Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
Nous mètodes immunològics i espectromètrics de masses per a l'anàlisi complexa d'oligosacàrids persistents en estufes de blat de moro pretractades amb AFEX.La biomassa lignocel·lulòsica és una alternativa sostenible als combustibles fòssils i s'utilitza àmpliament per desenvolupar biotecnologies per a la producció de productes com ara aliments, pinsos, combustibles i productes químics.La clau d'aquestes tecnologies és el desenvolupament de processos competitius en costos per convertir els hidrats de carboni complexos presents a les parets cel·lulars de les plantes en sucres simples com la glucosa, la xilosa i l'arabinosa.Com que la biomassa lignocel·lulòsica és molt tossuda, s'ha de sotmetre a tractaments termoquímics (p. ex., exfoliació de fibres d'amoníac (AFEX), àcids diluïts (DA), líquids iònics (IL)) i tractaments biològics (p. ex., hidròlisi enzimàtica i fermentació microbiana) en combinació per obtenir el producte desitjat..Tanmateix, quan s'utilitzen enzims fúngics comercials en el procés d'hidròlisi, només el 75-85% dels sucres solubles formats són monosacàrids, i el 15-25% restant són oligosacàrids solubles i intractables, que no sempre estan disponibles per als microorganismes.Anteriorment, hem aïllat i purificat amb èxit oligosacàrids solubles solubles mitjançant una combinació de separació de carboni i terra de diatomeas i cromatografia d'exclusió de mida, i també hem investigat les seves propietats inhibidores d'enzims.Hem trobat que els oligosacàrids que contenen substitucions d'àcid urònic metilats amb un grau més elevat de polimerització (DP) són més difícils de processar amb barreges d'enzims comercials que els oligosacàrids neutres i de baix DP.Aquí informem de l'ús de diversos mètodes addicionals, inclòs el perfil de glicans mitjançant anticossos monoclonals (mAbs) específics dels glicans de biomassa vegetal per caracteritzar els enllaços de glicans a les parets cel·lulars de les plantes i hidrolitzats enzimàtics, ionització per desorció làser assistida per matriu, espectrometria de masses en temps de vol..MALDI-TOF-MS) utilitza pics de diagnòstic informatius sobre l'estructura obtinguts per espectroscòpia després de la desintegració secundària d'ions negatius, cromatografia de gasos i espectrometria de masses (GC-MS) per caracteritzar els enllaços d'oligosacàrids amb i sense derivatització.A causa de la petita mida dels oligosacàrids (DP 4-20), aquestes molècules són difícils d'utilitzar per a la unió i caracterització de mAb.Per superar aquest problema, vam aplicar un nou mètode d'immobilització d'oligosacàrids basat en la conjugació de biotina que va etiquetar amb èxit la majoria d'oligosacàrids solubles en DP baix a la superfície de la microplaca, que després es va utilitzar en un sistema mAb d'alt rendiment per a l'anàlisi de lligament específic.Aquest nou mètode facilitarà el desenvolupament d'assajos de glicom d'alt rendiment més avançats en el futur que es puguin utilitzar per aïllar i caracteritzar oligosacàrids presents en biomarcadors amb finalitats diagnòstiques.
La biomassa lignocel·lulòsica, composta per materials agrícoles, forestals, herba i llenyosos, és una matèria primera potencial per a la producció de productes de base biològica, inclosos aliments, pinsos, combustibles i precursors químics per produir productes de major valor1.Els hidrats de carboni (com la cel·lulosa i l'hemicel·lulosa) presents a les parets cel·lulars de les plantes es despolimereixen en monosacàrids mitjançant processament químic i biotransformació (com la hidròlisi enzimàtica i la fermentació microbiana).Els pretractaments comuns inclouen l'expansió de la fibra d'amoníac (AFEX), l'àcid diluït (DA), el líquid iònic (IL) i l'explosió de vapor (SE), que utilitzen una combinació de productes químics i calor per reduir la producció de lignocel·lulosa obrint les parets cel·lulars de les plantes3,4.tossuderia de la matèria, 5. La hidròlisi enzimàtica es porta a terme amb una elevada càrrega de sòlids mitjançant enzims comercials que contenen carbohidrats actius (CAZymes) i fermentació microbiana mitjançant llevats o bacteris transgènics per produir combustibles i productes químics de base biològica 6 .
Els CAZymes dels enzims comercials es componen d'una barreja complexa d'enzims que escinden de manera sinèrgica els enllaços complexos d'hidrats de carboni-sucre per formar monosacàrids2,7.Com hem informat anteriorment, la complexa xarxa de polímers aromàtics de lignina amb hidrats de carboni els fa molt intractables, la qual cosa condueix a una conversió incompleta del sucre, acumulant un 15-25% d'oligosacàrids sexuals que no es produeixen durant la hidròlisi enzimàtica de la biomassa pretractada.Aquest és un problema comú amb diversos mètodes de pretractament de biomassa.Alguns motius d'aquest coll d'ampolla inclouen la inhibició enzimàtica durant la hidròlisi, o l'absència o els baixos nivells d'enzims essencials essencials necessaris per trencar els enllaços de sucre en la biomassa vegetal.Comprendre la composició i les característiques estructurals dels sucres, com ara els enllaços de sucre dels oligosacàrids, ens ajudarà a millorar la conversió del sucre durant la hidròlisi, fent que els processos biotecnològics siguin competitius en costos amb els productes derivats del petroli.
Determinar l'estructura dels hidrats de carboni és un repte i requereix una combinació de mètodes com ara la cromatografia líquida (LC)11,12, l'espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN)13, l'electroforesi capil·lar (CE)14,15,16 i l'espectrometria de masses (MS)17.,divuit anys.Els mètodes MS com l'espectrometria de masses en temps de vol amb desorció làser i ionització mitjançant una matriu (MALDI-TOF-MS) són un mètode versàtil per identificar estructures de carbohidrats.Recentment, la MS en tàndem de dissociació induïda per col·lisió (CID) d'aductes d'ions de sodi s'ha utilitzat més àmpliament per identificar empremtes dactilars corresponents a posicions d'unió d'oligosacàrids, configuracions anomèriques, seqüències i posicions de ramificació 20, 21 .
L'anàlisi de glicans és una eina excel·lent per a la identificació en profunditat dels enllaços de carbohidrats22.Aquest mètode utilitza anticossos monoclonals (mAbs) dirigits al glicà de la paret cel·lular de les plantes com a sondes per entendre els enllaços complexos de carbohidrats.Hi ha més de 250 mAb disponibles a tot el món, dissenyats contra diversos oligosacàrids lineals i ramificats mitjançant diversos sacàrids24.Diversos mAb s'han utilitzat àmpliament per caracteritzar l'estructura, la composició i les modificacions de la paret cel·lular vegetal, ja que hi ha diferències significatives segons el tipus de cèl·lula vegetal, l'òrgan, l'edat, l'etapa de desenvolupament i l'entorn de creixement25,26.Més recentment, aquest mètode s'ha utilitzat per comprendre les poblacions de vesícules en sistemes vegetals i animals i els seus respectius papers en el transport de glicans determinats per marcadors subcel·lulars, etapes de desenvolupament o estímuls ambientals, i per determinar l'activitat enzimàtica.Algunes de les diferents estructures de glicans i xilans que s'han identificat inclouen pectina (P), xilà (X), manà (M), xiloglucans (XylG), glucans d'enllaç mixt (MLG), arabinoxilà (ArbX), galactomanan (GalG), àcid glucurònic-arabinoxilà (GArbX) i arabino-Ggalactan (ArbX)2 (ArbX)2.
Tanmateix, malgrat tots aquests esforços d'investigació, només uns quants estudis s'han centrat en la naturalesa de l'acumulació d'oligosacàrids durant la hidròlisi d'alta càrrega de sòlids (HSL), incloent l'alliberament d'oligosacàrids, els canvis de longitud de la cadena oligomèrica durant la hidròlisi, diversos polímers de baix DP i les seves corbes.distribucions 30,31,32.Mentrestant, tot i que l'anàlisi de glicans ha demostrat ser una eina útil per a una anàlisi exhaustiva de l'estructura dels glicans, és difícil avaluar els oligosacàrids de baix DP solubles en aigua mitjançant mètodes d'anticossos.Els oligosacàrids DP més petits amb un pes molecular inferior a 5-10 kDa no s'uneixen a les plaques ELISA 33, 34 i es renten abans de l'addició d'anticossos.
Aquí, per primera vegada, demostrem un assaig ELISA en plaques recobertes d'avidina mitjançant anticossos monoclonals, combinant un procediment de biotinilació d'un sol pas per a oligosacàrids refractaris solubles amb anàlisi de glicoma.El nostre enfocament de l'anàlisi del glicom es va validar mitjançant l'anàlisi basada en MALDI-TOF-MS i GC-MS d'enllaços d'oligosacàrids complementaris mitjançant derivatització de trimetilsilil (TMS) de composicions de sucre hidrolitzat.Aquest enfocament innovador es pot desenvolupar com a mètode d'alt rendiment en el futur i trobar una aplicació més àmplia en la investigació biomèdica35.
Les modificacions post-traduccionals d'enzims i anticossos, com la glicosilació36, afecten la seva activitat biològica.Per exemple, els canvis en la glicosilació de les proteïnes sèriques tenen un paper important en l'artritis inflamatòria, i els canvis en la glicosilació s'utilitzen com a marcadors diagnòstics37.A la literatura s'ha informat que diversos glicans apareixen fàcilment en una varietat de malalties, incloses malalties inflamatòries cròniques del tracte gastrointestinal i del fetge, infeccions víriques, càncers d'ovari, de mama i de pròstata38,39,40.Comprendre l'estructura dels glicans mitjançant mètodes ELISA de glicans basats en anticossos proporcionarà confiança addicional en el diagnòstic de malalties sense l'ús de mètodes complexos d'EM.
El nostre estudi anterior va demostrar que els oligosacàrids tossuts es van mantenir sense hidrolitzar després del pretractament i la hidròlisi enzimàtica (figura 1).En el nostre treball publicat anteriorment, vam desenvolupar un mètode d'extracció en fase sòlida de carbó activat per aïllar oligosacàrids d'hidrolitzat de blat de moro pretractat amb AFEX (ACSH)8.Després de l'extracció i separació inicials, els oligosacàrids es van fraccionar encara més mitjançant cromatografia d'exclusió de mida (SEC) i es van recollir per ordre de pes molecular.Els monòmers i oligòmers de sucre alliberats de diversos pretractaments es van analitzar mitjançant l'anàlisi de la composició del sucre.Quan es compara el contingut d'oligòmers de sucre obtinguts per diversos mètodes de pretractament, la presència d'oligosacàrids tossuts és un problema comú en la conversió de biomassa en monosacàrids i pot provocar una reducció del rendiment de sucre d'almenys un 10-15% i fins i tot fins a un 18%.NOSALTRES.Aquest mètode s'utilitza per a la producció a gran escala de fraccions d'oligosacàrids.L'ACH resultant i les seves fraccions posteriors amb diferents pesos moleculars es van utilitzar com a material experimental per a la caracterització d'oligosacàrids en aquest treball.
Després del pretractament i la hidròlisi enzimàtica, els oligosacàrids persistents es van mantenir sense hidrolitzar.Aquí (A) hi ha un mètode de separació d'oligosacàrids en què els oligosacàrids s'aïllen d'hidrolitzat de blat de moro (ACSH) pretractat amb AFEX mitjançant un llit ple de carbó activat i terra de diatomeas;(B) Mètode de separació d'oligosacàrids.Els oligosacàrids es van separar encara més mitjançant cromatografia d'exclusió de mida (SEC);(C) Monòmers i oligòmers de sacàrids alliberats de diversos pretractaments (àcid diluït: DA, líquid iònic: IL i AFEX).Condicions d'hidròlisi enzimàtica: alta càrrega de sòlids del 25% (p/p) (aproximadament un 8% de càrrega de glucà), hidròlisi de 96 hores, càrrega enzimàtica comercial de 20 mg/g (proporció Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) i (D) Monòmers de sucre i oligòmers de glucosa, alliberament de blat de moro i AF alliberat de xilosa d'Arabinosa.
L'anàlisi de glicans ha demostrat ser una eina útil per a una anàlisi estructural integral dels glicans en extractes aïllats de residus de biomassa sòlida.Tanmateix, els sacàrids solubles en aigua estan poc representats mitjançant aquest mètode tradicional41 perquè els oligosacàrids de baix pes molecular són difícils d'immobilitzar a les plaques ELISA i es renten abans de l'addició d'anticossos.Per tant, per a la unió i caracterització d'anticossos, es va utilitzar un mètode de biotinilació d'un sol pas per recobrir oligosacàrids solubles i no compatibles en plaques ELISA recobertes d'avidina.Aquest mètode es va provar amb la nostra ACSH produïda prèviament i una fracció basada en el seu pes molecular (o grau de polimerització, DP).La biotinilació d'un sol pas es va utilitzar per augmentar l'afinitat d'unió dels oligosacàrids afegint biotina-LC-hidrazida a l'extrem reductor del carbohidrat (Fig. 2).En solució, el grup hemiacetal de l'extrem reductor reacciona amb el grup hidrazida de la biotina-LC-hidrazida per formar un enllaç hidrazona.En presència de l'agent reductor NaCNBH3, l'enllaç hidrazona es redueix a un producte final biotinilat estable.Amb la modificació de l'extrem reductor de sucre, es va fer possible la unió d'oligosacàrids de baix DP a plaques ELISA, i en el nostre estudi això es va fer en plaques recobertes d'avidina mitjançant mAbs dirigits a glicans.
Cribratge d'anticossos monoclonals basat en ELISA per a oligosacàrids biotinilats.Aquí (A) la biotinilació combinada d'oligosacàrids i el posterior cribratge ELISA amb mAbs dirigits a glicans en plaques recobertes de NeutrAvidin i (B) mostra un procediment d'un sol pas per a la biotinilació dels productes de la reacció.
A continuació, es van afegir plaques recobertes d'avidina amb anticossos conjugats amb oligosacàrids als anticossos primaris i secundaris i es van rentar en un medi sensible a la llum i al temps.Un cop completada la unió d'anticossos, afegiu substrat TMB per incubar la placa.Finalment, la reacció es va aturar amb àcid sulfúric.Les plaques incubades es van analitzar mitjançant un lector ELISA per determinar la força d'unió de cada anticòs per detectar la reticulació específica d'anticossos.Per obtenir detalls i paràmetres de l'experiment, vegeu la secció corresponent "Materials i mètodes".
Demostrem la utilitat d'aquest mètode recentment desenvolupat per a aplicacions específiques caracteritzant els oligosacàrids solubles presents en ACSH, així com en fraccions d'oligosacàrids bruts i purificats aïllades d'hidrolisats lignocel·lulòsics.Com es mostra a la figura 3, els xilans substituïts per epítops més comuns identificats en ACSH mitjançant mètodes d'assaig de glicoma bioacil·lat solen ser els arabinogalactans urònics (U) o metilurònics (MeU) i pèctics.La majoria d'ells també es van trobar en el nostre estudi anterior sobre l'anàlisi de glicans de sòlids no hidrolitzats (UHS)43.
Detecció d'epítops d'oligosacàrids recalcitrants mitjançant un anticòs monoclonal dirigit al glicà de la paret cel·lular.La fracció "neutre" és la fracció ACN i la fracció "àcida" és la fracció FA.Els vermells més brillants del mapa de calor indiquen un contingut d'epítop més alt, i els blaus més brillants indiquen un fons en blanc.Els valors de color a l'escala es basen en valors de DO en brut per a les formulacions N=2.A la dreta es mostren els principals epítops reconeguts pels anticossos.
Aquestes estructures no cel·lulosa no es van poder escindir per les cel·lulases i hemicel·lulases més comunes a la barreja d'enzims comercials provada, que inclou els enzims comercials més utilitzats.Per tant, es necessiten nous enzims auxiliars per a la seva hidròlisi.Sense els enzims accessoris no cel·lulosos necessaris, aquests enllaços no cel·lulosos impedeixen la conversió completa a monosacàrids, fins i tot si els seus polímers de sucre parentals s'hidrolitzen àmpliament en fragments més curts i es dissolen mitjançant mescles d'enzims comercials.
Un estudi addicional de la distribució del senyal i la seva força d'unió va demostrar que els epítops d'unió eren més baixos en les fraccions de sucre amb DP alt (A, B, C, DP fins a 20+) que en les fraccions de DP baixes (D, E, F, DP) en dímers) (Fig. 1).Els fragments àcids són més comuns en epítops no cel·lulosos que els fragments neutres.Aquests fenòmens són coherents amb el patró observat en el nostre estudi anterior, on els fragments de DP i àcids elevats eren més resistents a la hidròlisi enzimàtica.Per tant, la presència d'epítops de glicans no cel·lulosos i substitucions d'U i MeU pot contribuir en gran mesura a l'estabilitat dels oligosacàrids.Cal tenir en compte que l'eficiència d'unió i detecció pot ser problemàtica per als oligosacàrids de baix DP, especialment si l'epítop és un oligosacàrid dimèric o trimèric.Això es pot provar mitjançant oligosacàrids comercials de diferents longituds, cadascun conté només un epítop que s'uneix a un mAb específic.
Així, l'ús d'anticossos específics de l'estructura va revelar certs tipus d'enllaços recalcitrants.Depenent del tipus d'anticossos utilitzat, del patró de lligament adequat i de la força del senyal que produeix (més i menys abundant), es poden identificar nous enzims i afegir-los de manera semiquantitativa a la barreja d'enzims per obtenir una glicoconversió més completa.Prenent com a exemple l'anàlisi dels oligosacàrids ACSH, podem crear una base de dades d'enllaços de glicans per a cada material de biomassa.Cal tenir en compte aquí que s'ha de tenir en compte la diferent afinitat dels anticossos i, si es desconeix la seva afinitat, això generarà certes dificultats a l'hora de comparar els senyals de diferents anticossos.A més, la comparació dels enllaços de glicans pot funcionar millor entre mostres per al mateix anticòs.Aquests enllaços obstinats es poden enllaçar a la base de dades CAZyme, a partir de la qual podem identificar enzims, seleccionar enzims candidats i provar enzims que trenquen enllaços, o desenvolupar sistemes microbians per expressar aquests enzims per utilitzar-los en biorefineries44.
Per avaluar com els mètodes immunològics complementen els mètodes alternatius per caracteritzar els oligosacàrids de baix pes molecular presents en hidrolitzats lignocel·lulòsics, vam realitzar MALDI (Fig. 4, S1-S8) i anàlisi de sacàrids derivats de TMS basats en GC-MS al mateix panell (Fig. 5) part d'oligosacàrids.MALDI s'utilitza per comparar si la distribució massiva de les molècules d'oligosacàrids coincideix amb l'estructura prevista.A la fig.La figura 4 mostra el MC dels components neutres ACN-A i ACN-B.L'anàlisi ACN-A va confirmar una gamma de sucres de pentosa que van des del DP 4-8 (Fig. 4) fins al DP 22 (Fig. S1), els pesos dels quals corresponen als oligosacàrids de MeU-xilan.L'anàlisi ACN-B va confirmar la sèrie de pentoses i glucoxilans amb DP 8-15.En material suplementari com la figura S3, els mapes de distribució de massa de fraccions àcides FA-C mostren un rang de sucres pentoses substituïts (Me) U amb un DP de 8-15 que són coherents amb els xilans substituïts que es troben en el cribratge de mAb basat en ELISA.Els epítops són consistents.
Espectre MALDI-MS d'oligosacàrids solubles no compatibles presents a l'ACS.Aquí, (A) fraccions de rang de baix pes ACN-A que contenen oligosacàrids de glucuroxilà substituïts amb àcid urònic metilat (DP 4-8) i (B) xilà ACN-B i oligosacàrids d'àcid urònic metilat substituïts per glucuroxilà (DP 8-15).
Anàlisi de la composició del residu de glicà dels oligosacàrids refractaris.Aquí (A) Composició de sacàrids TMS de diverses fraccions d'oligosacàrids obtingudes mitjançant anàlisi GC-MS.(B) Estructures de diversos sucres derivats de TMS presents en oligosacàrids.ACN: fracció d'acetonitril que conté oligosacàrids neutres i FA: fracció d'àcid ferúlic que conté oligosacàrids àcids.
Una altra conclusió interessant es va extreure de l'anàlisi LC-MS de la fracció d'oligosacàrids, tal com es mostra a la figura S9 (els mètodes es poden veure al material suplementari electrònic).Es van observar repetidament fragments de grups hexosa i -OAc durant la lligadura de la fracció ACN-B.Aquesta troballa no només confirma la fragmentació observada en l'anàlisi de glicoma i MALDI-TOF, sinó que també proporciona nova informació sobre els possibles derivats d'hidrats de carboni en la biomassa lignocel·lulòsica pretractada.
També es va analitzar la composició de sucre de la fracció d'oligosacàrids mitjançant la derivatització del sucre TMS.Mitjançant GC-MS, vam determinar la composició dels sucres neurals (no derivats) i àcids (GluA i GalA) a la fracció d'oligosacàrids (Fig. 5).L'àcid glucurònic es troba als components àcids C i D, mentre que l'àcid galacturònic es troba als components àcids A i B, tots dos components d'alt DP dels sucres àcids.Aquests resultats no només confirmen les nostres dades ELISA i MALDI, sinó que també són coherents amb els nostres estudis anteriors d'acumulació d'oligosacàrids.Per tant, creiem que els mètodes immunològics moderns que utilitzen la biotinilació d'oligosacàrids i el cribratge ELISA posterior són suficients per detectar oligosacàrids recalcitrants solubles en diverses mostres biològiques.
Com que els mètodes de cribratge de mAb basats en ELISA s'han validat per diversos mètodes diferents, hem volgut explorar encara més el potencial d'aquest nou mètode quantitatiu.Es van comprar i provar dos oligosacàrids comercials, xilohexasacàrid oligosacàrid (XHE) i 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A2XX), mitjançant un nou enfocament mAb dirigit al glicà de la paret cel·lular.La figura 6 mostra una correlació lineal entre el senyal d'unió biotinilada i la concentració logarítmica de concentració d'oligosacàrids, cosa que suggereix un possible model d'adsorció de Langmuir.Entre els mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 i CCRC-M151 correlacionats amb XHE, i CCRC-M108, CCRC-M109 i LM11 correlacionats amb A2XX en un rang d'1 nm a 100 nano.A causa de la disponibilitat limitada d'anticossos durant l'experiment, es van realitzar experiments limitats amb cada concentració d'oligosacàrids.Cal assenyalar aquí que alguns anticossos reaccionen de manera molt diferent al mateix oligosacàrid com a substrat, presumiblement perquè s'uneixen a epítops lleugerament diferents i poden tenir afinitats d'unió molt diferents.Els mecanismes i les implicacions de la identificació precisa d'epítops seran molt més complexos quan el nou enfocament de mAb s'apliqui a mostres reals.
Es van utilitzar dos oligosacàrids comercials per determinar el rang de detecció de diversos mAbs dirigits a glicans.Aquí, les correlacions lineals amb la concentració logarítmica de la concentració d'oligosacàrids indiquen patrons d'adsorció de Langmuir per a (A) XHE amb mAb i (B) A2XX amb mAb.Els epítops corresponents indiquen les estructures dels oligosacàrids comercials utilitzats com a substrats en l'assaig.
L'ús d'anticossos monoclonals dirigits a glicans (anàlisi glicocòmica o cribratge de mAb basat en ELISA) és una eina poderosa per a la caracterització en profunditat de la majoria dels principals glicans de la paret cel·lular que constitueixen la biomassa vegetal.Tanmateix, l'anàlisi clàssica de glicans només caracteritza els glicans de la paret cel·lular més grans, ja que la majoria d'oligosacàrids no s'immobilitzen de manera eficient a les plaques ELISA.En aquest estudi, l'estufa de blat de moro pretractada amb AFEX es va hidrolitzar enzimàticament amb un alt contingut de sòlids.Es va utilitzar l'anàlisi de sucre per determinar la composició dels hidrats de carboni recalcitrants de la paret cel·lular a l'hidrolitzat.Tanmateix, l'anàlisi de mAb d'oligosacàrids més petits en hidrolitzats està subestimada i es necessiten eines addicionals per immobilitzar eficaçment els oligosacàrids a les plaques ELISA.
Informem aquí un mètode d'immobilització d'oligosacàrids nou i eficaç per al cribratge de mAb combinant la biotinilació d'oligosacàrids seguida del cribratge ELISA en plaques recobertes de NeutrAvidin ™.Els oligosacàrids biotinilats immobilitzats van mostrar una afinitat suficient per l'anticòs per permetre una detecció ràpida i eficient d'oligosacàrids recalcitrants.L'anàlisi de la composició d'aquests oligosacàrids tossuts basat en l'espectrometria de masses va confirmar els resultats d'aquest nou enfocament de la immunodetecció.Així, aquests estudis demostren que la combinació de la biotinilació d'oligosacàrids i el cribratge ELISA amb anticossos monoclonals dirigits a glicans es pot utilitzar per detectar enllaços creuats en oligosacàrids i es pot aplicar àmpliament en altres estudis bioquímics que caracteritzen l'estructura dels oligosacàrids.
Aquest mètode de perfil de glicans basat en biotina és el primer informe capaç d'investigar els enllaços d'hidrats de carboni recalcitrants dels oligosacàrids solubles en la biomassa vegetal.Això ajuda a entendre per què algunes parts de la biomassa són tan tossudes quan es tracta de la producció de biocombustibles.Aquest mètode omple un buit important en els mètodes d'anàlisi de glicoma i amplia la seva aplicació a una gamma més àmplia de substrats més enllà dels oligosacàrids vegetals.En el futur, podem utilitzar la robòtica per a la biotinilació i utilitzar el mètode que hem desenvolupat per a l'anàlisi d'alt rendiment de mostres mitjançant ELISA.
La palla de blat de moro (CS) cultivada a partir de llavors híbrides Pioneer 33A14 es va collir el 2010 a Kramer Farms a Ray, Colorado.Amb el permís del propietari, aquesta biomassa es pot utilitzar per a la investigació. Les mostres es van emmagatzemar seques < 6% d'humitat en bosses amb cremallera a temperatura ambient. Les mostres es van emmagatzemar seques < 6% d'humitat en bosses amb cremallera a temperatura ambient. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтности при комтности. Les mostres es van emmagatzemar seques a <6% d'humitat en bosses amb cremallera a temperatura ambient.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Les mostres s'emmagatzemen en bosses amb cremallera a temperatura ambient amb una humitat < 6%.L'estudi va complir amb les directrius locals i nacionals.L'anàlisi de la composició es va realitzar mitjançant el protocol NREL.Es va trobar que la composició contenia un 31,4% de glucà, un 18,7% de xilà, un 3,3% d'arabinan, un 1,2% de galactà, un 2,2% d'acetil, un 14,3% de lignina, un 1,7% de proteïnes i un 13,4% de cendres.
Cellic® CTec2 (138 mg de proteïna/ml, lot VCNI 0001) és una barreja complexa de cel·lulasa, β-glucosidasa i Cellic® HTec2 (157 mg de proteïna/ml, lot VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, EUA)).DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, EUA) va donar Multifect Pectinase® (72 mg de proteïna/ml), una combinació complexa d'enzims degradants de pectina.Les concentracions de proteïnes enzimàtiques es van determinar estimant el contingut de proteïnes (i restant la contribució de nitrogen no proteic) mitjançant l'anàlisi de nitrogen Kjeldahl (mètode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, EUA).La terra de diatomea 545 es va comprar a EMD Millipore (Billerica, MA).El carbó activat (DARCO, grànuls de 100 malles), Avicel (PH-101), xilà de faig i tots els altres productes químics es van comprar a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
El pretractament AFEX es va realitzar al GLBRC (Laboratori de Recerca de Conversió de Biomassa, MSU, Lansing, MI, EUA).El pretractament es va dur a terme a 140ºC durant 15 minuts.46 temps de residència a una proporció 1:1 d'amoníac anhidre a biomassa amb una càrrega del 60% (p/p) en un reactor discontinu de sobretaula d'acer inoxidable (Parr Instruments Company).Va trigar 30 minuts.El reactor es va portar a 140 ° C i l'amoníac es va alliberar ràpidament, permetent que la biomassa tornés ràpidament a la temperatura ambient.La composició de l'estufa de blat de moro pretractada (ACS) AFEX era similar a la de l'estufa de blat de moro no tractada (UT-CS).
Es va preparar ACSH 25% (p/p) d'alt sòlid (aproximadament un 8% de càrrega de dextran) com a material de partida per a la producció a gran escala d'oligosacàrids.La hidròlisi enzimàtica de l'ACS es va realitzar mitjançant una barreja d'enzims comercial que inclou Cellic® Ctec2 10 mg de proteïna/g glucà (en biomassa pretractada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg de proteïna/g glucà i Multifect Pectinase (Genencor Inc, EUA).).), 5 mg de proteïna/g de dextran.La hidròlisi enzimàtica es va dur a terme en un bioreactor de 5 litres amb un volum de treball de 3 litres, pH 4,8, 50 °C i 250 rpm.Després de la hidròlisi durant 96 hores, l'hidrolitzat es va recollir per centrifugació a 6000 rpm durant 30 minuts i després a 14000 rpm durant 30 minuts per eliminar els sòlids no hidrolitzats.L'hidrolitzat es va sotmetre a filtració estèril a través d'un vas de filtre de 0,22 mm.L'hidrolitzat filtrat es va emmagatzemar en ampolles estèrils a 4ºC i després es va fraccionar sobre carbó.
Anàlisi de la composició de mostres de biomassa basades en extractes segons procediments d'anàlisi de laboratori NREL: preparació de mostres per a anàlisi de composició (NREL/TP-510-42620) i determinació d'hidrats de carboni estructurals i lignina en biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
L'anàlisi d'oligosacàrids del corrent d'hidrolitzat es va realitzar a una escala de 2 ml mitjançant un mètode d'hidròlisi àcida basat en autoclau.Barregeu la mostra d'hidrolitzat amb 69,7 µl d'àcid sulfúric al 72% en un tub de cultiu de 10 ml de tapa de rosca i s'incuba durant 1 h en un banc a 121 ° C, refredar amb gel i filtrar en un vial de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC).La concentració d'oligosacàrids es va determinar restant la concentració de monosacàrids a la mostra no hidrolitzada de la concentració total de sucre a la mostra hidrolitzada amb àcid.
Les concentracions de glucosa, xilosa i arabinosa a la biomassa hidrolitzada amb àcid es van analitzar mitjançant un sistema HPLC Shimadzu equipat amb un mostreig automàtic, escalfador de columna, bomba isocràtica i detector d'índex de refracció en una columna Bio-Rad Aminex HPX-87H.La columna es va mantenir a 50 °C i es va eluir amb 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 en aigua.fluir.
El sobrenedant d'hidrolitzat es va diluir i es va analitzar pel contingut de monòmers i oligosacàrids.Els sucres monomèrics obtinguts després de la hidròlisi enzimàtica es van analitzar mitjançant HPLC equipat amb una columna Bio-Rad (Hèrcules, CA) Aminex HPX-87P i una columna de protecció de cendres.La temperatura de la columna es va mantenir a 80 °C, es va utilitzar aigua com a fase mòbil amb un cabal de 0,6 ml/min.Els oligosacàrids es van determinar per hidròlisi en àcid diluït a 121 °C segons els mètodes descrits a les refs.41, 48, 49.
L'anàlisi de sacàrids es va realitzar sobre residus de biomassa en brut, pretractats amb AFEX i tots els residus de biomassa no hidrolitzats (inclosa la producció d'extractes de paret cel·lular en sèrie i el seu cribratge de mAb) mitjançant els procediments descrits anteriorment 27, 43, 50, 51.Per a l'anàlisi de glicoma, els residus insolubles en alcohol del material de la paret cel·lular vegetal es preparen a partir de residus de biomassa i se sotmeten a extracció en sèrie amb reactius cada cop més agressius com ara oxalat d'amoni (50 mM), carbonat sòdic (50 mM i 0,5% p/v), CON.(1M i 4M, tots dos amb borohidrur de sodi a l'1% p/v) i clorit àcid tal com s'ha descrit anteriorment52,53.A continuació, els extractes es van sotmetre a ELISA contra un panell complex de mAb50 dirigit al glicà de la paret cel·lular i les reaccions d'unió a mAb es van presentar com un mapa tèrmic.Els mAbs dirigits al glicà de la paret cel·lular de les plantes es van comprar a les existències de laboratori (sèries CCRC, JIM i MAC).
Biotinilació d'oligosacàrids en un sol pas.La conjugació d'hidrats de carboni amb biotina-LC-hidrazida es va realitzar mitjançant el procediment següent.La biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) es va dissoldre en sulfòxid de dimetil (DMSO, 70 μl) mitjançant una agitació vigorosa i escalfament a 65 ° C durant 1 min.Es va afegir àcid acètic glacial (30 µl) i la mescla es va abocar sobre cianoborohidrur de sodi (6,4 mg/100 µmol) i es va dissoldre completament després d'escalfar a 65 °C durant aproximadament 1 minut.A continuació, es van afegir de 5 a 8 μl de la barreja de reacció a l'oligosacàrid sec (1-100 nmol) per obtenir un excés molar de 10 vegades o més de l'etiqueta sobre l'extrem reductor.La reacció es va dur a terme a 65 ° C durant 2 h, després de les quals les mostres es van purificar immediatament.No es va utilitzar cianoborohidrur de sodi en els experiments d'etiquetatge sense reducció, i les mostres es van fer reaccionar a 65 °C durant 2,5 hores.
Recobriment ELISA i rentat de mostres d'oligosacàrids biotinilats.Es van afegir 25 μl de mostres biotinilades (100 μl de cada mostra concentrada diluïda en 5 ml de solució tampó Tris 0, 1 M (TBS)) a cada pou de la placa recoberta d'avidina.Els pous de control es van recobrir amb 50 μl de biotina a una concentració de 10 μg/ml en TBS 0, 1 M.Es va utilitzar aigua desionitzada com a recobriment per a mesures en blanc.La pastilla es va incubar durant 2 hores a temperatura ambient a la foscor.Rentar la placa 3 vegades amb llet desnatada al 0,1% en TBS 0,1 M utilitzant el programa núm.11 per al pis Grenier 3A.
Addició i rentat d'anticossos primaris.Afegiu 40 µl d'anticossos primaris a cada pou.Incubar la microplaca durant 1 hora a temperatura ambient a la foscor.A continuació, es van rentar les plaques 3 vegades amb llet al 0, 1% en TBS 0, 1 M mitjançant el programa de rentat # 11 per a Grenier Flat 3A.
Afegir anticossos secundaris i rentar.Afegiu 50 µl d'anticossos secundaris de ratolí/rata (diluït 1:5000 en llet al 0,1% en TBS 0,1 M) a cada pou.Incubar la microplaca durant 1 hora a temperatura ambient a la foscor.A continuació, es van rentar les microplaques 5 vegades amb llet al 0,1% en TBS 0,1 M mitjançant el programa de rentat de plaques Grenier Flat 5A #12.
Afegir un substrat.Afegiu 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) al substrat base (afegiu 2 gotes de tampó, 3 gotes de TMB, 2 gotes de peròxid d'hidrogen a 15 ml d'aigua desionitzada).Prepareu el substrat TMB.i vortex abans de l'ús).Incubar la microplaca a temperatura ambient durant 30 minuts.En la foscor.
Completeu el pas i llegiu la tauleta.Afegiu 50 µl d'àcid sulfúric 1 N a cada pou i registreu l'absorbància de 450 a 655 nm amb un lector ELISA.
Prepareu solucions d'1 mg/ml d'aquests analits en aigua desionitzada: arabinosa, ramnosa, fucosa, xilosa, àcid galacturònic (GalA), àcid glucurònic (GlcA), manosa, glucosa, galactosa, lactosa, N-acetilmanosamina (manNAc), N-acetilglucosamina.(glcNAc), N-acetilgalactosamina (galNAc), inositol (estàndard intern).Es van preparar dos estàndards afegint les solucions de sucre d'1 mg/mL que es mostren a la taula 1. Les mostres es congelen i es liofilitzen a -80 °C fins que s'elimina tota l'aigua (normalment unes 12-18 hores).
Afegiu 100-500 µg de mostra als tubs de tap de rosca en una balança analítica.Anoteu la quantitat afegida.El millor és dissoldre la mostra en una concentració específica de dissolvent i afegir-la al tub com una alíquota líquida.Utilitzeu 20 µl d'1 mg/ml d'inositol com a estàndard intern per a cada tub de mostra.La quantitat d'estàndard intern afegit a la mostra ha de ser la mateixa que la quantitat d'estàndard intern afegit al tub estàndard.
Afegiu 8 ml de metanol anhidre a un vial amb tap de rosca.A continuació, 4 ml de solució de HCl metanòlic 3 N, tapats i agitats.Aquest procés no utilitza aigua.
Afegiu 500 µl de solució de metanol d'HCl 1 M a les mostres d'oligosacàrids i als tubs estàndard de TMS.Les mostres es van incubar durant la nit (168 hores) a 80ºC en un bloc tèrmic.Assecar el producte de metanolisi a temperatura ambient amb un col·lector d'assecat.Afegiu 200 µl de MeOH i assequeu-lo de nou.Aquest procés es repeteix dues vegades.Afegiu 200 µl de metanol, 100 µl de piridina i 100 µl d'anhídrid acètic a la mostra i barregeu bé.Les mostres es van incubar a temperatura ambient durant 30 minuts.i assecat.Afegiu 200 µl de metanol i assequeu-lo de nou.
Afegiu 200 µl de Tri-Sil i escalfeu el tub durant 20 minuts.80 °C, després es refreda a temperatura ambient.Utilitzeu un col·lector d'assecat per assecar encara més la mostra a un volum d'aproximadament 50 µl.És important tenir en compte que no vam deixar que les mostres s'assequessin completament.
Afegiu-hi 2 ml d'hexà i barregeu bé amb vòrtex.Ompliu les puntes de les pipetes Pasteur (5-8 mm) amb un tros de llana de vidre inserint la llana de vidre a sobre d'una pipeta de 5-3/4 polzades de diàmetre.Les mostres es van centrifugar a 3000 g durant 2 minuts.Es precipita qualsevol residu insoluble.Assecar la mostra a 100-150 µl.Es va injectar un volum d'aproximadament 1 μl al GC-MS a una temperatura inicial de 80 ° C i un temps inicial de 2, 0 minuts (taula 2).