Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).In die tussentyd, om volgehoue ​​ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Nuwe immunologiese en massaspektrometriese metodes vir komplekse ontleding van aanhoudende oligosakkariede in mieliestoof wat voorbehandel is met AFEX.Lignosellulose biomassa is 'n volhoubare alternatief vir fossielbrandstowwe en word wyd gebruik om biotegnologie te ontwikkel vir die produksie van produkte soos voedsel, voer, brandstof en chemikalieë.Die sleutel tot hierdie tegnologieë is die ontwikkeling van koste-mededingende prosesse vir die omskakeling van komplekse koolhidrate wat in plantselwande voorkom in eenvoudige suikers soos glukose, xilose en arabinose.Omdat lignosellulose biomassa baie hardnekkig is, moet dit in kombinasie aan termochemiese behandelings (bv. ammoniakveselafskilfering (AFEX), verdunde sure (DA), ioniese vloeistowwe (IL)) en biologiese behandelings (bv. ensiematiese hidrolise en mikrobiese fermentasie) onderwerp word om die gewenste produk te verkry..Wanneer kommersiële swam-ensieme egter in die hidroliseproses gebruik word, is slegs 75-85% van die oplosbare suikers wat gevorm word monosakkariede, en die oorblywende 15-25% is oplosbare, onhandelbare oligosakkariede, wat nie altyd vir mikroörganismes beskikbaar is nie.Voorheen het ons oplosbare hardnekkige oligosakkariede suksesvol geïsoleer en gesuiwer deur gebruik te maak van 'n kombinasie van koolstof- en diatomeeënaarde-skeiding en grootte-uitsluitingschromatografie, en ook hul ensiem-inhiberende eienskappe ondersoek.Ons het gevind dat oligosakkariede wat 'n hoër graad van polimerisasie (DP) gemethyleerde uronsuursubstitusies bevat moeiliker is om te verwerk met kommersiële ensiemmengsels as lae DP en neutrale oligosakkariede.Hier rapporteer ons die gebruik van verskeie addisionele metodes, insluitend glikaanprofilering deur gebruik te maak van monoklonale teenliggaampies (mAbs) spesifiek vir plantbiomassa-glikane om glikaanbindings in plantselwande en ensiematiese hidrolisate, matriks-ondersteunde laser-desorpsie-ionisasie, tyd-van-vlug massaspektrometrie te karakteriseer..MALDI-TOF-MS) gebruik struktuur-insiggewende diagnostiese pieke verkry deur spektroskopie na sekondêre verval van negatiewe ione, gaschromatografie en massaspektrometrie (GC-MS) om oligosakkariedbindings met en sonder derivatisering te karakteriseer.As gevolg van die klein grootte van oligosakkariede (DP 4-20), is hierdie molekules moeilik om te gebruik vir mAb-binding en karakterisering.Om hierdie probleem te oorkom, het ons 'n nuwe biotien konjugasie-gebaseerde oligosakkaried immobilisasie metode toegepas wat die meerderheid lae DP oplosbare oligosakkariede suksesvol op die mikroplaatoppervlak gemerk het, wat dan gebruik is in 'n hoë deurset mAb stelsel vir spesifieke ligasie analise.Hierdie nuwe metode sal in die toekoms die ontwikkeling van meer gevorderde hoë deurvloei glikoom toetse fasiliteer wat gebruik kan word om oligosakkariede wat in biomerkers teenwoordig is te isoleer en te karakteriseer vir diagnostiese doeleindes.
Lignosellulose biomassa, saamgestel uit landbou-, bosbou-, gras- en houtagtige materiale, is 'n potensiële grondstof vir die produksie van bio-gebaseerde produkte, insluitend voedsel, voer, brandstof en chemiese voorlopers om hoër waarde produkte te produseer1.Koolhidrate (soos sellulose en hemisellulose) wat in plantselwande voorkom, word gedepolimeriseer tot monosakkariede deur chemiese verwerking en biotransformasie (soos ensiematiese hidrolise en mikrobiese fermentasie).Algemene voorbehandelings sluit in ammoniakveseluitsetting (AFEX), verdunde suur (DA), ioniese vloeistof (IL) en stoomontploffing (SE), wat 'n kombinasie van chemikalieë en hitte gebruik om lignoselluloseproduksie te verminder deur plantselwande oop te maak3,4.hardnekkigheid van materie, 5. Ensiematiese hidrolise word uitgevoer teen 'n hoë vastestoflading deur gebruik te maak van kommersiële aktiewe koolhidraatbevattende ensieme (CAZymes) en mikrobiese fermentasie met behulp van transgeniese giste of bakterieë om bio-gebaseerde brandstof en chemikalieë te produseer 6 .
CAZymes in kommersiële ensieme is saamgestel uit 'n komplekse mengsel van ensieme wat komplekse koolhidraat-suikerbindings sinergisties klief om monosakkariede te vorm2,7.Soos ons vroeër berig het, maak die komplekse netwerk van aromatiese polimere van lignien met koolhidrate hulle hoogs onhandelbaar, wat lei tot onvolledige suikeromskakeling, wat 15-25% van seks-oligosakkariede ophoop wat nie tydens ensiematiese hidrolise van die voorbehandelde biomassa geproduseer word nie.Dit is 'n algemene probleem met verskeie biomassa-voorbehandelingsmetodes.Sommige redes vir hierdie bottelnek sluit in ensieminhibisie tydens hidrolise, of die afwesigheid of lae vlakke van noodsaaklike noodsaaklike ensieme wat nodig is om suikerbindings in plantbiomassa te breek.Om die samestelling en strukturele eienskappe van suikers te verstaan, soos die suikerbindings in oligosakkariede, sal ons help om suikeromsetting tydens hidrolise te verbeter, wat biotegnologiese prosesse koste-mededingend maak met petroleum-afgeleide produkte.
Die bepaling van die struktuur van koolhidrate is uitdagend en vereis 'n kombinasie van metodes soos vloeistofchromatografie (LC)11,12, kernmagnetiese resonansiespektroskopie (KMR)13, kapillêre elektroforese (CE)14,15,16 en massaspektrometrie (MS)17.,agtien.MS metodes soos tyd-van-vlug massaspektrometrie met laser desorpsie en ionisasie met behulp van 'n matriks (MALDI-TOF-MS) is 'n veelsydige metode om koolhidraatstrukture te identifiseer.Onlangs is Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS van natriumioonaddukte die meeste gebruik om vingerafdrukke te identifiseer wat ooreenstem met oligosakkariedaanhegtingsposisies, anomere konfigurasies, rye en vertakkingsposisies 20, 21 .
Glikaananalise is 'n uitstekende hulpmiddel vir die in-diepte identifikasie van koolhidraatbindings22.Hierdie metode gebruik monoklonale teenliggaampies (mAbs) wat gerig is op plantselwandglikan as probes om komplekse koolhidraatbindings te verstaan.Meer as 250 mAbs is wêreldwyd beskikbaar, ontwerp teen verskeie lineêre en vertakte oligosakkariede wat verskeie sakkariede gebruik24.Verskeie mAbs is wyd gebruik om die struktuur, samestelling en modifikasies van die plantselwand te karakteriseer, aangesien daar beduidende verskille is na gelang van plantseltipe, orgaan, ouderdom, ontwikkelingstadium en groeiomgewing25,26.Meer onlangs is hierdie metode gebruik om vesikelpopulasies in plant- en dierstelsels en hul onderskeie rolle in glikaanvervoer soos bepaal deur subsellulêre merkers, ontwikkelingstadia of omgewingsstimuli te verstaan, en om ensiematiese aktiwiteit te bepaal.Sommige van die verskillende strukture van glikane en xylane wat geïdentifiseer is, sluit in pektien (P), xilaan (X), mannan (M), xiloglukane (XylG), gemengde bindingsglukane (MLG), arabinoksielaan (ArbX), galaktomannan (GalG), glukuronzuur-arabinoksielaan (GArbinoX) en 2Galaktan (GarbinoX) 9
Ten spyte van al hierdie navorsingspogings het slegs 'n paar studies gefokus op die aard van oligosakkariedophoping tydens hoë vastestoflading (HSL) hidrolise, insluitend oligosakkariedvrystelling, oligomere kettinglengteveranderinge tydens hidrolise, verskeie lae DP polimere en hul krommes.verdelings 30,31,32.Intussen, alhoewel glikaananalise bewys het as 'n nuttige hulpmiddel vir 'n omvattende ontleding van glikaanstruktuur, is dit moeilik om wateroplosbare lae DP oligosakkariede te evalueer deur teenliggaammetodes te gebruik.Kleiner DP-oligosakkariede met 'n molekulêre gewig van minder as 5-10 kDa bind nie aan ELISA-plate 33, 34 nie en word weggespoel voor teenliggaamtoevoeging.
Hier demonstreer ons vir die eerste keer 'n ELISA-toets op avidien-bedekte plate deur gebruik te maak van monoklonale teenliggaampies, wat 'n eenstap-biotinyleringsprosedure vir oplosbare vuurvaste oligosakkariede kombineer met glikoomanalise.Ons benadering tot glikoomanalise is bekragtig deur MALDI-TOF-MS en GC-MS gebaseerde analise van komplementêre oligosakkariedbindings deur gebruik te maak van trimetielsiliel (TMS) derivatisering van gehidroliseerde suiker samestellings.Hierdie innoverende benadering kan in die toekoms as 'n hoë-deursetmetode ontwikkel word en wyer toepassing vind in biomediese navorsing35.
Post-translasie-modifikasies van ensieme en teenliggaampies, soos glikosilering,36 beïnvloed hul biologiese aktiwiteit.Byvoorbeeld, veranderinge in glikosilering van serumproteïene speel 'n belangrike rol in inflammatoriese artritis, en veranderinge in glikosilering word as diagnostiese merkers gebruik37.Daar is in die literatuur berig dat verskeie glikane geredelik in 'n verskeidenheid siektes voorkom, insluitend chroniese inflammatoriese siektes van die spysverteringskanaal en lewer, virale infeksies, eierstok-, bors- en prostaatkanker38,39,40.Om die struktuur van glikane te verstaan ​​deur teenliggaam-gebaseerde glikaan ELISA-metodes te gebruik, sal addisionele vertroue in siektediagnose verskaf sonder die gebruik van komplekse MS-metodes.
Ons vorige studie het getoon dat hardnekkige oligosakkariede ongehidroliseer gebly het na voorbehandeling en ensiematiese hidrolise (Figuur 1).In ons voorheen gepubliseerde werk het ons 'n vaste-fase-ekstraksiemetode van geaktiveerde houtskool ontwikkel om oligosakkariede te isoleer van AFEX-voorbehandelde mieliestoofhidrolisaat (ACSH)8.Na aanvanklike ekstraksie en skeiding is die oligosakkariede verder gefraksioneer deur grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en versamel in volgorde van molekulêre gewig.Suikermonomere en oligomere wat vrygestel is van verskeie voorbehandelings is deur suikersamestellingsanalise ontleed.Wanneer die inhoud van suiker-oligomere wat deur verskeie voorbehandelingsmetodes verkry word vergelyk word, is die teenwoordigheid van hardnekkige oligosakkariede 'n algemene probleem in die omskakeling van biomassa na monosakkariede en kan dit lei tot 'n vermindering in suikeropbrengs van minstens 10-15% en selfs tot 18%.VSA.Hierdie metode word gebruik vir verdere grootskaalse produksie van oligosakkariedfraksies.Die gevolglike ACH en sy daaropvolgende fraksies met verskillende molekulêre gewigte is as eksperimentele materiaal gebruik vir die karakterisering van oligosakkariede in hierdie werk.
Na voorbehandeling en ensiematiese hidrolise het aanhoudende oligosakkariede ongehidroliseer gebly.Hier (A) is 'n oligosakkaried-skeidingsmetode waarin oligosakkariede geïsoleer word uit AFEX-voorbehandelde mieliestoofhidrolisaat (ACSH) met behulp van 'n gepakte bed van geaktiveerde koolstof en diatomeeënaarde;(B) Metode vir skeiding van oligosakkariede.Die oligosakkariede is verder geskei deur grootte-uitsluitingschromatografie (SEC);(C) Sakkariedmonomere en oligomere vrygestel van verskeie voorbehandelings (verdunde suur: DA, ioniese vloeistof: IL en AFEX).Ensiematiese hidrolise toestande: hoë vastestoflading van 25% (w/w) (ongeveer 8% glukaanlading), 96 uur hidrolise, 20 mg/g kommersiële ensiemlading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 verhouding) en (D) Suikermonomere en oligomere van glukose, preosexilose vrygestel van AFS stover-mielies en EXS.
Glikaananalise het bewys dat dit 'n nuttige hulpmiddel is vir 'n omvattende strukturele ontleding van glikane in ekstrakte wat uit vaste biomassa-reste geïsoleer is.Wateroplosbare sakkariede word egter onderverteenwoordig deur gebruik te maak van hierdie tradisionele metode41 omdat lae molekulêre gewig oligosakkariede moeilik op ELISA-plate geïmmobiliseer kan word en voor teenliggaamtoevoeging uitgewas word.Daarom, vir teenliggaampiesbinding en karakterisering, is 'n eenstap biotinyleringsmetode gebruik om oplosbare, nie-voldoenende oligosakkariede op avidien-bedekte ELISA-plate te bedek.Hierdie metode is getoets met behulp van ons voorheen vervaardigde ACSH en 'n fraksie gebaseer op sy molekulêre gewig (of graad van polimerisasie, DP).Een-stap biotinilering is gebruik om oligosakkaried bindingsaffiniteit te verhoog deur biotien-LC-hidrasied by die reducerende punt van die koolhidraat te voeg (Fig. 2).In oplossing reageer die hemiacetaalgroep aan die reduserende kant met die hidrasiedgroep van biotien-LC-hidrasied om 'n hidrasoonbinding te vorm.In die teenwoordigheid van die reduseermiddel NaCNBH3 word die hidrasoonbinding tot 'n stabiele gebiotinileerde eindproduk gereduseer.Met die wysiging van die suikerverminderende einde het binding van lae DP oligosakkariede aan ELISA plate moontlik geword, en in ons studie is dit op avidien-bedekte plate gedoen deur gebruik te maak van glikaan-geteikende mAbs.
Sifting van monoklonale teenliggaampies gebaseer op ELISA vir gebiotinileerde oligosakkariede.Hier (A) gekombineerde biotinilering van oligosakkariede en daaropvolgende ELISA-sifting met glikaan-geteikende mAbs op NeutrAvidin-bedekte plate en (B) toon 'n eenstap-prosedure vir biotinilering van reaksieprodukte.
Avidin-bedekte plate met oligosakkaried-gekonjugeerde teenliggaampies is dan by primêre en sekondêre teenliggaampies gevoeg en in 'n lig- en tydsensitiewe medium gewas.Nadat teenliggaambinding voltooi is, voeg TMB-substraat by om die plaat te inkubeer.Die reaksie is uiteindelik met swaelsuur gestop.Die geïnkubeerde plate is ontleed met behulp van 'n ELISA-leser om die bindingssterkte van elke teenliggaam te bepaal om teenliggaam-spesifieke kruisbinding op te spoor.Vir besonderhede en parameters van die eksperiment, sien die ooreenstemmende afdeling "Materiale en Metodes".
Ons demonstreer die bruikbaarheid van hierdie nuut ontwikkelde metode vir spesifieke toepassings deur die oplosbare oligosakkariede wat in ACSH teenwoordig is sowel as in ru- en gesuiwerde oligosakkariedfraksies wat uit lignosellulosiese hidrolisate geïsoleer is, te karakteriseer.Soos getoon in Figuur 3, is die mees algemene epitoop-gesubstitueerde xylane wat in ACSH geïdentifiseer word deur gebruik te maak van bio-geasileerde glikomtoetsmetodes gewoonlik uroniese (U) of metieluroniese (MeU) en pektiese arabinogalaktane.Die meeste van hulle is ook gevind in ons vorige studie oor die ontleding van glikane van nie-gehidroliseerde vaste stowwe (UHS)43.
Opsporing van weerbarstige oligosakkaried-epitope met behulp van 'n monoklonale teenliggaam gerig op die selwandglikaan.Die "neutrale" breuk is die ACN breuk en die "suur" breuk is die FA breuk.Helder rooi op die hittekaart dui hoër epitoop-inhoud aan, en helderder blou dui op 'n leë agtergrond.Kleurwaardes op die skaal is gebaseer op rou OD-waardes vir formulerings N=2.Die hoofepitope wat deur die teenliggaampies herken word, word aan die regterkant getoon.
Hierdie nie-sellulose strukture kon nie deur die mees algemene sellulases en hemisellulases in die getoetste kommersiële ensiemmengsel, wat die mees gebruikte kommersiële ensieme insluit, geklief word nie.Daarom word nuwe hulpensieme benodig vir hul hidrolise.Sonder die nodige nie-sellulose bykomstige ensieme, verhoed hierdie nie-sellulose bindings volledige omskakeling na monosakkariede, selfs al word hul moedersuikerpolimere omvattend gehidroliseer in korter fragmente en opgelos met behulp van kommersiële ensiemmengsels.
Verdere studie van seinverspreiding en sy bindingssterkte het getoon dat bindingsepitope laer was in hoë DP suikerfraksies (A, B, C, DP tot 20+) as in lae DP fraksies (D, E, F, DP) in dimere) (Fig. 1).Suurfragmente is meer algemeen in nie-sellulose-epitope as neutrale fragmente.Hierdie verskynsels stem ooreen met die patroon wat in ons vorige studie waargeneem is, waar hoë DP en suur dele meer bestand was teen ensiematiese hidrolise.Daarom kan die teenwoordigheid van nie-sellulose glikaan epitope en U en MeU substitusies grootliks bydra tot die stabiliteit van die oligosakkariede.Daar moet kennis geneem word dat binding en opsporing doeltreffendheid problematies kan wees vir lae DP oligosakkariede, veral as die epitoop 'n dimeriese of trimeriese oligosakkaried is.Dit kan getoets word deur kommersiële oligosakkariede van verskillende lengtes te gebruik, wat elkeen slegs een epitoop bevat wat aan 'n spesifieke mAb bind.
Die gebruik van struktuurspesifieke teenliggaampies het dus sekere tipes weerbarstige bindings aan die lig gebring.Afhangende van die tipe teenliggaam wat gebruik word, die toepaslike ligasiepatroon en die sterkte van die sein wat dit produseer (die meeste en minste volop), kan nuwe ensieme geïdentifiseer en semi-kwantitatief by die ensiemmengsel gevoeg word vir meer volledige glikomsetting.Deur die ontleding van ACSH-oligosakkariede as 'n voorbeeld te neem, kan ons 'n databasis van glikaanbindings vir elke biomassamateriaal skep.Daar moet hier kennis geneem word dat die verskillende affiniteit van teenliggaampies in ag geneem moet word, en indien hul affiniteit onbekend is, sal dit sekere probleme skep wanneer die seine van verskillende teenliggaampies vergelyk word.Daarbenewens kan vergelyking van glikaanbindings die beste werk tussen monsters vir dieselfde teenliggaam.Hierdie hardnekkige bindings kan dan aan die CAZyme-databasis gekoppel word, waaruit ons ensieme kan identifiseer, kandidaat-ensieme kan kies en vir bindingsverbrekende ensieme kan toets, of mikrobiese stelsels kan ontwikkel om hierdie ensieme uit te druk vir gebruik in bioraffinaderye44.
Om te evalueer hoe immunologiese metodes alternatiewe metodes komplementeer vir die karakterisering van lae molekulêre gewig oligosakkariede teenwoordig in lignosellulosiese hidrolisate, het ons MALDI (Fig. 4, S1-S8) en ontleding van TMS-afgeleide sakkariede uitgevoer gebaseer op GC-MS op dieselfde paneel (Fig. 5) oligosakkaried deel.MALDI word gebruik om te vergelyk of die massaverspreiding van oligosakkariedmolekules ooreenstem met die beoogde struktuur.Op fig.4 toon die MC van die neutrale komponente ACN-A en ACN-B.ACN-A-analise het 'n reeks pentosesuikers bevestig wat wissel van DP 4-8 (Fig. 4) tot DP 22 (Fig. S1), wie se gewigte ooreenstem met MeU-xilan-oligosakkariede.ACN-B-analise het die pentose- en glukoksilaanreeks met DP 8-15 bevestig.In aanvullende materiaal soos Figuur S3, toon FA-C suurdeelmassaverspreidingskaarte 'n reeks (Me)U-gesubstitueerde pentosesuikers met 'n DP van 8-15 wat ooreenstem met die gesubstitueerde xylane wat in ELISA-gebaseerde mAb-sifting gevind word.Die epitope is konsekwent.
MALDI-MS spektrum van oplosbare nie-voldoenende oligosakkariede teenwoordig in ACS.Hier, (A) ACN-A lae gewig reeks fraksies wat gemetileerde uronsuur (DP 4-8) gesubstitueerde glukuroksielaan oligosakkariede en (B) ACN-B xilaan en gemetileerde uronsuur oligosakkariede bevat wat met glukuroksielaan (DP 8-15) vervang is.
Ontleding van die samestelling van die glikaanresidu van vuurvaste oligosakkariede.Hier (A) TMS sakkaried samestelling van verskeie oligosakkaried fraksies verkry met behulp van GC-MS analise.(B) Strukture van verskeie TMS-afgeleide suikers teenwoordig in oligosakkariede.ACN – asetonitrilfraksie wat neutrale oligosakkariede bevat en FA – feruliensuurfraksie wat suur oligosakkariede bevat.
Nog 'n interessante gevolgtrekking is gemaak uit die LC-MS-analise van die oligosakkariedfraksie, soos getoon in Figuur S9 (metodes kan in die elektroniese aanvullende materiaal gesien word).Fragmente van heksose en -OAc groepe is herhaaldelik waargeneem tydens afbinding van die ACN-B fraksie.Hierdie bevinding bevestig nie net die fragmentasie wat in glykoom- en MALDI-TOF-analise waargeneem word nie, maar verskaf ook nuwe inligting oor potensiële koolhidraatderivate in voorafbehandelde lignosellulose biomassa.
Ons het ook die suikersamestelling van die oligosakkariedfraksie ontleed deur TMS suikerderivatisering te gebruik.Met GC-MS het ons die samestelling van neurale (nie-afgeleide) en suur suikers (GluA en GalA) in die oligosakkariedfraksie bepaal (Fig. 5).Glukuronsuur word in suur komponente C en D aangetref, terwyl galakturonzuur in suur komponente A en B aangetref word, wat albei hoë DP-komponente van suur suikers is.Hierdie resultate bevestig nie net ons ELISA- en MALDI-data nie, maar stem ook ooreen met ons vorige studies van oligosakkariedophoping.Daarom glo ons dat moderne immunologiese metodes wat biotinilering van oligosakkariede gebruik en daaropvolgende ELISA-sifting voldoende is om oplosbare weerbarstige oligosakkariede in verskeie biologiese monsters op te spoor.
Aangesien ELISA-gebaseerde mAb-siftingsmetodes deur verskeie verskillende metodes bekragtig is, wou ons die potensiaal van hierdie nuwe kwantitatiewe metode verder ondersoek.Twee kommersiële oligosakkariede, xilohexasaccharide oligosaccharide (XHE) en 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), is aangekoop en getoets deur gebruik te maak van 'n nuwe mAb-benadering wat die selwandglikaan teiken.Figuur 6 toon 'n lineêre korrelasie tussen die gebiotinileerde bindingsein en die log-konsentrasie van oligosakkariedkonsentrasie, wat 'n moontlike Langmuir-adsorpsiemodel voorstel.Onder die mAbs het CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 en CCRC-M151 met XHE gekorreleer, en CCRC-M108, CCRC-M109 en LM11 het oor 'n reeks van 100n nam met A2XX gekorreleer.As gevolg van die beperkte beskikbaarheid van teenliggaampies tydens die eksperiment, is beperkte eksperimente uitgevoer met elke oligosakkariedkonsentrasie.Daar moet hier kennis geneem word dat sommige teenliggaampies baie verskillend reageer op dieselfde oligosakkaried as 'n substraat, vermoedelik omdat hulle aan effens verskillende epitope bind en baie verskillende bindingsaffiniteite kan hê.Die meganismes en implikasies van akkurate epitoop-identifikasie sal baie meer kompleks wees wanneer die nuwe mAb-benadering op werklike monsters toegepas word.
Twee kommersiële oligosakkariede is gebruik om die opsporingsreeks van verskeie glikaangerigte mAbs te bepaal.Hier dui lineêre korrelasies met log konsentrasie van oligosakkariedkonsentrasie Langmuir adsorpsiepatrone aan vir (A) XHE met mAb en (B) A2XX met mAb.Die ooreenstemmende epitope dui die strukture aan van die kommersiële oligosakkariede wat as substrate in die toets gebruik word.
Die gebruik van glikaan-geteikende monoklonale teenliggaampies (glikokomiese analise of ELISA-gebaseerde mAb-sifting) is 'n kragtige hulpmiddel vir in-diepte karakterisering van die meeste van die belangrikste selwandglikane waaruit plantbiomassa bestaan.Klassieke glikaananalise kenmerk egter net groter selwandglikane, aangesien die meeste oligosakkariede nie doeltreffend op ELISA-plate geïmmobiliseer word nie.In hierdie studie is AFEX-voorbehandelde mieliestoof ensiematies gehidroliseer teen 'n hoë vastestofinhoud.Suikeranalise is gebruik om die samestelling van weerbarstige selwandkoolhidrate in die hidrolisaat te bepaal.mAb-analise van kleiner oligosakkariede in hidrolisate word egter onderskat, en bykomende gereedskap is nodig om oligosakkariede effektief op ELISA-plate te immobiliseer.
Ons rapporteer hier 'n nuwe en doeltreffende oligosakkaried-immobilisasiemetode vir mAb-sifting deur oligosakkariedbiotinilering te kombineer, gevolg deur ELISA-sifting op NeutrAvidin™-bedekte plate.Die geïmmobiliseerde gebiotinileerde oligosakkariede het voldoende affiniteit vir die teenliggaam getoon om vinnige en doeltreffende opsporing van weerbarstige oligosakkariede moontlik te maak.Ontleding van die samestelling van hierdie hardnekkige oligosakkariede gebaseer op massaspektrometrie het die resultate van hierdie nuwe benadering tot immunosifting bevestig.Dus, hierdie studies demonstreer dat die kombinasie van oligosakkaried biotinilering en ELISA sifting met glikaan-geteikende monoklonale teenliggaampies gebruik kan word om kruisbindings in oligosakkariede op te spoor en wyd toegepas kan word in ander biochemiese studies wat die struktuur van oligosakkariede kenmerk.
Hierdie biotien-gebaseerde glikaan-profielmetode is die eerste verslag wat in staat is om die weerbarstige koolhidraatbindings van oplosbare oligosakkariede in plantbiomassa te ondersoek.Dit help om te verstaan ​​waarom sommige dele van biomassa so hardnekkig is wanneer dit by biobrandstofproduksie kom.Hierdie metode vul 'n belangrike leemte in glikomontledingsmetodes en brei die toepassing daarvan uit na 'n wyer reeks substrate buite plantoligosakkariede.In die toekoms kan ons robotika vir biotinilering gebruik en die metode gebruik wat ons ontwikkel het vir hoë-deurvloei-analise van monsters met behulp van ELISA.
Koringstrooi (CS) wat van Pioneer 33A14 bastersade gekweek is, is in 2010 vanaf Kramer Farms in Ray, Colorado geoes.Met die toestemming van die grondeienaar kan hierdie biomassa vir navorsing gebruik word. Die monsters is droog < 6% vog in ritssluitsakke in kamertemperatuur gestoor. Die monsters is droog < 6% vog in ritssluitsakke in kamertemperatuur gestoor. Verwyder die stelsel met 'n algemene stelsel van < 6% in 'n pakket met 'n stelsel van 'n plaaslike stelsel. Monsters is droog gestoor teen <6% humiditeit in sakke met ritssluiting by kamertemperatuur.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Optimale temperamente teen verbruik van < 6%. Monsters word in ritssakke gestoor by kamertemperatuur met humiditeit < 6%.Die studie het aan plaaslike en nasionale riglyne voldoen.Samestellingsanalise is uitgevoer met behulp van die NREL-protokol.Daar is gevind dat die samestelling 31,4% glukaan, 18,7% xilaan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktaan, 2,2% asetiel, 14,3% lignien, 1,7% proteïen en 13,4% as bevat.
Cellic® CTec2 (138 mg proteïen/ml, lot VCNI 0001) is 'n komplekse mengsel van sellulase, β-glukosidase en Cellic® HTec2 (157 mg proteïen/ml, lot VHN00001) van Novozymes (Franklinton, NC, VSA)).Multifect Pectinase® (72 mg proteïen/ml), 'n komplekse mengsel van pektienafbrekende ensieme, is geskenk deur DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, VSA).Ensiemproteïenkonsentrasies is bepaal deur proteïeninhoud te skat (en die bydrae van nie-proteïenstikstof af te trek) deur gebruik te maak van Kjeldahl stikstofanalise (AOAC metode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, VSA).Diatomeeënaarde 545 is by EMD Millipore (Billerica, MA) gekoop.Geaktiveerde koolstof (DARCO, 100 maas korrels), Avicel (PH-101), beuk-xilan en alle ander chemikalieë is by Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) gekoop.
AFEX-voorbehandeling is uitgevoer by GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, VSA).Voorbehandeling is vir 15 minute by 140°C uitgevoer.46 verblyftyd by 1:1 verhouding van watervrye ammoniak tot biomassa teen 60% (w/w) laai in 'n vlekvrye staal bankblad-joernaalreaktor (Parr Instruments Company).Dit het 30 minute geneem.Die reaktor is tot 140°C gebring en die ammoniak is vinnig vrygestel, sodat die biomassa vinnig na kamertemperatuur kon terugkeer.Die samestelling van AFEX voorafbehandelde mieliestoof (ACS) was soortgelyk aan dié van onbehandelde mieliestoof (UT-CS).
Hoë vastestowwe ACSH 25% (w/w) (ongeveer 8% dektraanlading) is voorberei as 'n beginmateriaal vir grootskaalse produksie van oligosakkariede.Ensiematiese hidrolise van ACS is uitgevoer met behulp van 'n kommersiële ensiemmengsel insluitend Cellic® Ctec2 10 mg proteïen/g glukaan (in voorafbehandelde biomassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteïen/g glukaan, en Multifect Pectinase (Genencor Inc, VSA).).), 5 mg proteïen/g dekstraan.Ensiematiese hidrolise is uitgevoer in 'n 5-liter bioreaktor met 'n werkvolume van 3 liter, pH 4.8, 50°C en 250 rpm.Na hidrolise vir 96 uur, is die hidrolisaat versamel deur sentrifugering teen 6000 rpm vir 30 minute en dan by 14000 rpm vir 30 minute om ongehidroliseerde vaste stowwe te verwyder.Die hidrolisaat is toe aan steriele filtrasie deur 'n 0.22 mm filterbeker onderwerp.Die gefiltreerde hidrolisaat is in steriele bottels by 4°C gestoor en dan op koolstof gefraksioneer.
Ontleding van die samestelling van uittreksel-gebaseerde biomassa monsters volgens NREL laboratorium analise prosedures: voorbereiding van monsters vir samestelling analise (NREL/TP-510-42620) en bepaling van strukturele koolhidrate en lignien in biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosakkaried-analise van die hidrolisaatstroom is op 'n 2 ml skaal uitgevoer deur gebruik te maak van 'n outoklaaf-gebaseerde suurhidrolise metode.Meng die hidrolisaatmonster met 69.7 µl 72% swaelsuur in 'n 10 ml skroefdop-kultuurbuis en inkubeer vir 1 uur op 'n tafelblad by 121 °C, koel af op ys en filtreer in 'n hoëwerkverrigting vloeistofchromatografie (HPLC) fles.Die konsentrasie van oligosakkariede is bepaal deur die konsentrasie van monosakkariede in die nie-gehidroliseerde monster van die totale suikerkonsentrasie in die suur-gehidroliseerde monster af te trek.
Glukose, xilose en arabinose konsentrasies in die suur gehidroliseerde biomassa is ontleed deur gebruik te maak van 'n Shimadzu HPLC stelsel toegerus met 'n outomonster, kolom verwarmer, isokratiese pomp, en brekingsindeks detektor op 'n Bio-Rad Aminex HPX-87H kolom.Die kolom is by 50°C gehandhaaf en met 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 in water geëlueer.vloei.
Die hidrolisaat-supernatant is verdun en geanaliseer vir monomeer- en oligosakkariedinhoud.Monomere suikers verkry na ensiematiese hidrolise is ontleed deur HPLC toegerus met 'n Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolom en 'n asskermkolom.Die kolomtemperatuur is op 80°C gehandhaaf, water is as die mobiele fase gebruik met 'n vloeitempo van 0.6 ml/min.Oligosakkariede is bepaal deur hidrolise in verdunde suur by 121°C volgens die metodes beskryf in refs.41, 48, 49.
Sakkariedanalise is uitgevoer op rou, AFEX-voorbehandelde en alle nie-gehidroliseerde biomassa-reste (insluitend produksie van reeksselwand-ekstrakte en hul mAb-sifting) deur gebruik te maak van voorheen beskryfde prosedures 27, 43, 50, 51.Vir glykoomanalise word alkohol-onoplosbare residue van plantselwandmateriaal uit biomassa-reste berei en aan reeksekstraksie onderwerp met toenemend aggressiewe reagense soos ammoniumoksalaat (50 mM), natriumkarbonaat (50 mM en 0,5% w/v), CON.(1M en 4M, beide met 1% w/v natriumboorhidried) en suurchloriet soos voorheen beskryf52,53.Die ekstrakte is dan aan ELISA onderwerp teen 'n komplekse paneel van mAb50's wat na die selwandglikaan gerig is, en die mAb-bindingsreaksies is as 'n hittekaart aangebied.mAbs wat plantselwandglikaan teiken, is van laboratoriumaandele (CCRC-, JIM- en MAC-reekse) gekoop.
Een-stap biotinilering van oligosakkariede.Die konjugasie van koolhidrate met biotien-LC-hidrasied is uitgevoer deur die volgende prosedure te gebruik.Biotien-LC-hidrasied (4.6 mg/12 μmol) is opgelos in dimetielsulfoksied (DMSO, 70 μl) deur sterk roer en verhitting by 65° C. vir 1 min.Ysasynsuur (30 µl) is bygevoeg en die mengsel is op natriumsianoboorhidried (6.4 mg/100 µmol) gegooi en heeltemal opgelos na verhitting by 65°C vir ongeveer 1 minuut.Daarna is 5 tot 8 μl van die reaksiemengsel by die gedroogde oligosakkaried (1-100 nmol) gevoeg om 'n 10-voudige of meer molêre oormaat van die etiket oor die reduseerkant te verkry.Die reaksie is vir 2 uur by 65°C uitgevoer, waarna die monsters onmiddellik gesuiwer is.Geen natriumsianoboorhidried is in die etikettering-eksperimente sonder reduksie gebruik nie, en die monsters is vir 2,5 uur by 65° C. gereageer.
ELISA-bedekking en was van monsters van gebiotinileerde oligosakkariede.25 μl gebiotinileerde monsters (100 μl van elke gekonsentreerde monster verdun in 5 ml 0.1 M Tris-bufferoplossing (TBS)) is by elke put van die avidien-bedekte plaat gevoeg.Kontroleputte is bedek met 50 μl biotien teen 'n konsentrasie van 10 μg/ml in 0.1 M TBS.Gedeïoniseerde water is as 'n deklaag vir blanko-metings gebruik.Die tablet is vir 2 uur by kamertemperatuur in die donker geïnkubeer.Was die plaat 3 keer met 0,1% afgeroomde melk in 0,1 M TBS deur program nr.11 vir Grenier woonstel 3A.
Byvoeging en was van primêre teenliggaampies.Voeg 40 µl primêre teenliggaampie by elke put.Inkubeer die mikroplaat vir 1 uur by kamertemperatuur in die donker.Die plate is dan 3 keer gewas met 0.1% melk in 0.1M TBS deur gebruik te maak van wasprogram #11 vir Grenier Flat 3A.
Voeg sekondêre teenliggaampies by en was.Voeg 50 µl muis/rot sekondêre teenliggaampie (verdun 1:5000 in 0.1% melk in 0.1 M TBS) by elke put.Inkubeer die mikroplaat vir 1 uur by kamertemperatuur in die donker.Die mikroplate is dan 5 keer gewas met 0.1% melk in 0.1 M TBS met behulp van Grenier Flat 5A plaatwas program #12.
Voeg 'n substraat by.Voeg 50 µl 3,3',5,5'-tetrametielbenzidien (TMB) by die basissubstraat (deur 2 druppels buffer, 3 druppels TMB, 2 druppels waterstofperoksied by 15 ml gedeïoniseerde water te voeg).Berei die TMB-substraat voor.en vortex voor gebruik).Inkubeer die mikroplaat by kamertemperatuur vir 30 minute.In die donker.
Voltooi die stap en lees die tablet.Voeg 50 µl 1 N swaelsuur by elke put en teken die absorpsie van 450 tot 655 nm aan met 'n ELISA-leser.
Berei 1 mg/ml oplossings van hierdie analiete in gedeïoniseerde water voor: arabinose, rhamnose, fukose, xilose, galakturonsuur (GalA), glukuronsuur (GlcA), mannose, glukose, galaktose, laktose, N-asetielmannosamien (manNAc), N-asetielglukosamien.(glcNAc), N-asetielgalaktosamien (galNAc), inositol (interne standaard).Twee standaarde is voorberei deur die 1 mg/mL suikeroplossings wat in Tabel 1 getoon word by te voeg. Monsters word gevries en gevriesdroog by -80°C totdat alle water verwyder is (gewoonlik ongeveer 12-18 uur).
Voeg 100–500 µg monster by skroefdopbuisies op 'n analitiese balans.Teken die hoeveelheid bygevoeg aan.Dit is die beste om die monster in 'n spesifieke konsentrasie oplosmiddel op te los en dit as 'n vloeibare hoeveelheid by die buis te voeg.Gebruik 20 µl 1 mg/ml inositol as 'n interne standaard vir elke monsterbuis.Die hoeveelheid interne standaard wat by die monster gevoeg word, moet dieselfde wees as die hoeveelheid interne standaard wat by die standaardbuis gevoeg word.
Voeg 8 ml watervrye metanol by 'n skroefdopbottel.Dan 4 ml 3 N. metanoliese HCl-oplossing, bedek en geskud.Hierdie proses gebruik nie water nie.
Voeg 500 µl 1 M HCl-metanoloplossing by die oligosakkariedmonsters en standaard TMS-buise.Monsters is oornag (168 uur) by 80°C in 'n termiese blok geïnkubeer.Droog die metanoliseproduk by kamertemperatuur met 'n droogspruitstuk.Voeg 200 µl MeOH by en droog weer.Hierdie proses word twee keer herhaal.Voeg 200 µl metanol, 100 µl piridien en 100 µl asynanhidried by die monster en meng goed.Monsters is vir 30 minute by kamertemperatuur geïnkubeer.en gedroog.Voeg 200 µl metanol by en droog weer.
Voeg 200 µl Tri-Sil by en verhit die buis vir 20 minute.80°C, dan afgekoel tot kamertemperatuur.Gebruik 'n droogspruitstuk om die monster verder te droog tot 'n volume van ongeveer 50 µl.Dit is belangrik om daarop te let dat ons nie toegelaat het dat die monsters heeltemal droog word nie.
Voeg 2 ml heksaan by en meng goed deur te vortex.Vul die punte van Pasteur-pipette (5-8 mm) met 'n stuk glaswol deur die glaswol bo-op 'n pipet van 5-3/4 duim deursnee te plaas.Monsters is vir 2 minute by 3000 g sentrifugeer.Enige onoplosbare residue word neergeslaan.Droog die monster tot 100-150 µl.'n Volume van ongeveer 1 μl is by 'n aanvanklike temperatuur van 80 °C en 'n aanvanklike tyd van 2.0 minute in die GC-MS ingespuit (Tabel 2).