Asante kwa kutembelea Nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo wa CSS. Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Utangamano katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutatoa tovuti bila mitindo na JavaScript.
Mbinu mpya za kinga na spektrometri za wingi kwa ajili ya uchambuzi tata wa oligosaccharides zinazoendelea katika stover ya mahindi zilizotibiwa awali na AFEX. Biomasi ya Lignocellulosic ni mbadala endelevu wa mafuta ya visukuku na hutumika sana kukuza teknolojia za kibiolojia kwa ajili ya uzalishaji wa bidhaa kama vile chakula, malisho, mafuta na kemikali. Ufunguo wa teknolojia hizi ni maendeleo ya michakato ya ushindani wa gharama kwa ajili ya kubadilisha wanga tata zilizopo kwenye kuta za seli za mimea kuwa sukari rahisi kama vile glukosi, xylose na arabinose. Kwa sababu biomasi ya lignocellulosic ni ngumu sana, lazima ifanyiwe matibabu ya jotokemikali (km, exfoliation ya nyuzinyuzi za amonia (AFEX), asidi iliyopunguzwa (DA), vimiminika vya ioni (IL)) na matibabu ya kibiolojia (km, hidrolisisi ya kimeng'enya na uchachushaji wa vijidudu) pamoja ili kupata bidhaa inayotakiwa. Hata hivyo, wakati vimeng'enya vya kuvu vya kibiashara vinapotumika katika mchakato wa hidrolisisi, ni 75-85% tu ya sukari mumunyifu inayoundwa ni monosaccharides, na 15-25% iliyobaki ni oligosaccharides mumunyifu na zisizoweza kutibika, ambazo hazipatikani kila wakati kwa vijidudu. Hapo awali, tumefanikiwa kutenga na kusafisha oligosaccharides ngumu mumunyifu kwa kutumia mchanganyiko wa utengano wa kaboni na diatomaceous earth na chromatografia ya kuondoa ukubwa, na pia tumechunguza sifa zao za kuzuia kimeng'enya. Tumegundua kuwa oligosaccharides zenye kiwango cha juu cha upolimishaji (DP) methylated uronic substitutions ni ngumu zaidi kusindika na mchanganyiko wa vimeng'enya vya kibiashara kuliko DP ya chini na oligosaccharides zisizo na upande wowote. Hapa tunaripoti matumizi ya mbinu kadhaa za ziada, ikiwa ni pamoja na uainishaji wa glycan kwa kutumia kingamwili za monokloni (mAbs) maalum kwa glycans za mimea ya mimea ili kuainisha vifungo vya glycan katika kuta za seli za mimea na hidrolisiati za kimeng'enya, ioni ya desorption ya laser inayosaidiwa na matrix, spectrometry ya muda wa kuruka. MALDI-TOF-MS) hutumia vilele vya utambuzi vinavyotoa taarifa za muundo vinavyopatikana kwa kutumia spektroskopia baada ya kuoza kwa pili kwa ioni hasi, kromatografia ya gesi na spektrometri ya wingi (GC-MS) kuainisha vifungo vya oligosaccharide vyenye na bila uundaji. Kutokana na ukubwa mdogo wa oligosaccharide (DP 4–20), molekuli hizi ni vigumu kutumia kwa ajili ya kufunga na kuainisha mAb. Ili kushinda tatizo hili, tulitumia mbinu mpya ya uzuiaji wa oligosaccharide inayotegemea munganishwaji wa biotini ambayo ilifanikiwa kuweka lebo nyingi za oligosaccharide mumunyifu za DP zenye kiwango cha chini kwenye uso wa microplate, ambazo kisha zilitumika katika mfumo wa mAb wenye kiwango cha juu kwa ajili ya uchambuzi maalum wa kufunga. Njia hii mpya itawezesha ukuzaji wa majaribio ya hali ya juu zaidi ya glycome yenye kiwango cha juu katika siku zijazo ambayo yanaweza kutumika kutenga na kuainisha oligosaccharide zilizopo katika biomarkers kwa madhumuni ya uchunguzi.
Biomasi ya Lignocellulosic, inayoundwa na vifaa vya kilimo, misitu, nyasi na mbao, ni chanzo kinachowezekana cha uzalishaji wa bidhaa zenye msingi wa kibiolojia, ikiwa ni pamoja na chakula, malisho, mafuta na kemikali zinazotangulia kuzalisha bidhaa zenye thamani kubwa1. Wanga (kama vile selulosi na hemicellulose) zilizopo kwenye kuta za seli za mimea huondolewa polima kuwa monosakaridi kwa usindikaji wa kemikali na ubadilishanaji wa kibiolojia (kama vile hidrolisisi ya kimeng'enya na uchachushaji wa vijidudu). Matibabu ya kawaida ya awali ni pamoja na upanuzi wa nyuzinyuzi za amonia (AFEX), asidi iliyopunguzwa (DA), kioevu cha ioni (IL), na mlipuko wa mvuke (SE), ambazo hutumia mchanganyiko wa kemikali na joto ili kupunguza uzalishaji wa lignocellulose kwa kufungua kuta za seli za mimea3,4. ukaidi wa maada, 5. Hidrolisisi ya kimeng'enya hufanywa kwa mzigo mkubwa wa vitu vikali kwa kutumia vimeng'enya vyenye wanga hai kibiashara (CAZymes) na uchachushaji wa vijidudu kwa kutumia chachu za transgenic au bakteria ili kutoa mafuta na kemikali zenye msingi wa kibiolojia6.
CAZymes katika vimeng'enya vya kibiashara huundwa na mchanganyiko tata wa vimeng'enya ambavyo hutenganisha vifungo tata vya wanga-sukari ili kuunda monosaccharides2,7. Kama tulivyoripoti hapo awali, mtandao tata wa polima zenye kunukia za lignin na wanga huzifanya kuwa ngumu sana, jambo ambalo husababisha ubadilishaji usiokamilika wa sukari, na kukusanya 15-25% ya oligosaccharides za jinsia ambazo hazizalishwi wakati wa hidrolisisi ya kimeng'enya ya biomasi iliyotibiwa awali. Hili ni tatizo la kawaida na mbinu mbalimbali za matibabu ya biomasi kabla ya matibabu. Baadhi ya sababu za kizuizi hiki ni pamoja na kizuizi cha vimeng'enya wakati wa hidrolisisi, au kutokuwepo au viwango vya chini vya vimeng'enya muhimu muhimu vinavyohitajika kuvunja vifungo vya sukari katika biomasi ya mimea. Kuelewa muundo na sifa za kimuundo za sukari, kama vile vifungo vya sukari katika oligosaccharides, kutatusaidia kuboresha ubadilishaji wa sukari wakati wa hidrolisisi, na kufanya michakato ya kibayolojia iwe ya ushindani na bidhaa zinazotokana na petroli.
Kubaini muundo wa wanga ni changamoto na kunahitaji mchanganyiko wa mbinu kama vile kromatografia ya kioevu (LC)11,12, spektroskopia ya mwangwi wa sumaku ya nyuklia (NMR)13, elektrophoresisi ya kapilari (CE)14,15,16 na spektroskopia ya wingi (MS)17. ,kumi na nane. Mbinu za MS kama vile spektroskopia ya wingi ya wakati wa kuruka kwa kutumia leza ya kuondoa msongeo na ioni kwa kutumia matrix (MALDI-TOF-MS) ni njia inayoweza kutumika kwa wingi kwa kutambua miundo ya wanga. Hivi majuzi, sanjari ya MS ya viambatisho vya ioni ya sodiamu inayosababishwa na Mgongano (CID) imetumika sana kutambua alama za vidole zinazolingana na nafasi za kiambatisho cha oligosaccharide, usanidi wa anomeri, mfuatano, na nafasi za matawi 20, 21.
Uchambuzi wa Glycan ni zana bora ya utambuzi wa kina wa vifungo vya wanga22. Njia hii hutumia kingamwili za monokloni (mAbs) zinazoelekezwa kwenye glycan ya ukuta wa seli za mimea kama probes ili kuelewa uhusiano tata wa wanga. Zaidi ya mAbs 250 zinapatikana duniani kote, zilizoundwa dhidi ya oligosaccharides mbalimbali za mstari na matawi kwa kutumia saccharides mbalimbali24. MAbs kadhaa zimetumika sana kuainisha muundo, muundo, na marekebisho ya ukuta wa seli za mimea, kwani kuna tofauti kubwa kulingana na aina ya seli za mimea, kiungo, umri, hatua ya ukuaji, na mazingira ya ukuaji25,26. Hivi majuzi, njia hii imetumika kuelewa idadi ya vilengelenge katika mifumo ya mimea na wanyama na majukumu yao husika katika usafirishaji wa glycan kama ilivyoamuliwa na alama ndogo za seli, hatua za ukuaji, au vichocheo vya mazingira, na kubaini shughuli za kimeng'enya. Baadhi ya miundo tofauti ya glikani na xylani ambazo zimetambuliwa ni pamoja na pectini (P), xylani (X), mannan (M), xyloglukani (XylG), glukani mchanganyiko (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) na arabino-galactan (ArbG)29.
Hata hivyo, licha ya juhudi hizi zote za utafiti, ni tafiti chache tu zilizolenga asili ya mkusanyiko wa oligosaccharide wakati wa hidrolisisi ya mzigo mkubwa wa vitu vikali (HSL), ikiwa ni pamoja na kutolewa kwa oligosaccharide, mabadiliko ya urefu wa mnyororo wa oligomeric wakati wa hidrolisisi, polima mbalimbali za DP za chini, na mikunjo yao. Wakati huo huo, ingawa uchambuzi wa glycan umethibitika kuwa zana muhimu kwa uchambuzi wa kina wa muundo wa glycan, ni vigumu kutathmini oligosaccharide za DP za chini zinazoyeyuka katika maji kwa kutumia mbinu za kingamwili. Oligosaccharide ndogo za DP zenye uzito wa molekuli wa chini ya 5-10 kDa hazijifungamani na sahani za ELISA 33, 34 na huoshwa kabla ya kuongezwa kwa kingamwili.
Hapa, kwa mara ya kwanza, tunaonyesha jaribio la ELISA kwenye sahani zilizofunikwa na avidin kwa kutumia kingamwili za monokloni, tukichanganya utaratibu wa hatua moja wa biotinili kwa oligosaccharides zinazoyeyuka na uchambuzi wa glycome. Mbinu yetu ya uchambuzi wa glycome ilithibitishwa na uchambuzi wa MALDI-TOF-MS na GC-MS wa miunganisho inayosaidiana ya oligosaccharide kwa kutumia uundaji wa trimethylsilyl (TMS) wa michanganyiko ya sukari iliyohidrolisisi. Mbinu hii bunifu inaweza kuendelezwa kama mbinu ya kiwango cha juu katika siku zijazo na kupata matumizi mapana katika utafiti wa matibabu35.
Marekebisho ya baada ya tafsiri ya vimeng'enya na kingamwili, kama vile glycosylation,36 huathiri shughuli zao za kibiolojia. Kwa mfano, mabadiliko katika glycosylation ya protini za seramu huchukua jukumu muhimu katika arthritis ya uchochezi, na mabadiliko katika glycosylation hutumika kama alama za utambuzi37. Glicans mbalimbali zimeripotiwa katika machapisho kuonekana kwa urahisi katika magonjwa mbalimbali, ikiwa ni pamoja na magonjwa sugu ya uchochezi ya njia ya utumbo na ini, maambukizi ya virusi, saratani ya ovari, matiti, na kibofu38,39,40. Kuelewa muundo wa glycans kwa kutumia mbinu za glycan ELISA zinazotegemea kingamwili kutatoa ujasiri zaidi katika utambuzi wa ugonjwa bila kutumia mbinu tata za MS.
Utafiti wetu uliopita ulionyesha kuwa oligosaccharide zenye ukaidi zilibaki bila hidrolisi baada ya matibabu ya awali na hidrolisi ya kimeng'enya (Mchoro 1). Katika kazi yetu iliyochapishwa hapo awali, tulitengeneza mbinu ya uchimbaji wa awamu ngumu ya mkaa iliyoamilishwa ili kutenga oligosaccharide kutoka kwa hidrolisati ya stover ya mahindi iliyotibiwa awali ya AFEX (ACSH)8. Baada ya uchimbaji na utenganishaji wa awali, oligosaccharide ziligawanywa zaidi kwa kutumia kromatografia ya kuondoa ukubwa (SEC) na kukusanywa kwa mpangilio wa uzito wa molekuli. Monomer za sukari na oligomer zilizotolewa kutoka kwa matibabu mbalimbali ya awali zilichambuliwa kwa kutumia uchanganuzi wa muundo wa sukari. Wakati wa kulinganisha maudhui ya oligomer za sukari zilizopatikana kwa njia mbalimbali za matibabu ya awali, uwepo wa oligosaccharide zenye ukaidi ni tatizo la kawaida katika ubadilishaji wa biomasi kuwa monosaccharide na unaweza kusababisha kupungua kwa mavuno ya sukari ya angalau 10-15% na hata hadi 18%. Marekani. Njia hii inatumika kwa uzalishaji mkubwa zaidi wa vipande vya oligosaccharide. ACH iliyotokana na vipande vyake vilivyofuata vyenye uzito tofauti wa molekuli vilitumika kama nyenzo ya majaribio kwa ajili ya uainishaji wa oligosaccharides katika kazi hii.
Baada ya matibabu ya awali na hidrolisisi ya kimeng'enya, oligosaccharide zinazoendelea zilibaki bila hidrolisisi. Hapa (A) ni mbinu ya utenganishaji wa oligosaccharide ambapo oligosaccharide hutengwa kutoka kwa hidrolisisiti ya stover ya mahindi iliyotibiwa awali ya AFEX (ACSH) kwa kutumia kitanda kilichojaa cha kaboni iliyoamilishwa na ardhi ya diatomaceous; (B) Mbinu ya utenganishaji wa oligosaccharide. Oligosaccharide zilitenganishwa zaidi na kromatografia ya kuondoa ukubwa (SEC); (C) Monomeri za Saccharide na oligomeri zilizotolewa kutoka kwa matibabu mbalimbali ya awali (asidi iliyopunguzwa: DA, kioevu cha ioni: IL na AFEX). Hali ya hidrolisisi ya kimeng'enya: mzigo mkubwa wa vitu vikali wa 25% (w/w) (takriban 8% ya mzigo wa glukani), hidrolisisi ya saa 96, mzigo wa kimeng'enya cha kibiashara cha 20 mg/g (uwiano wa Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) na (D) Monomer za sukari na oligomers za glukosi, xylose na arabinose iliyotolewa kutoka kwa AFEX iliyotibiwa awali ya corn stover (ACS).
Uchambuzi wa Glycan umethibitika kuwa zana muhimu kwa uchambuzi kamili wa kimuundo wa glikani katika dondoo zilizotengwa kutoka kwa mabaki ya biomasi ngumu. Hata hivyo, sakaridi zinazoyeyuka katika maji hazijawakilishwa kikamilifu kwa kutumia mbinu hii ya kitamaduni41 kwa sababu oligosakaridi zenye uzito mdogo wa molekuli ni vigumu kuzizuia kwenye sahani za ELISA na huoshwa kabla ya kuongezwa kwa kingamwili. Kwa hivyo, kwa ajili ya kufunga na kuainisha kingamwili, mbinu ya hatua moja ya biotinili ilitumika kufunika oligosakaridi zinazoyeyuka na zisizofuata sheria kwenye sahani za ELISA zilizofunikwa na avidin. Njia hii ilijaribiwa kwa kutumia ACSH yetu iliyotengenezwa hapo awali na sehemu kulingana na uzito wake wa molekuli (au kiwango cha upolimishaji, DP). Biotinilizi ya hatua moja ilitumika kuongeza mshikamano wa kufunga wa oligosakari kwa kuongeza biotin-LC-hydrazide kwenye ncha ya kupunguza ya kabohaidreti (Mchoro 2). Katika myeyusho, kundi la hemiacetal kwenye ncha ya kupunguza humenyuka na kundi la hidrazidi la biotin-LC-hydrazide ili kuunda kifungo cha hidrazoni. Mbele ya kichocheo cha NaCNBH3, kifungo cha hidrazoni hupunguzwa hadi bidhaa ya mwisho thabiti ya biotinili. Kwa marekebisho ya ncha ya kupunguza sukari, kufunga kwa oligosaccharides za DP za chini kwenye sahani za ELISA kuliwezekana, na katika utafiti wetu hii ilifanyika kwenye sahani zilizofunikwa na avidin kwa kutumia mAbs zilizolengwa na glycan.
Uchunguzi wa kingamwili za monokloni kulingana na ELISA kwa oligosaccharide zilizo na biotini. Hapa (A) mchanganyiko wa biotinila ya oligosaccharide na uchunguzi unaofuata wa ELISA na mAbs zinazolengwa na glycan kwenye sahani zilizofunikwa na NeutrAvidin na (B) inaonyesha utaratibu wa hatua moja wa biotinila ya bidhaa za mmenyuko.
Sahani zilizofunikwa na Avidin zenye kingamwili zilizounganishwa na oligosaccharide ziliongezwa kwenye kingamwili za msingi na za sekondari na kuoshwa katika chombo chenye mwanga na muda nyeti. Baada ya kukamilika kwa kufunga kingamwili, ongeza sehemu ya TMB ili kuangua sahani. Mwitikio hatimaye ulisimamishwa na asidi ya sulfuriki. Sahani zilizoangua zilichambuliwa kwa kutumia kisomaji cha ELISA ili kubaini nguvu ya kufunga ya kila kingamwili ili kugundua uunganishaji maalum wa kingamwili. Kwa maelezo na vigezo vya jaribio, tazama sehemu inayolingana "Vifaa na Mbinu".
Tunaonyesha manufaa ya mbinu hii mpya iliyotengenezwa kwa matumizi maalum kwa kuainisha oligosaccharide zinazoyeyuka zilizopo katika ACSH na pia katika vipande vya oligosaccharide ghafi na vilivyosafishwa vilivyotengwa kutoka kwa hidrolisati za lignocellulosic. Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 3, xylans za kawaida zinazobadilishwa na epitope zilizotambuliwa katika ACSH kwa kutumia mbinu za upimaji wa glycome iliyo na bioacyli kwa kawaida ni uronic (U) au methyluronic (MeU) na pectic arabinogalactans. Nyingi kati yao pia zilipatikana katika utafiti wetu wa awali kuhusu uchanganuzi wa glikans za vitu vyabisi visivyo na hidrolisisi (UHS)43.
Ugunduzi wa epitopu za oligosaccharide zisizo na kalcitranti kwa kutumia kingamwili ya monokloni iliyoelekezwa kwenye glycan ya ukuta wa seli. Sehemu "isiyo na upande wowote" ni sehemu ya ACN na sehemu "yenye asidi" ni sehemu ya FA. Nyekundu angavu zaidi kwenye ramani ya joto zinaonyesha kiwango cha juu cha epitopu, na bluu angavu zaidi zinaonyesha mandhari tupu. Thamani za rangi kwenye kipimo zinategemea thamani mbichi za OD kwa fomula N=2. Epitopu kuu zinazotambuliwa na kingamwili zinaonyeshwa upande wa kulia.
Miundo hii isiyo ya selulosi haikuweza kugawanywa na selulosi na hemiseli za kawaida katika mchanganyiko wa kimeng'enya cha kibiashara uliojaribiwa, ambao unajumuisha vimeng'enya vya kibiashara vinavyotumika sana. Kwa hivyo, vimeng'enya vipya saidizi vinahitajika kwa hidrolisisi yao. Bila vimeng'enya vya ziada visivyo vya selulosi, vifungo hivi visivyo vya selulosi huzuia ubadilishaji kamili kuwa monosakaridi, hata kama polima zao kuu za sukari huhidrolisisi kwa kiasi kikubwa katika vipande vifupi na kuyeyushwa kwa kutumia mchanganyiko wa vimeng'enya vya kibiashara.
Utafiti zaidi wa usambazaji wa ishara na nguvu yake ya kufungamana ulionyesha kuwa epitopu za kufungamana zilikuwa chini katika sehemu za sukari za DP zenye kiwango cha juu (A, B, C, DP hadi 20+) kuliko katika sehemu za DP zenye kiwango cha chini (D, E, F, DP) katika vipimo vya kipimo) (Mchoro 1). Vipande vya asidi ni vya kawaida zaidi katika epitopu zisizo za selulosi kuliko vipande visivyo na upande wowote. Matukio haya yanaendana na muundo ulioonekana katika utafiti wetu uliopita, ambapo sehemu za DP na asidi nyingi zilikuwa sugu zaidi kwa hidrolisisi ya kimeng'enya. Kwa hivyo, uwepo wa epitopu zisizo za selulosi za glycan na uingizwaji wa U na MeU unaweza kuchangia sana utulivu wa oligosaccharides. Ikumbukwe kwamba ufanisi wa kufungamana na kugundua unaweza kuwa tatizo kwa oligosaccharides za DP zenye kiwango cha chini, haswa ikiwa epitopu ni oligosaccharide ya dimeric au trimeric. Hii inaweza kupimwa kwa kutumia oligosaccharides za kibiashara za urefu tofauti, kila moja ikiwa na epitopu moja tu inayofungamana na mAb maalum.
Kwa hivyo, matumizi ya kingamwili maalum za muundo yalifunua aina fulani za vifungo vya recalcitrant. Kulingana na aina ya kingamwili inayotumika, muundo unaofaa wa kuunganisha, na nguvu ya ishara inayotoa (nyingi na chache zaidi), vimeng'enya vipya vinaweza kutambuliwa na kuongezwa kwa kiasi kidogo kwenye mchanganyiko wa kimeng'enya kwa ajili ya ubadilishaji kamili zaidi wa glycoconversion. Kwa kuchukua uchambuzi wa oligosaccharides za ACSH kama mfano, tunaweza kuunda hifadhidata ya vifungo vya glycan kwa kila nyenzo ya biomasi. Ikumbukwe hapa kwamba mshikamano tofauti wa kingamwili unapaswa kuzingatiwa, na ikiwa mshikamano wao haujulikani, hii itaunda ugumu fulani wakati wa kulinganisha ishara za kingamwili tofauti. Kwa kuongezea, ulinganisho wa vifungo vya glycan unaweza kufanya kazi vizuri zaidi kati ya sampuli za kingamwili hiyo hiyo. Vifungo hivi vikali vinaweza kuunganishwa na hifadhidata ya CAZyme, ambayo tunaweza kutambua vimeng'enya, kuchagua vimeng'enya vinavyofaa na kujaribu vimeng'enya vinavyovunja dhamana, au kutengeneza mifumo ya vijidudu ili kuelezea vimeng'enya hivi kwa matumizi katika biorefineries44.
Ili kutathmini jinsi mbinu za kinga mwilini zinavyokamilisha mbinu mbadala za kubainisha oligosaccharide zenye uzito mdogo wa molekuli zilizopo katika hidrolisiati za lignocellulosic, tulifanya MALDI (Mchoro 4, S1-S8) na uchambuzi wa sakaridi zinazotokana na TMS kulingana na GC-MS kwenye sehemu moja ya oligosaccharide (Mchoro 5). MALDI inatumika kulinganisha kama usambazaji wa wingi wa molekuli za oligosaccharide unalingana na muundo uliokusudiwa. Kwenye mchoro 4 inaonyesha MC ya vipengele visivyo na upande wowote ACN-A na ACN-B. Uchambuzi wa ACN-A ulithibitisha aina mbalimbali za sukari za pentose kuanzia DP 4–8 (Mchoro 4) hadi DP 22 (Mchoro S1), ambazo uzito wake unalingana na oligosaccharide za MeU-xylan. Uchambuzi wa ACN-B ulithibitisha mfululizo wa pentose na glukoksilani na DP 8-15. Katika nyenzo za ziada kama vile Mchoro S3, ramani za usambazaji wa wingi wa asidi wa FA-C zinaonyesha aina mbalimbali za sukari za pentose zilizobadilishwa na (Me)U zenye DP ya 8-15 ambazo zinaendana na xylans zilizobadilishwa zinazopatikana katika uchunguzi wa mAb unaotegemea ELISA. Epitopes ni thabiti.
MALDI-MS wigo wa oligosaccharide zisizotii zinazoyeyuka zilizopo katika ACS. Hapa, (A) Sehemu za ACN-A zenye uzito mdogo zenye asidi ya uroniki yenye methili (DP 4-8) zilibadilisha oligosaccharide za glucuroxylan na (B) oligosaccharide za asidi ya uroniki yenye methili za ACN-B zilizobadilishwa na glucuroxylan (DP 8-15).
Uchambuzi wa muundo wa mabaki ya glikani ya oligosaccharides zinazokinza. Hapa (A) Muundo wa sakrediti ya TMS wa vipande mbalimbali vya oligosaccharide vilivyopatikana kwa kutumia uchambuzi wa GC-MS. (B) Miundo ya sukari mbalimbali zinazotokana na TMS zilizopo katika oligosaccharides. ACN - sehemu ya asetonitrile iliyo na oligosaccharides zisizo na upande wowote na FA - sehemu ya asidi ya ferulic iliyo na oligosaccharides za asidi.
Hitimisho jingine la kuvutia lilitolewa kutokana na uchambuzi wa LC-MS wa sehemu ya oligosaccharide, kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro S9 (njia zinaweza kuonekana katika nyenzo za ziada za kielektroniki). Vipande vya vikundi vya hexose na -OAc vilizingatiwa mara kwa mara wakati wa kufungamana kwa sehemu ya ACN-B. Ugunduzi huu hauthibitishi tu mgawanyiko ulioonekana katika uchanganuzi wa glycome na MALDI-TOF, lakini pia hutoa taarifa mpya kuhusu viambato vinavyoweza kuwa vya kabohaidreti katika biomasi ya lignocellulosic iliyotibiwa mapema.
Pia tulichambua muundo wa sukari wa sehemu ya oligosaccharide kwa kutumia uundaji wa sukari wa TMS. Kwa kutumia GC-MS, tulibaini muundo wa sukari ya neva (isiyotokana na sukari) na asidi (GluA na GalA) katika sehemu ya oligosaccharide (Mchoro 5). Asidi ya Glucuronic inapatikana katika vipengele vya asidi C na D, huku asidi ya galacturonic inapatikana katika vipengele vya asidi A na B, vyote viwili ni vipengele vya juu vya DP vya sukari ya asidi. Matokeo haya hayathibitishi tu data yetu ya ELISA na MALDI, lakini pia yanaendana na tafiti zetu za awali za mkusanyiko wa oligosaccharide. Kwa hivyo, tunaamini kwamba mbinu za kisasa za kinga mwilini kwa kutumia biotinili ya oligosaccharide na uchunguzi wa ELISA unaofuata zinatosha kugundua oligosaccharide zinazoyeyuka katika sampuli mbalimbali za kibiolojia.
Kwa kuwa mbinu za uchunguzi wa mAb zinazotegemea ELISA zimethibitishwa na mbinu kadhaa tofauti, tulitaka kuchunguza zaidi uwezo wa mbinu hii mpya ya kiasi. Oligosaccharides mbili za kibiashara, oligosaccharide ya xylohexasaccharide (XHE) na 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), zilinunuliwa na kupimwa kwa kutumia mbinu mpya ya mAb inayolenga glycan ya ukuta wa seli. Mchoro 6 unaonyesha uhusiano wa mstari kati ya ishara ya kufunga ya biotini na mkusanyiko wa logi wa mkusanyiko wa oligosaccharide, ikipendekeza modeli inayowezekana ya ufyonzaji wa Langmuir. Miongoni mwa mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, na CCRC-M151 zilihusiana na XHE, na CCRC-M108, CCRC-M109, na LM11 zilihusiana na A2XX katika safu ya nano 1 hadi 100. Kutokana na upatikanaji mdogo wa kingamwili wakati wa jaribio, majaribio machache yalifanywa kwa kila mkusanyiko wa oligosaccharide. Ikumbukwe hapa kwamba baadhi ya kingamwili huitikia tofauti sana kwa oligosaccharide sawa na substrate, labda kwa sababu hufungamana na epitopu tofauti kidogo na zinaweza kuwa na miunganisho tofauti sana ya kufungamana. Mifumo na matokeo ya utambuzi sahihi wa epitopu yatakuwa magumu zaidi wakati mbinu mpya ya mAb itatumika kwa sampuli halisi.
Oligosaccharide mbili za kibiashara zilitumika kubaini kiwango cha kugundua cha mAbs mbalimbali zinazolenga glikani. Hapa, uhusiano wa mstari na mkusanyiko wa logi wa mkusanyiko wa oligosaccharide unaonyesha mifumo ya ufyonzaji wa Langmuir kwa (A) XHE na mAb na (B) A2XX na mAb. Epitopes zinazolingana zinaonyesha miundo ya oligosaccharide za kibiashara zinazotumika kama substrates katika jaribio.
Matumizi ya kingamwili za monokloni zinazolengwa na glycan (uchambuzi wa glycocomic au uchunguzi wa mAb unaotegemea ELISA) ni zana yenye nguvu ya uainishaji wa kina wa glycan nyingi kuu za ukuta wa seli zinazounda mimea. Hata hivyo, uchambuzi wa glycan wa kitamaduni huainisha glycan kubwa za ukuta wa seli pekee, kwani oligosaccharides nyingi haziwezi kuhamishwa kwa ufanisi kwenye sahani za ELISA. Katika utafiti huu, stover ya mahindi iliyotibiwa mapema ya AFEX ilihidrolisisi kwa kimeng'enya kwa kiwango cha juu cha vitu vikali. Uchambuzi wa sukari ulitumika kubaini muundo wa wanga wa ukuta wa seli unaokauka katika hidrolisisi. Hata hivyo, uchambuzi wa mAb wa oligosaccharides ndogo katika hidrolisisi haujakadiriwa, na zana za ziada zinahitajika ili kuzuia oligosaccharides kwa ufanisi kwenye sahani za ELISA.
Tunaripoti hapa mbinu mpya na bora ya kuzuia uhamaji wa oligosaccharide kwa ajili ya uchunguzi wa mAb kwa kuchanganya biotinylation ya oligosaccharide ikifuatiwa na uchunguzi wa ELISA kwenye sahani zilizofunikwa na NeutrAvidin™. Oligosaccharide zilizozimwa za biotinyle zilionyesha mshikamano wa kutosha kwa kingamwili ili kuwezesha ugunduzi wa haraka na ufanisi wa oligosaccharide zinazokauka. Uchambuzi wa muundo wa oligosaccharide hizi ngumu kulingana na spektrometri ya wingi ulithibitisha matokeo ya mbinu hii mpya ya uchunguzi wa kinga. Kwa hivyo, tafiti hizi zinaonyesha kwamba mchanganyiko wa biotinylation ya oligosaccharide na uchunguzi wa ELISA na kingamwili za monokloni zinazolengwa na glycan zinaweza kutumika kugundua viungo vya msalaba katika oligosaccharide na zinaweza kutumika sana katika tafiti zingine za kibiokemikali zinazoainisha muundo wa oligosaccharide.
Mbinu hii ya uainishaji wa glycan inayotegemea biotini ndiyo ripoti ya kwanza inayoweza kuchunguza vifungo vya wanga visivyo na kalsiamu vya oligosaccharide mumunyifu katika mimea ya mimea. Hii husaidia kuelewa ni kwa nini baadhi ya sehemu za mimea ya mimea ni ngumu sana linapokuja suala la uzalishaji wa nishati ya mimea. Njia hii inajaza pengo muhimu katika mbinu za uchambuzi wa glycome na kupanua matumizi yake kwa aina mbalimbali za substrates zaidi ya oligosaccharide za mimea. Katika siku zijazo, tunaweza kutumia roboti kwa biotinilasiyo na kutumia njia ambayo tumetengeneza kwa ajili ya uchambuzi wa kiwango cha juu cha sampuli kwa kutumia ELISA.
Majani ya mahindi (CS) yaliyopandwa kutoka kwa mbegu mseto za Pioneer 33A14 yalivunwa mwaka wa 2010 kutoka Kramer Farms huko Ray, Colorado. Kwa idhini ya mwenye shamba, majani haya yanaweza kutumika kwa utafiti. Sampuli zilihifadhiwa kavu chini ya unyevu wa 6% kwenye mifuko ya zipu kwenye joto la kawaida. Sampuli zilihifadhiwa kavu chini ya unyevu wa 6% kwenye mifuko ya zipu kwenye joto la kawaida. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Sampuli zilihifadhiwa kavu kwenye unyevu wa <6% kwenye mifuko yenye zipu kwenye joto la kawaida.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Sampuli huhifadhiwa kwenye mifuko ya zipu kwenye joto la kawaida lenye unyevunyevu chini ya 6%.Utafiti ulifuata miongozo ya ndani na ya kitaifa. Uchambuzi wa utungaji ulifanywa kwa kutumia itifaki ya NREL. Utungaji ulibainika kuwa na glukani 31.4%, xylani 18.7%, arabinan 3.3%, galactani 1.2%, asetili 2.2%, lignini 14.3%, protini 1.7% na majivu 13.4%.
Cellic® CTec2 (138 mg protini/ml, lot VCNI 0001) ni mchanganyiko changamano wa selulosi, β-glucosidase na Cellic® HTec2 (157 mg protini/ml, lot VHN00001) kutoka Novozymes (Franklinton, NC, Marekani)). Multifect Pectinase® (72 mg protini/mL), mchanganyiko changamano wa vimeng'enya vinavyoharibu pectini, ilitolewa na DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, Marekani). Viwango vya protini ya vimeng'enya viliamuliwa kwa kukadiria kiwango cha protini (na kutoa mchango wa nitrojeni isiyo ya protini) kwa kutumia uchambuzi wa nitrojeni wa Kjeldahl (njia ya AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, Marekani). Diatomaceous earth 545 ilinunuliwa kutoka EMD Millipore (Billerica, MA). Kaboni iliyoamilishwa (DARCO, chembe chembe 100 za matundu), Avicel (PH-101), beech xylan, na kemikali zingine zote zilinunuliwa kutoka Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Matibabu ya awali ya AFEX yalifanyika katika GLBRC (Maabara ya Utafiti wa Ubadilishaji wa Biomass, MSU, Lansing, MI, Marekani). Matibabu ya awali yalifanyika kwa nyuzi joto 140 kwa dakika 15. Muda wa kukaa kwa uwiano wa 1:1 wa amonia isiyo na maji na biomasi kwa upakiaji wa 60% (w/w) katika kinu cha chuma cha pua (Kampuni ya Parr Instruments). Ilichukua dakika 30. Kinu cha kiakili kilifikishwa hadi nyuzi joto 140 na amonia ilitolewa haraka, na kuruhusu biomasi kurudi haraka kwenye halijoto ya kawaida. Muundo wa kinu cha kiakili cha mahindi kilichotibiwa awali cha AFEX (ACS) ulikuwa sawa na ule wa kinu cha kiakili cha mahindi kisichotibiwa (UT-CS).
Viungo vyenye kiwango cha juu cha ACSH 25% (w/w) (takriban 8% ya dextran iliyojaa) ilitayarishwa kama nyenzo ya kuanzia kwa ajili ya uzalishaji mkubwa wa oligosaccharides. Hidrolisisi ya kimeng'enya ya ACS ilifanywa kwa kutumia mchanganyiko wa kimeng'enya cha kibiashara ikijumuisha Cellic® Ctec2 10 mg protini/g glucan (katika biomasi iliyotibiwa awali), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protini/g glucan, na Multifect Pectinase (Genencor Inc, Marekani). ). ), 5 mg protini/g dextran. Hidrolisisi ya kimeng'enya ilifanywa katika bioreactor ya lita 5 yenye ujazo wa kufanya kazi wa lita 3, pH 4.8, 50°C na 250 rpm. Baada ya hidrolisisi kwa saa 96, hidrolisisi ilikusanywa kwa kutumia centrifugation kwa 6000 rpm kwa dakika 30 na kisha kwa 14000 rpm kwa dakika 30 ili kuondoa viungo visivyo na hidrolisisi. Hidrolizati kisha ilichujwa kwa njia ya kopo la kichujio cha milimita 0.22. Hidrolizati iliyochujwa ilihifadhiwa kwenye chupa tasa kwa nyuzi joto 4 Selsiasi na kisha ikagawanywa kwenye kaboni.
Uchambuzi wa muundo wa sampuli za biomasi zinazotokana na dondoo kulingana na taratibu za uchambuzi wa maabara wa NREL: utayarishaji wa sampuli kwa ajili ya uchambuzi wa muundo (NREL/TP-510-42620) na uamuzi wa wanga wa kimuundo na lignini katika biomasi (NREL/TP-510 - 42618)47.
Uchambuzi wa oligosaccharide wa mkondo wa hidrolizati ulifanywa kwa kipimo cha mililita 2 kwa kutumia mbinu ya hidrolizati ya asidi inayotokana na autoclave. Changanya sampuli ya hidrolizati na 69.7 µl ya asidi ya sulfuriki 72% kwenye mrija wa kukuza kifuniko cha skrubu wa mililita 10 na uiangushe kwa saa 1 kwenye benchi kwenye 121 °C, ipoeze kwenye barafu na uchuje kwenye chupa ya kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu (HPLC). Mkusanyiko wa oligosaccharide ulibainishwa kwa kutoa mkusanyiko wa monosaccharide katika sampuli isiyo hidrolizati kutoka kwa jumla ya mkusanyiko wa sukari katika sampuli iliyo hidrolizati ya asidi.
Viwango vya glukosi, xylose, na arabinose katika biomasi iliyotiwa hidrolisisi ya asidi vilichambuliwa kwa kutumia mfumo wa Shimadzu HPLC ulio na kipima-sampler, hita ya safu, pampu ya isokratiki, na kigunduzi cha faharisi ya kuakisi kwenye safu wima ya Bio-Rad Aminex HPX-87H. Safu wima ilidumishwa kwa 50°C na kuepukwa kwa mtiririko wa maji wa 0.6 ml/min 5 mM H2SO4.
Sukari ya hidrolizati ilipunguzwa maji na kuchambuliwa kwa kiwango cha monoma na oligosaccharide. Sukari ya monomeric iliyopatikana baada ya hidroliza ya kimeng'enya ilichambuliwa na HPLC iliyo na safu wima ya Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P na safu wima ya ulinzi wa majivu. Joto la safu wima lilidumishwa kwa 80°C, maji yalitumika kama awamu ya kuhama yenye kiwango cha mtiririko wa 0.6 ml/dakika. Oligosaccharide ziliamuliwa kwa hidroliza katika asidi iliyopunguzwa kwa 121°C kulingana na mbinu zilizoelezwa katika marejeleo 41, 48, 49.
Uchambuzi wa Saccharide ulifanywa kwenye mabaki ya kibiolojia ghafi, yaliyotibiwa awali ya AFEX na yote yasiyo na hidrolisisi (ikiwa ni pamoja na uzalishaji wa dondoo za ukuta wa seli mfululizo na uchunguzi wao wa mAb) kwa kutumia taratibu zilizoelezwa hapo awali 27, 43, 50, 51. Kwa uchambuzi wa glikomi, mabaki yasiyoyeyuka ya nyenzo za ukuta wa seli za mimea huandaliwa kutoka kwa mabaki ya kibiolojia na huchimbwa mfululizo kwa kutumia vitendanishi vinavyozidi kuwa vikali kama vile oksalate ya amonia (50 mM), kaboneti ya sodiamu (50 mM na 0.5% w/v), CON. (1M na 4M, vyote vikiwa na 1% w/v sodiamu borohydride) na kloridi ya asidi kama ilivyoelezwa hapo awali52,53. Dondoo hizo kisha ziliwekwa kwenye ELISA dhidi ya paneli tata ya mAb50 zilizoelekezwa kwenye glikani ya ukuta wa seli, na athari za kufungamana kwa mAb ziliwasilishwa kama ramani ya joto. MAbs zinazolenga glikani ya ukuta wa seli za mimea zilinunuliwa kutoka kwa hisa za maabara (CCRC, JIM na mfululizo wa MAC).
Uundaji wa biotinili wa oligosakaridi kwa hatua moja. Uunganishaji wa wanga na biotin-LC-hydrazide ulifanywa kwa kutumia utaratibu ufuatao. Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) iliyeyushwa katika dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) kwa kukoroga kwa nguvu na kupasha joto kwa 65° C. kwa dakika 1. Asidi ya asetiki ya glacial (30 µl) iliongezwa na mchanganyiko huo ulimiminwa kwenye sodiamu cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) na kufutwa kabisa baada ya kupasha joto kwa 65° C. kwa takriban dakika 1. Kisha, kutoka 5 hadi 8 μl ya mchanganyiko wa mmenyuko ulioongezwa kwenye oligosakaridi iliyokaushwa (1-100 nmol) ili kupata ziada ya molari mara 10 au zaidi ya lebo juu ya ncha ya kupunguza. Mmenyuko huo ulifanywa kwa 65°C kwa saa 2, baada ya hapo sampuli zilisafishwa mara moja. Hakuna sodiamu ya sianoborohydride iliyotumika katika majaribio ya uwekaji lebo bila kupunguza, na sampuli zilifanyiwa kazi kwa nyuzi joto 65 kwa saa 2.5.
Mipako ya ELISA na kuosha sampuli za oligosaccharides zenye biotinili. 25 μl ya sampuli zenye biotinili (100 μl ya kila sampuli iliyokolea iliyochanganywa katika 5 ml ya 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) iliongezwa kwenye kila kisima cha bamba lililofunikwa na avidin. Visima vya kudhibiti vilifunikwa na 50 μl ya biotini kwa mkusanyiko wa 10 μg/ml katika 0.1 M TBS. Maji yaliyosafishwa yalitumika kama mipako kwa vipimo tupu. Tembe iliwekwa kwenye incubator kwa saa 2 kwenye joto la kawaida gizani. Osha bamba mara 3 kwa maziwa yaliyopunguzwa mafuta ya 0.1% katika 0.1 M TBS kwa kutumia programu nambari 11 kwa Grenier flat 3A.
Kuongeza na kuosha kingamwili za msingi. Ongeza µl 40 za kingamwili za msingi kwenye kila kisima. Weka kwenye kibao kidogo kwa saa 1 kwenye joto la kawaida gizani. Kisha sahani hizo zilioshwa mara 3 kwa maziwa ya 0.1% katika TBS ya 0.1M kwa kutumia programu ya kuosha #11 kwa Grenier Flat 3A.
Ongeza kingamwili ya pili na osha. Ongeza µl 50 za kingamwili ya pili ya panya/panya (iliyopunguzwa 1:5000 katika maziwa ya 0.1% katika TBS ya 0.1 M) kwenye kila kisima. Weka kibao kidogo kwa saa 1 kwenye joto la kawaida gizani. Kisha kibao kidogo kilioshwa mara 5 na maziwa ya 0.1% katika TBS ya 0.1 M kwa kutumia mpango wa kuosha sahani wa Grenier Flat 5A #12.
Kuongeza substrate. Ongeza 50 µl ya 3,3′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) kwenye substrate ya msingi (kwa kuongeza matone 2 ya buffer, matone 3 ya TMB, matone 2 ya peroksidi ya hidrojeni kwenye mililita 15 za maji yaliyosafishwa). Tayarisha substrate ya TMB. na vortex kabla ya matumizi). Weka microplate kwenye joto la kawaida kwa dakika 30. Katika giza.
Kamilisha hatua na usome kibao. Ongeza µl 50 za asidi sulfuriki 1 N kwenye kila kisima na urekodi unyonyaji kutoka 450 hadi 655 nm kwa kutumia kisomaji cha ELISA.
Andaa myeyusho 1 mg/ml ya vichambuzi hivi katika maji yaliyoondolewa ioni: arabinose, rhamnose, fukose, xylose, asidi ya galacturonic (GalA), asidi ya glucuronic (GlcA), mannose, glukosi, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine. (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (kiwango cha ndani). Viwango viwili vilitayarishwa kwa kuongeza myeyusho 1 mg/mL ya sukari iliyoonyeshwa kwenye Jedwali 1. Sampuli hugandishwa na kugandishwa kwa -80° C. hadi maji yote yatakapoondolewa (kawaida yapata saa 12-18).
Ongeza µg 100–500 za sampuli kwenye mirija ya kifuniko kwa usawa wa uchambuzi. Andika kiasi kilichoongezwa. Ni bora kuyeyusha sampuli katika mkusanyiko maalum wa kiyeyusho na kuiongeza kwenye mirija kama aliquot ya kioevu. Tumia µl 20 za inositol 1 mg/ml kama kiwango cha ndani kwa kila mirija ya sampuli. Kiasi cha kiwango cha ndani kilichoongezwa kwenye sampuli lazima kiwe sawa na kiasi cha kiwango cha ndani kilichoongezwa kwenye mirija ya kawaida.
Ongeza mililita 8 za methanoli isiyo na maji kwenye chupa ya kifuniko cha skrubu. Kisha mililita 4 za myeyusho wa HCl 3 wa N. methanoli, ufunikwe na kutikiswa. Mchakato huu hautumii maji.
Ongeza µl 500 za myeyusho wa methanoli wa 1 M HCl kwenye sampuli za oligosaccharide na mirija ya kawaida ya TMS. Sampuli ziliwekwa kwenye incubation usiku kucha (saa 168) kwa 80°C. kwenye kizuizi cha joto. Kausha bidhaa ya methanolisi kwenye joto la kawaida kwa kutumia kifaa cha kukausha. Ongeza µl 200 MeOH na kausha tena. Mchakato huu unarudiwa mara mbili. Ongeza µl 200 za methanoli, µl 100 za pyridine na µl 100 za anhidridi asetiki kwenye sampuli na uchanganye vizuri. Sampuli ziliwekwa kwenye incubation kwenye joto la kawaida kwa dakika 30. na zikaushwa. Ongeza µl 200 za methanoli na zikauke tena.
Ongeza 200 µl ya Tri-Sil na pasha moto bomba lililofunikwa kwa dakika 20. 80°C, kisha upoe hadi joto la kawaida. Tumia kifaa cha kukaushia ili kukausha zaidi sampuli hadi ujazo wa takriban 50 µl. Ni muhimu kutambua kwamba hatukuruhusu sampuli kukauka kabisa.
Ongeza mililita 2 za heksani na uchanganye vizuri kwa kutumia mvuke. Jaza ncha za pipettes za Pasteur (milimita 5-8) na kipande cha pamba ya kioo kwa kuingiza pamba ya kioo juu ya pipettes yenye kipenyo cha inchi 5-3/4. Sampuli ziliwekwa kwenye sentrifuge kwa gramu 3000 kwa dakika 2. Mabaki yoyote yasiyoyeyuka huwekwa kwenye sentrifuge. Kausha sampuli hadi µl 100-150. Kiasi cha takriban mililita 1 kiliingizwa kwenye GC-MS kwa joto la awali la nyuzi joto 80 na muda wa awali wa dakika 2.0 (Jedwali 2).