Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે જે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો તે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ ધરાવે છે.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).આ દરમિયાન, સતત સમર્થન સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટને રેન્ડર કરીશું.
નવી ઇમ્યુનોલોજિકલ અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રિક પદ્ધતિઓ AFEX સાથે પ્રીટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવરમાં સતત ઓલિગોસેકરાઇડ્સના જટિલ વિશ્લેષણ માટે.લિગ્નોસેલ્યુલોસિક બાયોમાસ એ અશ્મિભૂત ઇંધણનો ટકાઉ વિકલ્પ છે અને ખોરાક, ખોરાક, ઇંધણ અને રસાયણો જેવા ઉત્પાદનોના ઉત્પાદન માટે બાયોટેકનોલોજી વિકસાવવા માટે વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાય છે.આ તકનીકોની ચાવી એ છોડની કોષની દિવાલોમાં હાજર જટિલ કાર્બોહાઇડ્રેટ્સને ગ્લુકોઝ, ઝાયલોઝ અને એરાબીનોઝ જેવી સાદી શર્કરામાં રૂપાંતરિત કરવા માટે ખર્ચ-સ્પર્ધાત્મક પ્રક્રિયાઓનો વિકાસ છે.કારણ કે લિગ્નોસેલ્યુલોસિક બાયોમાસ ખૂબ જ હઠીલા છે, તેને થર્મોકેમિકલ સારવાર (દા.ત., એમોનિયા ફાઇબર એક્સ્ફોલિયેશન (AFEX), પાતળું એસિડ (DA), આયનીય પ્રવાહી (IL)) અને જૈવિક સારવાર (દા.ત., એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ અને માઇક્રોબાયલ આથો)ને આધીન હોવું જોઈએ..જો કે, જ્યારે વાણિજ્યિક ફંગલ ઉત્સેચકોનો ઉપયોગ હાઇડ્રોલિસિસ પ્રક્રિયામાં કરવામાં આવે છે, ત્યારે રચાયેલી દ્રાવ્ય શર્કરામાંથી માત્ર 75-85% મોનોસેકરાઇડ્સ હોય છે, અને બાકીના 15-25% દ્રાવ્ય, અસ્પષ્ટ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ હોય છે, જે હંમેશા સુક્ષ્મસજીવો માટે ઉપલબ્ધ હોતા નથી.અગાઉ, અમે કાર્બન અને ડાયટોમેસિયસ પૃથ્વી વિભાજન અને કદના બાકાત ક્રોમેટોગ્રાફીના મિશ્રણનો ઉપયોગ કરીને દ્રાવ્ય હઠીલા ઓલિગોસેકરાઇડ્સને સફળતાપૂર્વક અલગ અને શુદ્ધ કર્યા છે, અને તેમના એન્ઝાઇમ અવરોધક ગુણધર્મોની પણ તપાસ કરી છે.અમે શોધી કાઢ્યું છે કે ઉચ્ચ ડિગ્રી પોલિમરાઇઝેશન (DP) મેથિલેટેડ યુરોનિક એસિડ અવેજી ધરાવતા ઓલિગોસેકરાઇડ્સ નીચા ડીપી અને ન્યુટ્રલ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ કરતાં વ્યાવસાયિક એન્ઝાઇમ મિશ્રણો સાથે પ્રક્રિયા કરવા માટે વધુ મુશ્કેલ છે.અહીં અમે છોડના કોષની દિવાલો અને એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસેટ્સ, મેટ્રિક્સ-આસિસ્ટેડ લેસર ડિસોર્પ્શન આયનાઇઝેશન, ટાઇમ-ઓફ-ફ્લાઇટ માસ-સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીમાં ગ્લાયકન બોન્ડને લાક્ષણિકતા આપવા માટે પ્લાન્ટ બાયોમાસ ગ્લાયકેન માટે વિશિષ્ટ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ (mAbs) નો ઉપયોગ કરીને ગ્લાયકન પ્રોફાઇલિંગ સહિતની ઘણી વધારાની પદ્ધતિઓના ઉપયોગની જાણ કરીએ છીએ..MALDI-TOF-MS) ઓલિગોસેકરાઇડ બોન્ડને ડેરિવેટાઇઝેશન સાથે અને વગર દર્શાવવા માટે નકારાત્મક આયનોના ગૌણ સડો, ગેસ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (GC-MS) પછી સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી દ્વારા મેળવેલા માળખાકીય-માહિતીપ્રદ નિદાન શિખરોનો ઉપયોગ કરે છે.ઓલિગોસેકરાઇડ્સ (DP 4-20) ના નાના કદના કારણે, આ પરમાણુઓનો mAb બંધન અને લાક્ષણિકતા માટે ઉપયોગ કરવો મુશ્કેલ છે.આ સમસ્યાને દૂર કરવા માટે, અમે નવી બાયોટિન જોડાણ-આધારિત ઓલિગોસેકરાઇડ ઇમબિલાઇઝેશન પદ્ધતિ લાગુ કરી છે જેણે માઇક્રોપ્લેટ સપાટી પર બહુમતી નીચા DP દ્રાવ્ય ઓલિગોસેકરાઇડ્સને સફળતાપૂર્વક લેબલ કર્યું છે, જેનો ઉપયોગ ચોક્કસ લિગેશન વિશ્લેષણ માટે ઉચ્ચ થ્રુપુટ mAb સિસ્ટમમાં કરવામાં આવ્યો હતો.આ નવી પદ્ધતિ ભવિષ્યમાં વધુ અદ્યતન ઉચ્ચ થ્રુપુટ ગ્લાયકોમ એસેસના વિકાસને સરળ બનાવશે જેનો ઉપયોગ ડાયગ્નોસ્ટિક હેતુઓ માટે બાયોમાર્કર્સમાં હાજર ઓલિગોસેકરાઇડ્સને અલગ કરવા અને લાક્ષણિકતા આપવા માટે થઈ શકે છે.
લિગ્નોસેલ્યુલોસિક બાયોમાસ, કૃષિ, વનસંવર્ધન, ઘાસ અને લાકડાંની સામગ્રીઓથી બનેલું, ઉચ્ચ મૂલ્યના ઉત્પાદનોનું ઉત્પાદન કરવા માટે ખોરાક, ફીડ, બળતણ અને રાસાયણિક પુરોગામી સહિત બાયો-આધારિત ઉત્પાદનોના ઉત્પાદન માટે સંભવિત ફીડસ્ટોક છે.છોડના કોષની દિવાલોમાં હાજર કાર્બોહાઇડ્રેટ્સ (જેમ કે સેલ્યુલોઝ અને હેમીસેલ્યુલોઝ) રાસાયણિક પ્રક્રિયા અને બાયોટ્રાન્સફોર્મેશન (જેમ કે એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ અને માઇક્રોબાયલ આથો) દ્વારા મોનોસેકરાઇડ્સમાં ડિપોલિમરાઇઝ્ડ થાય છે.સામાન્ય પ્રી-ટ્રીટમેન્ટ્સમાં એમોનિયા ફાઇબર એક્સ્પાન્સન (AFEX), પાતળું એસિડ (DA), આયોનિક લિક્વિડ (IL), અને સ્ટીમ એક્સ્પ્લોશન (SE)નો સમાવેશ થાય છે, જે છોડની કોષની દિવાલો 3,4 ખોલીને લિગ્નોસેલ્યુલોઝ ઉત્પાદન ઘટાડવા માટે રસાયણો અને ગરમીના મિશ્રણનો ઉપયોગ કરે છે.દ્રવ્યની હઠીલાતા, 5. એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ એ જૈવ-આધારિત ઇંધણ અને રસાયણો ઉત્પન્ન કરવા માટે ટ્રાન્સજેનિક યીસ્ટ અથવા બેક્ટેરિયાનો ઉપયોગ કરીને વ્યવસાયિક સક્રિય કાર્બોહાઇડ્રેટ-સમાવતી ઉત્સેચકો (CAZymes) અને માઇક્રોબાયલ આથોનો ઉપયોગ કરીને ઉચ્ચ ઘન લોડ પર હાથ ધરવામાં આવે છે 6 .
વાણિજ્યિક ઉત્સેચકોમાં CAZymes એ ઉત્સેચકોના જટિલ મિશ્રણથી બનેલા હોય છે જે મોનોસેકરાઇડ્સ 2,7 બનાવવા માટે જટિલ કાર્બોહાઇડ્રેટ-સુગર બોન્ડને સિનર્જિસ્ટિક રીતે તોડી નાખે છે.જેમ આપણે અગાઉ જાણ કરી છે તેમ, કાર્બોહાઇડ્રેટ્સ સાથે લિગ્નીનના સુગંધિત પોલિમરનું જટિલ નેટવર્ક તેમને અત્યંત અવ્યવસ્થિત બનાવે છે, જે અપૂર્ણ ખાંડના રૂપાંતરણ તરફ દોરી જાય છે, 15-25% સેક્સ ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું સંચય કરે છે જે પ્રીટ્રીટેડ બાયોમાસના એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ દરમિયાન ઉત્પન્ન થતા નથી.વિવિધ બાયોમાસ પ્રીટ્રીટમેન્ટ પદ્ધતિઓ સાથે આ એક સામાન્ય સમસ્યા છે.આ અડચણ માટેના કેટલાક કારણોમાં હાઇડ્રોલિસિસ દરમિયાન એન્ઝાઇમ અવરોધ, અથવા છોડના બાયોમાસમાં સુગર બોન્ડ તોડવા માટે જરૂરી આવશ્યક ઉત્સેચકોની ગેરહાજરી અથવા નીચા સ્તરનો સમાવેશ થાય છે.શર્કરાની રચના અને માળખાકીય લાક્ષણિકતાઓને સમજવાથી, જેમ કે ઓલિગોસેકરાઇડ્સમાં સુગર બોન્ડ્સ, અમને હાઇડ્રોલિસિસ દરમિયાન ખાંડના રૂપાંતરણને સુધારવામાં મદદ કરશે, બાયોટેકનોલોજીકલ પ્રક્રિયાઓને પેટ્રોલિયમ-ઉત્પાદિત ઉત્પાદનો સાથે ખર્ચ-સ્પર્ધાત્મક બનાવશે.
કાર્બોહાઇડ્રેટ્સનું માળખું નક્કી કરવું પડકારજનક છે અને પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી (LC)11,12, ન્યુક્લિયર મેગ્નેટિક રેઝોનન્સ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (NMR)13, કેશિલરી ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ (CE)14,15,16 અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS)17 જેવી પદ્ધતિઓના સંયોજનની જરૂર છે.,અઢાર.MS પદ્ધતિઓ જેમ કે લેસર ડિસોર્પ્શન સાથે ફ્લાઇટ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી અને મેટ્રિક્સ (MALDI-TOF-MS) નો ઉપયોગ કરીને આયનીકરણ એ કાર્બોહાઇડ્રેટ માળખાને ઓળખવા માટે બહુમુખી પદ્ધતિ છે.તાજેતરમાં, અથડામણ-પ્રેરિત ડિસોસિએશન (CID) ટેન્ડમ MS ઓફ સોડિયમ આયન એડક્ટ્સનો ઉપયોગ ઓલિગોસેકરાઇડ એટેચમેન્ટ પોઝિશન્સ, એનોમેરિક કન્ફિગરેશન્સ, સિક્વન્સ અને બ્રાન્ચિંગ પોઝિશન્સ 20, 21ને અનુરૂપ ફિંગરપ્રિન્ટ્સને ઓળખવા માટે સૌથી વધુ વ્યાપકપણે થાય છે.
કાર્બોહાઇડ્રેટ બોન્ડની ઊંડાણપૂર્વક ઓળખ માટે ગ્લાયકન વિશ્લેષણ એ એક ઉત્તમ સાધન છે.આ પદ્ધતિ જટિલ કાર્બોહાઇડ્રેટ જોડાણોને સમજવા માટે પ્રોબ તરીકે સેલ વોલ ગ્લાયકેન રોપવા માટે નિર્દેશિત મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ (mAbs) નો ઉપયોગ કરે છે.વિશ્વભરમાં 250 કરતાં વધુ mAbs ઉપલબ્ધ છે, જે વિવિધ સેકરાઇડ્સ24નો ઉપયોગ કરીને વિવિધ રેખીય અને શાખાવાળા ઓલિગોસેકરાઇડ્સ સામે ડિઝાઇન કરવામાં આવ્યા છે.છોડની કોષ દિવાલની રચના, રચના અને ફેરફારોને દર્શાવવા માટે ઘણા mAbs નો વ્યાપકપણે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે, કારણ કે છોડના કોષના પ્રકાર, અંગ, ઉંમર, વિકાસના તબક્કા અને વૃદ્ધિના વાતાવરણના આધારે નોંધપાત્ર તફાવતો છે.તાજેતરમાં, આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ વનસ્પતિ અને પ્રાણી પ્રણાલીઓમાં વેસિકલ વસ્તી અને સબસેલ્યુલર માર્કર્સ, વિકાસના તબક્કાઓ અથવા પર્યાવરણીય ઉત્તેજના દ્વારા નિર્ધારિત ગ્લાયકેન પરિવહનમાં તેમની સંબંધિત ભૂમિકાઓને સમજવા અને એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ નક્કી કરવા માટે કરવામાં આવે છે.ગ્લાયકેન્સ અને ઝાયલન્સની કેટલીક વિવિધ રચનાઓ કે જેને ઓળખવામાં આવી છે તેમાં પેક્ટીન (P), ઝાયલાન (X), મન્નાન (M), ઝાયલોગ્લુકન્સ (XylG), મિશ્ર બોન્ડ ગ્લુકન્સ (MLG), એરાબીનોક્સીલાન (ArbX), ગેલેક્ટોમેનન (GalG) , ગ્લુકોરોનિક એસિડ-એરાબીનોક્સીલન (Arabinoxylan) અને ગ્લુકોરોનિક એસિડ-એરાબીનોક્સીલાન (ArbX9) અને ગ્લાયકેન્સનો સમાવેશ થાય છે.
જો કે, આ બધા સંશોધન પ્રયત્નો છતાં, માત્ર થોડા અભ્યાસોએ હાઈ સોલિડ લોડ (HSL) હાઈડ્રોલિસિસ દરમિયાન ઓલિગોસેકરાઈડના સંચયની પ્રકૃતિ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું છે, જેમાં ઓલિગોસેકરાઈડ રિલીઝ, હાઈડ્રોલિસિસ દરમિયાન ઓલિગોમેરિક સાંકળની લંબાઈમાં ફેરફાર, વિવિધ નીચા DP પોલિમર અને તેમના વળાંકનો સમાવેશ થાય છે.વિતરણ 30,31,32.દરમિયાન, જો કે ગ્લાયકેન વિશ્લેષણ એ ગ્લાયકેન માળખાના વ્યાપક વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગી સાધન સાબિત થયું છે, એન્ટિબોડી પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને પાણીમાં દ્રાવ્ય નીચા ડીપી ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું મૂલ્યાંકન કરવું મુશ્કેલ છે.5-10 kDa કરતા ઓછા મોલેક્યુલર વજનવાળા નાના ડીપી ઓલિગોસેકરાઇડ્સ ELISA પ્લેટ્સ 33, 34 સાથે જોડાતા નથી અને એન્ટિબોડી ઉમેરતા પહેલા ધોવાઇ જાય છે.
અહીં, પ્રથમ વખત, અમે મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને એવિડિન-કોટેડ પ્લેટો પર એક ELISA પરીક્ષાનું નિદર્શન કરીએ છીએ, જેમાં ગ્લાયકોમ વિશ્લેષણ સાથે દ્રાવ્ય પ્રત્યાવર્તન ઓલિગોસેકરાઇડ્સ માટે એક-પગલાની બાયોટિનાઇલેશન પ્રક્રિયાને જોડીને.ગ્લાયકોમ પૃથ્થકરણ માટેનો અમારો અભિગમ MALDI-TOF-MS અને GC-MS આધારિત હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ સુગર કમ્પોઝિશનના ટ્રાઇમેથાઇલસિલિલ (TMS) વ્યુત્પન્નીકરણનો ઉપયોગ કરીને પૂરક ઓલિગોસેકરાઇડ જોડાણોના વિશ્લેષણ દ્વારા માન્ય કરવામાં આવ્યો હતો.આ નવીન અભિગમને ભવિષ્યમાં ઉચ્ચ-થ્રુપુટ પદ્ધતિ તરીકે વિકસાવી શકાય છે અને બાયોમેડિકલ સંશોધનમાં વ્યાપક એપ્લિકેશન શોધી શકાય છે.
એન્ઝાઇમ્સ અને એન્ટિબોડીઝના અનુવાદ પછીના ફેરફારો, જેમ કે ગ્લાયકોસિલેશન,36 તેમની જૈવિક પ્રવૃત્તિને અસર કરે છે.ઉદાહરણ તરીકે, સીરમ પ્રોટીનના ગ્લાયકોસિલેશનમાં ફેરફાર બળતરા સંધિવામાં મહત્વની ભૂમિકા ભજવે છે, અને ગ્લાયકોસિલેશનમાં ફેરફારોનો ઉપયોગ ડાયગ્નોસ્ટિક માર્કર તરીકે થાય છે37.જઠરાંત્રિય માર્ગ અને યકૃત, વાયરલ ચેપ, અંડાશય, સ્તન અને પ્રોસ્ટેટ કેન્સર 38,39,40 સહિત વિવિધ રોગોમાં વિવિધ ગ્લાયકેન્સ સહેલાઈથી દેખાતા હોવાનું સાહિત્યમાં નોંધવામાં આવ્યું છે.એન્ટિબોડી-આધારિત ગ્લાયકેન ELISA પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને ગ્લાયકેન્સની રચનાને સમજવાથી જટિલ MS પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કર્યા વિના રોગના નિદાનમાં વધારાનો વિશ્વાસ મળશે.
અમારો અગાઉનો અભ્યાસ દર્શાવે છે કે હઠીલા ઓલિગોસેકરાઇડ્સ પ્રીટ્રીટમેન્ટ અને એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ (આકૃતિ 1) પછી બિનહાઇડ્રોલાઇઝ્ડ રહે છે.અમારા અગાઉ પ્રકાશિત થયેલા કાર્યમાં, અમે AFEX-પ્રીટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવર હાઇડ્રોલીઝેટ (ACSH)8 માંથી ઓલિગોસેકરાઇડ્સને અલગ કરવા માટે સક્રિય ચારકોલ સોલિડ-ફેઝ એક્સટ્રેક્શન પદ્ધતિ વિકસાવી છે.પ્રારંભિક નિષ્કર્ષણ અને વિભાજન પછી, ઓલિગોસેકરાઇડ્સને કદ બાકાત ક્રોમેટોગ્રાફી (SEC) દ્વારા વધુ વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા અને પરમાણુ વજનના ક્રમમાં એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.સુગર મોનોમર્સ અને ઓલિગોમર્સ વિવિધ પ્રીટ્રેટમેન્ટ્સમાંથી મુક્ત કરવામાં આવ્યા હતા, જેનું ખાંડ રચના વિશ્લેષણ દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.વિવિધ પ્રીટ્રીટમેન્ટ પદ્ધતિઓ દ્વારા મેળવેલ સુગર ઓલિગોમર્સની સામગ્રીની તુલના કરતી વખતે, હઠીલા ઓલિગોસેકરાઇડ્સની હાજરી એ બાયોમાસને મોનોસેકરાઇડ્સમાં રૂપાંતરિત કરવામાં એક સામાન્ય સમસ્યા છે અને તે ઓછામાં ઓછા 10-15% અને 18% સુધી ખાંડની ઉપજમાં ઘટાડો તરફ દોરી શકે છે.યુ.એસ.આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકના વધુ મોટા પાયે ઉત્પાદન માટે થાય છે.આ કાર્યમાં ઓલિગોસેકરાઇડ્સની લાક્ષણિકતા માટે પ્રાયોગિક સામગ્રી તરીકે વિવિધ પરમાણુ વજનવાળા પરિણામી ACH અને તેના અનુગામી અપૂર્ણાંકોનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
પ્રીટ્રીટમેન્ટ અને એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ પછી, સતત ઓલિગોસેકરાઇડ્સ બિનહાઇડ્રોલિસીસ રહ્યા.અહીં (A) એક ઓલિગોસેકરાઈડ અલગ કરવાની પદ્ધતિ છે જેમાં ઓલિગોસેકરાઈડને સક્રિય કાર્બન અને ડાયટોમેસિયસ અર્થના પેક્ડ બેડનો ઉપયોગ કરીને AFEX-પ્રીટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવર હાઈડ્રોલાઈઝેટ (ACSH) થી અલગ કરવામાં આવે છે;(B) ઓલિગોસેકરાઇડ્સને અલગ કરવાની પદ્ધતિ.ઓલિગોસેકરાઇડ્સને કદ બાકાત ક્રોમેટોગ્રાફી (SEC) દ્વારા વધુ અલગ કરવામાં આવ્યા હતા;(C) સેકરાઇડ મોનોમર્સ અને ઓલિગોમર્સ વિવિધ પ્રીટ્રીટમેન્ટ્સમાંથી મુક્ત થાય છે (પાતળું એસિડ: DA, આયનીય પ્રવાહી: IL અને AFEX).એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ શરતો: 25% (ડબલ્યુ/ડબલ્યુ) (આશરે 8% ગ્લુકન લોડિંગ) નું ઉચ્ચ ઘન લોડિંગ, 96 કલાકનું હાઇડ્રોલિસિસ, 20 મિલિગ્રામ/જી કોમર્શિયલ એન્ઝાઇમ લોડિંગ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 રેશિયો) અને (D) અને સુગર મોનોલોસેરા, મોનોલોસેરાબીનમાંથી મુક્ત થયેલ છે. EX પ્રી-ટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવર (ACS).
ગ્લાયકેન વિશ્લેષણ ઘન બાયોમાસ અવશેષોમાંથી અલગ કરાયેલા અર્કમાં ગ્લાયકેન્સના વ્યાપક માળખાકીય વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગી સાધન સાબિત થયું છે.જો કે, પાણીમાં દ્રાવ્ય સેકરાઇડ્સ આ પરંપરાગત પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને ઓછા દર્શાવવામાં આવે છે41 કારણ કે ઓછા પરમાણુ વજન ઓલિગોસેકરાઇડ્સ એલિસા પ્લેટ પર સ્થિર થવું મુશ્કેલ છે અને એન્ટિબોડી ઉમેરતા પહેલા ધોવાઇ જાય છે.તેથી, એન્ટિબોડી બંધનકર્તા અને લાક્ષણિકતા માટે, એવિડિન-કોટેડ ELISA પ્લેટો પર દ્રાવ્ય, બિન-સુસંગત ઓલિગોસેકરાઇડ્સને કોટ કરવા માટે એક-પગલાની બાયોટિનીલેશન પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.આ પદ્ધતિ અમારા અગાઉ ઉત્પાદિત ACSH અને તેના પરમાણુ વજન (અથવા પોલિમરાઇઝેશનની ડિગ્રી, DP) પર આધારિત અપૂર્ણાંકનો ઉપયોગ કરીને પરીક્ષણ કરવામાં આવી હતી.કાર્બોહાઇડ્રેટ (ફિગ. 2) ના ઘટાડતા અંતમાં બાયોટિન-એલસી-હાઇડ્રેઝાઇડ ઉમેરીને ઓલિગોસેકરાઇડ બંધનકર્તા જોડાણ વધારવા માટે વન-સ્ટેપ બાયોટીનીલેશનનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.સોલ્યુશનમાં, રિડ્યુસિંગ છેડે હેમિયાસેટલ ગ્રૂપ હાઇડ્રેઝોન બોન્ડ બનાવવા માટે બાયોટિન-એલસી-હાઇડરાઝાઇડના હાઇડ્રોઝાઇડ જૂથ સાથે પ્રતિક્રિયા આપે છે.ઘટાડનાર એજન્ટ NaCNBH3 ની હાજરીમાં, હાઇડ્રેઝોન બોન્ડને સ્થિર બાયોટિનીલેટેડ અંતિમ ઉત્પાદનમાં ઘટાડી દેવામાં આવે છે.સુગર રિડ્યુસિંગ એન્ડમાં ફેરફાર સાથે, નીચા DP ઓલિગોસેકરાઇડ્સને ELISA પ્લેટ્સ સાથે જોડવાનું શક્ય બન્યું, અને અમારા અભ્યાસમાં આ ગ્લાયકેન-લક્ષિત mAbs નો ઉપયોગ કરીને એવિડિન-કોટેડ પ્લેટો પર કરવામાં આવ્યું હતું.
બાયોટીનીલેટેડ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ માટે ELISA પર આધારિત મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝનું સ્ક્રીનીંગ.અહીં (A) ન્યુટ્રાએવિડિન કોટેડ પ્લેટ્સ પર ગ્લાયકેન-લક્ષિત mAbs સાથે ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું સંયુક્ત બાયોટિનાઇલેશન અને અનુગામી ELISA સ્ક્રીનીંગ અને (B) પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનોના બાયોટિનાઇલેશન માટે એક-પગલાની પ્રક્રિયા દર્શાવે છે.
ઓલિગોસેકરાઇડ-કન્જુગેટેડ એન્ટિબોડીઝ સાથે એવિડિન-કોટેડ પ્લેટો પછી પ્રાથમિક અને ગૌણ એન્ટિબોડીઝમાં ઉમેરવામાં આવી હતી અને પ્રકાશ અને સમય-સંવેદનશીલ માધ્યમમાં ધોવાઇ હતી.એન્ટિબોડી બંધન પૂર્ણ થયા પછી, પ્લેટને ઉકાળવા માટે TMB સબસ્ટ્રેટ ઉમેરો.પ્રતિક્રિયા આખરે સલ્ફ્યુરિક એસિડ સાથે બંધ કરવામાં આવી હતી.એન્ટિબોડી-વિશિષ્ટ ક્રોસ-લિંકિંગને શોધવા માટે પ્રત્યેક એન્ટિબોડીની બંધનકર્તા શક્તિ નક્કી કરવા માટે એલિસા રીડરનો ઉપયોગ કરીને ઇન્ક્યુબેટેડ પ્લેટોનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રયોગની વિગતો અને પરિમાણો માટે, અનુરૂપ વિભાગ "સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ" જુઓ.
અમે ACSH માં હાજર દ્રાવ્ય ઓલિગોસેકરાઇડ્સ તેમજ લિગ્નોસેલ્યુલોસિક હાઇડ્રોલિસેટ્સથી અલગ કરાયેલા ક્રૂડ અને શુદ્ધ ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકમાં વિશિષ્ટ એપ્લિકેશનો માટે આ નવી વિકસિત પદ્ધતિની ઉપયોગિતાનું નિદર્શન કરીએ છીએ.આકૃતિ 3 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, બાયોએસીલેટેડ ગ્લાયકોમ એસે પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને ACSH માં ઓળખવામાં આવેલા સૌથી સામાન્ય એપિટોપ-અવેજી ઝાયલન્સ સામાન્ય રીતે યુરોનિક (U) અથવા મેથિલ્યુરોનિક (MeU) અને પેક્ટિક એરાબિનોગાલેક્ટન્સ છે.તેમાંના મોટાભાગના નોન-હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ સોલિડ્સ (UHS)43 ના ગ્લાયકેનના વિશ્લેષણ પરના અમારા અગાઉના અભ્યાસમાં પણ જોવા મળ્યા હતા.
કોષની દિવાલ ગ્લાયકેન તરફ નિર્દેશિત મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કરીને રિકેલસીટ્રાન્ટ ઓલિગોસેકરાઇડ એપિટોપ્સની તપાસ."તટસ્થ" અપૂર્ણાંક એ ACN અપૂર્ણાંક છે અને "એસિડિક" અપૂર્ણાંક FA અપૂર્ણાંક છે.હીટમેપ પરના તેજસ્વી લાલો ઉચ્ચ એપિટોપ સામગ્રી સૂચવે છે, અને તેજસ્વી બ્લૂઝ ખાલી પૃષ્ઠભૂમિ સૂચવે છે.સ્કેલ પરના રંગ મૂલ્યો N=2 ફોર્મ્યુલેશન માટે કાચા OD મૂલ્યો પર આધારિત છે.એન્ટિબોડીઝ દ્વારા ઓળખાયેલ મુખ્ય એપિટોપ્સ જમણી બાજુએ બતાવવામાં આવે છે.
આ બિન-સેલ્યુલોઝ સ્ટ્રક્ચર્સ સૌથી સામાન્ય સેલ્યુલાસેસ અને હેમિસેલ્યુલાસેસ દ્વારા ચકાસાયેલ કોમર્શિયલ એન્ઝાઇમ મિશ્રણમાં ક્લીવ કરી શકાતા નથી, જેમાં સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતા કોમર્શિયલ એન્ઝાઇમનો સમાવેશ થાય છે.તેથી, તેમના હાઇડ્રોલિસિસ માટે નવા સહાયક ઉત્સેચકોની જરૂર છે.જરૂરી બિન-સેલ્યુલોઝ સહાયક ઉત્સેચકો વિના, આ બિન-સેલ્યુલોઝ બોન્ડ્સ મોનોસેકરાઇડ્સમાં સંપૂર્ણ રૂપાંતર અટકાવે છે, ભલે તેમના પિતૃ ખાંડ પોલિમરને ટૂંકા ટુકડાઓમાં વ્યાપકપણે હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ કરવામાં આવે અને વાણિજ્યિક એન્ઝાઇમ મિશ્રણનો ઉપયોગ કરીને ઓગળવામાં આવે.
સિગ્નલ વિતરણ અને તેની બંધન શક્તિનો વધુ અભ્યાસ દર્શાવે છે કે ડાઇમર્સમાં નીચા DP અપૂર્ણાંક (D, E, F, DP) કરતાં ઊંચા DP સુગર અપૂર્ણાંક (A, B, C, DP 20+ સુધી) માં બંધનકર્તા એપિટોપ્સ ઓછા હતા (ફિગ. 1).તટસ્થ ટુકડાઓ કરતાં નોન-સેલ્યુલોઝ એપિટોપ્સમાં એસિડ ટુકડાઓ વધુ સામાન્ય છે.આ ઘટનાઓ અમારા અગાઉના અભ્યાસમાં જોવા મળેલી પેટર્ન સાથે સુસંગત છે, જ્યાં ઉચ્ચ ડીપી અને એસિડ મોઇટી એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ માટે વધુ પ્રતિરોધક હતા.તેથી, નોન-સેલ્યુલોઝ ગ્લાયકેન એપિટોપ્સ અને U અને MeU અવેજીની હાજરી ઓલિગોસેકરાઇડ્સની સ્થિરતામાં મોટા પ્રમાણમાં ફાળો આપી શકે છે.એ નોંધવું જોઈએ કે બંધન અને શોધ કાર્યક્ષમતા ઓછી ડીપી ઓલિગોસેકરાઈડ માટે સમસ્યારૂપ હોઈ શકે છે, ખાસ કરીને જો એપિટોપ ડાયમેરિક અથવા ટ્રાઈમેરિક ઓલિગોસેકરાઈડ હોય.આનું પરીક્ષણ વિવિધ લંબાઈના વ્યાપારી ઓલિગોસેકરાઇડ્સનો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે, દરેકમાં માત્ર એક જ એપિટોપ હોય છે જે ચોક્કસ mAb સાથે જોડાય છે.
આમ, સ્ટ્રક્ચર-વિશિષ્ટ એન્ટિબોડીઝના ઉપયોગથી ચોક્કસ પ્રકારના રિકેલસીટ્રન્ટ બોન્ડ્સ પ્રગટ થયા.ઉપયોગમાં લેવાતા એન્ટિબોડીના પ્રકાર, યોગ્ય લિગેશન પેટર્ન અને તે જે સિગ્નલ ઉત્પન્ન કરે છે તેના આધારે (સૌથી વધુ અને ઓછામાં ઓછા વિપુલ પ્રમાણમાં) નવા ઉત્સેચકોને ઓળખી શકાય છે અને વધુ સંપૂર્ણ ગ્લાયકોકન્વર્ઝન માટે એન્ઝાઇમ મિશ્રણમાં અર્ધ-માત્રાત્મક રીતે ઉમેરી શકાય છે.ACSH oligosaccharides ના વિશ્લેષણને ઉદાહરણ તરીકે લેતા, અમે દરેક બાયોમાસ સામગ્રી માટે ગ્લાયકેન બોન્ડ્સનો ડેટાબેઝ બનાવી શકીએ છીએ.અહીં એ નોંધવું જોઈએ કે એન્ટિબોડીઝની અલગ-અલગ એફિનિટી ધ્યાનમાં લેવી જોઈએ, અને જો તેમની એફિનિટી અજાણ હોય, તો વિવિધ એન્ટિબોડીઝના સંકેતોની સરખામણી કરતી વખતે આ ચોક્કસ મુશ્કેલીઓ ઊભી કરશે.વધુમાં, સમાન એન્ટિબોડી માટેના નમૂનાઓ વચ્ચે ગ્લાયકન બોન્ડની સરખામણી શ્રેષ્ઠ કામ કરી શકે છે.આ હઠીલા બોન્ડ્સ પછી CAZyme ડેટાબેઝ સાથે લિંક કરી શકાય છે, જેમાંથી આપણે ઉત્સેચકોને ઓળખી શકીએ છીએ, ઉમેદવાર ઉત્સેચકો પસંદ કરી શકીએ છીએ અને બોન્ડ-બ્રેકિંગ એન્ઝાઇમ્સ માટે પરીક્ષણ કરી શકીએ છીએ, અથવા બાયોરિફાઇનરીમાં ઉપયોગ માટે આ ઉત્સેચકોને વ્યક્ત કરવા માટે માઇક્રોબાયલ સિસ્ટમ્સ વિકસાવી શકીએ છીએ.
લિગ્નોસેલ્યુલોસિક હાઇડ્રોલિસેટ્સમાં હાજર નીચા પરમાણુ વજન ઓલિગોસેકરાઇડ્સને લાક્ષણિકતા આપવા માટે રોગપ્રતિકારક પદ્ધતિઓ કેવી રીતે વૈકલ્પિક પદ્ધતિઓને પૂરક બનાવે છે તેનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે MALDI (ફિગ. 4, S1-S8) અને તે જ પેનલ પર GC-MS પર આધારિત TMS-ઉત્પાદિત સેકરાઇડ્સનું વિશ્લેષણ કર્યું.MALDI નો ઉપયોગ ઓલિગોસેકરાઇડ પરમાણુઓનું સમૂહ વિતરણ ઇચ્છિત બંધારણ સાથે મેળ ખાય છે કે કેમ તેની સરખામણી કરવા માટે થાય છે.અંજીર પર.4 તટસ્થ ઘટકો ACN-A અને ACN-B ના MC બતાવે છે.ACN-A વિશ્લેષણે DP 4–8 (ફિગ. 4) થી DP 22 (ફિગ. S1) સુધીની પેન્ટોઝ શર્કરાની શ્રેણીની પુષ્ટિ કરી છે, જેનું વજન MeU-xylan oligosaccharides ને અનુરૂપ છે.ACN-B વિશ્લેષણે DP 8-15 સાથે પેન્ટોઝ અને ગ્લુકોક્સિલાન શ્રેણીની પુષ્ટિ કરી.આકૃતિ S3 જેવી પૂરક સામગ્રીમાં, FA-C એસિડિક મોઇટી માસ ડિસ્ટ્રિબ્યુશન નકશા 8-15 ના DP સાથે (Me)U અવેજી પેન્ટોઝ શર્કરાની શ્રેણી દર્શાવે છે જે ELISA- આધારિત mAb સ્ક્રીનીંગમાં જોવા મળતા અવેજી ઝાયલન્સ સાથે સુસંગત છે.એપિટોપ્સ સુસંગત છે.
ACS માં હાજર દ્રાવ્ય બિન-સુસંગત ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું MALDI-MS સ્પેક્ટ્રમ.અહીં, (A) ACN-A નીચા વજન શ્રેણીના અપૂર્ણાંકો જેમાં મેથાઈલેટેડ યુરોનિક એસિડ (DP 4-8) અવેજી ગ્લુક્યુરોક્સિલાન ઓલિગોસેકરાઈડ્સ અને (B) ACN-B ઝાયલાન અને મેથાઈલેટેડ યુરોનિક એસિડ ઓલિગોસેકરાઈડ્સ ગ્લુકોરોક્સિલાન (DP 8-15) સાથે બદલાય છે.
પ્રત્યાવર્તન ઓલિગોસેકરાઇડ્સના ગ્લાયકેન અવશેષોની રચનાનું વિશ્લેષણ.અહીં (A) GC-MS વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને મેળવેલ વિવિધ ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકોની TMS સેકરાઇડ રચના.(B) ઓલિગોસેકરાઇડ્સમાં હાજર વિવિધ TMS-પ્રાપ્ત શર્કરાની રચનાઓ.ACN - એસીટોનાઇટ્રાઇલ અપૂર્ણાંક જેમાં તટસ્થ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ હોય છે અને એફએ - ફેરુલિક એસિડ અપૂર્ણાંક જેમાં એસિડ ઓલિગોસેકરાઇડ હોય છે.
આકૃતિ S9 (ઇલેક્ટ્રોનિક પૂરક સામગ્રીમાં પદ્ધતિઓ જોઈ શકાય છે) માં બતાવ્યા પ્રમાણે, ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકના LC-MS વિશ્લેષણમાંથી અન્ય એક રસપ્રદ નિષ્કર્ષ દોરવામાં આવ્યો હતો.ACN-B અપૂર્ણાંકના બંધન દરમિયાન હેક્સોઝ અને -OAc જૂથોના ટુકડાઓ વારંવાર જોવા મળ્યા હતા.આ શોધ માત્ર ગ્લાયકોમ અને MALDI-TOF વિશ્લેષણમાં જોવા મળેલા ફ્રેગમેન્ટેશનની પુષ્ટિ કરે છે, પરંતુ પ્રિટિટેડ લિગ્નોસેલ્યુલોસિક બાયોમાસમાં સંભવિત કાર્બોહાઇડ્રેટ ડેરિવેટિવ્ઝ વિશે નવી માહિતી પણ પ્રદાન કરે છે.
અમે TMS સુગર ડેરિવેટાઇઝેશનનો ઉપયોગ કરીને ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકની ખાંડની રચનાનું પણ વિશ્લેષણ કર્યું.GC-MS નો ઉપયોગ કરીને, અમે ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંક (ફિગ. 5) માં ન્યુરલ (બિન-ડેરિવેટિવ) અને એસિડિક શર્કરા (GluA અને GalA) ની રચના નક્કી કરી.ગ્લુકોરોનિક એસિડ એસિડિક ઘટકો C અને Dમાં જોવા મળે છે, જ્યારે ગેલેક્ટ્યુરોનિક એસિડ એસિડિક ઘટકો A અને Bમાં જોવા મળે છે, જે બંને એસિડિક શર્કરાના ઉચ્ચ ડીપી ઘટકો છે.આ પરિણામો ફક્ત અમારા ELISA અને MALDI ડેટાની પુષ્ટિ કરતા નથી, પરંતુ ઓલિગોસેકરાઇડ સંચયના અમારા અગાઉના અભ્યાસો સાથે પણ સુસંગત છે.તેથી, અમે માનીએ છીએ કે ઓલિગોસેકરાઇડ્સના બાયોટિનાઇલેશન અને અનુગામી ELISA સ્ક્રિનિંગનો ઉપયોગ કરીને આધુનિક રોગપ્રતિકારક પદ્ધતિઓ વિવિધ જૈવિક નમૂનાઓમાં દ્રાવ્ય રિકેલસીટ્રન્ટ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ શોધવા માટે પૂરતી છે.
ELISA-આધારિત mAb સ્ક્રિનિંગ પદ્ધતિઓને વિવિધ પદ્ધતિઓ દ્વારા માન્ય કરવામાં આવી હોવાથી, અમે આ નવી જથ્થાત્મક પદ્ધતિની સંભવિતતાને વધુ અન્વેષણ કરવા માગીએ છીએ.બે વ્યાપારી ઓલિગોસેકરાઇડ્સ, ઝાયલોહેક્સાસેકરાઇડ ઓલિગોસેકરાઇડ (XHE) અને 23-α-L-એરાબીનોફ્યુરાનોસિલ-ઝાયલોટ્રિઓઝ (A2XX), સેલ વોલ ગ્લાયકેનને લક્ષ્યાંકિત કરતા નવા mAb અભિગમનો ઉપયોગ કરીને ખરીદવામાં આવ્યા હતા અને પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યા હતા.આકૃતિ 6 બાયોટીનીલેટેડ બાઈન્ડીંગ સિગ્નલ અને ઓલિગોસેકરાઈડ સાંદ્રતાના લોગ સાંદ્રતા વચ્ચે રેખીય સહસંબંધ દર્શાવે છે, સંભવિત લેંગમુઈર શોષણ મોડેલ સૂચવે છે.mAbs માં, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, અને CCRC-M151 XHE સાથે સહસંબંધ ધરાવે છે, અને CCRC-M108, CCRC-M109, અને LM11 એ 1 થી 01m ની રેન્જમાં A2XX સાથે સહસંબંધ ધરાવે છે.પ્રયોગ દરમિયાન એન્ટિબોડીઝની મર્યાદિત ઉપલબ્ધતાને કારણે, દરેક ઓલિગોસેકરાઇડ સાંદ્રતા સાથે મર્યાદિત પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા.અહીં એ નોંધવું જોઇએ કે કેટલાક એન્ટિબોડીઝ સબસ્ટ્રેટ તરીકે સમાન ઓલિગોસેકરાઇડ પર ખૂબ જ અલગ રીતે પ્રતિક્રિયા આપે છે, સંભવતઃ કારણ કે તેઓ સહેજ અલગ એપિટોપ્સ સાથે જોડાય છે અને ખૂબ જ અલગ બંધનકર્તા જોડાણો ધરાવી શકે છે.જ્યારે વાસ્તવિક નમૂનાઓ પર નવો mAb અભિગમ લાગુ કરવામાં આવશે ત્યારે ચોક્કસ એપિટોપ ઓળખની પદ્ધતિઓ અને અસરો વધુ જટિલ હશે.
વિવિધ ગ્લાયકેન-લક્ષિત mAbs ની શોધ શ્રેણી નક્કી કરવા માટે બે વ્યવસાયિક ઓલિગોસેકરાઇડ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.અહીં, ઓલિગોસેકરાઇડ સાંદ્રતાના લોગ સાંદ્રતા સાથે રેખીય સહસંબંધો (A) mAb સાથે XHE અને mAb સાથે A2XX માટે લેંગમુઇર શોષણ પેટર્ન સૂચવે છે.અનુરૂપ એપિટોપ્સ એસેમાં સબસ્ટ્રેટ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાતા વ્યવસાયિક ઓલિગોસેકરાઇડ્સની રચના સૂચવે છે.
ગ્લાયકેન-લક્ષિત મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ (ગ્લાયકોકોમિક વિશ્લેષણ અથવા ELISA-આધારિત mAb સ્ક્રીનીંગ) એ છોડના બાયોમાસ બનાવે છે તે મોટા ભાગની મુખ્ય કોષ દિવાલ ગ્લાયકેન્સની ઊંડાણપૂર્વક લાક્ષણિકતા માટે એક શક્તિશાળી સાધન છે.જો કે, શાસ્ત્રીય ગ્લાયકેન વિશ્લેષણ માત્ર મોટી કોષ દિવાલ ગ્લાયકેનને જ દર્શાવે છે, કારણ કે મોટાભાગના ઓલિગોસેકરાઈડ ELISA પ્લેટો પર અસરકારક રીતે સ્થિર થતા નથી.આ અભ્યાસમાં, AFEX-પ્રીટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવરને ઉચ્ચ ઘન સામગ્રી પર એન્ઝાઇમેટિકલી હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ કરવામાં આવ્યું હતું.સુગર વિશ્લેષણનો ઉપયોગ હાઇડ્રોલીઝેટમાં રિકેલસીટ્રન્ટ સેલ વોલ કાર્બોહાઇડ્રેટ્સની રચના નક્કી કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.જો કે, હાઇડ્રોલિસેટ્સમાં નાના ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું mAb વિશ્લેષણ ઓછું આંકવામાં આવ્યું છે, અને ELISA પ્લેટો પર ઓલિગોસેકરાઇડ્સને અસરકારક રીતે સ્થિર કરવા માટે વધારાના સાધનોની જરૂર છે.
અમે અહીં ન્યુટ્રએવિડિન™ કોટેડ પ્લેટ્સ પર ELISA સ્ક્રીનીંગ દ્વારા અનુસરવામાં આવેલ ઓલિગોસેકરાઇડ બાયોટીનીલેશનને સંયોજિત કરીને mAb સ્ક્રીનીંગ માટે એક નવીન અને કાર્યક્ષમ ઓલિગોસેકરાઇડ સ્થાવર પદ્ધતિની જાણ કરીએ છીએ.સ્થાવર બાયોટીનીલેટેડ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ એ એન્ટિબોડી માટે પર્યાપ્ત આકર્ષણ દર્શાવ્યું હતું જેથી રિકેલસીટ્રન્ટ ઓલિગોસેકરાઇડ્સની ઝડપી અને કાર્યક્ષમ તપાસ કરવામાં સક્ષમ બને.માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી પર આધારિત આ હઠીલા ઓલિગોસેકરાઇડ્સની રચનાના વિશ્લેષણે ઇમ્યુનોસ્ક્રીનિંગ માટેના આ નવા અભિગમના પરિણામોની પુષ્ટિ કરી.આમ, આ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે ગ્લાયકન-લક્ષિત મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ સાથે ઓલિગોસેકરાઇડ બાયોટીનીલેશન અને ELISA સ્ક્રીનીંગના સંયોજનનો ઉપયોગ ઓલિગોસેકરાઇડ્સમાં ક્રોસલિંક શોધવા માટે કરી શકાય છે અને ઓલિગોસેકરાઇડ્સની રચનાને દર્શાવતા અન્ય બાયોકેમિકલ અભ્યાસોમાં વ્યાપકપણે લાગુ કરી શકાય છે.
આ બાયોટિન-આધારિત ગ્લાયકેન પ્રોફાઇલિંગ પદ્ધતિ એ પ્રથમ અહેવાલ છે જે છોડના બાયોમાસમાં દ્રાવ્ય ઓલિગોસેકરાઇડ્સના રિકેલસીટ્રન્ટ કાર્બોહાઇડ્રેટ બોન્ડની તપાસ કરવામાં સક્ષમ છે.આનાથી એ સમજવામાં મદદ મળે છે કે જ્યારે બાયોમાસના કેટલાક ભાગો જૈવિક ઇંધણના ઉત્પાદનની વાત આવે ત્યારે શા માટે આટલા હઠીલા હોય છે.આ પદ્ધતિ ગ્લાયકોમ પૃથ્થકરણ પદ્ધતિઓમાં એક મહત્વપૂર્ણ અંતર ભરે છે અને તેના ઉપયોગને છોડના ઓલિગોસેકરાઇડ્સ ઉપરાંત સબસ્ટ્રેટની વિશાળ શ્રેણી સુધી વિસ્તરે છે.ભવિષ્યમાં, અમે બાયોટિનિલેશન માટે રોબોટિક્સનો ઉપયોગ કરી શકીએ છીએ અને ELISA નો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓના ઉચ્ચ-થ્રુપુટ વિશ્લેષણ માટે અમે વિકસિત કરેલી પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરી શકીએ છીએ.
પાયોનિયર 33A14 હાઇબ્રિડ બીજમાંથી ઉગાડવામાં આવેલ કોર્ન સ્ટ્રો (CS) 2010 માં રે, કોલોરાડોમાં ક્રેમર ફાર્મ્સમાંથી લણણી કરવામાં આવી હતી.જમીન માલિકની પરવાનગી સાથે, આ બાયોમાસનો સંશોધન માટે ઉપયોગ કરી શકાય છે. નમૂનાઓ ઓરડાના તાપમાને ઝિપ-લોક બેગમાં શુષ્ક <6% ભેજ સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા. નમૂનાઓ ઓરડાના તાપમાને ઝિપ-લોક બેગમાં શુષ્ક <6% ભેજ સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. ઓરડાના તાપમાને ઝિપરવાળી બેગમાં <6% ભેજ પર નમૂનાઓ સૂકા સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. 6% થી વધુ ભેજ સાથે ઓરડાના તાપમાને ઝિપર બેગમાં નમૂનાઓ સંગ્રહિત કરવામાં આવે છે.અભ્યાસ સ્થાનિક અને રાષ્ટ્રીય દિશાનિર્દેશોનું પાલન કરે છે.NREL પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરીને રચનાત્મક વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.આ રચનામાં 31.4% ગ્લુકેન, 18.7% ઝાયલાન, 3.3% અરાબીનન, 1.2% ગેલેક્ટાન, 2.2% એસિટિલ, 14.3% લિગ્નીન, 1.7% પ્રોટીન અને 13. 4% રાખ હોવાનું જણાયું હતું.
Cellic® CTec2 (138 mg પ્રોટીન/ml, lot VCNI 0001) નોવોઝાઇમ્સ (ફ્રેન્કલિંટન, NC, USA)માંથી સેલ્યુલેઝ, β-ગ્લુકોસિડેઝ અને Cellic® HTec2 (157 mg પ્રોટીન/ml, lot VHN00001)નું જટિલ મિશ્રણ છે.મલ્ટિફેક્ટ પેક્ટીનેઝ® (72 મિલિગ્રામ પ્રોટીન/એમએલ), પેક્ટીન ડિગ્રેઝિંગ એન્ઝાઇમનું જટિલ મિશ્રણ, ડ્યુપોન્ટ ઇન્ડસ્ટ્રિયલ બાયોસાયન્સિસ (પાલો અલ્ટો, CA, યુએસએ) દ્વારા દાન કરવામાં આવ્યું હતું.કેજેલ્ડહલ નાઇટ્રોજન વિશ્લેષણ (AOAC પદ્ધતિ 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીન સામગ્રીનો અંદાજ (અને બિન-પ્રોટીન નાઇટ્રોજનના યોગદાનને બાદ કરીને) એન્ઝાઇમ પ્રોટીન સાંદ્રતા નક્કી કરવામાં આવી હતી.ડાયટોમેસિયસ અર્થ 545 EMD મિલિપોર (બિલેરિકા, MA) પાસેથી ખરીદવામાં આવ્યું હતું.સક્રિય કાર્બન (DARCO, 100 મેશ ગ્રાન્યુલ્સ), એવિસેલ (PH-101), બીચ ઝાયલાન અને અન્ય તમામ રસાયણો સિગ્મા-આલ્ડ્રિચ (સેન્ટ લૂઇસ, એમઓ) પાસેથી ખરીદવામાં આવ્યા હતા.
AFEX પ્રીટ્રીટમેન્ટ GLBRC (બાયોમાસ કન્વર્ઝન રિસર્ચ લેબોરેટરી, MSU, લેન્સિંગ, MI, USA) ખાતે કરવામાં આવી હતી.પૂર્વ-સારવાર 140 ડિગ્રી સેલ્સિયસ તાપમાને 15 મિનિટ માટે કરવામાં આવી હતી.સ્ટેનલેસ સ્ટીલ બેન્ચટોપ બેચ રિએક્ટર (પાર ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ્સ કંપની) માં 60% (w/w) લોડિંગ પર નિર્જળ એમોનિયા અને બાયોમાસના 1:1 ગુણોત્તરમાં 46 નિવાસનો સમય.તેમાં 30 મિનિટ લાગી.રિએક્ટરને 140 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર લાવવામાં આવ્યું હતું અને એમોનિયાને ઝડપથી મુક્ત કરવામાં આવ્યો હતો, જેનાથી બાયોમાસ ઝડપથી ઓરડાના તાપમાને પરત આવી શકે છે.AFEX પ્રી-ટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવર (ACS) ની રચના અનટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવર (UT-CS) જેવી જ હતી.
ઉચ્ચ ઘન ACSH 25% (w/w) (આશરે 8% ડેક્સ્ટ્રાન લોડિંગ) ઓલિગોસેકરાઇડ્સના મોટા પાયે ઉત્પાદન માટે પ્રારંભિક સામગ્રી તરીકે તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું.Cellic® Ctec2 10 mg પ્રોટીન/g ગ્લુકન (પ્રીટ્રીટેડ બાયોમાસમાં), Htec2 (નોવોઝાઇમ્સ, ફ્રેન્કલિંટન, NC), 5 મિલિગ્રામ પ્રોટીન/જી ગ્લુકન અને મલ્ટિફેક્ટ પેક્ટીનેઝ (જેનકોર ઇન્ક, યુએસએ) સહિત કોમર્શિયલ એન્ઝાઇમ મિશ્રણનો ઉપયોગ કરીને ACS નું એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ કરવામાં આવ્યું હતું.).), 5 મિલિગ્રામ પ્રોટીન/જી ડેક્સ્ટ્રાન.એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ 5-લિટર બાયોરિએક્ટરમાં 3 લિટર, pH 4.8, 50°C અને 250 rpm ના કાર્યકારી વોલ્યુમ સાથે હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું.96 કલાક સુધી હાઈડ્રોલિસિસ કર્યા પછી, હાઈડ્રોલાઈઝેટને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા 6000 આરપીએમ પર 30 મિનિટ માટે અને પછી 14000 આરપીએમ પર 30 મિનિટ માટે બિનહાઈડ્રોલાઈઝ્ડ ઘન પદાર્થોને દૂર કરવા માટે એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું.ત્યારબાદ 0.22 મીમી ફિલ્ટર બીકર દ્વારા હાઇડ્રોલીઝેટને જંતુરહિત ગાળણને આધિન કરવામાં આવ્યું હતું.ફિલ્ટર કરેલ હાઇડ્રોલીઝેટને જંતુરહિત બોટલોમાં 4° સે. પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું અને પછી કાર્બન પર વિભાજન કરવામાં આવ્યું હતું.
NREL પ્રયોગશાળા વિશ્લેષણ પ્રક્રિયાઓ અનુસાર અર્ક-આધારિત બાયોમાસ નમૂનાઓની રચનાનું વિશ્લેષણ: રચના વિશ્લેષણ માટે નમૂનાઓની તૈયારી (NREL/TP-510-42620) અને બાયોમાસમાં માળખાકીય કાર્બોહાઇડ્રેટ્સ અને લિગ્નિનનું નિર્ધારણ (NREL/TP-510) – 4718.
ઓટોક્લેવ-આધારિત એસિડ હાઇડ્રોલિસિસ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને હાઇડ્રોલિઝેટ સ્ટ્રીમનું ઓલિગોસેકરાઇડ વિશ્લેષણ 2 મિલી સ્કેલ પર કરવામાં આવ્યું હતું.10 મિલી સ્ક્રુ કેપ કલ્ચર ટ્યુબમાં 69.7 µl 72% સલ્ફ્યુરિક એસિડ સાથે હાઈડ્રોલાઈઝેટ નમૂનાને મિક્સ કરો અને 121 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર બેન્ચટૉપ પર 1 કલાક માટે સેવન કરો, બરફ પર ઠંડુ કરો અને ઉચ્ચ પ્રદર્શન પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી (HPLC) શીશીમાં ફિલ્ટર કરો.ઓલિગોસેકરાઇડ્સની સાંદ્રતા બિન-હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ નમૂનામાં મોનોસેકરાઇડ્સની સાંદ્રતાને એસિડ-હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ નમૂનામાં કુલ ખાંડની સાંદ્રતામાંથી બાદ કરીને નક્કી કરવામાં આવી હતી.
બાયો-રેડ એમીનેક્સ HPX-87H કૉલમ પર ઑટોસેમ્પલર, કૉલમ હીટર, આઇસોક્રેટિક પંપ અને રીફ્રેક્ટિવ ઇન્ડેક્સ ડિટેક્ટરથી સજ્જ શિમાડઝુ HPLC સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને એસિડ હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ બાયોમાસમાં ગ્લુકોઝ, ઝાયલોઝ અને અરેબિનોઝ સાંદ્રતાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.કોલમ 50°C પર જાળવવામાં આવી હતી અને પાણીમાં 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 સાથે એલ્યુટ કરવામાં આવી હતી.પ્રવાહ
હાઇડ્રોલીઝેટ સુપરનેટન્ટને પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું અને મોનોમર અને ઓલિગોસેકરાઇડ સામગ્રી માટે વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.બાયો-રેડ (હર્ક્યુલસ, CA) એમીનેક્સ HPX-87P કૉલમ અને એશ ગાર્ડ કૉલમથી સજ્જ HPLC દ્વારા એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ પછી મેળવેલી મોનોમેરિક શર્કરાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.સ્તંભનું તાપમાન 80°C પર જાળવવામાં આવ્યું હતું, પાણીનો ઉપયોગ 0.6 ml/min ના પ્રવાહ દર સાથે મોબાઈલ તબક્કા તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.ઓલિગોસેકરાઇડ્સ રેફ્સમાં વર્ણવેલ પદ્ધતિઓ અનુસાર 121 ° સે પર પાતળા એસિડમાં હાઇડ્રોલિસિસ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.41, 48, 49.
અગાઉ વર્ણવેલ પ્રક્રિયાઓ 27, 43, 50, 51 નો ઉપયોગ કરીને કાચા, AFEX પૂર્વ-સારવાર અને તમામ બિન-હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ બાયોમાસ અવશેષો (સીરીયલ સેલ વોલ અર્કના ઉત્પાદન અને તેમના mAb સ્ક્રીનીંગ સહિત) પર સેકરાઇડ વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ગ્લાયકોમ વિશ્લેષણ માટે, બાયોમાસ અવશેષોમાંથી છોડની કોષ દિવાલ સામગ્રીના આલ્કોહોલ-અદ્રાવ્ય અવશેષો તૈયાર કરવામાં આવે છે અને એમોનિયમ ઓક્સાલેટ (50 એમએમ), સોડિયમ કાર્બોનેટ (50 એમએમ અને 0.5% w/v), CON જેવા વધુને વધુ આક્રમક રીએજન્ટ્સ સાથે શ્રેણીબદ્ધ નિષ્કર્ષણને આધિન કરવામાં આવે છે.(1M અને 4M, બંને 1% w/v સોડિયમ બોરોહાઇડ્રાઇડ સાથે) અને એસિડ ક્લોરાઇટ અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે 52,53.પછી અર્કને સેલ વોલ ગ્લાયકેન તરફ નિર્દેશિત mAb50s ની જટિલ પેનલ સામે ELISA ને આધિન કરવામાં આવ્યું હતું, અને mAb બંધનકર્તા પ્રતિક્રિયાઓ હીટ મેપ તરીકે રજૂ કરવામાં આવી હતી.mAbs લેબોરેટરી સ્ટોક્સ (CCRC, JIM અને MAC શ્રેણી) માંથી પ્લાન્ટ સેલ વોલ ગ્લાયકેનને લક્ષ્યાંકિત કરે છે.
ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું વન-સ્ટેપ બાયોટિનાઇલેશન.બાયોટિન-એલસી-હાઈડ્રેઝાઈડ સાથે કાર્બોહાઈડ્રેટ્સનું જોડાણ નીચેની પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.બાયોટિન-એલસી-હાઈડ્રેઝાઈડ (4.6 mg/12 μmol) 1 મિનિટ માટે 65° C. પર જોરશોરથી હલાવીને અને ગરમ કરીને ડાયમિથાઈલ સલ્ફોક્સાઇડ (DMSO, 70 μl) માં ઓગળવામાં આવ્યું હતું.ગ્લેશિયલ એસિટિક એસિડ (30 µl) ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને મિશ્રણને સોડિયમ સાયનોબોરોહાઇડ્રેડ (6.4 mg/100 µmol) પર રેડવામાં આવ્યું હતું અને લગભગ 1 મિનિટ માટે 65° C પર ગરમ કર્યા પછી સંપૂર્ણપણે ઓગળી ગયું હતું.પછી, 5 થી 8 μl સુધી પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ સૂકા ઓલિગોસેકરાઇડ (1-100 nmol) માં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું જેથી ઘટાડતા છેડા પર લેબલની 10-ગણી અથવા વધુ દાઢ વધારે હોય.પ્રતિક્રિયા 2 કલાક માટે 65 ° સે પર હાથ ધરવામાં આવી હતી, ત્યારબાદ નમૂનાઓ તરત જ શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા.લેબલીંગ પ્રયોગોમાં ઘટાડો કર્યા વિના કોઈ સોડિયમ સાયનોબોરોહાઇડ્રેડનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો ન હતો, અને નમૂનાઓ 2.5 કલાક માટે 65° C પર પ્રતિક્રિયા આપવામાં આવ્યા હતા.
ELISA કોટિંગ અને બાયોટિનલેટેડ ઓલિગોસેકરાઇડ્સના નમૂનાઓ ધોવા.એવિડિન-કોટેડ પ્લેટના દરેક કૂવામાં 25 μl બાયોટિનિલેટેડ નમૂનાઓ (0.1 M ટ્રિસ બફર સોલ્યુશન (ટીબીએસ) ના 5 મિલીલીટરમાં 100 μl દરેક કેન્દ્રિત નમૂના ઉમેરવામાં આવ્યા હતા.નિયંત્રણ કુવાઓ 0.1 M TBS માં 10 μg/ml ની સાંદ્રતામાં 50 μl બાયોટિન સાથે કોટેડ હતા.ડીયોનાઇઝ્ડ પાણીનો ઉપયોગ ખાલી માપ માટે કોટિંગ તરીકે થતો હતો.ટેબ્લેટને અંધારામાં ઓરડાના તાપમાને 2 કલાક સુધી સેવન કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રોગ્રામ નંબરનો ઉપયોગ કરીને 0.1 M TBS માં 0.1% સ્કિમ્ડ દૂધ વડે પ્લેટને 3 વખત ધોઈ લો.ગ્રેનિયર ફ્લેટ 3A માટે 11.
પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝનો ઉમેરો અને ધોવા.દરેક કૂવામાં 40 µl પ્રાથમિક એન્ટિબોડી ઉમેરો.અંધારામાં ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે માઇક્રોપ્લેટને ઉકાળો.ત્યારબાદ ગ્રેનિયર ફ્લેટ 3A માટે વોશ પ્રોગ્રામ #11 નો ઉપયોગ કરીને પ્લેટોને 0.1% દૂધ સાથે 0.1M TBS માં 3 વખત ધોવામાં આવી હતી.
ગૌણ એન્ટિબોડી ઉમેરો અને ધોવા.દરેક કૂવામાં 50 µl માઉસ/ઉંદર ગૌણ એન્ટિબોડી (0.1 M TBS માં 0.1% દૂધમાં 1:5000 પાતળું) ઉમેરો.અંધારામાં ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે માઇક્રોપ્લેટને ઉકાળો.ત્યારબાદ ગ્રેનિયર ફ્લેટ 5A પ્લેટ વોશ પ્રોગ્રામ #12 નો ઉપયોગ કરીને માઇક્રોપ્લેટને 0.1 M TBS માં 0.1% દૂધ સાથે 5 વખત ધોવામાં આવી હતી.
સબસ્ટ્રેટ ઉમેરી રહ્યા છીએ.બેઝ સબસ્ટ્રેટમાં 50 µl નું 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ઉમેરો (બફરના 2 ટીપાં, TMBનાં 3 ટીપાં, 15 મિલી ડીયોનાઇઝ્ડ પાણીમાં હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડનાં 2 ટીપાં ઉમેરીને).TMB સબસ્ટ્રેટ તૈયાર કરો.અને ઉપયોગ પહેલાં વમળ).30 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને માઇક્રોપ્લેટને ઉકાળો.અંધારા માં.
પગલું પૂર્ણ કરો અને ટેબ્લેટ વાંચો.દરેક કૂવામાં 50 µl 1 N સલ્ફ્યુરિક એસિડ ઉમેરો અને ELISA રીડરનો ઉપયોગ કરીને 450 થી 655 nm સુધીના શોષણને રેકોર્ડ કરો.
ડીયોનાઇઝ્ડ પાણીમાં આ વિશ્લેષકોના 1 mg/ml ઉકેલો તૈયાર કરો: એરાબીનોઝ, રેમનોઝ, ફ્યુકોઝ, ઝાયલોઝ, ગેલેક્ટોરોનિક એસિડ (GalA), ગ્લુકોરોનિક એસિડ (GlcA), મેનોઝ, ગ્લુકોઝ, ગેલેક્ટોઝ, લેક્ટોઝ, N-acetylmanosamine (mantyNAglucosamine),(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (આંતરિક ધોરણ).કોષ્ટક 1 માં દર્શાવેલ 1 mg/mL ખાંડના ઉકેલો ઉમેરીને બે ધોરણો તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા. જ્યાં સુધી તમામ પાણી દૂર ન થાય ત્યાં સુધી નમૂનાઓ સ્થિર થાય છે અને -80° C પર લાયોફિલાઇઝ્ડ થાય છે (સામાન્ય રીતે લગભગ 12-18 કલાક).
વિશ્લેષણાત્મક સંતુલન પર સ્ક્રૂ કેપ ટ્યુબ માટે 100-500 µg નમૂના ઉમેરો.ઉમેરેલી રકમ રેકોર્ડ કરો.નમૂનાને દ્રાવકની ચોક્કસ સાંદ્રતામાં વિસર્જન કરવું અને તેને પ્રવાહી અલિક્વોટ તરીકે ટ્યુબમાં ઉમેરવાનું શ્રેષ્ઠ છે.દરેક સેમ્પલ ટ્યુબ માટે આંતરિક ધોરણ તરીકે 20 μl 1 mg/ml inositol નો ઉપયોગ કરો.નમૂનામાં ઉમેરવામાં આવેલ આંતરિક ધોરણની માત્રા પ્રમાણભૂત ટ્યુબમાં ઉમેરવામાં આવેલ આંતરિક ધોરણની માત્રા જેટલી જ હોવી જોઈએ.
સ્ક્રુ કેપ શીશીમાં 8 મિલી નિર્જળ મિથેનોલ ઉમેરો.પછી 3 N. મિથેનોલિક HCl સોલ્યુશનના 4 મિલી, કેપ્ડ અને હલાવો.આ પ્રક્રિયામાં પાણીનો ઉપયોગ થતો નથી.
ઓલિગોસેકરાઇડના નમૂનાઓ અને પ્રમાણભૂત TMS ટ્યુબમાં 500 µl 1 M HCl મિથેનોલ સોલ્યુશન ઉમેરો.નમૂનાઓ થર્મલ બ્લોકમાં 80° C પર રાતોરાત (168 કલાક) ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.ડ્રાયિંગ મેનીફોલ્ડનો ઉપયોગ કરીને ઓરડાના તાપમાને મિથેનોલિસિસ ઉત્પાદનને સૂકવી દો.200 μl MeOH ઉમેરો અને ફરીથી સૂકવો.આ પ્રક્રિયા બે વાર પુનરાવર્તિત થાય છે.નમૂનામાં 200 µl મિથેનોલ, 100 µl પાયરીડીન અને 100 µl એસિટિક એનહાઈડ્રાઈડ ઉમેરો અને સારી રીતે ભળી દો.નમૂનાઓ 30 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.અને સૂકા.200 µl મિથેનોલ ઉમેરો અને ફરીથી સૂકવો.
200 µl Tri-Sil ઉમેરો અને 20 મિનિટ માટે કેપ્ડ ટ્યુબ ગરમ કરો.80 ° સે, પછી ઓરડાના તાપમાને ઠંડુ થાય છે.અંદાજે 50 μl ની માત્રામાં નમૂનાને વધુ સૂકવવા માટે ડ્રાયિંગ મેનીફોલ્ડનો ઉપયોગ કરો.એ નોંધવું અગત્યનું છે કે અમે નમૂનાઓને સંપૂર્ણપણે સૂકવવા દીધા નથી.
2 મિલી હેક્સેન ઉમેરો અને વમળ દ્વારા સારી રીતે ભળી દો.5-3/4 ઇંચ વ્યાસની પીપેટની ટોચ પર કાચની ઊન નાખીને પાશ્ચર પાઈપેટ્સ (5-8 મીમી)ની ટીપ્સને કાચના ઊનના ટુકડાથી ભરો.નમૂનાઓને 2 મિનિટ માટે 3000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા.કોઈપણ અદ્રાવ્ય અવશેષો અવક્ષેપિત થાય છે.નમૂનાને 100-150 μl સુધી સૂકવો.GC-MS માં 80 °C ના પ્રારંભિક તાપમાન અને 2.0 મિનિટના પ્રારંભિક સમય (કોષ્ટક 2) પર આશરે 1 μl નું વોલ્યુમ ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું.