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Novos métodos imunológicos e espectrométricos de massa para análise complexa de oligossacarídeos persistentes em palha de milho pré-tratada com AFEX.A biomassa lignocelulósica é uma alternativa sustentável aos combustíveis fósseis e é amplamente utilizada para desenvolver biotecnologias para a produção de produtos como alimentos, rações, combustíveis e produtos químicos.A chave para essas tecnologias é o desenvolvimento de processos competitivos de custo para converter carboidratos complexos presentes nas paredes celulares das plantas em açúcares simples, como glicose, xilose e arabinose.Como a biomassa lignocelulósica é muito teimosa, ela deve ser submetida a tratamentos termoquímicos (por exemplo, esfoliação de fibras de amônia (AFEX), ácidos diluídos (DA), líquidos iônicos (IL)) e tratamentos biológicos (por exemplo, hidrólise enzimática e fermentação microbiana) em combinação para obter o produto desejado..No entanto, quando enzimas fúngicas comerciais são usadas no processo de hidrólise, apenas 75-85% dos açúcares solúveis formados são monossacarídeos, e os 15-25% restantes são oligossacarídeos solúveis e intratáveis, que nem sempre estão disponíveis para os microorganismos.Anteriormente, isolamos e purificamos com sucesso oligossacarídeos teimosos solúveis usando uma combinação de separação de carbono e terra de diatomáceas e cromatografia de exclusão de tamanho, e também investigamos suas propriedades inibidoras de enzimas.Descobrimos que oligossacarídeos contendo substituições de ácido urônico metilado com maior grau de polimerização (DP) são mais difíceis de processar com misturas de enzimas comerciais do que oligossacarídeos neutros e de baixo DP.Aqui, relatamos o uso de vários métodos adicionais, incluindo perfil de glicano usando anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para glicanos de biomassa vegetal para caracterizar ligações de glicano em paredes celulares de plantas e hidrolisados ​​enzimáticos, ionização por dessorção a laser assistida por matriz, espectrometria de massa com tempo de voo..MALDI-TOF-MS) usa picos de diagnóstico informativos de estrutura obtidos por espectroscopia após decaimento secundário de íons negativos, cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC-MS) para caracterizar ligações de oligossacarídeos com e sem derivatização.Devido ao pequeno tamanho dos oligossacarídeos (DP 4-20), essas moléculas são difíceis de usar para ligação e caracterização de mAb.Para superar esse problema, aplicamos um novo método de imobilização de oligossacarídeos à base de conjugação de biotina que marcou com sucesso a maioria dos oligossacarídeos solúveis em DP baixo na superfície da microplaca, que foi então usado em um sistema mAb de alto rendimento para análise de ligação específica.Este novo método facilitará o desenvolvimento de ensaios de glicoma de alto rendimento mais avançados no futuro, que podem ser usados ​​para isolar e caracterizar oligossacarídeos presentes em biomarcadores para fins de diagnóstico.
A biomassa lignocelulósica, composta de materiais agrícolas, florestais, gramíneos e lenhosos, é uma matéria-prima potencial para a produção de produtos de base biológica, incluindo alimentos, rações, combustíveis e precursores químicos para produzir produtos de maior valor1.Carboidratos (como celulose e hemicelulose) presentes nas paredes celulares das plantas são despolimerizados em monossacarídeos por processamento químico e biotransformação (como hidrólise enzimática e fermentação microbiana).Pré-tratamentos comuns incluem expansão de fibra de amônia (AFEX), ácido diluído (DA), líquido iônico (IL) e explosão de vapor (SE), que usam uma combinação de produtos químicos e calor para reduzir a produção de lignocelulose abrindo as paredes celulares das plantas3,4.teimosia da matéria, 5. A hidrólise enzimática é realizada com uma alta carga de sólidos usando enzimas contendo carboidratos ativos comerciais (CAZymes) e fermentação microbiana usando leveduras ou bactérias transgênicas para produzir biocombustíveis e produtos químicos 6 .
As CAZymas em enzimas comerciais são compostas por uma mistura complexa de enzimas que clivam sinergicamente ligações carboidratos-açúcares complexos para formar monossacarídeos2,7.Como relatamos anteriormente, a complexa rede de polímeros aromáticos de lignina com carboidratos os torna altamente intratáveis, o que leva à conversão incompleta de açúcares, acumulando 15-25% de oligossacarídeos sexuais que não são produzidos durante a hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada.Este é um problema comum com vários métodos de pré-tratamento de biomassa.Algumas razões para este gargalo incluem a inibição enzimática durante a hidrólise ou a ausência ou baixos níveis de enzimas essenciais essenciais que são necessárias para quebrar as ligações de açúcar na biomassa vegetal.Compreender a composição e as características estruturais dos açúcares, como as ligações de açúcar em oligossacarídeos, nos ajudará a melhorar a conversão de açúcar durante a hidrólise, tornando os custos dos processos biotecnológicos competitivos com os produtos derivados do petróleo.
Determinar a estrutura de carboidratos é desafiador e requer uma combinação de métodos como cromatografia líquida (LC)11,12, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)13, eletroforese capilar (CE)14,15,16 e espectrometria de massa (MS)17.,dezoito.Os métodos de MS, como a espectrometria de massa com tempo de voo com dessorção a laser e ionização usando uma matriz (MALDI-TOF-MS), são um método versátil para identificar estruturas de carboidratos.Recentemente, MS tandem de dissociação induzida por colisão (CID) de adutos de íons de sódio tem sido mais amplamente utilizado para identificar impressões digitais correspondentes a posições de ligação de oligossacarídeos, configurações anoméricas, sequências e posições de ramificação 20, 21 .
A análise de glicanos é uma excelente ferramenta para identificação aprofundada de ligações de carboidratos22.Este método usa anticorpos monoclonais (mAbs) direcionados ao glicano da parede celular da planta como sondas para entender as ligações complexas de carboidratos.Mais de 250 mAbs estão disponíveis em todo o mundo, projetados contra vários oligossacarídeos lineares e ramificados usando vários sacarídeos24.Vários mAbs têm sido amplamente utilizados para caracterizar a estrutura, composição e modificações da parede celular vegetal, pois existem diferenças significativas dependendo do tipo de célula vegetal, órgão, idade, estágio de desenvolvimento e ambiente de crescimento25,26.Mais recentemente, esse método tem sido usado para entender as populações de vesículas em sistemas vegetais e animais e seus respectivos papéis no transporte de glicanos, conforme determinado por marcadores subcelulares, estágios de desenvolvimento ou estímulos ambientais, e para determinar a atividade enzimática.Algumas das diferentes estruturas de glicanas e xilanas que foram identificadas incluem pectina (P), xilana (X), manana (M), xiloglucanas (XylG), glucanas de ligação mista (MLG), arabinoxilana (ArbX), galactomanana (GalG), ácido glucurônico-arabinoxilana (GArbX) e arabino-galactana (ArbG)29.
No entanto, apesar de todos esses esforços de pesquisa, apenas alguns estudos se concentraram na natureza do acúmulo de oligossacarídeos durante a hidrólise de alta carga de sólidos (HSL), incluindo liberação de oligossacarídeos, alterações no comprimento da cadeia oligomérica durante a hidrólise, vários polímeros de baixo DP e suas curvas.distribuições 30,31,32.Enquanto isso, embora a análise de glicano tenha provado ser uma ferramenta útil para uma análise abrangente da estrutura do glicano, é difícil avaliar oligossacarídeos de baixo DP solúveis em água usando métodos de anticorpos.Os oligossacarídeos DP menores com um peso molecular inferior a 5-10 kDa não se ligam às placas ELISA 33, 34 e são lavados antes da adição do anticorpo.
Aqui, pela primeira vez, demonstramos um ensaio ELISA em placas revestidas com avidina usando anticorpos monoclonais, combinando um procedimento de biotinilação em uma etapa para oligossacarídeos refratários solúveis com análise de glicoma.Nossa abordagem para análise de glicoma foi validada pela análise baseada em MALDI-TOF-MS e GC-MS de ligações de oligossacarídeos complementares usando derivatização de trimetilsilil (TMS) de composições de açúcar hidrolisado.Essa abordagem inovadora pode ser desenvolvida como um método de alto rendimento no futuro e encontrar uma aplicação mais ampla na pesquisa biomédica35.
Modificações pós-traducionais de enzimas e anticorpos, como a glicosilação,36 afetam sua atividade biológica.Por exemplo, alterações na glicosilação de proteínas séricas desempenham um papel importante na artrite inflamatória, e alterações na glicosilação são usadas como marcadores diagnósticos37.Vários glicanos foram relatados na literatura como prontamente aparecendo em uma variedade de doenças, incluindo doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal e fígado, infecções virais, câncer de ovário, mama e próstata38,39,40.Compreender a estrutura dos glicanos usando métodos ELISA de glicano baseados em anticorpos fornecerá confiança adicional no diagnóstico de doenças sem o uso de métodos complexos de MS.
Nosso estudo anterior mostrou que os oligossacarídeos teimosos permaneceram não hidrolisados ​​após o pré-tratamento e a hidrólise enzimática (Figura 1).Em nosso trabalho publicado anteriormente, desenvolvemos um método de extração em fase sólida de carvão ativado para isolar oligossacarídeos de hidrolisado de palha de milho pré-tratado com AFEX (ACSH)8.Após extração e separação iniciais, os oligossacarídeos foram posteriormente fracionados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e coletados em ordem de peso molecular.Monômeros e oligômeros de açúcar liberados de vários pré-tratamentos foram analisados ​​por análise de composição de açúcar.Ao comparar o conteúdo de oligômeros de açúcar obtidos por vários métodos de pré-tratamento, a presença de oligossacarídeos teimosos é um problema comum na conversão de biomassa em monossacarídeos e pode levar a uma redução no rendimento de açúcar de pelo menos 10-15% e até 18%.NÓS.Este método é usado para posterior produção em grande escala de frações de oligossacarídeos.A ACH resultante e suas frações subsequentes com diferentes pesos moleculares foram utilizadas como material experimental para a caracterização de oligossacarídeos neste trabalho.
Após o pré-tratamento e a hidrólise enzimática, os oligossacarídeos persistentes permaneceram não hidrolisados.Aqui (A) é um método de separação de oligossacarídeos no qual oligossacarídeos são isolados de hidrolisado de palha de milho (ACSH) pré-tratado com AFEX usando um leito compactado de carvão ativado e terra de diatomáceas;(B) Método de separação de oligossacarídeos.Os oligossacarídeos foram ainda separados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC);(C) Monômeros e oligômeros sacarídeos liberados de vários pré-tratamentos (ácido diluído: DA, líquido iônico: IL e AFEX).Condições de hidrólise enzimática: alta carga de sólidos de 25% (p/p) (aproximadamente 8% de carga de glucana), 96 horas de hidrólise, carga de enzima comercial de 20 mg/g (relação Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) e (D) Monômeros de açúcar e oligômeros de glicose, xilose e arabinose liberados da palha de milho pré-tratada com AFEX (ACS).
A análise de glicanos provou ser uma ferramenta útil para uma análise estrutural abrangente de glicanos em extratos isolados de resíduos sólidos de biomassa.No entanto, sacarídeos solúveis em água são sub-representados usando este método tradicional41 porque os oligossacarídeos de baixo peso molecular são difíceis de imobilizar em placas de ELISA e são lavados antes da adição do anticorpo.Portanto, para a ligação e caracterização do anticorpo, um método de biotinilação de uma etapa foi usado para revestir oligossacarídeos solúveis não complacentes em placas de ELISA revestidas com avidina.Este método foi testado usando nosso ACSH produzido anteriormente e uma fração com base em seu peso molecular (ou grau de polimerização, DP).A biotinilação em uma etapa foi usada para aumentar a afinidade de ligação do oligossacarídeo adicionando biotina-LC-hidrazida à extremidade redutora do carboidrato (Fig. 2).Em solução, o grupo hemiacetal na extremidade redutora reage com o grupo hidrazida da biotina-LC-hidrazida para formar uma ligação hidrazona.Na presença do agente redutor NaCNBH3, a ligação hidrazona é reduzida a um produto final biotinilado estável.Com a modificação da extremidade redutora de açúcar, tornou-se possível a ligação de oligossacarídeos de baixo DP a placas ELISA e, em nosso estudo, isso foi feito em placas revestidas com avidina usando mAbs direcionados a glicanos.
Triagem de anticorpos monoclonais com base em ELISA para oligossacarídeos biotinilados.Aqui (A) biotinilação combinada de oligossacarídeos e triagem ELISA subsequente com mAbs direcionados a glicanos em placas revestidas com NeutrAvidin e (B) mostra um procedimento de uma etapa para biotinilação de produtos de reação.
Placas revestidas com avidina com anticorpos conjugados com oligossacarídeos foram então adicionadas aos anticorpos primários e secundários e lavadas em um meio sensível à luz e ao tempo.Após a conclusão da ligação do anticorpo, adicione o substrato TMB para incubar a placa.A reação foi finalmente interrompida com ácido sulfúrico.As placas incubadas foram analisadas usando um leitor ELISA para determinar a força de ligação de cada anticorpo para detectar a reticulação específica do anticorpo.Para detalhes e parâmetros do experimento, consulte a seção correspondente “Materiais e Métodos”.
Demonstramos a utilidade deste método recém-desenvolvido para aplicações específicas, caracterizando os oligossacarídeos solúveis presentes no ACSH, bem como nas frações de oligossacarídeos brutos e purificados isolados de hidrolisados ​​lignocelulósicos.Conforme mostrado na Figura 3, os xilanos substituídos por epítopo mais comuns identificados em ACSH usando métodos de ensaio de glicoma bioacilado são geralmente urônicos (U) ou metilurônicos (MeU) e arabinogalactanos pécticos.A maioria deles também foi encontrada em nosso estudo anterior sobre a análise de glicanos de sólidos não hidrolisados ​​(UHS)43.
Detecção de epítopos de oligossacarídeos recalcitrantes usando um anticorpo monoclonal direcionado ao glicano da parede celular.A fração “neutra” é a fração ACN e a fração “ácida” é a fração FA.Vermelhos mais brilhantes no mapa de calor indicam conteúdo de epítopo mais alto e azuis mais brilhantes indicam um fundo em branco.Os valores de cor na escala são baseados em valores OD brutos para formulações N=2.Os principais epítopos reconhecidos pelos anticorpos são mostrados à direita.
Estas estruturas não celulósicas não puderam ser clivadas pelas celulases e hemicelulases mais comuns na mistura enzimática comercial testada, que inclui as enzimas comerciais mais comumente usadas.Portanto, novas enzimas auxiliares são necessárias para sua hidrólise.Sem as necessárias enzimas acessórias não celulósicas, essas ligações não celulósicas impedem a conversão completa em monossacarídeos, mesmo que seus polímeros de açúcar parental sejam extensivamente hidrolisados ​​em fragmentos mais curtos e dissolvidos usando misturas enzimáticas comerciais.
Um estudo mais aprofundado da distribuição do sinal e sua força de ligação mostrou que os epítopos de ligação eram menores em frações de açúcar de alto DP (A, B, C, DP até 20+) do que em frações de baixo DP (D, E, F, DP) em dímeros) (Fig. 1).Fragmentos ácidos são mais comuns em epítopos não celulósicos do que fragmentos neutros.Esses fenômenos são consistentes com o padrão observado em nosso estudo anterior, onde alto DP e porções ácidas foram mais resistentes à hidrólise enzimática.Portanto, a presença de epítopos de glicano não celulósicos e substituições de U e MeU podem contribuir muito para a estabilidade dos oligossacarídeos.Deve-se notar que a eficiência de ligação e detecção pode ser problemática para oligossacarídeos de baixo DP, especialmente se o epítopo for um oligossacarídeo dimérico ou trimérico.Isso pode ser testado usando oligossacarídeos comerciais de diferentes comprimentos, cada um contendo apenas um epítopo que se liga a um mAb específico.
Assim, o uso de anticorpos específicos de estrutura revelou certos tipos de ligações recalcitrantes.Dependendo do tipo de anticorpo usado, do padrão de ligação apropriado e da força do sinal que produz (mais e menos abundante), novas enzimas podem ser identificadas e adicionadas semiquantitativamente à mistura de enzimas para uma glicoconversão mais completa.Tomando como exemplo a análise de oligossacarídeos ACSH, podemos criar um banco de dados de ligações glicanas para cada material de biomassa.Deve-se notar aqui que as diferentes afinidades dos anticorpos devem ser levadas em consideração e, se sua afinidade for desconhecida, isso criará certas dificuldades ao comparar os sinais de diferentes anticorpos.Além disso, a comparação de ligações de glicano pode funcionar melhor entre amostras para o mesmo anticorpo.Essas ligações teimosas podem então ser vinculadas ao banco de dados CAZyme, a partir do qual podemos identificar enzimas, selecionar enzimas candidatas e testar enzimas que quebram ligações ou desenvolver sistemas microbianos para expressar essas enzimas para uso em biorrefinarias44.
Para avaliar como os métodos imunológicos complementam métodos alternativos para caracterizar oligossacarídeos de baixo peso molecular presentes em hidrolisados ​​lignocelulósicos, realizamos MALDI (Fig. 4, S1-S8) e análise de sacarídeos derivados de TMS com base em GC-MS no mesmo painel (Fig. 5) parte oligossacarídica.MALDI é usado para comparar se a distribuição de massa de moléculas de oligossacarídeos corresponde à estrutura pretendida.Na fig.4 mostra o MC dos componentes neutros ACN-A e ACN-B.A análise ACN-A confirmou uma gama de açúcares pentose variando de DP 4–8 (Fig. 4) a DP 22 (Fig. S1), cujos pesos correspondem a oligossacarídeos MeU-xilano.A análise ACN-B confirmou a série de pentose e glucoxilana com DP 8-15.Em material suplementar, como a Figura S3, os mapas de distribuição de massa da fração ácida FA-C mostram uma faixa de açúcares pentose substituídos (Me)U com um DP de 8-15 que são consistentes com os xilanos substituídos encontrados na triagem de mAb baseada em ELISA.Os epítopos são consistentes.
Espectro MALDI-MS de oligossacarídeos não complacentes solúveis presentes em ACS.Aqui, (A) frações de baixo peso ACN-A contendo ácido urônico metilado (DP 4-8) oligossacarídeos glucuroxilano substituídos e (B) xilano ACN-B e oligossacarídeos ácido urônico metilado substituídos por glucuroxilano (DP 8-15).
Análise da composição do resíduo glicano de oligossacarídeos refratários.Aqui (A) composição de sacarídeo TMS de várias frações de oligossacarídeos obtidas usando análise GC-MS.(B) Estruturas de vários açúcares derivados de TMS presentes em oligossacarídeos.ACN – fração de acetonitrila contendo oligossacarídeos neutros e FA – fração de ácido ferúlico contendo oligossacarídeos ácidos.
Outra conclusão interessante foi tirada da análise LC-MS da fração oligossacarídica, conforme mostrado na Figura S9 (os métodos podem ser vistos no material eletrônico suplementar).Fragmentos de grupos hexose e -OAc foram repetidamente observados durante a ligação da fração ACN-B.Esta descoberta não só confirma a fragmentação observada no glicoma e análise MALDI-TOF, mas também fornece novas informações sobre potenciais derivados de carboidratos em biomassa lignocelulósica pré-tratada.
Também analisamos a composição de açúcar da fração oligossacarídica usando derivatização de açúcar TMS.Usando GC-MS, determinamos a composição de açúcares neurais (não derivados) e ácidos (GluA e GalA) na fração de oligossacarídeos (Fig. 5).O ácido glucurônico é encontrado nos componentes ácidos C e D, enquanto o ácido galacturônico é encontrado nos componentes ácidos A e B, ambos componentes de alto DP de açúcares ácidos.Esses resultados não apenas confirmam nossos dados de ELISA e MALDI, mas também são consistentes com nossos estudos anteriores de acúmulo de oligossacarídeos.Portanto, acreditamos que métodos imunológicos modernos usando biotinilação de oligossacarídeos e subsequente triagem ELISA são suficientes para detectar oligossacarídeos recalcitrantes solúveis em várias amostras biológicas.
Como os métodos de triagem de mAb baseados em ELISA foram validados por vários métodos diferentes, queríamos explorar ainda mais o potencial desse novo método quantitativo.Dois oligossacarídeos comerciais, oligossacarídeo xilohexassacarídeo (XHE) e 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriose (A2XX), foram adquiridos e testados usando uma nova abordagem de mAb visando o glicano da parede celular.A Figura 6 mostra uma correlação linear entre o sinal de ligação biotinilado e a concentração logarítmica da concentração de oligossacarídeos, sugerindo um possível modelo de adsorção de Langmuir.Entre os mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 e CCRC-M151 correlacionados com XHE e CCRC-M108, CCRC-M109 e LM11 correlacionados com A2XX em uma faixa de 1 nm a 100 nano.Devido à disponibilidade limitada de anticorpos durante o experimento, experimentos limitados foram realizados com cada concentração de oligossacarídeo.Deve-se notar aqui que alguns anticorpos reagem de maneira muito diferente ao mesmo oligossacarídeo como substrato, presumivelmente porque se ligam a epítopos ligeiramente diferentes e podem ter afinidades de ligação muito diferentes.Os mecanismos e implicações da identificação precisa do epítopo serão muito mais complexos quando a nova abordagem mAb for aplicada a amostras reais.
Dois oligossacarídeos comerciais foram usados ​​para determinar o intervalo de detecção de vários mAbs direcionados a glicanos.Aqui, as correlações lineares com a concentração logarítmica da concentração de oligossacarídeos indicam os padrões de adsorção de Langmuir para (A) XHE com mAb e (B) A2XX com mAb.Os epítopos correspondentes indicam as estruturas dos oligossacarídeos comerciais usados ​​como substratos no ensaio.
O uso de anticorpos monoclonais direcionados a glicanos (análise glicocômica ou triagem de mAb baseada em ELISA) é uma ferramenta poderosa para a caracterização aprofundada da maioria dos principais glicanos da parede celular que compõem a biomassa vegetal.No entanto, a análise clássica de glicanos caracteriza apenas glicanos de paredes celulares maiores, já que a maioria dos oligossacarídeos não é eficientemente imobilizada em placas de ELISA.Neste estudo, palha de milho pré-tratada com AFEX foi hidrolisada enzimaticamente com alto teor de sólidos.A análise de açúcar foi usada para determinar a composição de carboidratos recalcitrantes da parede celular no hidrolisado.No entanto, a análise de mAb de oligossacarídeos menores em hidrolisados ​​é subestimada, e ferramentas adicionais são necessárias para imobilizar efetivamente oligossacarídeos em placas de ELISA.
Relatamos aqui um novo e eficiente método de imobilização de oligossacarídeos para triagem de mAb combinando a biotinilação de oligossacarídeos seguida de triagem por ELISA em placas revestidas com NeutrAvidin™.Os oligossacarídeos biotinilados imobilizados mostraram afinidade suficiente para o anticorpo para permitir a detecção rápida e eficiente de oligossacarídeos recalcitrantes.A análise da composição desses oligossacarídeos teimosos com base na espectrometria de massa confirmou os resultados dessa nova abordagem de imunotriagem.Assim, esses estudos demonstram que a combinação de biotinilação de oligossacarídeos e triagem de ELISA com anticorpos monoclonais direcionados a glicanos pode ser usada para detectar reticulações em oligossacarídeos e pode ser amplamente aplicada em outros estudos bioquímicos que caracterizam a estrutura de oligossacarídeos.
Este método de perfilagem de glicano à base de biotina é o primeiro relatório capaz de investigar as ligações de carboidratos recalcitrantes de oligossacarídeos solúveis na biomassa vegetal.Isso ajuda a entender por que algumas partes da biomassa são tão teimosas quando se trata de produção de biocombustíveis.Este método preenche uma lacuna importante nos métodos de análise de glicoma e estende sua aplicação a uma ampla gama de substratos além dos oligossacarídeos vegetais.No futuro, podemos usar a robótica para biotinilação e usar o método que desenvolvemos para análise de alto rendimento de amostras usando ELISA.
A palha de milho (CS) cultivada a partir de sementes híbridas Pioneer 33A14 foi colhida em 2010 na Kramer Farms em Ray, Colorado.Com a autorização do proprietário da terra, essa biomassa pode ser utilizada para pesquisa. As amostras foram armazenadas secas < 6% de umidade em sacos zip-lock em temperatura ambiente. As amostras foram armazenadas secas < 6% de umidade em sacos zip-lock em temperatura ambiente. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. As amostras foram armazenadas secas a <6% de umidade em sacos com zíper à temperatura ambiente.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥 < 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. As amostras são armazenadas em sacos com zíper em temperatura ambiente com umidade < 6%.O estudo obedeceu às diretrizes locais e nacionais.A análise composicional foi realizada usando o protocolo NREL.Verificou-se que a composição continha 31,4% de glucana, 18,7% de xilana, 3,3% de arabinana, 1,2% de galactana, 2,2% de acetil, 14,3% de lignina, 1,7% de proteína e 13,4% de cinzas.
Cellic® CTec2 (138 mg proteína/ml, lote VCNI 0001) é uma mistura complexa de celulase, β-glicosidase e Cellic® HTec2 (157 mg proteína/ml, lote VHN00001) da Novozymes (Franklinton, NC, EUA)).Multifect Pectinase® (72 mg proteína/mL), uma mistura complexa de enzimas degradadoras de pectina, foi doado pela DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, EUA).As concentrações de proteína enzimática foram determinadas estimando o conteúdo de proteína (e subtraindo a contribuição de nitrogênio não proteico) usando análise de nitrogênio Kjeldahl (método AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, EUA).A terra diatomácea 545 foi adquirida da EMD Millipore (Billerica, MA).Carvão ativado (DARCO, grânulos de 100 mesh), Avicel (PH-101), xilano de faia e todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
O pré-tratamento AFEX foi realizado no GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, EUA).O pré-tratamento foi realizado a 140°C por 15 minutos.46 tempo de residência na proporção de 1:1 de amônia anidra para biomassa a 60% (p/p) de carga em um reator de batelada de bancada de aço inoxidável (Parr Instruments Company).Demorou 30 minutos.O reator foi levado a 140°C e a amônia foi rapidamente liberada, permitindo que a biomassa voltasse rapidamente à temperatura ambiente.A composição da palha de milho pré-tratada com AFEX (ACS) foi semelhante à da palha de milho não tratada (UT-CS).
ACSH de alto teor de sólidos 25% (p/p) (aproximadamente 8% de carga de dextrano) foi preparado como material de partida para produção em larga escala de oligossacarídeos.A hidrólise enzimática de ACS foi realizada usando uma mistura enzimática comercial incluindo Cellic® Ctec2 10 mg de proteína/g glucano (em biomassa pré-tratada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg de proteína/g glucano e Multifect Pectinase (Genencor Inc, EUA).).), 5 mg de proteína/g de dextrano.A hidrólise enzimática foi realizada em biorreator de 5 litros com volume de trabalho de 3 litros, pH 4,8, 50°C e 250 rpm.Após hidrólise durante 96 horas, o hidrolisado foi recolhido por centrifugação a 6000 rpm durante 30 minutos e depois a 14000 rpm durante 30 minutos para remover os sólidos não hidrolisados.O hidrolisado foi então submetido a filtração estéril através de um béquer com filtro de 0,22 mm.O hidrolisado filtrado foi armazenado em frascos estéreis a 4°C e fracionado em carbono.
Análise da composição de amostras de biomassa à base de extrato de acordo com os procedimentos de análise laboratorial do NREL: preparação de amostras para análise de composição (NREL/TP-510-42620) e determinação de carboidratos estruturais e lignina na biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
A análise de oligossacarídeos da corrente de hidrolisado foi realizada em uma escala de 2 ml usando um método de hidrólise ácida baseado em autoclave.Misture a amostra de hidrolisado com 69,7 µl de ácido sulfúrico a 72% em um tubo de cultura de 10 ml com tampa de rosca e incube por 1 h em uma bancada a 121 ° C, resfrie no gelo e filtre em um frasco de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).A concentração de oligossacarídeos foi determinada subtraindo a concentração de monossacarídeos na amostra não hidrolisada da concentração total de açúcar na amostra hidrolisada com ácido.
As concentrações de glicose, xilose e arabinose na biomassa hidrolisada com ácido foram analisadas usando um sistema Shimadzu HPLC equipado com um amostrador automático, aquecedor de coluna, bomba isocrática e detector de índice de refração em uma coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H.A coluna foi mantida a 50°C e eluída com 0,6 ml/min de H2SO4 5 mM em água.fluxo.
O sobrenadante hidrolisado foi diluído e analisado quanto ao conteúdo de monômeros e oligossacarídeos.Açúcares monoméricos obtidos após hidrólise enzimática foram analisados ​​por HPLC equipada com uma coluna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P e uma coluna anti-cinza.A temperatura da coluna foi mantida a 80°C, água foi utilizada como fase móvel com uma vazão de 0,6 ml/min.Os oligossacarídeos foram determinados por hidrólise em ácido diluído a 121°C de acordo com os métodos descritos nas refs.41, 48, 49.
A análise de sacarídeos foi realizada em matérias-primas, pré-tratadas com AFEX e todos os resíduos de biomassa não hidrolisados ​​(incluindo a produção de extratos de parede celular em série e sua triagem de mAb) usando procedimentos descritos anteriormente 27, 43, 50, 51.Para análise de glicoma, resíduos insolúveis em álcool de material de parede celular vegetal são preparados a partir de resíduos de biomassa e submetidos a extração em série com reagentes cada vez mais agressivos, como oxalato de amônio (50 mM), carbonato de sódio (50 mM e 0,5% p/v), CON.(1M e 4M, ambos com borohidreto de sódio 1% p/v) e clorito ácido conforme descrito anteriormente52,53.Os extratos foram então submetidos a ELISA contra um painel complexo de mAb50s direcionados ao glicano da parede celular, e as reações de ligação do mAb foram apresentadas como um mapa de calor.Os mAbs direcionados ao glicano da parede celular da planta foram adquiridos de estoques de laboratório (séries CCRC, JIM e MAC).
Biotinilação em uma etapa de oligossacarídeos.A conjugação de carboidratos com biotina-LC-hidrazida foi realizada usando o seguinte procedimento.Biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) foi dissolvida em dimetil sulfóxido (DMSO, 70 μl) por agitação vigorosa e aquecimento a 65° C por 1 min.Adicionou-se ácido acético glacial (30 µl) e verteu-se a mistura sobre cianoborohidreto de sódio (6,4 mg/100 µmol) e dissolveu-se completamente após aquecimento a 65°C durante cerca de 1 minuto.Então, de 5 a 8 μl da mistura de reação foram adicionados ao oligossacarídeo seco (1-100 nmol) para obter um excesso molar de 10 vezes ou mais do marcador sobre a extremidade redutora.A reação foi realizada a 65°C por 2 h, após o que as amostras foram imediatamente purificadas.Nenhum cianoborohidreto de sódio foi usado nos experimentos de marcação sem redução, e as amostras foram feitas reagir a 65°C por 2,5 horas.
Revestimento ELISA e lavagem de amostras de oligossacarídeos biotinilados.25 μl de amostras biotiniladas (100 μl de cada amostra concentrada diluída em 5 ml de solução tampão Tris 0,1 M (TBS)) foram adicionados a cada poço da placa revestida com avidina.Os poços de controle foram revestidos com 50 μl de biotina a uma concentração de 10 μg/ml em 0,1 M TBS.Água deionizada foi usada como revestimento para medições em branco.O comprimido foi incubado durante 2 horas à temperatura ambiente no escuro.Lave a placa 3 vezes com leite desnatado 0,1% em TBS 0,1 M usando o programa no.11 para Grenier plano 3A.
Adição e lavagem de anticorpos primários.Adicione 40 µl de anticorpo primário a cada poço.Incube a microplaca por 1 hora em temperatura ambiente no escuro.As placas foram então lavadas 3 vezes com 0,1% de leite em 0,1M TBS usando o programa de lavagem #11 para Grenier Flat 3A.
Adicionar anticorpo secundário e lavar.Adicione 50 µl de anticorpo secundário de camundongo/rato (diluído 1:5.000 em 0,1% de leite em 0,1 M TBS) a cada poço.Incube a microplaca por 1 hora em temperatura ambiente no escuro.As microplacas foram então lavadas 5 vezes com 0,1% de leite em 0,1 M TBS usando o programa de lavagem de placas Grenier Flat 5A #12.
Adicionando um substrato.Adicione 50 µl de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) ao substrato base (adicionando 2 gotas de tampão, 3 gotas de TMB, 2 gotas de peróxido de hidrogênio a 15 ml de água deionizada).Prepare o substrato TMB.e vórtice antes de usar).Incubar a microplaca à temperatura ambiente durante 30 minutos.No escuro.
Conclua a etapa e leia o tablet.Adicione 50 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada poço e registre a absorbância de 450 a 655 nm usando um leitor de ELISA.
Prepare soluções de 1 mg/ml destes analitos em água desionizada: arabinose, ramnose, fucose, xilose, ácido galacturónico (GalA), ácido glucurónico (GlcA), manose, glucose, galactose, lactose, N-acetilmanosamina (manNAc), N-acetilglucosamina.(glcNAc), N-acetilgalactosamina (galNAc), inositol (padrão interno).Dois padrões foram preparados adicionando as soluções de açúcar de 1 mg/mL mostradas na Tabela 1. As amostras são congeladas e liofilizadas a -80° C até que toda a água seja removida (geralmente cerca de 12-18 horas).
Adicione 100–500 µg de amostra a tubos com tampa de rosca em uma balança analítica.Registre a quantidade adicionada.É melhor dissolver a amostra em uma concentração específica de solvente e adicioná-la ao tubo como uma alíquota de líquido.Use 20 µl de 1 mg/ml de inositol como padrão interno para cada tubo de amostra.A quantidade de padrão interno adicionada à amostra deve ser igual à quantidade de padrão interno adicionada ao tubo padrão.
Adicione 8 ml de metanol anidro a um frasco com tampa de rosca.Em seguida, 4 ml de solução metanólica de HCl 3 N, tampe e agite.Este processo não utiliza água.
Adicione 500 µl de solução de metanol HCl 1 M às amostras de oligossacarídeos e tubos TMS padrão.As amostras foram incubadas durante a noite (168 horas) a 80° C em um bloco térmico.Seque o produto da metanólise à temperatura ambiente usando um coletor de secagem.Adicione 200 µl de MeOH e seque novamente.Este processo é repetido duas vezes.Adicione 200 µl de metanol, 100 µl de piridina e 100 µl de anidrido acético à amostra e misture bem.As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos.e seco.Adicionar 200 µl de metanol e secar novamente.
Adicione 200 µl de Tri-Sil e aqueça o tubo tampado por 20 minutos.80°C, e então resfriado à temperatura ambiente.Use um coletor de secagem para secar ainda mais a amostra até um volume de aproximadamente 50 µl.É importante notar que não permitimos que as amostras secassem completamente.
Adicione 2 ml de hexano e misture bem em vórtex.Encha as pontas das pipetas Pasteur (5-8 mm) com um pedaço de lã de vidro, inserindo a lã de vidro no topo de uma pipeta de 5-3/4 de polegada de diâmetro.As amostras foram centrifugadas a 3000 g por 2 minutos.Quaisquer resíduos insolúveis são precipitados.Seque a amostra para 100-150 µl.Um volume de aproximadamente 1 μl foi injetado no GC-MS a uma temperatura inicial de 80 °C e um tempo inicial de 2,0 minutos (Tabela 2).