Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.برائوزر جو نسخو توهان استعمال ڪري رهيا آهيو محدود CSS سپورٽ آهي.بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).ساڳئي وقت ۾، مسلسل حمايت کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ پيش ڪنداسين.
نون امونولوجيڪل ۽ ماس spectrometric طريقن جي پيچيده تجزيي لاء مسلسل oligosaccharides جي AFEX سان تيار ڪيل ڪارن اسٽوور ۾.Lignocellulosic biomass هڪ پائيدار متبادل آهي فوسل ايندھن جو ۽ وڏي پيماني تي استعمال ڪيو ويندو آهي بايو ٽيڪنالاجي کي ترقي ڪرڻ لاءِ پراڊڪٽس جهڙوڪ کاڌو، فيڊ، ٻارڻ ۽ ڪيميائي.انهن ٽيڪنالاجيز جو اهم مقصد ٻوٽن جي سيل جي ڀتين ۾ موجود پيچيده ڪاربوهائيڊريٽ کي سادي شگر جهڙوڪ گلوڪوز، زائلوز ۽ اربينوز ۾ تبديل ڪرڻ لاءِ قيمتي مقابلي واري عمل جي ترقي آهي.ڇاڪاڻ ته lignocellulosic biomass تمام ضدي آهي، ان کي لازمي طور تي thermochemical علاج (مثال طور، امونيا فائبر exfoliation (AFEX)، dilute acids (DA)، ionic liquids (IL)) ۽ حياتياتي علاج (مثال طور، enzymatic hydrolysis ۽ microbial fermentation) سان گڏ مصنوعات جي خواهش کي گڏ ڪرڻ گهرجي..بهرحال، جڏهن ڪمرشل فنگل اينزائمز هائيڊولائيزيشن جي عمل ۾ استعمال ڪيا وڃن ٿا، ته ٺهندڙ حليل شگرن مان فقط 75-85٪ مونوساڪرائڊس آهن، ۽ باقي 15-25٪ حليل، ناقابل عمل oligosaccharides آهن، جيڪي هميشه مائڪروجنزمن لاءِ دستياب ناهن.اڳي، اسان ڪاميابيءَ سان حل ٿيندڙ ضدي اوليگوساڪرائڊس کي ڪاربن ۽ ڊاٽوماسيئس زمين جي علحدگيءَ ۽ سائيز جي خارج ڪرڻ واري ڪروميٽوگرافيءَ جي ميلاپ کي استعمال ڪندي ڪاميابيءَ سان الڳ ۽ صاف ڪيو آهي، ۽ انهن جي انزائم روڪڻ واري ملڪيت جي پڻ تحقيق ڪئي آهي.اسان ڏٺو آهي ته oligosaccharides جن ۾ اعلي درجي جي پوليمرائيزيشن (DP) ميٿيلائيڊ يورونڪ ايسڊ متبادل شامل آهن، گهٽ ڊي پي ۽ غير جانبدار oligosaccharides جي ڀيٽ ۾ ڪمرشل اينزيم مرکب سان پروسيس ڪرڻ وڌيڪ ڏکيو آهي.هتي اسان ڪيترن ئي اضافي طريقن جي استعمال جي رپورٽ ڪريون ٿا، جنهن ۾ گليڪان پروفائلنگ استعمال ڪندي مونوڪلونل اينٽي باڊيز (mAbs) مخصوص ٻوٽن جي سيل وال والز ۽ اينزيميٽڪ هائيڊولائيزٽس ۾ گلائڪن بانڊز کي خاص ڪرڻ لاءِ ٻوٽن جي بائيو ماس گليڪانز، ميٽرڪس اسسٽيڊ ليزر ڊيسورپشن آئنائيزيشن، ٽائيم آف فلائيٽ ماس اسپيڪٽروميٽري..MALDI-TOF-MS) استعمال ڪري ٿو ساخت جي-معلوماتي تشخيصي چوٽيون جيڪي اسپيڪٽرو اسڪوپي ذريعي حاصل ڪيون ويون آهن منفي آئنز جي ثانوي خرابي کان پوءِ، گيس ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري (GC-MS) oligosaccharide بانڊن کي خاص ڪرڻ لاءِ ۽ ان کان سواءِ ڊيريوٽائيزيشن.oligosaccharides (DP 4-20) جي ننڍي سائيز جي ڪري، اهي ماليڪيولز mAb بائنڊنگ ۽ ڪردار سازي لاءِ استعمال ڪرڻ مشڪل آهن.هن مسئلي کي ختم ڪرڻ لاء، اسان هڪ نئين بايوٽين ڪنجوگيشن تي ٻڌل oligosaccharide immobilization جو طريقو لاڳو ڪيو جنهن ڪاميابيءَ سان مائڪپليٽ جي مٿاڇري تي گھٽ ڊي پي حل ٿيندڙ oligosaccharides جي اڪثريت کي ليبل ڪيو، جيڪو پوءِ استعمال ڪيو ويو هڪ اعلي throughput mAb سسٽم ۾ مخصوص ligation تجزيو لاءِ.اهو نئون طريقو مستقبل ۾ وڌيڪ ترقي يافته اعلي throughput glycome assays جي ترقي کي آسان بڻائي ٿو جيڪو تشخيصي مقصدن لاء بايو مارڪرز ۾ موجود oligosaccharides کي الڳ ڪرڻ ۽ خاصيت ڪرڻ لاء استعمال ڪري سگهجي ٿو.
Lignocellulosic biomass، جيڪو زرعي، جنگلات، گھاس ۽ ڪاٺ جي مواد تي مشتمل آهي، هڪ امڪاني فيڊ اسٽاڪ آهي، بايو-بنياد پروڊڪٽس جي پيداوار لاءِ، جنهن ۾ خوراڪ، فيڊ، ٻارڻ ۽ ڪيميائي اڳڪٿيون شامل آهن ته جيئن اعليٰ قيمت جون شيون 1.ڪاربوهائيڊريٽ (جهڙوڪ سيلولوز ۽ هيميسيلوز) ٻوٽن جي سيلن جي ڀتين ۾ موجود آهن، ڪيميائي پروسيسنگ ۽ بايو ٽرانسفارميشن (جهڙوڪ اينزيميٽڪ هائيڊولائيزيشن ۽ مائڪروبيل خمير) ذريعي مونوسڪرائڊس ۾ مٽائي ويندا آهن.عام اڳوڻن علاجن ۾ شامل آهن امونيا فائبر جي توسيع (AFEX)، dilute acid (DA)، ionic liquid (IL)، ۽ steam explosion (SE)، جيڪي ٻوٽن جي سيل والز کي کولڻ سان lignocellulose جي پيداوار کي گهٽائڻ لاءِ ڪيميائي ۽ گرميءَ جو ميلاپ استعمال ڪن ٿا 3,4.معاملي جي ضد، 5. اينزيميٽڪ هائيڊولائيزيشن ڪمرشل فعال ڪاربوهائيڊريٽ تي مشتمل اينزائمز (CAZymes) ۽ مائڪروبيل خمير کي استعمال ڪندي تيز سولڊ لوڊ تي ڪيو ويندو آهي، بائيو بيسڊ فيولز ۽ ڪيميڪل تيار ڪرڻ لاءِ ٽرانسجينڪ خمير يا بيڪٽيريا استعمال ڪندي 6.
ڪمرشل اينزائمز ۾ CAZymes انزايمز جي هڪ پيچيده مرکب مان ٺهيل آهن جيڪي هم وقت سازي سان پيچيده ڪاربوهائيڊريٽ-شگر بانڊز کي ٽوڙي ڇڏيندا آهن ته جيئن مونوساڪريڊس 2,7 ٺاهين.جيئن ته اسان اڳ ۾ ٻڌايو آهي، ڪاربوهائيڊريٽ سان ليگنين جي خوشبودار پوليمر جو پيچيده نيٽ ورڪ انهن کي انتهائي ناقابل برداشت بڻائي ٿو، جيڪو نامڪمل کنڊ جي تبديليء جو سبب بڻائيندو آهي، 15-25٪ جنسي oligosaccharides گڏ ڪري ٿو جيڪي اڳوڻو بايوماس جي اينزيميٽڪ هائيڊولائيزيشن دوران پيدا نه ٿيندا آهن.هي هڪ عام مسئلو آهي مختلف بايوماس جي علاج جي طريقن سان.هن رڪاوٽ جي ڪجهه سببن ۾ شامل آهن هائيڊولائيزيشن دوران اينزيم جي پابندي، يا ضروري ضروري اينزائمز جي غير موجودگي يا گهٽ سطح جيڪي ٻوٽن جي بايوماس ۾ شوگر بانڊ کي ٽوڙڻ لاء گهربل آهن.شگر جي ساخت ۽ ساخت جي خاصيتن کي سمجھڻ، جيئن oligosaccharides ۾ شگر بانڊ، اسان کي هائڊروليسس جي دوران کنڊ جي تبديلي کي بهتر بنائڻ ۾ مدد ڏيندو، بايو ٽيڪنالاجي پروسيس کي پيٽروليم مان نڪتل شين سان قيمتي مقابلي ۾.
ڪاربوهائيڊريٽ جي جوڙجڪ کي طئي ڪرڻ مشڪل آهي ۽ طريقن جي ميلاپ جي ضرورت آهي جيئن ته مائع ڪروميٽوگرافي (LC) 11,12، ائٽمي مقناطيسي گونج اسپيڪٽروڪوپي (NMR) 13، ڪيپيلري اليڪٽرروفورسس (CE) 14,15,16 ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري (MS)17.،ارڙهن.MS طريقا جيئن ته وقت جي اڏام ماس اسپيڪٽروميٽري ليزر ڊيسورپشن سان ۽ ميٽرڪس استعمال ڪندي آئنائيزيشن (MALDI-TOF-MS) ڪاربوهائيڊريٽ جي جوڙجڪ جي سڃاڻپ لاءِ هڪ ورڇيل طريقو آهي.تازي طور تي، سوڊيم آئن ايڊڊڪٽس جو ڪليشن-انڊسڊ ڊسڪشن (سي آءِ ڊي) ٽنڊيم ايم ايس تمام وڏي پيماني تي استعمال ڪيو ويو آهي آڱرين جي نشانن جي سڃاڻپ ڪرڻ لاءِ oligosaccharide منسلڪ پوزيشن، anomeric ترتيبن، ترتيبن، ۽ برانچنگ پوزيشن 20, 21.
گليڪن جو تجزيو ڪاربوهائيڊريٽ بانڊز 22 جي کوٽائي جي سڃاڻپ لاءِ هڪ بهترين اوزار آهي.اهو طريقو مونوڪلونل اينٽي باڊيز (mAbs) استعمال ڪري ٿو جيڪو سيل وال گلائڪن کي پلانٽ ڪرڻ لاءِ هدايت ڪئي وئي آهي ته جيئن پيچيده ڪاربوهائيڊريٽ ڳنڍڻن کي سمجهڻ لاءِ.250 mAbs کان وڌيڪ پوري دنيا ۾ موجود آهن، مختلف لڪير ۽ برانچ ٿيل oligosaccharides جي خلاف ٺهيل مختلف saccharides24 استعمال ڪندي.ٻوٽن جي سيل جي ڀت جي ساخت، ساخت، ۽ تبديلين کي نمايان ڪرڻ لاءِ ڪيترائي mAbs وڏي پيماني تي استعمال ڪيا ويا آهن، ڇاڪاڻ ته ٻوٽي جي سيل جي قسم، عضون، عمر، ترقي واري مرحلي، ۽ واڌ جي ماحول جي لحاظ کان اهم فرق آهن 25,26.وڌيڪ تازو، هي طريقو استعمال ڪيو ويو آهي ٻوٽن ۽ جانورن جي سسٽم ۾ ويسيڪل آبادي کي سمجهڻ ۽ گليڪن ٽرانسپورٽ ۾ انهن جي لاڳاپيل ڪردار جيئن ذيلي سيلولر مارڪرز، ترقياتي مرحلن، يا ماحولياتي محرک، ۽ اينزيميٽڪ سرگرمي کي طئي ڪرڻ لاء.گليڪان ۽ زائلان جي ڪجهه مختلف ساختن جي نشاندهي ڪئي وئي آهي جن ۾ شامل آهن پيڪٽين (P)، زائلان (X)، منان (M)، xyloglucans (XylG)، مخلوط بانڊ گلوڪنز (MLG)، arabinoxylan (ArbX)، galactomannan (GalG)، glucuronic acid-arabinoxylan (Arabinooxylan) GA9-Arabinoxylan (Arabinooxylan)
جڏهن ته، انهن سڀني تحقيقاتي ڪوششن جي باوجود، صرف چند مطالعي تي ڌيان ڏنو ويو آهي oligosaccharide جي جمع ٿيڻ جي نوعيت تي هاء سولڊ لوڊ (HSL) هائيڊولائيزيشن، بشمول oligosaccharide ڇڏڻ، oligomeric زنجير جي ڊيگهه تبديلين دوران هائڊروليسس، مختلف گهٽ ڊي پي پوليمر، ۽ انهن جي وکر.تقسيم 30,31,32.ان کان علاوه، جيتوڻيڪ گليڪن جي تجزيي کي ثابت ڪيو ويو آهي هڪ ڪارائتو اوزار گليڪن جي جوڙجڪ جي جامع تجزيي لاء، اينٽي باڊي طريقن کي استعمال ڪندي پاڻي ۾ حل ٿيندڙ گهٽ ڊي پي اوليگوساڪرائڊس جو اندازو لڳائڻ ڏکيو آهي.ننڍڙا DP oligosaccharides جن جو ماليڪيولر وزن 5-10 kDa کان گھٽ هوندو آهي، اهي ELISA پليٽس 33، 34 سان جڙيل نه هوندا آهن ۽ اينٽي باڊي جي اضافي کان اڳ ڌوئي ويندا آهن.
هتي، پهريون ڀيرو، اسان هڪ ELISA امتحان ڏيکاريون ٿا avidin-coated پليٽن تي مونوڪلونل اينٽي باڊيز استعمال ڪندي، گليڪوم تجزيي سان حل ٿيندڙ ريفریکٹري اوليگوساڪرائڊس لاءِ هڪ قدم جي بايوٽينيليشن جي طريقيڪار کي گڏ ڪندي.Glycome تجزيي لاء اسان جو طريقو MALDI-TOF-MS ۽ GC-MS جي بنياد تي مڪمل ڪيل oligosaccharide ڳنڍڻن جي تجزيي جي ذريعي تصديق ڪئي وئي ٽرميٿيلسيليل (TMS) استعمال ڪندي هائڊروليز ٿيل کنڊ جي ٺھيل ٺاھڻ جي.هي جديد طريقي سان ترقي ڪري سگهجي ٿو هڪ اعلي-ذريعي طريقي سان مستقبل ۾ ۽ بايو ميڊيڪل ريسرچ35 ۾ وسيع ايپليڪيشن ڳوليو.
انزايمز ۽ اينٽي باڊيز جي ترجمي کان پوءِ تبديليون، جهڙوڪ گلائڪوسيليشن، 36 انهن جي حياتياتي سرگرمي کي متاثر ڪن ٿا.مثال طور، سيرم پروٽين جي گلائڪوسيليشن ۾ تبديليون سوزش واري گٿريس ۾ اهم ڪردار ادا ڪن ٿيون، ۽ گلائڪوسليشن ۾ تبديلين کي تشخيص مارڪرز طور استعمال ڪيو ويندو آهي 37.ادب ۾ مختلف گلائڪن ٻڌايو ويو آهي ته مختلف بيمارين ۾ آساني سان ظاهر ٿئي ٿي، جن ۾ معدي ۽ جگر جي دائمي سوزش واري بيماريون، وائرل انفڪشن، رحم، سينو، ۽ پروسٽٽ ڪينسر 38,39,40 شامل آهن.اينٽي باڊي تي ٻڌل گليڪان ELISA طريقن کي استعمال ڪندي گليڪين جي جوڙجڪ کي سمجھڻ سان پيچيده MS طريقن جي استعمال کان سواءِ مرض جي تشخيص ۾ اضافي اعتماد پيدا ٿيندو.
اسان جي پوئين مطالعي مان معلوم ٿئي ٿو ته ضدي oligosaccharides اڳي علاج ۽ اينزيميٽڪ هائيڊولائيزيشن کان پوءِ غير هائيڊولائيزڊ رهي (شڪل 1).اسان جي اڳوڻي شايع ٿيل ڪم ۾، اسان AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) 8 مان oligosaccharides کي ڌار ڪرڻ لاءِ چالو ٿيل چارڪو سولڊ فيز ڪڍڻ جو طريقو تيار ڪيو.ابتدائي اخراج ۽ علحدگيءَ کان پوءِ، oligosaccharides وڌيڪ ڀاڱا ڪيا ويا سائيز جي خارج ڪرڻ واري ڪروميٽوگرافي (SEC) ذريعي ۽ گڏ ڪيل ماليڪيولر وزن جي ترتيب ۾.شوگر monomers ۽ oligomers مختلف pretreatments مان آزاد ڪيو ويو کنڊ جي جوڙجڪ جي تجزيي ذريعي.جڏهن مختلف علاج جي طريقن سان حاصل ڪيل شگر oligomers جي مواد جو مقابلو ڪيو وڃي، ضدي oligosaccharides جي موجودگي بايوماس کي مونوساڪريڊس ۾ تبديل ڪرڻ ۾ هڪ عام مسئلو آهي ۽ گهٽ ۾ گهٽ 10-15٪ ۽ اڃا تائين 18٪ تائين کنڊ جي پيداوار ۾ گهٽتائي ٿي سگهي ٿي.يو ايس.هي طريقو oligosaccharide fractions جي وڌيڪ وڏي پيماني تي پيداوار لاء استعمال ڪيو ويندو آهي.نتيجي ۾ آيل ACH ۽ ان جا ايندڙ حصا مختلف ماليڪيولر وزنن سان گڏ هن ڪم ۾ oligosaccharides جي خاصيت لاءِ تجرباتي مواد طور استعمال ڪيا ويا.
علاج ۽ اينزيميٽڪ هائيڊولائيزيشن کان پوءِ، مسلسل اوليگوساڪرائڊس غير هائيڊولائيزڊ رهيون.هتي (A) هڪ oligosaccharides علحدگيءَ جو طريقو آهي جنهن ۾ oligosaccharides AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) کان الڳ ٿيل آهن ايڪٽيويٽ ڪاربن ۽ ڊاٽوماسيئس زمين جي ڀريل بستري کي استعمال ڪندي؛(ب) oligosaccharides جي الڳ ڪرڻ جو طريقو.oligosaccharides وڌيڪ الڳ ڪيا ويا سائيز exclusion chromatography (SEC)؛(سي) Saccharide monomers ۽ oligomers مختلف pretreatments مان جاري ڪيا ويا آهن (diluted acid: DA، ionic liquid: IL ۽ AFEX).اينزيميٽڪ هائيڊولائيزس جون حالتون: 25٪ (w/w) جي اعلي سولڊ لوڊنگ (تقريبن 8٪ گلوڪين لوڊنگ)، 96 ڪلاڪ هائيڊولائيزيشن، 20 mg/g تجارتي اينزيم لوڊ ڪرڻ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 تناسب) ۽ (ڊي) ۽ شوگر جي ايڪسائيزيشن مان نڪتل شوگرز ۽ گيسلوزولوسومروگوميرااف. EX پري علاج ٿيل ڪارن اسٽوور (ACS).
گليڪان جو تجزيو ثابت ڪيو ويو آهي هڪ ڪارائتو اوزار آهي هڪ جامع ڍانچي جي تجزيي لاءِ گليڪان جي نچوڙ ۾ جڙيل بايوماس جي باقيات کان الڳ ٿيل.بهرحال، پاڻي ۾ حل ٿيندڙ سيڪرائڊس کي هن روايتي طريقي سان استعمال ڪندي گهٽ پيش ڪيو ويو آهي41 ڇاڪاڻ ته گهٽ ماليڪيولر وزن oligosaccharides ELISA پليٽن تي متحرڪ ٿيڻ ڏکيو آهي ۽ اينٽي باڊي جي اضافي کان اڳ ڌوئي ويندا آهن.تنهن ڪري، اينٽي باڊي بائنڊنگ ۽ خصوصيت لاءِ، هڪ قدم جي بايوٽينيليشن جو طريقو استعمال ڪيو ويو هو ڪوٽ ڪرڻ لاءِ حل ٿيندڙ، غير تعميل oligosaccharides avidin-coated ELISA پليٽن تي.اهو طريقو اسان جي اڳوڻي پيدا ڪيل ACSH استعمال ڪندي آزمايو ويو ۽ ان جي ماليڪيولر وزن (يا پوليمرائيزيشن جي درجي، ڊي پي) جي بنياد تي هڪ حصو.هڪ قدم بايوٽينيليشن استعمال ڪيو ويو oligosaccharide بائنڊنگ لاڳاپي کي وڌائڻ لاء بايوٽين-LC-hydrazide شامل ڪندي ڪاربوهائيڊريٽ جي گھٽتائي واري آخر ۾ (Fig. 2).حل ۾، گهٽجڻ واري آخر ۾ هيمياسيٽل گروپ بايوٽين-LC-hydrazide جي هائيڊرازائيڊ گروپ سان رد عمل ڪري هڪ هائيڊرازون بانڊ ٺاهي ٿو.گھٽائڻ واري ايجنٽ NaCNBH3 جي موجودگي ۾، هائيڊروزون بانڊ هڪ مستحڪم بايوٽينيلڊ آخر پراڊڪٽ تائين گھٽجي ويو آهي.شگر جي گھٽتائي جي آخر ۾ تبديلي سان، گھٽ ڊي پي اوليگوساڪرائڊس جو پابند ELISA پليٽن تي ممڪن ٿي ويو، ۽ اسان جي مطالعي ۾ اھو ڪيو ويو avidin-coated پليٽن تي استعمال ڪندي گليڪن ھدف ٿيل mAbs.
ELISA جي بنياد تي monoclonal اينٽي باڊيز جي اسڪريننگ بائيوٽينيليٽ oligosaccharides لاءِ.هتي (A) oligosaccharides جي گڏيل بايوٽينيليشن ۽ بعد ۾ ELISA اسڪريننگ سان گڏ گليڪن-ٽارگيٽڊ ايم اي بيس تي NeutrAvidin ڪوٽيڊ پليٽس ۽ (B) رد عمل جي شين جي بايوٽينيليشن لاءِ هڪ قدم وارو طريقو ڏيکاري ٿو.
oligosaccharide-conjugated antibodies سان Avidin-coated پليٽون پوءِ پرائمري ۽ سيڪنڊري اينٽي باڊيز ۾ شامل ڪيون ويون ۽ روشني ۽ وقت جي حساس وچولي ۾ ڌوئي ويون.اينٽي باڊي بائنڊنگ مڪمل ٿيڻ کان پوءِ، پليٽ کي انبيوٽ ڪرڻ لاءِ TMB سبسٽرٽ شامل ڪريو.رد عمل آخرڪار سلفورڪ اسيد سان روڪيو ويو.اينٽي باڊي جي مخصوص ڪراس لنڪنگ کي ڳولڻ لاءِ هر اينٽي باڊي جي پابند قوت کي طئي ڪرڻ لاءِ ELISA ريڊر استعمال ڪندي انڪيوب ٿيل پليٽن جو تجزيو ڪيو ويو.تجربن جي تفصيلن ۽ پيرا ميٽرز لاءِ، لاڳاپيل سيڪشن ”مواد ۽ طريقا“ ڏسو.
اسان مخصوص ايپليڪيشنن لاءِ هن نئين ترقي يافته طريقي جي افاديت جو مظاهرو ڪريون ٿا ACSH ۾ موجود حليل oligosaccharides جي خصوصيت سان گڏوگڏ lignocellulosic hydrolysates کان ڌار ڪيل خام ۽ صاف ٿيل oligosaccharides ۾.جيئن ته شڪل 3 ۾ ڏيکاريل آهي، سڀ کان وڌيڪ عام ايپيٽوپ-متبادل xylans جي سڃاڻپ ACSH ۾ استعمال ڪندي بايوسيليٽ گليڪوم assay طريقا عام طور تي uronic (U) يا methyluronic (MeU) ۽ pectic arabinogalactans آهن.انهن مان گھڻا اسان جي پوئين مطالعي ۾ غير هائيڊولائزڊ سولڊس (UHS) 43 جي گليڪن جي تجزيي تي پڻ مليا.
سيل وال گلائڪن ڏانهن هدايت ڪئي وئي هڪ مونوڪلونل اينٽي باڊي استعمال ڪندي ريڪيڪلٽرنٽ اوليگوساڪرائڊ ايپيٽپس جي چڪاس."غير جانبدار" حصو ACN حصو آھي ۽ "تيزاب" حصو FA حصو آھي.گرميءَ جي نقشي تي روشن ڳاڙها ڳاڙها ڳاڙها اشارا ڪن ٿا اعليٰ ايپيٽوپ مواد، ۽ روشن بلوز هڪ خالي پس منظر ظاهر ڪن ٿا.پيماني تي رنگ جا قدر خام OD قدرن تي ٻڌل آهن فارموليشن N = 2 لاءِ.اينٽي باڊيز پاران سڃاتل مکيه ايپيٽپس ساڄي پاسي ڏيکاريل آهن.
اهي غير سيلولوز ڍانچي کي آزمائشي ڪمرشل اينزائيم مرکب ۾ سڀ کان وڌيڪ عام سيلوليز ۽ هيميسيلوليز طرفان صاف نه ٿي سگهيا آهن، جن ۾ سڀ کان وڌيڪ استعمال ٿيندڙ تجارتي اينزائمز شامل آهن.تنهن ڪري، انهن جي هائيڊولائيزيشن لاء نئين معاون اينزيمس گهربل آهن.غير ضروري غير سيلولوز رسائيندڙ اينزائمز کان سواءِ، اهي غير سيلولوز بانڊ مونوسڪرائڊز ۾ مڪمل تبديليءَ کي روڪيندا آهن، جيتوڻيڪ انهن جا والدين شگر پوليمر وڏي پئماني تي هائيڊولائيز ٿيل آهن ننڍن ٽڪرن ۾ ۽ تجارتي اينزائم مرکب استعمال ڪندي تحلیل ڪيا وڃن ٿا.
سگنل جي ورڇ ۽ ان جي پابند قوت جي وڌيڪ مطالعي مان معلوم ٿئي ٿو ته بائنڊنگ ايپيٽپس اعلي ڊي پي شوگر فرڪشن (A, B, C, DP تائين 20+) ۾ گھٽ ڊي پي فرڪشنن (D, E, F, DP) dimers ۾ (Fig. 1).تيزاب جا ٽڪرا غير سيلولوز ايپيٽپس ۾ غير جانبدار ٽڪرن جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ عام آهن.اهي واقعا اسان جي پوئين مطالعي ۾ مشاهدو ڪيل نمونن سان مطابقت رکن ٿا، جتي اعلي ڊي پي ۽ تيزابي مايون اينزيميٽڪ هائيڊولائيزيشن لاء وڌيڪ مزاحمتي هئا.تنهن ڪري، غير سيلولوز گليڪان ايپيٽپس ۽ يو ۽ مي يو متبادل جي موجودگي oligosaccharides جي استحڪام ۾ تمام گهڻو مدد ڪري سگھن ٿا.اهو ياد رکڻ گهرجي ته پابند ۽ ڳولڻ جي ڪارڪردگي گهٽ ڊي پي oligosaccharides لاء مسئلو ٿي سگهي ٿي، خاص طور تي جيڪڏهن ايپيٽوپ هڪ dimeric يا trimeric oligosaccharides آهي.اهو مختلف لمبائي جي تجارتي oligosaccharides استعمال ڪندي آزمائي سگهجي ٿو، هر هڪ ۾ صرف هڪ نسخو آهي جيڪو هڪ مخصوص mAb سان جڙيل آهي.
اهڙيء طرح، ساخت جي مخصوص اينٽي باڊيز جو استعمال ظاهر ڪيو ويو آهي مخصوص قسم جا ريڪليٽرنٽ بانڊ.استعمال ٿيل اينٽي باڊي جي قسم، مناسب لئگيشن جو نمونو، ۽ سگنل جي قوت ان جي پيدا ڪرڻ تي (سڀ کان وڌيڪ ۽ گهٽ ۾ گهٽ گهڻائي)، نئين اينزائمز کي سڃاڻي سگهجي ٿو ۽ وڌيڪ مڪمل گلائڪو ڪنورشن لاءِ اينزيم مرکب ۾ نيم مقدار ۾ شامل ڪري سگهجي ٿو.ACSH oligosaccharides جي تجزيي کي مثال طور، اسان هر بايوماس مواد لاء گليڪن بانڊ جو ڊيٽابيس ٺاهي سگهون ٿا.هتي اها ڳالهه ياد رکڻ گهرجي ته اينٽي باڊيز جي مختلف لاڳاپن کي نظر ۾ رکڻ گهرجي، ۽ جيڪڏهن انهن جو لاڳاپو اڻڄاتل آهي، اهو مختلف اينٽي باڊيز جي سگنلن جي مقابلي ۾ ڪجهه مشڪلات پيدا ڪندو.ان کان علاوه، گليڪن بانڊ جو مقابلو ساڳيو اينٽي باڊي لاءِ نمونن جي وچ ۾ بهترين ڪم ڪري سگھي ٿو.انهن ضدي بانڊن کي وري CAZyme ڊيٽابيس سان ڳنڍجي سگهجي ٿو، جنهن مان اسان اينزائمز جي سڃاڻپ ڪري سگهون ٿا، اميدوار اينزائمز چونڊي سگهون ٿا ۽ بانڊ ٽوڙڻ واري اينزائمز لاءِ ٽيسٽ ڪري سگهون ٿا، يا بائيو ريفائنريز44 ۾ استعمال لاءِ انهن اينزائمز کي ظاهر ڪرڻ لاءِ مائڪروبيل سسٽم ٺاهي سگهون ٿا.
تشخيص ڪرڻ لاءِ ته ڪيئن امونولوجيڪل طريقا متبادل طريقن کي پورو ڪن ٿا lignocellulosic hydrolysates ۾ موجود گهٽ ماليڪيولر وزن oligosaccharides جي خاصيت لاءِ، اسان MALDI (Fig. 4, S1-S8) ۽ TMS-نڪتل ٿيل saccharides جو تجزيو ڪيو GC-MS جي بنياد تي ساڳئي پينل تي (Fig5) .MALDI استعمال ڪيو وڃي ٿو موازنہ ڪرڻ لاءِ ته ڇا oligosaccharide ماليڪيولز جي وڏي تقسيم ارادي جي جوڙجڪ سان ملي ٿي.انجير تي.4 غير جانبدار اجزاء جو MC ڏيکاري ٿو ACN-A ۽ ACN-B.ACN-A تجزيي پينٽوز شگر جي هڪ حد جي تصديق ڪئي DP 4-8 (Fig. 4) کان DP 22 (Fig. S1) تائين، جن جو وزن MeU-xylan oligosaccharides سان مطابقت رکي ٿو.ACN-B تجزيي جي تصديق ڪئي وئي پينٽوز ۽ گلوڪوڪسيلان سيريز ڊي پي 8-15 سان.ضمني مواد جهڙوڪ تصوير S3 ۾، FA-C تيزابي موئيٽي ماس ڊسٽريبيوشن نقشا ڏيکارين ٿا (Me)U متبادل پينٽوز شگر جو هڪ DP 8-15 جي ڊي پي سان جيڪو ELISA-based mAb اسڪريننگ ۾ مليل متبادل xylans سان مطابقت رکي ٿو.Epitopes برابر آهن.
ACS ۾ موجود حل ٿيندڙ غير تعميل oligosaccharides جو MALDI-MS اسپيڪٽرم.هتي، (A) ACN-A گھٽ وزن جي حد جا جزا شامل آهن جن ۾ ميٿيلائيڊ يورونڪ ايسڊ (DP 4-8) متبادل گلوڪووروڪسيلان اوليگوساڪرائڊس ۽ (B) ACN-B xylan ۽ ميٿيلائيڊ يورونڪ ايسڊ oligosaccharides شامل آهن گلوڪووروڪسيلان (DP 8-15).
ريفرڪٽري oligosaccharides جي گليڪن جي رهائش جي جوڙجڪ جو تجزيو.هتي (A) TMS saccharide مختلف oligosaccharide fractions جو ٺهيل GC-MS تجزيو استعمال ڪندي حاصل ڪيو.(ب) oligosaccharides ۾ موجود مختلف TMS مان نڪتل شگر جي جوڙجڪ.ACN – acetonitrile fraction جنهن ۾ neutral oligosaccharides ۽ FA – ferulic acid fraction شامل آهن جنهن ۾ acid oligosaccharides شامل آهن.
ٻيو دلچسپ نتيجو ڪڍيو ويو LC-MS oligosaccharide fraction جي تجزيي مان، جيئن تصوير S9 ۾ ڏيکاريو ويو آهي (طريقن کي اليڪٽرانڪ ضمني مواد ۾ ڏسي سگھجي ٿو).ACN-B فريڪشن جي ligation دوران hexose ۽ -OAc گروپن جا ٽڪرا بار بار ڏٺا ويا.اها ڳولها نه رڳو گلائڪم ۽ مالدي ٽوف جي تجزيي ۾ مشاهدو ٿيل ٽڪراءَ جي تصديق ڪري ٿي، پر اڳواٽ ٿيل lignocellulosic بايوماس ۾ امڪاني ڪاربوهائيڊريٽ ڊيريويٽوز بابت نئين معلومات پڻ مهيا ڪري ٿي.
اسان TMS شوگر ڊيريوٽائيزيشن استعمال ڪندي oligosaccharide فريڪشن جي کنڊ جي جوڙجڪ جو پڻ تجزيو ڪيو.GC-MS استعمال ڪندي، اسان oligosaccharide fraction (Fig. 5) ۾ عصبي (غير مشتق) ۽ تيزابي شگر (GluA ۽ GalA) جي ٺاھ جوڙ جو اندازو لڳايو.گلوڪورونڪ ايسڊ تيزابي جزن سي ۽ ڊي ۾ ملي ٿو، جڏهن ته گليڪوروونڪ ايسڊ تيزابي جزن A ۽ B ۾ ملي ٿو، اهي ٻئي تيزابي شگر جا اعليٰ ڊي پي جز آهن.اهي نتيجا نه رڳو اسان جي ELISA ۽ MALDI ڊيٽا جي تصديق ڪن ٿا، پر oligosaccharide accumulation جي اسان جي پوئين مطالعي سان پڻ مطابقت آهن.تنهن ڪري، اسان يقين رکون ٿا ته جديد مدافعتي طريقا استعمال ڪندي oligosaccharides جي biotinylation ۽ بعد ۾ ELISA اسڪريننگ مختلف حياتياتي نمونن ۾ حل ٿيندڙ ريڪيڪلٽرنٽ oligosaccharides کي ڳولڻ لاء ڪافي آهن.
جيئن ته ELISA-based mAb اسڪريننگ طريقن کي ڪيترن ئي مختلف طريقن سان تصديق ڪيو ويو آهي، اسان چاهيون ٿا ته هن نئين مقدار جي طريقي جي صلاحيت کي وڌيڪ ڳولڻ لاء.ٻه تجارتي oligosaccharides، xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ۽ 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX)، خريد ڪيا ويا ۽ آزمائشي نئين ايم اي بي طريقي سان استعمال ڪندي سيل وال گليڪان کي ھدف ڪندي.شڪل 6 ڏيکاري ٿو بايوٽينيليٽ بائنڊنگ سگنل ۽ لاگ ڪنسنٽريشن جي oligosaccharide ڪنسنٽريشن جي وچ ۾ هڪ لڪير لاڳاپو، هڪ ممڪن Langmuir adsorption ماڊل جو مشورو ڏئي ٿو.mAbs ۾، CCRC-M137، CCRC-M138، CCRC-M147، CCRC-M148، ۽ CCRC-M151 XHE سان لاڳاپا، ۽ CCRC-M108، CCRC-M109، ۽ LM11 سان لاڳاپا A2XX کان 01m 01m جي حد تائين.تجربي دوران اينٽي باڊيز جي محدود دستيابي جي ڪري، هر oligosaccharide ڪنسنٽريشن سان محدود تجربا ڪيا ويا.هتي اهو ياد رکڻ گهرجي ته ڪجهه اينٽي باڊيز هڪ ئي اوليگوساڪرائڊ کي هڪ ذيلي ذخيري جي طور تي بلڪل مختلف طور تي رد ڪري ٿو، ممڪن آهي ڇاڪاڻ ته اهي ٿوري مختلف ايپيٽپس سان جڙيل آهن ۽ بلڪل مختلف پابند لاڳاپا رکي سگهن ٿيون.درست ايپيٽوپ جي سڃاڻپ جي ميکانيزم ۽ اثرات تمام گهڻو پيچيده ٿي ويندا جڏهن نئين ايم اي بي جو طريقو حقيقي نموني تي لاڳو ڪيو ويندو.
ٻن تجارتي oligosaccharides استعمال ڪيا ويا مختلف گليڪن-هدف واري ايم اي بي جي ڳولڻ جي حد کي طئي ڪرڻ لاء.هتي، oligosaccharide ڪنسنٽريشن جي لاگ ڪنسنٽريشن سان لڪير لاڳاپا ظاهر ڪن ٿا Langmuir adsorption نمونن لاءِ (A) XHE mAb سان ۽ (B) A2XX سان mAb.لاڳاپيل ايپيٽپس تجارتي oligosaccharides جي جوڙجڪ جي نشاندهي ڪن ٿا جيڪي پرکھ ۾ ذيلي ذخيرو طور استعمال ڪيا ويا آھن.
گلائڪن-ٽارگيٽڊ مونوڪلونل اينٽي باڊيز جو استعمال (گلائڪوڪومڪ اينالائسز يا ايليسا-بنياد ايم اي بي اسڪريننگ) هڪ طاقتور اوزار آهي گھڻائي واري خصوصيت لاءِ اڪثر وڏين وڏين سيل وال گلائڪنز جي جيڪا ٻوٽي جي بايوماس کي ٺاهيندي آهي.بهرحال، ڪلاسيڪل گليڪن جو تجزيو صرف وڏين سيل وال گلائڪن جي خاصيت ڪري ٿو، ڇاڪاڻ ته اڪثر اوليگوساڪرائڊس ELISA پليٽن تي موثر طور تي متحرڪ نه آهن.هن مطالعي ۾، AFEX-pretreated corn stover هڪ اعلي solids مواد تي enzymatically hydrolyzed ڪيو ويو.شوگر جي تجزيي کي استعمال ڪيو ويو هو هائيڊولائيزٽ ۾ ريٽيڪلٽينٽ سيل وال ڪاربوهائيڊريٽ جي جوڙجڪ جو اندازو لڳائڻ لاء.بهرحال، هائيڊولائيزٽس ۾ ننڍڙن oligosaccharides جو mAb تجزيو گهٽجي ويو آهي، ۽ ELISA پليٽن تي oligosaccharides کي موثر طريقي سان متحرڪ ڪرڻ لاءِ اضافي اوزارن جي ضرورت آهي.
اسان هتي رپورٽ ڪريون ٿا هڪ ناول ۽ ڪارائتو oligosaccharide immobilization طريقو mAb اسڪريننگ لاءِ oligosaccharide biotinylation کي گڏ ڪري بعد ۾ ELISA اسڪريننگ NeutrAvidin™ coated پليٽن تي.متحرڪ بايوٽينيليٽ ٿيل اوليگوساڪرائڊس اينٽي باڊي لاءِ ڪافي لاڳاپو ڏيکاريا آهن ته جيئن ريڪيڪلٽرنٽ اوليگوساڪرائڊس جي تيز ۽ موثر سڃاڻپ کي فعال ڪري سگهجي.انهن ضدي oligosaccharides جي ٺاھ جوڙ جو تجزيو ماس اسپيڪٽروميٽري جي بنياد تي ڪيو ويو آھي ھن نئين طريقي جي نتيجن جي اموناس اسڪريننگ جي.اهڙيء طرح، انهن مطالعي مان اهو ظاهر ٿئي ٿو ته oligosaccharide biotinylation ۽ ELISA اسڪريننگ جي ميلاپ سان گليڪن-ٽارگيٽڊ مونوڪلونل اينٽي باڊيز استعمال ڪري سگھجن ٿيون oligosaccharides ۾ ڪراس لنڪس کي ڳولڻ لاء ۽ وڏي پيماني تي استعمال ڪري سگھجن ٿيون ٻين بايو ڪيميڪل مطالعي ۾ oligosaccharides جي جوڙجڪ جي خصوصيت.
هي بايوٽين تي ٻڌل گليڪن جي پروفائيلنگ جو طريقو پهريون رپورٽ آهي جيڪو ٻوٽن جي بايوماس ۾ حل ٿيندڙ oligosaccharides جي recalcitrant ڪاربوهائيڊريٽ بانڊ جي تحقيق ڪرڻ جي قابل آهي.اهو سمجهڻ ۾ مدد ڪري ٿو ته ڇو بايوماس جا ڪجهه حصا ايترا ضد آهن جڏهن اهو بايو فيول جي پيداوار ۾ اچي ٿو.اهو طريقو گليڪوم جي تجزيي جي طريقن ۾ هڪ اهم خال ڀريندو آهي ۽ ان جي درخواست کي ٻوٽي جي اوليگوساڪرائڊس کان ٻاهر ذيلي ذخيري جي وسيع رينج تائين وڌائيندو آهي.مستقبل ۾، اسان بايوٽينيليشن لاءِ روبوٽڪس استعمال ڪري سگهون ٿا ۽ اهو طريقو استعمال ڪريون ٿا جيڪو اسان ELISA استعمال ڪندي نمونن جي اعليٰ درجي جي تجزيي لاءِ تيار ڪيو آهي.
Pioneer 33A14 هائبرڊ ٻج مان پوکيو ويو ڪارن اسٽرا (CS) 2010 ۾ ري، ڪولوراڊو ۾ ڪرمر فارمز مان حاصل ڪيو ويو.زميندار جي اجازت سان، هي بايوماس تحقيق لاء استعمال ڪري سگهجي ٿو. نمونا سڪي <6٪ نمي جي زپ-لاڪ بيگز ۾ ڪمري جي حرارت تي محفوظ ڪيا ويا. نمونا سڪي <6٪ نمي جي زپ-لاڪ بيگز ۾ ڪمري جي حرارت تي محفوظ ڪيا ويا. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. نمونن کي سڪي محفوظ ڪيو ويو <6٪ نمي تي زپ ٿيل بيگز ۾ ڪمري جي حرارت تي.样品在室温下以干燥<6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6٪. نمونن کي زپ بيگز ۾ ذخيرو ٿيل آهي ڪمري جي حرارت تي نمي سان <6٪.مطالعي مقامي ۽ قومي هدايتن سان عمل ڪيو.گڏيل تجزيي NREL پروٽوڪول استعمال ڪندي ڪيو ويو.ان جي جوڙجڪ ۾ 31.4٪ گلوڪين، 18.7٪ xylan، 3.3٪ arabinan، 1.2٪ galactan، 2.2٪ acetyl، 14.3٪ lignin، 1.7٪ پروٽين ۽ 13. 4٪ راھ شامل هئا.
Cellic® CTec2 (138 mg پروٽين/ml، lot VCNI 0001) سيلوليز، β-گلوڪوسيڊيس ۽ Cellic® HTec2 جو هڪ پيچيده مرکب آهي (157 mg پروٽين/ml، lot VHN00001) Novozymes (Franklinton, NC, USA)) کان.Multifect Pectinase® (72 mg پروٽين/mL)، پيڪٽين کي خراب ڪندڙ اينزائمز جو هڪ پيچيده مرکب، DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) پاران عطيو ڪيو ويو.اينزيم پروٽين جي مقدار جو اندازو لڳايو ويو پروٽين جي مواد جو اندازو لڳائڻ (۽ غير پروٽينن نائٽروجن جي مدد کي گھٽائڻ) ڪجيلڊال نائيٽروجن تجزيي (AOAC طريقو 2001.11، ڊيري ون ڪوآپريٽو Inc.، Ithaca, NY, USA).Diatomaceous Earth 545 EMD مليپور (Billerica، MA) کان خريد ڪيو ويو.چالو ڪاربن (DARCO، 100 ميش گرينولس)، Avicel (PH-101)، beech xylan، ۽ ٻيا سڀئي ڪيميائي شيون Sigma-Aldrich (سينٽ لوئس، MO) کان خريد ڪيا ويا.
AFEX اڳوڻي علاج GLBRC (بائيوماس ڪنورشن ريسرچ ليبارٽري، MSU، Lansing، MI، USA) ۾ ڪيو ويو.پري علاج 140 ° C. تي 15 منٽن لاء ڪيو ويو.46 رهائش جو وقت 1:1 تناسب تي اينهائيڊروس امونيا ۽ بايوماس جي تناسب تي 60٪ (w/w) اسٽينلیس اسٽيل بينچ ٽاپ بيچ ري ايڪٽر (پارر انسٽرمينٽس ڪمپني) ۾ لوڊ ڪندي.اهو 30 منٽ ورتو.ري ايڪٽر کي 140 ° C تي آندو ويو ۽ امونيا کي تيزيء سان آزاد ڪيو ويو، بايوماس کي جلدي ڪمري جي حرارت تي موٽڻ جي اجازت ڏني وئي.AFEX اڳ-علاج ٿيل ڪارن اسٽوور (ACS) جو ٺاھڻ غير علاج ٿيل مکين جي اسٽوور (UT-CS) سان ملندڙ جلندڙ ھو.
هاء سولڊس ACSH 25% (w/w) (تقريبن 8% dextran loading) oligosaccharides جي وڏي پيماني تي پيداوار لاءِ شروعاتي مواد طور تيار ڪيو ويو.ACS جو Enzymatic hydrolysis هڪ تجارتي اينزيم مرکب استعمال ڪندي ڪيو ويو جنهن ۾ Cellic® Ctec2 10 mg پروٽين/g گلوڪين (پريٽري ٿيل بايوماس ۾)، Htec2 (Novozymes، Franklinton، NC)، 5 mg protein/g glucan، ۽ Multifect Pectinase (Gencor Inc, USA).).)، 5 mg پروٽين/g dextran.Enzymatic hydrolysis 5-liter bioreactor ۾ 3 ليٽر، pH 4.8، 50° C ۽ 250 rpm جي ڪم ڪندڙ حجم سان ڪيو ويو.96 ڪلاڪن تائين هائيڊولائيزيشن کان پوءِ، هائيڊولائيزٽ کي سينٽري فيوگريشن ذريعي گڏ ڪيو ويو 6000 rpm تي 30 منٽن لاءِ ۽ پوءِ 14000 rpm تي 30 منٽن لاءِ غير هائيڊولائيز ٿيل سولڊز کي هٽائڻ لاءِ.هائيڊولائيزٽ کي پوءِ 0.22 ايم ايم فلٽر بيڪر ذريعي جراثيم کان پاڪ فلٽريشن جي تابع ڪيو ويو.فلٽر ٿيل هائيڊولائيزيٽ کي جراثيم کان پاڪ بوتلن ۾ 4 ° C تي ذخيرو ڪيو ويو ۽ پوء ڪاربان تي ورهايو ويو.
اين آر اي ايل جي ليبارٽري تجزيي جي طريقيڪار جي مطابق اقتباس تي ٻڌل بايوماس نموني جي جوڙجڪ جو تجزيو: ساخت جي تجزيي لاء نموني جي تياري (NREL/TP-510-42620) ۽ بايوماس (NREL/TP-510-4710) ۾ ساختي ڪاربوهائيڊريٽ ۽ ليگنين جو تعين.
hydrolyzate نديء جو Oligosaccharide تجزيو 2 ml پيماني تي ڪيو ويو آٽوڪلو-بنياد ايسڊ هائيڊولائيزس طريقو استعمال ڪندي.هائيڊولائيزٽ جي نموني کي 69.7 µl 72% سلفورڪ ايسڊ سان ملايو 10 ml اسڪرو ڪيپ ڪلچر ٽيوب ۾ ۽ 1 ڪلاڪ لاءِ بينچ ٽاپ تي 121 ° C تي انڪيوبيٽ ڪريو، برف تي ٿڌي ۽ هڪ اعلي ڪارڪردگي مائع ڪروميٽوگرافي (HPLC) شيشي ۾ فلٽر ڪريو.oligosaccharides جي ڪنسنٽريشن کي غير هائيڊولائيز ٿيل نموني ۾ مونوساڪريڊس جي ڪنسنٽريشن کي تيزاب-هائيڊولائيزڊ نموني ۾ ڪل کنڊ جي ڪنسنٽريشن مان گھٽائڻ سان طئي ڪيو ويو.
گلوڪوز، xylose، ۽ arabinose concentrations in acid hydrolysed biomass جو تجزيو ڪيو ويو Shimadzu HPLC سسٽم سان ليس آٽو سيمپلر، ڪالمن هيٽر، اسڪوڪريٽڪ پمپ، ۽ ريفرڪٽي انڊيڪس ڊيڪٽر سان ليس بائيو ريڊ امينڪس HPX-87H ڪالمن تي.ڪالمن کي 50 ° C تي برقرار رکيو ويو ۽ پاڻيء ۾ 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 سان وڌايو ويو.وهڪري.
hydrolyzate supernatant کي ملائي ڇڏيو ويو ۽ monomer ۽ oligosaccharide مواد لاء تجزيو ڪيو ويو.اينزيميٽڪ هائيڊولائيزيشن کان پوءِ حاصل ڪيل مونوميرڪ شگرز جو تجزيو ڪيو ويو HPLC پاران هڪ بايو-ريڊ (هرڪيولس، CA) امينڪس HPX-87P ڪالمن ۽ ايش گارڊ ڪالمن سان ليس.ڪالمن جي درجه حرارت 80 ° C تي برقرار رکيو ويو، پاڻي 0.6 ml/min جي وهڪري جي شرح سان موبائل مرحلي طور استعمال ڪيو ويو.Oligosaccharides refs ۾ بيان ڪيل طريقن جي مطابق 121 ° C تي dilute acid ۾ hydrolysis ذريعي طئي ڪيا ويا.41، 48، 49.
Saccharide تجزيو خام، AFEX اڳ ۾ علاج ٿيل ۽ سڀني غير هائيڊولائيز ٿيل بايوماس جي باقيات تي ڪيو ويو (بشمول سيريل سيل وال ڪڍڻ جي پيداوار ۽ انهن جي ايم اي بي اسڪريننگ) اڳ بيان ڪيل طريقا استعمال ڪندي 27، 43، 50، 51.گلائڪم جي تجزيي لاءِ، ٻوٽن جي سيل جي ڀت جي مادو جي شراب ۾ حل نه ٿيندڙ رهاڻ بايوماس جي رهزنن مان تيار ڪئي ويندي آهي ۽ سيريل ڪڍڻ جي تابع ڪئي ويندي آهي، وڌندڙ جارحتي ريجنٽس جهڙوڪ امونيم آڪساليٽ (50 ايم ايم)، سوڊيم ڪاربونيٽ (50 ايم ايم ۽ 0.5٪ w/v)، CON.(1M ۽ 4M، ٻئي 1٪ w/v sodium borohydride سان) ۽ تيزاب ڪلورائيٽ جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آھي52,53.اقتباس وري ELISA جي تابع ڪيا ويا mAb50s جي پيچيده پينل جي خلاف سيل وال گلائڪن ڏانهن هدايت ڪئي وئي، ۽ ايم اي بي پابند ردعمل کي گرمي نقشي جي طور تي پيش ڪيو ويو.mAbs ھدف ڪندڙ پلانٽ سيل وال گليڪان ليبارٽري اسٽاڪ مان خريد ڪيا ويا (CCRC، JIM ۽ MAC سيريز).
oligosaccharides جي هڪ-قدم biotinylation.بايوٽين-LC-hydrazide سان ڪاربوهائيڊريٽ جو ٺاهه هيٺين طريقي سان ڪيو ويو.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) ۾ 1 منٽ لاءِ 65° C. تي زوردار ھلائڻ ۽ گرم ڪرڻ سان.Glacial acetic acid (30 µl) شامل ڪيو ويو ۽ مرکب کي سوڊيم سائانوبوروهائيڊرائيڊ (6.4 mg/100 µmol) تي لڳايو ويو ۽ تقريباً 1 منٽ لاءِ 65° C. تي گرم ڪرڻ کان پوءِ مڪمل طور تي ڦهلجي ويو.ان کان پوء، رد عمل جي مرکب جي 5 کان 8 μl تائين خشڪ oligosaccharide (1-100 nmol) ۾ شامل ڪيو ويو ته 10-گنا يا وڌيڪ مولر اضافي حاصل ڪرڻ لاء ليبل کي گھٽائڻ واري آخر تي.رد عمل 65 ° C تي 2 ڪلاڪ لاء ڪيو ويو، جنهن کان پوء نموني کي فوري طور تي صاف ڪيو ويو.ليبلنگ تجربن ۾ ڪو به سوڊيم سائانوبورو هائيڊرائڊ استعمال نه ڪيو ويو بغير گھٽتائي جي، ۽ نموني کي 2.5 ڪلاڪن تائين 65 ° C تي رد ڪيو ويو.
ELISA ڪوٽنگ ۽ بايوٽينيليٽ oligosaccharides جي نموني جي ڌوئڻ.25 μl biotinylated نمونا (100 μl هر متمرکز نموني جو 5 ml 0.1 M Tris بفر حل (TBS) ۾ ملائي) avidin-coated پليٽ جي هر کوهه ۾ شامل ڪيا ويا.ڪنٽرول ويلز کي 0.1 M TBS ۾ 10 μg/ml جي ڪنسنٽريشن تي 50 μl بايوٽين سان گڏ ڪيو ويو.Deionized پاڻي خالي ماپ لاء ڪوٽنگ طور استعمال ڪيو ويو.ٽيبلٽ کي 2 ڪلاڪن تائين ڪمري جي حرارت تي اونداهي ۾ رکيو ويو.پروگرام نمبر استعمال ڪندي پليٽ کي 3 ڀيرا 0.1٪ اسڪيم ٿيل کير سان 0.1 M TBS ۾ ڌوئي.گرينئر فليٽ 3A لاءِ 11.
پرائمري اينٽي باڊيز جو اضافو ۽ ڌوئڻ.شامل ڪريو 40 µl پرائمري اينٽي باڊي هر کوهه ۾.اونداهي ۾ ڪمري جي حرارت تي 1 ڪلاڪ لاء مائڪروپليٽ کي وڌايو.گرينئر فليٽ 3A لاءِ واش پروگرام #11 استعمال ڪندي پليٽن کي 3 ڀيرا 0.1% کير سان 0.1M TBS ۾ ڌويو ويو.
ثانوي اينٽي باڊي شامل ڪريو ۽ ڌوئڻ.50 µl ماؤس/چوٿون سيڪنڊري اينٽي باڊي شامل ڪريو (0.1 M TBS ۾ 0.1٪ کير ۾ 1:5000 کي ملائي) هر کوهه ۾.اونداهي ۾ ڪمري جي حرارت تي 1 ڪلاڪ لاء مائڪروپليٽ کي وڌايو.مائڪپليٽس کي پوءِ 0.1 M TBS ۾ 0.1% کير سان 5 ڀيرا ڌويو ويو گرينئر فليٽ 5A پليٽ واش پروگرام #12 استعمال ڪندي.
هڪ substrate شامل ڪرڻ.شامل ڪريو 50 µl جو 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) بنيادي سبسٽريٽ ۾ (2 قطرا بفر جا، 3 قطرا TMB، 2 قطرا هائڊروجن پرڪسائيڊ جا 15 مليل ڊيونائيزڊ پاڻي ۾ شامل ڪري).TMB ذيلي ذخيرو تيار ڪريو.۽ استعمال کان اڳ vortex).30 منٽن لاء ڪمري جي حرارت تي مائڪروپليٽ کي وڌايو.اوندهه ۾.
قدم مڪمل ڪريو ۽ ٽيبليٽ پڙهو.هر کوهه ۾ 50 µl جو 1 N سلفورڪ ايسڊ شامل ڪريو ۽ ELISA ريڊر استعمال ڪندي 450 کان 655 nm جي جذب کي رڪارڊ ڪريو.
تيار ڪريو 1 mg/ml انهن تجزين جو حل deionized پاڻي ۾: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmanosamine (mantyNAlluce-Nalycosamine),.(glcNAc)، N-acetylgalactosamine (galNAc)، inositol (اندروني معيار).ٽيبل 1 ۾ ڏيکاريل 1 mg/mL کنڊ جو حل شامل ڪري ٻه معيار تيار ڪيا ويا. نمونن کي منجمد ڪيو ويندو آهي ۽ -80 ° C. تي ليوفيلائز ڪيو ويندو آهي جيستائين سڄو پاڻي ختم نه ٿئي (عام طور تي 12-18 ڪلاڪ).
100-500 µg نموني شامل ڪريو ڪيپ ٽيوب کي اسڪرو ڪرڻ لاءِ تجزياتي توازن تي.شامل ڪيل رقم کي رڪارڊ ڪريو.اهو بھترين آھي ته نموني کي محلول جي مخصوص ڪنسنٽريشن ۾ ٽوڙيو ۽ ان کي ٽيوب ۾ مائع aliquot طور شامل ڪيو وڃي.استعمال ڪريو 20 µl جو 1 mg/ml inositol هر نموني ٽيوب لاءِ اندروني معيار طور.نموني ۾ شامل ڪيل اندروني معيار جي مقدار کي معياري ٽيوب ۾ شامل ڪيل اندروني معيار جي مقدار جي برابر هجڻ گهرجي.
اسڪرو ڪيپ جي شيشي ۾ 8 مليل اينهائيڊرس ميٿانول شامل ڪريو.ان کان پوء 4 ml 3 N. ميٿانولڪ HCl حل، ڍڪيو ۽ ڇڪايو.اهو عمل پاڻي استعمال نٿو ڪري.
500 µl جو 1 M HCl ميٿانول حل oligosaccharide نموني ۽ معياري TMS ٽيوب ۾ شامل ڪريو.نمونن کي رات جو (168 ڪلاڪ) 80 ° C تي گرميءَ واري بلاڪ ۾ سينگاريو ويو.ميٿانولوزس پراڊڪٽ کي ڪمري جي حرارت تي خشڪ ڪرڻ واري ميني فولڊ استعمال ڪندي خشڪ ڪريو.200 µl MeOH شامل ڪريو ۽ وري سڪي.اهو عمل ٻه ڀيرا بار بار ڪيو ويندو آهي.نموني ۾ 200 µl ميٿانول، 100 µl pyridine ۽ 100 µl acetic anhydride شامل ڪريو ۽ چڱي طرح ملايو.نموني 30 منٽن تائين ڪمري جي حرارت تي پکڙيل هئا.۽ خشڪ.200 µl ميٿانول شامل ڪريو ۽ وري سڪي.
200 µl Tri-Sil شامل ڪريو ۽ 20 منٽن لاءِ ڪيپ ٿيل ٽيوب کي گرم ڪريو.80 ° سي، پوء ڪمري جي حرارت تي ٿڌي.50 µl جي مقدار تائين نموني کي وڌيڪ سڪي وڃڻ لاءِ خشڪ ڪرڻ وارو ميني فولڊ استعمال ڪريو.اهو نوٽ ڪرڻ ضروري آهي ته اسان نموني کي مڪمل طور تي سڪي وڃڻ جي اجازت نه ڏني هئي.
هيڪسين جو 2 مليل شامل ڪريو ۽ چڱي طرح سان گڏ ڪريو.5-3/4 انچ قطر جي پائيپٽ جي مٿان شيشي جي اون داخل ڪري شيشي جي اون جي هڪ ٽڪري سان پيسٽور پائيپٽس (5-8 ملي ايم) جي ڪنارن کي ڀريو.نمونا 3000 گرام تي 2 منٽن لاء سينٽرفيوج ڪيا ويا.ڪو به حل نه ٿيندڙ رهجي ويا آهن.نموني کي 100-150 μl تائين خشڪ ڪريو.تقريبن 1 μl جو حجم GC-MS ۾ 80 ° C جي شروعاتي درجه حرارت ۽ 2.0 منٽ جي شروعاتي وقت تي انجڻ ڪيو ويو (ٽيبل 2).