Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು.ನೀವು ಬಳಸುತ್ತಿರುವ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯು ಸೀಮಿತ CSS ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿ).ಈ ಮಧ್ಯೆ, ನಿರಂತರ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು ಜಾವಾಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ರೆಂಡರ್ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.
ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೋವರ್‌ನಲ್ಲಿನ ನಿರಂತರ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಹೊಸ ರೋಗನಿರೋಧಕ ಮತ್ತು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಕ್ ವಿಧಾನಗಳು AFEX ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರ್ವಭಾವಿಯಾಗಿ ಸಂಸ್ಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ.ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಬಯೋಮಾಸ್ ಪಳೆಯುಳಿಕೆ ಇಂಧನಗಳಿಗೆ ಸಮರ್ಥನೀಯ ಪರ್ಯಾಯವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಆಹಾರ, ಆಹಾರ, ಇಂಧನಗಳು ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕಗಳಂತಹ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಜೈವಿಕ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನಗಳ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶವೆಂದರೆ ಸಸ್ಯದ ಜೀವಕೋಶದ ಗೋಡೆಗಳಲ್ಲಿರುವ ಸಂಕೀರ್ಣ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗ್ಲೂಕೋಸ್, ಕ್ಸೈಲೋಸ್ ಮತ್ತು ಅರಾಬಿನೋಸ್‌ನಂತಹ ಸರಳ ಸಕ್ಕರೆಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲು ವೆಚ್ಚ-ಸ್ಪರ್ಧಾತ್ಮಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ.ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಬಯೋಮಾಸ್ ತುಂಬಾ ಮೊಂಡುತನದಿಂದ ಕೂಡಿರುವುದರಿಂದ, ಅಪೇಕ್ಷಿತ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಅದನ್ನು ಥರ್ಮೋಕೆಮಿಕಲ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳಿಗೆ (ಉದಾ, ಅಮೋನಿಯಾ ಫೈಬರ್ ಎಕ್ಸ್‌ಫೋಲಿಯೇಶನ್ (AFEX), ದುರ್ಬಲ ಆಮ್ಲಗಳು (DA), ಅಯಾನಿಕ್ ದ್ರವಗಳು (IL)) ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳಿಗೆ (ಉದಾ, ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಯ ಹುದುಗುವಿಕೆ) ಒಳಪಡಿಸಬೇಕು..ಆದಾಗ್ಯೂ, ಜಲವಿಚ್ಛೇದನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರಗಳ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದಾಗ, ರೂಪುಗೊಂಡ ಕರಗುವ ಸಕ್ಕರೆಗಳಲ್ಲಿ ಕೇವಲ 75-85% ಮಾತ್ರ ಮೊನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಉಳಿದ 15-25% ಕರಗುವ, ಕರಗದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು, ಅವು ಯಾವಾಗಲೂ ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಗಳಿಗೆ ಲಭ್ಯವಿರುವುದಿಲ್ಲ.ಹಿಂದೆ, ನಾವು ಕಾರ್ಬನ್ ಮತ್ತು ಡಯಾಟೊಮ್ಯಾಸಿಯಸ್ ಭೂಮಿಯ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಮತ್ತು ಗಾತ್ರದ ಹೊರಗಿಡುವ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿಯ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕರಗಬಲ್ಲ ಮೊಂಡುತನದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಿ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಕಿಣ್ವದ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಸಹ ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ.ಕಡಿಮೆ ಡಿಪಿ ಮತ್ತು ತಟಸ್ಥ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ ಪಾಲಿಮರೀಕರಣ (ಡಿಪಿ) ಮೆಥೈಲೇಟೆಡ್ ಯುರೋನಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಮಿಶ್ರಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೊಳಿಸಲು ಹೆಚ್ಚು ಕಷ್ಟಕರವೆಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ.ಸಸ್ಯ ಜೀವಕೋಶದ ಗೋಡೆಗಳು ಮತ್ತು ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಸಸ್ಯ ಜೀವರಾಶಿ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳಿಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು (mAbs) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಪ್ರೊಫೈಲಿಂಗ್ ಸೇರಿದಂತೆ ಹಲವಾರು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ವಿಧಾನಗಳ ಬಳಕೆಯನ್ನು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ, ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್-ಸಹಾಯದ ಲೇಸರ್ ಡಿಸಾರ್ಪ್ಶನ್ ಅಯಾನೀಕರಣ, ಸಮಯ-ಆಫ್-ಫ್ಲೈಟ್ ಮಾಸ್-ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ..MALDI-TOF-MS) ಋಣಾತ್ಮಕ ಅಯಾನುಗಳು, ಗ್ಯಾಸ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ ಮತ್ತು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (GC-MS) ನ ದ್ವಿತೀಯಕ ಕೊಳೆಯುವಿಕೆಯ ನಂತರ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯಿಂದ ಪಡೆದ ರಚನೆ-ಮಾಹಿತಿ ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ಶಿಖರಗಳನ್ನು ವ್ಯುತ್ಪನ್ನದೊಂದಿಗೆ ಮತ್ತು ಇಲ್ಲದೆ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಬಳಸುತ್ತದೆ.ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ (DP 4-20) ಸಣ್ಣ ಗಾತ್ರದ ಕಾರಣ, ಈ ಅಣುಗಳು mAb ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಗೆ ಬಳಸಲು ಕಷ್ಟಕರವಾಗಿದೆ.ಈ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ಹೋಗಲಾಡಿಸಲು, ನಾವು ಹೊಸ ಬಯೋಟಿನ್ ಸಂಯೋಗ-ಆಧಾರಿತ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಇಮೊಬಿಲೈಸೇಶನ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ್ದೇವೆ ಅದು ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್ ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ DP ಕರಗುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದೆ, ನಂತರ ಇದನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಬಂಧನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಥ್ರೋಪುಟ್ mAb ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಈ ಹೊಸ ವಿಧಾನವು ಭವಿಷ್ಯದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಸುಧಾರಿತ ಉನ್ನತ ಥ್ರೋಪುಟ್ ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ಸುಲಭಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ಉದ್ದೇಶಗಳಿಗಾಗಿ ಬಯೋಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇರುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಮತ್ತು ನಿರೂಪಿಸಲು ಬಳಸಬಹುದು.
ಲಿಗ್ನೊಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಬಯೋಮಾಸ್, ಕೃಷಿ, ಅರಣ್ಯ, ಹುಲ್ಲು ಮತ್ತು ವುಡಿ ವಸ್ತುಗಳಿಂದ ಕೂಡಿದೆ, ಆಹಾರ, ಆಹಾರ, ಇಂಧನ ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ಜೈವಿಕ-ಆಧಾರಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಸಂಭಾವ್ಯ ಫೀಡ್‌ಸ್ಟಾಕ್ ಆಗಿದೆ.ಸಸ್ಯದ ಜೀವಕೋಶದ ಗೋಡೆಗಳಲ್ಲಿರುವ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳು (ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಮತ್ತು ಹೆಮಿಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್‌ನಂತಹವು) ರಾಸಾಯನಿಕ ಸಂಸ್ಕರಣೆ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಪರಿವರ್ತನೆ (ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಹೈಡ್ರೊಲಿಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಯ ಹುದುಗುವಿಕೆ ಮುಂತಾದವು) ಮೂಲಕ ಮೊನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಾಗಿ ಡಿಪೋಲಿಮರೀಕರಣಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಸಾಮಾನ್ಯ ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳಲ್ಲಿ ಅಮೋನಿಯಾ ಫೈಬರ್ ವಿಸ್ತರಣೆ (AFEX), ಡೈಲ್ಯೂಟ್ ಆಸಿಡ್ (DA), ಅಯಾನಿಕ್ ಲಿಕ್ವಿಡ್ (IL), ಮತ್ತು ಸ್ಟೀಮ್ ಸ್ಫೋಟ (SE), ಇದು ಸಸ್ಯ ಕೋಶದ ಗೋಡೆಗಳನ್ನು ತೆರೆಯುವ ಮೂಲಕ ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ರಾಸಾಯನಿಕಗಳು ಮತ್ತು ಶಾಖದ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ3,4.ವಸ್ತುವಿನ ಮೊಂಡುತನ, 5. ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನವನ್ನು ವಾಣಿಜ್ಯ ಸಕ್ರಿಯ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು (CAZymes) ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ-ಆಧಾರಿತ ಇಂಧನಗಳು ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಟ್ರಾನ್ಸ್ಜೆನಿಕ್ ಯೀಸ್ಟ್ ಅಥವಾ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಯ ಹುದುಗುವಿಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಹೆಚ್ಚಿನ ಘನವಸ್ತುಗಳ ಹೊರೆಯಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ 6 .
ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವಗಳಲ್ಲಿನ CAZyme ಗಳು ಕಿಣ್ವಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಮಿಶ್ರಣದಿಂದ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ, ಇದು ಸಂಕೀರ್ಣ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್-ಸಕ್ಕರೆ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಸಿನರ್ಜಿಸ್ಟಿಕ್ ಆಗಿ ವಿಭಜಿಸಿ ಮೊನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ.ನಾವು ಮೊದಲೇ ವರದಿ ಮಾಡಿದಂತೆ, ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಲಿಗ್ನಿನ್‌ನ ಆರೊಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪಾಲಿಮರ್‌ಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಜಾಲವು ಅವುಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಅಗ್ರಾಹ್ಯವಾಗಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಅಪೂರ್ಣ ಸಕ್ಕರೆಯ ಪರಿವರ್ತನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಪೂರ್ವ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಜೀವರಾಶಿಯ ಕಿಣ್ವಕ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗದ 15-25% ಲೈಂಗಿಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುತ್ತದೆ.ವಿವಿಧ ಬಯೋಮಾಸ್ ಪೂರ್ವಚಿಕಿತ್ಸೆ ವಿಧಾನಗಳೊಂದಿಗೆ ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯ ಸಮಸ್ಯೆಯಾಗಿದೆ.ಈ ಅಡಚಣೆಗೆ ಕೆಲವು ಕಾರಣಗಳು ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕಿಣ್ವದ ಪ್ರತಿಬಂಧ, ಅಥವಾ ಸಸ್ಯದ ಜೀವರಾಶಿಯಲ್ಲಿ ಸಕ್ಕರೆ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಮುರಿಯಲು ಅಗತ್ಯವಾದ ಅಗತ್ಯ ಕಿಣ್ವಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿ ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಮಟ್ಟದ.ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಸಕ್ಕರೆ ಬಂಧಗಳಂತಹ ಸಕ್ಕರೆಗಳ ಸಂಯೋಜನೆ ಮತ್ತು ರಚನಾತ್ಮಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಕ್ಕರೆಯ ಪರಿವರ್ತನೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ನಮಗೆ ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಜೈವಿಕ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಪೆಟ್ರೋಲಿಯಂ-ಪಡೆದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳೊಂದಿಗೆ ವೆಚ್ಚ-ಸ್ಪರ್ಧಾತ್ಮಕವಾಗಿಸುತ್ತದೆ.
ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಸವಾಲಿನದ್ದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (LC)11,12, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ರೆಸೋನೆನ್ಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (NMR)13, ಕ್ಯಾಪಿಲರಿ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ (CE)14,15,16 ಮತ್ತು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (MS)17 ನಂತಹ ವಿಧಾನಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.,ಹದಿನೆಂಟು.ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ (MALDI-TOF-MS) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೇಸರ್ ಡಿಸಾರ್ಪ್ಶನ್ ಮತ್ತು ಅಯಾನೀಕರಣದೊಂದಿಗೆ ಹಾರಾಟದ ಸಮಯದ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯಂತಹ MS ವಿಧಾನಗಳು ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಬಹುಮುಖ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಲಗತ್ತು ಸ್ಥಾನಗಳು, ಅನೋಮೆರಿಕ್ ಕಾನ್ಫಿಗರೇಶನ್‌ಗಳು, ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಮತ್ತು ಕವಲೊಡೆಯುವ ಸ್ಥಾನಗಳು 20, 21 ಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾದ ಫಿಂಗರ್‌ಪ್ರಿಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಸೋಡಿಯಂ ಅಯಾನ್ ಅಡಕ್ಟ್‌ಗಳ ಘರ್ಷಣೆ-ಪ್ರೇರಿತ ವಿಘಟನೆ (ಸಿಐಡಿ) ಟೆಂಡೆಮ್ ಎಂಎಸ್ ಅನ್ನು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಗ್ಲೈಕಾನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ಬಾಂಡ್‌ಗಳ ಆಳವಾದ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗೆ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಸಾಧನವಾಗಿದೆ22.ಈ ವಿಧಾನವು ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು (mAbs) ಸಂಕೀರ್ಣ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ಸಂಪರ್ಕಗಳನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳಾಗಿ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗೆ ನಿರ್ದೇಶಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರಪಂಚದಾದ್ಯಂತ 250 mAbs ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಲಭ್ಯವಿದೆ, ವಿವಿಧ ಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಿವಿಧ ರೇಖೀಯ ಮತ್ತು ಶಾಖೆಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ವಿರುದ್ಧ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ24.ಸಸ್ಯ ಕೋಶದ ಗೋಡೆಯ ರಚನೆ, ಸಂಯೋಜನೆ ಮತ್ತು ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಹಲವಾರು mAbs ಅನ್ನು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಸಸ್ಯ ಕೋಶದ ಪ್ರಕಾರ, ಅಂಗ, ವಯಸ್ಸು, ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಹಂತ ಮತ್ತು ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಪರಿಸರವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳಿವೆ25,26.ತೀರಾ ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಸಸ್ಯ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಣಿಗಳ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಲ್ಲಿನ ಕೋಶಕ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಮತ್ತು ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಸಾಗಣೆಯಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಪಾತ್ರಗಳನ್ನು ಉಪಕೋಶದ ಗುರುತುಗಳು, ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಹಂತಗಳು ಅಥವಾ ಪರಿಸರ ಪ್ರಚೋದಕಗಳಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಗುರುತಿಸಲಾದ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಕ್ಸೈಲಾನ್‌ಗಳ ಕೆಲವು ವಿಭಿನ್ನ ರಚನೆಗಳಲ್ಲಿ ಪೆಕ್ಟಿನ್ (ಪಿ), ಕ್ಸಿಲಾನ್ (ಎಕ್ಸ್), ಮನ್ನಾನ್ (ಎಂ), ಕ್ಸೈಲೋಗ್ಲುಕಾನ್ಸ್ (ಎಕ್ಸ್‌ಎಲ್‌ಜಿ), ಮಿಶ್ರ ಬಾಂಡ್ ಗ್ಲುಕಾನ್‌ಗಳು (ಎಂಎಲ್‌ಜಿ), ಅರಾಬಿನೋಕ್ಸಿಲಾನ್ (ಆರ್‌ಬಿಎಕ್ಸ್), ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಮನ್ನನ್ (ಗ್ಯಾಲ್‌ಜಿ) , ಗ್ಲುಕುರೊನಿಕ್) ಗ್ಲುಕುರೊನಿಕ್ ಆಸಿಡ್ (ಜಿಎರಾಬಿನಾಕ್ಸಿಲಾನ್ ಎ-2) 9.
ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಎಲ್ಲಾ ಸಂಶೋಧನಾ ಪ್ರಯತ್ನಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಬಿಡುಗಡೆ, ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಮೆರಿಕ್ ಚೈನ್ ಉದ್ದ ಬದಲಾವಣೆಗಳು, ವಿವಿಧ ಕಡಿಮೆ DP ಪಾಲಿಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು ಸೇರಿದಂತೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಘನವಸ್ತುಗಳ ಲೋಡ್ (HSL) ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಶೇಖರಣೆಯ ಸ್ವರೂಪವನ್ನು ಕೆಲವೇ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಿವೆ.ವಿತರಣೆಗಳು 30,31,32.ಏತನ್ಮಧ್ಯೆ, ಗ್ಲೈಕ್ಯಾನ್ ರಚನೆಯ ಸಮಗ್ರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಒಂದು ಉಪಯುಕ್ತ ಸಾಧನವೆಂದು ಸಾಬೀತಾಗಿದೆಯಾದರೂ, ಪ್ರತಿಕಾಯ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಕಡಿಮೆ DP ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡುವುದು ಕಷ್ಟಕರವಾಗಿದೆ.5-10 kDa ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿರುವ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಸಣ್ಣ DP ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು 33, 34 ಗೆ ಬಂಧಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕಾಯ ಸೇರ್ಪಡೆಯ ಮೊದಲು ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಇಲ್ಲಿ, ಮೊದಲ ಬಾರಿಗೆ, ನಾವು ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ELISA ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ, ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯೊಂದಿಗೆ ಕರಗುವ ರಿಫ್ರ್ಯಾಕ್ಟರಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ಒಂದು-ಹಂತದ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಶನ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತೇವೆ.ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ನಮ್ಮ ವಿಧಾನವು MALDI-TOF-MS ಮತ್ತು GC-MS ಆಧಾರಿತ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ಡ್ ಸಕ್ಕರೆ ಸಂಯೋಜನೆಗಳ ಟ್ರೈಮಿಥೈಲ್ಸಿಲಿಲ್ (TMS) ವ್ಯುತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪೂರಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಂಪರ್ಕಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಮೌಲ್ಯೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ.ಈ ನವೀನ ವಿಧಾನವನ್ನು ಭವಿಷ್ಯದಲ್ಲಿ ಉನ್ನತ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ವಿಧಾನವಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಬಯೋಮೆಡಿಕಲ್ ಸಂಶೋಧನೆಯಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾದ ಅನ್ವಯವನ್ನು ಕಂಡುಕೊಳ್ಳಬಹುದು35.
ಗ್ಲೈಕೋಸೈಲೇಶನ್‌ನಂತಹ ಕಿಣ್ವಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಅನುವಾದದ ನಂತರದ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು ಅವುಗಳ ಜೈವಿಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಉರಿಯೂತದ ಸಂಧಿವಾತದಲ್ಲಿ ಸೀರಮ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಗ್ಲೈಕೋಸೈಲೇಷನ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವಹಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಗ್ಲೈಕೋಸೈಲೇಷನ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ಗುರುತುಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಜೀರ್ಣಾಂಗವ್ಯೂಹದ ಮತ್ತು ಯಕೃತ್ತಿನ ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಉರಿಯೂತದ ಕಾಯಿಲೆಗಳು, ವೈರಲ್ ಸೋಂಕುಗಳು, ಅಂಡಾಶಯ, ಸ್ತನ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಸ್ಟೇಟ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಸೇರಿದಂತೆ ವಿವಿಧ ಕಾಯಿಲೆಗಳಲ್ಲಿ ಸುಲಭವಾಗಿ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುವ ವಿವಿಧ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳು ಸಾಹಿತ್ಯದಲ್ಲಿ ವರದಿಯಾಗಿವೆ.ಪ್ರತಿಕಾಯ-ಆಧಾರಿತ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ELISA ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು ಸಂಕೀರ್ಣ MS ವಿಧಾನಗಳ ಬಳಕೆಯಿಲ್ಲದೆ ರೋಗದ ರೋಗನಿರ್ಣಯದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ವಿಶ್ವಾಸವನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.
ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನವು ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮತ್ತು ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ನಂತರ ಮೊಂಡುತನದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಜಲವಿಚ್ಛೇದಿತವಾಗದೆ ಉಳಿದಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1).ನಮ್ಮ ಈ ಹಿಂದೆ ಪ್ರಕಟಿಸಿದ ಕೆಲಸದಲ್ಲಿ, AFEX-ಪೂರ್ವಸಿದ್ಧ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೋವರ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೆಟ್ (ACSH)8 ನಿಂದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ನಾವು ಸಕ್ರಿಯ ಇದ್ದಿಲು ಘನ-ಹಂತದ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಆರಂಭಿಕ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ನಂತರ, ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗಾತ್ರದ ಹೊರಗಿಡುವ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (SEC) ಮೂಲಕ ಮತ್ತಷ್ಟು ಭಾಗಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸಕ್ಕರೆ ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ವಿವಿಧ ಪೂರ್ವ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆಯಾದ ಸಕ್ಕರೆ ಮೊನೊಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ವಿವಿಧ ಪೂರ್ವಸಿದ್ಧತಾ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಪಡೆದ ಸಕ್ಕರೆ ಆಲಿಗೋಮರ್‌ಗಳ ವಿಷಯವನ್ನು ಹೋಲಿಸಿದಾಗ, ಮೊಂಡುತನದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ಜೀವರಾಶಿಯನ್ನು ಮೊನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುವಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯ ಸಮಸ್ಯೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸಕ್ಕರೆ ಇಳುವರಿಯಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ 10-15% ಮತ್ತು 18% ವರೆಗೆ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.USಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳ ಮತ್ತಷ್ಟು ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ಕೆಲಸದಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಗೆ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಸ್ತುವಾಗಿ ವಿಭಿನ್ನ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದೊಂದಿಗೆ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ACH ಮತ್ತು ಅದರ ನಂತರದ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ಪೂರ್ವಚಿಕಿತ್ಸೆ ಮತ್ತು ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ನಂತರ, ನಿರಂತರವಾದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಜಲವಿಚ್ಛೇದಿತವಾಗದೇ ಉಳಿದಿವೆ.ಇಲ್ಲಿ (A) ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು AFEX-ಪೂರ್ವಸಿದ್ಧ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೋವರ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೆಟ್ (ACSH) ನಿಂದ ಸಕ್ರಿಯ ಇಂಗಾಲ ಮತ್ತು ಡಯಾಟೊಮ್ಯಾಸಿಯಸ್ ಭೂಮಿಯ ಪ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಲಾದ ಹಾಸಿಗೆಯನ್ನು ಬಳಸಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ;(B) ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸುವ ವಿಧಾನ.ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸೈಜ್ ಎಕ್ಸ್‌ಕ್ಲೂಷನ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (SEC) ಮೂಲಕ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗಿದೆ;(ಸಿ) ಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಮೊನೊಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋಮರ್‌ಗಳು ವಿವಿಧ ಪೂರ್ವ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗುತ್ತವೆ (ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ ಆಮ್ಲ: DA, ಅಯಾನಿಕ್ ದ್ರವ: IL ಮತ್ತು AFEX).ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು: 25% (w/w) ಹೆಚ್ಚಿನ ಘನವಸ್ತುಗಳನ್ನು ಲೋಡ್ ಮಾಡುವುದು (ಅಂದಾಜು 8% ಗ್ಲುಕನ್ ಲೋಡಿಂಗ್), 96 ಗಂಟೆಗಳ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆ, 20 mg/g ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಲೋಡಿಂಗ್ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ಅನುಪಾತ) ಮತ್ತು (D) ಶುಗರ್ ಮೊನೊಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗ್ಲುಕೋರೋಸೆಟ್‌ಗಳಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆಯಾದ ಗ್ಲುಕೋಮರ್‌ಗಳು ತೆಗೆದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೋವರ್ (ACS).
ಘನ ಜೀವರಾಶಿಯ ಅವಶೇಷಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳ ಸಮಗ್ರ ರಚನಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಉಪಯುಕ್ತ ಸಾಧನವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತಾಗಿದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಕಡಿಮೆ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನಿಶ್ಚಲವಾಗುವುದು ಕಷ್ಟ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕಾಯ ಸೇರ್ಪಡೆಯ ಮೊದಲು ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಪ್ರತಿಕಾಯ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಗಾಗಿ, ಎವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಕರಗುವ, ಅನುವರ್ತನೆಯಾಗದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಲೇಪಿಸಲು ಒಂದು-ಹಂತದ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಷನ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ನಮ್ಮ ಹಿಂದೆ ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ ACSH ಮತ್ತು ಅದರ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ (ಅಥವಾ ಪಾಲಿಮರೀಕರಣದ ಮಟ್ಟ, DP) ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಒಂದು ಭಾಗವನ್ನು ಬಳಸಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ನ ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ತುದಿಗೆ ಬಯೋಟಿನ್-ಎಲ್‌ಸಿ-ಹೈಡ್ರಜೈಡ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಾಂಧವ್ಯವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಒಂದು-ಹಂತದ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 2).ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ, ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ತುದಿಯಲ್ಲಿರುವ ಹೆಮಿಯಾಸೆಟಲ್ ಗುಂಪು ಬಯೋಟಿನ್-ಎಲ್‌ಸಿ-ಹೈಡ್ರಜೈಡ್‌ನ ಹೈಡ್ರಾಜೈಡ್ ಗುಂಪಿನೊಂದಿಗೆ ಹೈಡ್ರಾಝೋನ್ ಬಂಧವನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುತ್ತದೆ.ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ಏಜೆಂಟ್ NaCNBH3 ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, ಹೈಡ್ರೋಜೋನ್ ಬಂಧವನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾದ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಅಂತಿಮ ಉತ್ಪನ್ನಕ್ಕೆ ಇಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸಕ್ಕರೆ ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ಅಂತ್ಯದ ಮಾರ್ಪಾಡಿನೊಂದಿಗೆ, ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಕಡಿಮೆ DP ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಮ್ಮ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಗ್ಲೈಕಾನ್-ಉದ್ದೇಶಿತ mAbs ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇದನ್ನು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ELISA ಆಧಾರಿತ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್.ಇಲ್ಲಿ (A) ಒಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸಂಯೋಜಿತ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಶನ್ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಟ್ರಾಅವಿಡಿನ್ ಲೇಪಿತ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗ್ಲೈಕಾನ್-ಉದ್ದೇಶಿತ mAbs ನೊಂದಿಗೆ ನಂತರದ ELISA ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಮತ್ತು (B) ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಶನ್‌ಗಾಗಿ ಒಂದು-ಹಂತದ ವಿಧಾನವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್-ಸಂಯೋಜಿತ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಅವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ಫಲಕಗಳನ್ನು ನಂತರ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಮತ್ತು ದ್ವಿತೀಯಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಬೆಳಕು ಮತ್ತು ಸಮಯ-ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿಕಾಯ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯು ಪೂರ್ಣಗೊಂಡ ನಂತರ, ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಲು TMB ತಲಾಧಾರವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಸಲ್ಫ್ಯೂರಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ ನಿಲ್ಲಿಸಲಾಯಿತು.ಪ್ರತಿಕಾಯ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕ್ರಾಸ್-ಲಿಂಕಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಪ್ರತಿ ಪ್ರತಿಕಾಯದ ಬಂಧಿಸುವ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಕಾವುಕೊಡುವ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ELISA ರೀಡರ್ ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರಯೋಗದ ವಿವರಗಳು ಮತ್ತು ನಿಯತಾಂಕಗಳಿಗಾಗಿ, "ವಸ್ತುಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳು" ಅನುಗುಣವಾದ ವಿಭಾಗವನ್ನು ನೋಡಿ.
ACSH ನಲ್ಲಿರುವ ಕರಗುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಹಾಗೂ ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಕಚ್ಚಾ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ಈ ಹೊಸದಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ ವಿಧಾನದ ಉಪಯುಕ್ತತೆಯನ್ನು ನಾವು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ.ಚಿತ್ರ 3 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ, ಬಯೋಆಸಿಲೇಟೆಡ್ ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ಅಸ್ಸೇ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ACSH ನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಅತ್ಯಂತ ಸಾಮಾನ್ಯವಾದ ಎಪಿಟೋಪ್-ಬದಲಿ ಕ್ಸೈಲಾನ್‌ಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಯುರೋನಿಕ್ (U) ಅಥವಾ ಮೆಥಿಲುರಾನಿಕ್ (MeU) ಮತ್ತು ಪೆಕ್ಟಿಕ್ ಅರಾಬಿನೊಗಲಕ್ಟಾನ್‌ಗಳಾಗಿವೆ.ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನವು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ಡ್ ಅಲ್ಲದ ಘನವಸ್ತುಗಳ (UHS) 43 ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬಂದಿವೆ.
ಜೀವಕೋಶದ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗೆ ನಿರ್ದೇಶಿಸಲಾದ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮರುಕಳಿಸುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳ ಪತ್ತೆ."ತಟಸ್ಥ" ಭಾಗವು ACN ಭಾಗವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು "ಆಮ್ಲ" ಭಾಗವು FA ಭಾಗವಾಗಿದೆ.ಹೀಟ್‌ಮ್ಯಾಪ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರಕಾಶಮಾನವಾದ ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಎಪಿಟೋಪ್ ವಿಷಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಕಾಶಮಾನವಾದ ಬ್ಲೂಗಳು ಖಾಲಿ ಹಿನ್ನೆಲೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.ಸ್ಕೇಲ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬಣ್ಣದ ಮೌಲ್ಯಗಳು N=2 ಸೂತ್ರೀಕರಣಗಳಿಗಾಗಿ ಕಚ್ಚಾ OD ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಆಧರಿಸಿವೆ.ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಮುಖ್ಯ ಎಪಿಟೋಪ್ಗಳನ್ನು ಬಲಭಾಗದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಈ ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಅಲ್ಲದ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿತ ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಸಾಮಾನ್ಯ ಸೆಲ್ಯುಲೇಸ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಹೆಮಿಸೆಲ್ಯುಲೇಸ್‌ಗಳಿಂದ ಸೀಳಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ, ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಅವುಗಳ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆಗೆ ಹೊಸ ಸಹಾಯಕ ಕಿಣ್ವಗಳು ಬೇಕಾಗುತ್ತವೆ.ಅಗತ್ಯವಾದ ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್-ಅಲ್ಲದ ಪರಿಕರ ಕಿಣ್ವಗಳಿಲ್ಲದೆ, ಈ ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್-ಅಲ್ಲದ ಬಂಧಗಳು ಮೊನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಾಗಿ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪರಿವರ್ತನೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತವೆ, ಅವುಗಳ ಮೂಲ ಸಕ್ಕರೆ ಪಾಲಿಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡಿ ಸಣ್ಣ ತುಣುಕುಗಳಾಗಿ ಮತ್ತು ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಮಿಶ್ರಣಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ಕರಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಸಿಗ್ನಲ್ ವಿತರಣೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಧ್ಯಯನವು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಡಿಪಿ ಸಕ್ಕರೆ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳಲ್ಲಿ (ಎ, ಬಿ, ಸಿ, ಡಿಪಿ 20+ ವರೆಗೆ) ಕಡಿಮೆ ಡಿಪಿ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳಿಗಿಂತ (ಡಿ, ಇ, ಎಫ್, ಡಿಪಿ) ಡೈಮರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1).ತಟಸ್ಥ ತುಣುಕುಗಳಿಗಿಂತ ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಅಲ್ಲದ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಆಮ್ಲದ ತುಣುಕುಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿದೆ.ಈ ವಿದ್ಯಮಾನಗಳು ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಿದ ಮಾದರಿಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿವೆ, ಅಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ DP ಮತ್ತು ಆಮ್ಲ ಭಾಗಗಳು ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆಗೆ ಹೆಚ್ಚು ನಿರೋಧಕವಾಗಿರುತ್ತವೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಅಲ್ಲದ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳು ಮತ್ತು U ಮತ್ತು MeU ಪರ್ಯಾಯಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸ್ಥಿರತೆಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆ.ಕಡಿಮೆ ಡಿಪಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಡಿಟೆಕ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯು ಸಮಸ್ಯಾತ್ಮಕವಾಗಬಹುದು ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಎಪಿಟೋಪ್ ಡೈಮೆರಿಕ್ ಅಥವಾ ಟ್ರೈಮರಿಕ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಆಗಿದ್ದರೆ.ವಿಭಿನ್ನ ಉದ್ದಗಳ ವಾಣಿಜ್ಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಬಹುದು, ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ mAb ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಒಂದು ಎಪಿಟೋಪ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.
ಹೀಗಾಗಿ, ರಚನೆ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಬಳಕೆಯು ಕೆಲವು ವಿಧದ ಮರುಕಳಿಸುವ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು.ಬಳಸಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯದ ಪ್ರಕಾರ, ಸೂಕ್ತವಾದ ಬಂಧನ ಮಾದರಿ ಮತ್ತು ಅದು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಸಂಕೇತದ ಬಲವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ (ಹೆಚ್ಚು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಹೇರಳವಾಗಿ), ಹೊಸ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ಸಂಪೂರ್ಣ ಗ್ಲೈಕೊಕನ್ವರ್ಶನ್‌ಗಾಗಿ ಕಿಣ್ವ ಮಿಶ್ರಣಕ್ಕೆ ಅರೆ-ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸೇರಿಸಬಹುದು.ACSH ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ನಾವು ಪ್ರತಿ ಜೀವರಾಶಿ ವಸ್ತುವಿಗಾಗಿ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಬಾಂಡ್‌ಗಳ ಡೇಟಾಬೇಸ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಬಹುದು.ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಗಣನೆಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಬೇಕು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಸಂಬಂಧವು ತಿಳಿದಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಹೋಲಿಸಿದಾಗ ಇದು ಕೆಲವು ತೊಂದರೆಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಇಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಬೇಕು.ಜೊತೆಗೆ, ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಬಂಧಗಳ ಹೋಲಿಕೆಯು ಅದೇ ಪ್ರತಿಕಾಯದ ಮಾದರಿಗಳ ನಡುವೆ ಉತ್ತಮವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು.ಈ ಮೊಂಡುತನದ ಬಂಧಗಳನ್ನು ನಂತರ CAZyme ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ಗೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಬಹುದು, ಇದರಿಂದ ನಾವು ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಬಹುದು, ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬಹುದು ಮತ್ತು ಬಂಧ-ಮುರಿಯುವ ಕಿಣ್ವಗಳಿಗಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಬಹುದು, ಅಥವಾ ಈ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಬಯೋಫೈನರಿಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಲು ಈ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಬಹುದು.
ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇರುವ ಕಡಿಮೆ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ರೋಗನಿರೋಧಕ ವಿಧಾನಗಳು ಪರ್ಯಾಯ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಹೇಗೆ ಪೂರಕಗೊಳಿಸುತ್ತವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು, ನಾವು MALDI (Fig. 4, S1-S8) ಮತ್ತು ಅದೇ ಫಲಕದಲ್ಲಿ GC-MS ಆಧಾರಿತ TMS-ಪಡೆದ ಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ (Fig. 5) ಭಾಗ oligos.ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಅಣುಗಳ ಸಾಮೂಹಿಕ ವಿತರಣೆಯು ಉದ್ದೇಶಿತ ರಚನೆಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುತ್ತದೆಯೇ ಎಂದು ಹೋಲಿಸಲು MALDI ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಅಂಜೂರದ ಮೇಲೆ.4 ACN-A ಮತ್ತು ACN-B ತಟಸ್ಥ ಘಟಕಗಳ MC ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ACN-A ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು DP 4–8 (Fig. 4) ನಿಂದ DP 22 (Fig. S1) ವರೆಗಿನ ಪೆಂಟೋಸ್ ಸಕ್ಕರೆಗಳ ಶ್ರೇಣಿಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿದೆ, ಅದರ ತೂಕಗಳು MeU-xylan ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತವೆ.ACN-B ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು DP 8-15 ನೊಂದಿಗೆ ಪೆಂಟೋಸ್ ಮತ್ತು ಗ್ಲುಕೋಕ್ಸಿಲಾನ್ ಸರಣಿಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು.ಚಿತ್ರ S3 ನಂತಹ ಪೂರಕ ವಸ್ತುಗಳಲ್ಲಿ, FA-C ಆಮ್ಲೀಯ ಭಾಗದ ಸಮೂಹ ವಿತರಣಾ ನಕ್ಷೆಗಳು ELISA-ಆಧಾರಿತ mAb ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಬದಲಿ xylans ನೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುವ 8-15 DP ಯೊಂದಿಗೆ (Me)U ಬದಲಿ ಪೆಂಟೋಸ್ ಸಕ್ಕರೆಗಳ ಶ್ರೇಣಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.ಎಪಿಟೋಪ್ಗಳು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತವೆ.
ಎಸಿಎಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ನಾನ್-ಕಾಂಪ್ಲೈಂಟ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ MALDI-MS ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್.ಇಲ್ಲಿ, (A) ACN-A ಕಡಿಮೆ ತೂಕದ ಶ್ರೇಣಿಯ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮಿಥೈಲೇಟೆಡ್ ಯುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (DP 4-8) ಬದಲಿ ಗ್ಲುಕುರೊಕ್ಸಿಲಾನ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು (B) ACN-B ಕ್ಸೈಲಾನ್ ಮತ್ತು ಮೀಥೈಲೇಟೆಡ್ ಯುರೋನಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು (ಗ್ಲುಕುರಾಕ್ಸಿಲಾನ್-1 ನೊಂದಿಗೆ ಬದಲಿಸಲಾಗಿದೆ).
ವಕ್ರೀಕಾರಕ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ.ಇಲ್ಲಿ (A) GC-MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪಡೆದ ವಿವಿಧ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳ TMS ಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಂಯೋಜನೆ.(B) ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇರುವ ವಿವಿಧ TMS-ಪಡೆದ ಸಕ್ಕರೆಗಳ ರಚನೆಗಳು.ACN - ತಟಸ್ಥ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಅಸಿಟೋನೈಟ್ರೈಲ್ ಭಾಗ ಮತ್ತು FA - ಫೆರುಲಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಭಾಗವು ಆಮ್ಲ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.
ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಾಗದ LC-MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಮತ್ತೊಂದು ಕುತೂಹಲಕಾರಿ ತೀರ್ಮಾನವನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ, ಚಿತ್ರ S9 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ (ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನಿಕ್ ಪೂರಕ ವಸ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ಕಾಣಬಹುದು).ACN-B ಭಾಗದ ಬಂಧನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಹೆಕ್ಸೋಸ್ ಮತ್ತು -OAc ಗುಂಪುಗಳ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಪದೇ ಪದೇ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.ಈ ಸಂಶೋಧನೆಯು ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ಮತ್ತು MALDI-TOF ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ವಿಘಟನೆಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಪೂರ್ವ-ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಲಿಗ್ನೋಸೆಲ್ಯುಲೋಸಿಕ್ ಬಯೋಮಾಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಭಾವ್ಯ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಹೊಸ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
ನಾವು TMS ಸಕ್ಕರೆ ವ್ಯುತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಾಗದ ಸಕ್ಕರೆ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಸಹ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.GC-MS ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ನಾವು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಭಿನ್ನರಾಶಿಯಲ್ಲಿ (Fig. 5) ನರಗಳ (ಉತ್ಪನ್ನವಲ್ಲದ) ಮತ್ತು ಆಮ್ಲೀಯ ಸಕ್ಕರೆಗಳ (GluA ಮತ್ತು GalA) ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಗ್ಲುಕುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲವು C ಮತ್ತು D ಆಮ್ಲೀಯ ಘಟಕಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಗ್ಯಾಲಕ್ಟುರೊನಿಕ್ ಆಮ್ಲವು ಆಮ್ಲೀಯ ಘಟಕಗಳಾದ A ಮತ್ತು B ಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ, ಇವೆರಡೂ ಆಮ್ಲೀಯ ಸಕ್ಕರೆಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ DP ಅಂಶಗಳಾಗಿವೆ.ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ನಮ್ಮ ELISA ಮತ್ತು MALDI ಡೇಟಾವನ್ನು ಮಾತ್ರ ದೃಢೀಕರಿಸುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿವೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ವಿವಿಧ ಜೈವಿಕ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಮರುಕಳಿಸುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಷನ್ ಮತ್ತು ನಂತರದ ELISA ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಬಳಸುವ ಆಧುನಿಕ ರೋಗನಿರೋಧಕ ವಿಧಾನಗಳು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಂಬುತ್ತೇವೆ.
ELISA-ಆಧಾರಿತ mAb ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ವಿಧಾನಗಳು ಹಲವಾರು ವಿಭಿನ್ನ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಮೌಲ್ಯೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿರುವುದರಿಂದ, ನಾವು ಈ ಹೊಸ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನದ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಇನ್ನಷ್ಟು ಅನ್ವೇಷಿಸಲು ಬಯಸುತ್ತೇವೆ.ಎರಡು ವಾಣಿಜ್ಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು, ಕ್ಸೈಲೋಹೆಕ್ಸಾಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ (XHE) ಮತ್ತು 23-α-L-ಅರಾಬಿನೊಫ್ಯುರಾನೋಸಿಲ್-ಕ್ಸೈಲೋಟ್ರಿಯೋಸ್ (A2XX), ಸೆಲ್ ವಾಲ್ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುವ ಹೊಸ mAb ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಚಿತ್ರ 6 ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಿಗ್ನಲ್ ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಲಾಗ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ನಡುವಿನ ರೇಖಾತ್ಮಕ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಸಂಭವನೀಯ ಲ್ಯಾಂಗ್ಮುಯಿರ್ ಹೊರಹೀರುವಿಕೆ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.mAbs ಗಳಲ್ಲಿ, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ಮತ್ತು CCRC-M151 XHE ನೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆ, ಮತ್ತು CCRC-M108, CCRC-M109, ಮತ್ತು LM11 ಗಳು A2X0n ವರೆಗಿನ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಿಂದ A2X0 ವರೆಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆ.ಪ್ರಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಸೀಮಿತ ಲಭ್ಯತೆಯಿಂದಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಸೀಮಿತ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಕೆಲವು ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು ತಲಾಧಾರವಾಗಿ ಅದೇ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗೆ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ಇಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಬೇಕು, ಬಹುಶಃ ಅವು ಸ್ವಲ್ಪ ವಿಭಿನ್ನವಾದ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಬಂಧಕ ಸಂಬಂಧಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು.ನೈಜ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ ಹೊಸ mAb ವಿಧಾನವನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದಾಗ ನಿಖರವಾದ ಎಪಿಟೋಪ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳು ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಸಂಕೀರ್ಣವಾಗಿರುತ್ತವೆ.
ವಿವಿಧ ಗ್ಲೈಕಾನ್-ಟಾರ್ಗೆಟಿಂಗ್ mAbs ಪತ್ತೆ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಎರಡು ವಾಣಿಜ್ಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಇಲ್ಲಿ, ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಲಾಗ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ರೇಖೀಯ ಸಂಬಂಧಗಳು (A) mAb ನೊಂದಿಗೆ XHE ಮತ್ತು (B) A2XX ಗಾಗಿ mAb ಗಾಗಿ ಲ್ಯಾಂಗ್‌ಮುಯಿರ್ ಹೊರಹೀರುವಿಕೆ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.ಅನುಗುಣವಾದ ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ತಲಾಧಾರಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ವಾಣಿಜ್ಯ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
ಗ್ಲೈಕಾನ್-ಉದ್ದೇಶಿತ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಬಳಕೆ (ಗ್ಲೈಕೊಕೊಮಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಅಥವಾ ELISA-ಆಧಾರಿತ mAb ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್) ಸಸ್ಯ ಜೀವರಾಶಿಯನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ಜೀವಕೋಶದ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳ ಆಳವಾದ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಗೆ ಪ್ರಬಲ ಸಾಧನವಾಗಿದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕ್ಲಾಸಿಕಲ್ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ದೊಡ್ಡ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ನಿರೂಪಿಸುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ನಿಶ್ಚಲವಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, AFEX- ಪೂರ್ವ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೋವರ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಘನವಸ್ತುಗಳ ವಿಷಯದಲ್ಲಿ ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಆಗಿ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೆಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಮರುಕಳಿಸುವ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಸಕ್ಕರೆ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಹೈಡ್ರೊಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಸಣ್ಣ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ mAb ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ನಿಶ್ಚಲಗೊಳಿಸಲು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಉಪಕರಣಗಳು ಅಗತ್ಯವಿದೆ.
ನ್ಯೂಟ್ರಾಅವಿಡಿನ್ ™ ಲೇಪಿತ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ELISA ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ನಂತರ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಮೂಲಕ mAb ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ನಾವು ಒಂದು ಕಾದಂಬರಿ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ನಿಶ್ಚಲತೆಯ ವಿಧಾನವನ್ನು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.ನಿಶ್ಚಲವಾಗಿರುವ ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಮರುಕಳಿಸುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಪ್ರತಿಕಾಯಕ್ಕೆ ಸಾಕಷ್ಟು ಸಂಬಂಧವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ.ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಈ ಮೊಂಡುತನದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಇಮ್ಯುನೊಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ಗೆ ಈ ಹೊಸ ವಿಧಾನದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು.ಹೀಗಾಗಿ, ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕ್‌ಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಗ್ಲೈಕಾನ್-ಉದ್ದೇಶಿತ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಬಯೋಟೈನಿಲೇಷನ್ ಮತ್ತು ELISA ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ನಿರೂಪಿಸುವ ಇತರ ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಅನ್ವಯಿಸಬಹುದು.
ಈ ಬಯೋಟಿನ್-ಆಧಾರಿತ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಪ್ರೊಫೈಲಿಂಗ್ ವಿಧಾನವು ಸಸ್ಯ ಜೀವರಾಶಿಯಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಮರುಕಳಿಸುವ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವಿರುವ ಮೊದಲ ವರದಿಯಾಗಿದೆ.ಜೈವಿಕ ಇಂಧನ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಬಂದಾಗ ಜೀವರಾಶಿಯ ಕೆಲವು ಭಾಗಗಳು ಏಕೆ ಮೊಂಡುತನದಿಂದ ಕೂಡಿರುತ್ತವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಇದು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಈ ವಿಧಾನವು ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣಾ ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಅಂತರವನ್ನು ತುಂಬುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಸ್ಯದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಮೀರಿ ವ್ಯಾಪಕ ಶ್ರೇಣಿಯ ತಲಾಧಾರಗಳಿಗೆ ಅದರ ಅನ್ವಯವನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸುತ್ತದೆ.ಭವಿಷ್ಯದಲ್ಲಿ, ನಾವು ಬಯೋಟೈನೈಲೇಶನ್‌ಗಾಗಿ ರೋಬೋಟಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು ಮತ್ತು ELISA ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮಾದರಿಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ನಾವು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.
ಪಯೋನಿಯರ್ 33A14 ಹೈಬ್ರಿಡ್ ಬೀಜಗಳಿಂದ ಬೆಳೆದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟ್ರಾ (CS) ಅನ್ನು 2010 ರಲ್ಲಿ ಕೊಲೊರಾಡೋದ ರೇನಲ್ಲಿರುವ ಕ್ರಾಮರ್ ಫಾರ್ಮ್ಸ್‌ನಿಂದ ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಭೂಮಾಲೀಕರ ಅನುಮತಿಯೊಂದಿಗೆ, ಈ ಜೀವರಾಶಿಯನ್ನು ಸಂಶೋಧನೆಗೆ ಬಳಸಬಹುದು. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಜಿಪ್-ಲಾಕ್ ಚೀಲಗಳಲ್ಲಿ ಒಣ <6% ತೇವಾಂಶವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಜಿಪ್-ಲಾಕ್ ಚೀಲಗಳಲ್ಲಿ ಒಣ <6% ತೇವಾಂಶವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಒಬ್ರಝಿ ಹ್ಯಾಂಡ್ಸ್ ಸುಚಿಮಿ ಪ್ರೀ ವ್ಲಾಗ್ನೋಸ್ಟಿ < 6% ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಝಿಪ್ಪರ್ ಮಾಡಿದ ಚೀಲಗಳಲ್ಲಿ <6% ತೇವಾಂಶದಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಒಣಗಿಸಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% ಒಬ್ರಝಿ ಹ್ಯಾಂಡ್ ವ್ ಪ್ಯಾಕೆಟಚ್ಸ್ ಸೆಸ್ಟೇಜ್ಕೊಯ್-ಮಾಲ್ನಿಯೆಯ್ ಪ್ರಿ ಕಾಮ್ನಟ್ನೋಯ್ ಟೆಂಪರಟುರೆಸ್ ವ್ಲಾಗ್ನೋಸ್ಟ್ಯೂರ್ < 6%. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಝಿಪ್ಪರ್ ಚೀಲಗಳಲ್ಲಿ ಆರ್ದ್ರತೆ <6% ನೊಂದಿಗೆ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಅಧ್ಯಯನವು ಸ್ಥಳೀಯ ಮತ್ತು ರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿದೆ.NREL ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಸಂಯೋಜನೆಯು 31.4% ಗ್ಲುಕನ್, 18.7% ಕ್ಸೈಲಾನ್, 3.3% ಅರಾಬಿನಾನ್, 1.2% ಗ್ಯಾಲಕ್ಟನ್, 2.2% ಅಸಿಟೈಲ್, 14.3% ಲಿಗ್ನಿನ್, 1.7% ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮತ್ತು 13. 4% ಬೂದಿಯನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವುದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ.
Cellic® CTec2 (138 mg ಪ್ರೋಟೀನ್/ಮಿಲಿ, ಬಹಳಷ್ಟು VCNI 0001) ನೊವೊಜೈಮ್‌ಗಳಿಂದ (ಫ್ರಾಂಕ್ಲಿಂಟನ್, NC, USA) ಸೆಲ್ಯುಲೇಸ್, β-ಗ್ಲುಕೋಸಿಡೇಸ್ ಮತ್ತು Cellic® HTec2 (157 mg ಪ್ರೋಟೀನ್/ಮಿಲಿ, ಬಹಳಷ್ಟು VHN00001) ನ ಸಂಕೀರ್ಣ ಮಿಶ್ರಣವಾಗಿದೆ.ಮಲ್ಟಿಫೆಕ್ಟ್ ಪೆಕ್ಟಿನೇಸ್ ® (72 mg ಪ್ರೊಟೀನ್/mL), ಪೆಕ್ಟಿನ್ ಡಿಗ್ರೇಡಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಡುಪಾಂಟ್ ಇಂಡಸ್ಟ್ರಿಯಲ್ ಬಯೋಸೈನ್ಸ್ (Palo Alto, CA, USA) ದಾನ ಮಾಡಿದೆ.Kjeldahl ನೈಟ್ರೋಜನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (AOAC ವಿಧಾನ 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಂಶವನ್ನು (ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್-ಅಲ್ಲದ ಸಾರಜನಕದ ಕೊಡುಗೆಯನ್ನು ಕಳೆಯುವುದು) ಮೂಲಕ ಕಿಣ್ವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಡಯಾಟೊಮ್ಯಾಸಿಯಸ್ ಅರ್ಥ್ 545 ಅನ್ನು ಇಎಮ್‌ಡಿ ಮಿಲಿಪೋರ್‌ನಿಂದ (ಬಿಲ್ಲೆರಿಕಾ, ಎಂಎ) ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸಕ್ರಿಯ ಇಂಗಾಲ (DARCO, 100 ಮೆಶ್ ಗ್ರ್ಯಾನ್ಯೂಲ್ಸ್), ಅವಿಸೆಲ್ (PH-101), ಬೀಚ್ ಕ್ಸಿಲಾನ್, ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಇತರ ರಾಸಾಯನಿಕಗಳನ್ನು ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್ (ಸೇಂಟ್ ಲೂಯಿಸ್, MO) ನಿಂದ ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ.
AFEX ಪೂರ್ವಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು GLBRC (ಬಯೋಮಾಸ್ ಕನ್ವರ್ಶನ್ ರಿಸರ್ಚ್ ಲ್ಯಾಬೋರೇಟರಿ, MSU, ಲ್ಯಾನ್ಸಿಂಗ್, MI, USA) ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು 140 ° C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಬೆಂಚ್‌ಟಾಪ್ ಬ್ಯಾಚ್ ರಿಯಾಕ್ಟರ್‌ನಲ್ಲಿ (ಪಾರ್ ಇನ್‌ಸ್ಟ್ರುಮೆಂಟ್ಸ್ ಕಂಪನಿ) ಲೋಡ್ ಆಗುತ್ತಿರುವ 60% (w/w) ನಲ್ಲಿ 60% (w/w) ನಲ್ಲಿ ಅನ್‌ಹೈಡ್ರಸ್ ಅಮೋನಿಯದ 1:1 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ 46 ನಿವಾಸ ಸಮಯ.ಇದು 30 ನಿಮಿಷಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಂಡಿತು.ರಿಯಾಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು 140 ° C ಗೆ ತರಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅಮೋನಿಯಾವನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಇದು ಜೀವರಾಶಿಯನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ಮರಳಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.AFEX ಪೂರ್ವ-ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೋವರ್ (ACS) ಸಂಯೋಜನೆಯು ಸಂಸ್ಕರಿಸದ ಕಾರ್ನ್ ಸ್ಟೋವರ್ (UT-CS) ನಂತೆಯೇ ಇತ್ತು.
ಹೆಚ್ಚಿನ ಘನವಸ್ತುಗಳು ACSH 25% (w/w) (ಅಂದಾಜು 8% ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರಾನ್ ಲೋಡಿಂಗ್) ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಆರಂಭಿಕ ವಸ್ತುವಾಗಿ ತಯಾರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ.Cellic® Ctec2 10 mg ಪ್ರೊಟೀನ್/g ಗ್ಲುಕನ್ (ಪೂರ್ವಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಜೀವರಾಶಿಯಲ್ಲಿ), Htec2 (ನೊವೊಜೈಮ್ಸ್, ಫ್ರಾಂಕ್ಲಿಂಟನ್, NC), 5 mg ಪ್ರೋಟೀನ್/g ಗ್ಲುಕನ್, ಮತ್ತು ಮಲ್ಟಿಫೆಕ್ಟ್ ಪೆಕ್ಟಿನೇಸ್ (Genencor Inc, USA) ಸೇರಿದಂತೆ ವಾಣಿಜ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ACS ನ ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.)), 5 ಮಿಗ್ರಾಂ ಪ್ರೋಟೀನ್ / ಗ್ರಾಂ ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರಾನ್.3 ಲೀಟರ್, pH 4.8, 50 ° C ಮತ್ತು 250 rpm ನ ಕೆಲಸದ ಪರಿಮಾಣದೊಂದಿಗೆ 5-ಲೀಟರ್ ಜೈವಿಕ ರಿಯಾಕ್ಟರ್ನಲ್ಲಿ ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.96 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ನಂತರ, 6000 rpm ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮತ್ತು ನಂತರ 14000 rpm ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡದ ಘನವಸ್ತುಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸೇಟ್ ಅನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು.ನಂತರ 0.22 ಮಿಮೀ ಫಿಲ್ಟರ್ ಬೀಕರ್ ಮೂಲಕ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೆಟ್ ಅನ್ನು ಬರಡಾದ ಶೋಧನೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾದ ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೆಟ್ ಅನ್ನು 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಬರಡಾದ ಬಾಟಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಇಂಗಾಲದ ಮೇಲೆ ಭಾಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
NREL ಪ್ರಯೋಗಾಲಯದ ವಿಶ್ಲೇಷಣಾ ವಿಧಾನಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಸಾರ-ಆಧಾರಿತ ಜೀವರಾಶಿ ಮಾದರಿಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ: ಸಂಯೋಜನೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಮಾದರಿಗಳ ತಯಾರಿಕೆ (NREL/TP-510-42620) ಮತ್ತು ರಚನಾತ್ಮಕ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಜೀವರಾಶಿಯಲ್ಲಿ ಲಿಗ್ನಿನ್‌ನ ನಿರ್ಣಯ (NREL/TP-510 - 42618)47.
ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೆಟ್ ಸ್ಟ್ರೀಮ್ನ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಆಟೋಕ್ಲೇವ್-ಆಧಾರಿತ ಆಮ್ಲ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 2 ಮಿಲಿ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೆಟ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು 72% ಸಲ್ಫ್ಯೂರಿಕ್ ಆಮ್ಲದ 69.7 µl ನೊಂದಿಗೆ 10 ಮಿಲಿ ಸ್ಕ್ರೂ ಕ್ಯಾಪ್ ಕಲ್ಚರ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು ಬೆಂಚ್‌ಟಾಪ್‌ನಲ್ಲಿ 121 °C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂ ಕಾವುಕೊಡಿ, ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ತಣ್ಣಗಾಗಿಸಿ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಯ ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (HPLC) ಸೀಸೆಗೆ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿ.ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡದ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿನ ಮೊನೊಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಆಮ್ಲ-ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ಡ್ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿನ ಒಟ್ಟು ಸಕ್ಕರೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯಿಂದ ಕಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಆಸಿಡ್ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ಡ್ ಬಯೋಮಾಸ್‌ನಲ್ಲಿನ ಗ್ಲೂಕೋಸ್, ಕ್ಸೈಲೋಸ್ ಮತ್ತು ಅರಾಬಿನೋಸ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು ಶಿಮಾಡ್ಜು ಎಚ್‌ಪಿಎಲ್‌ಸಿ ಸಿಸ್ಟಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದನ್ನು ಬಯೋ-ರಾಡ್ ಅಮಿನೆಕ್ಸ್ ಎಚ್‌ಪಿಎಕ್ಸ್ -87 ಹೆಚ್ ಕಾಲಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಆಟೋಸ್ಯಾಂಪ್ಲರ್, ಕಾಲಮ್ ಹೀಟರ್, ಐಸೊಕ್ರೇಟಿಕ್ ಪಂಪ್ ಮತ್ತು ವಕ್ರೀಕಾರಕ ಸೂಚ್ಯಂಕ ಡಿಟೆಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು 50 ° C ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ನೀರಿನಲ್ಲಿ 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ನೊಂದಿಗೆ ಹೊರಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ಹರಿವು.
ಹೈಡ್ರೊಲೈಜೆಟ್ ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮೊನೊಮರ್ ಮತ್ತು ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ವಿಷಯಕ್ಕಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದ ನಂತರ ಪಡೆದ ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ ಸಕ್ಕರೆಗಳನ್ನು ಎಚ್‌ಪಿಎಲ್‌ಸಿ ಬಯೋ-ರಾಡ್ (ಹರ್ಕ್ಯುಲಸ್, ಸಿಎ) ಅಮಿನೆಕ್ಸ್ ಎಚ್‌ಪಿಎಕ್ಸ್-87 ಪಿ ಕಾಲಮ್ ಮತ್ತು ಆಶ್ ಗಾರ್ಡ್ ಕಾಲಮ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದೆ.ಕಾಲಮ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು 80 ° C ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ, 0.6 ಮಿಲಿ / ನಿಮಿಷದ ಹರಿವಿನ ದರದೊಂದಿಗೆ ನೀರನ್ನು ಮೊಬೈಲ್ ಹಂತವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು.ರೆಫ್ಸ್ನಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದ ವಿಧಾನಗಳ ಪ್ರಕಾರ 121 ° C ನಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲವಾದ ಆಮ್ಲದಲ್ಲಿ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನದಿಂದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.41, 48, 49.
ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳು 27, 43, 50, 51 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕಚ್ಚಾ, AFEX ಪೂರ್ವ-ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ಡ್ ಅಲ್ಲದ ಬಯೋಮಾಸ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಮೇಲೆ (ಸರಣಿ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಸಾರಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ mAb ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್ ಸೇರಿದಂತೆ) ಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಗ್ಲೈಕೋಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಸಸ್ಯದ ಜೀವಕೋಶದ ಗೋಡೆಯ ವಸ್ತುವಿನ ಆಲ್ಕೋಹಾಲ್-ಕರಗದ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಜೈವಿಕ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಯ ಅವಶೇಷಗಳಿಂದ ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಮೋನಿಯಂ ಆಕ್ಸಲೇಟ್ (50 mM), ಸೋಡಿಯಂ ಕಾರ್ಬೋನೇಟ್ (50 mM ಮತ್ತು 0.5% w/v), CON ನಂತಹ ಹೆಚ್ಚು ಆಕ್ರಮಣಕಾರಿ ಕಾರಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಸರಣಿ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.(1M ಮತ್ತು 4M, ಎರಡೂ 1% w/v ಸೋಡಿಯಂ ಬೊರೊಹೈಡ್ರೈಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ) ಮತ್ತು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಆಸಿಡ್ ಕ್ಲೋರೈಟ್52,53.ಸೆಲ್ ವಾಲ್ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗೆ ನಿರ್ದೇಶಿಸಲಾದ mAb50 ಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಫಲಕದ ವಿರುದ್ಧ ಸಾರಗಳನ್ನು ELISA ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು mAb ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಶಾಖ ನಕ್ಷೆಯಾಗಿ ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ಪ್ಲಾಂಟ್ ಸೆಲ್ ವಾಲ್ ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಅನ್ನು ಗುರಿಪಡಿಸುವ mAbs ಅನ್ನು ಪ್ರಯೋಗಾಲಯದ ಸ್ಟಾಕ್‌ಗಳಿಂದ (CCRC, JIM ಮತ್ತು MAC ಸರಣಿ) ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಒಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಒಂದು ಹಂತದ ಬಯೋಟೈನೈಲೇಶನ್.ಬಯೋಟಿನ್-ಎಲ್ಸಿ-ಹೈಡ್ರಾಜೈಡ್ನೊಂದಿಗೆ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ಅನ್ನು ಡೈಮೀಥೈಲ್ ಸಲ್ಫಾಕ್ಸೈಡ್ (DMSO, 70 μl) ನಲ್ಲಿ 1 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 65 ° C. ನಲ್ಲಿ ಹುರುಪಿನ ಸ್ಫೂರ್ತಿದಾಯಕ ಮತ್ತು ಬಿಸಿ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಕರಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಗ್ಲೇಶಿಯಲ್ ಅಸಿಟಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು (30 µl) ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಸೋಡಿಯಂ ಸೈನೊಬೊರೊಹೈಡ್ರೈಡ್ (6.4 mg/100 µmol) ಮೇಲೆ ಸುರಿಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸುಮಾರು 1 ನಿಮಿಷ 65 ° C. ನಲ್ಲಿ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿದ ನಂತರ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಕರಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ, 5 ರಿಂದ 8 μl ವರೆಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಒಣಗಿದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗೆ (1-100 nmol) ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುವ ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಲೇಬಲ್‌ನ 10-ಪಟ್ಟು ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮೋಲಾರ್ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಪಡೆಯಲು.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 65 ° C ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತಕ್ಷಣವೇ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಯಾವುದೇ ಸೋಡಿಯಂ ಸೈನೊಬೊರೊಹೈಡ್ರೈಡ್ ಅನ್ನು ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಕಡಿತವಿಲ್ಲದೆ ಬಳಸಲಾಗಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 2.5 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 65 ° C. ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಲಾಯಿತು.
ELISA ಲೇಪನ ಮತ್ತು ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತೊಳೆಯುವುದು.25 μl ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (100 μl ಪ್ರತಿ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತ ಮಾದರಿಯ 5 ಮಿಲಿ 0.1 M ಟ್ರಿಸ್ ಬಫರ್ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ (TBS) ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ) ಅವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.0.1 M TBS ನಲ್ಲಿ 10 μg/ml ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ 50 μl ಬಯೋಟಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕಂಟ್ರೋಲ್ ವೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ.ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ನೀರನ್ನು ಖಾಲಿ ಅಳತೆಗಳಿಗೆ ಲೇಪನವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು.ಟ್ಯಾಬ್ಲೆಟ್ ಅನ್ನು ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ ಸಂಖ್ಯೆ ಬಳಸಿ 0.1 M TBS ನಲ್ಲಿ 0.1% ಕೆನೆ ತೆಗೆದ ಹಾಲಿನೊಂದಿಗೆ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ.ಗ್ರೆನಿಯರ್ ಫ್ಲಾಟ್ 3A ಗೆ 11.
ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಸೇರ್ಪಡೆ ಮತ್ತು ತೊಳೆಯುವುದು.ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 40 μl ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ.ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಮೈಕ್ರೊಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಿ.ಗ್ರೆನಿಯರ್ ಫ್ಲಾಟ್ 3A ಗಾಗಿ ವಾಶ್ ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ #11 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 0.1M TBS ನಲ್ಲಿ 0.1% ಹಾಲಿನೊಂದಿಗೆ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ತೊಳೆಯಿರಿ.ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 50 µl ಮೌಸ್/ಇಲಿ ದ್ವಿತೀಯಕ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು (0.1 M TBS ನಲ್ಲಿ 1:5000 0.1% ಹಾಲಿನಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ) ಸೇರಿಸಿ.ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಮೈಕ್ರೊಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಿ.ಗ್ರೆನಿಯರ್ ಫ್ಲಾಟ್ 5A ಪ್ಲೇಟ್ ವಾಶ್ ಪ್ರೋಗ್ರಾಂ #12 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು 0.1 M TBS ನಲ್ಲಿ 0.1% ಹಾಲಿನೊಂದಿಗೆ 5 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
ತಲಾಧಾರವನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದು.50 µl ನ 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ಅನ್ನು ಬೇಸ್ ಸಬ್‌ಸ್ಟ್ರೇಟ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಿ (2 ಹನಿಗಳ ಬಫರ್, 3 ಹನಿ TMB, 2 ಹನಿ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಪೆರಾಕ್ಸೈಡ್ ಅನ್ನು 15 ಮಿಲಿ ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ನೀರಿಗೆ ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ).TMB ತಲಾಧಾರವನ್ನು ತಯಾರಿಸಿ.ಮತ್ತು ಬಳಕೆಯ ಮೊದಲು ಸುಳಿಯ).30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಮೈಕ್ರೊಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಿ.ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ.
ಹಂತವನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು ಟ್ಯಾಬ್ಲೆಟ್ ಅನ್ನು ಓದಿ.ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 50 µl 1 N ಸಲ್ಫ್ಯೂರಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ELISA ರೀಡರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 450 ರಿಂದ 655 nm ವರೆಗೆ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಿ.
ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಕಗಳ 1 mg/ml ದ್ರಾವಣಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಿ: ಅರಬಿನೋಸ್, ರಾಮ್ನೋಸ್, ಫ್ಯೂಕೋಸ್, ಕ್ಸೈಲೋಸ್, ಗ್ಯಾಲಕ್ಟುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (GalA), ಗ್ಲುಕುರೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (GlcA), ಮನ್ನೋಸ್, ಗ್ಲೂಕೋಸ್, ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್, ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್, N-ಅಸೆಟೈಲ್‌ಮನ್ನೋಸಮೈನ್ (NA-acetylmannosamine.)(glcNAc), N-ಅಸೆಟೈಲ್‌ಗಲಾಕ್ಟೊಸಮೈನ್ (galNAc), ಇನೋಸಿಟಾಲ್ (ಆಂತರಿಕ ಮಾನದಂಡ).ಕೋಷ್ಟಕ 1 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ 1 mg/mL ಸಕ್ಕರೆಯ ದ್ರಾವಣಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಎರಡು ಮಾನದಂಡಗಳನ್ನು ಸಿದ್ಧಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಎಲ್ಲಾ ನೀರನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವವರೆಗೆ (ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಸುಮಾರು 12-18 ಗಂಟೆಗಳವರೆಗೆ) -80 ° C. ನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಲೈಯೋಫಿಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.
ವಿಶ್ಲೇಷಣಾತ್ಮಕ ಸಮತೋಲನದಲ್ಲಿ ಕ್ಯಾಪ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳನ್ನು ತಿರುಗಿಸಲು 100-500 μg ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಿ.ಸೇರಿಸಿದ ಮೊತ್ತವನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಿ.ದ್ರಾವಕದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಕರಗಿಸುವುದು ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ದ್ರವ ಅಲಿಕೋಟ್ ಆಗಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸುವುದು ಉತ್ತಮ.ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗೆ 20 µl 1 mg/ml ಇನೋಸಿಟಾಲ್ ಅನ್ನು ಆಂತರಿಕ ಮಾನದಂಡವಾಗಿ ಬಳಸಿ.ಮಾದರಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾದ ಆಂತರಿಕ ಮಾನದಂಡದ ಪ್ರಮಾಣವು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾದ ಆಂತರಿಕ ಮಾನದಂಡದ ಮೊತ್ತದಂತೆಯೇ ಇರಬೇಕು.
ಸ್ಕ್ರೂ ಕ್ಯಾಪ್ ಸೀಸೆಗೆ 8 ಮಿಲಿ ಅಹೈಡ್ರಸ್ ಮೆಥನಾಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ.ನಂತರ 4 ಮಿಲಿ 3 N. ಮೆಥನಾಲಿಕ್ HCl ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಮುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಲ್ಲಾಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ನೀರನ್ನು ಬಳಸುವುದಿಲ್ಲ.
ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್ ಮಾದರಿಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ TMS ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಿಗೆ 500 µl 1 M HCl ಮೆಥನಾಲ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ.ಥರ್ಮಲ್ ಬ್ಲಾಕ್‌ನಲ್ಲಿ 80 ° C. ನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ (168 ಗಂಟೆಗಳು) ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಒಣಗಿಸುವ ಮ್ಯಾನಿಫೋಲ್ಡ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಮೆಥನಾಲಿಸಿಸ್ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಒಣಗಿಸಿ.200 µl MeOH ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಮತ್ತೆ ಒಣಗಿಸಿ.ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮಾದರಿಗೆ 200 µl ಮೆಥನಾಲ್, 100 µl ಪಿರಿಡಿನ್ ಮತ್ತು 100 µl ಅಸಿಟಿಕ್ ಅನ್ಹೈಡ್ರೈಡ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ.ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮತ್ತು ಒಣಗಿಸಿ.200 μl ಮೆಥನಾಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಮತ್ತೆ ಒಣಗಿಸಿ.
200 µl ಟ್ರೈ-ಸಿಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮುಚ್ಚಿದ ಟ್ಯೂಬ್ ಅನ್ನು ಬಿಸಿ ಮಾಡಿ.80 ° C, ನಂತರ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ತಂಪಾಗುತ್ತದೆ.ಸರಿಸುಮಾರು 50 µl ಪರಿಮಾಣಕ್ಕೆ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಒಣಗಿಸಲು ಒಣಗಿಸುವ ಬಹುದ್ವಾರಿ ಬಳಸಿ.ನಾವು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಒಣಗಲು ಅನುಮತಿಸಲಿಲ್ಲ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸುವುದು ಮುಖ್ಯ.
2 ಮಿಲಿ ಹೆಕ್ಸೇನ್ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಸುಳಿಯ ಮೂಲಕ ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ.5-3/4 ಇಂಚು ವ್ಯಾಸದ ಪೈಪೆಟ್‌ನ ಮೇಲೆ ಗಾಜಿನ ಉಣ್ಣೆಯನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಗಾಜಿನ ಉಣ್ಣೆಯ ತುಂಡಿನಿಂದ ಪಾಶ್ಚರ್ ಪೈಪೆಟ್‌ಗಳ (5-8 ಮಿಮೀ) ತುದಿಗಳನ್ನು ತುಂಬಿಸಿ.ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 3000 ಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಯಾವುದೇ ಕರಗದ ಶೇಷಗಳು ಅವಕ್ಷೇಪಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ.ಮಾದರಿಯನ್ನು 100-150 µl ಗೆ ಒಣಗಿಸಿ.80 °C ನ ಆರಂಭಿಕ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಮತ್ತು 2.0 ನಿಮಿಷಗಳ ಆರಂಭಿಕ ಸಮಯದಲ್ಲಿ (ಕೋಷ್ಟಕ 2) ಸುಮಾರು 1 μl ಪರಿಮಾಣವನ್ನು GC-MS ಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು.