Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing wis dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Metode imunologis lan spektrometri massa anyar kanggo analisis kompleks oligosakarida persisten ing jagung sing wis diolah nganggo AFEX. Biomassa lignoselulosa minangka alternatif lestari kanggo bahan bakar fosil lan digunakake sacara wiyar kanggo ngembangake bioteknologi kanggo produksi produk kayata panganan, pakan, bahan bakar, lan bahan kimia. Kunci teknologi kasebut yaiku pangembangan proses sing kompetitif biaya kanggo ngowahi karbohidrat kompleks sing ana ing dinding sel tanduran dadi gula prasaja kayata glukosa, xilosa, lan arabinosa. Amarga biomassa lignoselulosa bandel banget, mula kudu ngalami perawatan termokimia (kayata, pengelupasan serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ionik (IL)) lan perawatan biologis (kayata, hidrolisis enzimatik lan fermentasi mikroba) kanthi kombinasi kanggo entuk produk sing dikarepake. Nanging, nalika enzim jamur komersial digunakake ing proses hidrolisis, mung 75-85% gula sing larut yaiku monosakarida, lan 15-25% liyane yaiku oligosakarida sing larut lan ora bisa diatasi, sing ora mesthi kasedhiya kanggo mikroorganisme. Sadurunge, kita wis kasil ngisolasi lan nyuceni oligosakarida sing angel larut nggunakake kombinasi kromatografi pamisahan lan pengecualian ukuran karbon lan bumi diatom, lan uga nyelidiki sifat inhibitor enzim. Kita nemokake manawa oligosakarida sing ngemot substitusi asam uronat termetilasi tingkat polimerisasi (DP) sing luwih dhuwur luwih angel diproses nganggo campuran enzim komersial tinimbang oligosakarida DP rendah lan netral. Ing kene kita nglaporake panggunaan sawetara metode tambahan, kalebu profil glikan nggunakake antibodi monoklonal (mAbs) khusus kanggo glikan biomassa tanduran kanggo menehi ciri ikatan glikan ing dinding sel tanduran lan hidrolisat enzimatik, ionisasi desorpsi laser sing dibantu matriks, spektrometri massa wektu-penerbangan. . MALDI-TOF-MS) nggunakake puncak diagnostik informatif struktur sing dipikolehi kanthi spektroskopi sawise peluruhan sekunder ion negatif, kromatografi gas lan spektrometri massa (GC-MS) kanggo menehi ciri ikatan oligosakarida kanthi lan tanpa derivatisasi. Amarga ukuran oligosakarida sing cilik (DP 4-20), molekul-molekul iki angel digunakake kanggo pengikatan lan karakterisasi mAb. Kanggo ngatasi masalah iki, kita ngetrapake metode imobilisasi oligosakarida berbasis konjugasi biotin anyar sing kasil menehi label mayoritas oligosakarida larut DP rendah ing permukaan mikroplate, sing banjur digunakake ing sistem mAb throughput dhuwur kanggo analisis ligasi tartamtu. Metode anyar iki bakal nggampangake pangembangan uji glikome throughput dhuwur sing luwih maju ing mangsa ngarep sing bisa digunakake kanggo ngisolasi lan menehi karakterisasi oligosakarida sing ana ing biomarker kanggo tujuan diagnostik.
Biomassa lignoselulosa, sing kasusun saka bahan pertanian, kehutanan, suket, lan kayu, minangka bahan baku potensial kanggo produksi produk berbasis bio, kalebu panganan, pakan, bahan bakar, lan prekursor kimia kanggo ngasilake produk sing luwih dhuwur1. Karbohidrat (kayata selulosa lan hemiselulosa) sing ana ing dinding sel tanduran didepolimerisasi dadi monosakarida kanthi proses kimia lan biotransformasi (kayata hidrolisis enzimatik lan fermentasi mikroba). Pra-perawatan umum kalebu ekspansi serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ionik (IL), lan ledakan uap (SE), sing nggunakake kombinasi bahan kimia lan panas kanggo nyuda produksi lignoselulosa kanthi mbukak dinding sel tanduran3,4. kekakuan materi, 5. Hidrolisis enzimatik ditindakake kanthi beban padatan sing dhuwur nggunakake enzim sing ngemot karbohidrat aktif komersial (CAZymes) lan fermentasi mikroba nggunakake ragi utawa bakteri transgenik kanggo ngasilake bahan bakar lan bahan kimia berbasis bio6.
CAZyme ing enzim komersial kasusun saka campuran enzim kompleks sing kanthi sinergis misahake ikatan karbohidrat-gula kompleks kanggo mbentuk monosakarida2,7. Kaya sing wis dilapurake sadurunge, jaringan kompleks polimer aromatik lignin karo karbohidrat ndadekake dheweke angel banget diatasi, sing nyebabake konversi gula sing ora lengkap, nglumpukake 15-25% oligosakarida seks sing ora diprodhuksi sajrone hidrolisis enzimatik saka biomassa sing wis diolah. Iki minangka masalah umum karo macem-macem metode pretreatment biomassa. Sawetara alesan kanggo hambatan iki kalebu inhibisi enzim sajrone hidrolisis, utawa ora ana utawa tingkat enzim penting sing dibutuhake kanggo medhot ikatan gula ing biomassa tanduran. Ngerteni komposisi lan karakteristik struktural gula, kayata ikatan gula ing oligosakarida, bakal mbantu kita nambah konversi gula sajrone hidrolisis, nggawe proses bioteknologi kompetitif biaya karo produk sing asale saka petroleum.
Nemtokake struktur karbohidrat iku tantangan lan mbutuhake kombinasi metode kayata kromatografi cair (LC)11,12, spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR)13, elektroforesis kapiler (CE)14,15,16 lan spektrometri massa (MS)17., wolulas. Metode MS kayata spektrometri massa wektu-penerbangan kanthi desorpsi laser lan ionisasi nggunakake matriks (MALDI-TOF-MS) minangka metode serbaguna kanggo ngenali struktur karbohidrat. Bubar, tandem Disosiasi sing Diinduksi Tabrakan (CID) saka adduct ion natrium wis paling akeh digunakake kanggo ngenali sidik jari sing cocog karo posisi lampiran oligosakarida, konfigurasi anomerik, urutan, lan posisi percabangan 20, 21.
Analisis glikan minangka alat sing apik banget kanggo identifikasi ikatan karbohidrat sing jero22. Metode iki nggunakake antibodi monoklonal (mAbs) sing diarahake menyang glikan dinding sel tanduran minangka probe kanggo mangerteni ikatan karbohidrat kompleks. Luwih saka 250 mAb kasedhiya ing saindenging jagad, dirancang nglawan macem-macem oligosakarida linier lan cabang nggunakake macem-macem sakarida24. Sawetara mAb wis digunakake sacara wiyar kanggo menehi ciri struktur, komposisi, lan modifikasi dinding sel tanduran, amarga ana bedane sing signifikan gumantung saka jinis sel tanduran, organ, umur, tahap perkembangan, lan lingkungan pertumbuhan25,26. Bubar iki, metode iki wis digunakake kanggo mangerteni populasi vesikel ing sistem tanduran lan kewan lan peran masing-masing ing transportasi glikan sing ditemtokake dening penanda subselular, tahap perkembangan, utawa rangsangan lingkungan, lan kanggo nemtokake aktivitas enzimatik. Sawetara struktur glikan lan xilan sing wis diidentifikasi kalebu pektin (P), xilan (X), mannan (M), xiloglukan (XylG), glukan ikatan campuran (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomanan (GalG), asam glukuronat-arabinoksilan (GArbX) lan arabino-galaktan (ArbG)29.
Nanging, senadyan kabeh upaya riset iki, mung sawetara panliten sing fokus ing sifat akumulasi oligosakarida sajrone hidrolisis beban padatan dhuwur (HSL), kalebu pelepasan oligosakarida, owah-owahan dawa rantai oligomerik sajrone hidrolisis, macem-macem polimer DP rendah, lan kurva. distribusi 30,31,32. Sauntara kuwi, sanajan analisis glikan wis kabukten dadi alat sing migunani kanggo analisis lengkap babagan struktur glikan, angel ngevaluasi oligosakarida DP rendah sing larut ing banyu nggunakake metode antibodi. Oligosakarida DP sing luwih cilik kanthi bobot molekul kurang saka 5-10 kDa ora kaiket karo piring ELISA 33, 34 lan dicuci sadurunge tambahan antibodi.
Ing kene, kanggo pisanan, kita nduduhake uji ELISA ing piring sing dilapisi avidin nggunakake antibodi monoklonal, nggabungake prosedur biotinilasi siji langkah kanggo oligosakarida refraktori sing larut karo analisis glikome. Pendekatan kita kanggo analisis glikome divalidasi dening analisis MALDI-TOF-MS lan GC-MS adhedhasar ikatan oligosakarida komplementer nggunakake derivatisasi trimetilsilil (TMS) saka komposisi gula sing dihidrolisis. Pendekatan inovatif iki bisa dikembangake minangka metode throughput dhuwur ing mangsa ngarep lan nemokake aplikasi sing luwih akeh ing riset biomedis35.
Modifikasi pasca-translasi enzim lan antibodi, kayata glikosilasi,36 mengaruhi aktivitas biologis. Contone, owah-owahan ing glikosilasi protein serum nduweni peran penting ing arthritis inflamasi, lan owah-owahan ing glikosilasi digunakake minangka penanda diagnostik37. Macem-macem glikan wis dilapurake ing literatur sing gampang katon ing macem-macem penyakit, kalebu penyakit inflamasi kronis ing saluran pencernaan lan ati, infeksi virus, kanker ovarium, payudara, lan prostat38,39,40. Ngerteni struktur glikan nggunakake metode ELISA glikan adhedhasar antibodi bakal menehi kapercayan tambahan ing diagnosis penyakit tanpa nggunakake metode MS sing kompleks.
Panliten sadurunge nuduhake yen oligosakarida sing bandel tetep ora terhidrolisis sawise perawatan awal lan hidrolisis enzimatik (Gambar 1). Ing karya sing diterbitake sadurunge, kita ngembangake metode ekstraksi fase padat areng aktif kanggo ngisolasi oligosakarida saka hidrolisat jagung sing wis dirawat AFEX (ACSH)8. Sawise ekstraksi lan pamisahan awal, oligosakarida difraksinasi luwih lanjut kanthi kromatografi pengecualian ukuran (SEC) lan dikumpulake miturut bobot molekul. Monomer gula lan oligomer sing dibebasake saka macem-macem perawatan awal dianalisis kanthi analisis komposisi gula. Nalika mbandhingake isi oligomer gula sing dipikolehi kanthi macem-macem metode perawatan awal, anané oligosakarida sing bandel minangka masalah umum ing konversi biomassa dadi monosakarida lan bisa nyebabake penurunan asil gula paling ora 10-15% lan malah nganti 18%. AS. Metode iki digunakake kanggo produksi fraksi oligosakarida skala gedhe luwih lanjut. ACH sing diasilake lan fraksi sabanjure kanthi bobot molekul sing beda digunakake minangka bahan eksperimen kanggo karakterisasi oligosakarida ing karya iki.
Sawise perawatan awal lan hidrolisis enzimatik, oligosakarida sing persisten tetep ora terhidrolisis. Ing kene (A) minangka metode pamisahan oligosakarida ing ngendi oligosakarida diisolasi saka hidrolisat jagung sing wis diolah AFEX (ACSH) nggunakake amben karbon aktif lan lemah diatom sing dikemas; (B) Metode kanggo pamisahan oligosakarida. Oligosakarida luwih lanjut dipisahake kanthi kromatografi pengecualian ukuran (SEC); (C) Monomer lan oligomer sakarida sing dibebasake saka macem-macem perawatan awal (asam encer: DA, cairan ionik: IL lan AFEX). Kondisi hidrolisis enzimatik: pemuatan padatan dhuwur 25% (w/w) (kurang luwih 8% pemuatan glukan), hidrolisis 96 jam, pemuatan enzim komersial 20 mg/g (rasio Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) lan (D) Monomer gula lan oligomer glukosa, xilosa lan arabinosa sing dibebasake saka jagung sing wis diolah AFEX (ACS).
Analisis glikan wis kabukten dadi alat sing migunani kanggo analisis struktural glikan sing komprehensif ing ekstrak sing diisolasi saka residu biomassa padat. Nanging, sakarida sing larut ing banyu kurang diwakili nggunakake metode tradisional iki41 amarga oligosakarida kanthi bobot molekul rendah angel diimobilisasi ing piring ELISA lan dicuci sadurunge tambahan antibodi. Mulane, kanggo pengikatan lan karakterisasi antibodi, metode biotinilasi siji langkah digunakake kanggo nutupi oligosakarida sing larut lan ora patuh ing piring ELISA sing dilapisi avidin. Metode iki diuji nggunakake ACSH sing wis diprodhuksi sadurunge lan fraksi adhedhasar bobot molekul (utawa derajat polimerisasi, DP). Biotinilasi siji langkah digunakake kanggo nambah afinitas pengikatan oligosakarida kanthi nambahake biotin-LC-hidrazida menyang ujung reduksi karbohidrat (Gambar 2). Ing larutan, gugus hemiacetal ing ujung reduksi bereaksi karo gugus hidrazida biotin-LC-hidrazida kanggo mbentuk ikatan hidrazon. Ing ngarsane agen pangurang NaCNBH3, ikatan hidrazon direduksi dadi produk pungkasan biotinilasi sing stabil. Kanthi modifikasi ujung pangurang gula, pengikatan oligosakarida DP rendah menyang piring ELISA dadi bisa, lan ing panliten iki ditindakake ing piring sing dilapisi avidin nggunakake mAb sing ditargetake glikan.
Skrining antibodi monoklonal adhedhasar ELISA kanggo oligosakarida biotinilasi. Ing kene (A) biotinilasi gabungan oligosakarida lan skrining ELISA sabanjure nganggo mAbs sing ditargetake glikan ing piring sing dilapisi NeutrAvidin lan (B) nuduhake prosedur siji langkah kanggo biotinilasi produk reaksi.
Piring sing dilapisi Avidin nganggo antibodi konjugasi oligosakarida banjur ditambahake menyang antibodi primer lan sekunder lan dicuci ing medium sing sensitif marang cahya lan wektu. Sawise pengikatan antibodi rampung, tambahake substrat TMB kanggo nginkubasi piring kasebut. Reaksi kasebut pungkasane dihentikan nganggo asam sulfat. Piring sing diinkubasi dianalisis nggunakake pembaca ELISA kanggo nemtokake kekuwatan pengikatan saben antibodi kanggo ndeteksi cross-linking spesifik antibodi. Kanggo rincian lan parameter eksperimen, deleng bagean sing cocog "Bahan lan Metode".
Kita nduduhake kegunaan metode sing nembe dikembangake iki kanggo aplikasi tartamtu kanthi menehi ciri oligosakarida sing larut sing ana ing ACSH uga ing fraksi oligosakarida mentah lan murni sing diisolasi saka hidrolisat lignoselulosa. Kaya sing dituduhake ing Gambar 3, xilan sing diganti epitop sing paling umum sing diidentifikasi ing ACSH nggunakake metode uji glikome bioasilasi biasane uronik (U) utawa metiluronik (MeU) lan arabinogalactan pektik. Umume uga ditemokake ing panliten sadurunge babagan analisis glikan saka padatan sing ora dihidrolisis (UHS)43.
Deteksi epitop oligosakarida rekalsitran nggunakake antibodi monoklonal sing ditujokake menyang glikan dinding sel. Fraksi "netral" yaiku fraksi ACN lan fraksi "asam" yaiku fraksi FA. Abang sing luwih padhang ing peta panas nuduhake kandungan epitop sing luwih dhuwur, lan biru sing luwih padhang nuduhake latar mburi kosong. Nilai warna ing skala adhedhasar nilai OD mentah kanggo formulasi N=2. Epitop utama sing dikenali dening antibodi dituduhake ing sisih tengen.
Struktur non-selulosa iki ora bisa dibelah dening selulase lan hemiselulase sing paling umum ing campuran enzim komersial sing diuji, sing kalebu enzim komersial sing paling umum digunakake. Mulane, enzim tambahan anyar dibutuhake kanggo hidrolisis. Tanpa enzim aksesoris non-selulosa sing dibutuhake, ikatan non-selulosa iki nyegah konversi lengkap dadi monosakarida, sanajan polimer gula induk dihidrolisis sacara ekstensif dadi fragmen sing luwih cendhek lan dilarutake nggunakake campuran enzim komersial.
Panliten luwih lanjut babagan distribusi sinyal lan kekuwatan ikatan nuduhake yen epitop ikatan luwih murah ing fraksi gula DP dhuwur (A, B, C, DP nganti 20+) tinimbang ing fraksi DP endhek (D, E, F, DP) ing dimer) (Gambar 1). Fragmen asam luwih umum ing epitop non-selulosa tinimbang fragmen netral. Fenomena kasebut konsisten karo pola sing diamati ing panliten sadurunge, ing ngendi DP dhuwur lan gugus asam luwih tahan marang hidrolisis enzimatik. Mulane, anane epitop glikan non-selulosa lan substitusi U lan MeU bisa nyumbang banget kanggo stabilitas oligosakarida. Perlu dicathet yen efisiensi ikatan lan deteksi bisa dadi masalah kanggo oligosakarida DP endhek, utamane yen epitop kasebut minangka oligosakarida dimerik utawa trimerik. Iki bisa diuji nggunakake oligosakarida komersial kanthi dawa sing beda-beda, saben mung ngemot siji epitop sing kaiket karo mAb tartamtu.
Dadi, panggunaan antibodi spesifik struktur nuduhake jinis ikatan rekalsitran tartamtu. Gumantung saka jinis antibodi sing digunakake, pola ligasi sing cocog, lan kekuwatan sinyal sing diasilake (paling akeh lan paling sithik), enzim anyar bisa diidentifikasi lan ditambahake kanthi semi-kuantitatif menyang campuran enzim kanggo glikokonversi sing luwih lengkap. Njupuk analisis oligosakarida ACSH minangka conto, kita bisa nggawe database ikatan glikan kanggo saben bahan biomassa. Perlu dicathet ing kene yen afinitas antibodi sing beda kudu digatekake, lan yen afinitas kasebut ora dingerteni, iki bakal nggawe kesulitan tartamtu nalika mbandhingake sinyal antibodi sing beda. Kajaba iku, perbandingan ikatan glikan bisa uga paling apik antarane sampel kanggo antibodi sing padha. Ikatan sing angel iki banjur bisa digandhengake karo database CAZyme, saka ngendi kita bisa ngenali enzim, milih enzim kandidat lan nguji enzim pemecah ikatan, utawa ngembangake sistem mikroba kanggo ngekspresikan enzim kasebut kanggo digunakake ing biorefineries44.
Kanggo ngevaluasi kepiye metode imunologis nglengkapi metode alternatif kanggo nggambarake oligosakarida bobot molekul rendah sing ana ing hidrolisat lignoselulosa, kita nindakake MALDI (Gambar 4, S1-S8) lan analisis sakarida sing asale saka TMS adhedhasar GC-MS ing bagean oligosakarida panel sing padha (Gambar 5). MALDI digunakake kanggo mbandhingake apa distribusi massa molekul oligosakarida cocog karo struktur sing dikarepake. Ing gambar 4 nuduhake MC saka komponen netral ACN-A lan ACN-B. Analisis ACN-A ngonfirmasi sawetara gula pentosa wiwit saka DP 4-8 (Gambar 4) nganti DP 22 (Gambar S1), sing bobote cocog karo oligosakarida MeU-xylan. Analisis ACN-B ngonfirmasi seri pentosa lan glukoksilan karo DP 8-15. Ing materi tambahan kaya Gambar S3, peta distribusi massa gugus asam FA-C nuduhake rentang gula pentosa sing disubstitusi (Me)U kanthi DP 8-15 sing konsisten karo xilan sing disubstitusi sing ditemokake ing skrining mAb berbasis ELISA. Epitop kasebut konsisten.
Spektrum MALDI-MS saka oligosakarida sing ora tundhuk karo aturan sing larut sing ana ing ACS. Ing kene, (A) Fraksi kisaran bobot endhek ACN-A sing ngandhut oligosakarida glukuroksilan sing disubstitusi asam uronat termetilasi (DP 4-8) lan (B) oligosakarida asam uronat termetilasi ACN-B sing disubstitusi karo glukuroksilan (DP 8-15).
Analisis komposisi residu glikan saka oligosakarida refraktori. Ing kene (A) Komposisi sakarida TMS saka macem-macem fraksi oligosakarida sing dipikolehi nggunakake analisis GC-MS. (B) Struktur macem-macem gula sing asale saka TMS sing ana ing oligosakarida. ACN - fraksi asetonitril sing ngemot oligosakarida netral lan FA - fraksi asam ferulat sing ngemot oligosakarida asam.
Dudutan liyane sing menarik dijupuk saka analisis LC-MS saka fraksi oligosakarida, kaya sing dituduhake ing Gambar S9 (metode bisa dideleng ing materi tambahan elektronik). Fragmen gugus heksosa lan -OAc bola-bali diamati sajrone ligasi fraksi ACN-B. Temuan iki ora mung ngonfirmasi fragmentasi sing diamati ing analisis glikome lan MALDI-TOF, nanging uga menehi informasi anyar babagan turunan karbohidrat potensial ing biomassa lignoselulosa sing wis diolah sadurunge.
Kita uga nganalisa komposisi gula saka fraksi oligosakarida nggunakake derivatisasi gula TMS. Nggunakake GC-MS, kita nemtokake komposisi gula saraf (non-turunan) lan gula asam (GluA lan GalA) ing fraksi oligosakarida (Gambar 5). Asam glukuronat ditemokake ing komponen asam C lan D, dene asam galakturonat ditemokake ing komponen asam A lan B, loro-lorone minangka komponen DP dhuwur saka gula asam. Asil kasebut ora mung ngonfirmasi data ELISA lan MALDI kita, nanging uga konsisten karo panliten sadurunge babagan akumulasi oligosakarida. Mulane, kita percaya yen metode imunologis modern nggunakake biotinilasi oligosakarida lan skrining ELISA sabanjure cukup kanggo ndeteksi oligosakarida rekalsitran sing larut ing macem-macem sampel biologis.
Amarga metode skrining mAb berbasis ELISA wis divalidasi nganggo pirang-pirang metode sing beda, kita pengin njelajah luwih lanjut potensi metode kuantitatif anyar iki. Rong oligosakarida komersial, oligosakarida xylohexakarida (XHE) lan 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriosa (A2XX), dituku lan diuji nggunakake pendekatan mAb anyar sing nargetake glikan dinding sel. Gambar 6 nuduhake korelasi linier antarane sinyal pengikatan biotinilasi lan konsentrasi log konsentrasi oligosakarida, sing nuduhake model adsorpsi Langmuir sing bisa ditindakake. Antarane mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, lan CCRC-M151 berkorelasi karo XHE, lan CCRC-M108, CCRC-M109, lan LM11 berkorelasi karo A2XX sajrone kisaran 1 nm nganti 100 nano. Amarga kasedhiyan antibodi sing winates sajrone eksperimen, eksperimen winates ditindakake karo saben konsentrasi oligosakarida. Perlu dicathet ing kene yen sawetara antibodi nanggepi kanthi beda banget marang oligosakarida sing padha minangka substrat, amarga antibodi kasebut kaiket karo epitop sing rada beda lan bisa duwe afinitas pengikatan sing beda banget. Mekanisme lan implikasi saka identifikasi epitop sing akurat bakal luwih kompleks nalika pendekatan mAb anyar diterapake ing sampel nyata.
Rong oligosakarida komersial digunakake kanggo nemtokake rentang deteksi macem-macem mAb targeting glikan. Ing kene, korelasi linier karo konsentrasi log konsentrasi oligosakarida nuduhake pola adsorpsi Langmuir kanggo (A) XHE karo mAb lan (B) A2XX karo mAb. Epitop sing cocog nuduhake struktur oligosakarida komersial sing digunakake minangka substrat ing uji coba.
Panggunaan antibodi monoklonal sing ditargetake glikan (analisis glikokomik utawa skrining mAb adhedhasar ELISA) minangka alat sing kuat kanggo karakterisasi sing jero saka sebagian besar glikan dinding sel utama sing mbentuk biomassa tanduran. Nanging, analisis glikan klasik mung menehi ciri glikan dinding sel sing luwih gedhe, amarga sebagian besar oligosakarida ora diimobilisasi kanthi efisien ing piring ELISA. Ing panliten iki, jagung sing wis diolah sadurunge AFEX dihidrolisis kanthi enzimatik kanthi kandungan padatan sing dhuwur. Analisis gula digunakake kanggo nemtokake komposisi karbohidrat dinding sel rekalsitran ing hidrolisat. Nanging, analisis mAb saka oligosakarida sing luwih cilik ing hidrolisat kurang digatekake, lan alat tambahan dibutuhake kanggo ngimobilisasi oligosakarida kanthi efektif ing piring ELISA.
Kita nglaporake ing kene metode imobilisasi oligosakarida sing anyar lan efisien kanggo skrining mAb kanthi nggabungake biotinilasi oligosakarida banjur skrining ELISA ing piring sing dilapisi NeutrAvidin™. Oligosakarida biotinilasi sing diimobilisasi nuduhake afinitas sing cukup kanggo antibodi kanggo ngaktifake deteksi oligosakarida sing bandel kanthi cepet lan efisien. Analisis komposisi oligosakarida sing bandel iki adhedhasar spektrometri massa ngonfirmasi asil saka pendekatan anyar iki kanggo imunoskrining. Mangkono, panliten kasebut nuduhake manawa kombinasi biotinilasi oligosakarida lan skrining ELISA karo antibodi monoklonal sing ditargetake glikan bisa digunakake kanggo ndeteksi ikatan silang ing oligosakarida lan bisa diterapake kanthi wiyar ing panliten biokimia liyane sing menehi ciri struktur oligosakarida.
Metode profiling glikan berbasis biotin iki minangka laporan pertama sing bisa nyelidiki ikatan karbohidrat rekalsitran saka oligosakarida sing larut ing biomassa tanduran. Iki mbantu mangerteni kenapa sawetara bagean biomassa angel banget nalika produksi biofuel. Metode iki ngisi kesenjangan penting ing metode analisis glikome lan ngembangake aplikasine menyang macem-macem substrat sing ngluwihi oligosakarida tanduran. Ing mangsa ngarep, kita bisa uga nggunakake robotika kanggo biotinilasi lan nggunakake metode sing wis dikembangake kanggo analisis throughput dhuwur saka sampel nggunakake ELISA.
Jerami jagung (CS) sing ditandur saka wiji hibrida Pioneer 33A14 dipanen ing taun 2010 saka Kramer Farms ing Ray, Colorado. Kanthi idin saka sing duwe lahan, biomassa iki bisa digunakake kanggo riset. Sampel disimpen garing kanthi kelembapan < 6% ing kantong zip-lock ing suhu ruangan. Sampel disimpen garing kanthi kelembapan < 6% ing kantong zip-lock ing suhu ruangan. Образцы хранились сухими при влажности < 6% ing пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Sampel disimpen garing ing kelembapan <6% ing kantong sing nganggo resleting ing suhu kamar.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Sampel disimpen ing kantong resleting ing suhu ruangan kanthi kelembapan <6%.Panliten iki tundhuk karo pedoman lokal lan nasional. Analisis komposisi ditindakake nggunakake protokol NREL. Komposisi kasebut ditemokake ngandhut 31,4% glukan, 18,7% xilan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktan, 2,2% asetil, 14,3% lignin, 1,7% protein lan 13,4% awu.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) minangka campuran kompleks selulase, β-glukosidase lan Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) saka Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), campuran kompleks enzim pendegradasi pektin, disumbangake dening DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Konsentrasi protein enzim ditemtokake kanthi ngira-ngira kandungan protein (lan ngurangi kontribusi nitrogen non-protein) nggunakake analisis nitrogen Kjeldahl (metode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Tanah diatom 545 dituku saka EMD Millipore (Billerica, MA). Karbon aktif (DARCO, granul 100 mesh), Avicel (PH-101), beech xylan, lan kabeh bahan kimia liyane dituku saka Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Pretreatment AFEX ditindakake ing GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Pretreatment ditindakake ing suhu 140°C sajrone 15 menit. Wektu tinggal 46 menit kanthi rasio 1:1 amonia anhidrat karo biomassa kanthi pemuatan 60% (w/w) ing reaktor batch benchtop stainless steel (Parr Instruments Company). Butuh wektu 30 menit. Reaktor digawa menyang suhu 140°C lan amonia cepet dirilis, saengga biomassa cepet bali menyang suhu kamar. Komposisi AFEX pre-treated corn stover (ACS) padha karo corn stover sing ora diolah (UT-CS).
Padatan dhuwur ACSH 25% (w/w) (kurang luwih 8% muatan dekstran) disiapake minangka bahan wiwitan kanggo produksi oligosakarida skala gedhe. Hidrolisis enzimatik ACS ditindakake nggunakake campuran enzim komersial kalebu Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (ing biomassa sing wis diolah), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan, lan Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg protein/g dekstran. Hidrolisis enzimatik ditindakake ing bioreaktor 5 liter kanthi volume kerja 3 liter, pH 4,8, 50°C lan 250 rpm. Sawise hidrolisis sajrone 96 jam, hidrolisat dikumpulake kanthi sentrifugasi ing 6000 rpm sajrone 30 menit lan banjur ing 14000 rpm sajrone 30 menit kanggo mbusak padatan sing ora dihidrolisis. Hidrolisat kasebut banjur difiltrasi steril liwat gelas saring 0,22 mm. Hidrolisat sing wis disaring disimpen ing botol steril ing suhu 4° C banjur difraksinasi ing karbon.
Analisis komposisi sampel biomassa adhedhasar ekstrak miturut prosedur analisis laboratorium NREL: persiapan sampel kanggo analisis komposisi (NREL/TP-510-42620) lan panentu karbohidrat struktural lan lignin ing biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analisis oligosakarida saka aliran hidrolisat ditindakake ing skala 2 ml nggunakake metode hidrolisis asam berbasis autoklaf. Campur sampel hidrolisat karo 69,7 µl asam sulfat 72% ing tabung kultur tutup ulir 10 ml lan inkubasi sajrone 1 jam ing meja ing suhu 121 °C, adhemake ing es lan saring menyang botol kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Konsentrasi oligosakarida ditemtokake kanthi ngurangi konsentrasi monosakarida ing sampel sing ora dihidrolisis saka konsentrasi gula total ing sampel sing dihidrolisis asam.
Konsentrasi glukosa, xilosa, lan arabinosa ing biomassa sing dihidrolisis asam dianalisis nggunakake sistem Shimadzu HPLC sing dilengkapi autosampler, pemanas kolom, pompa isokratik, lan detektor indeks bias ing kolom Bio-Rad Aminex HPX-87H. Kolom kasebut dijaga ing suhu 50°C lan dielusi nganggo 0,6 ml/menit 5 mM H2SO4 ing banyu.
Supernatan hidrolisat diencerake lan dianalisis kandungan monomer lan oligosakarida. Gula monomerik sing dipikolehi sawise hidrolisis enzimatik dianalisis nganggo HPLC sing dilengkapi kolom Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P lan kolom pelindung abu. Suhu kolom dijaga ing 80°C, banyu digunakake minangka fase gerak kanthi laju aliran 0,6 ml/menit. Oligosakarida ditemtokake kanthi hidrolisis ing asam encer ing suhu 121°C miturut metode sing diterangake ing ref. 41, 48, 49.
Analisis sakarida ditindakake ing residu biomassa mentah, sing wis diolah sadurunge AFEX lan kabeh residu biomassa sing ora dihidrolisis (kalebu produksi ekstrak dinding sel serial lan skrining mAb) nggunakake prosedur sing wis diterangake sadurunge 27, 43, 50, 51. Kanggo analisis glikome, residu bahan dinding sel tanduran sing ora larut ing alkohol disiapake saka residu biomassa lan diekstraksi serial nganggo reagen sing saya agresif kayata amonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM lan 0,5% w/v), CON. (1M lan 4M, loro-lorone nganggo 1% w/v natrium borohidrida) lan asam klorit kaya sing wis diterangake sadurunge 52,53. Ekstrak kasebut banjur diekstrak nganggo ELISA nglawan panel kompleks mAb50 sing diarahake menyang glikan dinding sel, lan reaksi pengikatan mAb ditampilake minangka peta panas. mAb sing nargetake glikan dinding sel tanduran dituku saka stok laboratorium (CCRC, seri JIM lan MAC).
Biotinilasi oligosakarida siji langkah. Konjugasi karbohidrat karo biotin-LC-hidrazida ditindakake nggunakake prosedur ing ngisor iki. Biotin-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) dilarutake ing dimetil sulfoksida (DMSO, 70 μl) kanthi diaduk lan dipanasake kanthi kuat ing suhu 65° C suwene 1 menit. Asam asetat glasial (30 µl) ditambahake lan campuran kasebut diwutahake ing natrium sianoborohidrida (6,4 mg/100 µmol) lan dilarutake kanthi lengkap sawise dipanasake ing suhu 65° C suwene udakara 1 menit. Banjur, saka 5 nganti 8 μl campuran reaksi ditambahake menyang oligosakarida sing wis garing (1-100 nmol) kanggo entuk kelebihan molar 10 kali lipat utawa luwih saka label ing ndhuwur ujung reduksi. Reaksi kasebut ditindakake ing suhu 65°C suwene 2 jam, sawise iku sampel langsung dimurnèkaké. Ora ana natrium sianoborohidrida sing digunakake ing eksperimen pelabelan tanpa reduksi, lan sampel direaksikake ing suhu 65° C sajrone 2,5 jam.
Pelapisan ELISA lan pencucian sampel oligosakarida biotinilasi. 25 μl sampel biotinilasi (100 μl saben sampel pekat sing diencerake ing 5 ml larutan buffer Tris 0,1 M (TBS)) ditambahake ing saben sumur piring sing dilapisi avidin. Sumur kontrol dilapisi karo 50 μl biotin kanthi konsentrasi 10 μg/ml ing 0,1 M TBS. Banyu deionisasi digunakake minangka lapisan kanggo pangukuran kosong. Tablet diinkubasi sajrone 2 jam ing suhu kamar ing peteng. Cuci piring kaping 3 nganggo susu skim 0,1% ing 0,1 M TBS nggunakake program no. 11 kanggo Grenier flat 3A.
Penambahan lan pencucian antibodi primer. Tambahkan 40 µl antibodi primer ke setiap sumuran. Inkubasi microplate selama 1 jam pada suhu ruangan dalam keadaan gelap. Pelat-pelat tersebut kemudian dicuci 3 kali dengan susu 0,1% dalam 0,1M TBS menggunakan program pencucian #11 untuk Grenier Flat 3A.
Tambahna antibodi sekunder lan wisuh. Tambahna 50 µl antibodi sekunder tikus/tikus (diencerake 1:5000 ing susu 0,1% ing TBS 0,1 M) menyang saben sumur. Inkubasi microplate sajrone 1 jam ing suhu ruangan ing panggonan sing peteng. Microplate banjur dikumbah kaping 5 nganggo susu 0,1% ing TBS 0,1 M nggunakake program cuci piring Grenier Flat 5A #12.
Nambahake substrat. Tambahake 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) menyang substrat dasar (kanthi nambahake 2 tetes buffer, 3 tetes TMB, 2 tetes hidrogen peroksida menyang 15 ml banyu deionisasi). Siapke substrat TMB. lan vortex sadurunge digunakake). Inkubasi microplate ing suhu kamar suwene 30 menit. Ing peteng.
Rampungake langkah iki lan wacanen tablet kasebut. Tambahna 50 µl asam sulfat 1 N menyang saben sumur lan cathet absorbansi saka 450 nganti 655 nm nggunakake pembaca ELISA.
Siapke larutan 1 mg/ml saka analit iki ing banyu deionisasi: arabinosa, rhamnosa, fukosa, xilosa, asam galakturonat (GalA), asam glukuronat (GlcA), manosa, glukosa, galaktosa, laktosa, N-asetilmannosamina (manNAc), N-asetilglukosamin (glcNAc), N-asetilgalaktosamin (galNAc), inositol (standar internal). Rong standar disiapake kanthi nambahake larutan gula 1 mg/mL sing dituduhake ing Tabel 1. Sampel dibekukan lan diliofilisasi ing suhu -80° C nganti kabeh banyu ilang (biasane udakara 12-18 jam).
Tambahna 100–500 µg sampel menyang tabung tutup ulir ing neraca analitik. Cathet jumlah sing ditambahake. Paling apik yaiku nglarutake sampel ing konsentrasi pelarut tartamtu lan ditambahake menyang tabung minangka alikuot cair. Gunakake 20 µl inositol 1 mg/ml minangka standar internal kanggo saben tabung sampel. Jumlah standar internal sing ditambahake menyang sampel kudu padha karo jumlah standar internal sing ditambahake menyang tabung standar.
Tambahna 8 ml metanol anhidrat menyang botol tutup ulir. Banjur tambahna 4 ml larutan metanol HCl 3 N, tutup lan kocok. Proses iki ora nggunakake banyu.
Tambahna 500 µl larutan metanol 1 M menyang sampel oligosakarida lan tabung TMS standar. Sampel diinkubasi sewengi (168 jam) ing suhu 80° C. ing blok termal. Garingna produk metanolisis ing suhu kamar nggunakake manifold pangatusan. Tambahna 200 µl MeOH lan garingna maneh. Proses iki diulang kaping pindho. Tambahna 200 µl metanol, 100 µl piridin lan 100 µl anhidrida asetat menyang sampel lan aduk rata. Sampel diinkubasi ing suhu kamar suwene 30 menit. lan dikeringake. Tambahna 200 µl metanol lan garingna maneh.
Tambahna 200 µl Tri-Sil lan panasna tabung sing ditutup suwene 20 menit. 80°C, banjur adhemna nganti suhu ruangan. Gunakake manifold pangatusan kanggo ngeringake sampel nganti volume kira-kira 50 µl. Penting kanggo dicathet yen kita ora ngidini sampel garing kanthi sampurna.
Tambahna 2 ml heksana lan aduk rata nganggo vortex. Isi pucuk pipet Pasteur (5-8 mm) nganggo potongan wol kaca kanthi masang wol kaca ing ndhuwur pipet diameter 5-3/4 inci. Sampel disentrifugasi ing 3000 g sajrone 2 menit. Residu sing ora larut bakal diendapkan. Garingake sampel nganti 100-150 µl. Volume kira-kira 1 μl disuntikake menyang GC-MS ing suhu awal 80 °C lan wektu awal 2,0 menit (Tabel 2).