди.Мөңгү уксус кислотасы (30 мкл) кошулуп, аралашма натрий цианоборогидридине (6,4 мг/100 мкмоль) куюлуп, 65°C температурада 1 мүнөттөй ысытылгандан кийин толугу менен эриди.Андан кийин кургатылган олигосахаридге (1-100 нмоль) 5тен 8 мклге чейинки реакциялык аралашма кошулуп, редукциялоочу учунда энбелгиден 10 эсе же андан көп молярдык ашыкча пайда болгон.Реакция 65°С температурада 2 саатка жүргүзүлдү, андан кийин үлгүлөр дароо тазаланды.Эч кандай натрий цианоборогидриди этикеткалоо эксперименттеринде кыскартуусуз колдонулган жана үлгүлөр 2,5 саат бою 65°С реакцияга алынган.
ELISA каптоо жана биотинилденген олигосахариддердин үлгүлөрүн жуу.25 мкл биотинилденген үлгүлөр (5 мл 0,1 М Tris буфердик эритмесинде (TBS) суюлтулган ар бир концентрацияланган үлгүнүн 100 мкл) авидин менен капталган плитанын ар бир скважинасына кошулган.Контролдук кудуктар 0,1 M TBSде 10 мкг/мл концентрациясында 50 мкл биотин менен капталган.Деионизацияланган суу бош өлчөө үчүн каптоо катары колдонулган.Планшет караңгы жерде бөлмө температурасында 2 саат инкубацияланган.Пластинканы 3 жолу 0,1% майсыздандырылган сүт менен 0,1 M TBS программасынын жардамы менен жуу.11 Grenier батир 3А үчүн.
Биринчилик антителолорду кошуу жана жуу.Ар бир кудукка 40 мкл баштапкы антитело кошуңуз.Микропластинаны 1 саатка бөлмө температурасында караңгы жерде инкубациялаңыз.Андан кийин плиталар Grenier Flat 3A үчүн №11 жуу программасы аркылуу 0,1 M TBS ичинде 0,1% сүт менен 3 жолу жуулчу.
Экинчи антителолорду кошуп, жуу.Ар бир кудукка 50 мкл чычкан/келемиш экинчилик антитело (1:5000 0,1% сүттө 0,1 M TBS менен суюлтулган) кошуңуз.Микропластинаны 1 саатка бөлмө температурасында караңгы жерде инкубациялаңыз.Андан кийин микропластинкалар 0,1% сүт менен 0,1 M TBS ичинде Grenier Flat 5A табак жуу программасы №12 аркылуу 5 жолу жуулчу.
субстрат кошуу.Негизги субстратка 50 мкл 3,3′,5,5′-тетраметилбензидинди (TMB) кошуңуз (15 мл деионизацияланган сууга 2 тамчы буфер, 3 тамчы TMB, 2 тамчы суутек перекиси кошуу менен).TMB субстрат даярдоо.жана колдонуудан мурун куюн).Микропластинаны бөлмө температурасында 30 мүнөткө инкубациялаңыз.караңгыда.
Кадамды бүтүрүп, планшетти окуңуз.Ар бир скважинага 50 мкл 1 н күкүрт кислотасын кошуп, ELISA окугучунун жардамы менен 450дөн 655 нмге чейинки абсорбенцияны жазыңыз.
Бул талдоочу заттардын 1 мг/мл деионизацияланган сууга эритмелерин даярдагыла: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактурон кислотасы (ГалА), глюкурон кислотасы (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманнозамин (манНАклукосамин), N-acetylmannosamine.(glcNAc), N-acetylgalaktosamine (galNAc), inositol (ички стандарт).1-таблицада көрсөтүлгөн 1 мг/мл кант эритмелерин кошуу жолу менен эки стандарт даярдалды. Үлгүлөр тоңдурулуп, -80°C температурада бардык суулар алынганга чейин (көбүнчө 12-18 саат) лиофилизацияланат.
Аналитикалык таразага 100–500 мкг үлгү кошуңуз.Кошулган сумманы жазыңыз.Үлгүнү эриткичтин белгилүү бир концентрациясында эритип, аны суюк аликвот катары түтүккө кошуу жакшы.Ар бир үлгү түтүгү үчүн ички стандарт катары 20 мкл 1 мг/мл инозитол колдонуңуз.Үлгүгө кошулган ички стандарттын өлчөмү стандарттык түтүккө кошулган ички эталондун көлөмү менен бирдей болушу керек.
Бурама капкактын флаконуна 8 мл суусуз метанол кошуңуз.Андан кийин 4 мл 3 N. метанолик HCl эритмеси, капкагын жаап, чайкады.Бул процессте суу колдонулбайт.
Олигосахариддердин үлгүлөрүнө жана стандарттуу TMS түтүкчөлөрүнө 500 мкл 1 М HCl метанол эритмесин кошуңуз.Үлгүлөр түнү бою (168 саат) 80°С температурада термикалык блокто инкубацияланган.Метанолиз продуктуну бөлмө температурасында кургатуу коллекторун колдонуп кургатуу.200 мкл MeOH кошуп, кайра кургатыңыз.Бул процесс эки жолу кайталанат.Үлгүгө 200 мкл метанол, 100 мкл пиридин жана 100 мкл уксус ангидридин кошуп, жакшылап аралаштырыңыз.Үлгүлөр бөлмө температурасында 30 мүнөт инкубацияланды.жана кургатылган.200 мкл метанол кошуп, кайра кургатуу керек.
200 мкл Tri-Sil кошуп, капкагы жабылган түтүктү 20 мүнөт ысытыңыз.80 ° C, андан кийин бөлмө температурасында муздатылган.Үлгүнү болжол менен 50 мкл көлөмгө чейин кургатуу үчүн кургатуу коллекторун колдонуңуз.Биз үлгүлөрдү толук кургатууга жол берген жокпуз деп белгилей кетүү маанилүү.
2 мл гексан кошуп, жакшылап аралаштырабыз.Пастер пипеткаларынын учтарын (5-8 мм) 5-3/4 дюйм диаметрдеги пипеткага айнек жүндү салып, айнек жүндүн бир бөлүгү менен толтуруңуз.Үлгүлөр 3000 г температурада 2 мүнөт центрифугаланган.Кандайдыр бир эрибеген калдыктар чөктүрүлөт.Үлгүнү 100-150 мкл чейин кургатыңыз.Болжол менен 1 мкл көлөмү 80 °C баштапкы температурада жана 2,0 мүнөттүк баштапкы убакытта GC-MSке куюлган (2-таблица).