Gratias tibi ago pro natura.com adire.Versio navigatoris utens quam subsidia limitata CSS habet.Ad optimam experientiam commendamus ut navigatro renovato uteris (vel inactivare Compatibilitas Modus in Penitus Rimor).Interea, ut subsidia continua conservent, locum sine stylis et JavaScript reddemus.
Novae methodi spectrometriae immunologicae et massae pro complexa analysis oligosaccharidis in annona cum AFEX pervicax.Biomass lignocellulosica alternatio sustentabilis est ad fossilias fossilias et late ad explicandas biotechnologias ad producendos fructus, sicut ad cibum, nutrimentum, fomenta et oeconomiam.Clavis harum technologiarum est evolutio processuum cost-competitivi ad carbohydratos implicatos convertendi in parietibus cellularum plantarum in saccharos simplices, sicut glucose, xylosum et arabinosum.Quoniam biomass lignocellulosicus valde contumax est, subici debet curationibus thermochemicis (eg, ammoniaci fibra exfoliatione (AFEX), acida diluta (DA), liquidis ionicis (IL)) et curationibus biologicis (eg, hydrolysi enzymatico et fermento microbiali) in compositione ad productum desideratum obtinendum..Attamen, cum enzymes commerciales fungali in hydrolysi processu adhibentur, solum 75-85% saccharorum solutorum formatorum sunt monosaccharides, reliquae 15-25% sunt solubiles, oligosaccharides intractabiles, quae microorganismis non semper praesto sunt.Antea, feliciter solutum et obstinatum oligosaccharides remotum et purgatum utentes compositione carbonis et diatomaceae terrae separationis et magnitudine exclusionis chromatographiae, necnon earum enzyme inhibitoriae proprietates investigaverunt.Invenimus oligosaccharides in quo altiorem gradum polymerizationis (DP) methylated substitutionum acidum uronicum difficiliores sunt processus cum enzyme commerciali mixtionis quam humilis DP et neutra oligosaccharides.Hic pluribus additis methodis adhibitis, glycanis profilingis utentes elementorum monoclonales (mAbs) specificas utentes glycans glycanos plantare ad designandum ligamenta glycanorum in parietibus cellulis et hydrolysata enzymatica, matrix adiuvatae laser desorptionis ionizationis, temporis fugae mass- spectrometriae..MALDI-TOF-MS) utitur cacumina diagnostica informativa structurae spectroscopiae consecuta post corruptionem secundae nega- tionis, chromatographiae gasi et spectrometriae massae (GC-MS) ad vincula oligosaccharidis notanda cum sine derivatione.Ob parvitatem oligosaccharidum (DP 4-20), hae moleculae difficilia sunt ad usum ligaminis et characterisationum.Ad hanc quaestionem vincendam, novam methodum oligosaccharidis immobilizationis biotin-fundatae applicavimus, quae feliciter maiorem oligosaccharidum in superficie microplatis solubilem DP demissam appellavimus, quae tum in alta perput mAb systemate analysi certae ligationis adhibita est.Haec nova methodus progressionem altiorum altiorum per tentationes glycomes in futuro faciliorem reddet quae adhiberi potest ad segregare et denotare oligosaccharides quae in biomarkers pro diagnostica proposita sunt.
Biomass lignocellulosica, composita ex agriculturae, arboribus, herba et materiis ligneis, potentia pascendi est ad productionem productorum bio-fundatorum, incluso cibo, nutrimento, nutrimento et chemica praecursoribus ad praestantiora producta1 producendum.Carbohydratae (ut cellulosae et hemicellulosae) in parietibus cellularum plantis in monosaccharides depolymerantur per processum chemicum et biotransformationem (ut hydrolytica enzymatica et fermentatio microbialis).Communes prae curationes includunt expansionem ammoniacam fibram (AFEX), acidum dilutum (DA), liquorem ionicum (IL), et explosionem vaporis (SE), quibus chemicis et calore coniuncti utuntur ad productionem lignocellulosam reducendam per foramen parietis cellulae plantae 3,4.Pervicacia materiae, 5. Hydrolysis enzymatica exercetur in solidorum magno onere utendo commerciali activo carbohydrato continente enzymes (CAZymes) et fermentatio microbialis utens fermentis transgenicis seu bacteria ad producendas fomenta et chemicals bio-fundatas.
CAZymes in enzymis commercialibus componitur ex mixtione enzymorum quae synergistice complexa vincula carbohydratorum saccharo inhaerent ad monosaccharides2,7.Ut supra retulimus, complexus retis polymerorum lignini aromatici cum carbohydratibus eos valde intractabiles facit, quae ducit ad conversionem saccharum incompletam, cumulando 15-25% de sex oligosaccharidibus quae non gignuntur in hydrolysi enzymatica biomassis praelatae.Hoc problema commune est cum variis modis praetractationis biomass.Nonnullae rationes huius bottleneck enzyme inhibitionis in hydrolysi includunt, vel absentia vel humilis gradus essentialium enzymorum essentialium, quae ligamenta saccharo frangere requiruntur in taeda plantarum.Intellectus compositionis et structurarum notarum saccharorum, ut saccharum vincula in oligosaccharide, adiuvabit nos ad conversionem saccharo emendandam in hydrolysi, faciens processus biotechnologicos sumptus-competitivos cum productis petroleum derivatis.
Carbohydratorum structuram determinans provocat et requirit iuncturam methodorum ut chromatographia liquida (LC) 11, 12, spectroscopia magnetica nuclearis (NMR) 13, electrophoresis capillaris (CE) 14, 15, 16, et spectrometriae massae (MS)17.duodeviginti.Modi MS, ut temporis spectrometriae massae fugae cum laser desorptione et ionizatione matricis utentis (MALDI-TOF-MS) versatile sunt methodus ad structuras carbohydratas identificandas.Nuper, collisio-dissociatio (CID) tandem MS sodium ion adductorum late adhibita est ad cognoscendos digitos oligosaccharidis appositos positiones affectus, anomericas figurationes, sequentia et ramosa loca 20, 21 .
Praeclarum instrumentum ad identitatem carbohydratorum ligaturae Glycanae est.Haec methodus utitur elementis monoclonalibus (mAbs) ordinatis ad murum cellulam glycani plantandi sicut rimatur ad nexus carbohydratorum complexorum intelligendos.Plus quam 250 mAbs praesto sunt terrarum terrarum, contra varias lineares et ramosas oligosaccharidas dispositae utentes variis saccharidis 24 .Plures mAbs late ad designandam structuram, compositionem et modificationes muri cellulae plantae adhibitae sunt, sicut differentiae significantes secundum genus cellularum plantarum, organum, aetas, scaena progressus et incrementum environment25,26.Recentius haec methodus adhibita est ad intellegendas vesiculas incolas in systematibus plantarum et animali et earum functiones in glycanis onerariis secundum determinatas subcellulares, periodos progressus, aut stimulos environmentales et enzymaticas operationes determinare.Quaedam e diversis structurae glycanorum et xylanum quae notae sunt, pectinem (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), vinculum glucans mixtum (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), acidi glucuronic-arabinoxylan (GArbX) et arabino-a.
Tamen, non obstante his omnibus investigationibus nisus, pauca tantum studia naturam oligosaccharidis accumulationis in solidorum magnorum onere (HSL) hydrolysi inclusis, inclusa oligosaccharidis missione, catenae oligomericanae in hydrolysi, variis polymerorum humilibus DP, earumque curvarum mutationibus posuerunt.distributiones 30,31,32.Interim, licet analysis glycanae utile instrumentum esse pro analysi glycanae structurae comprehensivae probatum sit, difficile est DP oligosaccharides uti anticorporum methodos, aquam solubilem aestimare.Minor DP oligosaccharides cum pondere hypothetico minus quam 5-10 kda ad laminas ELISA 33, 34 et ante anticorpus additionem abluuntur.
Hic primum demonstramus ELISA tentationem de laminis avidin-colatis utentibus elementis monoclonalibus, unum gradum biotinylationis componendo procedendi refractionis oligosaccharidae cum analysi glycome solubili.Nostra accessio ad analysin glycome valida facta est a MALDI-TOF-MS et GC-MS innixa analysi oligosaccharidum nexuum complementariorum utens trimethylsilyl (TMS) derivationis derivationis saccharo hydrolyzatae compositionum.Haec novatio aditus explicari potest ut summus throughputa methodus in futuro et ampliorem applicationem in investigationibus biomedicis inveniatur.
Modificationes post-translationales enzymes et elementorum, sicut glycosylatio, eorum biologicam actionem 36 afficiunt.Exempli gratia, mutationes in glycosylatione serum servorum magni momenti partes agunt in arthritis inflammatione, et mutationes in glycosylatione adhibentur ut diagnostica notae 37 .Varii glycani in litteris relati sunt ut facile appareant in variis morbis, cum longis inflammatoriis morbi tractus gastroi et hepatis, virales contagiones, ovarii, pectoris et prostatae carcinomata 38, 39,40.Glycanorum structuram intelligendi methodi glycanorum ELISA anticorporis utendi substructio methodi diagnosis morborum additam fiduciam dabunt sine usu methodorum complexorum MS.
Praevius noster studium ostendit contumaces oligosaccharides post praetractationem et hydrolysim enzymaticam inhydrolysos manere (Figura 1).In opere nostro antehac edito, carbones solidi periodi extrahendi methodum reducuntur ad segregationem oligosaccharides ab AFEX-consecrato hydrolyzatae frugis (ACSH) 8 .Post initialem extractionem et separationem, oligosaccharides adhuc magnitudine exclusionis chromatographiae (SEC) fractae erant et ordine pondus hypotheticum colligebantur.Monomeri saccharo et oligomers e variis praetractationibus emissi sunt ab analysi saccharo compositione resoluti.Cum saccharo oligomerorum comparando varias praetractationis modos consecutus, praesentia oligosaccharidis pertinax communis problema est in conversione biomassis ad monosaccharides et ad reductionem in saccharo cede saltem 10-15% et usque ad 18% ducere potest.IIS.Haec methodus ad ulteriorem magnam scalam fractionum oligosaccharidum fractionum productione adhibita est.Inde ACH eiusque partes subsequentes cum diversis ponderibus molecularibus adhibitae sunt ut materia experimentalis pro charactere oligosaccharidis in hoc opere.
Post pretreatmentam et hydrolysim enzymaticam, oligosaccharides persistentes inhydrolysata manserunt.Hic (A) est methodus separationis oligosaccharidae qua oligosaccharides ab AFEX-pretrato hydrolyzatae (ACSH) areolae coactae carbonis et diatomaceae terrae referto utens;(B) Methodus separationis oligosaccharidis.Oligosaccharides longius a magnitudine exclusionis chromatographiae separabantur (SEC);(C) Saccharide monomeri et oligomers variis praetractationibus emissi (acidi diluti: DA, liquidi ionic: IL et AFEX).Condiciones hydrolysis enzymaticae: solidorum altae onerantium 25% (w/w) (proxime 8% glucan onerantium), hydrolysi 96 horarum, 20 mg/g enzyme commercialis onerantium (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) et (D) Monomeri saccharo et oligomerorum glucosi, xylosi et arabinosi ab AFEX (ACS prae-tractati frumentorum) emissi.
Analysis Glycana probavit utile esse instrumentum ad analysin comprehensive structuralem glycanorum in excerptis abstractis a reliquiis solidis taedae taeniae.Attamen saccharides aquae solubiles repraesentantur hac methodo traditae utentes 41 , quod pondus oligosaccharides humilis hypotheticas in laminas ELISA immobilitare difficile est et ante anticorporis additionem eluuntur.Itaque ad ligamen et characterisationem anticorporis methodus unus gradus biotinylationi solubilis, oligosaccharides non-obsequens in laminas ELISA-avidin-coactatas adhibebatur.Haec methodus tentabatur utens nostris ACS antea productis et fractione innixa suo pondere hypothetico (vel gradu polymerizationis, DP).Unus gradus biotinylationi usus est ad affinitatem ligandi oligosaccharidum augendam, addito biotin-LC-hydrazide ad finem carbohydratorum reducendum (fig. 2).In solutione, coetus hemiacetalis in fine reducendo reflectitur cum hydrazide globi biotin-LC-hydrazidi ad vinculum hydrazonis formandum.Coram agente NaCNBH3 reducendo, vinculum hydrazonum ad finem producti biotinylated stabili redactum est.Cum modificatione sacchari finem reducendi, ligamen oligosaccharides ad ELISA laminas humilis DP possibilis facta est, et in studio nostro hoc factum est in laminas avidincoactatas utentes glycan-iscopis mAbs.
Protegendo elementorum monoclonales ab ELISA pro biotinylatis oligosaccharidis fundatis.Hic (A) coniunctam biotinylationem oligosaccharidis et subsequentem ELISA protegendo cum glycan-iscopis mAbs in NeutrAvidin laminis obductis et (B) unum gradum procedendi ostendit pro biotinylatione reactionis productorum.
Avidin bracteae cum elementis oligosaccharide-conjugatis tunc additae elementis primariis et secundariis et lotae in medio levi ac sensitivo tempore.Post anticorpus ligamen completum, vul substratum adde laminam incundam.Reactio tandem facta est cum acido sulphurico.Laminae incubatae enucleatae sunt utens ELISA lectorem ad vim obligandi cuiusque anticorporis determinare ad nexus crucis specialium anticorpus deprehendendum.Pro singulis experimentorum parametris, sectio respondens "Materia et Methodi" vide respondentem.
Utilitatem huius methodi nuper evolutae pro certis applicationibus demonstramus, oligosaccharides solubiles in ACSH notando, necnon in fractionibus rudibus et purgatis a lignocellulosis hydrolysatis segregatis.Ut in Figura 3, notissima epitope substituto xylana notata in ACSH utens glycome bioacylated tentandi modi sunt plerumque uronici (U) vel methyluronici (MeU) et pectici arabinogalactani.Plerique etiam in praecedente studio inventi sunt in analysi glycanorum solidorum non hydrolyticorum (UHS)43.
Deprehensio epitopi recalcitrantis oligosaccharide utens anticorpus monoclonale ad glycanum parietem cellulae directum.Fractio "neutralis" est fractio ACN et "fractio acidica" est fractio FA.Clariores reds in heatmap notant altiorem epitopam contentam, et clariores Venetae in blank background indicant.Valores colorum in scala rudis OD valores in formulationibus N=2 nituntur.Epitopes principales elementorum agnoscuntur in dextra ostenduntur.
Hae structurae non-cellulosae adhaerere non poterant a frequentissimis cellulis et hemicellulasibus in enzyme mixtura probata commercialis, quae frequentissimos enzymes commerciales includit.Ideo novae enzymae auxiliares pro hydrolysi eorum requiruntur.Sine necessariis enzymis non-cellulosis accessoriis, vincula haec non cellulosa ad monosaccharides integram conversionem impediunt, etiamsi parens eorum saccharum polymerorum late hydrolyavit in fragmenta breviora et utens enzyme mixturae commercialis dissolvitur.
Praeterea studium insignem distributionis eiusque vires obligandi ostendit epitopas ligaturae esse in alta DP fractiones sacchari (A, B, C, DP usque ad 20+) quam in fractionibus humilibus DP (D, E, F, DP) in dimersis) (Fig. 1).Acidi fragmenta magis communia in epitopis non cellulosis quam in fragmentis neutralibus.Hae phaenomena constant cum exemplari nostro in studio praecedenti observato, ubi medietates altae DP et acidorum hydrolysi enzymaticae magis resistunt.Quapropter praesentia epitopes glycanorum non-cellulosorum et U et Mel substitutionum ad stabilitatem oligosaccharidum multum conferre possunt.Notandum est quod efficacia ligandi et deprehensio problematica esse potest pro low DP oligosaccharides, praesertim si epitope est oligosaccharide dimerica vel trimerica.Hoc probetur ex usu mercatorum oligosaccharidum diversarum longitudinum, unumquodque tantum unum epitopam continentem ad certum mAb.
Sic usus elementorum specialium structurarum quaedam genera vinculorum recalcitrantium revelavit.Secundum genus anticorporis adhibitum, apta ligatio exemplaris, et vis signi (plurimum minimeque copiosum), novae enzymae cognosci possunt et semi- quantitative enzyme mixtae ad glycoconversionem pleniorem addi possunt.Acceptis analysi ACSH oligosaccharidis in exemplum, possumus creare vinculorum glycanarum database pro unaquaque materia taeda.Hic notandum est, quod differentiae affinitatis elementorum consideranda est, et si affinitas eorum ignorata est, quasdam difficultates efficiet, collatis signis diversorum elementorum.Praeterea, comparatio vinculorum glycaniorum inter exempla pro eodem anticorpore optime operari potest.Pertinax haec vincula cum CAZyme datorum coniungi possunt, e quibus enzymes, electos candidatos enzymes cognoscere et enzymes vinculi temptare, vel microbiales rationes explicandi ad has enzymes pro usu in biorefineries 44 exprimendos.
Perpendere quomodo methodi immunologicae modos complent modos modos ad pondus oligosaccharides notans humilis hypotheticas in hydrolysatibus lignocellulosicis, MALDI (Fig. 4, S1-S8) et analysin ex TMS saccharidis derivatis in eadem tabula (fig. 5) oligosaccharidis (fig. 5) notata.MALDI comparare adhibetur num massae distributio oligosaccharidis moleculis intentae structurae aequet.Pridie fici.4 demonstrat MC neutrarum partium ACN-A et ACN-B.ACN-A analysis confirmatur amplitudinem saccharorum pentosarum ab DP 4-8 (Fig. 4) ad DP 22 (Fig. S1), cuius pondera correspondent MeU-xylan oligosaccharides.ACN-B analysis confirmavit seriem pentosae et glucoxylan cum DP 8-15.In materia suppletiva ut Figura S3, FA-C medietas massae acidicae mappis distributio (Me)U substituitur saccharo pentoso cum DP 8-15 quae constant cum substitutis xylans inventis in ELISA substructio mAb protegendo.Epitopi constantes sunt.
MALDI-MS spectrum solutum oligosaccharides non obsequentem praesentem in ACS.Hic, (A) ACN-A gravis gravis range fractus in quo acidum uronicum methylatum (DP 4-8) substituit glucuroxylan oligosaccharides et (B) ACN-B xylan et methylated acidum uronicum oligosaccharidum substitutum cum glucuroxylan (DP 8-15).
Analysis compositionis glycani reliquiarum refractorii oligosaccharides.Hic (A) TMS saccharide compositio variarum fractionum oligosaccharidum utens GC-MS analysis obtinuit.(B) Structurae variarum saccharorum TMs-actarum in oligosaccharidibus insunt.ACN - fractio acetonitrilis continens neutras oligosaccharidas et FA - fractio acidi ferulici continens acidum oligosaccharidum.
Alia iucunda conclusio ex LC-MS analysi fractionis oligosaccharidis extracta est, ut in Figura S9 ostensum est (modos videri possunt in materia supplementaria electronic).Fragmenta circulorum hexosi et -OAc in ligatione fractionis ACN-B saepissime observata sunt.Haec inventio non solum confirmat fragmentum in analysi glycome et MALDI-TOF observatum, sed etiam novas informationes praebet de derivationibus carbohydratorum potentiale in praetractatis biomassis lignocellulosico.
Nos etiam compositionem saccharo fractionis oligosaccharidis utentes derivationis saccharo TMS resolvimus.Usura GC-MS, compositionem neuralis (derivativae) et saccharorum acidicorum (GluA et GalA) in fractione oligosaccharidis (fig. 5) decrevimus.Acidum glucuronicum in componentibus acidicis C et D invenitur, dum galacturonicum acidum in componentibus acidicis A et B invenitur, quorum utrumque altae sunt DP partes saccharorum acidicorum.Hi eventus non solum confirmamus notitias nostras ELISA et MALDI, sed etiam cum praecedentibus studiis oligosaccharidis cumulus cohaerent.Propterea credimus modernos modos immunologicos utentes biotinylationes oligosaccharides et subsequentes ELISA protegendo sufficere ad recalcitrantem oligosaccharidem solutum in variis exemplis biologicis deprehendere.
Cum ELISA-substructio mAb protegendi methodis pluribus modis diversis confirmata sint, voluimus ulterius explorare potentiam novae quantitatis huius methodi.Duae commerciales oligosaccharides, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) et 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriosae (A2XX), empti sunt et probati utentes novo mAb accessu nisl muri cellae glycani.Figura 6 linearis correlationem inter signum ligaturae biotinylated et concentratio oligosaccharidis retrahitur, suggerens possibilem exemplar adsorptionis Langmuir.Inter mAbs, CRC-M137, CCRC-M138, CRC-M147, CRC-M148, et CRC-M151 cum XHE, CCRC-M108, CCRC-M109, et LM11 cum A2XX connectuntur per 1 um ad 100 nano connectuntur.Ob strictam disponibilitatem elementorum in experimento, experimenta limitata fiebant cum unaquaque intentione oligosaccharidis.Animadvertendum est hic nonnullas elementorum partes longe aliter agere eidem oligosaccharide substratae, scilicet quia adstringunt epitopas ad paulum diversa, et affinitates valde varias habere possunt.Machinae et implicationes identitatis accuratae epitopae multo magis implicatae erunt cum novus mAb accessus ad exempla realia applicatur.
Duae commerciales oligosaccharides adhibitae sunt ad detectionem range variarum glycanarum machinarum mAbs determinare.Hic, correlationes lineares cum intentione oligosaccharidis conglobationis logarum indicant Langmuir exemplaria adsorptionis pro (A) XHE cum mAb et (B) A2XX cum mAb.Epitopes correspondentes indicant structuras oligosaccharides mercatorum adhibitas substratorum in percepto.
Usus glycan-iaculatorum elementorum monoclonalis (analysis glycocomica vel ELISA substructio mAb protegendo) instrumentum validum est ad intimum characterisationum plurimorum muri cellae maioris glycanorum, quae plantae taedae faciunt.Nihilominus, analysis glycana classica solum glycans maiorem cellulam murum designat, cum maxime oligosaccharides in laminas ELISA efficaciter immobiles non sint.In hoc studio, AFEX-praetratum acervum frumenti enzymatice hydrolyzata ad solidorum altitudinem contenta est.Sugar analysis adhibita ad compositionem recalcitrantis muri cellae carbohydratorum in hydrolyzata determinare.Attamen mAb analysis oligosaccharidum minorum in hydrolysatibus minoris aestimatur, additamenta instrumenta oligosaccharides in ELISA lamminas efficaciter immobilitare requiruntur.
Hic nuntiamus novam et efficacem oligosaccharidam immobilizationis methodum mAb protegendo, iungendo oligosaccharide biotinylation, quam ELISA protegendo in NeutrAvidin™ laminas obductis.Biotinylated oligosaccharides immobiles satis affinitatem ostenderunt cum anticorpore ut celeris et efficax detectio recalcitrantis oligosaccharidis possit.Analysis compositionis harum pertinax oligosaccharides in spectrometria missa fundata confirmavit eventus novus accessus ad immunoscreening.Haec ergo studia demonstrant compositionem oligosaccharidis biotinylationis et ELISA protegentis cum elementorum glycan-iscopatorum monoclonaliorum usu posse ad cruces in oligosaccharides deprehendendas adhiberi ac late applicari posse in aliis studiis biochemicis quae structuram oligosaccharidis designant.
Haec biotin-substructio methodi glycani profilingis est prima relatio capax investigandi vincula recalcitrantis carbohydratorum solubilium oligosaccharidum in plantis taedae.Hoc adiuvat ad intellegendum cur aliquae partes taedae tam pertinaces sint cum ad productionem biofuel adveniat.Haec methodus magnum intervallum in methodis analysi glycome implet et applicationem suum ad latius subiectorum ultra plantam oligosaccharides extendit.In posterum, roboticis ad biotinylationem uti possumus et methodo quam pertractatam analysin exemplorum ELISA utendo enucleavimus.
Palea frumentaria (CS) crevit e Pioneer 33A14 semina hybridorum anno 2010 ab Kramer Farms in Ray, Colorado desumpta sunt.Permissu familias, haec biomass ad investigationes adhiberi potest. Exemplaria siccis condita <6% humoris in saccis zip-cincinnis in cella temperie. Exemplaria siccis condita <6% humoris in saccis zip-cincinnis in cella temperie. разцы ранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Exemplaria arida ad <6% humiditatem in saccis zippered ad cella caliditatem repositae sunt.< 6%< 6% разцы ранят в пакетах с астежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью <6%. Exemplaria reponuntur in saccis zipper ad cella temperatura cum humiditate <6%.Studium cum loci et nationalis indiciis obsecutus est.Analysis compositionalis fiebat utens protocollo NREL.Compositio inventa continet 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% interdum et 13. 4% cinis.
Cellic® CTec2 (138 mg interdum/ml, multum VCNI 0001) complexa est mixtura cellularum, β-glucosidase et Cellic® HTec2 (157 mg interdum/ml, multum VHN00001) ex Novozymis (Franklinton, NC, USA)).Pectinase® multiplex (72 mg interdum/mL), complexus pectinorum turpium enzymorum complexus, a DuPont Bioscientiae Industrialis donatus est (Palo Alto, CA, USA).Concentratio interdum enzyme determinata aestimandis dapibus contentorum (et subtrahendo collationem nitrogenii non- interdum) utendo Kjeldahl analysi nitrogenii (AoAC methodus 2001.11, Lacticiniis One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatomacea terra 545 emit ab EMD Millipore (Billerica, MA).Carbonis activum (DARCO, granula reticula 100), Avicel (PH-101), fagus xylan, et omnes aliae oeconomiae emptae sunt ex Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX praetractatio apud GLBRC facta est (Biomass Conversio Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Prae-curatio ante 140° C. peracta est ad 15 minuta.46 temporis commorationis in 1:1 ratio ammoniae anhydroi ad taeda cum 60% (w/w) onerantium in batch reactoris incorrupta ferri scamni (Parr Instruments Company).Accepit 30 minuta.Reactor ad 140°C perductus est et ammoniaci celerius dimissus est, permittens taeda ut celeriter reverteretur ad temperatura cella.Compositio AFEX praetractata stor (ACS) similis fuit quam stover frumenti increati (UT-CS).
Alta solidorum ACSH 25% (w/w) (proxime 8% onerantium dextranarum) praeparata est ut materia incipiens magnae magnitudinis productionis oligosaccharidum.Hydrolysis enzymatica ACS fiebat utens enzyme commercii commercii inter Cellic® Ctec2 10 mg interdum/g glucan (in praetractata biomass), Htec2 (Novozyma, Franklinton, NC), 5 mg interdum/g glucan, et Pectinase multifectae (Genencor Inc, USA).).), 5 mg interdum/g dextran.Hydrolysis enzymatica in 5-litteris bioreactoris cum operante tomo 3 litrarum elaborata est, pH 4.8, 50°C et 250 rpm.Post hydrolysim per 96 horas, hydrolyzata per centrifugationem ad 6000 rpm per 30 minuta coacta est, et tunc ad 14000 rpm per 30 minuta ad solida unhydrolysa removenda.Hydrolyzata igitur filtration sterili per 0,22 mm colum potorio subiecta est.Hydrolyzata saccata in utribus sterilibus conditum erat ad 4° C. ac deinde in carbonem fractum.
Analysis compositionis extracti-basi taemi exemplorum secundum rationes analyseos NREL laboratoriae: praeparatio exemplorum ad analysin compositionis (NREL/TP-510-42620) et determinatio carbohydratorum et lignin in biomass (NREL/TP-510-42618)47.
Analysis oligosaccharidis aquae hydrolyzatae in scala 2 ml fiebat utens methodo hydrolysi acidi autoclave fundato.Misce hydrolyzatae specimen cum 69.7 µl ex 72% acido sulphurico in tubo culturae 10 ml cochleae cap et incubare pro 1 h in scamno ad 121 °C, refrigerandi in glacie et colum in altam perficiendi phialam liquidam (HPLC) .Concentratio oligosaccharidis subtrahendo retrahitur monosaccharides in specimen non hydrolyzatum e toto saccharo retrahitur in specimen acido hydrolyzatum.
Glucosa, xylosa, et intentiones arabinosae in acido hydrolysi taeda enucleatae sunt usus systematis Shimadzu HPLC instructi cum autosampler, columna calefacientis, sentinam isocraticam, et index refractivus detector in columna Bio-Rad Aminex HPX-87H.Columna in 50°C conservata est et in aqua 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 eluctata.fluere.
Hydrolyzata supernatantem dilutum et resolutum pro contentus monomer et oligosaccharide est.Saccharum monomericarum post hydrolysim enzymaticam consecuti sunt ab HPLC instructi cum Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P columna et columna custodiae fraxinorum.Columella temperatura in 80°C conservata est, aqua cum rate fluunt 0.6 ml/min ut tempus mobile adhibitum est.Oligosaccharides ab hydrolysi in acido diluti ad 121°C determinabantur secundum modos in refs descriptos.XLI, XLVIII, XLIX.
Saccharida analysis fiebat in crudis, AFEX praetractatis et omnes residua biomass non hydrolysed (inclusa productione extrahendi muri cellae et earum mAb protegendo) adhibitis processibus antecedentibus 27, 43, 50, 51.Ad analysin glycomae, residua alcohol-insolabilis parietis cellulae plantae materialis ex taeda residua praeparata sunt et subiciuntur ad extractionem vide cum reagentibus magis magisque infestantibus sicut ammonium oxalatum (50 mM), aphronitri (50 mM et 0.5% w/v), CON.(1M et 4M, ambo cum 1% w/v sodium borohydride) et acidum chloritum, ut ante dictum est 52,53.Tum extracta ELISA subiecta sunt contra tabulam complexam mAb50s ad glycanum murum cellae directae, et mAb reactiones ligandi sicut tabula caloris exhibita sunt.mAbs nisl glycani empti e nervo laboratorio (CCRC, JIM et MAC series).
One-gradus biotinylationis oligosaccharidis.Coniugatio carbohydratorum cum biotin-LC-hydrazide fiebat utendo modo sequenti.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) dissolutum est in sulfoxide dimetrili (DMSO, 70 μl) a vehementi agitatione et calefactione ad 65° C. pro 1 min.Acidum glaciale aceticum (30 µl) adiectum est, et mixtio in sodium cyanoborohydridarum (6.4 mg/100 µmol) effusa est et post calefactionem omnino 65° C. circiter minutatim dissolvitur.Deinde, ab 5 ad 8 µl mixtionis reactionis oligosaccharidae aridi (nmol 1-100) addita est, ut plusquam 10 centuplum vel plus molarem pittacii excessum in finem reducendo adiciatur.Reactio facta est 65°C pro 2 h, postquam exemplaria statim purificata sunt.Nulla cyanoborohydrida sodium in experimentis labellis sine diminutione adhibitum est, et exempla ad 65° C. per 2.5 horas portavit.
ELISA coating and ablution of samples of biotinylated oligosaccharides.25 µl speciminum biotinylatorum (100 µl uniuscuiusque specimen contracti dilutum in 5 ml 0,1 M Tris solutionis quiddam (TBS)) singulis bene bracteae avidin-coactae additae sunt.Putei temperantiae cum 50 μl biotini obductis ad collationem 10 μg/ml in 0.1 M TBS.Deionized aqua in vestiendo pro mensuris blank adhibebatur.Tabula incubata est per 2 horas ad cella temperies in tenebris.Lava laminam 3 times cum 0.1% summa lac in 0.1 M TBS utens programmate no.11 pro Grenier plana 3A.
Additio et lotio elementorum primarium.40 µl primitivae anticorporis unicuique bene adde.Incubant microplate pro 1 hora ad cella temperies in tenebris.Tum eæ 3 vicibus lavabantur cum 0.1% lacte in 0.1M TBS programmate lavatorio #11 pro Grenier Flat 3A.
Adde secundarium anticorpum et lava.Adde 50 µl mus/rat anticorpus secundarium (dilutatum 1:5000 in 0.1% lac in 0.1 M TBS) unicuique bene.Incubant microplate pro 1 hora ad cella temperies in tenebris.Microplatae tunc 5 temporibus cum 0.1% lacte abluebantur in 0.1 M TBS utens Grenier Flat 5A laminam programma lavandum #12.
Subiecto addito.Adde 50 µl of 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) basi subiecta (addendo 2 guttas quiddam, guttas 3 TMB, 2 guttas peroxidis hydrogenii ad 15 ml aquae deionizatae).Praeparate vul distent.et gurges ante usum).Microplate incubare ad locus temperatus pro XXX minutis.In tenebris.
Perficere gradum et tabulam legere.Ad singulas bene acidi sulphurici 50 µl adde, et absortionem ab 450 ad 655 um ad ELISA lectorem refer.
Praeparate solutiones harum analytarum in aqua deionizata 1 mg/ml: arabinosum, rhamnosum, fucosum, xylosum, acidum glucuronicum (GlcA), mannosum, glucosum, galactosum, lactosum, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (vexillum internum).Duo signa parata sunt addendo solutiones 1 mg/mL saccharo in Tabula ostensa 1. Exemplaria congelata et lyophilisata in -80° C. donec omnis aqua removeatur (fere 12-18 horas solet).
100-500 µg specimen ad cochleam fistulae analyticae in statera adde.Quantum adiecit recordarentur.Optimum est specimen resolvere in specifica intentione solvendi, et illud tubo ut liquidum aliquotum addas.Utere 20 µl ex 1 mg/ml inositollo ut signo interno pro utroque specimen tubo.Quantitas vexillum interni ad sample additum debet, eadem esse ac moles vexillum interni ad tubum vexillum additum.
Adde 8 ml methanolum anhydroum ad phialam cochleae pilei.Inde 4 ml 3 N. solutio methanolica HCl, capped et conquassata.Hic processus aqua non utitur.
Adde 500 µl ex 1 M HCl solutionem methanolum ad exempla oligosaccharidis et fistulae vexillum TMS.Exemplaria incubata pernoctare (168 horis) ad 80° C. in scandalo scelerisque.Methanolysis desicca producti in cella temperatura utens desiccatione multiplici.200 µl MeOH adde et iterum sicca.Hic processus bis repetitur.Adde 200 µl methanoli, 100 µl pyridini et 100 µl anhydridis aceticae ad sample et bene misce.Exemplaria incubata sunt ad locus temperatus pro 30 minutis.et exsiccata.200 µl methanolum addere et iterum siccare.
200 µl ex Tri-Sil adde et tubus nubiferae caloris per 20 minuta.80°C, dein refrigeratum ad cella temperies.Multiplici desiccatione utere ut specimine ulteriore siccato ad volumen circiter 50 µl.Illud notandum est quod exemplaria omnino siccari non permittimus.
Adde 2 ml hexane et vorticem bene misce.Replete apices pipettarum Pasteur (5—8 mm) cum particula lanae vitreae inserendo lanam vitream super 5-3/4 inch diametro pipettae.Exemplaria centrifugerunt ad 3000 g pro 2 minutis.Praecipitantur reliquiae quaevis insolubiles.Excoquatur specimen ad 100-150 µl.Volumen circiter 1 μl injectum est in GC-MS temperiem initialem 80 °C et tempus initiale 2.0 minutorum (Tabula 2).