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Novi metudi immunologichi è spettrometrichi di massa per l'analisi cumplessa di oligosaccharidi persistenti in corn stover pretrattati cù AFEX.A biomassa lignocellulosica hè una alternativa sustenibile à i carburanti fossili è hè largamente usata per sviluppà biotecnologie per a produzzione di prudutti cum'è l'alimentariu, l'alimentazione, i carburanti è i chimichi.A chjave di sti tecnulugii hè u sviluppu di i prucessi di cuncurrenza di costu per cunvertisce i carbuidrati cumplessi presenti in i muri di e cellule vegetali in zuccheri simplici cum'è glucose, xylose è arabinose.Perchè a biomassa lignocellulosica hè assai stubborn, deve esse sottumessu à trattamenti termochimici (per esempiu, esfoliazione di fibre di ammonia (AFEX), acidi diluiti (DA), liquidi ionici (IL)) è trattamenti biologichi (per esempiu, idrolisi enzimatica è fermentazione microbiana) in cumbinazioni per ottene u pruduttu desideratu..In ogni casu, quandu l'enzimi fungali cumerciali sò usati in u prucessu di l'idrolisi, solu u 75-85% di i zuccheri sulubbili formati sò monosaccaridi, è u 15-25% restante sò oligosaccharides solubili, intrattabili, chì ùn sò micca sempre dispunibili à i microorganismi.In precedenza, avemu isolatu è purificatu oligosaccaridi stubborn solubili cù una cumminazione di separazione di carbonu è terra di diatomee è cromatografia di esclusione di taglia, è ancu investigatu e so proprietà inibitori di l'enzima.Avemu trovu chì l'oligosaccharidi chì cuntenenu un altu gradu di polimerizazione (DP) i sustituzioni di l'acidu uronicu metilatu sò più difficiuli di processà cù mischi d'enzyme cummirciali cà DP bassu è oligosaccharides neutri.Quì raportemu l'usu di parechji metudi supplementari, cumprese a profilazione di glicani chì utilizanu anticorpi monoclonali (mAbs) specifichi à i glicani di a biomassa vegetale per caratterizà i legami di glicani in i muri di e cellule vegetali è l'idrolizati enzimatici, l'ionizazione di desorption laser assistita da matrice, spettrometria di massa in tempu di volu..MALDI-TOF-MS) usa picchi di diagnostichi di struttura informativa ottenuti da spettroscopia dopu a decadenza secundaria di ioni negativi, cromatografia di gas è spettrometria di massa (GC-MS) per caratterizà i ligami oligosaccharidi cù è senza derivatizazione.A causa di a piccula dimensione di oligosaccharidi (DP 4-20), sti molécule sò difficiuli d'utilizà per u ligame è a carattarizazione di mAb.Per superà stu prublema, avemu applicatu un novu metudu d'immobilizazione di oligosaccharidi basatu in conjugazione di biotina chì hà etichettatu cù successu a maiò parte di l'oligosaccharides solubili di DP bassu nantu à a superficia di u microplate, chì hè stata allora utilizata in un sistema mAb d'altu throughput per l'analisi di ligazione specifica.Stu novu metudu faciliterà in u futuru u sviluppu di saggi di glicome più avanzati in u futuru chì ponu esse usatu per isolà è caratterizà l'oligosaccharidi prisenti in biomarcatori per scopi diagnostichi.
A biomassa lignocellulosica, cumposta di materiali agriculi, forestali, erba è legnu, hè una materia prima potenziale per a produzzione di prudutti bio-basati, cumpresi l'alimentu, l'alimentazione, i carburanti è i precursori chimichi per pruduce prudutti di più valore1.I carbuidrati (cum'è a cellulosa è l'emicellulosa) prisenti in i muri di e cellule vegetali sò depolimerizzati in monosaccharidi per prucessu chimicu è biotrasformazione (cum'è l'idrolisi enzimatica è a fermentazione microbiana).I pretrattamenti cumuni includenu l'espansione di fibre d'ammonia (AFEX), l'acidu diluitu (DA), u liquidu ionicu (IL) è l'esplosione di vapore (SE), chì utilizanu una cumminazione di chimichi è calore per riduce a produzzione di lignocellulose aprendu i muri di e cellule vegetali3,4.stubbornness di a materia, 5. L'idrolisi enzimatica hè realizata à una carica di solidi elevati cù l'enzimi chì cuntenenu carbuidrati attivi cummerciale (CAZymes) è a fermentazione microbiana cù levadura transgénica o bacteria per pruduce carburanti è chimichi bio-basati 6 .
I CAZymes in enzimi cummirciali sò cumposti da una mistura cumplessa di enzimi chì sinergisticamente cleave ligami cumplessi di carbuidrati-zuccheru per furmà monosaccharides2,7.Cumu avemu infurmatu prima, a reta cumplessa di polimeri aromatici di lignina cù carbuidrati li rende assai intrattabili, chì porta à a cunversione di zuccaru incompleta, accumulendu 15-25% di oligosaccharides sessuali chì ùn sò micca pruduciuti durante l'idrolisi enzimatica di a biomassa pretrattata.Questu hè un prublema cumuni cù diversi metudi di pretrattamentu di biomassa.Certi mutivi di stu collu di bottiglia includenu l'inibizione enzimatica durante l'idrolisi, o l'assenza o livelli bassi di enzimi essenziali essenziali chì sò necessarii per rompe i ligami di zuccaru in a biomassa vegetale.Capisce a cumpusizioni è e caratteristiche strutturali di i zuccheri, cum'è i ligami di zuccaru in oligosaccharidi, ci aiuterà à migliurà a cunversione di zuccaru durante l'idrolisi, facendu i prucessi biotecnologici cuncurrenti in i costi cù i prudutti derivati ​​di u petroliu.
A determinazione di a struttura di i carbuidrati hè sfida è richiede una cumminazione di metudi cum'è a cromatografia liquida (LC)11,12, spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)13, elettroforesi capillare (CE)14,15,16 è spettrometria di massa (MS)17.,diciottu.I metudi MS cum'è a spettrometria di massa di u tempu di volu cù desorption laser è ionizazione cù una matrice (MALDI-TOF-MS) sò un metudu versatile per identificà strutture di carbuidrati.Recently, Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS of sodium ion adducts hè statu più largamente utilizatu per identificà e impronte digitali chì currispondenu à e pusizioni di attache di oligosaccharide, cunfigurazioni anomeriche, sequenze è ramificazioni 20, 21 .
L'analisi di Glycan hè un strumentu eccellente per l'identificazione in profonda di i ligami di carbuidrati22.Stu metudu usa anticorpi monoclonali (mAbs) diretti à u glicanu di u muru di a cellula vegetale cum'è sonde per capisce i ligami cumplessi di carbuidrati.Più di 250 mAbs sò dispunibuli in u mondu, cuncepiti contr'à diversi oligosaccharidi lineari è ramificati chì utilizanu diversi saccharides24.Diversi mAbs sò stati largamente utilizati per caratterizà a struttura, a cumpusizioni è e mudificazioni di u muru di a cellula vegetale, postu chì ci sò differenze significative secondu u tipu di cellula vegetale, l'urganu, l'età, u stadiu di sviluppu è l'ambiente di crescita25,26.Più recentemente, stu metudu hè statu utilizatu per capiscenu e pupulazioni di vesicule in i sistemi vegetali è animali è i so roli rispettivi in ​​u trasportu di glicani determinati da marcatori subcellulari, tappe di sviluppu o stimuli ambientali, è per determinà l'attività enzimatica.Alcune di e diverse strutture di glicani è xilani chì sò stati identificati includenu pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glucani di legami misti (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) 2 è arabino-Galactan.
Tuttavia, malgradu tutti questi sforzi di ricerca, solu uni pochi studii anu focu annantu à a natura di l'accumulazione d'oligosaccharide durante l'idrolisi di alta carica di solidi (HSL), cumpresa a liberazione di oligosaccharide, i cambiamenti di a lunghezza di a catena oligomerica durante l'idrolisi, diversi polimeri DP bassi, è e so curve.distribuzioni 30,31,32.Intantu, ancu s'è l'analisi di glycan hà dimustratu per esse un strumentu utile per un analisi cumpletu di a struttura di glycan, hè difficiule di valutà oligosaccharides DP solubili in acqua cù metudi di anticorpi.L'oligosaccharidi DP più chjuchi cù un pesu molekulari di menu di 5-10 kDa ùn si liganu micca à i platti ELISA 33, 34 è sò lavati prima di l'addizione di l'anticorpi.
Quì, per a prima volta, dimustramu un test ELISA nantu à piastre rivestite di avidina cù anticorpi monoclonali, cumminendu una prucedura di biotinilazione in un passu per oligosaccharides refrattari solubili cù analisi di glicome.U nostru approcciu à l'analisi di glicome hè statu validatu da l'analisi basata MALDI-TOF-MS è GC-MS di ligami oligosaccharidi cumplementarii utilizendu derivatizazione di trimetilsilil (TMS) di cumpusizioni di zuccaru idrolizzati.Stu approcciu innovativu pò esse sviluppatu cum'è un metudu à altu rendimentu in u futuru è truvà una applicazione più larga in a ricerca biomedica35.
E modificazioni post-traduzzione di l'enzimi è l'anticorpi, cum'è a glicosilazione,36 affettanu a so attività biologica.Per esempiu, i cambiamenti in a glicosilazione di e proteine ​​​​serum ghjucanu un rolu impurtante in l'artrite inflamatoria, è i cambiamenti in a glicosilazione sò usati cum'è marcatori diagnostichi37.Diversi glicani sò stati rappurtati in a literatura per apparisce prestu in una varietà di malatie, cumprese e malatie inflammatorii croniche di u trattu gastrointestinali è u fegatu, infezioni virali, ovari, pettu è cancers di prostata38,39,40.A capiscitura di a struttura di i glicani utilizendu metudi ELISA di glicani basati in anticorpi darà una fiducia supplementaria in a diagnosi di a malatia senza l'usu di metudi MS cumplessi.
U nostru studiu precedente hà dimustratu chì l'oligosaccaridi stubborn sò stati unhydrolyzed dopu pretrattamentu è idrolisi enzimatica (Figura 1).In u nostru travagliu publicatu prima, avemu sviluppatu un metudu di estrazione in fase solida di carbone attivatu per isolà oligosaccharidi da l'idrolizatu di corn stover pretrattatu AFEX (ACSH)8.Dopu l'estrazione iniziale è a separazione, l'oligosaccharidi sò stati fraccionati ulteriormente da a cromatografia d'esclusione di taglia (SEC) è raccolti in ordine di pesu moleculare.I monomeri di zuccaru è oligomeri liberati da diversi pretrattamenti sò stati analizati da l'analisi di a cumpusizioni di zuccaru.Quandu si compara u cuntenutu di l'oligomeri di zuccaru ottenuti da parechji metudi di pretrattamentu, a prisenza di oligosaccharides stubborn hè un prublema cumuni in a cunversione di a biomassa à monosaccharides è pò purtà à una riduzzione di u zuccheru di almenu 10-15% è ancu finu à 18%.US.Stu metudu hè utilizatu per più pruduzzione à grande scala di frazioni oligosaccharide.L'ACH resultanti è e so fraccioni successivi cù diversi pesi moleculari sò stati utilizati com'è materiale sperimentale per a carattarizazione di l'oligosaccharidi in stu travagliu.
Dopu u pretrattamentu è l'idrolisi enzimatica, l'oligosaccaridi persistenti sò stati unhydrolysed.Quì (A) hè un metudu di separazione d'oligosaccharidi in quale oligosaccharides sò isolati da AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) cù un lettu imballatu di carbone attivatu è terra di diatomee;(B) Metudu per a separazione di oligosaccharides.L'oligosaccharides sò stati più separati da a cromatografia d'esclusione di taglia (SEC);(C) Monomeri di saccaridi è oligomeri liberati da diversi pretrattamenti (acidu diluted: DA, liquid ionic: IL è AFEX).Condizioni di idrolisi enzimatica: elevata carica di solidi di 25% (w / w) (circa 8% carica di glucanu), 96 ore di idrolisi, 20 mg / g di carica enzimatica cummerciale (Ctec2: Htec2: MP-2: ratio 1: 1) è (D) Monomeri di zuccheru è oligomeri di glucose, EX xyloseed liberatu da glucose, xyloseed AF stovered da arabica è liberata.
L'analisi di glicani hà dimustratu esse un strumentu utile per un'analisi strutturale cumpleta di i glicani in estratti isolati da residui di biomassa solida.Tuttavia, i saccaridi solubili in acqua sò sottorappresentati cù stu metudu tradiziunale41, perchè l'oligosaccharidi di pocu pesu moleculare sò difficiuli di immobilizzà nantu à i platti ELISA è sò lavati prima di l'aggiunta di anticorpi.Per quessa, per u ligame di l'anticorpi è a carattarizazione, un metudu di biotinilazione in un passu hè statu utilizatu per rivesti oligosaccharidi solubili, non conformi, nantu à i platti ELISA rivestiti d'avidina.Stu metudu hè statu pruvatu cù u nostru ACSH pruduciutu prima è una frazzioni basata nantu à u so pesu moleculare (o gradu di polimerizazione, DP).A biotinilazione in un passu hè stata utilizata per aumentà l'affinità di ubligatoriu di l'oligosaccharide aghjunghjendu biotin-LC-hydrazide à l'estremità riducente di carbuidrati (Fig. 2).In suluzione, u gruppu hemiacetal à l'estremità riduzzione reagisce cù u gruppu hydrazide di biotin-LC-hydrazide per furmà un ligame hydrazone.In a prisenza di l'agente riducente NaCNBH3, u legame di hydrazone hè ridutta à un pruduttu finale biotinilatu stabile.Cù a mudificazione di l'estremità di riduzzione di zuccaru, u ligame di oligosaccharides DP bassu à i platti ELISA hè diventatu pussibule, è in u nostru studiu hè statu fattu nantu à i platti rivestiti di avidina cù mAbs glycan-targeted.
Screening di anticorpi monoclonali basati su ELISA per oligosaccaridi biotinilati.Quì (A) biotinilazione cumminata di oligosaccharides è screening ELISA sussegwenti cù mAbs glycan-targeted nantu à platti rivestiti di NeutrAvidin è (B) mostra una prucedura in un passu per a biotinilazione di i prudutti di reazione.
I platti rivestiti d'avidina cù l'anticorpi cunjugati à l'oligosaccharide sò stati aghjunghje à l'anticorpi primari è secundarii è lavati in un mediu sensible à a luce è à u tempu.Dopu chì u ligame di l'anticorpu hè cumpletu, aghjunghje sustrato TMB per incubate a piastra.A reazzione hè stata finalmente firmata cù l'acidu sulfuricu.I platti incubati sò stati analizati cù un lettore ELISA per determinà a forza di ligame di ogni anticorpu per detectà a reticulazione specifica di l'anticorpu.Per i dettagli è i paràmetri di l'esperimentu, vede a sezione currispundente "Materiali è Metudi".
Dimustremu l'utilità di stu metudu novu sviluppatu per applicazioni specifiche carattirizzandu l'oligosaccharidi solubili presenti in ACSH è ancu in frazioni oligosaccharidi crude è purificate isolate da idrolisati lignocellulosici.Comu mostra in a Figura 3, i xilani sustituiti da epitopi più cumuni identificati in ACSH cù metudi di analisi di glicome bioacilati sò generalmente uronici (U) o metiluronici (MeU) è arabinogalactani pectici.A maiò parte di elli sò stati truvati ancu in u nostru studiu precedente nantu à l'analisi di glicani di solidi non idrolizzati (UHS)43.
Rilevazione di epitopi oligosaccharidi recalcitranti cù un anticorpu monoclonale direttu à u glycan di a parete cellulare.A frazzioni "neutrali" hè a frazzioni ACN è a frazzioni "acidica" hè a frazzioni FA.I rossi più brillanti nantu à a mappa di calore indicanu un cuntenutu di epitope più altu, è i blu più brillanti indicanu un fondo in biancu.I valori di u culore nantu à a scala sò basati nantu à i valori OD bruti per formulazioni N = 2.L'epitopi principali ricunnisciuti da l'anticorpi sò mostrati à a diritta.
Queste strutture non-cellulosa ùn puderanu micca esse chjappate da e cellulasi è hemicellulasi più cumuni in a mistura di enzimi cummirciali pruvati, chì include l'enzimi cummerciale più cumunimenti utilizati.Dunque, novi enzimi ausiliarii sò necessarii per a so idrolisi.Senza l'enzimi accessori non-cellulosa necessarii, questi ligami non-cellulosa impediscenu a cunversione cumpleta à monosaccharides, ancu s'è i so polimeri di zuccaru parenti sò largamente idrolizzati in frammenti più brevi è dissoluti cù mischi di enzimi cummerciale.
Ulteriori studiu di a distribuzione di u signale è a so forza di ubligatoriu hà dimustratu chì l'epitopi di ubligatoriu eranu più bassi in frazioni di zuccaru DP (A, B, C, DP finu à 20+) chì in frazioni DP bassu (D, E, F, DP) in dimers) (Fig. 1).I frammenti di l'acidu sò più cumuni in l'epitopi non-cellulosa chì i frammenti neutri.Questi fenomeni sò cunsistenti cù u mudellu osservatu in u nostru studiu precedente, induve l'alti DP è i frati acidi eranu più resistenti à l'idrolisi enzimatica.Dunque, a prisenza di epitopi di glycan non cellulosa è di sustituzzioni U è MeU pò cuntribuisce assai à a stabilità di l'oligosaccharidi.Hè devi esse nutatu chì l'efficienza di ubligatoriu è di deteczione pò esse problematica per oligosaccharides DP bassu, soprattuttu se l'epitope hè un oligosaccharide dimericu o trimericu.Questu pò esse pruvatu cù oligosaccharidi cummirciali di diverse lunghezze, ognunu cuntene un solu epitope chì si lega à un mAb specificu.
Cusì, l'usu di l'anticorpi specifichi di a struttura palesa certi tipi di ligami recalcitranti.Sicondu u tipu d'anticorpu utilizatu, u mudellu di ligation appropritatu, è a forza di u signale chì pruduce (a più è u menu abbundante), i novi enzimi ponu esse identificati è aghjuntu semi-quantitatively à a mistura di l'enzima per una glycoconversion più completa.Pigliendu l'analisi di l'oligosaccharidi ACSH cum'è un esempiu, pudemu creà una basa di dati di ligami glycan per ogni materiale di biomassa.Si deve esse nutatu quì chì a differente affinità di l'anticorpi deve esse cunsideratu, è se a so affinità hè scunnisciuta, questu crearà certe difficultà quandu paragunate i signali di diversi anticorpi.Inoltre, a comparazione di ligami glicani pò travaglià megliu trà e mostre per u stessu anticorpu.Questi ligami stubborn ponu esse ligati à a basa di dati CAZyme, da quale pudemu identificà l'enzimi, selezziunà l'enzimi candidati è pruvà per l'enzimi di rottura di ligami, o sviluppà sistemi microbichi per sprime sti enzimi per l'usu in bioraffinerie44.
Per evaluà cumu i metudi immunologichi cumplementarii metudi alternativi per caratterizà l'oligosaccharides di pesu moleculare pocu prisenti in lignocellulosic hydrolysates, avemu realizatu MALDI (Fig. 4, S1-S8) è analisi di saccharides derivati ​​​​di TMS basatu in GC-MS nantu à u stessu panel (Fig. 5) oligosaccharide part.MALDI hè utilizatu per paragunà se a distribuzione di massa di molécule oligosaccharide currisponde à a struttura prevista.Nantu à fig.4 mostra u MC di i cumpunenti neutri ACN-A è ACN-B.L'analisi ACN-A cunfirmò una varietà di zuccheri di pentosa chì varieghja da DP 4-8 (Fig. 4) à DP 22 (Fig. S1), chì i pesi currispondenu à MeU-xylan oligosaccharides.L'analisi ACN-B hà cunfirmatu a serie di pentosa è glucoxylan cù DP 8-15.In u materiale supplementu cum'è a Figura S3, e carte di distribuzione di massa acida FA-C mostranu una gamma di zuccheri pentosi sustituiti (Me) U cù un DP di 8-15 chì sò coerenti cù i xilani sustituiti truvati in u screening mAb basatu in ELISA.L'epitopi sò cunsistenti.
Spettru MALDI-MS di oligosaccharidi solubili non conformi presenti in ACS.Quì, (A) ACN-A frazioni di gamma bassa di pesu chì cuntenenu l'acidu uronicu methylated (DP 4-8) sustituitu glucuroxylan oligosaccharides è (B) ACN-B xylan è methylated uronic acid oligosaccharides sustituitu cù glucuroxylan (DP 8-15).
Analisi di a cumpusizioni di u residu di glycan di oligosaccharides refrattarii.Eccu (A) A cumpusizioni di saccharide TMS di diverse frazioni oligosaccharidi ottenute cù l'analisi GC-MS.(B) Strutture di varii zuccheri derivati ​​da TMS prisenti in oligosaccharidi.ACN - a frazione di acetonitrile chì cuntene oligosaccharidi neutri è FA - a frazione di l'acidu ferulicu chì cuntene oligosaccharidi acidi.
Un'altra cunclusione interessante hè stata tirata da l'analisi LC-MS di a frazione oligosaccharide, cum'è mostra in a Figura S9 (i metudi ponu esse vistu in u materiale supplementu elettronicu).Frammenti di gruppi di hexose è -OAc sò stati osservati ripetutamente durante a ligazione di a frazione ACN-B.Questa scuperta ùn solu cunfirma a frammentazione osservata in l'analisi di glicome è MALDI-TOF, ma ancu furnisce una nova infurmazione nantu à i putenziali derivati ​​di carbuidrati in a biomassa lignocellulosica pretrattata.
Avemu ancu analizatu a cumpusizioni di zuccheru di a frazione oligosaccharide utilizendu a derivatizazione di zuccaru TMS.Utilizendu GC-MS, avemu determinatu a cumpusizioni di zuccheri neurale (non-derivati) è acidi (GluA è GalA) in a frazione oligosaccharide (Fig. 5).L'acidu glucuronicu si trova in i cumpunenti acidi C è D, mentre chì l'acidu galacturonicu si trova in i cumpunenti acidi A è B, chì sò dui cumpunenti DP elevati di zuccheri acidi.Questi risultati ùn solu cunfirmanu i nostri dati ELISA è MALDI, ma sò ancu coherenti cù i nostri studii previ di l'accumulazione d'oligosaccharide.Dunque, credemu chì i metudi immunologichi muderni chì utilizanu a biotinilazione di oligosaccharidi è u screening ELISA sussegwente sò abbastanza per detect oligosaccharides recalcitrant solubili in diversi campioni biologichi.
Siccomu i metudi di screening mAb basati in ELISA sò stati validati da parechji metudi diffirenti, avemu vulutu scopre più u putenziale di stu novu metudu quantitativo.Dui oligosaccharidi cummirciali, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) è 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), sò stati acquistati è testati cù un novu approcciu mAb destinatu à u glycan di a parete cellulare.A Figura 6 mostra una correlazione lineale trà u signale di ubligatoriu biotinilatu è a cuncentrazione log di a concentrazione di oligosaccharide, chì suggerenu un pussibule mudellu di adsorption Langmuir.Trà i mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, è CCRC-M151 correlati cù XHE, è CCRC-M108, CCRC-M109 è LM11 correlati cù A2XX in una gamma di 1 nm à 100 nano.A causa di a dispunibilità limitata di l'anticorpi durante l'esperimentu, esperimenti limitati sò stati realizati cù ogni concentrazione di oligosaccharide.Si deve esse nutatu quì chì certi anticorpi reagiscenu assai diversamente à u listessu oligosaccharide cum'è un sustrato, presumibbilmente perchè si liganu à epitopi ligeramente differenti è ponu avè affinità di ligame assai diverse.I miccanismi è l'implicazioni di l'identificazione precisa di l'epitopi seranu assai più cumplessi quandu u novu approcciu mAb hè applicatu à campioni reali.
Dui oligosaccharidi cummirciali sò stati utilizati per determinà a gamma di rilevazione di diversi mAbs di glycan-targeting.Quì, correlazioni lineari cù logu concentrazione di concentrazione di oligosaccharide indicanu mudelli di adsorption Langmuir per (A) XHE cù mAb è (B) A2XX cù mAb.L'epitopi currispondenti indicanu e strutture di l'oligosaccharidi cummirciali utilizati com'è sustrati in l'assay.
L'usu di l'anticorpi monoclonali di glycan-targeted (analisi glycocomic o screening mAb basatu in ELISA) hè un strumentu putente per una carattarizazione approfondita di a maiò parte di i principali glicani di a parete cellulare chì custituiscenu a biomassa vegetale.In ogni casu, l'analisi classica di glicani carattirizza solu i glicani di a parete cellulare più grande, postu chì a maiò parte di l'oligosaccharidi ùn sò micca immobilizzati in modu efficiente nantu à i platti ELISA.In questu studiu, a stufa di granu pretrattata AFEX hè stata idrolizzata enzimaticamente à un altu cuntenutu di solidi.L'analisi di zuccaru hè stata utilizata per determinà a cumpusizioni di i carbuidrati di u muru di cellula recalcitrant in l'idrolizatu.Tuttavia, l'analisi mAb di oligosaccharidi più chjuchi in l'idrolizati hè sottovalutata, è sò necessarii strumenti supplementari per immobilizzà efficacemente oligosaccharides nantu à i platti ELISA.
Riportemu quì un metudu di immobilizzazione di oligosaccharidi novu è efficiente per u screening di mAb cumminendu a biotinilazione di oligosaccharidi seguita da u screening ELISA nantu à piastre rivestite di NeutrAvidin™.L'oligosaccharidi biotinilati immobilizzati mostranu una affinità sufficiente per l'anticorpu per permettà a rilevazione rapida è efficace di oligosaccharidi recalcitranti.L'analisi di a cumpusizioni di sti oligosaccharides stubborn basatu nantu à spettrometria di massa hà cunfirmatu i risultati di stu novu approcciu à l'immunoscreening.Cusì, sti studii dimustranu chì a cumminazzioni di biotinilazione oligosaccharide è screening ELISA cù anticorpi monoclonali di glycan-targeted pò esse usata per detectà i crosslinks in oligosaccharides è pò esse largamente appiicata in altri studii biochimichi chì caratterizzanu a struttura di oligosaccharides.
Stu metudu di prufilu di glycan basatu in biotina hè u primu rapportu capace di investigà i ligami di carbuidrati recalcitranti di oligosaccharides solubili in a biomassa vegetale.Questu aiuta à capisce perchè certi parti di a biomassa sò cusì stubborn quandu si tratta di produzzione di biocarburanti.Stu metudu riempia una lacuna impurtante in i metudi di analisi di glicome è estende a so applicazione à una gamma più larga di sustrati oltre l'oligosaccharidi vegetali.In u futuru, pudemu usà a robotica per a biotinilazione è aduprà u metudu chì avemu sviluppatu per l'analisi d'alta produzzione di campioni cù ELISA.
A paglia di granu (CS) cultivata da i semi hibridi Pioneer 33A14 hè stata cugliera in 2010 da Kramer Farms in Ray, Colorado.Cù u permessu di u pruprietariu, sta biomassa pò esse usata per a ricerca. I campioni sò stati guardati secchi < 6% umidità in sacchetti zip-lock in a temperatura di l'ambienti. I campioni sò stati guardati secchi < 6% umidità in sacchetti zip-lock in a temperatura di l'ambienti. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнах с застежкой-молнией при комтнатной I campioni sò stati guardati secchi à <6% di umidità in sacchetti di zipper à a temperatura di l'ambienti.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. I campioni sò guardati in sacchetti di zipper à a temperatura di l'ambienti cù umidità < 6%.U studiu cumpletu cù e linee lucali è naziunali.L'analisi cumpusizionale hè stata realizata cù u protocolu NREL.A cumpusizioni hè stata trovata chì cuntene 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% proteina è 13.4% cendra.
Cellic® CTec2 (138 mg di proteina/ml, lot VCNI 0001) hè una mistura cumplessa di cellulasi, β-glucosidasi è Cellic® HTec2 (157 mg di proteina/ml, lot VHN00001) da Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg di proteina/mL), una mistura cumplessa di enzimi degradanti di pectina, hè stata donata da DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).A cuncentrazione di a proteina di l'enzima hè stata determinata da stima di u cuntenutu di prutezione (è sottrazione di a cuntribuzione di nitrogenu non-protein) utilizendu l'analisi di nitrogenu Kjeldahl (metu AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).A terra di diatomee 545 hè stata acquistata da EMD Millipore (Billerica, MA).Carbon attivatu (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, è tutti l'altri chimichi sò stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
U pretrattamentu AFEX hè statu realizatu in GLBRC (Laboratory Research di Biomass Conversion, MSU, Lansing, MI, USA).U pre-trattamentu hè stata fatta à 140 ° C. per 15 minuti.46 tempu di residenza à u rapportu 1: 1 di ammonia anidra à biomassa à 60% (w / w) di carica in un reactore in batchtop in acciaio inox (Parr Instruments Company).Pigliò 30 minuti.U reactore hè stata purtata à 140 ° C è l'ammonia hè stata liberata rapidamente, chì permette à a biomassa di vultà rapidamente à a temperatura di l'ambienti.A cumpusizioni di AFEX pre-treated corn stover (ACS) era simile à quella di corn stover non trattata (UT-CS).
Alti solidi ACSH 25% (w/w) (circa 8% di carica di destranu) hè stata preparata cum'è materiale di partenza per a produzzione à grande scala di oligosaccharidi.L'idrolisi enzimatica di l'ACS hè stata realizata utilizendu una mistura enzimatica cummerciale chì include Cellic® Ctec2 10 mg di proteina / g glucan (in biomassa pretrattata), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg di proteina / g glucan, è Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg di proteina/g destrano.L'idrolisi enzimatica hè stata fatta in un bioreattore di 5 litri cù un voluminu di travagliu di 3 litri, pH 4,8, 50 ° C è 250 rpm.Dopo l'idrolisi per 96 ore, l'idrolizzato è stato raccolto per centrifugazione a 6000 rpm per 30 minuti e poi a 14000 rpm per 30 minuti per rimuovere i solidi non idrolizzati.L'idrolizatu hè statu sottumessu à una filtrazione sterile attraversu un becher filtrante di 0,22 mm.L'idrolizatu filtratu hè statu conservatu in buttigli sterili à 4 ° C è dopu fraccionatu nantu à carbone.
Analisi di a cumpusizioni di campioni di biomassa basati in estratti secondu e prucedure di analisi di laboratori NREL: preparazione di campioni per l'analisi di cumpusizioni (NREL/TP-510-42620) è determinazione di carbuidrati strutturali è lignina in biomassa (NREL/TP-510 - 42618)47.
L'analisi di l'oligosaccharide di u flussu di l'idrolizatu hè stata realizata nantu à una scala di 2 ml cù un metudu di l'idrolisi di l'acidu in autoclave.Imbulighjate u campione di l'idrolizatu cù 69,7 µl d'acidu sulfuricu 72% in un tubu di cultura di tappi a vite da 10 ml è incubate per 1 ora nantu à un bancone à 121 ° C, rinfriscà nantu à ghiaccio è filtru in una fiala di cromatografia liquida di alta prestazione (HPLC).A cuncintrazione di oligosaccharidi hè stata determinata da sottrazione di a cuncentrazione di monosaccharides in a mostra non-hydrolyzed da a cuncentrazione di zuccaru tutale in u sample acid-hydrolyzed.
E cuncentrazioni di glucose, xilose è arabinose in a biomassa idrolizzata à l'acidu sò stati analizati cù un sistema HPLC Shimadzu equipatu di un autosampler, un riscaldatore di colonna, una pompa isocratica è un detector d'indice di rifrazione nantu à una colonna Bio-Rad Aminex HPX-87H.A colonna hè stata mantenuta à 50 ° C è eluita cù 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 in acqua.flussu.
U supernatante di l'idrolizatu hè stata diluita è analizata per u cuntenutu di monomeru è oligosaccharide.I zuccheri monomerici ottenuti dopu l'idrolisi enzimatica sò stati analizati da HPLC equipatu di una colonna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P è una colonna di guardia di cendre.A temperatura di a colonna hè stata mantenuta à 80 ° C, l'acqua hè stata aduprata cum'è a fase mobile cù un flussu di 0,6 ml / min.L'oligosaccharidi sò stati determinati da l'idrolisi in l'acidu diluitu à 121 ° C secondu i metudi descritti in refs.41, 48, 49.
L'analisi di saccharide hè stata realizata nantu à i residui di biomassa cruda, AFEX pre-trattata è tutti i non-hydrolysed biomass (cumpresa a pruduzzione di l'estratti di u muru di cellula seriale è u so screening mAb) utilizendu prucedure descritte prima 27, 43, 50, 51.Per l'analisi di glicome, i residui insolubili in alcolu di u materiale di u muru di a pianta sò preparati da i residui di biomassa è sottumessi à l'estrazione seriale cù reagenti sempre più aggressivi cum'è oxalate d'ammoniu (50 mM), carbonate di sodiu (50 mM è 0,5% w / v), CON.(1M è 4M, tramindui cù 1% w / v borohydrure di sodiu) è chlorite acidu cum'è descrittu prima52,53.L'estratti sò stati sottumessi à ELISA contr'à un pannellu cumplessu di mAb50s diretti à u glycan di u muru di a cellula, è e reazzioni di u ligame di mAb sò stati presentati cum'è una mappa di calore.I mAbs destinati à u glicanu di a parete di e cellule vegetali sò stati acquistati da i stock di laboratori (serie CCRC, JIM è MAC).
Biotinilazione in un passu di oligosaccharidi.A cunjugazione di carbuidrati cù biotin-LC-hydrazide hè stata realizata cù a prucedura seguente.Biotin-LC-hydrazide (4,6 mg / 12 μmol) hè stata dissolta in dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) da una agitazione vigorosa è calore à 65 ° C per 1 min.L'acidu acìticu glaciale (30 µl) hè aghjuntu è a mistura hè stata versata nantu à cianoborohydrure di sodiu (6,4 mg/100 µmol) è dissolutu cumplettamente dopu riscaldamentu à 65 ° C per circa 1 minutu.Dopu, da 5 à 8 μl di a mistura di a reazione hè stata aghjunta à l'oligosaccharide seccu (1-100 nmol) per ottene un eccessu molare di 10 volte o più di l'etichetta sopra l'estremità riducente.A reazzione hè stata fatta à 65 ° C per 2 h, dopu chì i campioni sò stati purificati immediatamente.Nisun cianoborohydrure di sodiu hè stata utilizata in l'esperimenti di l'etichettatura senza riduzzione, è i campioni sò stati reazzione à 65 ° C. per 2,5 ore.
Rivestimentu ELISA è lavatu di campioni di oligosaccharidi biotinilati.25 μl di campioni biotinilati (100 μl di ogni mostra cuncentrata diluita in 5 ml di soluzione tampone Tris 0,1 M (TBS)) sò stati aghjuntu à ogni pozzu di a piastra rivestita di avidina.I pozzi di cuntrollu sò stati rivestiti cù 50 μl di biotina à una cuncentrazione di 10 μg / ml in 0.1 M TBS.L'acqua deionizzata hè stata aduprata cum'è un revestimentu per e misure in biancu.A tableta hè incubata per 2 ore à a temperatura di l'ambienti in u bughju.Lavate a piastra 3 volte cù 0,1% di latte scrematu in 0,1 M TBS cù u prugramma n.11 per Grenier flat 3A.
Aggiunta è lavatura di anticorpi primari.Aghjunghjite 40 µl di anticorpu primariu à ogni pozzu.Incubate u microplate per 1 ora à a temperatura di l'ambienti in u bughju.I piatti sò stati poi lavati 3 volte cù 0.1% di latte in 0.1M TBS cù u prugramma di lavaggio #11 per Grenier Flat 3A.
Aghjunghjite l'anticorpu secundariu è lavate.Aggiungere 50 µl di anticorpi secondari di mouse/rat (diluito 1:5000 in latte 0,1% in 0,1 M TBS) in ogni pozzo.Incubate u microplate per 1 ora à a temperatura di l'ambienti in u bughju.I microplate sò stati poi lavati 5 volte cù 0,1% di latte in 0,1 M TBS cù u prugramma Grenier Flat 5A di lavaggio di piastre #12.
Aghjunghjendu un sustrato.Aghjunghjite 50 µl di 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) à u sustrato di basa (aghjunghjendu 2 gocce di buffer, 3 gocce di TMB, 2 gocce di perossu di l'idrogenu à 15 ml d'acqua deionizzata).Preparate u sustrato TMB.è vortex prima di l'usu).Incubate u microplate à a temperatura di l'ambienti per 30 minuti.In u bughju.
Cumplete u passu è leghje a tableta.Aggiungere 50 µl di acido sulfurico 1 N in ogni pozzetto e registrare l'assorbanza da 450 a 655 nm usando un lettore ELISA.
Preparate 1 mg / ml di suluzione di questi analiti in acqua deionizzata: arabinose, ramnose, fucose, xilose, àcitu galacturonic (GalA), àcitu glucuronicu (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine .(glcNAc), N-acetilgalattosamina (galNAc), inositol (standard internu).Dui standard sò stati preparati aghjunghjendu i suluzioni di zuccaru 1 mg / mL mostratu in a Table 1. I campioni sò congelati è lyophilized à -80 ° C. finu à chì tutte l'acqua hè eliminata (di solitu circa 12-18 ore).
Aghjunghjite 100-500 µg di campione à i tubi di tappi a vite in una bilancia analitica.Registrate a quantità aghjuntu.Hè megliu di dissolve a mostra in una cuncentrazione specifica di solvente è aghjunghje à u tubu cum'è una aliquota liquida.Aduprate 20 µl di 1 mg/ml inositol cum'è standard internu per ogni tubu di mostra.A quantità di standard internu aghjuntu à a mostra deve esse uguali à a quantità di standard internu aghjuntu à u tubu standard.
Aghjunghjite 8 ml di metanol anidru à un vial di tappa a vite.Allora 4 ml di suluzione 3 N. metanolica HCl, capped and shake.Stu prucessu ùn usa micca acqua.
Aggiungere 500 µl di soluzione di metanolo HCl 1 M ai campioni di oligosaccaridi e ai tubi TMS standard.I campioni sò stati incubati per a notte (168 ore) à 80 ° C. in un bloccu termale.Asciugà u pruduttu di metanolisi à a temperatura di l'ambienti cù un manifold di secca.Aggiuncenu 200 µl di MeOH è siccate di novu.Stu prucessu hè ripetutu duie volte.Aggiungere 200 µl di metanolo, 100 µl di piridina e 100 µl di anidride acetica al campione e mischiare bene.I campioni sò stati incubati à a temperatura di l'ambienti per 30 minuti.è secca.Aghjunghjite 200 µl di metanolu è siccate di novu.
Aggiungere 200 µl di Tri-Sil e riscaldare il tubo per 20 minuti.80 ° C, dopu rinfriscata à a temperatura di l'ambienti.Aduprate un manifold di essiccazione per asciugà ulteriormente a mostra à un voluminu di circa 50 µl.Hè impurtante di nutà chì ùn avemu micca permessu chì i campioni siccanu completamente.
Aggiuncenu 2 ml di hexane è mischjà bè cù vortexing.Riempite e punte di pipette Pasteur (5-8 mm) cun un pezzu di lana di vetru inserindu a lana di vetru nantu à una pipetta di 5-3/4 inch di diametru.I campioni sò stati centrifugati à 3000 g per 2 minuti.Ogni residuu insoluble hè precipitatu.Asciugà u campione à 100-150 µl.Un volume di circa 1 μl hè statu iniettatu in u GC-MS à una temperatura iniziale di 80 ° C è un tempu iniziale di 2,0 minuti (Table 2).