شكرًا لك على زيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة ، نوصي باستخدام مستعرض محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في غضون ذلك ، لضمان استمرار الدعم ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
طرق طيفية مناعية وكتلة جديدة للتحليل المعقد للسكريات قليلة السكاريد الثابتة في حطب الذرة المُعالج مسبقًا باستخدام AFEX.الكتلة الحيوية Lignocellulosic هي بديل مستدام للوقود الأحفوري وتستخدم على نطاق واسع لتطوير التقنيات الحيوية لإنتاج منتجات مثل الأغذية والأعلاف والوقود والمواد الكيميائية.مفتاح هذه التقنيات هو تطوير عمليات تنافسية من حيث التكلفة لتحويل الكربوهيدرات المعقدة الموجودة في جدران الخلايا النباتية إلى سكريات بسيطة مثل الجلوكوز والزيلوز والأرابينوز.نظرًا لأن الكتلة الحيوية للجنوسليلوز عنيدة جدًا ، يجب أن تخضع للعلاجات الكيميائية الحرارية (على سبيل المثال ، تقشير ألياف الأمونيا (AFEX) ، والأحماض المخففة (DA) ، والسوائل الأيونية (IL)) والمعالجات البيولوجية (مثل التحلل المائي الأنزيمي والتخمير الميكروبي) معًا للحصول على المنتج المطلوب..ومع ذلك ، عند استخدام الإنزيمات الفطرية التجارية في عملية التحلل المائي ، فإن 75-85٪ فقط من السكريات القابلة للذوبان المتكونة عبارة عن سكريات أحادية ، أما نسبة 15-25٪ المتبقية فهي سكريات قليلة الذوبان غير قابلة للتحلل ، والتي لا تتوفر دائمًا للكائنات الحية الدقيقة.في السابق ، نجحنا في عزل وتطهير السكريات قليلة الذوبان العنيدة القابلة للذوبان باستخدام مزيج من فصل الكربون والأرض الدياتومي وكروماتوجرافيا استبعاد الحجم ، كما درسنا خصائص تثبيط الإنزيم.لقد وجدنا أن السكريات القليلة التي تحتوي على درجة أعلى من البلمرة (DP) بدائل حمض اليورونيك الميثيل هي أكثر صعوبة في المعالجة باستخدام خلطات الإنزيمات التجارية مقارنةً بالسكريات المنخفضة DP و oligosaccharides المحايدة.هنا نُبلغ عن استخدام العديد من الطرق الإضافية ، بما في ذلك التنميط الجليكان باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) الخاصة بالكتلة الحيوية النباتية جليكانات لتوصيف روابط الجليكان في جدران الخلايا النباتية والتحلل المائي الإنزيمي ، وتأين امتصاص الليزر بمساعدة المصفوفة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة..يستخدم MALDI-TOF-MS) قمم تشخيصية غنية بالمعلومات تم الحصول عليها عن طريق التحليل الطيفي بعد التحلل الثانوي للأيونات السالبة واللوني للغاز وقياس الطيف الكتلي (GC-MS) لتوصيف روابط قليل السكاريد مع وبدون اشتقاق.نظرًا لصغر حجم السكريات قليلة السكاريد (DP 4-20) ، يصعب استخدام هذه الجزيئات لربط وتوصيف mAb.للتغلب على هذه المشكلة ، طبقنا طريقة تجميد السكاريد قليلة السكاريد القائمة على اقتران البيوتين والتي نجحت في تمييز غالبية السكريات قليلة الذوبان منخفضة DP القابلة للذوبان على سطح الصفيحة الدقيقة ، والتي تم استخدامها بعد ذلك في نظام mAb عالي الإنتاجية لتحليل ربط محدد.ستسهل هذه الطريقة الجديدة تطوير فحوصات glycome عالية الإنتاجية أكثر تقدمًا في المستقبل والتي يمكن استخدامها لعزل وتوصيف السكريات القليلة الموجودة في المؤشرات الحيوية لأغراض التشخيص.
تعتبر الكتلة الحيوية Lignocellulosic ، المكونة من المواد الزراعية والغابات والعشبية والخشبية ، مادة أولية محتملة لإنتاج المنتجات الحيوية ، بما في ذلك الأغذية والأعلاف والوقود والسلائف الكيميائية لإنتاج منتجات ذات قيمة أعلى.يتم إزالة بلمرة الكربوهيدرات (مثل السليلوز والهيميسليلوز) الموجودة في جدران الخلايا النباتية إلى السكريات الأحادية عن طريق المعالجة الكيميائية والتحول الأحيائي (مثل التحلل المائي الأنزيمي والتخمير الميكروبي).تشمل المعالجات المسبقة الشائعة تمدد ألياف الأمونيا (AFEX) ، والحمض المخفف (DA) ، والسائل الأيوني (IL) ، والانفجار البخاري (SE) ، والتي تستخدم مزيجًا من المواد الكيميائية والحرارة لتقليل إنتاج اللجنوسليلوز عن طريق فتح جدران الخلايا النباتية.عناد المادة ، 5. يتم إجراء التحلل المائي الأنزيمي عند حمولة عالية من المواد الصلبة باستخدام الإنزيمات التجارية المحتوية على الكربوهيدرات (CAZymes) والتخمير الميكروبي باستخدام الخمائر المحورة جينيا أو البكتيريا لإنتاج الوقود الحيوي والمواد الكيميائية 6.
تتكون الكازيمات في الإنزيمات التجارية من خليط معقد من الإنزيمات التي تشق بشكل تآزر روابط معقدة من الكربوهيدرات والسكر لتكوين السكريات الأحادية.كما ذكرنا سابقًا ، فإن الشبكة المعقدة للبوليمرات العطرية من اللجنين مع الكربوهيدرات تجعلها شديدة الصعوبة ، مما يؤدي إلى تحويل السكر غير الكامل ، مما يؤدي إلى تراكم 15-25 ٪ من السكريات القلة التي لا يتم إنتاجها أثناء التحلل الإنزيمي للكتلة الحيوية المعالجة مسبقًا.هذه مشكلة شائعة في طرق المعالجة المسبقة للكتلة الحيوية.تشمل بعض أسباب هذا الاختناق تثبيط الإنزيم أثناء التحلل المائي ، أو غياب أو انخفاض مستويات الإنزيمات الأساسية اللازمة لكسر روابط السكر في الكتلة الحيوية النباتية.سيساعدنا فهم التركيب والخصائص الهيكلية للسكريات ، مثل روابط السكر في السكريات القليلة ، على تحسين تحويل السكر أثناء التحلل المائي ، مما يجعل عمليات التكنولوجيا الحيوية تنافسية من حيث التكلفة مع المنتجات المشتقة من البترول.
يعد تحديد بنية الكربوهيدرات أمرًا صعبًا ويتطلب مجموعة من الطرق مثل اللوني السائل (LC) 11،12 ، والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) 13 ، والرحلان الكهربي الشعري (CE) 14،15،16 وقياس الطيف الكتلي (MS) 17.،الثامنة عشر.تعد طرق MS مثل قياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة مع امتصاص الليزر والتأين باستخدام مصفوفة (MALDI-TOF-MS) طريقة متعددة الاستخدامات لتحديد الهياكل الكربوهيدراتية.في الآونة الأخيرة ، تم استخدام MS الترادفي الناجم عن الاصطدام (CID) من مقاربات أيونات الصوديوم على نطاق واسع لتحديد بصمات الأصابع المقابلة لمواضع ارتباط قليل السكاريد ، والتكوينات الشاذة ، والتسلسلات ، والمواضع المتفرعة 20 ، 21.
يعد تحليل الجليكان أداة ممتازة للتعرف المتعمق على روابط الكربوهيدرات.تستخدم هذه الطريقة الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) الموجهة إلى جليكان جدار الخلية النباتية كمجسات لفهم روابط الكربوهيدرات المعقدة.يتوفر أكثر من 250 مللي أمبير في جميع أنحاء العالم ، وهو مصمم ضد السكريات قليلة السكاريد الخطية والمتفرعة باستخدام السكريات المختلفة.تم استخدام العديد من mAbs على نطاق واسع لتوصيف بنية جدار الخلية النباتية وتكوينه وتعديلاته ، حيث توجد اختلافات كبيرة اعتمادًا على نوع الخلية النباتية والعضو والعمر ومرحلة النمو وبيئة النمو.في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه الطريقة لفهم مجموعات الحويصلات في الأنظمة النباتية والحيوانية وأدوار كل منها في نقل الجليكان كما هو محدد بواسطة العلامات تحت الخلوية ، أو مراحل النمو ، أو المنبهات البيئية ، ولتحديد النشاط الأنزيمي.بعض الهياكل المختلفة للجليكانات والزيلان التي تم تحديدها تشمل البكتين (P) ، xylan (X) ، mannan (M) ، xyloglucans (XylG) ، جلوكان السندات المختلطة (MLG) ، أرابينوكسيلان (ArbX) ، galactomannan (GalG) ، وحمض الجلوكورونيك - arabinoxylan (Arino-galactX).
ومع ذلك ، على الرغم من كل هذه الجهود البحثية ، فقد ركزت دراسات قليلة فقط على طبيعة تراكم السكاريد قليل السكاريد أثناء التحلل المائي لحمل المواد الصلبة العالية (HSL) ، بما في ذلك إطلاق السكاريد قليل السكاريد ، وتغييرات طول سلسلة قليلة القسيمات أثناء التحلل المائي ، ومختلف البوليمرات منخفضة الكثافة ، ومنحنياتها.التوزيعات 30،31،32.وفي الوقت نفسه ، على الرغم من أن تحليل الجليكان قد أثبت أنه أداة مفيدة لإجراء تحليل شامل لهيكل الجليكان ، إلا أنه من الصعب تقييم السكريات قليلة الذوبان في الماء والقابلة للذوبان في الماء باستخدام طرق الأجسام المضادة.السكاريد الصغير DP الأصغر بوزن جزيئي أقل من 5-10 كيلو دالتون لا يرتبط بألواح ELISA 33 ، 34 ويتم غسلها قبل إضافة الجسم المضاد.
هنا ، ولأول مرة ، نعرض اختبار ELISA على الألواح المطلية بأفيدين باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، والجمع بين إجراء التحلل الحيوي من خطوة واحدة لسكريات قليلة السكاريد الحرارية القابلة للذوبان مع تحليل glycome.تم التحقق من صحة نهجنا في تحليل glycome من خلال التحليل المستند إلى MALDI-TOF-MS و GC-MS للروابط قليلة السكريد التكميلية باستخدام اشتقاق ثلاثي ميثيل سيليل (TMS) لتركيبات السكر المتحللة بالماء.يمكن تطوير هذا النهج المبتكر كطريقة عالية الإنتاجية في المستقبل وإيجاد تطبيق أوسع في البحوث الطبية الحيوية.
تؤثر التعديلات اللاحقة للترجمة على الإنزيمات والأجسام المضادة ، مثل الارتباط بالجليكوزيل 36 ، على نشاطها البيولوجي.على سبيل المثال ، تلعب التغييرات في الارتباط بالجليكوزيل لبروتينات المصل دورًا مهمًا في التهاب المفاصل الالتهابي ، وتستخدم التغييرات في الارتباط بالجليكوزيل كواسمات تشخيصية.تم الإبلاغ عن الجليكانات المختلفة في الأدبيات لتظهر بسهولة في مجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك الأمراض الالتهابية المزمنة في الجهاز الهضمي والكبد ، والالتهابات الفيروسية ، وسرطان المبيض والثدي والبروستاتا.سيوفر فهم بنية الجليكانات باستخدام طرق ELISA القائمة على الأجسام المضادة ثقة إضافية في تشخيص المرض دون استخدام طرق MS المعقدة.
أظهرت دراستنا السابقة أن السكريات قليلة السكاريد العنيدة ظلت غير متحللة بعد المعالجة المسبقة والتحلل المائي الأنزيمي (الشكل 1).في عملنا المنشور سابقًا ، قمنا بتطوير طريقة استخراج الطور الصلب للفحم المنشط لعزل السكريات قليلة السكاريد من تحلل حبات الذرة المعالج مسبقًا AFEX (ACSH) 8.بعد الاستخراج الأولي والفصل ، تم تجزئة السكريات القليلة عن طريق كروماتوجرافيا استبعاد الحجم (SEC) وتم جمعها بترتيب الوزن الجزيئي.تم تحليل مونومرات السكر والأليغومرات المنبعثة من المعالجات المختلفة عن طريق تحليل تكوين السكر.عند مقارنة محتوى أوليغومرات السكر التي تم الحصول عليها من خلال طرق المعالجة المختلفة ، فإن وجود السكريات القليلة العنيدة يمثل مشكلة شائعة في تحويل الكتلة الحيوية إلى السكريات الأحادية ويمكن أن يؤدي إلى انخفاض في محصول السكر بنسبة 10-15٪ على الأقل وحتى 18٪.نحن.تُستخدم هذه الطريقة لإنتاج مزيد من أجزاء السكريات قليلة السكاريد على نطاق واسع.تم استخدام ACH الناتج والكسور اللاحقة ذات الأوزان الجزيئية المختلفة كمواد تجريبية لتوصيف السكريات القليلة في هذا العمل.
بعد المعالجة المسبقة والتحلل المائي الأنزيمي ، ظلت السكريات قليلة السكاريد غير مائيّة.هنا (أ) هي طريقة فصل السكاريد قليلة السكاريد التي يتم فيها عزل السكريات قليلة السكاريد من تحلل الذرة المعالج مسبقًا AFEX (ACSH) باستخدام طبقة معبأة من الكربون المنشط والأرض الدياتومي ؛(ب) طريقة لفصل السكريات القليلة.تم فصل السكريات القليلة عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ؛(C) مونومرات السكاريد وأوليغومرات المنبعثة من المعالجات المختلفة (حمض مخفف: DA ، سائل أيوني: IL و AFEX).ظروف التحلل المائي الأنزيمي: تحميل مواد صلبة عالية بنسبة 25٪ (وزن / وزن) (حوالي 8٪ تحميل جلوكان) ، 96 ساعة تحلل مائي ، 20 مجم / جرام تحميل إنزيم تجاري (نسبة Ctec2: Htec2: MP-2: 1: 1) و (د) مونومرات السكر وأوليجومرات الجلوكوز والزيلوز والأرابينوز المنطلق من AFEX (ACS) المعالج مسبقًا.
أثبت تحليل الجليكان أنه أداة مفيدة للتحليل الهيكلي الشامل للجليكان في المستخلصات المعزولة من مخلفات الكتلة الحيوية الصلبة.ومع ذلك ، يتم تمثيل السكريات القابلة للذوبان في الماء تمثيلاً ناقصًا باستخدام هذه الطريقة التقليدية 41 نظرًا لصعوبة تثبيت السكريات قليلة الوزن الجزيئي ذات الوزن الجزيئي المنخفض على ألواح ELISA ويتم غسلها قبل إضافة الجسم المضاد.لذلك ، من أجل ربط الجسم المضاد وتوصيفه ، تم استخدام طريقة تفاعل حيوي من خطوة واحدة لتغليف السكريات قليلة الذوبان وغير المتوافقة على ألواح ELISA المطلية بأفيدين.تم اختبار هذه الطريقة باستخدام ACSH المنتج مسبقًا الخاص بنا وجزءًا يعتمد على الوزن الجزيئي (أو درجة البلمرة ، DP).تم استخدام biotinylation بخطوة واحدة لزيادة تقارب ربط قليل السكاريد عن طريق إضافة البيوتين- LC- هيدرازيد إلى النهاية المختزلة للكربوهيدرات (الشكل 2).في المحلول ، تتفاعل مجموعة hemiacetal عند الطرف المختزل مع مجموعة هيدرازيد البيوتين- LC- هيدرازيد لتكوين رابطة هيدرازون.في ظل وجود عامل الاختزال NaCNBH3 ، يتم تقليل رابطة الهيدرازون إلى منتج نهائي مستقر من المعالجة الحيوية.مع تعديل نهاية الحد من السكر ، أصبح ربط قليل السكاريد منخفض DP لألواح ELISA ممكنًا ، وفي دراستنا تم ذلك على ألواح مغلفة بأفيدين باستخدام mAbs المستهدفة بالجليكان.
فحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة على أساس ELISA للسكريات قليلة النواة الحيوية.هنا (أ) الجمع بين biotinylation للسكريات قليلة السكاريد وفحص ELISA اللاحق باستخدام mAbs الموجه للجليكان على الألواح المطلية بـ NeutrAvidin و (B) يُظهر إجراءً من خطوة واحدة للارتباط الحيوي بمنتجات التفاعل.
ثم تمت إضافة الألواح المطلية بأفيدين مع الأجسام المضادة المرتبطة بسكاريد قليل السكاريد إلى الأجسام المضادة الأولية والثانوية وغسلها في وسط حساس للضوء والوقت.بعد اكتمال ارتباط الجسم المضاد ، أضف ركيزة TMB لاحتضان اللوحة.تم إيقاف التفاعل أخيرًا بحمض الكبريتيك.تم تحليل الصفائح المحتضنة باستخدام قارئ ELISA لتحديد قوة الارتباط لكل جسم مضاد لاكتشاف الارتباط المتبادل الخاص بالجسم المضاد.للحصول على تفاصيل ومعلمات التجربة ، راجع القسم المقابل "المواد والطرق".
نوضح فائدة هذه الطريقة المطورة حديثًا لتطبيقات محددة من خلال توصيف السكريات قليلة الذوبان الموجودة في ACSH وكذلك في كسور قليل السكاريد الخام والمنقى المعزولة من التحلل المائي lignocellulosic.كما هو مبين في الشكل 3 ، فإن الزيلان الأكثر شيوعًا الذي تم استبداله في ACSH باستخدام طرق مقايسة glycome الحيوي هي عادةً uronic (U) أو methyluronic (MeU) و arabinogalactans البكتيرية.تم العثور على معظمها أيضًا في دراستنا السابقة حول تحليل الجليكانات للمواد الصلبة غير المتحللة (UHS) 43.
الكشف عن حواتم oligosaccharide المتمردة باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة موجه إلى جدار الخلية glycan.الجزء "المحايد" هو جزء ACN والجزء "الحمضي" هو جزء FA.تشير درجات اللون الأحمر الأكثر سطوعًا على خريطة الحرارة إلى محتوى حلقية أعلى ، بينما يشير اللون الأزرق الأكثر إشراقًا إلى خلفية فارغة.تستند قيم اللون على المقياس إلى قيم OD الخام للصيغ N = 2.تظهر الحواتم الرئيسية التي تتعرف عليها الأجسام المضادة على اليمين.
لا يمكن قطع هذه الهياكل غير السليلوزية عن طريق السليولازات والهيميسليلاز الأكثر شيوعًا في خليط الإنزيمات التجارية المختبرة ، والتي تتضمن الإنزيمات التجارية الأكثر استخدامًا.لذلك ، هناك حاجة إلى إنزيمات مساعدة جديدة لتحللها المائي.بدون الإنزيمات الإضافية غير السليلوزية الضرورية ، تمنع هذه الروابط غير السليلوزية التحويل الكامل إلى السكريات الأحادية ، حتى لو تم تحلل بوليمرات السكر الأم على نطاق واسع إلى أجزاء أقصر وتم إذابتها باستخدام خلائط إنزيمية تجارية.
أظهرت دراسة أخرى لتوزيع الإشارات وقوة الربط الخاصة بها أن حلقات الربط كانت أقل في كسور السكر عالية DP (A ، B ، C ، DP حتى 20+) مقارنةً بكسور DP المنخفضة (D ، E ، F ، DP) في الثنائيات) (الشكل 1).شظايا الحمض أكثر شيوعًا في الحواتم غير السليلوزية من الأجزاء المحايدة.تتوافق هذه الظواهر مع النمط الذي لوحظ في دراستنا السابقة ، حيث كانت الشقوق العالية DP والحمضية أكثر مقاومة للتحلل المائي الإنزيمي.لذلك ، فإن وجود حواتم الجليكان غير السليلوزية وبدائل U و MeU يمكن أن يسهم بشكل كبير في استقرار السكريات القليلة.وتجدر الإشارة إلى أن كفاءة الربط والكشف يمكن أن تكون مشكلة بالنسبة للسكريات قليلة الكثافة DP المنخفضة ، خاصة إذا كانت الحاتمة عبارة عن أوليغوساكاريد ثنائي أو ثلاثي.يمكن اختبار ذلك باستخدام سكريات قليلة التعدد التجارية بأطوال مختلفة ، كل منها يحتوي على حاتمة واحدة فقط ترتبط بـ mAb معين.
وهكذا ، كشف استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالهيكل عن أنواع معينة من الروابط المتمردة.اعتمادًا على نوع الجسم المضاد المستخدم ، ونمط الربط المناسب ، وقوة الإشارة التي ينتجها (الأكثر والأقل وفرة) ، يمكن تحديد إنزيمات جديدة وإضافتها شبه كمي إلى خليط الإنزيم من أجل تحويل سكري أكثر اكتمالاً.أخذ تحليل قليل السكريات ACSH كمثال ، يمكننا إنشاء قاعدة بيانات للروابط الجليكان لكل مادة من مواد الكتلة الحيوية.وتجدر الإشارة هنا إلى أنه يجب أخذ التقارب المختلف للأجسام المضادة في الاعتبار ، وإذا كان تقاربها غير معروف ، فسيؤدي ذلك إلى بعض الصعوبات عند مقارنة إشارات الأجسام المضادة المختلفة.بالإضافة إلى ذلك ، قد تعمل مقارنة روابط الجليكان بشكل أفضل بين عينات نفس الجسم المضاد.يمكن بعد ذلك ربط هذه الروابط العنيدة بقاعدة بيانات CAZyme ، والتي يمكننا من خلالها تحديد الإنزيمات واختيار الإنزيمات المرشحة واختبار إنزيمات كسر الروابط أو تطوير أنظمة ميكروبية للتعبير عن هذه الإنزيمات لاستخدامها في المصافي الحيوية.
لتقييم كيف تكمل الطرق المناعية طرقًا بديلة لتوصيف السكريات قليلة الوزن الجزيئي منخفضة الوزن الموجودة في التحلل المائي اللجيني سليلوز ، أجرينا MALDI (الشكل 4 ، S1-S8) وتحليل السكريات المشتقة من TMS بناءً على GC-MS على نفس اللوحة (الشكل 5) جزء قليل السكاريد.يتم استخدام MALDI لمقارنة ما إذا كان التوزيع الكتلي لجزيئات السكاريد الصغير يطابق الهيكل المقصود.على التين.يوضح الشكل 4 MC للمكونات المحايدة ACN-A و ACN-B.أكد تحليل ACN-A نطاقًا من السكريات البنتوزية تتراوح من DP 4-8 (الشكل 4) إلى DP 22 (الشكل S1) ، والتي تتوافق أوزانها مع السكريات قليلة السكاريد MeU-xylan.أكد تحليل ACN-B سلسلة البنتوز والجلوكوكسيلان باستخدام DP 8-15.في المواد التكميلية مثل الشكل S3 ، تُظهر خرائط توزيع الكتلة الحمضية FA-C مجموعة من السكريات البنتوزية المستبدلة (Me) U مع DP من 8-15 والتي تتوافق مع الزيلان المستبدلة الموجودة في فحص mAb القائم على ELISA.الحلقات متسقة.
طيف MALDI-MS للسكريات قليلة الذوبان غير المتوافقة الموجودة في ACS.هنا ، (A) ACN-A الكسور ذات الوزن المنخفض التي تحتوي على حمض اليورونيك الميثلي (DP 4-8) السكريات السكرية المستبدلة من الجلوكوروكسيلان و (ب) ACN-B الزيلان و oligosaccharides حمض اليورونيك الميثلي المستبدل بالجلوكوروكسيلان (DP 8-15).
تحليل تكوين بقايا الجليكان للسكريات قليلة المقاومة للحرارة.هنا (أ) تكوين السكريد TMS من كسور قليلة السكريد المختلفة التي تم الحصول عليها باستخدام تحليل GC-MS.(ب) هياكل مختلفة من السكريات المشتقة من TMS الموجودة في السكريات القليلة.ACN - جزء أسيتونيتريل يحتوي على القليل من السكريات المحايدة و FA - جزء حمض الفيروليك الذي يحتوي على قليل السكريات الحمضية.
تم استخلاص نتيجة أخرى مثيرة للاهتمام من تحليل LC-MS لجزء قليل السكاريد ، كما هو موضح في الشكل S9 (يمكن رؤية الطرق في المواد التكميلية الإلكترونية).تمت ملاحظة شظايا من مجموعات سداسيوز و -OAc بشكل متكرر أثناء ربط جزء ACN-B.لا تؤكد هذه النتيجة التجزئة التي لوحظت في تحليل glycome و MALDI-TOF فحسب ، بل توفر أيضًا معلومات جديدة حول مشتقات الكربوهيدرات المحتملة في الكتلة الحيوية lignocellulosic المعالجة مسبقًا.
قمنا أيضًا بتحليل تركيبة السكر لجزء قليل السكاريد باستخدام اشتقاق السكر TMS.باستخدام GC-MS ، حددنا تركيبة السكريات العصبية (غير المشتقة) والحمضية (GluA و GalA) في جزء قليل السكاريد (الشكل 5).يوجد حمض الجلوكورونيك في المكونات الحمضية C و D ، بينما يوجد حمض الجالاكتورونيك في المكونات الحمضية A و B ، وكلاهما مكونان عاليان من DP للسكريات الحمضية.هذه النتائج لا تؤكد فقط بيانات ELISA و MALDI الخاصة بنا ، ولكنها تتوافق أيضًا مع دراساتنا السابقة لتراكم قليل السكاريد.لذلك ، نعتقد أن الطرق المناعية الحديثة التي تستخدم biotinylation للسكريات قليلة السكاريد وفحص ELISA اللاحق كافية للكشف عن السكريات قليلة الذوبان المتمردة القابلة للذوبان في عينات بيولوجية مختلفة.
منذ أن تم التحقق من صحة طرق فحص mAb المستندة إلى ELISA بعدة طرق مختلفة ، أردنا مواصلة استكشاف إمكانات هذه الطريقة الكمية الجديدة.تم شراء اثنين من السكريات التجارية قليلة السكاريد ، السكاريد الزيلوهيكساكرايد (XHE) و 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) ، واختبارهما باستخدام نهج mAb الجديد الذي يستهدف جليكان جدار الخلية.يوضح الشكل 6 ارتباطًا خطيًا بين إشارة الربط المعالجة حيوياً والتركيز اللوغاريتمي لتركيز قليل السكاريد ، مما يشير إلى نموذج امتصاص لانجمير محتمل.من بين mAbs ، تم ربط CCRC-M137 و CCRC-M138 و CCRC-M147 و CCRC-M148 و CCRC-M151 بـ XHE و CCRC-M108 و CCRC-M109 و LM11 مع A2XX على مدى من 1 نانومتر إلى 100 نانو.بسبب التوافر المحدود للأجسام المضادة أثناء التجربة ، أجريت تجارب محدودة مع كل تركيز قليل السكاريد.وتجدر الإشارة هنا إلى أن بعض الأجسام المضادة تتفاعل بشكل مختلف تمامًا مع نفس قليل السكاريد كركيزة ، ويفترض أنها ترتبط بحواتم مختلفة قليلاً ويمكن أن يكون لها روابط ارتباط مختلفة تمامًا.ستكون آليات وآثار تحديد الحاتمة الدقيقة أكثر تعقيدًا عند تطبيق نهج mAb الجديد على عينات حقيقية.
تم استخدام اثنين من السكريات السكرية التجارية لتحديد نطاق الكشف عن mAbs مختلفة لاستهداف الجليكان.هنا ، تشير الارتباطات الخطية مع تركيز سجل تركيز قليل السكاريد إلى أنماط امتصاص لانجموير لـ (A) XHE مع mAb و (B) A2XX مع mAb.تشير الحلقات المقابلة إلى هياكل السكريات التجارية قليلة السكاريد المستخدمة كركائز في الفحص.
يعد استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المستهدفة للجليكان (تحليل الجليكوكوم أو فحص mAb القائم على ELISA) أداة قوية للتوصيف المتعمق لمعظم جليكانات جدار الخلية الرئيسية التي تشكل الكتلة الحيوية للنبات.ومع ذلك ، فإن تحليل الجليكان الكلاسيكي يميز فقط جليكانات جدار الخلية الأكبر ، حيث أن معظم السكريات قليلة السكاريد لا يتم تثبيتها بكفاءة على ألواح ELISA.في هذه الدراسة ، تم تحلل حطب الذرة المعالج بـ AFEX بشكل إنزيمي عند نسبة عالية من المواد الصلبة.تم استخدام تحليل السكر لتحديد تكوين كربوهيدرات جدار الخلية المتمردة في التحلل المائي.ومع ذلك ، فإن تحليل mAb للسكريات الصغيرة في التحلل المائي لا يستهان به ، وهناك حاجة إلى أدوات إضافية لتثبيط السكريات قليلة السكاريد بشكل فعال على ألواح ELISA.
قدمنا ​​تقريرًا هنا عن طريقة جديدة وفعالة لتثبيت السكاريد قليل السكاريد لفحص mAb من خلال الجمع بين السكاريد الأحيائي متبوعًا بفحص ELISA على الألواح المطلية بـ NeutrAvidin ™.أظهرت السكريات قليلة التقلص المُثبَّتة حيوياً تقاربًا كافيًا مع الجسم المضاد لتمكين الاكتشاف السريع والفعال للسكريات قليلة التقسيم المتمردة.أكد تحليل تركيبة السكريات القليلة العنيدة هذه بناءً على قياس الطيف الكتلي نتائج هذا النهج الجديد للفحص المناعي.وهكذا ، تُظهر هذه الدراسات أن الجمع بين التصفية الحيوية قليلة السكاريد وفحص ELISA مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المستهدفة للجليكان يمكن استخدامها لاكتشاف الروابط المتشابكة في السكريات قليلة السكاريد ويمكن تطبيقها على نطاق واسع في دراسات كيميائية حيوية أخرى تميز بنية السكريات قليلة السكاريد.
تعد طريقة التنميط الجليكان القائمة على البيوتين أول تقرير قادر على التحقيق في روابط الكربوهيدرات المتمردة للسكريات قليلة الذوبان القابلة للذوبان في الكتلة الحيوية النباتية.يساعد هذا في فهم سبب عناد بعض أجزاء الكتلة الحيوية عندما يتعلق الأمر بإنتاج الوقود الحيوي.تملأ هذه الطريقة فجوة مهمة في طرق تحليل glycome وتوسع نطاق تطبيقها إلى نطاق أوسع من الركائز إلى ما وراء السكريات قليلة السكاريد النباتية.في المستقبل ، قد نستخدم الروبوتات من أجل biotinylation ونستخدم الطريقة التي طورناها لتحليل عالي الإنتاجية للعينات باستخدام ELISA.
تم حصاد قش الذرة (CS) المزروع من بذور هجينة Pioneer 33A14 في عام 2010 من مزارع كرامر في راي ، كولورادو.بإذن من مالك الأرض ، يمكن استخدام هذه الكتلة الحيوية للبحث. تم تخزين العينات جافة <6٪ رطوبة في أكياس مضغوطة في درجة حرارة الغرفة. تم تخزين العينات جافة <6٪ رطوبة في أكياس مضغوطة في درجة حرارة الغرفة. бразцы ранились сухими влажности أقل من 6٪ вланости с застежкой-молнией при комнатной термператуой. تم تخزين العينات جافة عند أقل من 6٪ رطوبة في أكياس بسحاب عند درجة حرارة الغرفة.样品 在 室温 下 以 干燥 <6٪ 水分 储存 在 自封袋 中。样品 在 室温 下 以 干燥 <6٪ бразцы ранят в пакетах застежкой-молнией комнатной температуре с влажностью <6٪. يتم تخزين العينات في أكياس بسحاب في درجة حرارة الغرفة مع رطوبة أقل من 6٪.امتثلت الدراسة للمبادئ التوجيهية المحلية والوطنية.تم إجراء التحليل التركيبي باستخدام بروتوكول NREL.وجد أن التركيبة تحتوي على 31.4٪ جلوكان ، 18.7٪ زيلان ، 3.3٪ أرابينان ، 1.2٪ جلاكتان ، 2.2٪ أسيتيل ، 14.3٪ لجنين ، 1.7٪ بروتين ، 13. 4٪ رماد.
Cellic® CTec2 (138 مجم بروتين / مل ، دفعة VCNI 0001) هو خليط معقد من السليولاز ، β-glucosidase و Cellic® HTec2 (157 مجم بروتين / مل ، دفعة VHN00001) من نوفوزيمز (فرانكلينتون ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية)).تم التبرع بـ Multifect Pectinase® (72 مجم بروتين / مل) ، وهو مزيج معقد من الإنزيمات المهينة للبكتين ، من قبل DuPont Industrial Biosciences (بالو ألتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).تم تحديد تركيزات بروتين الإنزيم عن طريق تقدير محتوى البروتين (وطرح مساهمة النيتروجين غير البروتيني) باستخدام تحليل نيتروجين Kjeldahl (طريقة AOAC 2001.11 ، Dairy One Cooperative Inc. ، إيثاكا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية).تم شراء التراب الدياتومي 545 من EMD Millipore (Billerica ، MA).تم شراء الكربون المنشط (DARCO ، 100 حبيبات شبكية) ، Avicel (PH-101) ، خشب الزان ، وجميع المواد الكيميائية الأخرى من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، MO).
تم إجراء المعالجة AFEX في GLBRC (معمل أبحاث تحويل الكتلة الحيوية ، MSU ، Lansing ، MI ، الولايات المتحدة الأمريكية).تم إجراء المعالجة المسبقة عند 140 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.46 وقت مكوث عند نسبة 1: 1 من الأمونيا اللامائية إلى الكتلة الحيوية عند تحميل 60٪ (وزن / وزن) في مفاعل دفعي من الفولاذ المقاوم للصدأ (Parr Instruments Company).استغرق الأمر 30 دقيقة.تم إحضار المفاعل إلى 140 درجة مئوية وتم إطلاق الأمونيا بسرعة ، مما يسمح للكتلة الحيوية بالعودة بسرعة إلى درجة حرارة الغرفة.كان تكوين حطب الذرة المعالج مسبقًا AFEX (ACS) مشابهًا لتكوين حطب الذرة غير المعالج (UT-CS).
تم تحضير المواد الصلبة العالية ACSH 25٪ (وزن / وزن) (حوالي 8٪ تحميل ديكستران) كمواد أولية لإنتاج السكريات على نطاق واسع.تم إجراء التحلل المائي الأنزيمي للـ ACS باستخدام خليط إنزيم تجاري بما في ذلك Cellic® Ctec2 10 مجم بروتين / جم جلوكان (في الكتلة الحيوية المعالجة مسبقًا) ، Htec2 (Novozymes ، Franklinton ، NC) ، 5 مجم بروتين / جم جلوكان ، و Multifect Pectinase (Genencor Inc ، الولايات المتحدة الأمريكية).).) ، 5 ملغ بروتين / غ ديكستران.تم إجراء التحلل المائي الأنزيمي في مفاعل حيوي سعة 5 لتر مع حجم عمل يبلغ 3 لترات ودرجة الحموضة 4.8 و 50 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة.بعد التحلل المائي لمدة 96 ساعة ، تم جمع التحلل المائي بالطرد المركزي عند 6000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة ثم عند 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة لإزالة المواد الصلبة غير المتحللة بالماء.ثم تم تعريض التحلل المائي لترشيح معقم من خلال دورق مرشح 0.22 مم.تم تخزين التحلل المائي المرشح في زجاجات معقمة عند 4 درجات مئوية ثم تجزئة على الكربون.
تحليل تكوين عينات الكتلة الحيوية المستخرجة وفقًا لإجراءات التحليل المختبري NREL: تحضير عينات لتحليل التركيب (NREL / TP-510-42620) وتحديد الكربوهيدرات الهيكلية واللجنين في الكتلة الحيوية (NREL / TP-510-42618) 47.
تم إجراء تحليل قليل السكاريد لتيار التحلل المائي على مقياس 2 مل باستخدام طريقة التحلل الحمضي القائم على الأوتوكلاف.امزج عينة التحلل المائي مع 69.7 ميكرولتر من حمض الكبريتيك بنسبة 72٪ في أنبوب استزراع ذو غطاء لولبي سعة 10 مل واحتضانها لمدة ساعة واحدة على سطح الطاولة عند 121 درجة مئوية ، ثم تبرد على الجليد ثم قم بالتصفية في قارورة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC).تم تحديد تركيز السكريات القليلة عن طريق طرح تركيز السكريات الأحادية في العينة غير المتحللة بالماء من تركيز السكر الكلي في العينة المتحللة بالحمض.
تم تحليل تركيزات الجلوكوز والزيلوز والأرابينوز في الكتلة الحيوية المتحللة بالحمض باستخدام نظام Shimadzu HPLC المجهز بجهاز أخذ عينات تلقائي ، ومسخن عمود ، ومضخة متساوية ، وكاشف معامل الانكسار على عمود Bio-Rad Aminex HPX-87H.تم الحفاظ على العمود عند 50 درجة مئوية وتم التصفية التتابعية باستخدام 0.6 مل / دقيقة 5 ملي مولار H2SO4 في الماء.تدفق.
تم تخفيف المادة الطافية المتحللة بالماء وتحليلها لمحتوى المونومر والسكاريد القليل.تم تحليل السكريات الأحادية التي تم الحصول عليها بعد التحلل المائي الأنزيمي بواسطة HPLC المجهز بعمود Bio-Rad (Hercules ، CA) Aminex HPX-87P وعمود حماية الرماد.تم الحفاظ على درجة حرارة العمود عند 80 درجة مئوية ، تم استخدام الماء كمرحلة متحركة بمعدل تدفق 0.6 مل / دقيقة.تم تحديد السكريات القليلة عن طريق التحلل المائي في الحمض المخفف عند 121 درجة مئوية وفقًا للطرق الموضحة في المراجع.41 ، 48 ، 49.
تم إجراء تحليل السكاريد على جميع بقايا الكتلة الحيوية الخام والمعالجة مسبقًا AFEX وجميع بقايا الكتلة الحيوية غير المتحللة بالماء (بما في ذلك إنتاج مستخلصات جدار الخلية التسلسلي وفحص mAb الخاص بهم) باستخدام الإجراءات الموصوفة سابقًا 27 ، 43 ، 50 ، 51.لتحليل glycome ، يتم تحضير المخلفات غير القابلة للذوبان في الكحول لمواد جدار الخلية النباتية من مخلفات الكتلة الحيوية وتخضع لاستخراج متسلسل بكواشف شديدة العدوانية مثل أكسالات الأمونيوم (50 ملي مولار) وكربونات الصوديوم (50 ملي مولار و 0.5٪ وزن / حجم) ، CON.(1 م و 4 م ، كلاهما يحتوي على 1٪ وزن / حجم بوروهيدريد الصوديوم) وحمض كلوريت كما هو موصوف سابقًا.تم بعد ذلك تعريض المستخلصات لـ ELISA مقابل لوحة معقدة من mAb50s موجهة إلى جليكان جدار الخلية ، وتم تقديم تفاعلات ربط mAb كخريطة حرارة.تم شراء mAbs التي تستهدف جدار الخلية النباتية من مخزون المختبرات (سلسلة CCRC و JIM و MAC).
خطوة واحدة biotinylation للسكريات قليلة السكاريد.تم إجراء اقتران الكربوهيدرات مع البيوتين- LC- هيدرازيد باستخدام الإجراء التالي.تمت إذابة Biotin-LC- هيدرازيد (4.6 مجم / 12 ميكرولتر) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO ، 70 ميكرولتر) عن طريق التقليب والتسخين بقوة عند 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.يضاف حمض الخليك الجليدي (30 ميكرولتر) ويصب الخليط على سيانوبوروهيدريد الصوديوم (6.4 مجم / 100 ميكرو مول) ويذوب تمامًا بعد التسخين عند 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة تقريبًا.بعد ذلك ، تمت إضافة من 5 إلى 8 ميكرولتر من خليط التفاعل إلى قليل السكاريد المجفف (1-100 نانومول) للحصول على 10 أضعاف أو أكثر من المولي الزائد من الملصق على الطرف المختزل.تم إجراء التفاعل عند 65 درجة مئوية لمدة ساعتين ، وبعد ذلك تمت تنقية العينات على الفور.لم يتم استخدام سيانوبوروهيدريد الصوديوم في تجارب وضع العلامات بدون اختزال ، وتم تفاعل العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة.
طلاء ELISA وغسل عينات من السكريات قليلة التقلص الحيوي.تمت إضافة 25 ميكرولتر من العينات المعالجة بالبيوتين (100 ميكرولتر من كل عينة مركزة مخففة في 5 مل من محلول عازلة 0.1 M تريس (TBS)) إلى كل بئر من اللوحة المطلية بأفيدين.تم طلاء آبار التحكم بـ 50 ميكرولتر من البيوتين بتركيز 10 ميكروغرام / مل في 0.1 M TBS.تم استخدام الماء منزوع الأيونات كطلاء للقياسات الفارغة.تم تحضين القرص لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة في الظلام.اغسل الطبق 3 مرات مع 0.1٪ لبن منزوع الدسم في 0.1 م تيرابايت باستخدام رقم البرنامج.11 لشقة جرينير 3 أ.
إضافة وغسل الأجسام المضادة الأولية.أضف 40 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي لكل بئر.احتضان صفيحة ميكروسكوبية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.تم بعد ذلك غسل الأطباق 3 مرات مع 0.1٪ حليب في 0.1 مليون TBS باستخدام برنامج الغسيل رقم 11 لـ Grenier Flat 3A.
أضف الجسم المضاد الثانوي واغسله.أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي للفأر / الجرذ (المخفف 1: 5000 في 0.1٪ حليب في 0.1 م TBS) لكل بئر.احتضان صفيحة ميكروسكوبية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.تم بعد ذلك غسل الألواح الدقيقة 5 مرات باستخدام 0.1٪ حليب في 0.1 مليون تيرابايت باستخدام برنامج غسيل الأطباق Grenier Flat 5A رقم 12.
إضافة ركيزة.أضف 50 ميكرولتر من 3،3 ، 5،5′-tetramethylbenzidine (TMB) إلى الركيزة الأساسية (بإضافة قطرتين من المخزن المؤقت ، و 3 قطرات من TMB ، وقطرتان من بيروكسيد الهيدروجين إلى 15 مل من الماء منزوع الأيونات).تحضير الركيزة TMB.ودوامة قبل الاستخدام).احتضان صفيحة ميكروسكوبية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.في الظلام.
أكمل الخطوة واقرأ الجهاز اللوحي.أضف 50 ميكرولتر من 1 N حامض الكبريتيك لكل بئر وسجل الامتصاص من 450 إلى 655 نانومتر باستخدام قارئ ELISA.
تحضير محاليل 1 مجم / مل من هذه التحليلات في الماء منزوع الأيونات: أرابينوز ، رامنوز ، فوكوز ، زيلوز ، حمض جالاكتورونيك (جالا) ، حمض الجلوكورونيك (GlcA) ، مانوز ، جلوكوز ، جالاكتوز ، لاكتوز ، N-acetylmannosamine (manNAc) ، N-acetylglucosamine.(glcNAc) ، N-acetylgalactosamine (galNAc) ، إينوزيتول (المعيار الداخلي).تم تحضير معيارين بإضافة محاليل سكر 1 مجم / مل الموضحة في الجدول 1. يتم تجميد العينات وتجفيفها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى تتم إزالة كل الماء (عادة حوالي 12-18 ساعة).
أضف 100-500 ميكروغرام من العينة إلى أنابيب الغطاء اللولبية على ميزان تحليلي.سجل المبلغ المضاف.من الأفضل إذابة العينة بتركيز معين من المذيب وإضافتها إلى الأنبوب كقسمة سائلة.استخدم 20 ميكرولتر من 1 مجم / مل إينوزيتول كمعيار داخلي لكل أنبوب عينة.يجب أن تكون كمية المعيار الداخلي المضافة إلى العينة هي نفسها كمية المعيار الداخلي المضافة إلى الأنبوب القياسي.
أضف 8 مل من الميثانول اللامائي إلى قارورة ذات غطاء لولبي.ثم 4 مل من 3 ن.محلول حمض الهيدروكلوريك الميثانولي ، توج ورج.هذه العملية لا تستخدم الماء.
إضافة 500 ميكرولتر من محلول الميثانول 1 M حمض الهيدروكلوريك لعينات قليلة السكريات وأنابيب TMS القياسية.تم تحضين العينات طوال الليل (168 ساعة) عند 80 درجة مئوية في قالب حراري.جفف منتج تحلل الميثان في درجة حرارة الغرفة باستخدام مشعب تجفيف.أضف 200 ميكرولتر MeOH وجفف مرة أخرى.هذه العملية تتكرر مرتين.أضف 200 ميكرولتر من الميثانول و 100 ميكرولتر من بيريدين و 100 ميكرولتر من أنهيدريد الخل إلى العينة واخلطهم جيدًا.تم تحضين العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.وتجفف.أضف 200 ميكرولتر من الميثانول وجفف مرة أخرى.
أضف 200 ميكرولتر من Tri-Sil وأنبوب مغطى بالحرارة لمدة 20 دقيقة.80 درجة مئوية ، ثم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.استخدم مشعب تجفيف لمزيد من تجفيف العينة إلى حجم حوالي 50 ميكرولتر.من المهم ملاحظة أننا لم نسمح للعينات أن تجف تمامًا.
أضف 2 مل من الهكسان واخلطه جيدًا بواسطة دوامة.املأ أطراف ماصات Pasteur (5-8 مم) بقطعة من الصوف الزجاجي عن طريق إدخال الصوف الزجاجي فوق ماصة قطرها 5-3 / 4 بوصة.تم طرد العينات عند 3000 جم لمدة دقيقتين.يتم ترسيب أي بقايا غير قابلة للذوبان.جفف العينة إلى 100-150 ميكرولتر.تم حقن حجم ما يقرب من 1 ميكرولتر في GC-MS عند درجة حرارة أولية تبلغ 80 درجة مئوية ووقت أولي يبلغ 2.0 دقيقة (الجدول 2).