Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Chan eil ach beagan taic CSS aig an tionndadh brobhsair a tha thu a’ cleachdadh.Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir à comas Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer).Anns an eadar-ama, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bheir sinn seachad an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.
Modhan ùra imdhun-eòlasach agus mòr-speactrometric airson mion-sgrùdadh iom-fhillte air oligosaccharides leantainneach ann an stòbha arbhair air an làimhseachadh le AFEX.Tha bith-thomas lignocellulosic na roghainn seasmhach eile an àite connadh fosail agus tha e air a chleachdadh gu farsaing gus bith-theicneòlasan a leasachadh airson cinneasachadh thoraidhean leithid biadh, biadhadh, connadh agus ceimigean.Is e an iuchair do na teicneòlasan sin leasachadh phròiseasan farpaiseach cosgais airson gualaisgean iom-fhillte a tha an làthair ann am ballachan cealla planntrais a thionndadh gu siùcaran sìmplidh leithid glucose, xylose agus arabinose.Leis gu bheil bith-thomas lignocellulosic gu math stòlda, feumaidh e a bhith fo smachd leigheasan teirm-cheimiceach (me, exfoliation ammonia fiber (AFEX), searbhag caolach (DA), lioftaichean ionic (IL)) agus làimhseachadh bith-eòlasach (me, uisgeachadh enzymatic agus coipeadh microbial) còmhla gus an toradh a tha thu ag iarraidh fhaighinn..Ach, nuair a thathar a 'cleachdadh enzyman fungach malairteach anns a' phròiseas uisgeachaidh, chan eil ann ach 75-85% de na siùcairean solubhail a tha air an cruthachadh mar monosaccharides, agus tha an 15-25% a tha air fhàgail nan oligosaccharides soluble, so-ruigsinneach, nach eil an-còmhnaidh rim faighinn le meanbh-fhàs-bheairtean.Roimhe seo, tha sinn air oligosaccharides stòlda solubhail a sgaradh agus a ghlanadh gu soirbheachail le bhith a’ cleachdadh measgachadh de chromatography dealachaidh gualain agus talamh diatomaceous agus às-dùnadh meud, agus rinn sinn sgrùdadh cuideachd air na feartan casg enzyme aca.Tha sinn air faighinn a-mach gu bheil oligosaccharides anns a bheil ìre nas àirde de polymerization (DP) ionadan searbhag uronic methylated nas duilghe a phròiseasadh le measgachadh enzyman malairteach na DP ìosal agus oligosaccharides neodrach.An seo tha sinn ag aithris mar a chleachdar grunn dhòighean a bharrachd, a’ gabhail a-steach pròifil glycan a’ cleachdadh antibodies monoclonal (mAbs) a tha sònraichte do glycans bith-thomaid planntrais gus bannan glycan a chomharrachadh ann am ballachan cealla planntrais agus hydrolysates enzymatic, ionization desorption laser le taic matrix, mòr-speactrometry ùine-itealaich..Bidh MALDI-TOF-MS) a’ cleachdadh stùcan sgrùdaidh structar-fiosrachaidh a gheibhear le speactroscopaidh às deidh lobhadh àrd-sgoile de ions àicheil, cromatagrafaidheachd gas agus mòr-speactrometry (GC-MS) gus bannan oligosaccharide a chomharrachadh le agus às aonais derivatization.Air sgàth cho beag sa tha oligosaccharides (DP 4-20), tha na moileciuilean sin duilich an cleachdadh airson ceangal agus comharrachadh mAb.Gus faighinn thairis air an duilgheadas seo, chuir sinn an sàs dòigh gluasad oligosaccharide stèidhichte air co-luachadh biotin a chuir an cèill gu soirbheachail a’ mhòr-chuid de oligosaccharides soluble DP ìosal air uachdar microplate, a chaidh a chleachdadh an uairsin ann an siostam mAb trochur àrd airson mion-sgrùdadh ligation sònraichte.Cuidichidh an dòigh ùr seo le bhith a’ leasachadh mheasaidhean glycome trochur àrd nas adhartaiche san àm ri teachd a ghabhas cleachdadh gus oligosaccharides a tha an làthair ann am bith-chomharran a lorg agus a chomharrachadh airson adhbharan breithneachaidh.
Tha bith-thomas lignocellulosic, air a dhèanamh suas de stuthan àiteachais, coilltearachd, feur is fiodha, na stòras beathachaidh a dh’ fhaodadh a bhith ann airson cinneasachadh thoraidhean bith-stèidhichte, a ’toirt a-steach biadh, biadhadh, connadh agus ro-ruitheadairean ceimigeach gus toraidhean le luach nas àirde a thoirt gu buil1.Tha gualaisgean (leithid ceallalose agus hemicellulose) a tha an làthair ann am ballachan cealla planntrais air an depolymerized gu monosaccharides le giollachd ceimigeach agus biotransformation (leithid hydrolysis enzymatic agus coipeadh microbial).Tha ro-làimhseachadh cumanta a’ toirt a-steach leudachadh ammonia fiber (AFEX), searbhag caolach (DA), lionn ionic (IL), agus spreadhadh smùid (SE), a bhios a’ cleachdadh measgachadh de cheimigean agus teas gus cinneasachadh lignocellulose a lughdachadh le bhith a’ fosgladh ballachan cealla planntrais3,4.seasmhachd stuth, 5. Bithear a’ dèanamh uisgeachadh eunzymatic aig luchd àrd de sholaidean a’ cleachdadh enzyman gnìomhach malairteach anns a bheil gualaisg (CAZymes) agus coipeadh microbial a’ cleachdadh beirm transgenic no bacteria gus connadh bith-stèidhichte agus ceimigean 6 a thoirt gu buil.
Tha CAZymes ann an enzyman malairteach air an dèanamh suas de mheasgachadh iom-fhillte de enzymes a bhios gu co-obrachail a’ glanadh cheanglaichean iom-fhillte gualaisg-siùcair gus monosaccharides2,7 a chruthachadh.Mar a thuirt sinn na bu thràithe, tha an lìonra iom-fhillte de pholaimirean cùbhraidh de lignin le gualaisg gan dèanamh gu math do-ruigsinneach, a tha a’ leantainn gu tionndadh siùcar neo-choileanta, a’ cruinneachadh 15-25% de oligosaccharides gnè nach eil air an toirt a-mach aig àm uisgeachadh eun-eòlach air a’ bhith-thomas ro-làimh.Tha seo na dhuilgheadas cumanta le diofar dhòighean pretreatment biomass.Tha cuid de na h-adhbharan airson a’ bhotail seo a’ toirt a-steach casg air enzyman rè hydrolysis, no às-làthaireachd no ìrean ìosal de enzyman riatanach riatanach a dh’ fheumar gus bannan siùcair a bhriseadh ann am bith-thomas planntrais.Cuidichidh tuigse air co-dhèanamh agus feartan structarail shiùcair, leithid na bannan siùcair ann an oligosaccharides, sinn le bhith ag adhartachadh tionndadh siùcair rè uisgeachadh, a’ dèanamh pròiseasan bith-theicneòlasach a thaobh cosgais le toraidhean a thig bho pheatroil.
Tha e dùbhlanach a bhith a’ dearbhadh structar gualaisg agus tha feum air measgachadh de dhòighean leithid cromatagrafaidheachd liùlach (LC) 11,12, speactroscopaidh ath-shuidheachadh magnetach niùclasach (NMR)13, electrophoresis capillary (CE) 14,15,16 agus mòr-speactrometry (MS)17.,ochd-deug.Tha modhan MS leithid mòr-speactrometry ùine-itealaich le desorption laser agus ionization a’ cleachdadh matrix (MALDI-TOF-MS) nan dòigh ioma-ghnìomhach airson structaran gualaisg a chomharrachadh.O chionn ghoirid, chaidh MS tandem de dh’ ian sodium a chleachdadh gu farsaing gus lorgan-meòir a chomharrachadh a tha co-chosmhail ri suidheachadh ceangail oligosaccharide, rèiteachaidhean anomeric, sreathan, agus suidheachadh branndaidh 20, 21 .
Tha mion-sgrùdadh glycan na inneal math airson ceanglaichean gualaisg a chomharrachadh gu domhainn22.Bidh an dòigh seo a’ cleachdadh antibodies monoclonal (mAbs) a tha air an stiùireadh gu bhith a’ cur glycan balla cealla mar probes gus ceanglaichean iom-fhillte gualaisg a thuigsinn.Tha còrr air 250 mAbs rim faighinn air feadh an t-saoghail, air an dealbhadh an aghaidh diofar oligosaccharides sreathach agus branrach a’ cleachdadh diofar saccharides24.Chaidh grunn mAbs a chleachdadh gu farsaing gus structar, co-dhèanamh agus atharrachaidhean air balla cealla planntrais a chomharrachadh, leis gu bheil eadar-dhealachaidhean mòra ann a rèir seòrsa cealla planntrais, organ, aois, ìre leasachaidh, agus àrainneachd fàis25,26.O chionn ghoirid, chaidh an dòigh seo a chleachdadh gus àireamhan bileagan ann an siostaman planntrais is bheathaichean a thuigsinn agus na dreuchdan aca ann an còmhdhail glycan mar a chaidh a dhearbhadh le comharran subcellular, ìrean leasachaidh, no brosnachaidhean àrainneachd, agus gus gnìomhachd enzymatic a dhearbhadh.Am measg cuid de na structaran eadar-dhealaichte de glycans agus xylans a chaidh a chomharrachadh tha pectin (P), xylan (X), manan (M), xyloglucans (XylG), glucans bond measgaichte (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbino-Gactan (GArbX) agus arabino.
Ach, a dh’ aindeoin na h-oidhirpean rannsachaidh sin, chan eil ach beagan sgrùdaidhean air fòcas a chuir air nàdar cruinneachadh oligosaccharide aig àm uisgeachadh luchdan àrd solid (HSL), a’ toirt a-steach sgaoileadh oligosaccharide, atharrachaidhean fad slabhraidh oligomeric rè uisgeachadh, grunn pholaimirean DP ìosal, agus na lùban aca.sgaoilidhean 30,31,32.Aig an aon àm, ged a tha mion-sgrùdadh glycan air a bhith na inneal feumail airson mion-sgrùdadh coileanta air structar glycan, tha e duilich oligosaccharides DP ìosal a tha soluiteach ann an uisge a mheasadh a’ cleachdadh dòighean antibody.Chan eil oligosaccharides DP nas lugha le cuideam moileciuil nas lugha na 5-10 kDa a’ ceangal ri pleitean ELISA 33, 34 agus tha iad air an nighe air falbh mus cuir iad antibody ris.
An seo, airson a’ chiad uair, tha sinn a’ sealltainn measadh ELISA air lannan còmhdaichte le avidin a’ cleachdadh antibodies monoclonal, a’ cothlamadh modh bith-tinylation aon-cheum airson oligosaccharides teasairginn solubhail le mion-sgrùdadh glycome.Chaidh an dòigh-obrach againn a thaobh mion-sgrùdadh glycome a dhearbhadh le mion-sgrùdadh stèidhichte air MALDI-TOF-MS agus GC-MS air ceanglaichean oligosaccharide co-phàirteach a’ cleachdadh derivatization trimethylsilyl (TMS) de sgrìobhadh siùcar hydrolyzed.Faodar an dòigh-obrach ùr-ghnàthach seo a leasachadh mar dhòigh-obrach àrd-toraidh san àm ri teachd agus lorgar cleachdadh nas fharsainge ann an rannsachadh bith-mheidigeach35.
Bidh atharrachaidhean iar-eadar-theangachaidh air enzyman agus antibodies, leithid glycosylation,36 a’ toirt buaidh air an gnìomhachd bith-eòlasach aca.Mar eisimpleir, tha àite cudromach aig atharrachaidhean ann an glycosylation de phròtainean serum ann an airtritis inflammatory, agus thathas a’ cleachdadh atharrachaidhean ann an glycosylation mar chomharran sgrùdaidh37.Thathas air aithris gu bheil diofar glycans anns an litreachas a’ nochdadh gu furasta ann an grunn ghalaran, a’ toirt a-steach galairean sèid leantainneach den t-slighe gastrointestinal agus an grùthan, galairean viral, cansearan ovarian, broilleach agus prostate38,39,40.Bheir tuigse air structar glycans le bhith a ‘cleachdadh dhòighean glycan ELISA stèidhichte air antibody misneachd a bharrachd ann a bhith a’ breithneachadh ghalaran gun a bhith a ‘cleachdadh dhòighean iom-fhillte MS.
Sheall an sgrùdadh a rinn sinn roimhe gun robh oligosaccharides stòlda fhathast gun uisgeachadh às deidh ro-làimhseachadh agus hydrolysis enzymatic (Figear 1).Anns an obair againn a chaidh fhoillseachadh roimhe, leasaich sinn dòigh tarraing ìre cruaidh gual-fhiodha gnìomhaichte gus oligosaccharides a sgaradh bho hydrolyzate arbhair a chaidh a làimhseachadh ro-làimh le AFEX (ACSH)8.Às deidh às-tharraing agus dealachadh tùsail, chaidh na oligosaccharides a bhriseadh a-rithist le cromatagrafaidheachd às-dùnadh meud (SEC) agus air an cruinneachadh ann an òrdugh cuideam moileciuil.Chaidh monomers siùcair agus oligomers a chaidh an leigeil ma sgaoil bho dhiofar ro-làimhseachadh a sgrùdadh le mion-sgrùdadh co-dhèanamh siùcair.Nuair a thathar a’ dèanamh coimeas eadar susbaint oligomers siùcair a gheibhear le diofar dhòighean pretreatment, tha làthaireachd oligosaccharides stubborn na dhuilgheadas cumanta ann a bhith ag atharrachadh bith-thomas gu monosaccharides agus faodaidh e leantainn gu lùghdachadh ann an toradh siùcar co-dhiù 10-15% agus eadhon suas ri 18%.U.S.Tha an dòigh seo air a chleachdadh airson tuilleadh cinneasachadh mòr de bhloighean oligosaccharide.Chaidh an ACH a thàinig às a dhèidh agus na bloighean às deidh sin le cuideaman moileciuil eadar-dhealaichte a chleachdadh mar stuth deuchainneach airson comharrachadh oligosaccharides san obair seo.
Às deidh pretreatment agus hydrolysis enzymatic, bha oligosaccharides leantainneach fhathast gun uisgeachadh.An seo tha (A) na dhòigh dealachaidh oligosaccharide anns a bheil oligosaccharides air an dealachadh bho AFEX-pretreated arbhair hydrolyzate (ACSH) a’ cleachdadh leabaidh làn de charbon gnìomhaichte agus talamh diatomaceous;(B) Dòigh airson sgaradh oligosaccharides.Chaidh na oligosaccharides a sgaradh tuilleadh le cromatagrafaidheachd às-dùnadh meud (SEC);(C) Monomers saccharide agus oligomers air an leigeil ma sgaoil bho dhiofar ro-làimhseachadh (searbhag caolaichte: DA, leaghan ionic: IL agus AFEX).Suidheachadh hydrolysis enzymatic: luchdachadh solidan àrd de 25% (w / w) (timcheall air 8% luchdachadh glucan), hydrolysis 96 uair, luchdachadh enzyme malairteach 20 mg / g (Ctec2: Htec2: MP-2: co-mheas 1: 1) agus (D) Monomeran siùcair agus oligomers glùcois, xylose agus araEXSAC air a leigeil ma sgaoil.
Tha mion-sgrùdadh Glycan air a bhith na inneal feumail airson mion-sgrùdadh structarail farsaing air glycans ann an earrannan a tha air leth bho fhuigheall bith-chonnadh cruaidh.Ach, chan eil saccharides a tha soluiteach ann an uisge air an riochdachadh gu leòr a’ cleachdadh an dòigh thraidiseanta seo41 leis gu bheil oligosaccharides le cuideam ìosal moileciuil duilich a ghluasad air truinnsearan ELISA agus tha iad air an nighe a-mach mus cuir iad antibody ris.Mar sin, airson ceangal agus comharrachadh antibody, chaidh dòigh biotinylation aon-cheum a chleachdadh gus oligosaccharides soluble, neo-ghèilleadh a chòta air truinnsearan ELISA còmhdaichte le avidin.Chaidh an dòigh seo a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh an ACSH a rinn sinn roimhe agus bloigh stèidhichte air a chuideam moileciuil (no ìre de polymerization, DP).Chaidh biotinylation aon-cheum a chleachdadh gus dàimh ceangail oligosaccharide a mheudachadh le bhith a 'cur biotin-LC-hydrazide ri ceann lùghdaichte a' charbohydrate (Fig. 2).Ann am fuasgladh, bidh a’ bhuidheann hemiacetal aig a’ cheann lùghdachaidh ag ath-fhreagairt leis a’ bhuidheann hydrazide de biotin-LC-hydrazide gus ceangal hydrazone a chruthachadh.Ann an làthaireachd an àidseant lughdachadh NaCNBH3, tha an ceangal hydrazone air a lughdachadh gu toradh deireannach biotinylated seasmhach.Le atharrachadh air deireadh lughdachadh siùcair, dh’ fhàs e comasach ceangal oligosaccharides DP ìosal gu lannan ELISA, agus nar sgrùdadh chaidh seo a dhèanamh air lannan còmhdaichte le avidin a’ cleachdadh mAbs le targaid glycan.
Sgrionadh de antibodies monoclonal stèidhichte air ELISA airson oligosaccharides biotinylated.An seo (A) biotinylation còmhla de oligosaccharides agus sgrìonadh ELISA às deidh sin le mAbs le targaid glycan air truinnsearan còmhdaichte NeutrAvidin agus (B) a’ sealltainn modh-obrach aon-cheum airson biotinylation de thoraidhean ath-bhualadh.
Chaidh truinnsearan còmhdaichte le avidin le antibodies conjugated oligosaccharide an uairsin a chuir ri antibodies bun-sgoile agus àrd-sgoile agus an nighe ann am meadhan a bha mothachail air solas agus ùine.Às deidh an ceangal antibody a bhith deiseil, cuir substrate TMB ris gus a’ phlàta a bhrosnachadh.Chaidh stad a chuir air an ath-bhualadh mu dheireadh le searbhag sulfarach.Chaidh na truinnsearan brosnachaidh a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh leughadair ELISA gus neart ceangail gach antibody a dhearbhadh gus tar-cheangal sònraichte antibody a lorg.Airson mion-fhiosrachadh agus crìochan an deuchainn, faic an earrann fhreagarrach “Stuthan agus Dòighean”.
Bidh sinn a’ sealltainn cho feumail sa tha an dòigh ùr-leasaichte seo airson tagraidhean sònraichte le bhith a’ comharrachadh nan oligosaccharides soluble a tha an làthair ann an ACSH a bharrachd air ann am bloighean oligosaccharide amh agus fìor-ghlan air an dealachadh bho hydrolysates lignocellulosic.Mar a chithear ann am Figear 3, mar as trice is e uronic (U) no methyluronic (MeU) agus arabinogalactans pectic na xylans ionad-epitope as cumanta a chaidh an comharrachadh ann an ACSH a’ cleachdadh dòighean assay glycome bioacylated.Chaidh a’ mhòr-chuid dhiubh a lorg cuideachd anns an sgrùdadh a rinn sinn roimhe air mion-sgrùdadh glycans de sholaidean neo-hydrolyzed (UHS)43.
A’ lorg epitopes oligosaccharide recalcitrant a’ cleachdadh antibody monoclonal air a stiùireadh gu glycan balla cealla.Is e a’ bhloigh “neodrach” am bloigh ACN agus is e a’ bhloigh “searbhagach” am bloigh FA.Tha dearg nas gile air a’ mhapa teas a’ nochdadh susbaint epitope nas àirde, agus tha blues nas soilleire a’ nochdadh cùl-raon bàn.Tha luachan dath air an sgèile stèidhichte air luachan OD amh airson cumaidhean N = 2.Tha na prìomh epitopes a tha aithnichte leis na antibodies air an sealltainn air an taobh cheart.
Cha b ’urrainnear na structaran neo-cellulose sin a ghlanadh leis na ceallan agus na hemicellulases as cumanta anns a’ mheasgachadh enzyme malairteach deuchainneach, a tha a ’toirt a-steach na h-enzyman malairteach as cumanta.Mar sin, tha feum air einnseanan taice ùra airson an hydrolysis.Às aonais na h-enzyman accessory neo-cellulose riatanach, tha na bannan neo-cellulose sin a 'cur casg air tionndadh iomlan gu monosaccharides, eadhon ged a tha na polymers siùcair pàrant aca air an uisgeachadh gu mòr ann am pìosan nas giorra agus air an sgaoileadh le bhith a' cleachdadh measgachadh enzyme malairteach.
Sheall tuilleadh sgrùdaidh air cuairteachadh chomharran agus a neart ceangail gu robh epitopes ceangail nas ìsle ann am bloighean siùcar DP àrd (A, B, C, DP suas gu 20+) na ann am bloighean DP ìosal (D, E, F, DP) ann an dimers) (Fig. 1).Tha mìrean searbhagach nas cumanta ann an epitopes neo-cellulose na mìrean neodrach.Tha na h-uinneanan sin co-chòrdail ris a’ phàtran a chaidh fhaicinn san sgrùdadh a rinn sinn roimhe, far an robh DP àrd agus moieties searbhagach nas seasmhaiche ri uisgeachadh euntach.Mar sin, faodaidh làthaireachd epitopes glycan neo-cellulose agus luchd-ionaid U agus MeU cur gu mòr ri seasmhachd nan oligosaccharides.Bu chòir a thoirt fa-near gum faod èifeachdas ceangail agus lorg a bhith na dhuilgheadas airson oligosaccharides DP ìosal, gu sònraichte ma tha an epitope na oligosaccharide dimeric no trimeric.Faodar seo a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh oligosaccharides malairteach de dhiofar fhaid, anns gach fear anns nach eil ach aon epitope a tha a’ ceangal ri mAb sònraichte.
Mar sin, nochd cleachdadh antibodies structar-sònraichte seòrsaichean sònraichte de cheanglaichean ath-aithriseach.A rèir an t-seòrsa antibody a thathar a’ cleachdadh, am pàtran ligation iomchaidh, agus neart a’ chomharra a bhios e a’ toirt a-mach (a’ mhòr-chuid agus an ìre as lugha), faodar enzyman ùra a chomharrachadh agus a chur gu leth-chainneachdail ris a’ mheasgachadh enzyme airson glycoconversion nas coileanta.A’ gabhail an anailis air oligosaccharides ACSH mar eisimpleir, is urrainn dhuinn stòr-dàta de cheanglaichean glycan a chruthachadh airson gach stuth bith-thomas.Bu chòir a thoirt fa-near an seo gum bu chòir aire a thoirt don dàimh eadar-dhealaichte de antibodies, agus mura h-eil fios dè an dàimh a th ’aca, cruthaichidh seo duilgheadasan sònraichte nuair a thathar a’ dèanamh coimeas eadar comharran diofar antibodies.A bharrachd air an sin, is dòcha gum bi coimeas eadar bannan glycan ag obair nas fheàrr eadar sampallan airson an aon antibody.Faodar na bannan stòlda sin an uairsin a cheangal ri stòr-dàta CAZyme, às an urrainn dhuinn enzyman a chomharrachadh, enzyman tagraiche a thaghadh agus deuchainn a dhèanamh airson enzyman brisidh bannan, no siostaman microbial a leasachadh gus na h-einsilean sin a chuir an cèill airson an cleachdadh ann am biorefineries44.
Gus measadh a dhèanamh air mar a tha modhan imdhon-eòlais a’ cur ri dòighean eile airson a bhith a’ comharrachadh oligosaccharides le cuideam ìosal moileciuil a tha an làthair ann an hydrolysates lignocellulosic, rinn sinn MALDI (Fig. 4, S1-S8) agus mion-sgrùdadh air saccharides stèidhichte air TMS stèidhichte air GC-MS air an aon phannal (Fig. 5) pàirt oligosaccharide.Tha MALDI air a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh a bheil cuairteachadh mòr mholacilean oligosaccharide a rèir an structair a tha san amharc.Air fige.Tha 4 a’ sealltainn MC de na pàirtean neodrach ACN-A agus ACN-B.Dhaingnich mion-sgrùdadh ACN-A raon de shiùcairean pentose bho DP 4-8 (Fig. 4) gu DP 22 (Fig. S1), aig a bheil cuideaman a rèir oligosaccharides MeU-xylan.Dhearbh mion-sgrùdadh ACN-B an t-sreath pentose agus glucoxylan le DP 8-15.Ann an stuthan leasachail leithid Figear S3, tha mapaichean cuairteachaidh tomad moiety searbhagach FA-C a’ sealltainn raon de shiùcairean pentose a chaidh an àiteachadh le (Me)U le DP de 8-15 a tha co-chòrdail ris na xylans ionaid a lorgar ann an sgrìonadh mAb stèidhichte air ELISA.Tha na epitopes cunbhalach.
Sgeama MALDI-MS de oligosaccharides solubhail neo-ghèilleadh an làthair ann an ACS.An seo, chuir (A) ACN-A bloighean raon cuideam ìosal anns a bheil searbhag uronic methylated (DP 4-8) an àite oligosaccharides glucuroxylan agus (B) xylan ACN-B agus oligosaccharides aigéad uronic methylated le glucuroxylan (DP 8-15).
Mion-sgrùdadh air na tha air fhàgail de glycan de oligosaccharides teasairginn.An seo (A) co-dhèanamh saccharide TMS de dhiofar bloighean oligosaccharide air fhaighinn a’ cleachdadh mion-sgrùdadh GC-MS.(B) Structaran de dhiofar shiùcairean a thig bho TMS an làthair ann an oligosaccharides.ACN - bloigh acetonitrile anns a bheil oligosaccharides neodrach agus FA - bloigh searbhag ferulic anns a bheil oligosaccharides searbhagach.
Chaidh co-dhùnadh inntinneach eile a tharraing bho sgrùdadh LC-MS air bloigh oligosaccharide, mar a chithear ann am Figear S9 (tha dòighean rim faicinn anns an stuth leasachail dealanach).Chaidh pìosan de bhuidhnean hexose agus -OAc fhaicinn a-rithist nuair a chaidh bloigh ACN-B a cheangal.Tha an lorg seo chan ann a-mhàin a’ dearbhadh a’ bhriseadh a chaidh fhaicinn ann an anailis glycome agus MALDI-TOF, ach tha e cuideachd a’ toirt seachad fiosrachadh ùr mu thoraidhean gualaisg a dh’ fhaodadh a bhith ann am bith-thomas lignocellulosic ro-làimh.
Rinn sinn mion-sgrùdadh cuideachd air co-dhèanamh siùcair na bloigh oligosaccharide a’ cleachdadh derivatization siùcar TMS.A’ cleachdadh GC-MS, cho-dhùin sinn co-dhèanamh siùcaran neural (neo-thorrach) agus searbhagach (GluA agus GalA) anns a’ bhloigh oligosaccharide (Fig. 5).Tha searbhag glucuronic air a lorg ann an co-phàirtean searbhagach C agus D, agus lorgar searbhag galacturonic ann an co-phàirtean searbhagach A agus B, a tha le chèile nan co-phàirtean DP àrd de shiùcairean searbhagach.Chan e a-mhàin gu bheil na toraidhean sin a’ dearbhadh ar dàta ELISA agus MALDI, ach tha iad cuideachd co-chòrdail ris na sgrùdaidhean a rinn sinn roimhe air cruinneachadh oligosaccharide.Mar sin, tha sinn den bheachd gu bheil dòighean imdhun-eòlais an latha an-diugh a’ cleachdadh biotinylation de oligosaccharides agus sgrìonadh ELISA às deidh sin gu leòr gus oligosaccharides soluble recalcitrant a lorg ann an grunn shamhlaichean bith-eòlasach.
Leis gu bheil modhan sgrìonaidh mAb stèidhichte air ELISA air an dearbhadh le grunn dhòighean eadar-dhealaichte, bha sinn airson tuilleadh sgrùdaidh a dhèanamh air comasachd an dòigh cainneachdail ùr seo.Chaidh dà oligosaccharides malairteach, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) agus 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), a cheannach agus a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh dòigh-obrach mAb ùr a bha ag amas air glycan balla cealla.Tha Figear 6 a’ sealltainn co-dhàimh sreathach eadar an comharra ceangail biotinylated agus an dùmhlachd log de cho-chruinneachadh oligosaccharide, a’ moladh modal sùghaidh Langmuir a dh’ fhaodadh a bhith ann.Am measg nam mAbs, bha CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, agus CCRC-M151 co-cheangailte ri XHE, agus CCRC-M108, CCRC-M109, agus LM11 co-cheangailte ri A2XX thairis air raon de 1 nm gu 100 nano.Air sgàth cho beag de antibodies a bha rim faighinn tron ​​​​deuchainn, chaidh deuchainnean cuibhrichte a dhèanamh le gach dùmhlachd oligosaccharide.Bu chòir a thoirt fa-near an seo gu bheil cuid de antibodies a’ dèiligeadh gu math eadar-dhealaichte ris an aon oligosaccharide mar fho-fhilleadh, a rèir coltais air sgàth gu bheil iad a’ ceangal ri epitopes a tha beagan eadar-dhealaichte agus gum faod ceanglaichean ceangail gu math eadar-dhealaichte a bhith aca.Bidh uidheamachdan agus builean comharrachadh epitope ceart tòrr nas iom-fhillte nuair a thèid an dòigh-obrach mAb ùr a chuir an sàs ann an sampallan fìor.
Chaidh dà oligosaccharides malairteach a chleachdadh gus raon lorg diofar mAbs a bha ag amas air glycan a dhearbhadh.An seo, tha co-dhàimhean sreathach le dùmhlachd log de cho-chruinneachadh oligosaccharide a’ nochdadh pàtrain sùghaidh Langmuir airson (A) XHE le mAb agus (B) A2XX le mAb.Tha na epitopes co-fhreagarrach a’ nochdadh structaran nan oligosaccharides malairteach a thathas a’ cleachdadh mar fho-stratan san assay.
Tha cleachdadh antibodies monoclonal le targaid glycan (mion-sgrùdadh glycan no sgrìonadh mAb stèidhichte air ELISA) na inneal cumhachdach airson a bhith a’ comharrachadh a’ mhòr-chuid de na prìomh glycanan balla cealla a tha a’ dèanamh suas bith-thomas planntrais.Ach, chan eil mion-sgrùdadh glycan clasaigeach ach a’ comharrachadh glycans balla cealla nas motha, leis nach eil a’ mhòr-chuid de oligosaccharides air an gluasad gu h-èifeachdach air lannan ELISA.Anns an sgrùdadh seo, chaidh stòbha arbhair ro-làimh le AFEX a h-uisgeachadh gu enzymatically aig susbaint àrd de sholaidean.Chaidh mion-sgrùdadh siùcar a chleachdadh gus co-dhèanamh gualaisg balla cealla ath-aithriseach anns an hydrolyzate a dhearbhadh.Ach, thathas a’ dèanamh dìmeas air mion-sgrùdadh mAb air oligosaccharides nas lugha ann an hydrolysates, agus tha feum air innealan a bharrachd gus oligosaccharides a ghluasad gu h-èifeachdach air truinnsearan ELISA.
Bidh sinn ag aithris an seo dòigh gluasad oligosaccharide ùr-nodha agus èifeachdach airson sgrìonadh mAb le bhith a’ cothlamadh bith-bhiotamain oligosaccharide agus sgrìonadh ELISA air truinnsearan còmhdaichte NeutrAvidin ™.Sheall na oligosaccharides biotinylated neo-ghluasadach dàimh gu leòr airson an antibody gus leigeil le oligosaccharides ath-aithriseach a lorg gu luath agus gu h-èifeachdach.Dhaingnich mion-sgrùdadh air co-dhèanamh nan oligosaccharides stòlda sin stèidhichte air mòr-speactrometry toraidhean an dòigh-obrach ùr seo a thaobh dìon-dìon.Mar sin, tha na sgrùdaidhean sin a’ sealltainn gum faodar an cothlamadh de biotinylation oligosaccharide agus sgrìonadh ELISA le antibodies monoclonal le targaid glycan a chleachdadh gus crois-cheanglaichean a lorg ann an oligosaccharides agus faodar an cur an sàs gu farsaing ann an sgrùdaidhean bith-cheimiceach eile a tha a’ comharrachadh structar oligosaccharides.
Is e an dòigh pròifil glycan seo stèidhichte air biotin a’ chiad aithisg a tha comasach air sgrùdadh a dhèanamh air na ceanglaichean gualaisg recalcitrant de oligosaccharides soluble ann am bith-thomas planntrais.Tha seo a’ cuideachadh le bhith a’ tuigsinn carson a tha cuid de phàirtean de bhith-chonnadh cho borb nuair a thig e gu cinneasachadh bith-chonnadh.Bidh an dòigh seo a ’lìonadh beàrn cudromach ann an dòighean sgrùdaidh glycome agus a’ leudachadh a chleachdadh gu raon nas fharsainge de fho-stratan nas fhaide na oligosaccharides planntrais.Anns an àm ri teachd, faodaidh sinn innealan-fuadain a chleachdadh airson biotinylation agus an dòigh a tha sinn air a leasachadh a chleachdadh airson mion-sgrùdadh àrd-threòrachadh de shamhlaichean a’ cleachdadh ELISA.
Chaidh connlach arbhair (CS) a chaidh fhàs bho shìol hybrid Pioneer 33A14 a bhuain ann an 2010 bho Kramer Farms ann an Ray, Colorado.Le cead bhon uachdaran, faodar am bith-thomas seo a chleachdadh airson rannsachadh. Chaidh na sampallan a stòradh tioram <6% taiseachd ann am pocannan glas-zip aig teòthachd an t-seòmair. Chaidh na sampallan a stòradh tioram <6% taiseachd ann am pocannan glas-zip aig teòthachd an t-seòmair. Mar a gheibh thu cuidhteas an t-saighead < 6% anns a 'phacaid agus an àbhaist-mholaidh при комнатнопра темура. Bha sampaill air an stòradh tioram aig <6% taiseachd ann am pocannan zippered aig teòthachd an t-seòmair.样 品 在室温下以干燥< 6% 的水分 储 存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Gabhail a-steach an t-saoghail ann an pacifier airson an t-seòmair-beò < 6%. Bidh sampaill air an stòradh ann am pocannan zipper aig teòthachd an t-seòmair le taiseachd <6%.Bha an sgrùdadh a’ gèilleadh ri stiùiridhean ionadail is nàiseanta.Chaidh mion-sgrùdadh co-phàirteach a dhèanamh a’ cleachdadh protocol NREL.Chaidh a lorg gu robh 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% pròtain agus 13. 4% uinnseann.
Tha Cellic® CTec2 (138 mg pròtain / ml, lot VCNI 0001) na mheasgachadh iom-fhillte de cellulase, β-glucosidase agus Cellic® HTec2 (157 mg pròtain / ml, lot VHN00001) bho Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Chaidh Multifect Pectinase® (72 mg pròtain / mL), measgachadh iom-fhillte de einnseanan truaillidh pectin, a thoirt seachad le DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Chaidh co-chruinneachaidhean pròtain einnsein a dhearbhadh le bhith a 'toirt tuairmse air susbaint pròtain (agus a' toirt air falbh tabhartas nitrigin neo-phròtain) a 'cleachdadh mion-sgrùdadh nitrigin Kjeldahl (modh AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Chaidh talamh diatomaceous 545 a cheannach bho EMD Millipore (Billerica, MA).Chaidh carbon gnìomhaichte (DARCO, gràinneagan 100 mogal), Avicel (PH-101), xylan faidhbhile, agus a h-uile ceimigeach eile a cheannach bho Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Chaidh pretreatment AFEX a dhèanamh aig GLBRC (Obair-lann Rannsachaidh Biomass Conversion, MSU, Lansing, MI, USA).Chaidh ro-làimhseachadh a dhèanamh aig 140 ° C. airson 15 mionaidean.Ùine còmhnaidh 46 aig co-mheas 1: 1 de ammonia anhydrous gu bith-thomas aig 60% (w / w) luchdachadh ann an reactair baidse benchtop stàilinn gun staoin (Companaidh Parr Instruments).Thug e 30 mionaid.Chaidh an reactair a thoirt gu 140 ° C agus chaidh ammonia a leigeil ma sgaoil gu sgiobalta, a’ leigeil leis a ’bhith-thomas tilleadh gu luath gu teòthachd an t-seòmair.Bha co-dhèanamh stòbha arbhair ro-làimh AFEX (ACS) coltach ris an fhear a bh’ ann an stòbha arbhair gun làimhseachadh (UT-CS).
Chaidh solidan àrda ACSH 25% (w / w) (timcheall air 8% luchdachadh dextran) ullachadh mar stuth tòiseachaidh airson cinneasachadh mòr de oligosaccharides.Chaidh hydrolysis enzymatic de ACS a dhèanamh a ’cleachdadh measgachadh enzyme malairteach a’ toirt a-steach Cellic® Ctec2 10 mg pròtain / g glucan (ann am bith-thomas ro-làimh), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg pròtain / g glucan, agus Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg pròtain / g dextran.Chaidh hydrolysis enzymatic a dhèanamh ann am bioreactor 5-liotair le tomhas obrach de 3 liotair, pH 4.8, 50 ° C agus 250 rpm.Às deidh uisgeachadh airson 96 uairean, chaidh an hydrolyzate a chruinneachadh le centrifugation aig 6000 rpm airson 30 mionaid agus an uairsin aig 14000 rpm airson 30 mionaidean gus solidan gun uisge a thoirt air falbh.Chaidh an hydrolyzate an uairsin fo shìoladh sterile tro bhìog sìoltachain 0.22 mm.Bha an hydrolyzate sìoltaichte air a stòradh ann am botail sterile aig 4 ° C. agus an uairsin air a bloigh air carbon.
Mion-sgrùdadh air co-dhèanamh sampallan bith-thomas stèidhichte air earrann a rèir modhan sgrùdaidh obair-lann NREL: ullachadh sampallan airson mion-sgrùdadh co-dhèanamh (NREL / TP-510-42620) agus dearbhadh gualaisg structarail agus lignin ann am bith-thomas (NREL / TP-510 - 42618)47.
Chaidh mion-sgrùdadh Oligosaccharide air an t-sruth hydrolyzate a dhèanamh air sgèile 2 ml a’ cleachdadh modh hydrolysis searbhag stèidhichte air autoclave.Measgaich an sampall hydrolyzate le 69.7 µl de searbhag sulfarach 72% ann an tiùb cultar caip sgriubha 10 ml agus goir airson 1 h air benchtop aig 121 ° C, fionnar air deigh agus sìoladh a-steach do vial cromatagrafaidheachd lionn àrd-choileanadh (HPLC).Chaidh an ìre de oligosaccharides a dhearbhadh le bhith a’ toirt air falbh an dùmhlachd de monosaccharides anns an sampall neo-hydrolyzed bhon chruinneachadh iomlan de shiùcair anns an sampall searbhag-hydrolyzed.
Chaidh glùcois, xylose, agus co-chruinneachaidhean arabinose ann am bith-thomas searbhagach a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh siostam Shimadzu HPLC uidheamaichte le autosampler, teasadair colbh, pumpa isocratic, agus lorgaire clàr-amais ath-tharraingeach air colbh Bio-Rad Aminex HPX-87H.Bha an colbh air a chumail aig 50 ° C agus air a lasadh le 0.6 ml / min 5 mM H2SO4 ann an uisge.sruth.
Chaidh an supernatant hydrolyzate a lagachadh agus a sgrùdadh airson susbaint monomer agus oligosaccharide.Chaidh siùcar monomeric a fhuaireadh às deidh uisgeachadh enzymatic a sgrùdadh le HPLC uidheamaichte le colbh Aminex HPX-87P Bio-Rad (Hercules, CA) agus colbh dìon uinnseann.Chaidh teòthachd a’ cholbh a chumail aig 80 ° C, chaidh uisge a chleachdadh mar an ìre gluasadach le ìre sruthadh de 0.6 ml / min.Chaidh Oligosaccharides a dhearbhadh le uisgeachadh ann an searbhag lag aig 121 ° C a rèir nam modhan a chaidh a mhìneachadh ann an refs.41, 48, 49.
Chaidh mion-sgrùdadh saccharide a dhèanamh air fuigheall bith-thomas amh, ro-làimhseachadh AFEX agus a h-uile fuigheall bith-thomas neo-hydrolysed (a ’toirt a-steach cinneasachadh earrannan balla cealla sreathach agus an sgrìonadh mAb) a’ cleachdadh modhan a chaidh a mhìneachadh roimhe 27, 43, 50, 51 .Airson mion-sgrùdadh glycome, bidh fuigheall deoch làidir de stuth balla cealla planntrais air ullachadh bho fhuigheall bith-chonnadh agus air a thoirt a-mach gu sreathach le ath-bheachdan a tha a ’sìor fhàs ionnsaigheach leithid ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM agus 0.5% w / v), CON.(1M agus 4M, gach cuid le 1% w / v sodium borohydride) agus searbhag clorite mar a chaidh a mhìneachadh roimhe52,53.Chaidh na h-earrannan an uairsin a chuir fo ELISA an aghaidh pannal iom-fhillte de mAb50s air an stiùireadh gu glycan balla cealla, agus chaidh ath-bheachdan ceangail mAb a thaisbeanadh mar mhapa teas.Chaidh mAbs a bha ag amas air glycan balla cealla planntrais a cheannach bho stoc obair-lann (sreath CCRC, JIM agus MAC).
Biotinylation aon-cheum de oligosaccharides.Chaidh co-luachadh gualaisg le biotin-LC-hydrazide a dhèanamh a 'cleachdadh a' mhodh-obrachaidh a leanas.Chaidh Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) a sgaoileadh ann an dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) le gluasad làidir agus teasachadh aig 65 ° C. airson 1 min.Chaidh searbhag acetic eigheachail (30 µl) a chur ris agus chaidh am measgachadh a dhòrtadh air sodium cyanoborohydride (6.4 mg / 100 µmol) agus a sgaoileadh gu tur às deidh teasachadh aig 65 ° C. airson timcheall air 1 mionaid.An uairsin, bho 5 gu 8 μl den mheasgachadh ath-bhualadh chaidh a chur ris an oligosaccharide tiormaichte (1-100 nmol) gus còrr molar 10-fhillte no barrachd fhaighinn den leubail thairis air a ’cheann lughdachadh.Chaidh am freagairt a dhèanamh aig 65 ° C airson 2 h, agus às deidh sin chaidh na sampallan a ghlanadh sa bhad.Cha deach sodium cyanoborohydride a chleachdadh anns na deuchainnean bileagan gun lughdachadh, agus chaidh na sampallan ath-fhreagairt aig 65 ° C. airson 2.5 uairean.
Còmhdach ELISA agus nighe sampaill de oligosaccharides biotinylated.Chaidh 25 μl de shamhlaichean biotinylated (100 μl de gach sampall tiugh air a lagachadh ann an 5 ml de fhuasgladh bufair 0.1 M Tris (TBS)) a chur ri gach tobar den phlàta còmhdaichte le avidin.Bha tobraichean smachd air an còmhdach le 50 μl de biotin aig dùmhlachd de 10 μg / ml ann an 0.1 M TBS.Chaidh uisge deionized a chleachdadh mar chòmhdach airson tomhas bàn.Chaidh am tablet a ghluasad airson 2 uair aig teòthachd an t-seòmair anns an dorchadas.Nigh am plàta 3 tursan le 0.1% bainne sgim ann an 0.1 M TBS a’ cleachdadh prògram àireamh.11 airson flat Grenier 3A.
Cur-ris agus nighe antibodies bun-sgoile.Cuir 40 µl de phrìomh antibody ris gach tobar.Goir am microplate airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair anns an dorchadas.Chaidh na truinnsearan an uairsin a nighe 3 tursan le 0.1% bainne ann an 0.1M TBS a’ cleachdadh prògram nighe #11 airson Grenier Flat 3A.
Cuir antibody àrd-sgoile ris agus nigh.Cuir 50 µl de antibody àrd-sgoile luchag / radan (air a lagachadh 1: 5000 ann an 0.1% bainne ann an 0.1 M TBS) ri gach tobar.Goir am microplate airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair anns an dorchadas.Chaidh na microplates an uairsin a nighe 5 tursan le 0.1% bainne ann an 0.1 M TBS a’ cleachdadh prògram nighe truinnsear Grenier Flat 5A #12.
A 'cur ri substrate.Cuir 50 µl de 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ris an t-substrate bunaiteach (le bhith a’ cur 2 drops de bufair, 3 tuiteam de TMB, 2 tuiteam de hydrogen peroxide gu 15 ml de dh’ uisge deionized).Ullaich an substrate TMB.agus vortex mus tèid a chleachdadh).Goir am microplate aig teòthachd an t-seòmair airson 30 mionaid.Anns an dorchadas.
Cuir crìoch air a’ cheum agus leugh am tablet.Cuir 50 µl de 1 N searbhag sulfarach ris gach tobar agus clàraich an sùghadh bho 450 gu 655 nm a’ cleachdadh leughadair ELISA.
Ullaich fuasglaidhean 1 mg / ml de na mion-sgrùdaidhean sin ann an uisge deionized: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, searbhag galacturonic (GalA), searbhag glucuronic (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine .(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (inbhe a-staigh).Chaidh dà inbhean ullachadh le bhith a' cur ris na fuasglaidhean siùcar 1 mg/mL a chithear ann an Clàr 1. Tha sampaill air an reothadh agus air an lyophilized aig -80 ° C. gus an tèid a h-uile uisge a thoirt air falbh (mar as trice mu uairean 12-18).
Cuir 100–500 µg de shampall ri tiùban caip sgriubha air cothromachadh anailis.Clàraich an t-suim a chaidh a chur ris.Tha e nas fheàrr an sampall a sgaoileadh ann an dùmhlachd sònraichte de fhuasgladh agus a chuir ris an tiùb mar aliquot lionn.Cleachd 20 µl de 1 mg/ml inositol mar ìre a-staigh airson gach sampall tiùb.Feumaidh an ìre de inbhe a-staigh a chaidh a chur ris an sampall a bhith co-ionann ris an ìre de inbhe a-staigh a chaidh a chur ris an tiùb àbhaisteach.
Cuir 8 ml de methanol anhydrous ri vial caip sgriubha.An uairsin 4 ml de fhuasgladh 3 N. methanolic HCl, air a chuartachadh agus air a chrathadh.Chan eil am pròiseas seo a 'cleachdadh uisge.
Cuir 500 µl de fhuasgladh methanol 1 M HCl ris na sampallan oligosaccharide agus na tiùban TMS àbhaisteach.Chaidh sampallan a ghluasad thar oidhche (168 uairean) aig 80 ° C. ann am bloc teirmeach.Tiormaich an toradh methanolysis aig teòthachd an t-seòmair le bhith a’ cleachdadh iomadachadh tiormachaidh.Cuir 200 µl MeOH ris agus tiormaich a-rithist.Bidh am pròiseas seo air ath-aithris dà uair.Cuir 200 µl de methanol, 100 µl de pyridine agus 100 µl de acetic anhydride ris an sampall agus measgachadh gu math.Chaidh sampaill a ghluasad aig teòthachd an t-seòmair airson 30 mionaid.agus tiormaich.Cuir 200 µl de methanol ris agus tiormaich a-rithist.
Cuir 200 µl de Tri-Sil ris agus teas an tiùb le caiptean airson 20 mionaid.80 ° C, agus an uairsin air fhuarachadh gu teòthachd an t-seòmair.Cleachd iomadachd tiormachaidh gus an sampall a thiormachadh gu tomhas-lìonaidh timcheall air 50 µl.Tha e cudromach cuimhneachadh nach do leig sinn leis na sampallan tiormachadh gu tur.
Cuir 2 ml de hexane ris agus measgachadh gu math le vortexing.Lìon na molaidhean de phìoban Pasteur (5-8 mm) le pìos clòimh glainne le bhith a 'cur a-steach a' chlòimh glainne air mullach pìobaid le trast-thomhas de 5-3 / 4 òirleach.Chaidh sampaill a chuir sa mheadhan aig 3000 g airson 2 mhionaid.Tha fuigheall neo-sholabailte sam bith air a dhùsgadh.Tiormaich an sampall gu 100-150 µl.Chaidh tomhas-lìonaidh timcheall air 1 μl a thoirt a-steach don GC-MS aig teòthachd tùsail de 80 ° C agus ùine tùsail de 2.0 mionaidean (Clàr 2).