Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutatoa tovuti bila mitindo na JavaScript.
Mbinu mpya za kinga ya mwili na spectrometriki kwa wingi kwa uchanganuzi changamano wa oligosakaridi sugu kwenye jiko la mahindi lililowekwa tayari kwa AFEX.Lignocellulosic biomass ni mbadala endelevu kwa nishati ya kisukuku na hutumika sana kutengeneza teknolojia ya kibayolojia kwa ajili ya uzalishaji wa bidhaa kama vile chakula, malisho, nishati na kemikali.Ufunguo wa teknolojia hizi ni ukuzaji wa michakato ya gharama ya kubadilisha wanga changamano iliyopo kwenye kuta za seli za mimea kuwa sukari rahisi kama vile glukosi, xylose na arabinose.Kwa sababu biomasi ya lignocellulosic ni mkaidi sana, lazima ifanyiwe matibabu ya thermochemical (kwa mfano, uondoaji wa nyuzi za amonia (AFEX), asidi ya dilute (DA), maji ya ionic (IL)) na matibabu ya kibayolojia (kwa mfano, hidrolisisi ya enzymatic na fermentation ya microbial) pamoja ili kupata bidhaa inayotakiwa..Hata hivyo, wakati enzymes za kuvu za kibiashara zinatumiwa katika mchakato wa hidrolisisi, 75-85% tu ya sukari mumunyifu hutengenezwa ni monosaccharides, na 15-25% iliyobaki ni mumunyifu, oligosaccharides isiyoweza kuambukizwa, ambayo haipatikani kila mara kwa microorganisms.Hapo awali, tumefaulu kutenga na kusafisha oligosakaridi zilizo na ukaidi zinazoyeyuka kwa kutumia mchanganyiko wa kaboni na utengano wa dunia wa diatomia na kromatografia ya kutojumuisha ukubwa, na pia kuchunguza sifa zao za kuzuia kimeng'enya.Tumegundua kuwa oligosaccharides zenye kiwango cha juu cha upolimishaji (DP) mbadala wa asidi ya uroniki ya methylated ni vigumu zaidi kuchakata na michanganyiko ya vimeng'enya vya kibiashara kuliko DP ya chini na oligosaccharides zisizo na upande.Hapa tunaripoti matumizi ya mbinu kadhaa za ziada, ikiwa ni pamoja na maelezo ya glycan kwa kutumia kingamwili za monoclonal (mAbs) maalum kwa kupanda glycans ya majani ili kubainisha vifungo vya glycan katika kuta za seli za mimea na hidrolisaiti za enzymatic, ioni ya laser desorption inayosaidiwa na matrix, spectrometry ya wakati wa kukimbia..MALDI-TOF-MS) hutumia vilele vya uchunguzi wa muundo-taarifa vilivyopatikana kwa uchunguzi baada ya uozo wa pili wa ioni hasi, kromatografia ya gesi na spectrometry ya molekuli (GC-MS) ili kubainisha vifungo vya oligosakaridi na bila utokaji.Kutokana na ukubwa mdogo wa oligosaccharides (DP 4–20), molekuli hizi ni vigumu kutumia kwa kuunganisha na kubainisha mAb.Ili kuondokana na tatizo hili, tulitumia mbinu mpya ya uunganishaji-msingi ya oligosaccharide ya biotini ambayo ilifaulu kuweka lebo ya oligosaccharides nyingi za chini za DP kwenye uso wa microplate, ambayo ilitumiwa katika mfumo wa juu wa mAb kwa uchanganuzi maalum wa kuunganisha.Njia hii mpya itawezesha ukuzaji wa majaribio ya hali ya juu zaidi ya glycome katika siku zijazo ambayo yanaweza kutumika kutenganisha na kutofautisha oligosaccharides zilizopo kwenye alama za kibayolojia kwa madhumuni ya utambuzi.
Lignocellulosic biomass, inayoundwa na kilimo, misitu, nyasi na mbao, ni malisho inayoweza kutumika kwa ajili ya uzalishaji wa bidhaa za kibayolojia, ikiwa ni pamoja na chakula, malisho, mafuta na vitangulizi vya kemikali ili kuzalisha bidhaa zenye thamani ya juu1.Kabohaidreti (kama vile selulosi na hemicellulose) zilizopo kwenye kuta za seli za mmea hutolewa upolimishaji kuwa monosakaridi kwa usindikaji wa kemikali na ubadilishanaji wa kibaolojia (kama vile hidrolisisi ya enzymatic na uchachushaji wa vijiumbe).Matibabu ya awali ya kawaida ni pamoja na upanuzi wa nyuzi za amonia (AFEX), asidi ya dilute (DA), kioevu ionic (IL), na mlipuko wa mvuke (SE), ambayo hutumia mchanganyiko wa kemikali na joto ili kupunguza uzalishaji wa lignocellulose kwa kufungua kuta za seli za mimea3,4.ukaidi wa jambo, 5. Hidrolisisi ya enzymatic hufanyika kwa mzigo wa juu ya yabisi kwa kutumia vimeng'enya vilivyo na kabohaidreti (CAZymes) na uchachushaji wa vijiumbe kwa kutumia chachu zisizobadilika au bakteria kutoa mafuta na kemikali za bio-msingi 6 .
CAZymes katika vimeng'enya vya kibiashara huundwa na mchanganyiko changamano wa vimeng'enya ambavyo hupasua kwa pamoja vifungo changamano vya kabohaidreti-sukari ili kuunda monosakharidi2,7.Kama tulivyoripoti hapo awali, mtandao mgumu wa polima zenye kunukia za lignin na wanga huwafanya kuwa ngumu sana, ambayo husababisha ubadilishaji usio kamili wa sukari, kukusanya 15-25% ya oligosaccharides ya ngono ambayo haitolewi wakati wa hidrolisisi ya enzymatic ya biomass iliyosafishwa.Hili ni tatizo la kawaida kwa mbinu mbalimbali za matibabu ya majani.Baadhi ya sababu za tatizo hili ni pamoja na kizuizi cha kimeng'enya wakati wa hidrolisisi, au kutokuwepo au viwango vya chini vya vimeng'enya muhimu vinavyohitajika kuvunja vifungo vya sukari kwenye majani ya mimea.Kuelewa muundo na sifa za muundo wa sukari, kama vile vifungo vya sukari katika oligosakaridi, kutatusaidia kuboresha ubadilishaji wa sukari wakati wa hidrolisisi, na kufanya michakato ya kibayoteknolojia kuwa na gharama ya kushindana na bidhaa zinazotokana na petroli.
Kuamua muundo wa kabohaidreti ni changamoto na kunahitaji mchanganyiko wa mbinu kama vile kromatografia ya kioevu (LC)11,12, spectroscopy ya sumaku ya nyuklia (NMR)13, electrophoresis ya kapilari (CE)14,15,16 na spectrometry ya molekuli (MS)17.,kumi na nane.Mbinu za MS kama vile spectrometry ya wingi wa wakati wa safari ya ndege yenye desorption ya leza na uionishaji kwa kutumia matrix (MALDI-TOF-MS) ni mbinu nyingi za kutambua miundo ya kabohaidreti.Hivi majuzi, Utengano Unaosababishwa na Mgongano (CID) sanjari na MS wa viambatanisho vya ioni ya sodiamu umetumiwa sana kutambua alama za vidole zinazolingana na nafasi za viambatisho vya oligosaccharide, usanidi usio na kipimo, mfuatano na nafasi za matawi 20, 21 .
Uchambuzi wa Glycan ni zana bora ya utambuzi wa kina wa vifungo vya wanga22.Mbinu hii hutumia kingamwili za monokloni (mAbs) zinazoelekezwa kupanda glycan ya ukuta wa seli kama uchunguzi wa kuelewa uhusiano changamano wa kabohaidreti.Zaidi ya 250 mAbs zinapatikana duniani kote, iliyoundwa dhidi ya oligosaccharides mbalimbali za mstari na matawi kwa kutumia saccharides mbalimbali24.MAb kadhaa zimetumika sana kubainisha muundo, muundo, na marekebisho ya ukuta wa seli ya mmea, kwani kuna tofauti kubwa kulingana na aina ya seli ya mmea, chombo, umri, hatua ya ukuaji, na mazingira ya ukuaji25,26.Hivi majuzi, njia hii imetumiwa kuelewa idadi ya vijidudu katika mifumo ya mimea na wanyama na majukumu yao husika katika usafirishaji wa glycan kama inavyobainishwa na viashirio vya seli ndogo, hatua za ukuaji, au vichocheo vya mazingira, na kuamua shughuli za enzymatic.Baadhi ya miundo tofauti ya glycans na xylans ambayo imetambuliwa ni pamoja na pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glucans za dhamana zilizochanganywa (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG) , glucuronic acid-arabinoxy-XbGlan (2) Arbinoxylan (2) na arabinoxylan (2000).
Hata hivyo, licha ya jitihada hizi zote za utafiti, ni tafiti chache tu ambazo zimezingatia asili ya mkusanyiko wa oligosaccharide wakati wa hidrolisisi ya juu ya yabisi (HSL), ikiwa ni pamoja na kutolewa kwa oligosaccharide, mabadiliko ya urefu wa oligomeric wakati wa hidrolisisi, polima mbalimbali za chini za DP, na curves zao.mgawanyo 30,31,32.Wakati huo huo, ingawa uchanganuzi wa glycan umethibitisha kuwa chombo muhimu kwa uchambuzi wa kina wa muundo wa glycan, ni vigumu kutathmini oligosaccharides ya DP ya chini mumunyifu kwa kutumia mbinu za kingamwili.Oligosaccharides ndogo za DP zenye uzito wa Masi chini ya 5-10 kDa hazifungamani na sahani za ELISA 33, 34 na huoshwa kabla ya kuongezwa kwa antibody.
Hapa, kwa mara ya kwanza, tunaonyesha uchunguzi wa ELISA kwenye sahani zilizofunikwa na avidin kwa kutumia kingamwili za monoclonal, kuchanganya utaratibu wa hatua moja wa biotinilation kwa oligosaccharides ya refractory mumunyifu na uchambuzi wa glycome.Mbinu yetu ya uchanganuzi wa glycome ilithibitishwa na uchanganuzi wa MALDI-TOF-MS na GC-MS wa miunganisho ya ziada ya oligosaccharide kwa kutumia trimethylsilyl (TMS) ya uundaji wa viunzi vya sukari hidrolisisi.Mbinu hii bunifu inaweza kuendelezwa kama mbinu ya matokeo ya juu katika siku zijazo na kupata matumizi mapana zaidi katika utafiti wa matibabu35.
Marekebisho ya baada ya kutafsiri ya vimeng'enya na kingamwili, kama vile glycosylation,36 huathiri shughuli zao za kibiolojia.Kwa mfano, mabadiliko katika glycosylation ya protini za seramu huwa na jukumu muhimu katika ugonjwa wa arthritis, na mabadiliko katika glycosylation hutumiwa kama alama za uchunguzi37.Glycans mbalimbali zimeripotiwa katika maandiko kuonekana kwa urahisi katika magonjwa mbalimbali, ikiwa ni pamoja na magonjwa ya uchochezi ya muda mrefu ya njia ya utumbo na ini, maambukizi ya virusi, ovari, matiti, na saratani ya kibofu38,39,40.Kuelewa muundo wa glycans kwa kutumia mbinu za glycan ELISA za antibody zitatoa ujasiri wa ziada katika uchunguzi wa ugonjwa bila kutumia mbinu za MS ngumu.
Utafiti wetu wa awali ulionyesha kuwa oligosaccharides ya mkaidi ilibakia bila hidrolisisi baada ya matibabu na hidrolisisi ya enzymatic (Mchoro 1).Katika kazi yetu iliyochapishwa hapo awali, tulitengeneza mbinu iliyoamilishwa ya uchimbaji wa awamu ya mkaa ili kutenga oligosaccharides kutoka kwa AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8.Baada ya uchimbaji wa awali na kutenganishwa, oligosaccharides ziligawanywa zaidi na kromatografia ya kutengwa (SEC) na kukusanywa kwa mpangilio wa uzito wa Masi.Monomeri za sukari na oligomeri zilizotolewa kutoka kwa matibabu anuwai zilichambuliwa na uchambuzi wa muundo wa sukari.Wakati wa kulinganisha maudhui ya oligomers ya sukari yaliyopatikana kwa njia mbalimbali za utayarishaji, uwepo wa oligosaccharides mkaidi ni tatizo la kawaida katika ubadilishaji wa biomass kwa monosaccharides na inaweza kusababisha kupunguzwa kwa mavuno ya sukari ya angalau 10-15% na hata hadi 18%.Marekani.Njia hii hutumiwa kwa uzalishaji zaidi wa kiasi kikubwa cha sehemu za oligosaccharide.Matokeo ya ACH na sehemu zake zilizofuata zenye uzani tofauti wa molekuli zilitumika kama nyenzo za majaribio kwa ajili ya kubainisha oligosaccharides katika kazi hii.
Baada ya matibabu ya awali na hidrolisisi ya enzymatic, oligosaccharides inayoendelea ilibaki bila hidrolisisi.Hapa (A) ni njia ya kutenganisha oligosaccharide ambayo oligosaccharides hutengwa na AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) kwa kutumia kitanda kilichojaa cha kaboni iliyoamilishwa na ardhi ya diatomaceous;(B) Njia ya kujitenga kwa oligosaccharides.Oligosaccharides zilitenganishwa zaidi na kromatografia ya kutengwa kwa ukubwa (SEC);(C) Sakharidi monoma na oligomers iliyotolewa kutoka pretreatments mbalimbali (diluted asidi: DA, ionic kioevu: IL na AFEX).Hali ya hidrolisisi ya enzymatic: upakiaji wa vitu vikali vya juu vya 25% (w/w) (takriban 8% ya upakiaji wa glucan), hidrolisisi ya saa 96, upakiaji wa kimeng'enya cha kibiashara cha 20 mg/g (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 uwiano) na (D) Monoma za sukari na oligoma za glukosi, xyradidi ya mahindi ya EXA iliyotolewa na xyrafuCSACSA iliyotolewa na xyranose ya mahindi).
Uchanganuzi wa Glycan umethibitishwa kuwa zana muhimu kwa uchanganuzi wa kina wa muundo wa glycans katika dondoo zilizotengwa na mabaki ya biomasi thabiti.Hata hivyo, sakcharidi zenye mumunyifu katika maji haziwakilishwi kwa kutumia mbinu hii ya kitamaduni41 kwa sababu oligosaccharides yenye uzito wa chini wa molekuli ni vigumu kuziba kwenye sahani za ELISA na huoshwa kabla ya kuongezwa kwa kingamwili.Kwa hiyo, kwa ajili ya kufunga antibody na sifa, mbinu ya hatua moja ya biotini ilitumiwa kupaka oligosaccharides mumunyifu, zisizofuata kwenye sahani za ELISA zilizofunikwa na avidin.Njia hii ilijaribiwa kwa kutumia ACSH yetu iliyotengenezwa hapo awali na sehemu kulingana na uzito wake wa Masi (au kiwango cha upolimishaji, DP).Biotinylation ya hatua moja ilitumika kuongeza mshikamano wa kisheria wa oligosaccharide kwa kuongeza biotin-LC-hydrazide hadi mwisho wa kupunguza wa kabohaidreti (Mchoro 2).Katika suluhisho, kikundi cha hemiacetal kwenye mwisho wa kupunguza humenyuka pamoja na kikundi cha hidrazidi cha biotin-LC-hydrazide ili kuunda dhamana ya hydrazone.Mbele ya wakala wa kupunguza NaCNBH3, dhamana ya hydrazone imepunguzwa hadi bidhaa ya mwisho ya biotini iliyoimarishwa.Kwa marekebisho ya mwisho wa kupunguza sukari, kuunganisha kwa oligosaccharides ya chini ya DP kwa sahani za ELISA kuliwezekana, na katika utafiti wetu hii ilifanyika kwenye sahani za avidin-coated kwa kutumia mAbs zilizolengwa na glycan.
Uchunguzi wa antibodies ya monoclonal kulingana na ELISA kwa oligosaccharides ya biotinylated.Hapa (A) biotinylation ya oligosaccharides na uchunguzi uliofuata wa ELISA na mAbs inayolengwa na glycan kwenye sahani zilizopakwa za NeutrAvidin na (B) inaonyesha utaratibu wa hatua moja wa biotinylation ya bidhaa za athari.
Sahani zilizofunikwa na Avidin zilizo na antibodies zilizounganishwa na oligosaccharide ziliongezwa kwa kingamwili za msingi na za sekondari na kuosha kwa njia ya mwanga na ya muda.Baada ya kukamilisha kufunga kingamwili, ongeza sehemu ndogo ya TMB ili kuangulia sahani.Mwitikio huo hatimaye ulisimamishwa na asidi ya sulfuriki.Sahani zilizoamilishwa zilichanganuliwa kwa kutumia kisomaji cha ELISA ili kubaini nguvu ya kufunga ya kila kingamwili ili kugundua uunganishaji mtambuka wa kingamwili mahususi.Kwa maelezo na vigezo vya jaribio, angalia sehemu inayolingana ya "Nyenzo na Mbinu".
Tunaonyesha manufaa ya mbinu hii mpya iliyobuniwa kwa matumizi mahususi kwa kubainisha oligosaccharides mumunyifu zilizopo katika ACSH na pia katika sehemu ghafi na zilizosafishwa za oligosaccharide zilizotengwa na hidrolisisi ya lignocellulosic.Kama inavyoonyeshwa katika Mchoro wa 3, xylani zinazotumika badala ya epitopu zinazotambuliwa katika ACSH kwa kutumia mbinu za kupima glycome kwa kawaida ni uronic (U) au methyluronic (MeU) na pectic arabinogalactani.Wengi wao pia walipatikana katika utafiti wetu uliopita juu ya uchanganuzi wa glycans ya yabisi isiyo na hidrolisisi (UHS)43.
Ugunduzi wa epitopes za oligosaccharide za recalcitrant kwa kutumia kingamwili moja inayoelekezwa kwenye glycan ya ukuta wa seli.Sehemu "isiyo na upande" ni sehemu ya ACN na sehemu ya "tindikali" ni sehemu ya FA.Nyekundu zinazong'aa zaidi kwenye ramani ya joto huonyesha maudhui ya juu zaidi, na samawati angavu zaidi huonyesha mandharinyuma tupu.Thamani za rangi kwenye mizani zinatokana na thamani mbichi za OD za uundaji N=2.Epitopes kuu zinazotambuliwa na antibodies zinaonyeshwa upande wa kulia.
Miundo hii isiyo ya selulosi haikuweza kung'olewa na selulasi na hemiseli za kawaida katika mchanganyiko wa kimeng'enya wa kibiashara uliojaribiwa, unaojumuisha vimeng'enya vinavyotumika sana kibiashara.Kwa hiyo, enzymes mpya za msaidizi zinahitajika kwa hidrolisisi yao.Bila vimeng'enya vya nyongeza visivyo vya selulosi, vifungo hivi visivyo vya selulosi huzuia ubadilishaji kamili hadi monosakaridi, hata kama polima zao kuu za sukari hutolewa kwa kiasi kikubwa hidrolisisi katika vipande vifupi na kufutwa kwa kutumia mchanganyiko wa vimeng'enya vya kibiashara.
Utafiti zaidi wa usambazaji wa ishara na nguvu zake za kumfunga ulionyesha kuwa epitopes za kumfunga zilikuwa chini katika sehemu za juu za sukari za DP (A, B, C, DP hadi 20 +) kuliko katika sehemu za chini za DP (D, E, F, DP) katika dimers) (Mchoro 1).Vipande vya asidi ni kawaida zaidi katika epitopes zisizo za selulosi kuliko vipande vya neutral.Matukio haya yanawiana na muundo uliozingatiwa katika utafiti wetu uliopita, ambapo DP ya juu na sehemu za asidi zilikuwa sugu kwa hidrolisisi ya enzymatic.Kwa hiyo, uwepo wa epitopes za glycan zisizo za selulosi na mbadala za U na MeU zinaweza kuchangia sana utulivu wa oligosaccharides.Ikumbukwe kwamba ufanisi wa kuunganisha na kugundua unaweza kuwa tatizo kwa oligosaccharides ya chini ya DP, hasa ikiwa epitope ni oligosaccharide ya dimeric au trimeric.Hii inaweza kujaribiwa kwa kutumia oligosakaridi za kibiashara za urefu tofauti, kila moja ikiwa na epitopu moja tu inayofungamana na mAb mahususi.
Kwa hivyo, matumizi ya antibodies maalum ya muundo yalifunua aina fulani za vifungo vya recalcitrant.Kulingana na aina ya kingamwili inayotumiwa, muundo unaofaa wa kuunganisha, na nguvu ya ishara inayozalisha (zaidi na ndogo zaidi), vimeng'enya vipya vinaweza kutambuliwa na kuongezwa nusu-kiasi kwenye mchanganyiko wa kimeng'enya kwa ubadilishaji kamili zaidi wa glyco.Kwa kuchukua uchanganuzi wa oligosaccharides za ACSH kama mfano, tunaweza kuunda hifadhidata ya vifungo vya glycan kwa kila nyenzo ya majani.Ikumbukwe hapa kwamba mshikamano tofauti wa antibodies unapaswa kuzingatiwa, na ikiwa ushirika wao haujulikani, hii itaunda matatizo fulani wakati wa kulinganisha ishara za antibodies tofauti.Kwa kuongeza, ulinganisho wa vifungo vya glycan unaweza kufanya kazi vyema kati ya sampuli za kingamwili sawa.Vifungo hivi vya ukaidi vinaweza kisha kuunganishwa na hifadhidata ya CAZyme, ambapo tunaweza kutambua vimeng'enya, kuchagua vimeng'enya teuliwa na kupima vimeng'enya vinavyovunja dhamana, au kuunda mifumo ya vijidudu ili kueleza vimeng'enya hivi kwa matumizi katika biorefineries44.
Ili kutathmini jinsi mbinu za kinga za mwili zinavyosaidia mbinu mbadala za kubainisha oligosaccharides yenye uzito wa chini wa Masi iliyopo katika hidrolisisi ya lignocellulosic, tulifanya MALDI (Mchoro 4, S1-S8) na uchanganuzi wa sakharidi zinazotokana na TMS kulingana na GC-MS kwenye paneli sawa (Mchoro 5) sehemu ya oligosaccharide.MALDI hutumiwa kulinganisha ikiwa usambazaji mkubwa wa molekuli za oligosaccharide unalingana na muundo uliokusudiwa.Kwenye mtini.4 inaonyesha MC ya vipengele vya upande wowote ACN-A na ACN-B.Uchambuzi wa ACN-A ulithibitisha aina mbalimbali za sukari za pentose kuanzia DP 4-8 (Mchoro 4) hadi DP 22 (Mchoro S1), ambao uzani wake unalingana na oligosaccharides ya MeU-xylan.Uchambuzi wa ACN-B ulithibitisha mfululizo wa pentose na glucoxylan na DP 8-15.Katika nyenzo za ziada kama vile Kielelezo S3, ramani za usambazaji wa kiasi cha asidi ya FA-C zinaonyesha aina mbalimbali za sukari ya pentose (Me)U iliyobadilishwa na DP ya 8-15 ambayo inalingana na sailani zilizobadilishwa zinazopatikana katika uchunguzi wa mAb unaotegemea ELISA.Epitopes ni thabiti.
MALDI-MS wigo wa oligosaccharides mumunyifu isiyotii ambayo iko katika ACS.Hapa, (A) ACN-A visehemu vya uzani wa chini vilivyo na asidi ya uroni ya methylated (DP 4-8) ilibadilisha oligosaccharides ya glucuroxylan na (B) ACN-B xylan na oligosaccharides ya asidi ya uroniki iliyo na methylated na kubadilishwa na glucuroxylan (DP 8-15).
Uchambuzi wa muundo wa mabaki ya glycan ya oligosaccharides ya kinzani.Hapa (A) Muundo wa sakharidi ya TMS ya sehemu mbalimbali za oligosakaridi zilizopatikana kwa kutumia uchanganuzi wa GC-MS.(B) Miundo ya sukari mbalimbali inayotokana na TMS iliyopo katika oligosaccharides.ACN - sehemu ya asetonitrili iliyo na oligosaccharides ya neutral na FA - sehemu ya asidi ferulic yenye oligosaccharides ya asidi.
Hitimisho lingine la kuvutia lilitolewa kutoka kwa uchambuzi wa LC-MS wa sehemu ya oligosaccharide, kama inavyoonyeshwa kwenye Kielelezo S9 (mbinu zinaweza kuonekana katika nyenzo za ziada za elektroniki).Vipande vya vikundi vya hexose na -OAc vilizingatiwa mara kwa mara wakati wa kuunganisha sehemu ya ACN-B.Ugunduzi huu sio tu unathibitisha mgawanyiko unaozingatiwa katika uchanganuzi wa glikomu na MALDI-TOF, lakini pia hutoa habari mpya kuhusu uwezekano wa derivatives za kabohaidreti katika biomasi ya lignocellulosic iliyotangulia.
Pia tulichambua muundo wa sukari wa sehemu ya oligosaccharide kwa kutumia derivatization ya sukari ya TMS.Kwa kutumia GC-MS, tuliamua muundo wa neural (isiyo ya derivative) na sukari tindikali (GluA na GalA) katika sehemu ya oligosaccharide (Mchoro 5).Asidi ya Glucuronic hupatikana katika vipengele vya asidi C na D, wakati asidi ya galacturonic hupatikana katika vipengele vya asidi A na B, vyote viwili ni vipengele vya juu vya DP vya sukari ya asidi.Matokeo haya sio tu kuthibitisha data yetu ya ELISA na MALDI, lakini pia ni sawa na masomo yetu ya awali ya mkusanyiko wa oligosaccharide.Kwa hiyo, tunaamini kwamba mbinu za kisasa za kinga kwa kutumia biotinylation ya oligosaccharides na uchunguzi wa ELISA unaofuata zinatosha kugundua oligosaccharides recalcitrant mumunyifu katika sampuli mbalimbali za kibiolojia.
Kwa kuwa mbinu za uchunguzi wa mAb kulingana na ELISA zimeidhinishwa na mbinu kadhaa tofauti, tulitaka kuchunguza zaidi uwezo wa mbinu hii mpya ya upimaji.Oligosaccharides mbili za kibiashara, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) na 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), zilinunuliwa na kujaribiwa kwa kutumia mbinu mpya ya mAb inayolenga glycan ya ukuta wa seli.Mchoro wa 6 unaonyesha uwiano wa mstari kati ya mawimbi ya kuunganisha ya biotini na mkusanyiko wa logi wa mkusanyiko wa oligosaccharide, ikipendekeza mfano unaowezekana wa utangazaji wa Langmuir.Miongoni mwa mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, na CCRC-M151 inayohusiana na XHE, na CCRC-M108, CCRC-M109, na LM11 inayohusiana na A2XX kwa masafa ya 100 nmno.Kwa sababu ya upatikanaji mdogo wa kingamwili wakati wa jaribio, majaribio machache yalifanywa kwa kila mkusanyiko wa oligosaccharide.Ikumbukwe hapa kwamba baadhi ya kingamwili huguswa kwa njia tofauti sana kwa oligosaccharide sawa na substrate, labda kwa sababu hufunga kwa epitopu tofauti kidogo na zinaweza kuwa na uhusiano tofauti sana.Mbinu na athari za utambuzi sahihi wa epitopu zitakuwa ngumu zaidi wakati mbinu mpya ya mAb itatumika kwa sampuli halisi.
Oligosakaridi mbili za kibiashara zilitumiwa kubaini aina mbalimbali za mAbs zinazolenga glycan.Hapa, miunganisho ya mstari na mkusanyiko wa logi ya mkusanyiko wa oligosaccharide huonyesha ruwaza za utangazaji za Langmuir za (A) XHE na mAb na (B) A2XX na mAb.Epitopes sambamba zinaonyesha miundo ya oligosaccharides ya kibiashara kutumika kama substrates katika assay.
Matumizi ya kingamwili za monokloni zinazolengwa na glycan (uchambuzi wa glycocomic au uchunguzi wa mAb unaotegemea ELISA) ni zana madhubuti ya kubainisha sifa za kina za glycans nyingi za ukuta wa seli zinazounda biomasi ya mimea.Hata hivyo, uchanganuzi wa glycan wa kitamaduni huonyesha tu glycans kubwa za ukuta wa seli, kwani oligosaccharides nyingi hazijasongwa vizuri kwenye bamba za ELISA.Katika utafiti huu, jiko la mahindi la AFEX-pretreated liliwekwa haidrolisisi kwa kimelea katika maudhui ya juu ya yabisi.Uchambuzi wa sukari ulitumiwa kuamua muundo wa wanga wa ukuta wa seli ya recalcitrant katika hidrolizati.Hata hivyo, uchambuzi wa mAb wa oligosaccharides ndogo katika hydrolysates haujakadiriwa, na zana za ziada zinahitajika ili kuimarisha oligosaccharides kwa ufanisi kwenye sahani za ELISA.
Tunaripoti hapa mbinu mpya na bora ya uzuiaji wa oligosaccharide kwa uchunguzi wa mAb kwa kuchanganya oligosaccharide biotinylation ikifuatiwa na uchunguzi wa ELISA kwenye sahani zilizopakwa za NeutrAvidin™.Oligosaccharides za biotini zisizohamishika zilionyesha mshikamano wa kutosha kwa antibody ili kuwezesha ugunduzi wa haraka na wa ufanisi wa oligosaccharides ya recalcitrant.Uchambuzi wa muundo wa oligosaccharides hizi za mkaidi kulingana na spectrometry ya molekuli ulithibitisha matokeo ya mbinu hii mpya ya kinga ya kinga.Kwa hivyo, tafiti hizi zinaonyesha kwamba mchanganyiko wa biotinylation ya oligosaccharide na uchunguzi wa ELISA na antibodies ya monoclonal inayolengwa ya glycan inaweza kutumika kuchunguza viungo vya msalaba katika oligosaccharides na inaweza kutumika sana katika tafiti nyingine za biochemical zinazoonyesha muundo wa oligosaccharides.
Mbinu hii ya kuorodhesha ya glycan inayotokana na biotini ni ripoti ya kwanza inayoweza kuchunguza vifungo vya kabohaidreti vikali vya oligosaccharides mumunyifu katika majani ya mimea.Hii inasaidia kuelewa ni kwa nini baadhi ya sehemu za majani ni mkaidi sana linapokuja suala la uzalishaji wa nishati ya mimea.Njia hii inajaza pengo muhimu katika mbinu za uchanganuzi wa glycome na kupanua matumizi yake kwa anuwai pana ya substrates zaidi ya oligosaccharides ya mimea.Katika siku zijazo, tunaweza kutumia robotiki kwa biotinini na kutumia mbinu ambayo tumeunda kwa uchanganuzi wa matokeo ya juu wa sampuli kwa kutumia ELISA.
Majani ya mahindi (CS) yanayokuzwa kutoka kwa mbegu mseto za Pioneer 33A14 yalivunwa mwaka wa 2010 kutoka Kramer Farms huko Ray, Colorado.Kwa ruhusa ya mwenye shamba, majani haya yanaweza kutumika kwa utafiti. Sampuli zilihifadhiwa kavu chini ya 6% ya unyevu kwenye mifuko ya zip-lock kwenye joto la kawaida. Sampuli zilihifadhiwa kavu chini ya 6% ya unyevu kwenye mifuko ya zip-lock kwenye joto la kawaida. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Sampuli zilihifadhiwa zikiwa zimekauka kwa unyevu wa chini ya asilimia 6 kwenye mifuko ya zipu kwenye joto la kawaida.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Sampuli huhifadhiwa kwenye mifuko ya zipu kwenye joto la kawaida na unyevu wa chini ya 6%.Utafiti ulizingatia miongozo ya ndani na kitaifa.Uchambuzi wa utunzi ulifanywa kwa kutumia itifaki ya NREL.Utungaji huo ulipatikana kuwa na 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% asetili, 14.3% lignin, 1.7% ya protini na 13. 4% majivu.
Cellic® CTec2 (138 mg protini/ml, kura VCNI 0001) ni mchanganyiko changamano wa selulasi, β-glucosidase na Cellic® HTec2 (157 mg protini/ml, lot VHN00001) kutoka Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg protini/mL), mchanganyiko changamano wa vimeng'enya vya pectini vinavyoharibu hadhi, ilitolewa na DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Viwango vya proteni ya enzyme viliamuliwa kwa kukadiria maudhui ya protini (na kupunguza mchango wa nitrojeni isiyo na protini) kwa kutumia uchanganuzi wa nitrojeni ya Kjeldahl (mbinu ya AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatomaceous earth 545 ilinunuliwa kutoka EMD Millipore (Billerica, MA).Kaboni iliyoamilishwa (DARCO, chembechembe za matundu 100), Avicel (PH-101), beech xylan, na kemikali zingine zote zilinunuliwa kutoka Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Maandalizi ya awali ya AFEX yalifanywa katika GLBRC (Maabara ya Utafiti wa Uongofu wa Biomass, MSU, Lansing, MI, USA).Matibabu ya awali yalifanywa kwa 140 ° C. kwa dakika 15.46 muda wa makazi katika uwiano wa 1:1 wa amonia isiyo na maji kwa biomasi kwa 60% (w/w) upakiaji katika kiyeyea bechi cha benchi ya chuma cha pua (Parr Instruments Company).Ilichukua dakika 30.Reactor ililetwa hadi 140 ° C na amonia ilitolewa kwa haraka, kuruhusu biomass kurudi haraka kwenye joto la kawaida.Muundo wa AFEX pre-treated corn stover (ACS) ulikuwa sawa na ule wa jiko la mahindi ambalo halijatibiwa (UT-CS).
Yabisi ya juu ACSH 25% (w/w) (takriban 8% ya upakiaji wa dextran) ilitayarishwa kama nyenzo ya kuanzia kwa uzalishaji mkubwa wa oligosaccharides.Hidrolisisi ya enzymatic ya ACS ilifanywa kwa kutumia mchanganyiko wa kimeng'enya cha kibiashara ikijumuisha Cellic® Ctec2 10 mg ya protini/g glucan (katika biomasi iliyosafishwa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg ya protini/g glucan, na Multifect Pectinase (Genencor Inc, Marekani).)), 5 mg protini/g dextran.Hidrolisisi ya enzymatic ilifanyika katika bioreactor ya lita 5 na kiasi cha kazi cha lita 3, pH 4.8, 50 ° C na 250 rpm.Baada ya hidrolisisi kwa masaa 96, hydrolyzate ilikusanywa na centrifugation saa 6000 rpm kwa dakika 30 na kisha saa 14000 rpm kwa dakika 30 ili kuondoa yabisi isiyo na hidrolisisi.Kisha hidrolizati iliwekwa kwenye mchujo tasa kupitia kopo la chujio la mm 0.22.Hidrolizati iliyochujwa ilihifadhiwa katika chupa tasa kwa 4° C. na kisha kugawanywa kwenye kaboni.
Uchambuzi wa muundo wa sampuli za biomasi kulingana na dondoo kulingana na taratibu za uchambuzi wa maabara ya NREL: maandalizi ya sampuli kwa uchambuzi wa utungaji (NREL/TP-510-42620) na uamuzi wa muundo wa wanga na lignin katika biomass (NREL/TP-510 - 42618)47.
Uchunguzi wa oligosaccharide wa mkondo wa hidrolizati ulifanyika kwa kiwango cha 2 ml kwa kutumia mbinu ya hidrolisisi ya asidi ya autoclave.Changanya sampuli ya hidrolizati na 69.7 µl ya 72% ya asidi ya sulfuriki katika mirija ya kutengenezea skrubu ya mililita 10 na uangulie kwa saa 1 kwenye benchi ifikapo 121 °C, baridi kwenye barafu na uchuje kwenye bakuli la utendaji wa juu wa kromatografia kioevu (HPLC).Mkusanyiko wa oligosaccharides uliamuliwa kwa kuondoa mkusanyiko wa monosaccharides katika sampuli isiyo na hidrolisisi kutoka kwa mkusanyiko wa sukari katika sampuli ya asidi-hidrolisisi.
Viwango vya Glukosi, xylose, na arabinose katika biomasi ya hidrolisisi ya asidi vilichanganuliwa kwa kutumia mfumo wa Shimadzu HPLC ulio na sampuli ya otomatiki, hita ya safu wima, pampu ya isocratic, na kitambua kiashiria cha refractive kwenye safu wima ya Bio-Rad Aminex HPX-87H.Safu ilidumishwa kwa 50°C na kutolewa kwa 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ndani ya maji.mtiririko.
Kidhibiti kikuu cha hidrolizati kilipunguzwa na kuchambuliwa kwa maudhui ya monoma na oligosaccharide.Sukari ya monomeri iliyopatikana baada ya hidrolisisi ya enzymatic ilichambuliwa na HPLC iliyo na safu ya Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P na safu ya ulinzi wa majivu.Joto la safu lilidumishwa kwa 80 ° C, maji yalitumiwa kama awamu ya simu na kiwango cha mtiririko wa 0.6 ml / min.Oligosaccharides iliamuliwa na hidrolisisi katika asidi ya dilute saa 121 ° C kulingana na mbinu zilizoelezwa katika refs.41, 48, 49.
Uchambuzi wa sakharidi ulifanywa kwa mbichi, AFEX iliyotibiwa awali na mabaki yote ya biomass yasiyo ya hidrolisisi (ikiwa ni pamoja na uzalishaji wa dondoo za ukuta wa seli na uchunguzi wao wa mAb) kwa kutumia taratibu zilizoelezwa hapo awali 27, 43, 50, 51 .Kwa uchanganuzi wa glycome, mabaki ya alkoholi yasiyoyeyushwa ya nyenzo za ukuta wa seli ya mimea hutayarishwa kutoka kwa mabaki ya mimea na huchimbwa mfululizo na vitendanishi vinavyozidi kuwa fujo kama vile oxalate ya ammoniamu (50 mM), kabonati ya sodiamu (50 mM na 0.5% w/v), CON.(1M na 4M, zote zikiwa na 1% w/v sodium borohydride) na kloriti ya asidi kama ilivyoelezwa hapo awali52,53.Kisha dondoo ziliwekwa kwa ELISA dhidi ya paneli changamano ya mAb50s iliyoelekezwa kwa glycan ya ukuta wa seli, na miitikio ya kumfunga mAb iliwasilishwa kama ramani ya joto.mAbs zinazolenga ukuta wa seli za glycan zilinunuliwa kutoka kwa hisa za maabara (CCRC, JIM na mfululizo wa MAC).
Biotinylation ya hatua moja ya oligosaccharides.Mchanganyiko wa wanga na biotin-LC-hydrazide ulifanyika kwa kutumia utaratibu ufuatao.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) iliyeyushwa katika dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) kwa kuchochea na kupasha joto kwa 65° C. kwa dakika 1.Asidi ya glacial ya asetiki (30 µl) iliongezwa na mchanganyiko huo ukamwagwa kwenye sodiamu cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) na kufutwa kabisa baada ya kupasha joto kwa 65° C. kwa takriban dakika 1.Kisha, kutoka 5 hadi 8 μl ya mchanganyiko wa majibu iliongezwa kwa oligosaccharide kavu (1-100 nmol) ili kupata ziada ya molar ya 10 au zaidi ya lebo juu ya mwisho wa kupunguza.Mmenyuko ulifanyika saa 65 ° C kwa h 2, baada ya hapo sampuli zilitakaswa mara moja.Hakuna cyanoborohydride ya sodiamu iliyotumiwa katika majaribio ya kuweka lebo bila kupunguzwa, na sampuli zilichukuliwa kwa 65 ° C. kwa saa 2.5.
Mipako ya ELISA na kuosha sampuli za oligosaccharides za biotini.25 μl ya sampuli za biotini (100 μl ya kila sampuli iliyokolea iliyopunguzwa katika 5 ml ya 0.1 M Tris buffer ufumbuzi (TBS)) ziliongezwa kwa kila kisima cha sahani ya avidin-coated.Visima vya kudhibiti vilipakwa 50 μl ya biotini katika mkusanyiko wa 10 μg/ml katika 0.1 M TBS.Maji yaliyotengwa yalitumiwa kama mipako ya vipimo tupu.Kompyuta kibao iliingizwa kwa masaa 2 kwa joto la kawaida katika giza.Osha sahani mara 3 kwa maziwa ya skimmed 0.1% katika 0.1 M TBS kwa kutumia programu Na.11 kwa gorofa ya Grenier 3A.
Kuongeza na kuosha kwa antibodies ya msingi.Ongeza 40 µl za kingamwili msingi kwa kila kisima.Ingiza microplate kwa saa 1 kwenye joto la kawaida kwenye giza.Sahani zilioshwa mara 3 kwa maziwa 0.1% katika TBS 0.1M kwa kutumia programu ya safisha #11 ya Grenier Flat 3A.
Ongeza kingamwili ya pili na safisha.Ongeza 50 µl ya kingamwili ya pili ya panya/panya (iliyopunguzwa 1:5000 katika maziwa 0.1% katika 0.1 M TBS) kwenye kila kisima.Ingiza microplate kwa saa 1 kwenye joto la kawaida kwenye giza.Kisha sahani ndogo zilioshwa mara 5 kwa maziwa 0.1% katika 0.1 M TBS kwa kutumia programu ya kuosha sahani ya Grenier Flat 5A #12.
Kuongeza substrate.Ongeza 50 µl ya 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) kwenye substrate ya msingi (kwa kuongeza matone 2 ya bafa, matone 3 ya TMB, matone 2 ya peroxide ya hidrojeni kwa 15 ml ya maji yaliyotolewa).Andaa substrate ya TMB.na vortex kabla ya matumizi).Ingiza microplate kwenye joto la kawaida kwa dakika 30.Katika giza.
Kamilisha hatua na usome kibao.Ongeza 50 µl ya 1 N asidi ya sulfuriki kwenye kila kisima na urekodi ufyonzaji kutoka 450 hadi 655 nm kwa kutumia kisomaji cha ELISA.
Tayarisha miyeyusho 1 mg/ml ya wachanganuzi hawa katika maji yaliyotolewa: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, asidi ya galacturonic (GalA), asidi ya glucuronic (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (mantylglu).(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (kiwango cha ndani).Viwango viwili vilitayarishwa kwa kuongeza miyeyusho ya sukari ya 1 mg/mL iliyoonyeshwa kwenye Jedwali 1. Sampuli hugandishwa na kugandishwa kwa -80° C. hadi maji yote yameondolewa (kwa kawaida kuhusu saa 12-18).
Ongeza 100–500 µg za sampuli kwenye mirija ya skrubu kwenye mizani ya uchanganuzi.Rekodi kiasi kilichoongezwa.Ni bora kufuta sampuli katika mkusanyiko maalum wa kutengenezea na kuiongeza kwenye bomba kama aliquot ya kioevu.Tumia 20 µl ya 1 mg/ml inositol kama kiwango cha ndani kwa kila sampuli ya tube.Kiasi cha kiwango cha ndani kinachoongezwa kwenye sampuli lazima kiwe sawa na kiwango cha ndani kilichoongezwa kwenye bomba la kawaida.
Ongeza 8 ml ya methanoli isiyo na maji kwenye bakuli la screw cap.Kisha 4 ml ya ufumbuzi wa 3 N. methanolic HCl, iliyofungwa na kutikiswa.Utaratibu huu hautumii maji.
Ongeza 500 µl ya 1 M HCl suluhisho la methanoli kwenye sampuli za oligosakaridi na mirija ya kawaida ya TMS.Sampuli ziliangaziwa usiku kucha (masaa 168) kwa 80° C. katika kizuizi cha joto.Kausha bidhaa ya methanolysis kwenye joto la kawaida kwa kutumia njia mbalimbali ya kukausha.Ongeza 200 µl MeOH na kavu tena.Utaratibu huu unarudiwa mara mbili.Ongeza 200 µl za methanoli, 100 µl za pyridine na 100 µl za anhidridi asetiki kwenye sampuli na changanya vizuri.Sampuli ziliwekwa kwenye joto la kawaida kwa dakika 30.na kavu.Ongeza 200 µl za methanoli na kavu tena.
Ongeza 200 µl za Tri-Sil na bomba lililofungwa joto kwa dakika 20.80 ° C, kisha kilichopozwa kwa joto la kawaida.Tumia namna mbalimbali ya kukaushia ili kukausha zaidi sampuli kwa ujazo wa takriban 50 µl.Ni muhimu kutambua kwamba hatukuruhusu sampuli kukauka kabisa.
Ongeza 2 ml ya hexane na kuchanganya vizuri na vortexing.Jaza vidokezo vya pipettes ya Pasteur (5-8 mm) na kipande cha pamba ya kioo kwa kuingiza pamba ya kioo juu ya pipette ya kipenyo cha 5-3 / 4.Sampuli ziliwekwa katikati kwa 3000 g kwa dakika 2.Mabaki yoyote yasiyoyeyuka yananyesha.Kausha sampuli hadi 100-150 µl.Kiasi cha takriban 1 μl kilidungwa kwenye GC-MS kwa joto la awali la 80 °C na wakati wa awali wa dakika 2.0 (Jedwali 2).