Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Ing sawetoro wektu, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nerjemahake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Metode spektrometri imunologis lan massa anyar kanggo analisis kompleks oligosakarida persisten ing stover jagung sing diobati karo AFEX.Biomassa lignoselulosa minangka alternatif sing lestari kanggo bahan bakar fosil lan akeh digunakake kanggo ngembangake bioteknologi kanggo produksi produk kayata panganan, pakan, bahan bakar lan bahan kimia.Kunci kanggo teknologi kasebut yaiku pangembangan proses kompetitif biaya kanggo ngowahi karbohidrat kompleks sing ana ing tembok sel tanduran dadi gula sederhana kayata glukosa, xilosa lan arabinosa.Amarga biomas lignoselulosa banget bandel, mula kudu ngalami perawatan termokimia (contone, pengelupasan serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ion (IL) lan perawatan biologis (contone, hidrolisis enzimatik lan fermentasi mikroba) kanthi kombinasi kanggo entuk produk sing dikarepake..Nanging, nalika enzim jamur komersial digunakake ing proses hidrolisis, mung 75-85% saka gula larut sing dibentuk minangka monosakarida, lan sisa 15-25% sing larut, oligosakarida sing ora bisa diobati, sing ora tansah kasedhiya kanggo mikroorganisme.Sadurunge, kita wis sukses ngisolasi lan ngresiki oligosakarida bandel sing larut kanthi nggunakake kombinasi pemisahan bumi karbon lan diatomaceous lan kromatografi pengecualian ukuran, lan uga nyelidiki sifat-sifat inhibitor enzim.Kita nemokake manawa oligosakarida sing ngemot substitusi asam uronik metilasi polimerisasi (DP) luwih angel diproses kanthi campuran enzim komersial tinimbang oligosakarida DP sing kurang lan netral.Ing kene kita nglaporake panggunaan sawetara cara tambahan, kalebu profiling glycan nggunakake antibodi monoklonal (mAbs) khusus kanggo tanduran glycans biomassa kanggo menehi ciri ikatan glycan ing tembok sel tanduran lan hidrolisat enzimatik, ionisasi desorpsi laser sing dibantu matriks, spektrometri massa wektu penerbangan..MALDI-TOF-MS) nggunakake puncak diagnostik informatif struktur sing dipikolehi kanthi spektroskopi sawise bosok sekunder ion negatif, kromatografi gas lan spektrometri massa (GC-MS) kanggo menehi ciri ikatan oligosakarida kanthi lan tanpa derivatisasi.Amarga ukuran cilik saka oligosakarida (DP 4-20), molekul iki angel digunakake kanggo ngiket lan karakterisasi mAb.Kanggo ngatasi masalah iki, kita nggunakake metode immobilisasi oligosakarida berbasis konjugasi biotin anyar sing kasil menehi label mayoritas oligosakarida larut DP sing kurang ing permukaan microplate, sing banjur digunakake ing sistem mAb throughput dhuwur kanggo analisis ligasi tartamtu.Cara anyar iki bakal nggampangake pangembangan tes glikome throughput sing luwih maju ing mangsa ngarep sing bisa digunakake kanggo ngisolasi lan menehi ciri oligosakarida sing ana ing biomarker kanggo tujuan diagnostik.
Biomassa lignoselulosa, sing kasusun saka bahan pertanian, kehutanan, suket lan kayu, minangka bahan baku potensial kanggo produksi produk adhedhasar bio, kalebu panganan, pakan, bahan bakar lan prekursor kimia kanggo ngasilake produk sing luwih dhuwur1.Karbohidrat (kayata selulosa lan hemiselulosa) sing ana ing tembok sel tanduran didepolimerisasi dadi monosakarida kanthi pangolahan kimia lan biotransformasi (kayata hidrolisis enzimatik lan fermentasi mikroba).Pra-perawatan umum kalebu ekspansi serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ion (IL), lan ledakan uap (SE), sing nggunakake kombinasi bahan kimia lan panas kanggo nyuda produksi lignoselulosa kanthi mbukak tembok sel tanduran3,4.stubbornness saka materi, 5. Hidrolisis enzimatik ditindakake kanthi beban padhet sing dhuwur nggunakake enzim sing ngemot karbohidrat aktif komersial (CAZymes) lan fermentasi mikroba nggunakake ragi transgenik utawa bakteri kanggo ngasilake bahan bakar lan bahan kimia sing adhedhasar bio 6 .
CAZymes ing enzim komersial dumadi saka campuran kompleks enzim sing sinergis mecah ikatan karbohidrat-gula kompleks dadi monosakarida2,7.Kaya sing wis dilapurake sadurunge, jaringan kompleks polimer aromatik lignin kanthi karbohidrat ndadekake banget ora bisa ditindakake, sing nyebabake konversi gula sing ora lengkap, nglumpukake 15-25% oligosakarida seks sing ora diprodhuksi sajrone hidrolisis enzimatik biomassa sing wis diolah.Iki minangka masalah umum karo macem-macem cara pretreatment biomassa.Sawetara alasan kanggo bottleneck iki kalebu inhibisi enzim sajrone hidrolisis, utawa ora ana utawa kurang enzim penting penting sing dibutuhake kanggo ngilangi ikatan gula ing biomassa tanduran.Ngerteni komposisi lan karakteristik struktural gula, kayata ikatan gula ing oligosakarida, bakal mbantu kita nambah konversi gula sajrone hidrolisis, nggawe proses bioteknologi kompetitif karo produk sing asale saka petroleum.
Nemtokake struktur karbohidrat pancen angel lan mbutuhake kombinasi metode kayata kromatografi cair (LC)11,12, spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR)13, elektroforesis kapiler (CE)14,15,16 lan spektrometri massa (MS)17., wolulas.Cara MS kayata spektrometri massa wektu-penerbangan kanthi desorpsi laser lan ionisasi nggunakake matriks (MALDI-TOF-MS) minangka cara serbaguna kanggo ngenali struktur karbohidrat.Bubar, Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS saka tambahan ion natrium wis paling akeh digunakake kanggo ngenali sidik jari sing cocog karo posisi lampiran oligosakarida, konfigurasi anomerik, urutan, lan posisi cabang 20, 21.
Analisis Glycan minangka alat sing apik kanggo identifikasi ikatan karbohidrat sing luwih jero.Cara iki nggunakake antibodi monoklonal (mAbs) sing diarahake kanggo tanduran glycan tembok sel minangka probe kanggo mangerteni ubungan karbohidrat kompleks.Luwih saka 250 mAbs kasedhiya ing saindenging jagad, dirancang nglawan macem-macem oligosakarida linier lan cabang nggunakake macem-macem sakarida24.Sawetara mAb wis akeh digunakake kanggo ciri struktur, komposisi, lan modifikasi tembok sel tanduran, amarga ana bedane sing signifikan gumantung saka jinis sel tanduran, organ, umur, tahap perkembangan, lan lingkungan pertumbuhan25,26.Paling anyar, metode iki digunakake kanggo mangerteni populasi vesikel ing sistem tanduran lan kewan lan peran masing-masing ing transportasi glycan kaya sing ditemtokake dening tandha subselular, tahap perkembangan, utawa rangsangan lingkungan, lan kanggo nemtokake aktivitas enzimatik.Sawetara struktur glycans lan xylan sing beda-beda sing wis diidentifikasi kalebu pektin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glukan ikatan campuran (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbXgaan) lan arabinoxylan (GArbX.
Nanging, sanajan kabeh upaya riset kasebut, mung sawetara studi sing fokus ing sifat akumulasi oligosakarida sajrone hidrolisis beban padatan dhuwur (HSL), kalebu pelepasan oligosakarida, owah-owahan dawa rantai oligomer sajrone hidrolisis, macem-macem polimer DP rendah, lan kurva.distribusi 30,31,32.Sauntara kuwi, sanajan analisis glycan wis kabukten minangka alat sing migunani kanggo analisis lengkap babagan struktur glycan, angel kanggo ngevaluasi oligosakarida DP rendah sing larut ing banyu nggunakake metode antibodi.Oligosakarida DP sing luwih cilik kanthi bobot molekul kurang saka 5-10 kDa ora ikatan karo piring ELISA 33, 34 lan dikumbah sadurunge tambahan antibodi.
Ing kene, kanggo pisanan, kita nduduhake tes ELISA ing piring sing dilapisi avidin nggunakake antibodi monoklonal, nggabungake prosedur biotinilasi siji-langkah kanggo oligosakarida refraktori larut kanthi analisis glikome.Pendekatan kita kanggo analisis glikome divalidasi dening MALDI-TOF-MS lan GC-MS adhedhasar analisis hubungan oligosakarida pelengkap nggunakake trimethylsilyl (TMS) derivatization saka komposisi gula hidrolisis.Pendekatan inovatif iki bisa dikembangake minangka cara dhuwur ing mangsa ngarep lan nemokake aplikasi sing luwih akeh ing riset biomedis35.
Modifikasi enzim lan antibodi sawise translasi, kayata glikosilasi,36 mengaruhi aktivitas biologis.Contone, owah-owahan glikosilasi protein serum nduweni peran penting ing arthritis inflamasi, lan owah-owahan glikosilasi digunakake minangka penanda diagnostik37.Macem-macem glycans wis dilapurake ing literatur supaya bisa katon ing macem-macem penyakit, kalebu penyakit inflamasi kronis ing saluran pencernaan lan ati, infeksi virus, kanker ovarium, payudara, lan prostat38,39,40.Ngerteni struktur glycans nggunakake metode glycan berbasis antibodi ELISA bakal menehi kapercayan tambahan ing diagnosis penyakit tanpa nggunakake metode MS sing kompleks.
Panaliten sadurunge nuduhake yen oligosakarida degil tetep ora dihidrolisis sawise pretreatment lan hidrolisis enzimatik (Gambar 1).Ing karya sing diterbitake sadurunge, kita ngembangake metode ekstraksi fase padat arang aktif kanggo ngisolasi oligosakarida saka AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8.Sawise ekstraksi lan pemisahan awal, oligosakarida dipecah maneh kanthi kromatografi eksklusi ukuran (SEC) lan diklumpukake miturut bobot molekul.Monomer gula lan oligomer sing dibebasake saka macem-macem pretreatment dianalisis kanthi analisis komposisi gula.Nalika mbandhingake isi oligomer gula sing dipikolehi kanthi macem-macem cara pretreatment, anané oligosakarida degil minangka masalah umum ing konversi biomas dadi monosakarida lan bisa nyebabake pangurangan asil gula paling sethithik 10-15% lan malah nganti 18%.AS.Cara iki digunakake kanggo produksi fraksi oligosakarida kanthi skala gedhe.ACH asil lan pecahan sakteruse karo bobot molekul beda digunakake minangka bahan eksperimen kanggo karakterisasi oligosakarida ing karya iki.
Sawise pretreatment lan hidrolisis enzimatik, oligosakarida persisten tetep ora dihidrolisis.Ing kene (A) minangka cara pamisahan oligosakarida ing ngendi oligosakarida diisolasi saka AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) nggunakake amben karbon aktif lan bumi diatom;(B) Metode pemisahan oligosakarida.Oligosakarida luwih dipisahake kanthi kromatografi eksklusi ukuran (SEC);(C) Monomer sakarida lan oligomer sing dibebasake saka macem-macem pretreatment (asam encer: DA, cairan ionik: IL lan AFEX).Kondisi hidrolisis enzimatik: muatan padhet dhuwur 25% (w/w) (kira-kira 8% beban glukan), hidrolisis 96 jam, 20 mg/g muatan enzim komersial (rasio Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) lan (D) Monomer gula lan oligomer glukosa, xylose lan arabinose (presttreated AFEX AFEX).
Analisis Glycan wis kabukten minangka alat sing migunani kanggo analisis struktural lengkap glycans ing ekstrak sing diisolasi saka residu biomas padat.Nanging, sakarida larut banyu kurang diwakili nggunakake metode tradisional iki41 amarga oligosakarida bobot molekul sing sithik angel diimobilisasi ing piring ELISA lan dicuci sadurunge tambahan antibodi.Mulane, kanggo ikatan lan karakterisasi antibodi, metode biotinilasi siji-langkah digunakake kanggo nutupi oligosakarida sing larut lan ora cocog ing piring ELISA sing dilapisi avidin.Cara iki dites nggunakake ACSH sing digawe sadurunge lan fraksi adhedhasar bobot molekul (utawa derajat polimerisasi, DP).Biotinilasi siji-langkah digunakake kanggo nambah afinitas ikatan oligosakarida kanthi nambahake biotin-LC-hydrazide menyang ujung ngurangi karbohidrat (Gambar 2).Ing larutan, gugus hemiacetal ing ujung reduksi bereaksi karo gugus hidrazida biotin-LC-hidrazida kanggo mbentuk ikatan hidrazon.Ing ngarsane agen pereduksi NaCNBH3, ikatan hidrazon dikurangi dadi produk pungkasan biotinilasi sing stabil.Kanthi modifikasi pungkasan nyuda gula, ikatan oligosakarida DP sing kurang menyang piring ELISA bisa ditindakake, lan ing panliten iki ditindakake ing piring sing dilapisi avidin nggunakake mAbs sing ditargetake glycan.
Screening antibodi monoklonal adhedhasar ELISA kanggo oligosakarida biotinilasi.Ing kene (A) gabungan biotinilasi oligosakarida lan saringan ELISA sabanjure kanthi mAb sing ditargetake glycan ing piring sing dilapisi NeutrAvidin lan (B) nuduhake prosedur siji-langkah kanggo biotinilasi produk reaksi.
Piring sing dilapisi Avidin kanthi antibodi konjugasi oligosakarida banjur ditambahake menyang antibodi primer lan sekunder lan dicuci ing medium sing sensitif cahya lan wektu.Sawise ikatan antibodi rampung, tambahake substrat TMB kanggo inkubasi piring kasebut.Reaksi kasebut pungkasane mandheg nganggo asam sulfat.Piring sing diinkubasi dianalisis nggunakake maca ELISA kanggo nemtokake kekuatan ikatan saben antibodi kanggo ndeteksi salib-link spesifik antibodi.Kanggo rincian lan paramèter eksperimen, deleng bagean sing cocog "Bahan lan Metode".
Kita nduduhake utilitas metode sing mentas dikembangake iki kanggo aplikasi tartamtu kanthi menehi ciri oligosakarida larut sing ana ing ACSH uga ing fraksi oligosakarida mentah lan diresiki sing diisolasi saka hidrolisat lignoselulosa.Kaya sing dituduhake ing Gambar 3, xylan sing diganti epitope sing paling umum sing diidentifikasi ing ACSH nggunakake metode uji glikome bioacylated biasane uronik (U) utawa methyluronic (MeU) lan arabinogalactans pectic.Umume uga ditemokake ing panliten sadurunge babagan analisis glycans saka non-hydrolyzed solids (UHS)43.
Deteksi epitope oligosakarida recalcitrant nggunakake antibodi monoklonal sing diarahake menyang glycan tembok sel.Fraksi "netral" yaiku fraksi ACN lan fraksi "asam" yaiku fraksi FA.Werna abang sing luwih padhang ing peta panas nuduhake isi epitope sing luwih dhuwur, lan biru sing luwih cerah nuduhake latar mburi kosong.Nilai warna ing skala adhedhasar nilai OD mentah kanggo formulasi N=2.Epitope utama sing diakoni dening antibodi ditampilake ing sisih tengen.
Struktur non-selulosa iki ora bisa dipisahake dening selulase lan hemiselulosa sing paling umum ing campuran enzim komersial sing diuji, sing kalebu enzim komersial sing paling umum digunakake.Mula, enzim tambahan anyar dibutuhake kanggo hidrolisis.Tanpa enzim aksesori non-selulosa sing dibutuhake, ikatan non-selulosa iki nyegah konversi lengkap dadi monosakarida, sanajan polimer gula induke dihidrolisis sacara ekstensif dadi pecahan sing luwih cendhek lan dibubarake nggunakake campuran enzim komersial.
Sinau luwih lanjut babagan distribusi sinyal lan kekuatan ikatan kasebut nuduhake yen epitope pengikat luwih murah ing fraksi gula DP dhuwur (A, B, C, DP nganti 20+) tinimbang ing fraksi DP kurang (D, E, F, DP) ing dimer) (Gambar 1).Fragmen asam luwih umum ing epitope non-selulosa tinimbang fragmen netral.Fenomena kasebut konsisten karo pola sing diamati ing panliten sadurunge, ing ngendi DP dhuwur lan gugus asam luwih tahan kanggo hidrolisis enzimatik.Mulane, anané epitope glycan non-selulosa lan substitusi U lan MeU bisa nyumbang banget marang stabilitas oligosakarida.Perlu dicathet yen efisiensi ikatan lan deteksi bisa dadi masalah kanggo oligosakarida DP sing kurang, utamane yen epitope minangka oligosakarida dimerik utawa trimerik.Iki bisa dites nggunakake oligosakarida komersial sing beda-beda dawa, saben mung ngemot siji epitope sing ngiket mAb tartamtu.
Mangkono, panggunaan antibodi spesifik struktur ngungkapake jinis ikatan recalcitrant tartamtu.Gumantung saka jinis antibodi sing digunakake, pola ligasi sing cocok, lan kekuatan sinyal sing diasilake (paling akeh lan paling ora akeh), enzim anyar bisa diidentifikasi lan ditambahake kanthi semi-kuantitatif menyang campuran enzim kanggo konversi glikogen sing luwih lengkap.Njupuk analisis oligosakarida ACSH minangka conto, kita bisa nggawe database ikatan glycan kanggo saben bahan biomassa.Perlu dicathet ing kene yen afinitas antibodi sing beda kudu dianggep, lan yen afinitas kasebut ora dingerteni, iki bakal nggawe kesulitan tartamtu nalika mbandhingake sinyal antibodi sing beda.Kajaba iku, mbandhingake ikatan glycan bisa uga paling apik ing antarane conto kanggo antibodi sing padha.Ikatan bandel iki banjur bisa disambungake menyang basis data CAZyme, saka ngendi kita bisa ngenali enzim, milih calon enzim lan nguji enzim pemecah ikatan, utawa ngembangake sistem mikroba kanggo nyebut enzim kasebut kanggo digunakake ing biorefineries44.
Kanggo ngevaluasi carane cara imunologis nglengkapi cara alternatif kanggo menehi ciri oligosakarida bobot molekul rendah sing ana ing hidrolisat lignoselulosa, kita nindakake MALDI (Gambar 4, S1-S8) lan analisis saka sakarida asale saka TMS adhedhasar GC-MS ing panel oligosakarida sing padha (Gambar 5).MALDI digunakake kanggo mbandhingake manawa distribusi massa molekul oligosakarida cocog karo struktur sing dituju.Ing anjir.4 nuduhake MC komponen netral ACN-A lan ACN-B.Analisis ACN-A dikonfirmasi sawetara gula pentosa wiwit saka DP 4-8 (Gambar 4) nganti DP 22 (Gambar S1), sing bobote cocog karo oligosakarida MeU-xylan.Analisis ACN-B ngonfirmasi seri pentosa lan glukoksilan kanthi DP 8-15.Ing materi tambahan kayata Gambar S3, peta distribusi massa gugus asam FA-C nuduhake sawetara gula pentosa sing diganti (Me) U kanthi DP 8-15 sing konsisten karo xylan sing diganti sing ditemokake ing screening mAb adhedhasar ELISA.Epitopes kasebut konsisten.
Spektrum MALDI-MS saka oligosakarida sing ora larut larut sing ana ing ACS.Ing kene, (A) ACN-A pecahan sawetara bobot kurang ngemot asam uronik metilasi (DP 4-8) diganti oligosakarida glukuroksilan lan (B) xylan ACN-B lan oligosakarida asam uronik metilasi diganti karo glukuroksilan (DP 8-15).
Analisis komposisi residu glycan saka oligosakarida refraktori.Ing kene (A) komposisi sakarida TMS saka macem-macem fraksi oligosakarida dijupuk nggunakake analisis GC-MS.(B) Struktur macem-macem gula sing asale saka TMS sing ana ing oligosakarida.ACN - fraksi asetonitril sing ngandhut oligosakarida netral lan FA - fraksi asam ferulat sing ngandhut oligosakarida asam.
Kesimpulan liyane sing menarik digambar saka analisis LC-MS saka fraksi oligosakarida, kaya sing ditampilake ing Gambar S9 (metode bisa dideleng ing materi tambahan elektronik).Fragmen kelompok heksosa lan -OAc bola-bali diamati nalika ligasi fraksi ACN-B.Panemuan iki ora mung ngonfirmasi fragmentasi sing diamati ing analisis glikome lan MALDI-TOF, nanging uga menehi informasi anyar babagan turunan karbohidrat potensial ing biomas lignoselulosa sing wis diobati.
Kita uga nganalisa komposisi gula saka fraksi oligosakarida nggunakake derivatisasi gula TMS.Nggunakake GC-MS, kita nemtokake komposisi gula saraf (non-turunan) lan asam (GluA lan GalA) ing fraksi oligosakarida (Gambar 5).Asam glukuronat ditemokake ing komponen asam C lan D, dene asam galacturonic ditemokake ing komponen asam A lan B, loro-lorone minangka komponen DP dhuwur saka gula asam.Asil kasebut ora mung ngonfirmasi data ELISA lan MALDI, nanging uga konsisten karo panaliten sadurunge babagan akumulasi oligosakarida.Mulane, kita percaya yen metode imunologi modern nggunakake biotinilasi oligosakarida lan screening ELISA sabanjure cukup kanggo ndeteksi oligosakarida recalcitrant larut ing macem-macem conto biologi.
Wiwit metode screening mAb adhedhasar ELISA wis divalidasi dening sawetara cara sing beda-beda, kita pengin luwih njelajah potensial metode kuantitatif anyar iki.Loro oligosakarida komersial, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) lan 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), dituku lan diuji nggunakake pendekatan mAb anyar sing ngarahake glycan tembok sel.Gambar 6 nuduhake korélasi linear antarane sinyal naleni biotinilasi lan konsentrasi log konsentrasi oligosakarida, nyaranake model adsorpsi Langmuir.Antarane mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, lan CCRC-M151 hubungane karo XHE, lan CCRC-M108, CCRC-M109, lan LM11 hubungane karo A2XX sajrone kisaran 1 nm nganti 100 nano.Amarga kasedhiyan antibodi sing winates sajrone eksperimen, eksperimen winates ditindakake kanthi saben konsentrasi oligosakarida.Perlu dicathet ing kene yen sawetara antibodi bereaksi beda banget marang oligosakarida sing padha minangka substrat, bisa uga amarga padha ngiket epitope sing rada beda lan bisa duwe afinitas ikatan sing beda banget.Mekanisme lan implikasi identifikasi epitope sing akurat bakal luwih rumit nalika pendekatan mAb anyar ditrapake kanggo conto nyata.
Loro oligosakarida komersial digunakake kanggo nemtokake sawetara deteksi macem-macem mAbs glycan-targeting.Ing kene, korélasi linear karo konsentrasi log konsentrasi oligosakarida nuduhake pola adsorpsi Langmuir kanggo (A) XHE karo mAb lan (B) A2XX karo mAb.Epitope sing cocog nuduhake struktur oligosakarida komersial sing digunakake minangka substrat ing tes kasebut.
Panggunaan antibodi monoklonal sing ditargetake glycan (analisis glikomik utawa screening mAb adhedhasar ELISA) minangka alat sing kuat kanggo karakterisasi jero saka sebagian besar glycans tembok sel utama sing nggawe biomassa tanduran.Nanging, analisis glycan klasik mung menehi ciri glycans tembok sel sing luwih gedhe, amarga akeh oligosakarida ora diimobilisasi kanthi efisien ing piring ELISA.Ing panliten iki, stover jagung sing wis diolah AFEX dihidrolisis sacara enzimatik kanthi kandungan padatan sing dhuwur.Analisis gula digunakake kanggo nemtokake komposisi karbohidrat tembok sel recalcitrant ing hidrolisat.Nanging, analisis mAb saka oligosakarida sing luwih cilik ing hidrolisat diremehake, lan alat tambahan dibutuhake kanggo immobilize oligosakarida kanthi efektif ing piring ELISA.
Kita nglaporake ing kene cara imobilisasi oligosakarida sing novel lan efisien kanggo saringan mAb kanthi nggabungake biotinilasi oligosakarida diikuti karo saringan ELISA ing piring sing dilapisi NeutrAvidin™.Oligosakarida biotinilasi sing ora bisa digerakake nuduhake afinitas sing cukup kanggo antibodi supaya bisa deteksi oligosakarida bandel kanthi cepet lan efisien.Analisis komposisi oligosakarida degil adhedhasar spektrometri massa dikonfirmasi asil pendekatan anyar iki kanggo immunoscreening.Mangkono, panliten kasebut nduduhake yen kombinasi biotinilasi oligosakarida lan skrining ELISA karo antibodi monoklonal sing ditargetake glycan bisa digunakake kanggo ndeteksi crosslinks ing oligosakarida lan bisa ditrapake sacara luas ing studi biokimia liyane sing nduweni ciri struktur oligosakarida.
Cara profiling glycan adhedhasar biotin iki minangka laporan pisanan sing bisa nyelidiki ikatan karbohidrat bandel saka oligosakarida larut ing biomassa tanduran.Iki mbantu ngerti sebabe sawetara bagean biomas dadi wangkal nalika nerangake produksi biofuel.Cara iki ngisi longkangan penting ing cara analisis glikome lan ngluwihi aplikasi kanggo macem-macem substrat ngluwihi oligosakarida tanduran.Ing mangsa ngarep, kita bisa nggunakake robotika kanggo biotinilasi lan nggunakake metode sing wis dikembangake kanggo analisis sampel kanthi dhuwur nggunakake ELISA.
Jerami jagung (CS) sing ditanam saka wiji hibrida Pioneer 33A14 dipanen ing taun 2010 saka Kramer Farms ing Ray, Colorado.Kanthi idin saka pemilik lahan, biomassa iki bisa digunakake kanggo riset. Sampel disimpen garing <6% kelembapan ing tas zip-lock ing suhu kamar. Sampel disimpen garing <6% kelembapan ing tas zip-lock ing suhu kamar. Образцы хранились сухими при влажности < 6% ing пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Sampel disimpen garing ing asor <6% ing tas zippered ing suhu kamar.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Sampel disimpen ing tas zipper ing suhu kamar kanthi kelembapan <6%.Panliten kasebut tundhuk karo pedoman lokal lan nasional.Analisis komposisi ditindakake kanthi nggunakake protokol NREL.Komposisi kasebut ditemokake ngemot 31,4% glukan, 18,7% xilan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktan, 2,2% asetil, 14,3% lignin, 1,7% protein lan 13, 4% abu.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) minangka campuran kompleks selulase, β-glukosidase lan Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, akèh VHN00001) saka Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), campuran kompleks enzim pectin degrading, disumbang dening DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Konsentrasi protein enzim ditemtokake kanthi ngira isi protein (lan nyuda kontribusi nitrogen non-protein) nggunakake analisis nitrogen Kjeldahl (metode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Bumi diatomaceous 545 dituku saka EMD Millipore (Billerica, MA).Karbon aktif (DARCO, granula bolong 100), Avicel (PH-101), xylan beech, lan kabeh bahan kimia liyane dituku saka Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Pretreatment AFEX ditindakake ing GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Pre-treatment ditindakake ing 140 ° C. suwene 15 menit.46 wektu manggon ing rasio 1:1 saka amonia anhydrous kanggo biomassa ing 60% (w/w) loading ing reaktor kumpulan benchtop stainless steel (Parr Instruments Company).Butuh 30 menit.Reaktor digawa menyang 140 ° C lan amonia dibebasake kanthi cepet, saéngga biomas bisa cepet bali menyang suhu kamar.Komposisi AFEX pre-treated corn stover (ACS) padha karo untreated corn stover (UT-CS).
Padatan dhuwur ACSH 25% (w/w) (kira-kira 8% dextran loading) disiapake minangka bahan wiwitan kanggo produksi oligosakarida skala gedhe.Hidrolisis enzimatik ACS ditindakake kanthi nggunakake campuran enzim komersial kalebu Cellic® Ctec2 10 mg protein / g glukan (ing biomassa sing wis diolah), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein / g glukan, lan Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg protein/g dekstran.Hidrolisis enzimatik ditindakake ing bioreaktor 5 liter kanthi volume kerja 3 liter, pH 4,8, 50 ° C lan 250 rpm.Sawise hidrolisis sajrone 96 jam, hidrolisat diklumpukake kanthi sentrifugasi ing 6000 rpm suwene 30 menit lan banjur ing 14000 rpm suwene 30 menit kanggo ngilangi barang padhet sing ora dihidrolisis.Hidrolisat kasebut banjur disaring steril liwat beaker filter 0,22 mm.Hidrolisat sing disaring disimpen ing botol steril ing suhu 4 ° C. banjur difraksinasi ing karbon.
Analisis komposisi sampel biomassa adhedhasar ekstrak miturut prosedur analisis laboratorium NREL: persiapan sampel kanggo analisis komposisi (NREL/TP-510-42620) lan penentuan karbohidrat struktural lan lignin ing biomas (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analisis oligosakarida saka aliran hidrolisat ditindakake kanthi skala 2 ml kanthi nggunakake metode hidrolisis asam berbasis autoklaf.Campuran sampel hidrolisat karo 69,7 µl asam sulfat 72% ing tabung kultur tutup sekrup 10 ml lan inkubasi 1 jam ing benchtop ing suhu 121 °C, adhem ing es lan saring menyang vial kromatografi cair kinerja dhuwur (HPLC).Konsentrasi oligosakarida ditemtokake kanthi nyuda konsentrasi monosakarida ing sampel sing ora dihidrolisis saka konsentrasi gula total ing sampel sing dihidrolisis asam.
Konsentrasi glukosa, xilosa, lan arabinosa ing biomassa terhidrolisis asam dianalisis kanthi nggunakake sistem Shimadzu HPLC sing dilengkapi autosampler, pemanas kolom, pompa isocratic, lan detektor indeks bias ing kolom Bio-Rad Aminex HPX-87H.Kolom kasebut dijaga ing 50 ° C lan diencerake kanthi 0,6 ml / min 5 mM H2SO4 ing banyu.mili.
Supernatan hidrolisat diencerke lan dianalisis kanggo kandungan monomer lan oligosakarida.Gula monomer sing dipikolehi sawise hidrolisis enzimatik dianalisis dening HPLC sing dilengkapi kolom Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P lan kolom penjaga abu.Suhu kolom dijaga ing 80 ° C, banyu digunakake minangka fase gerak kanthi laju aliran 0,6 ml / min.Oligosakarida ditemtokake kanthi hidrolisis ing asam encer ing 121 ° C miturut metode sing diterangake ing refs.41, 48, 49.
Analisis sakarida ditindakake kanthi mentah, AFEX sing wis diobati lan kabeh residu biomas sing ora dihidrolisis (kalebu produksi ekstrak tembok sel serial lan skrining mAb) nggunakake prosedur sing wis diterangake sadurunge 27, 43, 50, 51.Kanggo analisis glikome, residu alkohol sing ora larut saka bahan tembok sel tanduran disiapake saka residu biomas lan diekstraksi serial kanthi reagen sing luwih agresif kayata amonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM lan 0,5% w / v), CON.(1M lan 4M, loro-lorone karo 1% w/v sodium borohydride) lan asam klorit minangka diterangake sadurunge52,53.Ekstrak kasebut banjur ditindakake ELISA marang panel kompleks mAb50s sing diarahake menyang glycan tembok sel, lan reaksi ikatan mAb ditampilake minangka peta panas.mAbs nargetake glycan tembok sel tanduran dituku saka saham laboratorium (seri CCRC, JIM lan MAC).
Biotinilasi siji-langkah saka oligosakarida.Konjugasi karbohidrat karo biotin-LC-hydrazide ditindakake kanthi nggunakake prosedur ing ngisor iki.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) dibubarake ing dimetil sulfoksida (DMSO, 70 μl) kanthi aduk kuat lan panas ing 65 ° C. kanggo 1 menit.Asam asetat glasial (30 μl) ditambahake lan campuran kasebut diwutahake menyang sodium cyanoborohydride (6,4 mg / 100 μmol) lan larut kanthi lengkap sawise dipanasake ing 65 ° C. kira-kira 1 menit.Banjur, saka 5 nganti 8 μl saka campuran reaksi ditambahake menyang oligosakarida garing (1-100 nmol) kanggo entuk keluwihan molar 10-fold utawa luwih saka label ing ujung sing nyuda.Reaksi kasebut ditindakake ing suhu 65 ° C suwene 2 jam, sawise sampel kasebut langsung diresiki.Ora ana sodium cyanoborohydride digunakake ing eksperimen labeling tanpa ngurangi, lan conto padha reacted ing 65 ° C kanggo 2,5 jam.
ELISA lapisan lan ngumbah conto oligosakarida biotinilasi.25 μl sampel biotinilasi (100 μl saben sampel pekat sing diencerke ing 5 ml larutan buffer Tris (TBS) 0,1 M) ditambahake ing saben sumur saka piring sing dilapisi avidin.Sumur kontrol dilapisi karo 50 μl biotin kanthi konsentrasi 10 μg / ml ing 0,1 M TBS.Banyu deionisasi digunakake minangka lapisan kanggo pangukuran kosong.Tablet kasebut diinkubasi sajrone 2 jam ing suhu kamar ing peteng.Cuci piring kaping telu nganggo susu skim 0,1% ing 0,1 M TBS nggunakake program no.11 kanggo Grenier flat 3A.
Penambahan lan ngumbah antibodi primer.Tambah 40 µl antibodi primer kanggo saben sumur.Inkubasi microplate kanggo 1 jam ing suhu kamar ing peteng.Piring banjur dikumbah kaping 3 nganggo susu 0,1% ing 0,1M TBS nggunakake program cuci #11 kanggo Grenier Flat 3A.
Tambah antibodi sekunder lan cuci.Tambah 50 µl antibodi sekunder tikus/tikus (diencerke 1:5000 ing susu 0,1% ing 0,1 M TBS) ing saben sumur.Inkubasi microplate kanggo 1 jam ing suhu kamar ing peteng.Piring mikro banjur dikumbah kaping 5 nganggo susu 0,1% ing 0,1 M TBS nggunakake program cuci piring Grenier Flat 5A #12.
Nambahake substrat.Tambah 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) menyang substrat basa (kanthi nambahake 2 tetes buffer, 3 tetes TMB, 2 tetes hidrogen peroksida nganti 15 ml banyu deionisasi).Siapke substrat TMB.lan vortex sadurunge digunakake).Inkubasi microplate ing suhu kamar nganti 30 menit.Ing pepeteng.
Rampungake langkah kasebut lan waca tablet.Tambah 50 µl asam sulfat 1 N kanggo saben sumur lan catat absorbansi saka 450 nganti 655 nm nggunakake ELISA reader.
Siapke 1 mg / ml solusi saka analit iki ing banyu deionized: arabinosa, rhamnose, fucose, xylose, asam galacturonic (GalA), asam glukuronat (GlcA), mannose, glukosa, galaktosa, laktosa, N-acetylmannosamine (manNAc), N-asetilglukosamin.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (standar internal).Loro standar disiapake kanthi nambahake 1 mg / mL larutan gula sing ditampilake ing Tabel 1. Sampel beku lan lyophilized ing -80 ° C. nganti kabeh banyu dibusak (biasane udakara 12-18 jam).
Tambahake 100–500 µg sampel menyang tabung tutup sekrup ing neraca analitik.Rekam jumlah sing ditambahake.Iku paling apik kanggo dissolve sampel ing konsentrasi tartamtu saka solvent lan ditambahake menyang tabung minangka aliquot Cairan.Gunakake 20 µl inositol 1 mg/ml minangka standar internal kanggo saben tabung sampel.Jumlah standar internal sing ditambahake menyang sampel kudu padha karo jumlah standar internal sing ditambahake menyang tabung standar.
Tambah 8 ml metanol anhidrat menyang vial tutup sekrup.Banjur 4 ml 3 N. larutan HCl metanol, ditutup lan digoyang.Proses iki ora nggunakake banyu.
Tambah 500 µl larutan metanol HCl 1 M menyang sampel oligosakarida lan tabung TMS standar.Sampel diinkubasi sewengi (168 jam) ing 80 ° C. ing blok termal.Garing produk metanolisis ing suhu kamar nggunakake manifold pangatusan.Tambah 200 µl MeOH lan garing maneh.Proses iki diulang kaping pindho.Tambahake 200 µl metanol, 100 µl piridin lan 100 µl anhidrida asetat ing sampel lan aduk nganti rata.Sampel diinkubasi ing suhu kamar suwene 30 menit.lan garing.Tambah 200 µl metanol lan garing maneh.
Tambah 200 µl Tri-Sil lan tabung sing ditutup panas suwene 20 menit.80 ° C, banjur adhem nganti suhu kamar.Gunakake manifold pangatusan kanggo luwih garing sampel nganti volume kira-kira 50 µl.Wigati dimangerteni manawa kita ora ngidini conto garing.
Tambah 2 ml heksana lan aduk kanthi apik kanthi vortexing.Isi ujung pipet Pasteur (5-8 mm) kanthi potongan wol kaca kanthi masang wol kaca ing ndhuwur pipet diameter 5-3/4 inci.Sampel disentrifugasi ing 3000 g suwene 2 menit.Sembarang residu sing ora larut diencerake.Keringake sampel nganti 100-150 µl.Volume kira-kira 1 μl disuntikake menyang GC-MS ing suhu awal 80 ° C lan wektu wiwitan menit 2.0 (Tabel 2).