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Novos métodos imunológicos e de espectrometria de massa para análise complexa de oligossacarídeos persistentes em palha de milho pré-tratada com AFEX. A biomassa lignocelulósica é uma alternativa sustentável aos combustíveis fósseis e é amplamente utilizada no desenvolvimento de biotecnologias para a produção de produtos como alimentos, rações, combustíveis e produtos químicos. A chave para essas tecnologias é o desenvolvimento de processos economicamente competitivos para a conversão de carboidratos complexos presentes nas paredes celulares das plantas em açúcares simples, como glicose, xilose e arabinose. Como a biomassa lignocelulósica é muito resistente, ela deve ser submetida a tratamentos termoquímicos (por exemplo, esfoliação de fibras com amônia (AFEX), ácidos diluídos (AD), líquidos iônicos (LI)) e tratamentos biológicos (por exemplo, hidrólise enzimática e fermentação microbiana) em combinação para se obter o produto desejado. No entanto, quando enzimas fúngicas comerciais são utilizadas no processo de hidrólise, apenas 75-85% dos açúcares solúveis formados são monossacarídeos, e os 15-25% restantes são oligossacarídeos solúveis e de difícil processamento, que nem sempre estão disponíveis para os microrganismos. Anteriormente, isolamos e purificamos com sucesso oligossacarídeos solúveis de difícil processamento utilizando uma combinação de separação por carbono e terra diatomácea e cromatografia de exclusão por tamanho, além de investigar suas propriedades inibitórias enzimáticas. Descobrimos que oligossacarídeos contendo substituições de ácido urônico metilado com maior grau de polimerização (DP) são mais difíceis de processar com misturas de enzimas comerciais do que oligossacarídeos neutros e de baixo DP. Neste trabalho, relatamos o uso de diversos métodos adicionais, incluindo o perfilamento de glicanos utilizando anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para glicanos da biomassa vegetal para caracterizar as ligações glicânicas nas paredes celulares vegetais e em hidrolisados ​​enzimáticos, e espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz com tempo de voo (MALDI-TOF-MS). A espectrometria de massa MALDI-TOF utiliza picos diagnósticos com informações estruturais obtidos por espectroscopia após o decaimento secundário de íons negativos, cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC-MS) para caracterizar ligações de oligossacarídeos com e sem derivatização. Devido ao pequeno tamanho dos oligossacarídeos (DP 4–20), essas moléculas são difíceis de usar para ligação e caracterização de anticorpos monoclonais (mAbs). Para superar esse problema, aplicamos um novo método de imobilização de oligossacarídeos baseado na conjugação com biotina, que marcou com sucesso a maioria dos oligossacarídeos solúveis de baixo DP na superfície da microplaca. Essa microplaca foi então utilizada em um sistema de mAb de alto rendimento para análise de ligação específica. Esse novo método facilitará o desenvolvimento de ensaios de glicoma de alto rendimento mais avançados no futuro, que poderão ser usados ​​para isolar e caracterizar oligossacarídeos presentes em biomarcadores para fins diagnósticos.
A biomassa lignocelulósica, composta por materiais agrícolas, florestais, de pastagens e lenhosos, é uma matéria-prima potencial para a produção de produtos de base biológica, incluindo alimentos, rações, combustíveis e precursores químicos para a produção de produtos de maior valor agregado¹. Os carboidratos (como celulose e hemicelulose) presentes nas paredes celulares das plantas são despolimerizados em monossacarídeos por meio de processamento químico e biotransformação (como hidrólise enzimática e fermentação microbiana). Os pré-tratamentos comuns incluem a expansão de fibras com amônia (AFEX), ácido diluído (DA), líquido iônico (IL) e explosão a vapor (SE), que utilizam uma combinação de produtos químicos e calor para reduzir a lignocelulose, abrindo as paredes celulares das plantas³.⁴ A hidrólise enzimática é realizada com alta carga de sólidos, utilizando enzimas comerciais ativas contendo carboidratos (CAZymes), e a fermentação microbiana utiliza leveduras ou bactérias transgênicas para produzir biocombustíveis e produtos químicos⁶.
As CAZimas em enzimas comerciais são compostas por uma mistura complexa de enzimas que clivam sinergicamente ligações complexas entre carboidratos e açúcares para formar monossacarídeos^2,7. Como relatamos anteriormente, a complexa rede de polímeros aromáticos da lignina com carboidratos torna-as altamente difíceis de processar, o que leva à conversão incompleta de açúcares, acumulando 15-25% de oligossacarídeos sexuais que não são produzidos durante a hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada. Este é um problema comum em vários métodos de pré-tratamento de biomassa. Algumas razões para esse gargalo incluem a inibição enzimática durante a hidrólise ou a ausência ou baixos níveis de enzimas essenciais necessárias para quebrar as ligações de açúcar na biomassa vegetal. Compreender a composição e as características estruturais dos açúcares, como as ligações de açúcar em oligossacarídeos, nos ajudará a melhorar a conversão de açúcares durante a hidrólise, tornando os processos biotecnológicos competitivos em termos de custo com os produtos derivados do petróleo.
Determinar a estrutura de carboidratos é um desafio e requer uma combinação de métodos como cromatografia líquida (CL)11,12, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)13, eletroforese capilar (EC)14,15,16 e espectrometria de massa (EM)17,18. Métodos de EM, como a espectrometria de massa por tempo de voo com dessorção e ionização a laser usando uma matriz (MALDI-TOF-MS), são um método versátil para identificar estruturas de carboidratos. Recentemente, a espectrometria de massa em tandem com dissociação induzida por colisão (CID) de adutos de íons sódio tem sido amplamente utilizada para identificar impressões digitais correspondentes a posições de ligação de oligossacarídeos, configurações anoméricas, sequências e posições de ramificação20,21.
A análise de glicanos é uma excelente ferramenta para a identificação detalhada de ligações de carboidratos22. Este método utiliza anticorpos monoclonais (mAbs) direcionados a glicanos da parede celular vegetal como sondas para compreender as complexas ligações de carboidratos. Mais de 250 mAbs estão disponíveis mundialmente, projetados contra diversos oligossacarídeos lineares e ramificados, utilizando vários sacarídeos24. Diversos mAbs têm sido amplamente utilizados para caracterizar a estrutura, a composição e as modificações da parede celular vegetal, visto que existem diferenças significativas dependendo do tipo de célula vegetal, órgão, idade, estágio de desenvolvimento e ambiente de crescimento25,26. Mais recentemente, este método tem sido utilizado para compreender as populações de vesículas em sistemas vegetais e animais e seus respectivos papéis no transporte de glicanos, determinados por marcadores subcelulares, estágios de desenvolvimento ou estímulos ambientais, e para determinar a atividade enzimática. Algumas das diferentes estruturas de glicanos e xilanos que foram identificadas incluem pectina (P), xilano (X), manano (M), xiloglucanos (XylG), glucanos de ligação mista (MLG), arabinoxilano (ArbX), galactomanano (GalG), ácido glucurônico-arabinoxilano (GArbX) e arabino-galactano (ArbG)29.
No entanto, apesar de todos esses esforços de pesquisa, apenas alguns estudos se concentraram na natureza do acúmulo de oligossacarídeos durante a hidrólise com alta carga de sólidos (HSL), incluindo a liberação de oligossacarídeos, alterações no comprimento da cadeia oligomérica durante a hidrólise, vários polímeros de baixo grau de polimerização (DP) e suas curvas de distribuição 30,31,32. Enquanto isso, embora a análise de glicanos tenha se mostrado uma ferramenta útil para uma análise abrangente da estrutura de glicanos, é difícil avaliar oligossacarídeos de baixo DP solúveis em água usando métodos com anticorpos. Oligossacarídeos de DP menor, com peso molecular inferior a 5-10 kDa, não se ligam às placas de ELISA 33,34 e são removidos por lavagem antes da adição de anticorpos.
Aqui, pela primeira vez, demonstramos um ensaio ELISA em placas revestidas com avidina usando anticorpos monoclonais, combinando um procedimento de biotinilação em uma única etapa para oligossacarídeos solúveis refratários com análise do glicoma. Nossa abordagem para análise do glicoma foi validada por MALDI-TOF-MS e GC-MS, com base em análises de ligações oligossacarídicas complementares, utilizando derivatização com trimetilsilil (TMS) de composições de açúcares hidrolisados. Essa abordagem inovadora pode ser desenvolvida como um método de alto rendimento no futuro e encontrar aplicação mais ampla em pesquisa biomédica.
Modificações pós-traducionais de enzimas e anticorpos, como a glicosilação,36 afetam sua atividade biológica. Por exemplo, alterações na glicosilação de proteínas séricas desempenham um papel importante na artrite inflamatória, e essas alterações são utilizadas como marcadores diagnósticos.37 Vários glicanos têm sido relatados na literatura como estando presentes em uma variedade de doenças, incluindo doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal e do fígado, infecções virais, cânceres de ovário, mama e próstata.38,39,40 Compreender a estrutura dos glicanos utilizando métodos ELISA baseados em anticorpos proporcionará maior segurança no diagnóstico de doenças sem a necessidade de métodos complexos de espectrometria de massas.
Nosso estudo anterior mostrou que oligossacarídeos resistentes permaneceram não hidrolisados ​​após o pré-tratamento e a hidrólise enzimática (Figura 1). Em nosso trabalho publicado anteriormente, desenvolvemos um método de extração em fase sólida com carvão ativado para isolar oligossacarídeos do hidrolisado de palha de milho pré-tratado com AFEX (ACSH)8. Após a extração e separação iniciais, os oligossacarídeos foram fracionados por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e coletados em ordem crescente de massa molecular. Os monômeros e oligômeros de açúcar liberados pelos diferentes pré-tratamentos foram analisados ​​por meio de análise de composição de açúcares. Ao comparar o teor de oligômeros de açúcar obtidos por diferentes métodos de pré-tratamento, a presença de oligossacarídeos resistentes é um problema comum na conversão de biomassa em monossacarídeos e pode levar a uma redução no rendimento de açúcares de pelo menos 10-15% e até 18%. Este método é utilizado para a produção em larga escala de frações de oligossacarídeos. O ACH resultante e suas frações subsequentes com diferentes pesos moleculares foram utilizados como material experimental para a caracterização de oligossacarídeos neste trabalho.
Após o pré-tratamento e a hidrólise enzimática, os oligossacarídeos persistentes permaneceram não hidrolisados. Aqui, (A) é um método de separação de oligossacarídeos no qual os oligossacarídeos são isolados do hidrolisado de palha de milho pré-tratado com AFEX (ACSH) usando um leito fixo de carvão ativado e terra diatomácea; (B) Método para separação de oligossacarídeos. Os oligossacarídeos foram posteriormente separados por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC); (C) Monômeros e oligômeros de sacarídeos liberados por vários pré-tratamentos (ácido diluído: DA, líquido iônico: IL e AFEX). Condições de hidrólise enzimática: alta carga de sólidos de 25% (p/p) (aproximadamente 8% de carga de glucano), 96 horas de hidrólise, 20 mg/g de carga de enzima comercial (proporção Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) e (D) Monômeros e oligômeros de açúcar de glicose, xilose e arabinose liberados do sabugo de milho pré-tratado com AFEX (ACS).
A análise de glicanos provou ser uma ferramenta útil para uma análise estrutural abrangente de glicanos em extratos isolados de resíduos de biomassa sólida. No entanto, os sacarídeos solúveis em água são sub-representados usando esse método tradicional⁴¹ porque os oligossacarídeos de baixo peso molecular são difíceis de imobilizar em placas de ELISA e são removidos antes da adição do anticorpo. Portanto, para a ligação e caracterização de anticorpos, um método de biotinilação em uma única etapa foi usado para revestir oligossacarídeos solúveis e não-compatíveis em placas de ELISA revestidas com avidina. Este método foi testado usando nosso ACSH produzido anteriormente e uma fração baseada em seu peso molecular (ou grau de polimerização, DP). A biotinilação em uma única etapa foi usada para aumentar a afinidade de ligação do oligossacarídeo adicionando biotina-LC-hidrazida à extremidade redutora do carboidrato (Fig. 2). Em solução, o grupo hemiacetal na extremidade redutora reage com o grupo hidrazida da biotina-LC-hidrazida para formar uma ligação hidrazona. Na presença do agente redutor NaCNBH3, a ligação hidrazona é reduzida a um produto final biotinilado estável. Com a modificação da extremidade redutora do açúcar, tornou-se possível a ligação de oligossacarídeos de baixo grau de polimerização (DP) a placas de ELISA, e em nosso estudo isso foi feito em placas revestidas com avidina usando mAbs direcionados a glicanos.
Triagem de anticorpos monoclonais baseada em ELISA para oligossacarídeos biotinilados. Aqui, (A) mostra a biotinilação combinada de oligossacarídeos e a subsequente triagem por ELISA com mAbs direcionados a glicanos em placas revestidas com NeutrAvidina e (B) mostra um procedimento de uma única etapa para biotinilação dos produtos da reação.
Placas revestidas com avidina e anticorpos conjugados a oligossacarídeos foram então adicionadas aos anticorpos primários e secundários e lavadas em um meio fotossensível e sensível ao tempo. Após a ligação completa dos anticorpos, adicionou-se o substrato TMB para incubação da placa. A reação foi interrompida com ácido sulfúrico. As placas incubadas foram analisadas em um leitor de ELISA para determinar a força de ligação de cada anticorpo e detectar a reticulação específica do anticorpo. Para detalhes e parâmetros do experimento, consulte a seção correspondente "Materiais e Métodos".
Demonstramos a utilidade deste método recentemente desenvolvido para aplicações específicas, caracterizando os oligossacarídeos solúveis presentes no ACSH, bem como em frações de oligossacarídeos brutos e purificados isolados de hidrolisados ​​lignocelulósicos. Como mostrado na Figura 3, os xilanos com epítopos substituídos mais comuns identificados no ACSH usando métodos de ensaio de glicoma bioacilado são geralmente arabinogalactanos urônicos (U) ou metilurônicos (MeU) e pécticos. A maioria deles também foi encontrada em nosso estudo anterior sobre a análise de glicanos de sólidos não hidrolisados ​​(UHS)43.
Detecção de epítopos de oligossacarídeos recalcitrantes usando um anticorpo monoclonal direcionado ao glicano da parede celular. A fração “neutra” é a fração ACN e a fração “ácida” é a fração FA. Tons de vermelho mais intensos no mapa de calor indicam maior conteúdo de epítopos, e tons de azul mais intensos indicam um fundo neutro. Os valores de cor na escala são baseados nos valores de DO brutos para formulações N=2. Os principais epítopos reconhecidos pelos anticorpos são mostrados à direita.
Essas estruturas não celulósicas não puderam ser clivadas pelas celulases e hemicelulases mais comuns presentes na mistura enzimática comercial testada, que inclui as enzimas comerciais mais utilizadas. Portanto, novas enzimas auxiliares são necessárias para a sua hidrólise. Sem as enzimas acessórias não celulósicas necessárias, essas ligações não celulósicas impedem a conversão completa em monossacarídeos, mesmo que seus polímeros de açúcar originais sejam extensivamente hidrolisados ​​em fragmentos menores e dissolvidos utilizando misturas enzimáticas comerciais.
Estudos adicionais sobre a distribuição do sinal e sua força de ligação mostraram que os epítopos de ligação eram menos frequentes nas frações de açúcares com alto grau de polimerização (DP) (A, B, C, DP até 20+) do que nas frações com baixo DP (D, E, F, DP em dímeros) (Fig. 1). Fragmentos ácidos são mais comuns em epítopos não celulósicos do que fragmentos neutros. Esses fenômenos são consistentes com o padrão observado em nosso estudo anterior, no qual grupos com alto DP e ácidos mostraram-se mais resistentes à hidrólise enzimática. Portanto, a presença de epítopos glicânicos não celulósicos e substituições de U e MeU podem contribuir significativamente para a estabilidade dos oligossacarídeos. Deve-se notar que a eficiência de ligação e detecção pode ser problemática para oligossacarídeos com baixo DP, especialmente se o epítopo for um oligossacarídeo dimérico ou trimérico. Isso pode ser testado utilizando oligossacarídeos comerciais de diferentes comprimentos, cada um contendo apenas um epítopo que se liga a um anticorpo monoclonal específico.
Assim, o uso de anticorpos específicos para estruturas revelou certos tipos de ligações recalcitrantes. Dependendo do tipo de anticorpo utilizado, do padrão de ligação apropriado e da intensidade do sinal produzido (mais e menos abundante), novas enzimas podem ser identificadas e adicionadas semiquantitativamente à mistura enzimática para uma glicoconversão mais completa. Tomando como exemplo a análise de oligossacarídeos ACSH, podemos criar um banco de dados de ligações glicânicas para cada material de biomassa. Deve-se notar que a afinidade variável dos anticorpos deve ser levada em consideração e, se essa afinidade for desconhecida, isso criará certas dificuldades na comparação dos sinais de diferentes anticorpos. Além disso, a comparação de ligações glicânicas pode funcionar melhor entre amostras para o mesmo anticorpo. Essas ligações resistentes podem então ser vinculadas ao banco de dados CAZyme, a partir do qual podemos identificar enzimas, selecionar enzimas candidatas e testar enzimas que quebram ligações, ou desenvolver sistemas microbianos para expressar essas enzimas para uso em biorrefinarias.
Para avaliar como os métodos imunológicos complementam métodos alternativos para a caracterização de oligossacarídeos de baixo peso molecular presentes em hidrolisados ​​lignocelulósicos, realizamos análises por MALDI (Fig. 4, S1-S8) e por GC-MS dos sacarídeos derivados de TMS no mesmo painel (Fig. 5) da parte de oligossacarídeos. O MALDI é utilizado para comparar se a distribuição de massa das moléculas de oligossacarídeos corresponde à estrutura pretendida. A Fig. 4 mostra a distribuição de massa dos componentes neutros ACN-A e ACN-B. A análise de ACN-A confirmou uma gama de açúcares pentoses com graus de polimerização (DP) variando de 4 a 8 (Fig. 4) até DP 22 (Fig. S1), cujos pesos correspondem a oligossacarídeos de MeU-xilano. A análise de ACN-B confirmou as séries de pentoses e glicoxilanos com DP de 8 a 15. Em material suplementar, como a Figura S3, os mapas de distribuição de massa da porção ácida FA-C mostram uma gama de açúcares pentoses substituídos por (Me)U com um grau de polimerização (DP) de 8 a 15, que são consistentes com os xilanos substituídos encontrados na triagem de mAbs baseada em ELISA. Os epítopos são consistentes.
Espectro MALDI-MS de oligossacarídeos solúveis não conformes presentes em ACS. Aqui, (A) frações de baixo peso molecular de ACN-A contendo oligossacarídeos de glucuroxilano substituídos por ácido urônico metilado (DP 4-8) e (B) oligossacarídeos de xilano e ácido urônico metilado substituídos por glucuroxilano (DP 8-15) de ACN-B.
Análise da composição do resíduo glicano de oligossacarídeos refratários. Aqui, (A) composição de sacarídeos TMS de várias frações de oligossacarídeos obtidas por análise GC-MS. (B) Estruturas de vários açúcares derivados de TMS presentes nos oligossacarídeos. ACN – fração de acetonitrila contendo oligossacarídeos neutros e FA – fração de ácido ferúlico contendo oligossacarídeos ácidos.
Outra conclusão interessante foi obtida a partir da análise LC-MS da fração de oligossacarídeos, conforme mostrado na Figura S9 (os métodos podem ser consultados no material suplementar eletrônico). Fragmentos de hexose e grupos -OAc foram observados repetidamente durante a ligação da fração ACN-B. Essa descoberta não apenas confirma a fragmentação observada na análise do glicoma e MALDI-TOF, mas também fornece novas informações sobre potenciais derivados de carboidratos na biomassa lignocelulósica pré-tratada.
Também analisamos a composição de açúcares da fração de oligossacarídeos utilizando a derivatização de açúcares com TMS. Por meio de GC-MS, determinamos a composição de açúcares neutros (não derivados) e ácidos (GluA e GalA) na fração de oligossacarídeos (Fig. 5). O ácido glucurônico é encontrado nos componentes ácidos C e D, enquanto o ácido galacturônico é encontrado nos componentes ácidos A e B, ambos componentes de alto grau de polimerização (DP) dos açúcares ácidos. Esses resultados não apenas confirmam nossos dados de ELISA e MALDI, mas também são consistentes com nossos estudos anteriores sobre o acúmulo de oligossacarídeos. Portanto, acreditamos que os métodos imunológicos modernos, utilizando biotinilação de oligossacarídeos e subsequente triagem por ELISA, são suficientes para detectar oligossacarídeos solúveis recalcitrantes em diversas amostras biológicas.
Como os métodos de triagem de mAbs baseados em ELISA foram validados por diversos métodos diferentes, quisemos explorar ainda mais o potencial deste novo método quantitativo. Dois oligossacarídeos comerciais, o oligossacarídeo xilohexassacarídeo (XHE) e a 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriose (A2XX), foram adquiridos e testados utilizando uma nova abordagem com mAbs direcionada ao glicano da parede celular. A Figura 6 mostra uma correlação linear entre o sinal de ligação biotinilado e o logaritmo da concentração do oligossacarídeo, sugerindo um possível modelo de adsorção de Langmuir. Entre os mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 e CCRC-M151 correlacionaram-se com XHE, e CCRC-M108, CCRC-M109 e LM11 correlacionaram-se com A2XX em uma faixa de 1 nm a 100 nanopartículas. Devido à disponibilidade limitada de anticorpos durante o experimento, um número limitado de experimentos foi realizado com cada concentração de oligossacarídeo. Cabe ressaltar que alguns anticorpos reagem de maneira muito diferente ao mesmo oligossacarídeo como substrato, presumivelmente porque se ligam a epítopos ligeiramente diferentes e podem apresentar afinidades de ligação bastante distintas. Os mecanismos e as implicações da identificação precisa de epítopos serão muito mais complexos quando a nova abordagem com anticorpos monoclonais for aplicada a amostras reais.
Dois oligossacarídeos comerciais foram usados ​​para determinar a faixa de detecção de vários mAbs direcionados a glicanos. Aqui, correlações lineares com o logaritmo da concentração do oligossacarídeo indicam padrões de adsorção de Langmuir para (A) XHE com mAb e (B) A2XX com mAb. Os epítopos correspondentes indicam as estruturas dos oligossacarídeos comerciais usados ​​como substratos no ensaio.
O uso de anticorpos monoclonais direcionados a glicanos (análise glicocômica ou triagem de mAbs baseada em ELISA) é uma ferramenta poderosa para a caracterização aprofundada da maioria dos principais glicanos da parede celular que compõem a biomassa vegetal. No entanto, a análise clássica de glicanos caracteriza apenas os glicanos maiores da parede celular, visto que a maioria dos oligossacarídeos não é imobilizada eficientemente em placas de ELISA. Neste estudo, palha de milho pré-tratada com AFEX foi hidrolisada enzimaticamente com alto teor de sólidos. A análise de açúcares foi utilizada para determinar a composição de carboidratos recalcitrantes da parede celular no hidrolisado. Contudo, a análise de oligossacarídeos menores em hidrolisados ​​por mAbs é subestimada, sendo necessárias ferramentas adicionais para imobilizar efetivamente os oligossacarídeos em placas de ELISA.
Neste trabalho, descrevemos um método inovador e eficiente de imobilização de oligossacarídeos para triagem de anticorpos monoclonais (mAbs), combinando a biotinilação de oligossacarídeos seguida de triagem por ELISA em placas revestidas com NeutrAvidin™. Os oligossacarídeos biotinilados imobilizados apresentaram afinidade suficiente pelo anticorpo para permitir a detecção rápida e eficiente de oligossacarídeos recalcitrantes. A análise da composição desses oligossacarídeos resistentes, baseada em espectrometria de massas, confirmou os resultados dessa nova abordagem de imunotriagem. Assim, estes estudos demonstram que a combinação da biotinilação de oligossacarídeos e da triagem por ELISA com anticorpos monoclonais direcionados a glicanos pode ser utilizada para detectar ligações cruzadas em oligossacarídeos e pode ser amplamente aplicada em outros estudos bioquímicos que caracterizam a estrutura de oligossacarídeos.
Este método de perfilamento de glicanos baseado em biotina é o primeiro relato capaz de investigar as ligações de carboidratos recalcitrantes de oligossacarídeos solúveis em biomassa vegetal. Isso ajuda a entender por que algumas partes da biomassa são tão resistentes à produção de biocombustíveis. Este método preenche uma lacuna importante nos métodos de análise do glicoma e amplia sua aplicação a uma gama mais ampla de substratos além dos oligossacarídeos vegetais. No futuro, poderemos utilizar robótica para biotinilação e aplicar o método que desenvolvemos para análise de alto rendimento de amostras por meio de ELISA.
A palha de milho (CM) cultivada a partir de sementes híbridas Pioneer 33A14 foi colhida em 2010 na Kramer Farms em Ray, Colorado. Com a permissão do proprietário, essa biomassa pode ser utilizada para pesquisa. As amostras foram armazenadas secas, com umidade inferior a 6%, em sacos plásticos com fecho hermético, à temperatura ambiente. As amostras foram armazenadas secas, com umidade inferior a 6%, em sacos plásticos com fecho hermético, à temperatura ambiente. A privacidade deve ser mantida com uma taxa de retorno < 6% no pacote com temperatura de temperatura máxima. As amostras foram armazenadas a seco, com umidade inferior a 6%, em sacos com fecho hermético e à temperatura ambiente.样品在室温下以干燥<6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥<6% Certifique-se de que o pacote esteja com temperatura máxima de entrada < 6%. As amostras são armazenadas em sacos com fecho hermético à temperatura ambiente com humidade inferior a 6%.O estudo seguiu as diretrizes locais e nacionais. A análise composicional foi realizada utilizando o protocolo do NREL. A composição apresentou 31,4% de glucano, 18,7% de xilano, 3,3% de arabinano, 1,2% de galactano, 2,2% de acetil, 14,3% de lignina, 1,7% de proteína e 13,4% de cinzas.
Cellic® CTec2 (138 mg de proteína/mL, lote VCNI 0001) é uma mistura complexa de celulase, β-glucosidase e Cellic® HTec2 (157 mg de proteína/mL, lote VHN00001) da Novozymes (Franklinton, NC, EUA). Multifect Pectinase® (72 mg de proteína/mL), uma mistura complexa de enzimas degradadoras de pectina, foi doada pela DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, EUA). As concentrações de proteína das enzimas foram determinadas estimando-se o teor proteico (e subtraindo-se a contribuição do nitrogênio não proteico) utilizando a análise de nitrogênio Kjeldahl (método AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, EUA). A terra diatomácea 545 foi adquirida da EMD Millipore (Billerica, MA). Carvão ativado (DARCO, grânulos de 100 mesh), Avicel (PH-101), xilana de faia e todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
O pré-tratamento AFEX foi realizado no GLBRC (Laboratório de Pesquisa de Conversão de Biomassa, MSU, Lansing, MI, EUA). O pré-tratamento foi conduzido a 140 °C por 15 minutos, com um tempo de residência de 46 minutos, em uma proporção de 1:1 de amônia anidra para biomassa, com uma carga de 60% (m/m), em um reator de bancada de aço inoxidável (Parr Instruments Company). O processo durou 30 minutos. O reator foi então aquecido a 140 °C e a amônia foi liberada rapidamente, permitindo que a biomassa retornasse rapidamente à temperatura ambiente. A composição da palha de milho pré-tratada com AFEX (ACS) foi semelhante à da palha de milho não tratada (UT-CS).
Uma biomassa de ACSH com alto teor de sólidos (25% p/p), contendo aproximadamente 8% de dextrana, foi preparada como matéria-prima para a produção em larga escala de oligossacarídeos. A hidrólise enzimática da biomassa de ACSH foi realizada utilizando uma mistura enzimática comercial composta por Cellic® Ctec2 (10 mg de proteína/g de glucano na biomassa pré-tratada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC, 5 mg de proteína/g de glucano) e pectinase Multifect (Genencor Inc., EUA). A hidrólise enzimática foi conduzida em um biorreator de 5 litros com volume útil de 3 litros, pH 4,8, 50 °C e 250 rpm. Após 96 horas de hidrólise, o hidrolisado foi coletado por centrifugação a 6000 rpm por 30 minutos e, em seguida, a 14000 rpm por 30 minutos para remoção dos sólidos não hidrolisados. O hidrolisado foi então submetido a filtração estéril através de um filtro de 0,22 mm. O hidrolisado filtrado foi armazenado em frascos estéreis a 4 °C e posteriormente fracionado em carvão ativado.
Análise da composição de amostras de biomassa baseadas em extrato de acordo com os procedimentos de análise de laboratório do NREL: preparação de amostras para análise de composição (NREL/TP-510-42620) e determinação de carboidratos estruturais e lignina na biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
A análise de oligossacarídeos do fluxo de hidrolisado foi realizada em escala de 2 ml utilizando um método de hidrólise ácida em autoclave. A amostra de hidrolisado foi misturada com 69,7 µl de ácido sulfúrico a 72% em um tubo de cultura de 10 ml com tampa de rosca e incubada por 1 h em temperatura ambiente a 121 °C. Em seguida, a mistura foi resfriada em gelo e filtrada para um frasco de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A concentração de oligossacarídeos foi determinada subtraindo-se a concentração de monossacarídeos na amostra não hidrolisada da concentração total de açúcares na amostra hidrolisada em ácido.
As concentrações de glicose, xilose e arabinose na biomassa hidrolisada em meio ácido foram analisadas utilizando um sistema HPLC Shimadzu equipado com amostrador automático, aquecedor de coluna, bomba isocrática e detector de índice de refração em uma coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H. A coluna foi mantida a 50°C e eluída com 0,6 ml/min de H2SO4 5 mM em água.
O sobrenadante do hidrolisado foi diluído e analisado quanto ao teor de monômeros e oligossacarídeos. Os açúcares monoméricos obtidos após a hidrólise enzimática foram analisados ​​por HPLC equipado com uma coluna Aminex HPX-87P da Bio-Rad (Hercules, CA) e uma coluna de guarda de cinzas. A temperatura da coluna foi mantida a 80 °C, e a água foi utilizada como fase móvel com uma vazão de 0,6 mL/min. Os oligossacarídeos foram determinados por hidrólise em ácido diluído a 121 °C, de acordo com os métodos descritos nas referências 41, 48 e 49.
A análise de sacarídeos foi realizada em resíduos de biomassa bruta, pré-tratada com AFEX e em todos os resíduos de biomassa não hidrolisados ​​(incluindo a produção de extratos seriados de parede celular e sua triagem de mAbs) utilizando procedimentos descritos anteriormente 27, 43, 50, 51. Para a análise do glicoma, resíduos insolúveis em álcool do material da parede celular vegetal foram preparados a partir de resíduos de biomassa e submetidos à extração seriada com reagentes progressivamente mais agressivos, como oxalato de amônio (50 mM), carbonato de sódio (50 mM e 0,5% p/v), CON. (1M e 4M, ambos com 1% p/v de borohidreto de sódio) e clorito ácido, conforme descrito anteriormente 52,53. Os extratos foram então submetidos a ELISA contra um painel complexo de mAbs50 direcionados ao glicano da parede celular, e as reações de ligação dos mAbs foram apresentadas como um mapa de calor. Os mAbs direcionados ao glicano da parede celular vegetal foram adquiridos de estoques de laboratório (séries CCRC, JIM e MAC).
Biotinilação de oligossacarídeos em uma única etapa. A conjugação de carboidratos com biotina-LC-hidrazida foi realizada utilizando o seguinte procedimento. Biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) foi dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO, 70 μl) sob agitação vigorosa e aquecimento a 65 °C por 1 min. Adicionou-se ácido acético glacial (30 µl) e a mistura foi vertida sobre cianoboroidreto de sódio (6,4 mg/100 µmol) e completamente dissolvida após aquecimento a 65 °C por cerca de 1 minuto. Em seguida, adicionou-se de 5 a 8 μl da mistura reacional ao oligossacarídeo seco (1-100 nmol) para obter um excesso molar de 10 vezes ou mais do marcador em relação à extremidade redutora. A reação foi conduzida a 65 °C por 2 h, após o que as amostras foram imediatamente purificadas. Não foi utilizado cianoboroidreto de sódio nos experimentos de marcação sem redução, e as amostras foram reagidas a 65°C por 2,5 horas.
Revestimento e lavagem de amostras de oligossacarídeos biotinilados para ELISA. 25 μl de amostras biotiniladas (100 μl de cada amostra concentrada diluída em 5 ml de solução tampão Tris 0,1 M (TBS)) foram adicionados a cada poço da placa revestida com avidina. Os poços de controle foram revestidos com 50 μl de biotina a uma concentração de 10 μg/ml em TBS 0,1 M. Água deionizada foi usada como revestimento para as medições em branco. O comprimido foi incubado por 2 horas à temperatura ambiente no escuro. A placa foi lavada 3 vezes com leite desnatado a 0,1% em TBS 0,1 M usando o programa nº 11 para Grenier flat 3A.
Adição e lavagem dos anticorpos primários. Adicione 40 µl de anticorpo primário em cada poço. Incube a microplaca por 1 hora à temperatura ambiente, no escuro. Em seguida, as placas foram lavadas 3 vezes com leite a 0,1% em TBS 0,1M, utilizando o programa de lavagem nº 11 para Grenier Flat 3A.
Adicione o anticorpo secundário e lave. Adicione 50 µl de anticorpo secundário de rato/camundongo (diluído 1:5000 em leite a 0,1% em TBS 0,1 M) a cada poço. Incube a microplaca por 1 hora à temperatura ambiente no escuro. As microplacas foram então lavadas 5 vezes com leite a 0,1% em TBS 0,1 M usando o programa de lavagem de placas Grenier Flat 5A nº 12.
Adição do substrato. Adicione 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) ao substrato base (adicionando 2 gotas de tampão, 3 gotas de TMB e 2 gotas de peróxido de hidrogênio a 15 ml de água deionizada). Prepare o substrato de TMB e agite em vórtex antes de usar. Incube a microplaca à temperatura ambiente por 30 minutos, no escuro.
Complete a etapa e leia o comprimido. Adicione 50 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada poço e registre a absorbância de 450 a 655 nm usando um leitor de ELISA.
Prepare soluções de 1 mg/mL dos seguintes analitos em água deionizada: arabinose, ramnose, fucose, xilose, ácido galacturônico (GalA), ácido glucurônico (GlcA), manose, glicose, galactose, lactose, N-acetilmanosamina (manNAc), N-acetilglucosamina (glcNAc), N-acetilgalactosamina (galNAc) e inositol (padrão interno). Dois padrões foram preparados adicionando-se as soluções de açúcar a 1 mg/mL mostradas na Tabela 1. As amostras foram congeladas e liofilizadas a -80 °C até a completa remoção da água (geralmente entre 12 e 18 horas).
Adicione 100–500 µg da amostra a tubos com tampa de rosca em uma balança analítica. Registre a quantidade adicionada. É recomendável dissolver a amostra em um solvente de concentração específica e adicioná-la ao tubo como uma alíquota líquida. Utilize 20 µl de inositol a 1 mg/ml como padrão interno para cada tubo de amostra. A quantidade de padrão interno adicionada à amostra deve ser a mesma que a quantidade de padrão interno adicionada ao tubo padrão.
Adicione 8 ml de metanol anidro a um frasco com tampa de rosca. Em seguida, adicione 4 ml de solução de HCl metanólico 3 N, tampe e agite. Este processo não utiliza água.
Adicione 500 µl de solução de HCl 1 M em metanol às amostras de oligossacarídeos e aos tubos padrão de TMS. As amostras foram incubadas durante a noite (168 horas) a 80 °C em um bloco térmico. Seque o produto da metanólise à temperatura ambiente usando um sistema de secagem. Adicione 200 µl de MeOH e seque novamente. Repita este processo duas vezes. Adicione 200 µl de metanol, 100 µl de piridina e 100 µl de anidrido acético à amostra e misture bem. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos e secas. Adicione 200 µl de metanol e seque novamente.
Adicione 200 µl de Tri-Sil e aqueça o tubo tampado por 20 minutos a 80 °C, depois resfrie à temperatura ambiente. Use um sistema de secagem para secar ainda mais a amostra até um volume de aproximadamente 50 µl. É importante observar que não deixamos as amostras secarem completamente.
Adicione 2 ml de hexano e misture bem por agitação em vórtex. Preencha as pontas das pipetas Pasteur (5-8 mm) com um pedaço de lã de vidro, inserindo a lã de vidro na extremidade de uma pipeta de 5-3/4 polegadas de diâmetro. As amostras foram centrifugadas a 3000 g por 2 minutos. Quaisquer resíduos insolúveis foram precipitados. Seque a amostra até um volume de 100-150 µl. Um volume de aproximadamente 1 µl foi injetado no GC-MS a uma temperatura inicial de 80 °C e um tempo inicial de 2,0 minutos (Tabela 2).