Nature.com تي اچڻ لاءِ مهرباني. توهان جي استعمال ڪيل برائوزر ورزن ۾ محدود CSS سپورٽ آهي. بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي غير فعال ڪريو). انهي دوران، مسلسل سپورٽ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، اسان سائيٽ کي اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ کان سواءِ رينڊر ڪنداسين.
AFEX سان اڳ ۾ علاج ڪيل مکڻ جي اسٽوور ۾ مسلسل اوليگوساڪرائڊس جي پيچيده تجزيي لاءِ نوان امونولوجيڪل ۽ ماس اسپيڪٽروميٽرڪ طريقا. ليگنوسيلوسڪ بايوماس فوسل ايندھن جو هڪ پائيدار متبادل آهي ۽ کاڌي، فيڊ، ايندھن ۽ ڪيميڪل جهڙين شين جي پيداوار لاءِ بايو ٽيڪنالاجي کي ترقي ڪرڻ لاءِ وڏي پيماني تي استعمال ڪيو ويندو آهي. انهن ٽيڪنالاجي جي ڪنجي ٻوٽن جي سيل ڀتين ۾ موجود پيچيده ڪاربوهائيڊريٽس کي سادي شگر جهڙوڪ گلوڪوز، زائلوز ۽ عربينوز ۾ تبديل ڪرڻ لاءِ قيمت جي مقابلي واري عملن جي ترقي آهي. ڇاڪاڻ ته ليگنوسيلوسڪ بايوماس تمام ضدي آهي، ان کي گهربل پيداوار حاصل ڪرڻ لاءِ ٿرمو ڪيميڪل علاج (مثال طور، امونيا فائبر ايڪسفوليئشن (AFEX)، ڊائليٽ ايسڊ (DA)، آئنڪ مائع (IL)) ۽ حياتياتي علاج (مثال طور، اينزيميٽڪ هائيڊولائسس ۽ مائڪروبيل خمير) جي تابع هجڻ گهرجي. . جڏهن ته، جڏهن هائيڊرولائسس جي عمل ۾ ڪمرشل فنگل اينزائمز استعمال ڪيا ويندا آهن، ته ٺهيل حل ٿيندڙ شگر مان صرف 75-85٪ مونوساڪرائڊز آهن، ۽ باقي 15-25٪ حل ٿيندڙ، ناقابلِ حل ٿيندڙ اوليگوساڪرائڊز آهن، جيڪي هميشه مائڪروجنزمن لاءِ دستياب نه هوندا آهن. اڳي، اسان ڪاربن ۽ ڊائيٽوميسيس زمين جي علحدگي ۽ سائيز خارج ڪرڻ ڪروميٽوگرافي جي ميلاپ کي استعمال ڪندي حل ٿيندڙ ضدي اوليگوساڪرائڊز کي ڪاميابي سان الڳ ۽ صاف ڪيو آهي، ۽ انهن جي اينزائم روڪڻ واري خاصيتن جي پڻ جاچ ڪئي آهي. اسان اهو ڏٺو آهي ته پوليمرائيزيشن (DP) جي اعلي درجي جي ميٿائليٽڊ يورونڪ ايسڊ متبادل تي مشتمل اوليگوساڪرائڊز کي گهٽ DP ۽ غير جانبدار اوليگوساڪرائڊز جي ڀيٽ ۾ ڪمرشل اينزائم مرکبن سان پروسيس ڪرڻ وڌيڪ ڏکيو آهي. هتي اسان ڪيترن ئي اضافي طريقن جي استعمال جي رپورٽ ڪريون ٿا، جنهن ۾ ٻوٽن جي سيل والز ۽ اينزيميٽڪ هائيڊرولائسٽس ۾ گلائيڪن بانڊز کي نمايان ڪرڻ لاءِ ٻوٽن جي بايوماس گلائيڪنز لاءِ مخصوص مونوڪلونل اينٽي باڊيز (mAbs) استعمال ڪندي گلائيڪن پروفائلنگ شامل آهي، ميٽرڪس جي مدد سان ليزر ڊيسورپشن آئنائيزيشن، ٽائيم آف فلائيٽ ماس اسپيڪٽروميٽري. MALDI-TOF-MS) منفي آئنز، گيس ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري (GC-MS) جي ثانوي خرابي کان پوءِ اسپيڪٽرو اسڪوپي ذريعي حاصل ڪيل ساخت-معلوماتي تشخيصي چوٽين کي استعمال ڪري ٿو ته جيئن ڊيريويٽيزيشن سان ۽ بغير اوليگوساڪرائڊ بانڊز کي بيان ڪري سگهجي. اوليگوساڪرائڊز جي ننڍڙي سائيز (DP 4-20) جي ڪري، انهن ماليڪيولز کي mAb بائنڊنگ ۽ ڪردار نگاري لاءِ استعمال ڪرڻ ڏکيو آهي. هن مسئلي کي دور ڪرڻ لاءِ، اسان هڪ نئون بايوٽين ڪنجوگيشن تي ٻڌل اوليگوساڪرائڊ اموبيلائيزيشن طريقو لاڳو ڪيو جنهن مائڪروپليٽ جي مٿاڇري تي گهٽ DP حل ٿيندڙ اوليگوساڪرائڊز جي اڪثريت کي ڪاميابي سان ليبل ڪيو، جيڪو پوءِ مخصوص ليگيشن تجزيو لاءِ هڪ هاءِ ٿرو پُٽ mAb سسٽم ۾ استعمال ڪيو ويو. هي نئون طريقو مستقبل ۾ وڌيڪ ترقي يافته هاءِ ٿرو پُٽ گلائڪوم اسيس جي ترقي کي آسان بڻائيندو جيڪو تشخيصي مقصدن لاءِ بايو مارڪرز ۾ موجود اوليگوساڪرائڊز کي الڳ ڪرڻ ۽ خاصيت ڏيڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجي ٿو.
زرعي، ٻيلن، گاهه ۽ ڪاٺ جي مواد تي مشتمل، ليگنوسيلوسڪ بايوماس، بايو تي ٻڌل شين جي پيداوار لاءِ هڪ امڪاني فيڊ اسٽاڪ آهي، جنهن ۾ کاڌو، کاڌو، ايندھن ۽ ڪيميائي اڳڪٿيون شامل آهن جيڪي اعليٰ قدر جون شيون پيدا ڪن ٿيون1. ​​ٻوٽن جي سيل جي ڀتين ۾ موجود ڪاربوهائيڊريٽ (جهڙوڪ سيلولوز ۽ هيميسيلوز) کي ڪيميائي پروسيسنگ ۽ بايو ٽرانسفارميشن (جهڙوڪ اينزيميٽڪ هائيڊروليسس ۽ مائڪروبيل خمير) ذريعي مونوساڪرائڊز ۾ ڊيپوليمرائيز ڪيو ويندو آهي. عام پري ٽريٽمينٽ ۾ امونيا فائبر ايڪسپينشن (AFEX)، ڊائليٽ ايسڊ (DA)، آئنڪ مائع (IL)، ۽ اسٽيم ايڪسپلوزيشن (SE) شامل آهن، جيڪي ٻوٽي جي سيل جي ڀتين کي کولڻ سان ليگنوسيلوز جي پيداوار کي گهٽائڻ لاءِ ڪيميڪلز ۽ گرمي جي ميلاپ کي استعمال ڪندا آهن3,4. مادي جي ضد، 5. اينزيميٽڪ هائيڊروليسس هڪ اعلي سولڊس لوڊ تي ڪمرشل ايڪٽو ڪاربوهائيڊريٽ تي مشتمل اينزائمز (CAZymes) ۽ مائڪروبيل خمير کي استعمال ڪندي ٽرانسجينڪ خمير يا بيڪٽيريا استعمال ڪندي بايو تي ٻڌل ايندھن ۽ ڪيميڪل پيدا ڪرڻ لاءِ ڪيو ويندو آهي 6.
ڪمرشل اينزائمز ۾ CAZymes اينزائمز جي هڪ پيچيده مرکب مان ٺهيل آهن جيڪي پيچيده ڪاربوهائيڊريٽ-شوگر بانڊز کي هم آهنگي سان ٽوڙي مونوساڪرايڊس 2,7 ٺاهيندا آهن. جيئن اسان اڳ ۾ ٻڌايو، ڪاربوهائيڊريٽ سان ليگنين جي خوشبودار پوليمر جو پيچيده نيٽ ورڪ انهن کي انتهائي ناقابل برداشت بڻائي ٿو، جيڪو نامڪمل کنڊ جي تبديلي جو سبب بڻجي ٿو، 15-25٪ جنسي اوليگوساڪرائڊس کي گڏ ڪري ٿو جيڪي اڳ ۾ علاج ٿيل بايوماس جي اينزيميٽڪ هائيڊولائيسس دوران پيدا نه ٿيندا آهن. هي مختلف بايوماس پريٽريٽمينٽ طريقن سان هڪ عام مسئلو آهي. هن رڪاوٽ جي ڪجهه سببن ۾ هائيڊولائيسس دوران اينزائم جي روڪٿام، يا ضروري ضروري اينزائمز جي غير موجودگي يا گهٽ سطح شامل آهن جيڪي ٻوٽي جي بايوماس ۾ شوگر بانڊز کي ٽوڙڻ لاءِ گهربل آهن. شگر جي بناوت ۽ ساخت جي خاصيتن کي سمجهڻ، جهڙوڪ اوليگوساڪرائڊس ۾ شوگر بانڊ، اسان کي هائيڊولائيسس دوران شوگر جي تبديلي کي بهتر بڻائڻ ۾ مدد ڪندو، بايوٽيڪنالوجيڪل عملن کي پيٽروليم مان نڪتل شين سان قيمت جي مقابلي ۾.
ڪاربوهائيڊريٽ جي بناوت جو تعين ڪرڻ مشڪل آهي ۽ ان لاءِ طريقن جي ميلاپ جي ضرورت آهي جهڙوڪ مائع ڪروميٽوگرافي (LC)11,12، نيوڪليئر ميگنيٽڪ ريزوننس اسپيڪٽرو اسڪوپي (NMR)13، ڪيپيلري اليڪٽرروفورسس (CE)14,15,16 ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري (MS)17.، ارڙهن. ايم ايس طريقا جهڙوڪ ٽائيم آف فلائيٽ ماس اسپيڪٽروميٽري ليزر ڊيسورپشن سان ۽ ميٽرڪس (MALDI-TOF-MS) استعمال ڪندي آئنائيزيشن ڪاربوهائيڊريٽ ڍانچي جي سڃاڻپ لاءِ هڪ ورسٽائل طريقو آهي. تازو، ڪوليشن-انڊيوسڊ ڊسسوسيئيشن (CID) ٽينڊم MS آف سوڊيم آئن ايڊڪٽس کي اوليگوساڪرائڊ اٽيچمينٽ پوزيشن، اينومريڪ ڪنفيگريشن، سيڪوئنس، ۽ برانچنگ پوزيشن 20، 21 سان لاڳاپيل فنگر پرنٽس جي سڃاڻپ لاءِ تمام گهڻو استعمال ڪيو ويو آهي.
گلائيڪن تجزيو ڪاربوهائيڊريٽ بانڊز 22 جي کوٽائي جي سڃاڻپ لاءِ هڪ بهترين اوزار آهي. هي طريقو پيچيده ڪاربوهائيڊريٽ لنڪيج کي سمجهڻ لاءِ ٻوٽي جي سيل وال گلائيڪن کي هدايت ڪيل مونوڪلونل اينٽي باڊيز (mAbs) کي پروب طور استعمال ڪري ٿو. 250 کان وڌيڪ mAbs دنيا ۾ موجود آهن، جيڪي مختلف سيڪرائڊز 24 استعمال ڪندي مختلف لڪير ۽ شاخن واري اوليگوسيڪرائڊز جي خلاف ٺهيل آهن. ڪيترائي mAbs وڏي پيماني تي ٻوٽي جي سيل وال جي جوڙجڪ، ساخت، ۽ تبديلين کي بيان ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيا ويا آهن، ڇاڪاڻ ته ٻوٽي جي سيل جي قسم، عضوو، عمر، ترقي جي مرحلي، ۽ واڌ جي ماحول 25,26 تي منحصر ڪري اهم فرق آهن. تازو، هي طريقو ٻوٽن ۽ جانورن جي نظامن ۾ ويسيڪل آبادي ۽ گلائيڪن ٽرانسپورٽ ۾ انهن جي لاڳاپيل ڪردارن کي سمجهڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو آهي جيئن سب سيلولر مارڪرز، ترقياتي مرحلن، يا ماحولياتي محرکن پاران طئي ڪيو ويو آهي، ۽ اينزيميٽڪ سرگرمي کي طئي ڪرڻ لاءِ. گلائڪين ۽ زائلن جي ڪجھ مختلف بناوتن جي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي جن ۾ پيڪٽين (P)، زائلان (X)، مانان (M)، زائلوگلوڪانس (XylG)، مخلوط بانڊ گلوڪن (MLG)، اربينو آڪسيلان (ArbX)، گليڪٽومانن (GalG)، گلوڪورونڪ ايسڊ-اربين آڪسيلان (GArbX) ۽ اربينو-گليڪٽان (ArbG)29 شامل آهن.
جڏهن ته، انهن سڀني تحقيقي ڪوششن جي باوجود، صرف ڪجهه مطالعي هاءِ سولڊس لوڊ (HSL) هائيڊولائيزيشن دوران اوليگوساڪرائڊ جي جمع ٿيڻ جي نوعيت تي ڌيان ڏنو آهي، جنهن ۾ اوليگوساڪرائڊ جي ڇڏڻ، هائيڊولائيزيشن دوران اوليگوميرڪ زنجير جي ڊيگهه ۾ تبديليون، مختلف گهٽ ڊي پي پوليمر، ۽ انهن جا وکر شامل آهن. تقسيم 30,31,32. ان دوران، جيتوڻيڪ گليڪان تجزيو گليڪان جي جوڙجڪ جي جامع تجزيي لاءِ هڪ ڪارآمد اوزار ثابت ٿيو آهي، اينٽي باڊي طريقن کي استعمال ڪندي پاڻي ۾ حل ٿيندڙ گهٽ ڊي پي اوليگوساڪرائڊ جو جائزو وٺڻ ڏکيو آهي. 5-10 kDa کان گهٽ ماليڪيولر وزن سان ننڍا DP اوليگوساڪرائڊ ELISA پليٽس 33,34 سان جڙيل نه آهن ۽ اينٽي باڊي جي اضافي کان اڳ ڌوئي ويندا آهن.
هتي، پهريون ڀيرو، اسان مونوڪلونل اينٽي باڊيز استعمال ڪندي ايويڊن-ڪوٽيڊ پليٽن تي ELISA ٽيسٽ جو مظاهرو ڪريون ٿا، گلائڪوم تجزيي سان گڏ گھلنشيل ريفريڪٽري اوليگوساڪرائڊس لاءِ هڪ قدم بايوٽينيليشن طريقيڪار کي گڏ ڪريون ٿا. گلائڪوم تجزيي لاءِ اسان جو طريقو MALDI-TOF-MS ۽ GC-MS تي ٻڌل تجزيو ذريعي تصديق ڪيو ويو جيڪو هائيڊولائيزڊ شوگر ڪمپوزيشن جي ٽرائيميٿائل سليل (TMS) ڊيريويٽيزيشن استعمال ڪندي مڪمل اوليگوساڪرائڊ لنڪيجز جو آهي. هي جديد طريقو مستقبل ۾ هڪ اعليٰ ٿرو پُٽ طريقو طور ترقي ڪري سگهجي ٿو ۽ بايو ميڊيڪل ريسرچ ۾ وسيع ايپليڪيشن ڳولي سگهجي ٿو.
اينزائمز ۽ اينٽي باڊيز جي پوسٽ-ٽرانسليشنل تبديليون، جهڙوڪ گلائڪوسائيليشن، 36 انهن جي حياتياتي سرگرمي کي متاثر ڪن ٿيون. مثال طور، سيرم پروٽين جي گلائڪوسائيليشن ۾ تبديليون سوزش واري گٿريت ۾ اهم ڪردار ادا ڪن ٿيون، ۽ گلائڪوسائيليشن ۾ تبديليون تشخيصي نشانن جي طور تي استعمال ڪيون وينديون آهن 37. ادب ۾ مختلف گلائڪن جي رپورٽ ڪئي وئي آهي ته اهي مختلف بيمارين ۾ آساني سان ظاهر ٿين ٿا، جن ۾ گيسٽرو انٽيسٽينل ٽريڪ ۽ جگر جي دائمي سوزش واري بيماريون، وائرل انفيڪشن، رحم، سينو، ۽ پروسٽيٽ ​​ڪينسر 38,39,40 شامل آهن. اينٽي باڊي تي ٻڌل گلائڪن ELISA طريقن کي استعمال ڪندي گلائڪن جي جوڙجڪ کي سمجهڻ پيچيده MS طريقن جي استعمال کان سواءِ بيماري جي تشخيص ۾ اضافي اعتماد فراهم ڪندو.
اسان جي پوئين مطالعي مان ظاهر ٿيو ته ضدي اوليگوساڪرائڊز پريٽريٽمينٽ ۽ اينزيميٽڪ هائيڊولائيزس کان پوءِ غير هائيڊولائيزڊ رهيا (شڪل 1). اسان جي اڳ شايع ٿيل ڪم ۾، اسان AFEX-پريٽريٽ ٿيل ڪارن اسٽوور هائيڊولائيزٽ (ACSH)8 کان اوليگوساڪرائڊز کي الڳ ڪرڻ لاءِ هڪ چالو ٿيل چارڪو سولڊ فيز ڪڍڻ جو طريقو تيار ڪيو. شروعاتي ڪڍڻ ۽ الڳ ڪرڻ کان پوءِ، اوليگوساڪرائڊز کي سائيز ايڪسڪلوشن ڪروميٽوگرافي (SEC) ذريعي وڌيڪ ورهايو ويو ۽ ماليڪيولر وزن جي ترتيب ۾ گڏ ڪيو ويو. مختلف پريٽريٽمينٽ مان جاري ڪيل شوگر مونومر ۽ اوليگومر جو تجزيو شوگر جي جوڙجڪ جي تجزيي ذريعي ڪيو ويو. جڏهن مختلف پريٽريٽمينٽ طريقن سان حاصل ڪيل شوگر اوليگومر جي مواد جو مقابلو ڪيو وڃي ٿو، ضدي اوليگوساڪرائڊز جي موجودگي بايوماس کي مونوساڪرائڊز ۾ تبديل ڪرڻ ۾ هڪ عام مسئلو آهي ۽ گهٽ ۾ گهٽ 10-15٪ ۽ اڃا تائين 18٪ تائين کنڊ جي پيداوار ۾ گهٽتائي جو سبب بڻجي سگهي ٿي. آمريڪا. هي طريقو اوليگوساڪرائڊ فريڪشن جي وڌيڪ وڏي پيماني تي پيداوار لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. نتيجي ۾ ACH ۽ ان جي بعد ۾ مختلف ماليڪيولر وزنن سان گڏ مختلف ماليڪيولر وزنن کي هن ڪم ۾ اوليگوساڪرائڊز جي خاصيت لاءِ تجرباتي مواد طور استعمال ڪيو ويو.
پريٽريٽمينٽ ۽ اينزيميٽڪ هائيڊرولائيزيشن کان پوءِ، مسلسل اوليگوساڪرائڊز غير هائيڊرولائيزيشن رهيا. هتي (الف) هڪ اوليگوساڪرائڊ الڳ ڪرڻ جو طريقو آهي جنهن ۾ اوليگوساڪرائڊز کي AFEX-پريٽريٽ ٿيل ڪارن اسٽوور هائيڊرولائيزيٽ (ACSH) کان چالو ڪاربن ۽ ڊائيٽوميسيس زمين جي پيڪ ٿيل بستري استعمال ڪندي الڳ ڪيو ويندو آهي؛ (ب) اوليگوساڪرائڊز کي الڳ ڪرڻ جو طريقو. اوليگوساڪرائڊز کي سائيز ايڪسڪلوشن ڪروميٽوگرافي (SEC) ذريعي وڌيڪ الڳ ڪيو ويو؛ (ج) مختلف پريٽريٽمينٽس مان جاري ڪيل سيڪرائڊ مونومر ۽ اوليگومر (ڊائليٽڊ ايسڊ: DA، آئنڪ مائع: IL ۽ AFEX). اينزيميٽڪ هائيڊرولائيزيشن حالتون: 25٪ (w/w) جي اعلي سولڊس لوڊنگ (تقريبن 8٪ گلوڪن لوڊنگ)، 96 ڪلاڪ هائيڊرولائيزيشن، 20 mg/g ڪمرشل اينزائم لوڊنگ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 تناسب) ۽ (د) AFEX پريٽريٽ ٿيل ڪارن اسٽوور (ACS) مان جاري ڪيل گلوڪوز، زائلوز ۽ عربينوز جا شوگر مونومر ۽ اوليگومر.
گلائيڪن تجزيو مضبوط بايوماس جي باقيات مان الڳ ٿيل عرق ۾ گلائيڪن جي جامع ساخت جي تجزيي لاءِ هڪ مفيد اوزار ثابت ٿيو آهي. تنهن هوندي به، هن روايتي طريقي 41 استعمال ڪندي پاڻي ۾ حل ٿيندڙ سيڪرائڊس کي گهٽ نمائندگي ڏني وئي آهي ڇاڪاڻ ته گهٽ ماليڪيولر وزن واري اوليگوسيڪرائڊس کي ELISA پليٽن تي متحرڪ ڪرڻ ڏکيو آهي ۽ اينٽي باڊي شامل ڪرڻ کان اڳ ڌوئي ويندا آهن. تنهن ڪري، اينٽي باڊي بائنڊنگ ۽ خاصيت لاءِ، هڪ قدم بايوٽينيليشن طريقو استعمال ڪيو ويو هو حل ٿيندڙ، غير تعميل واري اوليگوسيڪرائڊس کي ايوڊين ڪوٽيڊ ELISA پليٽن تي ڪوٽ ڪرڻ لاءِ. هي طريقو اسان جي اڳ ۾ تيار ڪيل ACSH ۽ ان جي ماليڪيولر وزن (يا پوليمرائيزيشن جي ڊگري، DP) جي بنياد تي هڪ حصو استعمال ڪندي آزمايو ويو. ڪاربوهائيڊريٽ جي گھٽائيندڙ آخر ۾ بايوٽين-LC-هائيڊرازائيڊ شامل ڪندي اوليگوسيڪرائڊ بائنڊنگ لاڳاپو وڌائڻ لاءِ هڪ قدم بايوٽينيليشن استعمال ڪيو ويو (شڪل 2). حل ۾، گھٽائيندڙ آخر ۾ هيمياسيٽل گروپ بايوٽين-LC-هائيڊرازائيڊ جي هائيڊرازائيڊ گروپ سان رد عمل ظاهر ڪري ٿو ته جيئن هائيڊرازون بانڊ ٺاهي سگهجي. گهٽائڻ واري ايجنٽ NaCNBH3 جي موجودگي ۾، هائيڊرازون بانڊ هڪ مستحڪم بايوٽينيلٽيڊ اينڊ پراڊڪٽ ۾ گهٽجي ويندو آهي. شوگر گهٽائڻ واري اينڊ جي ترميم سان، گهٽ ڊي پي اوليگوساڪرائڊس کي ELISA پليٽن سان ڳنڍڻ ممڪن ٿي ويو، ۽ اسان جي مطالعي ۾ اهو گلائيڪن-ٽارگيٽڊ mAbs استعمال ڪندي ايوڊين-ڪوٽيڊ پليٽن تي ڪيو ويو.
بايوٽينيلٽيڊ اوليگوساڪرائڊس لاءِ ELISA جي بنياد تي مونوڪلونل اينٽي باڊيز جي اسڪريننگ. هتي (A) اوليگوساڪرائڊس جي گڏيل بايوٽينيليشن ۽ بعد ۾ ELISA اسڪريننگ NeutrAvidin ڪوٽيڊ پليٽن تي گلائيڪن-ٽارگيٽڊ mAbs سان ۽ (B) رد عمل جي شين جي بايوٽينيليشن لاءِ هڪ قدم وارو طريقو ڏيکاري ٿو.
پوءِ اوليگوساڪرائڊ-ڪنجوگيٽڊ اينٽي باڊيز سان گڏ ايويڊين-ڪوٽيڊ پليٽون پرائمري ۽ سيڪنڊري اينٽي باڊيز ۾ شامل ڪيون ويون ۽ روشني ۽ وقت جي لحاظ کان حساس وچولي ۾ ڌوئي ويون. اينٽي باڊي بائنڊنگ مڪمل ٿيڻ کان پوءِ، پليٽ کي انڪيوبيٽ ڪرڻ لاءِ TMB سبسٽريٽ شامل ڪريو. رد عمل آخرڪار سلفورڪ ايسڊ سان بند ڪيو ويو. اينٽي باڊي مخصوص ڪراس لنڪنگ کي ڳولڻ لاءِ هر اينٽي باڊي جي بائنڊنگ طاقت کي طئي ڪرڻ لاءِ ELISA ريڊر استعمال ڪندي انڪيوبيٽ ٿيل پليٽن جو تجزيو ڪيو ويو. تجربي جي تفصيل ۽ پيرا ميٽرز لاءِ، لاڳاپيل سيڪشن "مواد ۽ طريقا" ڏسو.
اسان مخصوص ايپليڪيشنن لاءِ هن نئين ترقي يافته طريقي جي افاديت جو مظاهرو ڪريون ٿا ACSH ۾ موجود حل ٿيندڙ اوليگوساڪرائڊس جي خاصيت ڪندي ۽ گڏوگڏ لينگوسلوولوسڪ هائيڊرولائيسيٽس کان الڳ ٿيل خام ۽ صاف ٿيل اوليگوساڪرائڊ حصن ۾. جيئن شڪل 3 ۾ ڏيکاريل آهي، ACSH ۾ بايو ايڪيليليٽڊ گلائڪوم ايسي طريقن کي استعمال ڪندي سڃاڻپ ڪيل سڀ کان عام ايپيٽوپ-متبادل زائلان عام طور تي يورونڪ (U) يا ميٿيلورونڪ (MeU) ۽ پيڪٽڪ عربينوگاليڪٽان آهن. انهن مان گھڻا اسان جي پوئين مطالعي ۾ غير هائيڊرولائيزڊ سولڊس (UHS)43 جي گلائڪن جي تجزيي تي پڻ مليا هئا.
سيل وال گلائيڪن ڏانهن هدايت ڪيل مونوڪلونل اينٽي باڊي استعمال ڪندي ريڪالسيٽرنٽ اوليگوساڪرائڊ ايپيٽوپس جي سڃاڻپ. "غير جانبدار" حصو ACN حصو آهي ۽ "تيزابي" حصو FA حصو آهي. هيٽ ميپ تي روشن ڳاڙهو وڌيڪ ايپيٽوپ مواد جي نشاندهي ڪن ٿا، ۽ روشن نيرو هڪ خالي پس منظر جي نشاندهي ڪن ٿا. پيماني تي رنگن جون قيمتون فارموليشن N=2 لاءِ خام OD قدرن تي ٻڌل آهن. اينٽي باڊيز پاران سڃاتل مکيه ايپيٽوپس ساڄي پاسي ڏيکاريا ويا آهن.
انهن غير سيلولوز ڍانچن کي آزمائشي ڪمرشل اينزائم مرکب ۾ سڀ کان عام سيلوليز ۽ هيميسيلوليز ذريعي نه ٽوڙي سگهجي ٿو، جنهن ۾ سڀ کان وڌيڪ عام طور تي استعمال ٿيندڙ ڪمرشل اينزائم شامل آهن. تنهن ڪري، انهن جي هائيڊولائيزيشن لاءِ نوان معاون اينزائم گهربل آهن. ضروري غير سيلولوز معاون اينزائمز کان سواءِ، اهي غير سيلولوز بانڊ مونوساڪرائڊس ۾ مڪمل تبديلي کي روڪيندا آهن، جيتوڻيڪ انهن جي والدين شوگر پوليمر کي وڏي پيماني تي ننڍن ٽڪرن ۾ هائيڊولائيز ڪيو وڃي ۽ ڪمرشل اينزائم مرکب استعمال ڪندي حل ڪيو وڃي.
سگنل ورڇ ۽ ان جي پابند طاقت جي وڌيڪ مطالعي مان ظاهر ٿيو ته پابند ايپيٽوپس گهٽ ڊي پي کنڊ جي حصن (اي، بي، سي، ڊي پي 20+ تائين) ۾ گهٽ ڊي پي حصن (ڊي، اي، ايف، ڊي پي) جي ڀيٽ ۾ گهٽ هئا (شڪل 1). تيزابي ٽڪرا غير جانبدار ٽڪرن جي ڀيٽ ۾ غير سيلولوز ايپيٽوپس ۾ وڌيڪ عام آهن. اهي رجحان اسان جي پوئين مطالعي ۾ مشاهدو ڪيل نموني سان مطابقت رکن ٿا، جتي اعلي ڊي پي ۽ تيزابي ٽڪرا اينزيميٽڪ هائيڊولائيسس جي خلاف وڌيڪ مزاحمتي هئا. تنهن ڪري، غير سيلولوز گليڪان ايپيٽوپس ۽ يو ۽ مي يو متبادل جي موجودگي اوليگوساڪرائڊس جي استحڪام ۾ تمام گهڻو حصو وٺي سگهي ٿي. اهو ياد رکڻ گهرجي ته پابند ۽ ڳولڻ جي ڪارڪردگي گهٽ ڊي پي اوليگوساڪرائڊس لاءِ مسئلو ٿي سگهي ٿي، خاص طور تي جيڪڏهن ايپيٽوپ هڪ ڊائميرڪ يا ٽرائمرڪ اوليگوساڪرائڊس آهي. ان کي مختلف ڊيگهه جي تجارتي اوليگوساڪرائڊس استعمال ڪندي آزمائي سگهجي ٿو، هر هڪ ۾ صرف هڪ ايپيٽوپ هوندو آهي جيڪو هڪ مخصوص mAb سان ڳنڍيل هوندو آهي.
اهڙيءَ طرح، بناوت جي لحاظ کان مخصوص اينٽي باڊيز جي استعمال سان ڪجهه قسمن جي ريڪالسيٽرنٽ بانڊز ظاهر ٿيا. استعمال ٿيل اينٽي باڊي جي قسم، مناسب ليگيشن پيٽرن، ۽ ان جي پيدا ٿيندڙ سگنل جي طاقت (گهڻو ڪري ۽ گهٽ ۾ گهٽ گهڻو) تي منحصر ڪري، نوان اينزائمز سڃاڻپ ڪري سگهجن ٿا ۽ وڌيڪ مڪمل گلائڪو ڪنورشن لاءِ اينزائم مرکب ۾ نيم مقداري طور تي شامل ڪري سگهجن ٿا. مثال طور ACSH اوليگوساڪرائڊس جي تجزيي کي وٺي، اسان هر بايوماس مواد لاءِ گلائڪن بانڊز جو ڊيٽابيس ٺاهي سگهون ٿا. هتي اهو نوٽ ڪيو وڃي ته اينٽي باڊيز جي مختلف لاڳاپي کي حساب ۾ رکيو وڃي، ۽ جيڪڏهن انهن جو لاڳاپو نامعلوم آهي، ته اهو مختلف اينٽي باڊيز جي سگنلن جي مقابلي ۾ ڪجهه مشڪلاتون پيدا ڪندو. ان کان علاوه، گلائڪن بانڊز جو مقابلو ساڳئي اينٽي باڊي لاءِ نمونن جي وچ ۾ بهترين ڪم ڪري سگهي ٿو. انهن ضدي بانڊز کي پوءِ CAZyme ڊيٽابيس سان ڳنڍي سگهجي ٿو، جتان اسان اينزائمز جي سڃاڻپ ڪري سگهون ٿا، اميدوار اينزائمز چونڊي سگهون ٿا ۽ بانڊ ٽوڙڻ واري اينزائمز جي جانچ ڪري سگهون ٿا، يا بايو ريفائنريز ۾ استعمال لاءِ انهن اينزائمز کي ظاهر ڪرڻ لاءِ مائڪروبيل سسٽم ٺاهي سگهون ٿا44.
اهو جائزو وٺڻ لاءِ ته ڪيئن اميونولوجيڪل طريقا lignocellulosic hydrolysates ۾ موجود گهٽ ماليڪيولر وزن واري oligosaccharides جي خاصيت لاءِ متبادل طريقن کي پورو ڪن ٿا، اسان MALDI (شڪل 4، S1-S8) ۽ ساڳئي پينل (شڪل 5) oligosaccharide حصي تي GC-MS تي ٻڌل TMS مان نڪتل saccharides جو تجزيو ڪيو. MALDI کي مقابلو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ته ڇا oligosaccharide ماليڪيولن جي وڏي پيماني تي ورڇ گهربل ساخت سان ملي ٿي. شڪل 4 تي غير جانبدار حصن ACN-A ۽ ACN-B جي MC ڏيکاري ٿي. ACN-A تجزيي DP 4-8 (شڪل 4) کان DP 22 (شڪل S1) تائين پينٽوز شگر جي هڪ حد جي تصديق ڪئي، جن جا وزن MeU-xylan oligosaccharides سان ملن ٿا. ACN-B تجزيي DP 8-15 سان پينٽوز ۽ گلوڪوزڪسيلان سيريز جي تصديق ڪئي. شڪل S3 جهڙي اضافي مواد ۾، FA-C تيزابي moiety ماس ورڇ جا نقشا (Me)U متبادل پينٽوز شگر جي هڪ حد ڏيکارين ٿا جنهن جو DP 8-15 آهي جيڪو ELISA-based mAb اسڪريننگ ۾ مليل متبادل زائلان سان مطابقت رکي ٿو. ايپيٽوپس هڪجهڙا آهن.
ACS ۾ موجود گھلنشيل غير تعميل ڪندڙ اوليگوساڪرائڊس جو MALDI-MS اسپيڪٽرم. هتي، (A) ACN-A گهٽ وزن واري حد جا حصا جن ۾ ميٿائليٽيڊ يورونڪ ايسڊ (DP 4-8) متبادل گلوڪوروڪسيلان اوليگوساڪرائڊس ۽ (B) ACN-B زائلان ۽ ميٿائليٽيڊ يورونڪ ايسڊ اوليگوساڪرائڊس گلوڪوروڪسيلان (DP 8-15) سان متبادل آهن.
ريفريڪٽري اوليگوساڪرائڊس جي گلائيڪن باقيات جي بناوت جو تجزيو. هتي (الف) GC-MS تجزيي جي استعمال سان حاصل ڪيل مختلف اوليگوساڪرائڊس حصن جي TMS ساڪرائڊس جوڙجڪ. (ب) اوليگوساڪرائڊس ۾ موجود مختلف TMS مان نڪتل شگر جي بناوت. ACN - غير جانبدار اوليگوساڪرائڊس تي مشتمل ايسٽونائيٽريل حصو ۽ FA - تيزابي اوليگوساڪرائڊس تي مشتمل فيرولڪ ايسڊ حصو.
هڪ ٻيو دلچسپ نتيجو اوليگوساڪرائڊ فريڪشن جي LC-MS تجزيي مان ڪڍيو ويو، جيئن شڪل S9 ۾ ڏيکاريل آهي (طريقا اليڪٽرانڪ ضمني مواد ۾ ڏسي سگهجن ٿا). ACN-B فريڪشن جي ليگيشن دوران هيڪسوز ۽ -OAc گروپن جا ٽڪرا بار بار ڏٺا ويا. هي ڳولا نه رڳو گلائڪوم ۽ MALDI-TOF تجزيي ۾ مشاهدو ڪيل فريگمينٽيشن جي تصديق ڪري ٿي، پر اڳ ۾ علاج ٿيل ليگنو سيلولوسڪ بايوماس ۾ امڪاني ڪاربوهائيڊريٽ ڊيريويٽوز بابت نئين معلومات پڻ فراهم ڪري ٿي.
اسان TMS شوگر ڊيريويٽيزيشن استعمال ڪندي اوليگوساڪرائڊ فريڪشن جي شوگر جي ساخت جو تجزيو پڻ ڪيو. GC-MS استعمال ڪندي، اسان اوليگوساڪرائڊ فريڪشن ۾ نيورل (غير ڊيريويٽو) ۽ تيزابي شگر (GluA ۽ GalA) جي ساخت جو تعين ڪيو (شڪل 5). گلوڪورونڪ ايسڊ تيزابي جزن C ۽ D ۾ ملي ٿو، جڏهن ته گليڪٽورونک ايسڊ تيزابي جزن A ۽ B ۾ ملي ٿو، جيڪي ٻئي تيزابي شگر جا اعليٰ DP جزا آهن. اهي نتيجا نه رڳو اسان جي ELISA ۽ MALDI ڊيٽا جي تصديق ڪن ٿا، پر اوليگوساڪرائڊ جمع ٿيڻ جي اسان جي پوئين مطالعي سان پڻ مطابقت رکن ٿا. تنهن ڪري، اسان جو يقين آهي ته اوليگوساڪرائڊ جي بايوٽينيليشن ۽ بعد ۾ ELISA اسڪريننگ استعمال ڪندي جديد امونولوجيڪل طريقا مختلف حياتياتي نمونن ۾ حل ٿيندڙ ريڪيلسيٽرنٽ اوليگوساڪرائڊ کي ڳولڻ لاءِ ڪافي آهن.
جيئن ته ELISA تي ٻڌل mAb اسڪريننگ طريقن کي ڪيترن ئي مختلف طريقن سان تصديق ڪيو ويو آهي، اسان هن نئين مقداري طريقي جي صلاحيت کي وڌيڪ ڳولڻ چاهيون ٿا. ٻه تجارتي oligosaccharides، xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ۽ 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX)، خريد ڪيا ويا ۽ سيل وال گلائيڪن کي نشانو بڻائي هڪ نئين mAb اپروچ استعمال ڪندي جانچيا ويا. شڪل 6 بايوٽينيلٽيڊ بائنڊنگ سگنل ۽ oligosaccharide ڪنسنٽريشن جي لاگ ڪنسنٽريشن جي وچ ۾ هڪ لڪير وارو لاڳاپو ڏيکاري ٿو، جيڪو هڪ ممڪن Langmuir adsorption ماڊل جو مشورو ڏئي ٿو. mAbs ۾، CCRC-M137، CCRC-M138، CCRC-M147، CCRC-M148، ۽ CCRC-M151 XHE سان لاڳاپيل آهن، ۽ CCRC-M108، CCRC-M109، ۽ LM11 1 nm کان 100 نانو جي حد تائين A2XX سان لاڳاپيل آهن. تجربي دوران اينٽي باڊيز جي محدود دستيابي جي ڪري، هر اوليگوساڪرائڊ ڪنسنٽريشن سان محدود تجربا ڪيا ويا. هتي اهو نوٽ ڪرڻ گهرجي ته ڪجهه اينٽي باڊيز هڪ ئي اوليگوساڪرائڊ تي هڪ سبسٽريٽ جي طور تي تمام مختلف رد عمل ظاهر ڪن ٿا، شايد ڇاڪاڻ ته اهي ٿوري مختلف ايپيٽوپس سان ڳنڍيل آهن ۽ تمام مختلف پابند لاڳاپا رکي سگهن ٿا. صحيح ايپيٽوپ جي سڃاڻپ جا طريقا ۽ اثر تمام گهڻو پيچيده هوندا جڏهن نئون mAb طريقو حقيقي نمونن تي لاڳو ڪيو ويندو.
مختلف گلائيڪن-ٽارگيٽنگ mAbs جي ڳولا جي حد کي طئي ڪرڻ لاءِ ٻه ڪمرشل اوليگوساڪرائڊ استعمال ڪيا ويا. هتي، اوليگوساڪرائڊ ڪنسنٽريشن جي لاگ ڪنسنٽريشن سان لڪير لاڳاپا (A) mAb سان XHE ۽ (B) mAb سان A2XX لاءِ لانگموئر جذب جي نمونن کي ظاهر ڪن ٿا. لاڳاپيل ايپيٽوپس تجزيي ۾ سبسٽريٽ طور استعمال ٿيندڙ ڪمرشل اوليگوساڪرائڊز جي بناوتن کي ظاهر ڪن ٿا.
گلائيڪن-ٽارگيٽڊ مونوڪلونل اينٽي باڊيز (گلائيڪوڪومڪ تجزيو يا ELISA-based mAb اسڪريننگ) جو استعمال گھڻن وڏن سيل وال گلائيڪن جي گہرائي جي خاصيت لاءِ هڪ طاقتور اوزار آهي جيڪي ٻوٽن جي بايوماس کي ٺاهيندا آهن. بهرحال، ڪلاسيڪل گلائيڪن تجزيو صرف وڏين سيل وال گلائيڪن جي خاصيت ڪري ٿو، ڇاڪاڻ ته گهڻا اوليگوساڪرائڊز ELISA پليٽن تي موثر طور تي متحرڪ نه هوندا آهن. هن مطالعي ۾، AFEX-pretreated ڪارن اسٽوور کي هڪ اعلي سولڊ مواد تي اينزيميٽڪ طور تي هائيڊولائيز ڪيو ويو. هائيڊولائيزيٽ ۾ ريڪيلسيٽرنٽ سيل وال ڪاربوهائيڊريٽس جي جوڙجڪ کي طئي ڪرڻ لاءِ شوگر تجزيو استعمال ڪيو ويو. جڏهن ته، هائيڊولائيزٽس ۾ ننڍن اوليگوساڪرائڊز جي mAb تجزيو کي گهٽ سمجهيو ويندو آهي، ۽ ELISA پليٽن تي اوليگوساڪرائڊز کي مؤثر طريقي سان متحرڪ ڪرڻ لاءِ اضافي اوزارن جي ضرورت آهي.
اسان هتي رپورٽ ڪريون ٿا هڪ ناول ۽ ڪارآمد اوليگوساڪرائڊ اموبيلائيزيشن طريقو mAb اسڪريننگ لاءِ اوليگوساڪرائڊ بايوٽينيليشن کي گڏ ڪندي ۽ پوءِ NeutrAvidin™ ڪوٽيڊ پليٽس تي ELISA اسڪريننگ ڪندي. متحرڪ بايوٽينيلٽيڊ اوليگوساڪرائڊس اينٽي باڊي لاءِ ڪافي لاڳاپو ڏيکاريو ته جيئن ريڪيلسيٽرنٽ اوليگوساڪرائڊس جي تيز ۽ ڪارآمد سڃاڻپ کي فعال بڻائي سگهجي. ماس اسپيڪٽروميٽري جي بنياد تي انهن ضدي اوليگوساڪرائڊس جي جوڙجڪ جي تجزيي امونو اسڪريننگ جي هن نئين طريقي جي نتيجن جي تصديق ڪئي. ان ڪري، اهي مطالعي اهو ظاهر ڪن ٿا ته اوليگوساڪرائڊ بايوٽينيليشن ۽ ELISA اسڪريننگ جو ميلاپ گليڪان-ٽارگيٽڊ مونوڪلونل اينٽي باڊيز سان اوليگوساڪرائڊس ۾ ڪراس لنڪس کي ڳولڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجي ٿو ۽ اوليگوساڪرائڊس جي جوڙجڪ جي خاصيت رکندڙ ٻين بايو ڪيميڪل مطالعي ۾ وڏي پيماني تي لاڳو ڪري سگهجي ٿو.
هي بايوٽين تي ٻڌل گلائيڪن پروفائلنگ طريقو پهرين رپورٽ آهي جيڪا ٻوٽن جي بايوماس ۾ حل ٿيندڙ اوليگوساڪرائڊس جي ريڪيلسيٽرنٽ ڪاربوهائيڊريٽ بانڊ جي جاچ ڪرڻ جي قابل آهي. هي سمجهڻ ۾ مدد ڪري ٿو ته بايوماس جا ڪجهه حصا ڇو ايترا ضدي آهن جڏهن اهو بايوفيول جي پيداوار جي ڳالهه اچي ٿي. هي طريقو گلائيڪوم تجزيي جي طريقن ۾ هڪ اهم خال کي ڀريندو آهي ۽ ان جي درخواست کي ٻوٽن جي اوليگوساڪرائڊس کان ٻاهر ذيلي ذخيري جي وسيع رينج تائين وڌائيندو آهي. مستقبل ۾، اسان بايوٽينيليشن لاءِ روبوٽڪس استعمال ڪري سگهون ٿا ۽ ELISA استعمال ڪندي نمونن جي اعليٰ-ٿرو پُٽ تجزيي لاءِ اسان جي ترقي ڪيل طريقي کي استعمال ڪري سگهون ٿا.
پائنيئر 33A14 هائبرڊ ٻج مان اُگايل مڪئي جي ٻوٽي (CS) کي 2010 ۾ ڪولوراڊو جي ري ۾ ڪريمر فارمز مان حاصل ڪيو ويو هو. زميندار جي اجازت سان، هي بايوماس تحقيق لاءِ استعمال ڪري سگهجي ٿو. نمونن کي ڪمري جي حرارت تي زپ لاڪ ٿيلهين ۾ 6٪ کان گهٽ نمي تي خشڪ محفوظ ڪيو ويو. نمونن کي ڪمري جي حرارت تي زپ لاڪ ٿيلهين ۾ 6٪ کان گهٽ نمي تي خشڪ محفوظ ڪيو ويو. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. نمونن کي ڪمري جي حرارت تي زپ ٿيل ٿيلهين ۾ <6٪ نمي تي سڪل محفوظ ڪيو ويو.样品在室温下以干燥<6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6٪. نمونا زپ ٿيلهين ۾ ڪمري جي حرارت تي 6٪ کان گهٽ نمي تي محفوظ ڪيا ويندا آهن.مطالعي مقامي ۽ قومي هدايتن جي تعميل ڪئي. NREL پروٽوڪول استعمال ڪندي ساخت جو تجزيو ڪيو ويو. ساخت ۾ 31.4٪ گلوڪن، 18.7٪ زائلان، 3.3٪ عربنان، 1.2٪ گليڪٽان، 2.2٪ ايسٽيل، 14.3٪ ليگنين، 1.7٪ پروٽين ۽ 13.4٪ راھ شامل هئي.
Cellic® CTec2 (138 mg پروٽين/ml، لاٽ VCNI 0001) نوووزائمز (فرينڪلنٽن، اين سي، آمريڪا) مان سيلوليز، β-گلوڪوسيڊيس ۽ Cellic® HTec2 (157 mg پروٽين/ml، لاٽ VHN00001) جو هڪ پيچيده مرکب آهي. ملٽيفيڪٽ پيڪٽينيز® (72 mg پروٽين/mL)، پيڪٽين کي خراب ڪندڙ اينزائمز جو هڪ پيچيده مرکب، ڊيوپونٽ انڊسٽريل بايو سائنسز (پالو آلٽو، سي اي، آمريڪا) پاران عطيو ڪيو ويو. اينزائم پروٽين جي ڪنسنٽريشن کي پروٽين جي مواد جو اندازو لڳائڻ (۽ غير پروٽين نائٽروجن جي حصي کي گھٽائڻ) ڪجيلڊال نائٽروجن تجزيو (AOAC طريقو 2001.11، ڊيري ون ڪوآپريٽو انڪارپوريٽڊ، اٿاڪا، NY، آمريڪا) استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو. ڊائيٽوميسيس ارتھ 545 EMD مليپور (بلريڪا، ايم اي) کان خريد ڪيو ويو. چالو ڪاربن (DARCO، 100 ميش گرينولس)، Avicel (PH-101)، بيچ زائلان، ۽ ٻيا سڀئي ڪيميڪل سگما-الڊرچ (سينٽ لوئس، MO) کان خريد ڪيا ويا هئا.
AFEX پريٽريٽمينٽ GLBRC (بايوماس ڪنورشن ريسرچ ليبارٽري، MSU، لينسنگ، MI، USA) ۾ ڪيو ويو. پريٽريٽمينٽ 140°C تي 15 منٽن لاءِ ڪيو ويو. اسٽينلیس اسٽيل بينچ ٽاپ بيچ ري ايڪٽر (پار انسٽرومينٽس ڪمپني) ۾ 60% (w/w) لوڊنگ تي اينهائيڊروس امونيا ۽ بايوماس جي 1:1 تناسب تي 46 رهائش جو وقت. ان ۾ 30 منٽ لڳا. ري ايڪٽر کي 140°C تي آندو ويو ۽ امونيا کي تيزيءَ سان آزاد ڪيو ويو، جنهن سان بايوماس جلدي ڪمري جي حرارت تي واپس اچي ويو. AFEX پري-ٽريٽ ٿيل ڪارن اسٽوور (ACS) جي جوڙجڪ غير علاج ٿيل ڪارن اسٽوور (UT-CS) جي برابر هئي.
اوليگوساڪرائڊس جي وڏي پيماني تي پيداوار لاءِ شروعاتي مواد جي طور تي هاءِ سولڊس ACSH 25٪ (w/w) (تقريبن 8٪ ڊيڪسٽران لوڊنگ) تيار ڪئي وئي. ACS جو اينزيميٽڪ هائيڊرولائسز هڪ ڪمرشل اينزائم مرکب استعمال ڪندي ڪيو ويو جنهن ۾ سيلڪ® Ctec2 10 mg پروٽين/g گلوڪن (پريٽريٽ ٿيل بايوماس ۾)، Htec2 (نووزائمز، فرينڪلنٽن، NC)، 5 mg پروٽين/g گلوڪن، ۽ ملٽيفيڪٽ پيڪٽينيس (جينڪور انڪ، آمريڪا) شامل آهن. )، 5 mg پروٽين/g ڊيڪسٽران. اينزيميٽڪ هائيڊرولائسز 5-ليٽر بايو ري ايڪٽر ۾ 3 ليٽر، پي ايڇ 4.8، 50°C ۽ 250 rpm جي ڪم ڪندڙ مقدار سان ڪيو ويو. 96 ڪلاڪن تائين هائيڊرولائسز کان پوءِ، هائيڊرولائزيٽ کي سينٽرفيوگيشن ذريعي 6000 rpm تي 30 منٽن لاءِ ۽ پوءِ 14000 rpm تي 30 منٽن لاءِ گڏ ڪيو ويو ته جيئن غير هائيڊرولائز ٿيل سولڊس کي هٽايو وڃي. پوءِ هائيڊولائيزيٽ کي 0.22 ملي ميٽر فلٽر بيڪر ذريعي جراثيم کان پاڪ فلٽريشن جي تابع ڪيو ويو. فلٽر ٿيل هائيڊولائيزيٽ کي 4°C تي جراثيم کان پاڪ بوتلن ۾ محفوظ ڪيو ويو ۽ پوءِ ڪاربان تي ورهايو ويو.
NREL ليبارٽري تجزيي جي طريقيڪار مطابق ڪڍڻ تي ٻڌل بايوماس نمونن جي جوڙجڪ جو تجزيو: ساخت جي تجزيو لاءِ نمونن جي تياري (NREL/TP-510-42620) ۽ بايوماس ۾ ساختي ڪاربوهائيڊريٽ ۽ ليگنين جو تعين (NREL/TP-510 – 42618)47.
هائيڊرولائيزيٽ اسٽريم جو اوليگوساڪرائڊ تجزيو آٽوڪليو تي ٻڌل ايسڊ هائيڊرولائيزيشن طريقو استعمال ڪندي 2 ملي ليٽر اسڪيل تي ڪيو ويو. هائيڊرولائيزيٽ نموني کي 10 ملي ليٽر اسڪرو ڪيپ ڪلچر ٽيوب ۾ 72٪ سلفورڪ ايسڊ جي 69.7 µl سان ملايو ۽ 121 °C تي بينچ ٽاپ تي 1 ڪلاڪ لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو، برف تي ٿڌو ڪريو ۽ هڪ اعليٰ ڪارڪردگي واري مائع ڪروميٽوگرافي (HPLC) شيشي ۾ فلٽر ڪريو. اوليگوساڪرائڊز جي ڪنسنٽريشن کي تيزاب-هائيڊرولائيز ٿيل نموني ۾ ڪل کنڊ جي ڪنسنٽريشن مان غير هائيڊرولائيز ٿيل نموني ۾ مونوساڪرائڊز جي ڪنسنٽريشن کي گھٽائي طئي ڪيو ويو.
تيزابي هائيڊولائيزڊ بايوماس ۾ گلوڪوز، زائلوز، ۽ عربينوز ڪنسنٽريشن جو تجزيو شيمازو ايڇ پي ايل سي سسٽم استعمال ڪندي ڪيو ويو جيڪو آٽو سمپلر، ڪالم هيٽر، آئسوڪريٽڪ پمپ، ۽ بايو-ريڊ امينڪس ايڇ پي ايڪس-87 ايڇ ڪالم تي ريفريڪٽو انڊيڪس ڊيڪٽر سان ليس هو. ڪالم کي 50 ° سي تي برقرار رکيو ويو ۽ پاڻي جي وهڪري ۾ 0.6 ايم ايل / منٽ 5 ايم ايم ايڇ 2 ايس او 4 سان ايليوٽ ڪيو ويو.
هائيڊولائيزيٽ سپرنيٽينٽ کي مونومر ۽ اوليگوساڪرائڊ جي مواد لاءِ ڊليٽ ڪيو ويو ۽ تجزيو ڪيو ويو. اينزيميٽڪ هائيڊولائيزيشن کان پوءِ حاصل ڪيل مونوميرڪ شگرز جو تجزيو HPLC پاران بايو ريڊ (هرڪيولس، CA) امينڪس HPX-87P ڪالم ۽ هڪ ايش گارڊ ڪالم سان ليس ڪيو ويو. ڪالم جو گرمي پد 80 ° C تي برقرار رکيو ويو، پاڻي کي 0.6 ml/min جي وهڪري جي شرح سان موبائل فيز طور استعمال ڪيو ويو. اوليگوساڪرائڊس کي ريفري ۾ بيان ڪيل طريقن مطابق 121 ° C تي ڊليٽ ايسڊ ۾ هائيڊولائيزيشن ذريعي طئي ڪيو ويو. 41، 48، 49.
سيڪرائڊ تجزيو خام، AFEX اڳ-علاج ٿيل ۽ سڀني غير هائيڊولائيزڊ بايوماس باقيات (سيريل سيل وال ڪڍڻ ۽ انهن جي mAb اسڪريننگ سميت) تي اڳ بيان ڪيل طريقيڪار 27، 43، 50، 51 استعمال ڪندي ڪيو ويو. گلائڪوم تجزيي لاءِ، ٻوٽن جي سيل وال مواد جي الڪوحل-ناحل ٿيندڙ باقيات کي بايوماس باقيات مان تيار ڪيو ويندو آهي ۽ وڌندڙ جارحاڻي ريجنٽس جهڙوڪ امونيم آڪساليٽ (50 mM)، سوڊيم ڪاربونيٽ (50 mM ۽ 0.5% w/v)، CON سان سيريل ڪڍڻ جي تابع ڪيو ويندو آهي. (1M ۽ 4M، ٻئي 1% w/v سوڊيم بوروهائيڊرائيڊ سان) ۽ ايسڊ ڪلورائيٽ جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي52,53. پوءِ ڪڍڻ کي mAb50s جي هڪ پيچيده پينل جي خلاف ELISA جي تابع ڪيو ويو جيڪو سيل وال گلائيڪن ڏانهن هدايت ڪئي وئي هئي، ۽ mAb بائنڊنگ رد عمل کي گرمي نقشي جي طور تي پيش ڪيو ويو. ٻوٽي جي سيل وال گلائيڪن کي نشانو بڻائڻ وارا mAbs ليبارٽري اسٽاڪ (CCRC، JIM ۽ MAC سيريز) مان خريد ڪيا ويا.
اوليگوساڪرائڊس جو هڪ قدم بايوٽينيليشن. ڪاربوهائيڊريٽس جو بايوٽين-ايل سي-هائيڊرازائيڊ سان ميلاپ هيٺ ڏنل طريقيڪار استعمال ڪندي ڪيو ويو. بايوٽين-ايل سي-هائيڊرازائيڊ (4.6 ملي گرام/12 μmol) کي ڊائي ميٿائل سلفو آڪسائيڊ (DMSO، 70 μl) ۾ 65 ° C تي 1 منٽ لاءِ زوردار حرڪت ۽ گرم ڪرڻ سان حل ڪيو ويو. گليشيل ايسٽڪ ايسڊ (30 μl) شامل ڪيو ويو ۽ مرکب کي سوڊيم سائانوبوروهائيڊرائيڊ (6.4 mg/100 μmol) تي وجھي ڇڏيو ويو ۽ 65 ° C تي تقريباً 1 منٽ لاءِ گرم ڪرڻ کان پوءِ مڪمل طور تي حل ڪيو ويو. پوءِ، رد عمل جي مرکب جو 5 کان 8 μl خشڪ اوليگوساڪرائڊ (1-100 nmol) ۾ شامل ڪيو ويو ته جيئن ريڊيوسنگ اينڊ تي ليبل جي 10 گنا يا وڌيڪ دالر اضافي حاصل ڪري سگهجي. رد عمل 65 ° C تي 2 ڪلاڪن لاءِ ڪيو ويو، جنهن کان پوءِ نمونن کي فوري طور تي صاف ڪيو ويو. ليبلنگ تجربن ۾ ڪو به سوڊيم سائانوبوروهائيڊرائيڊ استعمال نه ڪيو ويو بغير گهٽتائي جي، ۽ نمونن کي 2.5 ڪلاڪن لاءِ 65 ° C تي رد عمل ڪيو ويو.
بايوٽينيلٽيڊ اوليگوساڪرائڊس جي نمونن جي ELISA ڪوٽنگ ۽ ڌوئڻ. 25 μl بايوٽينيلٽيڊ نمونا (هر مرڪوز نموني جو 100 μl 0.1 M ٽريس بفر محلول (TBS) جي 5 ml ۾ ملائي) ايوڊين ڪوٽيڊ پليٽ جي هر کوهه ۾ شامل ڪيا ويا. ڪنٽرول ويلز کي 0.1 M TBS ۾ 10 μg/ml جي ڪنسنٽريشن تي 50 μl بايوٽين سان ڪوٽ ڪيو ويو. خالي ماپن لاءِ ڊيونائيزڊ پاڻي کي ڪوٽنگ طور استعمال ڪيو ويو. ٽيبليٽ کي اونداهي ۾ ڪمري جي حرارت تي 2 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. گرينيئر فليٽ 3A لاءِ پروگرام نمبر 11 استعمال ڪندي پليٽ کي 0.1 M TBS ۾ 0.1٪ اسڪيم ٿيل کير سان 3 ڀيرا ڌوئو.
پرائمري اينٽي باڊيز جو اضافو ۽ ڌوئڻ. هر هڪ کوهه ۾ 40 μl پرائمري اينٽي باڊي شامل ڪريو. مائڪرو پليٽ کي ڪمري جي حرارت تي اونداهي ۾ 1 ڪلاڪ لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو. پوءِ پليٽن کي گرينيئر فليٽ 3A لاءِ واش پروگرام #11 استعمال ڪندي 0.1M ٽي بي ايس ۾ 0.1٪ کير سان 3 ڀيرا ڌويو ويو.
ثانوي اينٽي باڊي شامل ڪريو ۽ ڌوئو. هر هڪ کوهه ۾ 50 μl چوٿون/چوٿين ثانوي اينٽي باڊي (0.1٪ کير ۾ 0.1 M TBS ۾ 1:5000 کي ملائي) شامل ڪريو. مائڪرو پليٽ کي ڪمري جي حرارت تي اونداهي ۾ 1 ڪلاڪ لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو. پوءِ مائڪرو پليٽس کي گرينيئر فليٽ 5A پليٽ واش پروگرام #12 استعمال ڪندي 0.1٪ کير 0.1 M TBS ۾ 5 ڀيرا ڌوئو ويو.
هڪ سبسٽريٽ شامل ڪرڻ. بنيادي سبسٽريٽ ۾ 50 μl 3,3′,5,5′-ٽيٽرامائيٿائل بينزيڊائن (TMB) شامل ڪريو (2 قطرا بفر، 3 قطرا TMB، 2 قطرا هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ کي 15 ملي ليٽر ڊيونائيزڊ پاڻي ۾ شامل ڪندي). TMB سبسٽريٽ تيار ڪريو. ۽ استعمال کان اڳ وورٽيڪس). مائڪروپليٽ کي ڪمري جي حرارت تي 30 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو. اونداهي ۾.
قدم مڪمل ڪريو ۽ ٽيبليٽ پڙهو. هر کوهه ۾ 50 µl 1 N سلفورڪ ايسڊ شامل ڪريو ۽ ELISA ريڊر استعمال ڪندي 450 کان 655 nm تائين جذب رڪارڊ ڪريو.
ڊيونائيزڊ پاڻي ۾ انهن تجزين جا 1 ملي گرام/مليٽر محلول تيار ڪريو: عربينوز، رمونوز، فيوڪوز، زائلوز، گليڪٽورونک ايسڊ (GalA)، گلوڪورونڪ ايسڊ (GlcA)، مينوز، گلوڪوز، گليڪٽوز، ليڪٽوز، N-ايسٽيل مينوسامين (manNAc)، N-ايسٽيل گلوڪوسامين. (glcNAc)، N-ايسٽيل گليڪٽوسامين (galNAc)، انوسيٽول (اندروني معيار). ٽيبل 1 ۾ ڏيکاريل 1 ملي گرام/مليٽر کنڊ جي محلول کي شامل ڪندي ٻه معيار تيار ڪيا ويا. نمونن کي -80 ° C تي منجمد ۽ لائوفيلائيز ڪيو ويندو آهي جيستائين سڄو پاڻي نه ڪڍيو وڃي (عام طور تي تقريباً 12-18 ڪلاڪ).
تجزياتي توازن تي اسڪرو ڪيپ ٽيوب ۾ 100-500 µg نموني شامل ڪريو. شامل ڪيل مقدار کي رڪارڊ ڪريو. اهو بهتر آهي ته نموني کي محلول جي مخصوص ڪنسنٽريشن ۾ حل ڪيو وڃي ۽ ان کي ٽيوب ۾ مائع aliquot جي طور تي شامل ڪيو وڃي. هر نموني ٽيوب لاءِ اندروني معيار جي طور تي 1 mg/ml انوسيٽول جو 20 µl استعمال ڪريو. نموني ۾ شامل ڪيل اندروني معيار جي مقدار معياري ٽيوب ۾ شامل ڪيل اندروني معيار جي مقدار جي برابر هجڻ گهرجي.
اسڪرو ڪيپ شيشي ۾ 8 ملي ليٽر اين هائيڊروس ميٿانول شامل ڪريو. پوءِ 4 ملي ليٽر 3 اين ايڇ ميٿانولڪ ايڇ سي ايل محلول، ڍڪيل ۽ هلايو. هن عمل ۾ پاڻي استعمال نه ٿيندو آهي.
اوليگوساڪرائڊ نمونن ۽ معياري ٽي ايم ايس ٽيوب ۾ 500 μl 1 M HCl ميٿانول محلول شامل ڪريو. نمونن کي رات جو (168 ڪلاڪ) 80 ° C تي ٿرمل بلاڪ ۾ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. ڊرائينگ ميني فولڊ استعمال ڪندي ميٿانولائسس پراڊڪٽ کي ڪمري جي حرارت تي خشڪ ڪريو. 200 μl MeOH شامل ڪريو ۽ ٻيهر خشڪ ڪريو. هي عمل ٻه ڀيرا ورجايو ويندو آهي. نموني ۾ 200 μl ميٿانول، 100 μl پائريڊائن ۽ 100 μl ايسٽڪ اينهائيڊرائيڊ شامل ڪريو ۽ چڱي طرح ملايو. نمونن کي 30 منٽن لاءِ ڪمري جي حرارت تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو. ۽ خشڪ ڪيو ويو. 200 μl ميٿانول شامل ڪريو ۽ ٻيهر خشڪ ڪريو.
200 µl ٽرائي-سل شامل ڪريو ۽ ڍڪيل ٽيوب کي 20 منٽن لاءِ گرم ڪريو. 80°C تي، پوءِ ڪمري جي حرارت تي ٿڌو ڪيو وڃي. نموني کي تقريباً 50 µl جي مقدار تائين وڌيڪ خشڪ ڪرڻ لاءِ ڊرائينگ ميني فولڊ استعمال ڪريو. اهو نوٽ ڪرڻ ضروري آهي ته اسان نمونن کي مڪمل طور تي سڪي وڃڻ نه ڏنو.
2 ملي ليٽر هيڪسين شامل ڪريو ۽ وورٽيڪسنگ ذريعي چڱي طرح ملايو. 5-3/4 انچ قطر جي پائپيٽ جي مٿان شيشي جي اون کي داخل ڪندي پاسچر پائپيٽس (5-8 ملي ميٽر) جي چوٽين کي شيشي جي اون جي هڪ ٽڪري سان ڀريو. نمونن کي 2 منٽن لاءِ 3000 گرام تي سينٽرفيوج ڪيو ويو. ڪنهن به غير حل ٿيندڙ باقيات کي ختم ڪيو ويو آهي. نموني کي 100-150 µl تائين سڪايو. تقريبن 1 μl جو مقدار GC-MS ۾ 80 °C جي شروعاتي گرمي پد ۽ 2.0 منٽن جي شروعاتي وقت تي داخل ڪيو ويو (ٽيبل 2).