Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
Novos métodos inmunolóxicos e de espectrometría de masas para a análise complexa de oligosacáridos persistentes en estufas de millo pretratadas con AFEX.A biomasa lignocelulósica é unha alternativa sostible aos combustibles fósiles e é amplamente utilizada para desenvolver biotecnoloxías para a produción de produtos como alimentos, pensos, combustibles e produtos químicos.A clave destas tecnoloxías é o desenvolvemento de procesos competitivos en custos para converter os carbohidratos complexos presentes nas paredes das células vexetais en azucres simples como a glicosa, a xilosa e a arabinosa.Dado que a biomasa lignocelulósica é moi teimosa, debe someterse a tratamentos termoquímicos (p. ex., exfoliación de fibras de amoníaco (AFEX), ácidos diluídos (DA), líquidos iónicos (IL)) e tratamentos biolóxicos (p. ex., hidrólise enzimática e fermentación microbiana) en combinación para obter o produto desexado..Non obstante, cando se usan encimas fúngicas comerciais no proceso de hidrólise, só o 75-85% dos azucres solubles formados son monosacáridos, e o 15-25% restante son oligosacáridos solubles e intratables, que non sempre están dispoñibles para os microorganismos.Anteriormente, illamos e purificamos con éxito oligosacáridos solubles solubles mediante unha combinación de separación de carbono e terra de diatomeas e cromatografía de exclusión de tamaño, e tamén investigamos as súas propiedades inhibidoras de encimas.Descubrimos que os oligosacáridos que conteñen substitucións de ácido urónico metilado de maior grao de polimerización (DP) son máis difíciles de procesar con mesturas de encimas comerciais que os oligosacáridos neutros e de baixo DP.Aquí informamos do uso de varios métodos adicionais, incluíndo o perfil de glicanos mediante anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para os glicanos da biomasa vexetal para caracterizar os enlaces de glicanos nas paredes celulares vexetais e os hidrolizados enzimáticos, a ionización por desorción láser asistida por matriz, espectrometría de masas en tempo de voo..MALDI-TOF-MS) utiliza picos diagnósticos informativos da estrutura obtidos por espectroscopia despois da desintegración secundaria de ións negativos, cromatografía de gases e espectrometría de masas (GC-MS) para caracterizar enlaces oligosacáridos con e sen derivatización.Debido ao pequeno tamaño dos oligosacáridos (DP 4–20), estas moléculas son difíciles de usar para a unión e caracterización de mAb.Para superar este problema, aplicamos un novo método de inmobilización de oligosacáridos baseado na conxugación de biotina que marcou con éxito a maioría dos oligosacáridos solubles de baixo DP na superficie da microplaca, que logo se utilizou nun sistema mAb de alto rendemento para a análise de ligadura específica.Este novo método facilitará no futuro o desenvolvemento de ensaios de glicoma de alto rendemento máis avanzados que se poidan utilizar para illar e caracterizar oligosacáridos presentes en biomarcadores con fins de diagnóstico.
A biomasa lignocelulósica, composta por materiais agrícolas, forestais, herbáceos e leñosos, é unha materia prima potencial para a produción de produtos de base biolóxica, incluíndo alimentos, pensos, combustibles e precursores químicos para producir produtos de maior valor1.Os hidratos de carbono (como a celulosa e a hemicelulosa) presentes nas paredes celulares vexetais despolimerízanse en monosacáridos mediante procesamento químico e biotransformación (como a hidrólise enzimática e a fermentación microbiana).Os pretratamentos comúns inclúen a expansión da fibra de amoníaco (AFEX), o ácido diluído (DA), o líquido iónico (IL) e a explosión de vapor (SE), que usan unha combinación de produtos químicos e calor para reducir a produción de lignocelulosa abrindo as paredes celulares das plantas3,4.teimosía da materia, 5. A hidrólise enzimática realízase cunha alta carga de sólidos mediante encimas comerciais que conteñen carbohidratos activos (CAZymes) e fermentación microbiana mediante levaduras ou bacterias transxénicas para producir combustibles e produtos químicos de base biolóxica 6 .
Os CAZymes en encimas comerciais están compostos por unha mestura complexa de encimas que escinden de forma sinérxica enlaces complexos carbohidrato-azucre para formar monosacáridos2,7.Como xa informamos anteriormente, a complexa rede de polímeros aromáticos de lignina con hidratos de carbono fainos altamente intratables, o que leva a unha conversión incompleta de azucres, acumulando un 15-25% dos oligosacáridos sexuais que non se producen durante a hidrólise enzimática da biomasa pretratada.Este é un problema común con varios métodos de pretratamento de biomasa.Algunhas razóns para este pescozo de botella inclúen a inhibición enzimática durante a hidrólise, ou a ausencia ou os baixos niveis de encimas esenciais esenciais que son necesarios para romper os enlaces de azucre na biomasa vexetal.Comprender a composición e as características estruturais dos azucres, como os enlaces de azucre dos oligosacáridos, axudaranos a mellorar a conversión de azucres durante a hidrólise, facendo que os procesos biotecnolóxicos sexan competitivos en custos cos produtos derivados do petróleo.
Determinar a estrutura dos carbohidratos é un reto e require unha combinación de métodos como a cromatografía líquida (LC)11,12, a espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)13, a electroforese capilar (CE)14,15,16 e a espectrometría de masas (MS)17.,dezaoito.Os métodos de MS como a espectrometría de masas de tempo de voo con desorción e ionización con láser mediante unha matriz (MALDI-TOF-MS) son un método versátil para identificar estruturas de carbohidratos.Recentemente, a MS en tándem de disociación inducida por colisión (CID) de aductos de ións de sodio foi o máis amplamente utilizado para identificar as impresións dixitais correspondentes ás posicións de unión de oligosacáridos, configuracións anoméricas, secuencias e posicións de ramificación 20, 21 .
A análise de glicanos é unha excelente ferramenta para a identificación en profundidade de enlaces de carbohidratos22.Este método utiliza anticorpos monoclonais (mAb) dirixidos ao glicano da parede celular das plantas como sondas para comprender as conexións de carbohidratos complexos.Máis de 250 mAb están dispoñibles en todo o mundo, deseñados contra varios oligosacáridos lineais e ramificados usando varios sacáridos24.Varios mAb foron moi utilizados para caracterizar a estrutura, composición e modificacións da parede celular vexetal, xa que existen diferenzas significativas dependendo do tipo de célula vexetal, órgano, idade, estadio de desenvolvemento e ambiente de crecemento25,26.Máis recentemente, este método utilizouse para comprender as poboacións de vesículas en sistemas vexetais e animais e os seus respectivos papeis no transporte de glicanos determinados por marcadores subcelulares, etapas de desenvolvemento ou estímulos ambientais, e para determinar a actividade enzimática.Algunhas das diferentes estruturas de glicanos e xilanos que se identificaron inclúen pectina (P), xilano (X), manano (M), xiloglucanos (XylG), glucanos de enlace mixto (MLG), arabinoxilano (ArbX), galactomanano (GalG), ácido glucurónico-arabinoxilano (GArbX) e arabino-Galactan9 (ArbX)2.
Non obstante, a pesar de todos estes esforzos de investigación, só algúns estudos centráronse na natureza da acumulación de oligosacáridos durante a hidrólise de alta carga de sólidos (HSL), incluíndo a liberación de oligosacáridos, os cambios de lonxitude da cadea oligomérica durante a hidrólise, varios polímeros de baixo DP e as súas curvas.distribucións 30,31,32.Mentres tanto, aínda que a análise de glicanos demostrou ser unha ferramenta útil para unha análise completa da estrutura dos glicanos, é difícil avaliar os oligosacáridos de baixo DP solubles en auga mediante métodos de anticorpos.Os oligosacáridos DP máis pequenos cun peso molecular inferior a 5-10 kDa non se unen ás placas ELISA 33, 34 e son lavados antes da adición de anticorpos.
Aquí, por primeira vez, demostramos un ensaio ELISA en placas recubertas de avidina utilizando anticorpos monoclonais, combinando un procedemento de biotinilación dun paso para oligosacáridos refractarios solubles coa análise de glicoma.A nosa aproximación á análise de glicoma foi validada pola análise baseada en MALDI-TOF-MS e GC-MS de enlaces de oligosacáridos complementarios mediante a derivatización de trimetilsililo (TMS) de composicións de azucres hidrolizados.Este enfoque innovador pode desenvolverse como un método de alto rendemento no futuro e atopar unha aplicación máis ampla na investigación biomédica35.
As modificacións postraducionais de encimas e anticorpos, como a glicosilación,36 afectan á súa actividade biolóxica.Por exemplo, os cambios na glicosilación das proteínas séricas xogan un papel importante na artrite inflamatoria, e os cambios na glicosilación utilízanse como marcadores diagnósticos37.Varios glicanos informouse na literatura que aparecen facilmente nunha variedade de enfermidades, incluíndo enfermidades inflamatorias crónicas do tracto gastrointestinal e do fígado, infeccións virais, cancro de ovario, mama e próstata38,39,40.Comprender a estrutura dos glicanos mediante métodos ELISA de glicanos baseados en anticorpos proporcionará unha confianza adicional no diagnóstico da enfermidade sen o uso de métodos complexos de MS.
O noso estudo anterior mostrou que os oligosacáridos obstinados permaneceron sen hidrolizar despois do pretratamento e da hidrólise enzimática (Figura 1).No noso traballo publicado previamente, desenvolvemos un método de extracción en fase sólida de carbón activado para illar oligosacáridos do hidrolizado de maíz pretratado con AFEX (ACSH)8.Despois da extracción e separación inicial, os oligosacáridos foron fraccionados aínda máis mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) e recollidos por orde de peso molecular.Analizáronse os monómeros e oligómeros de azucre liberados de varios pretratamentos mediante a análise da composición de azucres.Ao comparar o contido de oligómeros de azucre obtidos por varios métodos de pretratamento, a presenza de oligosacáridos teimosos é un problema común na conversión de biomasa en monosacáridos e pode levar a unha redución do rendemento de azucre de polo menos un 10-15% e mesmo ata un 18%.EUA.Este método úsase para a produción a gran escala de fraccións de oligosacáridos.O ACH resultante e as súas fraccións posteriores con diferentes pesos moleculares utilizáronse como material experimental para a caracterización de oligosacáridos neste traballo.
Despois do pretratamento e da hidrólise enzimática, os oligosacáridos persistentes permaneceron sen hidrolizar.Aquí (A) é un método de separación de oligosacáridos no que os oligosacáridos se illan a partir de hidrolizado de millo (ACSH) pretratado con AFEX utilizando un leito compacto de carbón activado e terra de diatomeas;(B) Método de separación de oligosacáridos.Os oligosacáridos separáronse aínda máis mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC);(C) Monómeros e oligómeros de sacáridos liberados de diversos pretratamentos (ácido diluído: DA, líquido iónico: IL e AFEX).Condicións de hidrólise enzimática: alta carga de sólidos do 25% (p/p) (aproximadamente un 8% de carga de glucano), hidrólise de 96 horas, carga de encimas comerciais de 20 mg/g (proporción Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) e (D) Monómeros de azucre e oligómeros de glicosa, liberación de xilosa pretratada de glicosa e arabinosa (estrada de AF e arabinosa).
A análise de glicanos demostrou ser unha ferramenta útil para unha análise estrutural completa dos glicanos en extractos illados de residuos de biomasa sólida.Non obstante, os sacáridos solubles en auga están infrarrepresentados usando este método tradicional41 porque os oligosacáridos de baixo peso molecular son difíciles de inmobilizar nas placas ELISA e son lavados antes da adición de anticorpos.Polo tanto, para a unión e caracterización de anticorpos, utilizouse un método de biotinilación dun paso para recubrir oligosacáridos solubles e non conformes en placas ELISA recubertas de avidina.Este método probouse usando o noso ACSH producido previamente e unha fracción baseada no seu peso molecular (ou grao de polimerización, DP).A biotinilación dun paso foi usada para aumentar a afinidade de unión aos oligosacáridos engadindo biotina-LC-hidrazida ao extremo redutor do carbohidrato (Fig. 2).En solución, o grupo hemiacetal no extremo redutor reacciona co grupo hidrazida da biotina-LC-hidrazida para formar un enlace hidrazona.En presenza do axente redutor NaCNBH3, o enlace hidrazona redúcese a un produto final biotinilado estable.Coa modificación do extremo redutor de azucre, fíxose posible a unión de oligosacáridos de baixo DP ás placas ELISA, e no noso estudo fíxose en placas recubertas de avidina usando mAbs dirixidos a glicanos.
Cribado de anticorpos monoclonais baseado en ELISA para oligosacáridos biotinilados.Aquí (A) a biotinilación combinada de oligosacáridos e o posterior cribado ELISA con mAbs dirixidos a glicanos en placas revestidas de NeutrAvidin e (B) mostra un procedemento dun só paso para a biotinilación dos produtos da reacción.
Despois engadíronse placas recubertas de avidina con anticorpos conxugados con oligosacáridos aos anticorpos primarios e secundarios e laváronse nun medio sensible á luz e ao tempo.Despois de completar a unión de anticorpos, engade o substrato de TMB para incubar a placa.Finalmente detívose a reacción con ácido sulfúrico.As placas incubadas analizáronse mediante un lector ELISA para determinar a forza de unión de cada anticorpo para detectar a reticulación específica de anticorpos.Para obter detalles e parámetros do experimento, consulte a sección correspondente "Materiais e métodos".
Demostramos a utilidade deste método recentemente desenvolvido para aplicacións específicas caracterizando os oligosacáridos solubles presentes na ACSH, así como en fraccións de oligosacáridos brutos e purificados illadas de hidrolizados lignocelulósicos.Como se mostra na Figura 3, os xilanos substituídos por epítopos máis comúns identificados en ACSH mediante métodos de ensaio de glicoma bioacilado adoitan ser os arabinogalactanos urónicos (U) ou metilurónicos (MeU) e pécticos.A maioría deles tamén se atoparon no noso estudo previo sobre a análise de glicanos de sólidos non hidrolizados (UHS)43.
Detección de epítopos de oligosacáridos recalcitrantes mediante un anticorpo monoclonal dirixido ao glicano da parede celular.A fracción "neutra" é a fracción ACN e a fracción "ácida" é a fracción FA.Os vermellos máis brillantes do mapa térmico indican un maior contido de epítopo, e os azuis máis brillantes indican un fondo en branco.Os valores de cor na escala baséanse nos valores de DO bruto para as formulacións N=2.Á dereita móstranse os principais epítopos recoñecidos polos anticorpos.
Estas estruturas non celulosas non puideron ser escindidas polas celulasas e hemicelulases máis comúns na mestura de encimas comerciais probada, que inclúe os encimas comerciais máis usados.Polo tanto, son necesarios novos encimas auxiliares para a súa hidrólise.Sen os encimas accesorios non celulósicos necesarios, estes enlaces non celulósicos impiden a conversión completa en monosacáridos, aínda que os seus polímeros de azucre nai se hidrolicen extensamente en fragmentos máis curtos e se disolvan usando mesturas de encimas comerciais.
Un estudo máis detallado da distribución do sinal e da súa forza de unión mostrou que os epítopos de unión eran máis baixos nas fraccións de azucre con DP alto (A, B, C, DP ata 20+) que nas fraccións con DP baixa (D, E, F, DP) nos dímeros) (Fig. 1).Os fragmentos ácidos son máis comúns en epítopos non celulósicos que os fragmentos neutros.Estes fenómenos son consistentes co patrón observado no noso estudo anterior, onde as partes altas de DP e ácido eran máis resistentes á hidrólise enzimática.Polo tanto, a presenza de epítopos de glicanos non celulósicos e substitucións de U e MeU pode contribuír en gran medida á estabilidade dos oligosacáridos.Hai que ter en conta que a eficiencia de unión e detección pode ser problemática para oligosacáridos de baixo DP, especialmente se o epítopo é un oligosacárido dímero ou trimérico.Isto pódese probar utilizando oligosacáridos comerciais de diferentes lonxitudes, cada un contén só un epítopo que se une a un mAb específico.
Así, o uso de anticorpos específicos da estrutura revelou certos tipos de enlaces recalcitrantes.Dependendo do tipo de anticorpo utilizado, do patrón de ligamento axeitado e da intensidade do sinal que produce (máis e menos abundante), pódense identificar novos encimas e engadirse de forma semicuantitativa á mestura de encimas para unha glicoconversión máis completa.Tomando como exemplo a análise dos oligosacáridos ACSH, podemos crear unha base de datos de enlaces de glicanos para cada material de biomasa.Cabe sinalar aquí que hai que ter en conta a diferente afinidade dos anticorpos, e se a súa afinidade é descoñecida, isto xerará certas dificultades á hora de comparar os sinais de diferentes anticorpos.Ademais, a comparación de enlaces de glicano pode funcionar mellor entre mostras para o mesmo anticorpo.Estes enlaces obstinados pódense vincular despois á base de datos CAZyme, a partir da cal podemos identificar encimas, seleccionar encimas candidatas e probar encimas que rompen enlaces ou desenvolver sistemas microbianos para expresar estes encimas para o seu uso en biorrefinerías44.
Para avaliar como os métodos inmunolóxicos complementan os métodos alternativos para caracterizar oligosacáridos de baixo peso molecular presentes en hidrolizados lignocelulósicos, realizamos MALDI (Fig. 4, S1-S8) e análise de sacáridos derivados de TMS baseados en GC-MS no mesmo panel (Fig. 5) parte de oligosacáridos.MALDI utilízase para comparar se a distribución en masa das moléculas de oligosacáridos coincide coa estrutura prevista.Sobre a fig.A figura 4 mostra o MC dos compoñentes neutros ACN-A e ACN-B.A análise ACN-A confirmou unha gama de azucres pentosas que van desde DP 4-8 (Fig. 4) ata DP 22 (Fig. S1), cuxos pesos corresponden aos oligosacáridos de MeU-xilano.A análise ACN-B confirmou a serie de pentosa e glicoxilano con DP 8-15.En material suplementario como a Figura S3, os mapas de distribución de masas de restos ácidos FA-C mostran un rango de azucres pentosas substituídos por (Me)U cun DP de 8-15 que son consistentes cos xilanos substituídos que se atopan no cribado de mAb baseado en ELISA.Os epítopos son consistentes.
Espectro MALDI-MS de oligosacáridos solubles non conformes presentes en ACS.Aquí, (A) fraccións de baixo peso ACN-A que conteñen ácido urónico metilado (DP 4-8) substituídos con oligosacáridos de glucuroxilano e (B) xilano ACN-B e oligosacáridos de ácido urónico metilado substituídos por glucuroxilano (DP 8-15).
Análise da composición do residuo glicano dos oligosacáridos refractarios.Aquí (A) Composición de sacáridos TMS de varias fraccións de oligosacáridos obtidas mediante análise GC-MS.(B) Estruturas de varios azucres derivados de TMS presentes nos oligosacáridos.ACN - fracción de acetonitrilo que contén oligosacáridos neutros e FA - fracción de ácido ferúlico que contén oligosacáridos ácidos.
Outra conclusión interesante foi extraída da análise LC-MS da fracción de oligosacáridos, como se mostra na Figura S9 (os métodos pódense ver no material complementario electrónico).Durante a ligadura da fracción ACN-B observáronse repetidamente fragmentos de grupos hexosa e -OAc.Este achado non só confirma a fragmentación observada na análise de glicome e MALDI-TOF, senón que tamén proporciona nova información sobre os posibles derivados de carbohidratos na biomasa lignocelulósica pretratada.
Tamén se analizou a composición de azucre da fracción de oligosacáridos mediante a derivatización do azucre TMS.Usando GC-MS, determinamos a composición dos azucres neurais (non derivados) e ácidos (GluA e GalA) na fracción de oligosacáridos (Fig. 5).O ácido glucurónico atópase nos compoñentes ácidos C e D, mentres que o ácido galacturónico atópase nos compoñentes ácidos A e B, os cales son compoñentes de alto DP dos azucres ácidos.Estes resultados non só confirman os nosos datos ELISA e MALDI, senón que tamén son consistentes cos nosos estudos previos sobre a acumulación de oligosacáridos.Polo tanto, cremos que os métodos inmunolóxicos modernos que usan a biotinilación de oligosacáridos e o posterior cribado ELISA son suficientes para detectar oligosacáridos recalcitrantes solubles en varias mostras biolóxicas.
Dado que os métodos de cribado de mAb baseados en ELISA foron validados por varios métodos diferentes, queriamos explorar aínda máis o potencial deste novo método cuantitativo.Dous oligosacáridos comerciais, xilohexasacárido oligosacárido (XHE) e 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A2XX), foron adquiridos e probados utilizando un novo enfoque mAb dirixido ao glicano da parede celular.A figura 6 mostra unha correlación lineal entre o sinal de unión biotinilado e a concentración logarítmica da concentración de oligosacáridos, o que suxire un posible modelo de adsorción de Langmuir.Entre os mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 e CCRC-M151 correlacionáronse con XHE, e CCRC-M108, CCRC-M109 e LM11 correlacionáronse con A2XX nun rango de 1 nm a 100 nano.Debido á limitada dispoñibilidade de anticorpos durante o experimento, realizáronse experimentos limitados con cada concentración de oligosacáridos.Cabe sinalar aquí que algúns anticorpos reaccionan de forma moi diferente ao mesmo oligosacárido que un substrato, presumiblemente porque se unen a epítopos lixeiramente diferentes e poden ter afinidades de unión moi diferentes.Os mecanismos e as implicacións da identificación precisa dos epítopos serán moito máis complexos cando o novo enfoque de mAb se aplique a mostras reais.
Utilizáronse dous oligosacáridos comerciais para determinar o rango de detección de varios mAb dirixidos aos glicanos.Aquí, as correlacións lineais coa concentración logarítmica da concentración de oligosacáridos indican patróns de adsorción de Langmuir para (A) XHE con mAb e (B) A2XX con mAb.Os epítopos correspondentes indican as estruturas dos oligosacáridos comerciais utilizados como substratos no ensaio.
O uso de anticorpos monoclonais dirixidos a glicanos (análise glicocómica ou cribado de mAb baseado en ELISA) é unha poderosa ferramenta para a caracterización en profundidade da maioría dos principais glicanos da parede celular que constitúen a biomasa vexetal.Non obstante, a análise clásica de glicanos só caracteriza a glicanos de parede celular máis grandes, xa que a maioría dos oligosacáridos non se inmobilizan de forma eficiente nas placas ELISA.Neste estudo, a estufa de millo pretratada con AFEX hidrolizouse enzimáticamente cun alto contido de sólidos.Utilizouse a análise de azucres para determinar a composición dos carbohidratos recalcitrantes da parede celular no hidrolizado.Non obstante, a análise de mAb de oligosacáridos máis pequenos en hidrolizados está subestimada e son necesarias ferramentas adicionais para inmobilizar eficazmente os oligosacáridos nas placas ELISA.
Presentamos aquí un método de inmobilización de oligosacáridos novedoso e eficiente para a selección de mAb combinando a biotinilación de oligosacáridos seguida do cribado ELISA en placas revestidas de NeutrAvidin™.Os oligosacáridos biotinilados inmobilizados mostraron unha afinidade suficiente polo anticorpo para permitir a detección rápida e eficiente dos oligosacáridos recalcitrantes.A análise da composición destes oligosacáridos obstinados baseada na espectrometría de masas confirmou os resultados deste novo enfoque para a inmunocribaxe.Así, estes estudos demostran que a combinación de biotinilación de oligosacáridos e cribado ELISA con anticorpos monoclonais dirixidos a glicanos pode usarse para detectar enlaces cruzados en oligosacáridos e pode ser amplamente aplicado noutros estudos bioquímicos que caracterizan a estrutura dos oligosacáridos.
Este método de perfilado de glicanos baseado en biotina é o primeiro informe capaz de investigar os enlaces de carbohidratos recalcitrantes dos oligosacáridos solubles na biomasa vexetal.Isto axuda a entender por que algunhas partes da biomasa son tan teimosas cando se trata de produción de biocombustibles.Este método enche unha lagoa importante nos métodos de análise de glicoma e estende a súa aplicación a unha gama máis ampla de substratos máis aló dos oligosacáridos vexetais.No futuro, podemos utilizar a robótica para a biotinilación e utilizar o método que desenvolvemos para a análise de mostras de alto rendemento mediante ELISA.
A palla de millo (CS) cultivada a partir de sementes híbridas Pioneer 33A14 foi colleitada en 2010 de Kramer Farms en Ray, Colorado.Co permiso do propietario, esta biomasa pode ser utilizada para a investigación. As mostras almacenáronse en seco < 6% de humidade en bolsas con cierre zip a temperatura ambiente. As mostras almacenáronse en seco < 6% de humidade en bolsas con cierre zip a temperatura ambiente. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнатной при комтности As mostras gardáronse secas a unha humidade <6% en bolsas con cremalleira a temperatura ambiente.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. As mostras almacénanse en bolsas con cremalleira a temperatura ambiente cunha humidade < 6%.O estudo cumpriu as directrices locais e nacionais.A análise compositiva realizouse mediante o protocolo NREL.Descubriuse que a composición contén 31,4% de glucano, 18,7% de xilano, 3,3% de arabinano, 1,2% de galactano, 2,2% de acetilo, 14,3% de lignina, 1,7% de proteína e 13,4% de cinzas.
Cellic® CTec2 (138 mg proteína/ml, lote VCNI 0001) é unha mestura complexa de celulase, β-glucosidasa e Cellic® HTec2 (157 mg proteína/ml, lote VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, EUA)).Multifect Pectinase® (72 mg de proteína/ml), unha mestura complexa de encimas que degradan a pectina, foi doada por DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, EUA).As concentracións de proteínas enzimáticas determináronse estimando o contido proteico (e restando a contribución de nitróxeno non proteico) mediante a análise de nitróxeno Kjeldahl (método AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, EUA).A terra de diatomeas 545 foi adquirida a EMD Millipore (Billerica, MA).O carbón activado (DARCO, gránulos de malla 100), Avicel (PH-101), xilano de faia e todos os outros produtos químicos foron adquiridos a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
O pretratamento AFEX realizouse no GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, EUA).O pretratamento realizouse a 140 °C durante 15 minutos.46 tempo de residencia nunha proporción 1:1 de amoníaco anhidro a biomasa a unha carga do 60% (p/p) nun reactor discontinuo de sobremesa de aceiro inoxidable (Parr Instruments Company).Levou 30 minutos.O reactor levouse a 140 °C e o amoníaco liberouse rapidamente, permitindo que a biomasa volvese rapidamente á temperatura ambiente.A composición do fogón de millo pretratado (ACS) AFEX foi similar á do fogón de millo non tratado (UT-CS).
Preparouse ACSH 25% (p/p) de alto contido en sólidos (aproximadamente un 8% de carga de dextrano) como material de partida para a produción a gran escala de oligosacáridos.A hidrólise enzimática de ACS realizouse usando unha mestura de encimas comercial que inclúe Cellic® Ctec2 10 mg de proteína/g de glucano (en biomasa pretratada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg de proteína/g de glucano e Multifect Pectinase (Genencor Inc, EUA).).), 5 mg de proteína/g de dextrano.A hidrólise enzimática realizouse nun biorreactor de 5 litros cun volume de traballo de 3 litros, pH 4,8, 50°C e 250 rpm.Despois da hidrólise durante 96 horas, o hidrolizado foi recollido por centrifugación a 6000 rpm durante 30 minutos e despois a 14000 rpm durante 30 minutos para eliminar os sólidos non hidrolizados.A continuación, o hidrolizado foi sometido a filtración estéril a través dun vaso de precipitados de 0,22 mm.O hidrolizado filtrado almacenouse en frascos estériles a 4°C e despois fraccionouse en carbón.
Análise da composición de mostras de biomasa a base de extractos segundo procedementos de análise de laboratorio NREL: preparación de mostras para análise de composición (NREL/TP-510-42620) e determinación de hidratos de carbono estruturais e lignina na biomasa (NREL/TP-510 – 42618)47.
A análise de oligosacáridos da corrente de hidrolizado realizouse nunha escala de 2 ml mediante un método de hidrólise ácida baseado en autoclave.Mestura a mostra de hidrolizado con 69,7 µl de ácido sulfúrico ao 72% nun tubo de cultivo de 10 ml de tapón de rosca e incuba durante 1 h nunha mesa a 121 °C, arrefríase en xeo e filtra nun vial de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).A concentración de oligosacáridos determinouse restando a concentración de monosacáridos na mostra non hidrolizada da concentración total de azucre na mostra hidrolizada con ácido.
Analizáronse as concentracións de glicosa, xilosa e arabinosa na biomasa ácida hidrolizada mediante un sistema HPLC Shimadzu equipado cun automostrador, quentador de columna, bomba isocrática e detector de índice de refracción nunha columna Bio-Rad Aminex HPX-87H.A columna mantívose a 50 °C e eluíuse con 0,6 ml/min de H2SO4 5 mM en auga.fluxo.
O sobrenadante de hidrolizado diluíuse e analizouse o contido de monómeros e oligosacáridos.Os azucres monómeros obtidos tras a hidrólise enzimática foron analizados por HPLC equipado cunha columna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P e unha columna protectora de cinzas.A temperatura da columna mantívose a 80 °C, utilizouse auga como fase móbil cun caudal de 0,6 ml/min.Os oligosacáridos determináronse por hidrólise en ácido diluído a 121 °C segundo os métodos descritos nas ref.41, 48, 49.
Realizouse a análise de sacáridos en residuos de biomasa en bruto, pretratados con AFEX e todos os residuos de biomasa non hidrolizados (incluída a produción de extractos de parede celular en serie e o seu cribado de mAb) utilizando os procedementos descritos anteriormente 27, 43, 50, 51.Para a análise do glicoma, os residuos insolubles en alcohol do material da parede celular vexetal prepáranse a partir de residuos de biomasa e son sometidos a extracción en serie con reactivos cada vez máis agresivos como oxalato de amonio (50 mM), carbonato de sodio (50 mM e 0,5% p/v), CON.(1M e 4M, ambos con borohidruro sódico ao 1% p/v) e clorito ácido como se describiu anteriormente52,53.A continuación, os extractos foron sometidos a ELISA contra un panel complexo de mAb50 dirixido ao glicano da parede celular, e as reaccións de unión de mAb presentáronse como un mapa térmico.Os mAb dirixidos ao glicano da parede celular das plantas foron adquiridos en existencias de laboratorio (series CCRC, JIM e MAC).
Biotinilación dun paso de oligosacáridos.A conxugación de hidratos de carbono con biotina-LC-hidrazida realizouse mediante o seguinte procedemento.A biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) disolveuse en dimetilsulfóxido (DMSO, 70 μl) mediante axitación vigorosa e quentando a 65 °C durante 1 min.Engadiuse ácido acético glacial (30 µl) e a mestura vertiuse sobre cianoborohidruro de sodio (6,4 mg/100 µmol) e disoltouse completamente despois de quentar a 65 °C durante aproximadamente 1 minuto.A continuación, engadíronse de 5 a 8 μl da mestura de reacción ao oligosacárido seco (1-100 nmol) para obter un exceso molar de 10 veces ou máis do marcador sobre o extremo redutor.A reacción realizouse a 65 °C durante 2 h, despois das cales as mostras foron inmediatamente purificadas.Non se utilizou cianoborohidruro de sodio nos experimentos de etiquetaxe sen redución, e as mostras foron reaccionadas a 65 °C durante 2,5 horas.
Revestimento ELISA e lavado de mostras de oligosacáridos biotinilados.Engadíronse 25 μl de mostras biotiniladas (100 μl de cada mostra concentrada diluída en 5 ml de solución tampón Tris 0,1 M (TBS)) a cada pocillo da placa recuberta de avidina.Os pozos de control foron recubertos con 50 μl de biotina a unha concentración de 10 μg/ml en TBS 0,1 M.Utilizouse auga desionizada como revestimento para medicións en branco.O comprimido foi incubado durante 2 horas a temperatura ambiente na escuridade.Lavar o prato 3 veces con leite desnatado 0,1% en 0,1 M TBS usando o programa núm.11 para Grenier flat 3A.
Adición e lavado de anticorpos primarios.Engadir 40 µl de anticorpo primario a cada pozo.Incubar a microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente na escuridade.A continuación, lavaron as placas 3 veces con leite ao 0,1% en TBS 0,1M usando o programa de lavado #11 para Grenier Flat 3A.
Engadir anticorpo secundario e lavar.Engade 50 µl de anticorpo secundario de rato/rato (diluído 1:5000 en leite ao 0,1% en TBS 0,1 M) a cada pozo.Incubar a microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente na escuridade.A continuación, lavaron as microplacas 5 veces con leite ao 0,1% en TBS 0,1 M usando o programa de lavado de placas Grenier Flat 5A #12.
Engadindo un substrato.Engade 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) ao substrato base (engadindo 2 gotas de tampón, 3 gotas de TMB, 2 gotas de peróxido de hidróxeno a 15 ml de auga desionizada).Prepare o substrato de TMB.e vórtice antes de usar).Incubar a microplaca a temperatura ambiente durante 30 minutos.Na escuridade.
Completa o paso e le a tableta.Engadir 50 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pozo e rexistrar a absorbancia de 450 a 655 nm usando un lector ELISA.
Prepare solucións de 1 mg/ml destes analitos en auga desionizada: arabinosa, ramnose, fucosa, xilosa, ácido galacturónico (GalA), ácido glucurónico (GlcA), manosa, glicosa, galactosa, lactosa, N-acetilmanosamina (manNAc), N-acetilglucosamina.(glcNAc), N-acetilgalactosamina (galNAc), inositol (estándar interno).Preparáronse dous patróns engadindo as solucións de azucre de 1 mg/mL que se mostran na táboa 1. As mostras conxélanse e liofilízanse a -80 °C ata que se elimina toda a auga (normalmente unhas 12-18 horas).
Engade 100–500 µg de mostra aos tubos de tapón de rosca nunha balanza analítica.Anota a cantidade engadida.O mellor é disolver a mostra nunha concentración específica de disolvente e engadila ao tubo como alícuota líquida.Use 20 µl de 1 mg/ml de inositol como patrón interno para cada tubo de mostra.A cantidade de patrón interno engadido á mostra debe ser a mesma que a cantidade de patrón interno engadido ao tubo estándar.
Engade 8 ml de metanol anhidro a un vial de tapa de rosca.A continuación, 4 ml de solución metanólica de HCl 3 N, tapados e sacudidos.Este proceso non usa auga.
Engade 500 µl de solución de metanol de HCl 1 M ás mostras de oligosacáridos e aos tubos estándar de TMS.As mostras incubáronse durante a noite (168 horas) a 80 °C nun bloque térmico.Seque o produto de metanólise a temperatura ambiente usando un colector de secado.Engade 200 µl de MeOH e seca de novo.Este proceso repítese dúas veces.Engade 200 µl de metanol, 100 µl de piridina e 100 µl de anhídrido acético á mostra e mestura ben.As mostras incubáronse a temperatura ambiente durante 30 minutos.e secas.Engade 200 µl de metanol e seca de novo.
Engadir 200 µl de Tri-Sil e quentar o tubo durante 20 minutos.80 ° C, despois arrefriado a temperatura ambiente.Use un colector de secado para secar aínda máis a mostra ata un volume de aproximadamente 50 µl.É importante ter en conta que non permitimos que as mostras secasen por completo.
Engadir 2 ml de hexano e mesturar ben mediante vórtex.Enche as puntas das pipetas Pasteur (5-8 mm) cun anaco de la de vidro introducindo a la de vidro encima dunha pipeta de 5-3/4 polgadas de diámetro.As mostras centrifugáronse a 3000 g durante 2 minutos.Calquera residuo insoluble é precipitado.Seque a mostra a 100-150 µl.Inxectouse un volume de aproximadamente 1 μl no GC-MS a unha temperatura inicial de 80 ° C e un tempo inicial de 2,0 minutos (táboa 2).