Благодарим вас за посещение Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Новые иммунологические и масс-спектрометрические методы комплексного анализа персистентных олигосахаридов в соломе кукурузы, предварительно обработанной AFEX.Лигноцеллюлозная биомасса является устойчивой альтернативой ископаемому топливу и широко используется для разработки биотехнологий для производства таких продуктов, как продукты питания, корма, топливо и химикаты.Ключом к этим технологиям является разработка конкурентоспособных по стоимости процессов преобразования сложных углеводов, присутствующих в стенках клеток растений, в простые сахара, такие как глюкоза, ксилоза и арабиноза.Поскольку лигноцеллюлозная биомасса очень упряма, ее необходимо подвергать термохимической обработке (например, расслаиванию волокон аммиака (AFEX), разбавленными кислотами (DA), ионным жидкостям (IL)) и биологической обработке (например, ферментативному гидролизу и микробной ферментации) в сочетании для получения желаемого продукта..Однако при использовании в процессе гидролиза коммерческих ферментов грибов только 75-85% образующихся растворимых сахаров составляют моносахариды, а остальные 15-25% - растворимые, не поддающиеся обработке олигосахариды, которые не всегда доступны микроорганизмам.Ранее мы успешно выделили и очистили растворимые стойкие олигосахариды, используя комбинацию разделения углерода и диатомовой земли и эксклюзионной хроматографии, а также исследовали их ингибирующие свойства ферментов.Мы обнаружили, что олигосахариды, содержащие замещения метилированной уроновой кислоты с более высокой степенью полимеризации (DP), труднее обрабатывать коммерческими смесями ферментов, чем олигосахариды с низкой DP и нейтральные олигосахариды.Здесь мы сообщаем об использовании нескольких дополнительных методов, включая профилирование гликанов с использованием моноклональных антител (мАт), специфичных к гликанам растительной биомассы, для характеристики гликановых связей в клеточных стенках растений и ферментативных гидролизатах, ионизацию с помощью лазерной десорбции с помощью матрицы, времяпролетную масс-спектрометрию..MALDI-TOF-MS) использует структурно-информационные диагностические пики, полученные с помощью спектроскопии после вторичного распада отрицательных ионов, газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ-МС) для характеристики олигосахаридных связей с дериватизацией и без нее.Из-за небольшого размера олигосахаридов (DP 4–20) эти молекулы трудно использовать для связывания и характеристики mAb.Чтобы преодолеть эту проблему, мы применили новый метод иммобилизации олигосахаридов на основе конъюгации биотина, который успешно пометил большинство растворимых олигосахаридов с низкой DP на поверхности микропланшета, который затем был использован в высокопроизводительной системе mAb для анализа специфического лигирования.Этот новый метод облегчит разработку более совершенных высокопроизводительных анализов гликома в будущем, которые можно будет использовать для выделения и характеристики олигосахаридов, присутствующих в биомаркерах, в диагностических целях.
Лигноцеллюлозная биомасса, состоящая из сельскохозяйственных, лесных, травяных и древесных материалов, является потенциальным сырьем для производства продуктов на биологической основе, включая продукты питания, корма, топливо и химические прекурсоры для производства более ценных продуктов1.Углеводы (такие как целлюлоза и гемицеллюлоза), присутствующие в клеточных стенках растений, деполимеризуются в моносахариды путем химической обработки и биотрансформации (таких как ферментативный гидролиз и микробная ферментация).Общие предварительные обработки включают расширение волокон аммиака (AFEX), разбавленную кислоту (DA), ионную жидкость (IL) и паровой взрыв (SE), в которых используется комбинация химических веществ и тепла для снижения производства лигноцеллюлозы за счет открытия клеточных стенок растений3,4.упрямство вещества, 5. Ферментативный гидролиз осуществляется при высокой нагрузке по твердым веществам с использованием коммерческих ферментов, содержащих активные углеводы (CAZymes), и микробной ферментации с использованием трансгенных дрожжей или бактерий для производства топлива и химикатов на биологической основе 6 .
CAZymes в коммерческих ферментах состоят из сложной смеси ферментов, которые синергетически расщепляют сложные углеводно-сахарные связи с образованием моносахаридов2,7.Как мы сообщали ранее, сложная сеть ароматических полимеров лигнина с углеводами делает их крайне трудноусвояемыми, что приводит к неполной конверсии сахаров, накоплению 15-25% половых олигосахаридов, не образующихся при ферментативном гидролизе предварительно обработанной биомассы.Это общая проблема с различными методами предварительной обработки биомассы.Некоторые причины этого узкого места включают ингибирование ферментов во время гидролиза или отсутствие или низкий уровень основных незаменимых ферментов, которые необходимы для разрыва сахарных связей в биомассе растений.Понимание состава и структурных характеристик сахаров, таких как сахарные связи в олигосахаридах, поможет нам улучшить конверсию сахара во время гидролиза, сделав биотехнологические процессы экономически конкурентоспособными по сравнению с продуктами, полученными из нефти.
Определение структуры углеводов является сложной задачей и требует сочетания таких методов, как жидкостная хроматография (ЖХ)11,12, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)13, капиллярный электрофорез (КЭ)14,15,16 и масс-спектрометрия (МС)17.,восемнадцать.Методы МС, такие как времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF-MS), являются универсальным методом идентификации углеводных структур.Недавно Collision-Induced Dissociation (CID) тандемная MS аддуктов ионов натрия наиболее широко использовалась для идентификации отпечатков пальцев, соответствующих положениям прикрепления олигосахаридов, аномерным конфигурациям, последовательностям и положениям ветвления 20, 21 .
Анализ гликанов является отличным инструментом для глубокой идентификации углеводных связей22.В этом методе используются моноклональные антитела (мАт), направленные на гликан клеточной стенки растений, в качестве зондов для понимания сложных углеводных связей.Во всем мире доступно более 250 mAb, разработанных против различных линейных и разветвленных олигосахаридов с использованием различных сахаридов24.Несколько mAb широко использовались для характеристики структуры, состава и модификаций клеточной стенки растений, поскольку существуют значительные различия в зависимости от типа растительной клетки, органа, возраста, стадии развития и среды роста25,26.Совсем недавно этот метод был использован для понимания популяций везикул в растительных и животных системах и их соответствующих ролей в транспорте гликанов, определяемых субклеточными маркерами, стадиями развития или стимулами окружающей среды, а также для определения ферментативной активности.Некоторые из различных структур гликанов и ксиланов, которые были идентифицированы, включают пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюканы (XylG), глюканы со смешанной связью (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкуроновая кислота-арабиноксилан (GArbX) и арабино-галактан (ArbG)29.
Однако, несмотря на все эти исследовательские усилия, лишь несколько исследований были сосредоточены на природе накопления олигосахаридов во время гидролиза с высокой нагрузкой твердых веществ (HSL), включая высвобождение олигосахаридов, изменения длины олигомерной цепи во время гидролиза, различные полимеры с низким DP и их кривые.распределения 30,31,32.Между тем, хотя анализ гликанов оказался полезным инструментом для всестороннего анализа структуры гликанов, трудно оценить водорастворимые олигосахариды с низкой DP с использованием методов антител.Меньшие олигосахариды DP с молекулярной массой менее 5-10 кДа не связываются с планшетами для ИФА 33, 34 и вымываются перед добавлением антител.
Здесь мы впервые демонстрируем анализ ELISA на планшетах, покрытых авидином, с использованием моноклональных антител, сочетая одноэтапную процедуру биотинилирования растворимых устойчивых олигосахаридов с анализом гликома.Наш подход к анализу гликома был подтвержден анализом MALDI-TOF-MS и ГХ-МС комплементарных олигосахаридных связей с использованием триметилсилиловой (ТМС) дериватизации гидролизованных сахарных композиций.Этот инновационный подход может быть развит как высокопроизводительный метод в будущем и найти более широкое применение в биомедицинских исследованиях35.
Посттрансляционные модификации ферментов и антител, такие как гликозилирование,36 влияют на их биологическую активность.Например, изменения в гликозилировании сывороточных белков играют важную роль при воспалительном артрите, а изменения в гликозилировании используются в качестве диагностических маркеров37.В литературе сообщалось, что различные гликаны легко появляются при различных заболеваниях, включая хронические воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта и печени, вирусные инфекции, рак яичников, молочной железы и простаты38,39,40.Понимание структуры гликанов с использованием методов ИФА гликанов на основе антител обеспечит дополнительную уверенность в диагностике заболеваний без использования сложных методов МС.
Наше предыдущее исследование показало, что стойкие олигосахариды оставались негидролизованными после предварительной обработки и ферментативного гидролиза (рис. 1).В нашей ранее опубликованной работе мы разработали метод твердофазной экстракции с активированным углем для выделения олигосахаридов из предварительно обработанного AFEX гидролизата кукурузной соломы (ACSH)8.После первоначальной экстракции и разделения олигосахариды далее фракционировали методом эксклюзионной хроматографии (ЭХ) и собирали в порядке молекулярной массы.Мономеры и олигомеры сахара, высвобождаемые в результате различных предварительных обработок, анализировали с помощью анализа состава сахара.При сравнении содержания олигомеров сахаров, полученных различными методами предварительной обработки, наличие стойких олигосахаридов является распространенной проблемой при конверсии биомассы в моносахариды и может привести к снижению выхода сахара не менее чем на 10-15% и даже до 18%.НАС.Этот метод используется для дальнейшего крупнотоннажного производства олигосахаридных фракций.Полученный АХГ и его последующие фракции с разной молекулярной массой использовали в качестве экспериментального материала для характеристики олигосахаридов в данной работе.
После предварительной обработки и ферментативного гидролиза стойкие олигосахариды оставались негидролизованными.Здесь (A) представляет собой метод выделения олигосахаридов, в котором олигосахариды выделяют из предварительно обработанного AFEX гидролизата кукурузной соломы (ACSH) с использованием уплотненного слоя активированного угля и диатомовой земли;(B) Метод разделения олигосахаридов.Олигосахариды далее разделяли эксклюзионной хроматографией (SEC);(C) Сахаридные мономеры и олигомеры, высвобождаемые при различных предварительных обработках (разбавленная кислота: DA, ионная жидкость: IL и AFEX).Условия ферментативного гидролиза: высокое содержание твердых веществ 25% (вес./вес.) (примерно 8% содержания глюкана), 96 часов гидролиза, 20 мг/г коммерческого содержания фермента (соотношение Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) и (D) мономеры сахара и олигомеры глюкозы, ксилозы и арабинозы, высвобождаемые из предварительно обработанной AFEX кукурузной соломы (ACS).
Анализ гликанов оказался полезным инструментом для всестороннего структурного анализа гликанов в экстрактах, выделенных из твердых остатков биомассы.Однако при использовании этого традиционного метода водорастворимые сахариды недостаточно представлены, поскольку низкомолекулярные олигосахариды трудно иммобилизовать на планшетах для ELISA, и они вымываются перед добавлением антител.Таким образом, для связывания и характеристики антител использовали одноэтапный метод биотинилирования для покрытия растворимыми, несовместимыми олигосахаридами планшетов для ELISA, покрытых авидином.Этот метод был протестирован с использованием нашего ранее произведенного ACSH и фракции, основанной на его молекулярной массе (или степени полимеризации, DP).Одностадийное биотинилирование использовали для увеличения аффинности связывания олигосахаридов путем добавления биотин-LC-гидразида к восстанавливающему концу углевода (рис. 2).В растворе полуацетальная группа на восстанавливающем конце реагирует с гидразидной группой биотин-LC-гидразид с образованием гидразонной связи.В присутствии восстановителя NaCNBH3 гидразонная связь восстанавливается до стабильного биотинилированного конечного продукта.С модификацией восстанавливающего конец сахара стало возможным связывание олигосахаридов с низкой DP с планшетами для ELISA, и в нашем исследовании это было сделано на планшетах, покрытых авидином, с использованием mAb, нацеленных на гликан.
Скрининг моноклональных антител на основе ИФА на биотинилированные олигосахариды.Здесь (A) комбинированное биотинилирование олигосахаридов и последующий скрининг ELISA с mAb, нацеленными на гликан, на планшетах, покрытых NeutrAvidin, и (B) показана одноэтапная процедура биотинилирования продуктов реакции.
Затем к первичным и вторичным антителам добавляли планшеты, покрытые авидином, с антителами, конъюгированными с олигосахаридами, и промывали в светочувствительной и времячувствительной среде.После завершения связывания антител добавьте субстрат TMB для инкубации планшета.Реакцию окончательно останавливали серной кислотой.Инкубированные планшеты анализировали с использованием устройства для считывания ELISA для определения силы связывания каждого антитела для выявления перекрестного связывания, специфичного для антитела.Подробности и параметры эксперимента см. в соответствующем разделе «Материалы и методы».
Мы демонстрируем полезность этого недавно разработанного метода для конкретных применений, характеризуя растворимые олигосахариды, присутствующие в ACSH, а также в неочищенных и очищенных фракциях олигосахаридов, выделенных из лигноцеллюлозных гидролизатов.Как показано на рисунке 3, наиболее распространенными замещенными эпитопом ксиланами, идентифицированными в ACSH с использованием методов анализа биоацилированного гликома, обычно являются уроновые (U) или метилуроновые (MeU) и пектиновые арабиногалактаны.Большинство из них были обнаружены и в нашем предыдущем исследовании по анализу гликанов негидролизованных твердых веществ (НГТ)43.
Обнаружение рекальцитрантных олигосахаридных эпитопов с использованием моноклональных антител, направленных на гликан клеточной стенки.«Нейтральная» фракция — это фракция ACN, а «кислая» фракция — это фракция FA.Более яркие красные оттенки на тепловой карте указывают на более высокое содержание эпитопов, а более яркие синие — на пустой фон.Значения цвета на шкале основаны на необработанных значениях ОП для составов N=2.Основные эпитопы, распознаваемые антителами, показаны справа.
Эти нецеллюлозные структуры не могли быть расщеплены наиболее распространенными целлюлазами и гемицеллюлазами в тестируемой коммерческой смеси ферментов, которая включает наиболее часто используемые коммерческие ферменты.Поэтому для их гидролиза требуются новые вспомогательные ферменты.Без необходимых нецеллюлозных вспомогательных ферментов эти нецеллюлозные связи предотвращают полное превращение в моносахариды, даже если их исходные сахарные полимеры экстенсивно гидролизуются на более короткие фрагменты и растворяются с использованием коммерческих смесей ферментов.
Дальнейшее изучение распределения сигнала и силы его связывания показало, что связывающие эпитопы были ниже во фракциях сахара с высокой DP (A, B, C, DP до 20+), чем во фракциях с низкой DP (D, E, F, DP) в димерах) (рис. 1).Кислотные фрагменты чаще встречаются в нецеллюлозных эпитопах, чем нейтральные фрагменты.Эти явления согласуются с картиной, наблюдаемой в нашем предыдущем исследовании, где высокие DP и кислотные фрагменты были более устойчивы к ферментативному гидролизу.Следовательно, присутствие нецеллюлозных гликановых эпитопов и замен U и MeU может значительно способствовать стабильности олигосахаридов.Следует отметить, что эффективность связывания и обнаружения может быть проблематичной для олигосахаридов с низкой DP, особенно если эпитоп представляет собой димерный или тримерный олигосахарид.Это можно проверить с использованием коммерческих олигосахаридов разной длины, каждый из которых содержит только один эпитоп, который связывается с конкретным mAb.
Таким образом, использование структурно-специфических антител выявило определенные типы рекальцитрантных связей.В зависимости от типа используемого антитела, соответствующей модели лигирования и силы сигнала, который оно производит (наиболее и наименее обильное), можно идентифицировать новые ферменты и добавлять их в полуколичественном количестве к смеси ферментов для более полной гликоконверсии.Взяв в качестве примера анализ олигосахаридов ACSH, мы можем создать базу данных гликановых связей для каждого материала биомассы.Здесь следует отметить, что следует учитывать разную аффинность антител, и если их аффинность неизвестна, это создаст определенные трудности при сравнении сигналов разных антител.Кроме того, сравнение гликановых связей может работать лучше всего между образцами для одного и того же антитела.Затем эти неподатливые связи могут быть связаны с базой данных CAZyme, из которой мы можем идентифицировать ферменты, выбирать ферменты-кандидаты и тестировать ферменты, разрушающие связи, или разрабатывать микробные системы для экспрессии этих ферментов для использования на биоперерабатывающих заводах44.
Чтобы оценить, как иммунологические методы дополняют альтернативные методы характеристики низкомолекулярных олигосахаридов, присутствующих в лигноцеллюлозных гидролизатах, мы выполнили MALDI (рис. 4, S1-S8) и анализ сахаридов, полученных из ТМС, на основе ГХ-МС на той же панели (рис. 5) олигосахаридной части.MALDI используется для сравнения того, соответствует ли массовое распределение молекул олигосахаридов предполагаемой структуре.На рис.4 представлены МС нейтральных компонентов ACN-A и ACN-B.Анализ ACN-A подтвердил ряд пентозных сахаров в диапазоне от DP 4–8 (рис. 4) до DP 22 (рис. S1), вес которых соответствует олигосахаридам MeU-ксилана.Анализ ACN-B подтвердил ряды пентозы и глюкоксилана с DP 8-15.В дополнительном материале, таком как рисунок S3, карты массового распределения кислых фрагментов FA-C показывают диапазон (Me)U замещенных пентозных сахаров с DP 8–15, которые согласуются с замещенными ксиланами, обнаруженными при скрининге mAb на основе ELISA.Эпитопы являются последовательными.
Спектр MALDI-MS растворимых несовместимых олигосахаридов, присутствующих в ACS.Здесь (A) фракции низкого веса ACN-A, содержащие метилированную уроновую кислоту (DP 4-8), замещенные олигосахаридами глюкуроксилана, и (B) ксилан ACN-B и олигосахариды метилированной уроновой кислоты, замещенные глюкурококсиланом (DP 8-15).
Анализ состава гликанового остатка тугоплавких олигосахаридов.Здесь (A) сахаридная композиция ТМС различных фракций олигосахаридов, полученная с использованием анализа ГХ-МС.(B) Структуры различных сахаров, полученных из TMS, присутствующих в олигосахаридах.АЦН – ацетонитриловая фракция, содержащая нейтральные олигосахариды и ФА – фракция феруловой кислоты, содержащая кислые олигосахариды.
Другой интересный вывод был сделан из анализа LC-MS фракции олигосахаридов, как показано на рисунке S9 (методы можно увидеть в электронном дополнительном материале).Фрагменты гексозных и -OAc-групп неоднократно наблюдались при лигировании фракции ACN-B.Это открытие не только подтверждает фрагментацию, наблюдаемую в анализе гликома и MALDI-TOF, но также предоставляет новую информацию о потенциальных углеводных производных в предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассе.
Мы также проанализировали сахарный состав фракции олигосахаридов, используя дериватизацию сахара ТМС.С помощью ГХ-МС мы определили состав нейральных (не производных) и кислых сахаров (GluA и GalA) во фракции олигосахаридов (рис. 5).Глюкуроновая кислота содержится в кислых компонентах C и D, тогда как галактуроновая кислота содержится в кислых компонентах A и B, оба из которых являются компонентами с высокой DP кислых сахаров.Эти результаты не только подтверждают наши данные ELISA и MALDI, но также согласуются с нашими предыдущими исследованиями накопления олигосахаридов.Поэтому мы считаем, что современных иммунологических методов с использованием биотинилирования олигосахаридов и последующего ИФА-скрининга достаточно для обнаружения растворимых рекальцитрантных олигосахаридов в различных биологических образцах.
Поскольку методы скрининга mAb на основе ELISA были проверены несколькими различными методами, мы хотели дополнительно изучить потенциал этого нового количественного метода.Два коммерческих олигосахарида, олигосахарид ксилогексасахарида (XHE) и 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX), были приобретены и протестированы с использованием нового подхода mAb, нацеленного на гликан клеточной стенки.На рисунке 6 показана линейная корреляция между сигналом биотинилированного связывания и логарифмом концентрации концентрации олигосахаридов, что предполагает возможную модель адсорбции Ленгмюра.Среди mAb CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 и CCRC-M151 коррелировали с XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 и LM11 коррелировали с A2XX в диапазоне от 1 нм до 100 нано.Из-за ограниченной доступности антител во время эксперимента были проведены ограниченные эксперименты с каждой концентрацией олигосахарида.Здесь следует отметить, что некоторые антитела очень по-разному реагируют на один и тот же олигосахарид в качестве субстрата, по-видимому, потому, что они связываются с немного разными эпитопами и могут иметь очень разную аффинность связывания.Механизмы и последствия точной идентификации эпитопов будут намного сложнее, когда новый подход mAb будет применяться к реальным образцам.
Два коммерческих олигосахарида использовали для определения диапазона обнаружения различных mAb, нацеленных на гликаны.Здесь линейные корреляции с логарифмической концентрацией концентрации олигосахаридов указывают на модели Ленгмюровской адсорбции для (A) XHE с mAb и (B) A2XX с mAb.Соответствующие эпитопы указывают на структуры коммерческих олигосахаридов, используемых в качестве субстратов в анализе.
Использование направленных на гликан моноклональных антител (гликокомический анализ или скрининг mAb на основе ELISA) является мощным инструментом для углубленной характеристики большинства основных гликанов клеточных стенок, составляющих биомассу растений.Однако классический анализ гликанов характеризует только более крупные гликаны клеточной стенки, поскольку большинство олигосахаридов неэффективно иммобилизуются на планшетах ELISA.В этом исследовании кукурузная солома, предварительно обработанная AFEX, подвергалась ферментативному гидролизу с высоким содержанием твердых веществ.Анализ сахара использовали для определения состава рекальцитрантных углеводов клеточной стенки в гидролизате.Однако анализ mAb более мелких олигосахаридов в гидролизатах недооценен, и необходимы дополнительные инструменты для эффективной иммобилизации олигосахаридов на планшетах для ELISA.
Мы сообщаем здесь о новом и эффективном методе иммобилизации олигосахаридов для скрининга mAb путем сочетания биотинилирования олигосахаридов с последующим скринингом ELISA на планшетах, покрытых NeutrAvidin™.Иммобилизованные биотинилированные олигосахариды показали достаточную аффинность к антителу, чтобы сделать возможным быстрое и эффективное обнаружение рекальцитрантных олигосахаридов.Анализ состава этих стойких олигосахаридов на основе масс-спектрометрии подтвердил результаты этого нового подхода к иммуноскринингу.Таким образом, эти исследования демонстрируют, что сочетание биотинилирования олигосахаридов и скрининга ELISA с моноклональными антителами, нацеленными на гликаны, может быть использовано для обнаружения поперечных связей в олигосахаридах и может широко применяться в других биохимических исследованиях, характеризующих структуру олигосахаридов.
Этот метод профилирования гликанов на основе биотина является первым отчетом, способным исследовать неподатливые углеводные связи растворимых олигосахаридов в биомассе растений.Это помогает понять, почему некоторые части биомассы так упрямы, когда дело доходит до производства биотоплива.Этот метод заполняет важный пробел в методах анализа гликомов и расширяет его применение на более широкий спектр субстратов, помимо растительных олигосахаридов.В будущем мы можем использовать робототехнику для биотинилирования и использовать разработанный нами метод для высокопроизводительного анализа образцов с помощью ИФА.
Кукурузная солома (CS), выращенная из гибридных семян Pioneer 33A14, была собрана в 2010 году на фермах Kramer Farms в Рэе, штат Колорадо.С разрешения землевладельца эту биомассу можно использовать для исследований. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Образцы хранились густыми при температуре < 6% в пакетах с застежкой-молнией при температуре окружающей среды. Образцы хранились в сухом виде при влажности <6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с закваской-молнией при температуре с влажностью < 6%. Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре и влажности < 6%.Исследование соответствовало местным и национальным рекомендациям.Композиционный анализ проводили с использованием протокола NREL.Было обнаружено, что композиция содержит 31,4% глюкана, 18,7% ксилана, 3,3% арабинана, 1,2% галактана, 2,2% ацетила, 14,3% лигнина, 1,7% белка и 13,4% золы.
Cellic® CTec2 (138 мг белка/мл, партия VCNI 0001) представляет собой сложную смесь целлюлазы, β-глюкозидазы и Cellic® HTec2 (157 мг белка/мл, партия VHN00001) от Novozymes (Франклинтон, Северная Каролина, США)).Multifect Pectinase® (72 мг белка/мл), сложная смесь ферментов, разлагающих пектин, была предоставлена ​​компанией DuPont Industrial Biosciences (Пало-Альто, Калифорния, США).Концентрации белка фермента определяли путем оценки содержания белка (и вычитания вклада небелкового азота) с использованием азотного анализа Кьельдаля (метод AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Итака, штат Нью-Йорк, США).Диатомовая земля 545 была приобретена у EMD Millipore (Биллерика, Массачусетс).Активированный уголь (DARCO, гранулы 100 меш), авицел (PH-101), ксилан бука и все другие химические вещества были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).
Предварительную обработку AFEX проводили в GLBRC (Исследовательская лаборатория преобразования биомассы, МГУ, Лансинг, Мичиган, США).Предварительную обработку проводили при 140°С в течение 15 минут.46 время пребывания при соотношении безводного аммиака к биомассе 1:1 при загрузке 60% (масс./масс.) в настольном реакторе периодического действия из нержавеющей стали (Parr Instruments Company).Это заняло 30 минут.Реактор доводили до 140°С, и аммиак быстро высвобождался, позволяя биомассе быстро вернуться к комнатной температуре.Состав предварительно обработанной AFEX кукурузной соломы (ACS) был аналогичен составу необработанной кукурузной соломы (UT-CS).
В качестве исходного материала для крупномасштабного производства олигосахаридов готовили ACSH 25% (масс./масс.) с высоким содержанием твердых веществ (примерно 8% загрузки декстрана).Ферментативный гидролиз ACS проводили с использованием коммерческой смеси ферментов, включающей Cellic® Ctec2 10 мг белка/г глюкана (в предварительно обработанной биомассе), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг белка/г глюкана и Multifect Pectinase (Genencor Inc, США).).), 5 мг белка/г декстрана.Ферментативный гидролиз проводили в 5-литровом биореакторе с рабочим объемом 3 л, рН 4,8, 50°С и 250 об/мин.После гидролиза в течение 96 часов гидролизат собирали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 минут, а затем при 14000 об/мин в течение 30 минут для удаления негидролизованных твердых веществ.Затем гидролизат подвергали стерильной фильтрации через стакан с фильтром диаметром 0,22 мм.Отфильтрованный гидролизат хранили в стерильных бутылях при 4°С и затем фракционировали на угле.
Анализ состава образцов биомассы на основе экстракта в соответствии с процедурами лабораторного анализа NREL: подготовка образцов для анализа состава (NREL/TP-510-42620) и определение структурных углеводов и лигнина в биомассе (NREL/TP-510 – 42618)47.
Олигосахаридный анализ потока гидролизата выполняли в масштабе 2 мл с использованием метода кислотного гидролиза на основе автоклава.Смешайте образец гидролизата с 69,7 мкл 72%-ной серной кислоты в 10 мл культуральной пробирке с завинчивающейся крышкой и инкубируйте в течение 1 часа на столе при 121 °C, охладите на льду и профильтруйте во флакон для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).Концентрацию олигосахаридов определяли путем вычитания концентрации моносахаридов в негидролизованном образце из общей концентрации сахара в кислотно-гидролизованном образце.
Концентрации глюкозы, ксилозы и арабинозы в кислотно-гидролизованной биомассе анализировали с использованием системы ВЭЖХ Shimadzu, оснащенной автоматическим пробоотборником, нагревателем колонки, изократическим насосом и детектором показателя преломления на колонке Bio-Rad Aminex HPX-87H.Колонку поддерживали при 50°C и элюировали 0,6 мл/мин 5 мМ H2SO4 в воде.поток.
Супернатант гидролизата разбавляли и анализировали на содержание мономера и олигосахаридов.Мономерные сахара, полученные после ферментативного гидролиза, анализировали с помощью ВЭЖХ, оснащенной колонкой Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P и колонкой с защитой от золы.Температуру колонки поддерживали на уровне 80°С, в качестве подвижной фазы использовали воду со скоростью потока 0,6 мл/мин.Олигосахариды определяли гидролизом в разбавленной кислоте при 121°C в соответствии с методами, описанными в ссылках.41, 48, 49.
Сахаридный анализ проводили на необработанных, предварительно обработанных AFEX и всех негидролизованных остатках биомассы (включая получение серийных экстрактов клеточных стенок и их скрининг mAb) с использованием ранее описанных процедур 27, 43, 50, 51 .Для анализа гликома нерастворимые в спирте остатки материала клеточных стенок растений готовят из остатков биомассы и подвергают серийной экстракции все более агрессивными реагентами, такими как оксалат аммония (50 мМ), карбонат натрия (50 мМ и 0,5% масс./об.), CON.(1M и 4M, оба с 1% мас./об. боргидрида натрия) и хлорангидридом, как описано ранее52,53.Экстракты затем подвергали ELISA против комплексной панели mAb50, направленных на гликан клеточной стенки, и реакции связывания mAb представляли в виде тепловой карты.mAb, нацеленные на гликан клеточной стенки растений, были приобретены из лабораторных запасов (серии CCRC, JIM и MAC).
Одностадийное биотинилирование олигосахаридов.Конъюгацию углеводов с биотин-LC-гидразидом проводили по следующей методике.Биотин-LC-гидразид (4,6 мг/12 мкмоль) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, 70 мкл) при интенсивном перемешивании и нагревании при 65°С в течение 1 мин.Добавляли ледяную уксусную кислоту (30 мкл) и смесь выливали на цианборгидрид натрия (6,4 мг/100 мкмоль) и полностью растворяли после нагревания при 65°С в течение примерно 1 минуты.Затем к высушенному олигосахариду (1-100 нмоль) добавляли от 5 до 8 мкл реакционной смеси до получения 10-кратного и более молярного избытка метки над восстанавливающим концом.Реакцию проводили при 65°С в течение 2 ч, после чего образцы сразу очищали.Цианоборогидрид натрия не использовали в экспериментах по мечению без восстановления, и образцы реагировали при 65°С в течение 2,5 часов.
ИФА покрытие и промывание образцов биотинилированных олигосахаридов.В каждую лунку планшета, покрытого авидином, добавляли по 25 мкл биотинилированных образцов (по 100 мкл каждого концентрированного образца, разведенного в 5 мл 0,1 М трис-буферного раствора (TBS)).В контрольные лунки вносили по 50 мкл биотина в концентрации 10 мкг/мл в 0,1 М ТБС.В качестве покрытия для холостых измерений использовали деионизированную воду.Планшет инкубировали 2 часа при комнатной температуре в темноте.Промойте пластину 3 раза 0,1% обезжиренным молоком в 0,1 М TBS, используя программу №.11 для квартиры Гренье 3А.
Добавление и отмывание первичных антител.Добавьте в каждую лунку по 40 мкл первичных антител.Инкубируйте микропланшет в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.Затем планшеты промывали 3 раза 0,1% молоком в 0,1 М TBS, используя программу промывки №11 для Grenier Flat 3A.
Добавьте вторичное антитело и промойте.Добавьте 50 мкл вторичного антитела мыши/крысы (разбавленного 1:5000 в 0,1% молока в 0,1 М TBS) в каждую лунку.Инкубируйте микропланшет в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.Затем микропланшеты промывали 5 раз 0,1% молоком в 0,1 М TBS, используя программу промывки планшетов Grenier Flat 5A №12.
Добавление субстрата.Добавьте 50 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) к основному субстрату (путем добавления 2 капель буфера, 3 капель ТМБ, 2 капель перекиси водорода к 15 мл деионизированной воды).Подготовьте субстрат ТМБ.и вортекс перед использованием).Инкубируйте микропланшет при комнатной температуре в течение 30 минут.Во тьме.
Завершите шаг и прочитайте табличку.Добавьте 50 мкл 1 N серной кислоты в каждую лунку и запишите оптическую плотность от 450 до 655 нм, используя считыватель ELISA.
Готовят растворы 1 мг/мл этих аналитов в деионизированной воде: арабинозы, рамнозы, фукозы, ксилозы, галактуроновой кислоты (GalA), глюкуроновой кислоты (GlcA), маннозы, глюкозы, галактозы, лактозы, N-ацетилманнозамина (manNAc), N-ацетилглюкозамина.(glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (внутренний стандарт).Два стандарта готовили путем добавления растворов сахара с концентрацией 1 мг/мл, показанных в таблице 1. Образцы замораживали и лиофилизировали при -80°С до полного удаления воды (обычно около 12-18 часов).
Добавьте 100–500 мкг образца в пробирки с завинчивающимися крышками на аналитических весах.Запишите добавленную сумму.Лучше всего растворить образец в растворителе определенной концентрации и добавить его в пробирку в виде жидкой аликвоты.Используйте 20 мкл инозитола с концентрацией 1 мг/мл в качестве внутреннего стандарта для каждой пробирки с образцом.Количество внутреннего стандарта, добавляемого в образец, должно быть таким же, как и количество внутреннего стандарта, добавляемого в стандартную пробирку.
Добавьте 8 мл безводного метанола во флакон с завинчивающейся крышкой.Затем 4 мл 3 н. метанольного раствора HCl закрывают крышкой и встряхивают.В этом процессе не используется вода.
Добавьте 500 мкл 1 М раствора метанола HCl в образцы олигосахаридов и стандартные пробирки TMS.Образцы инкубировали в течение ночи (168 часов) при 80°С в термоблоке.Высушите продукт метанолиза при комнатной температуре, используя сушильный коллектор.Добавьте 200 мкл MeOH и снова высушите.Этот процесс повторяется дважды.Добавьте к образцу 200 мкл метанола, 100 мкл пиридина и 100 мкл уксусного ангидрида и хорошо перемешайте.Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.и высушенный.Добавьте 200 мкл метанола и снова высушите.
Добавьте 200 мкл Tri-Sil и нагревайте пробирку с крышкой в ​​течение 20 минут.80°С, затем охлаждают до комнатной температуры.Используйте коллектор для сушки, чтобы дополнительно высушить образец до объема примерно 50 мкл.Важно отметить, что мы не давали образцам полностью высохнуть.
Добавьте 2 мл гексана и хорошо перемешайте на вортексе.Заполните наконечники пипеток Пастера (5-8 мм) куском стекловаты, вставив стекловату поверх пипетки диаметром 5-3/4 дюйма.Образцы центрифугировали при 3000 g в течение 2 минут.Любые нерастворимые остатки осаждаются.Высушите образец до 100-150 мкл.Объем примерно 1 мкл вводили в ГХ-МС при начальной температуре 80 °C и начальном времени 2,0 минуты (таблица 2).