نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
طرق مناعية وقياس طيفي جديدة لتحليل معقد للسكريات قليلة التعدد المستعصية في سيقان الذرة المعالجة مسبقًا بتقنية AFEX. تُعد الكتلة الحيوية الليغنوسليلوزية بديلاً مستدامًا للوقود الأحفوري، وتُستخدم على نطاق واسع في تطوير التقنيات الحيوية لإنتاج منتجات مثل الغذاء والأعلاف والوقود والمواد الكيميائية. يكمن مفتاح هذه التقنيات في تطوير عمليات تنافسية من حيث التكلفة لتحويل الكربوهيدرات المعقدة الموجودة في جدران الخلايا النباتية إلى سكريات بسيطة مثل الجلوكوز والزيلوز والأرابينوز. نظرًا لأن الكتلة الحيوية الليغنوسليلوزية شديدة المقاومة، يجب إخضاعها لمعالجات كيميائية حرارية (مثل تقشير الألياف بالأمونيا (AFEX)، والأحماض المخففة (DA)، والسوائل الأيونية (IL)) ومعالجات بيولوجية (مثل التحلل الإنزيمي والتخمر الميكروبي) مجتمعة للحصول على المنتج المطلوب. مع ذلك، عند استخدام الإنزيمات الفطرية التجارية في عملية التحلل المائي، فإن 75-85% فقط من السكريات الذائبة المتكونة هي سكريات أحادية، بينما تشكل السكريات قليلة التعدد الذائبة والمعقدة النسبة المتبقية (15-25%)، وهي ليست متاحة دائمًا للكائنات الدقيقة. وقد نجحنا سابقًا في عزل وتنقية السكريات قليلة التعدد الذائبة والمعقدة باستخدام مزيج من فصل الكربون والتراب الدياتومي وفصل الكروماتوغرافيا الاستبعادية الحجمية، كما درسنا خصائصها المثبطة للإنزيمات. ووجدنا أن السكريات قليلة التعدد التي تحتوي على بدائل حمض اليورونيك الميثيلي ذات درجة بلمرة عالية (DP) أصعب في المعالجة باستخدام مزيج الإنزيمات التجارية من السكريات قليلة التعدد ذات درجة البلمرة المنخفضة والمتعادلة. نقدم هنا استخدام عدة طرق إضافية، تشمل تحليل الغليكان باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) المتخصصة في غليكانات الكتلة الحيوية النباتية لتوصيف روابط الغليكان في جدران الخلايا النباتية والمُحللات الإنزيمية، والتأين بالليزر بمساعدة المصفوفة، وقياس الطيف الكتلي بزمن الطيران (MALDI-TOF-MS). تستخدم هذه الطريقة قممًا تشخيصية غنية بالمعلومات البنيوية، يتم الحصول عليها بواسطة التحليل الطيفي بعد التحلل الثانوي للأيونات السالبة، بالإضافة إلى كروماتوغرافيا الغاز وقياس الطيف الكتلي (GC-MS) لتوصيف روابط السكريات قليلة الوحدات مع وبدون اشتقاق. ونظرًا لصغر حجم السكريات قليلة الوحدات (درجة البلمرة 4-20)، يصعب استخدام هذه الجزيئات لربط الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وتوصيفها. للتغلب على هذه المشكلة، طبقنا طريقة جديدة لتثبيت السكريات قليلة الوحدات باستخدام البيوتين، والتي نجحت في وسم غالبية السكريات قليلة الوحدات الذائبة ذات درجة البلمرة المنخفضة على سطح الصفيحة الدقيقة، والتي استُخدمت لاحقًا في نظام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عالي الإنتاجية لتحليل الربط النوعي. ستُسهّل هذه الطريقة الجديدة تطوير فحوصات جليكومية أكثر تطورًا وعالية الإنتاجية في المستقبل، والتي يُمكن استخدامها لعزل وتوصيف السكريات قليلة الوحدات الموجودة في المؤشرات الحيوية لأغراض التشخيص.
تُعدّ الكتلة الحيوية الليغنوسليلوزية، المُكوّنة من مواد زراعية وحرجية وعشبية وخشبية، مادة خام محتملة لإنتاج منتجات حيوية، بما في ذلك الغذاء والعلف والوقود والمواد الكيميائية الأولية لإنتاج منتجات ذات قيمة أعلى.¹ تُحوّل الكربوهيدرات (مثل السليلوز والهيميسليلوز) الموجودة في جدران الخلايا النباتية إلى سكريات أحادية عن طريق المعالجة الكيميائية والتحويل الحيوي (مثل التحلل الإنزيمي والتخمر الميكروبي). تشمل المعالجات الأولية الشائعة تمديد الألياف بالأمونيا (AFEX)، والحمض المخفف (DA)، والسائل الأيوني (IL)، والانفجار البخاري (SE)، والتي تستخدم مزيجًا من المواد الكيميائية والحرارة لتقليل إنتاج الليغنوسليلوز عن طريق فتح جدران الخلايا النباتية.^3،4 يُجرى التحلل الإنزيمي عند حمولة عالية من المواد الصلبة باستخدام إنزيمات تجارية نشطة تحتوي على الكربوهيدرات (CAZymes)، بينما يُجرى التخمر الميكروبي باستخدام الخمائر أو البكتيريا المُعدّلة وراثيًا لإنتاج الوقود والمواد الكيميائية الحيوية.⁶
تتكون إنزيمات CAZymes التجارية من مزيج معقد من الإنزيمات التي تعمل بتآزر على كسر الروابط المعقدة بين الكربوهيدرات والسكريات لتكوين السكريات الأحادية. وكما ذكرنا سابقًا، فإن الشبكة المعقدة من البوليمرات العطرية للّجنين مع الكربوهيدرات تجعلها صعبة التحلل، مما يؤدي إلى تحويل غير كامل للسكريات، وتراكم ما بين 15 و25% من السكريات قليلة التعدد التي لا تُنتج أثناء التحلل الإنزيمي للكتلة الحيوية المعالجة مسبقًا. تُعد هذه مشكلة شائعة في مختلف طرق المعالجة المسبقة للكتلة الحيوية. تشمل بعض أسباب هذه المشكلة تثبيط الإنزيم أثناء التحلل المائي، أو غياب أو انخفاض مستويات الإنزيمات الأساسية اللازمة لكسر روابط السكر في الكتلة الحيوية النباتية. إن فهم تركيب وخصائص السكريات، مثل روابط السكر في السكريات قليلة التعدد، سيساعدنا على تحسين تحويل السكريات أثناء التحلل المائي، مما يجعل العمليات البيوتكنولوجية قادرة على المنافسة من حيث التكلفة مع المنتجات المشتقة من البترول.
يُعدّ تحديد بنية الكربوهيدرات أمرًا بالغ الصعوبة، ويتطلب استخدام مجموعة من الطرق، مثل كروماتوغرافيا السائل (LC)¹¹،¹²، وقياس الطيف بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)¹³، والرحلان الكهربائي الشعيري (CE)¹⁴،¹⁵،¹⁶، وقياس الطيف الكتلي (MS)¹⁷،¹⁸. وتُعتبر طرق قياس الطيف الكتلي، مثل قياس الطيف الكتلي بزمن الطيران مع التأين بالليزر باستخدام مصفوفة (MALDI-TOF-MS)، طريقةً متعددة الاستخدامات لتحديد بنى الكربوهيدرات. ومؤخرًا، أصبح قياس الطيف الكتلي الترادفي بالتفكك الناتج عن التصادم (CID) لمركبات أيونات الصوديوم الأكثر استخدامًا لتحديد البصمات التي تُشير إلى مواقع ارتباط السكريات قليلة الوحدات، والتكوينات الأنوميرية، والتسلسلات، ومواقع التفرع²⁰،²¹.
يُعد تحليل الغليكان أداةً ممتازةً لتحديد روابط الكربوهيدرات بدقةٍ متناهية²². تستخدم هذه الطريقة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) الموجهة ضد غليكان جدار الخلية النباتية كمجسات لفهم روابط الكربوهيدرات المعقدة. يتوفر أكثر من 250 جسمًا مضادًا وحيد النسيلة في جميع أنحاء العالم، مصممة ضد أنواع مختلفة من السكريات قليلة الوحدات الخطية والمتفرعة باستخدام سكريات متنوعة²⁴. وقد استُخدمت العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة على نطاق واسع لتوصيف بنية جدار الخلية النباتية وتركيبه وتعديلاته، نظرًا لوجود اختلافات كبيرة اعتمادًا على نوع الخلية النباتية والعضو والعمر ومرحلة النمو وبيئة النمو^25،26. ومؤخرًا، استُخدمت هذه الطريقة لفهم تجمعات الحويصلات في الأنظمة النباتية والحيوانية وأدوارها في نقل الغليكان كما هو محدد بواسطة المؤشرات الخلوية الفرعية أو مراحل النمو أو المحفزات البيئية، ولتحديد النشاط الإنزيمي. تتضمن بعض الهياكل المختلفة للسكريات والزيلانات التي تم تحديدها البكتين (P) والزيلان (X) والمانان (M) والزيلوجلوكان (XylG) والجلوكانات ذات الروابط المختلطة (MLG) والأرابينوكسيلان (ArbX) والجالاكتومانان (GalG) وحمض الجلوكورونيك-أرابينوكسيلان (GArbX) والأرابينو-جالاكتان (ArbG)29.
مع ذلك، ورغم كل هذه الجهود البحثية، لم تُركز سوى دراسات قليلة على طبيعة تراكم السكريات قليلة الوحدات أثناء التحلل المائي في وجود حمولة عالية من المواد الصلبة، بما في ذلك إطلاق السكريات قليلة الوحدات، وتغيرات طول السلسلة قليلة الوحدات أثناء التحلل المائي، وبوليمرات مختلفة ذات درجة بلمرة منخفضة، ومنحنيات توزيعها 30، 31، 32. في الوقت نفسه، ورغم أن تحليل السكريات أثبت جدواه كأداة مفيدة للتحليل الشامل لبنية السكريات، إلا أنه من الصعب تقييم السكريات قليلة الوحدات ذات درجة البلمرة المنخفضة والقابلة للذوبان في الماء باستخدام طرق الأجسام المضادة. فالسكريات قليلة الوحدات ذات درجة البلمرة المنخفضة، والتي يقل وزنها الجزيئي عن 5-10 كيلو دالتون، لا ترتبط بألواح ELISA 33، 34، وتُغسل قبل إضافة الأجسام المضادة.
نقدم هنا، ولأول مرة، اختبار ELISA على صفائح مغلفة بالأفيدين باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، جامعًا بين إجراء بيوتينيليشن أحادي الخطوة للسكريات قليلة التعدد القابلة للذوبان والمقاوم للتحلل، وتحليل الجليكوم. وقد تم التحقق من صحة منهجنا لتحليل الجليكوم باستخدام تحليل MALDI-TOF-MS وGC-MS لروابط السكريات قليلة التعدد التكميلية، وذلك باستخدام مشتقات ثلاثي ميثيل سيليل (TMS) لتراكيب السكريات المتحللة. يمكن تطوير هذا المنهج المبتكر ليصبح طريقة عالية الإنتاجية في المستقبل، وإيجاد تطبيقات أوسع في البحوث الطبية الحيوية.
تؤثر التعديلات اللاحقة للترجمة للإنزيمات والأجسام المضادة، مثل الغلكزة، على نشاطها البيولوجي. فعلى سبيل المثال، تلعب التغيرات في غلكزة بروتينات المصل دورًا هامًا في التهاب المفاصل، وتُستخدم هذه التغيرات كعلامات تشخيصية. وقد أشارت الدراسات إلى ظهور أنواع مختلفة من السكريات بسهولة في العديد من الأمراض، بما في ذلك الأمراض الالتهابية المزمنة في الجهاز الهضمي والكبد، والعدوى الفيروسية، وسرطانات المبيض والثدي والبروستاتا. إن فهم بنية السكريات باستخدام طرق ELISA القائمة على الأجسام المضادة سيوفر ثقة أكبر في تشخيص الأمراض دون الحاجة إلى استخدام طرق قياس الطيف الكتلي المعقدة.
أظهرت دراستنا السابقة أن السكريات قليلة التعدد المقاومة تبقى غير متحللة بعد المعالجة المسبقة والتحلل الإنزيمي (الشكل 1). في بحثنا المنشور سابقًا، طورنا طريقة استخلاص الطور الصلب باستخدام الفحم المنشط لعزل السكريات قليلة التعدد من محلول تحلل قش الذرة المعالج مسبقًا بالفحم المنشط (ACSH). بعد الاستخلاص والفصل الأوليين، تم تجزئة السكريات قليلة التعدد بشكل إضافي باستخدام كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي (SEC) وجمعها حسب الوزن الجزيئي. تم تحليل مونومرات السكريات وقليلات السكريات الناتجة عن المعالجات المسبقة المختلفة من خلال تحليل تركيب السكريات. عند مقارنة محتوى قليلات السكريات التي تم الحصول عليها باستخدام طرق المعالجة المسبقة المختلفة، يتضح أن وجود السكريات قليلة التعدد المقاومة يمثل مشكلة شائعة في تحويل الكتلة الحيوية إلى سكريات أحادية، ويمكن أن يؤدي إلى انخفاض في إنتاجية السكر بنسبة لا تقل عن 10-15%، وقد تصل إلى 18%. تُستخدم هذه الطريقة لإنتاج أجزاء السكريات قليلة التعدد على نطاق واسع. تم استخدام ACH الناتج وأجزائه اللاحقة ذات الأوزان الجزيئية المختلفة كمادة تجريبية لتوصيف السكريات قليلة الوحدات في هذا العمل.
بعد المعالجة المسبقة والتحلل الإنزيمي، بقيت السكريات قليلة التعدد غير متحللة. يوضح الشكل (أ) طريقة فصل السكريات قليلة التعدد، حيث تُعزل من محلول التحلل المائي لقش الذرة المعالج مسبقًا بتقنية AFEX (ACSH) باستخدام طبقة معبأة من الكربون المنشط والتراب الدياتومي. يوضح الشكل (ب) طريقة فصل السكريات قليلة التعدد، والتي فُصلت لاحقًا باستخدام كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي (SEC). يوضح الشكل (ج) مونومرات السكريات ومتعدداتها الناتجة عن المعالجات المسبقة المختلفة (حمض مخفف: DA، سائل أيوني: IL، وAFEX). ظروف التحلل الإنزيمي: تحميل عالي للمواد الصلبة بنسبة 25٪ (وزن/وزن) (تحميل غلوكان بنسبة 8٪ تقريبًا)، تحلل لمدة 96 ساعة، تحميل إنزيم تجاري 20 ملغم/غ (نسبة Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) و (د) مونومرات السكريات وقليلات السكريات من الجلوكوز والزيلوز والأرابينوز المنطلقة من سيقان الذرة المعالجة مسبقًا بـ AFEX (ACS).
أثبت تحليل السكريات أنه أداة مفيدة لإجراء تحليل بنيوي شامل للسكريات في المستخلصات المعزولة من مخلفات الكتلة الحيوية الصلبة. مع ذلك، فإن السكريات الذائبة في الماء لا تُمثَّل تمثيلاً كافياً باستخدام هذه الطريقة التقليدية⁴¹، وذلك لصعوبة تثبيت السكريات قليلة التعدد ذات الوزن الجزيئي المنخفض على صفائح ELISA، حيث تُغسل قبل إضافة الأجسام المضادة. لذا، ولغرض ربط الأجسام المضادة وتوصيفها، استُخدمت طريقة البيوتينية أحادية الخطوة لتغطية السكريات قليلة التعدد الذائبة وغير المتوافقة على صفائح ELISA المغلفة بالأفيدين. جُرِّبت هذه الطريقة باستخدام ACSH الذي أنتجناه سابقاً، وجزء منه بناءً على وزنه الجزيئي (أو درجة بلمرته). استُخدمت البيوتينية أحادية الخطوة لزيادة ألفة ارتباط السكريات قليلة التعدد بإضافة بيوتين-LC-هيدرازيد إلى الطرف المختزل للكربوهيدرات (الشكل 2). في المحلول، تتفاعل مجموعة الهيمياستال عند الطرف المختزل مع مجموعة الهيدرازيد في بيوتين-LC-هيدرازيد لتكوين رابطة هيدرازون. بوجود عامل الاختزال NaCNBH3، تُختزل رابطة الهيدرازون إلى ناتج نهائي بيوتيني مستقر. مع تعديل الطرف المختزل للسكر، أصبح من الممكن ربط السكريات قليلة التعدد ذات درجة البلمرة المنخفضة بألواح ELISA، وفي دراستنا، تم ذلك على ألواح مغلفة بالأفيدين باستخدام أجسام مضادة أحادية النسيلة تستهدف السكريات.
فحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة باستخدام مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للكشف عن السكريات قليلة الوحدات المُبَيتَنَة. يوضح الشكل (أ) عملية دمج عملية البيوتين للسكريات قليلة الوحدات مع فحص ELISA اللاحق باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة تستهدف السكريات على صفائح مطلية بالنيوترأفيدين، بينما يوضح الشكل (ب) إجراءً من خطوة واحدة لبيوتين نواتج التفاعل.
أُضيفت الأجسام المضادة الأولية والثانوية إلى صفائح مطلية بالأفيدين ومُحمّلة بأجسام مضادة مرتبطة بالأوليغوساكاريد، ثم غُسلت في وسط حساس للضوء والوقت. بعد اكتمال ارتباط الأجسام المضادة، أُضيف ركيزة TMB لحضانة الصفيحة. أُوقف التفاعل في النهاية باستخدام حمض الكبريتيك. حُللت الصفائح المحضونة باستخدام قارئ ELISA لتحديد قوة ارتباط كل جسم مضاد للكشف عن التشابك النوعي للأجسام المضادة. لمزيد من التفاصيل ومعايير التجربة، يُرجى مراجعة القسم ذي الصلة "المواد والطرائق".
نُبرهن على فائدة هذه الطريقة المُطوَّرة حديثًا لتطبيقات مُحدَّدة من خلال توصيف السكريات قليلة التعدد الذائبة الموجودة في مُستخلصات التحلل المائي للمواد الليغنوسليلوزية، بالإضافة إلى أجزاء السكريات قليلة التعدد الخامة والمُنقَّاة المُستخلصة من مُستخلصات التحلل المائي للمواد الليغنوسليلوزية. وكما هو مُوضَّح في الشكل 3، فإن أكثر أنواع الزيلانات المُستبدلة بالإبيتوب شيوعًا، والتي تم تحديدها في مُستخلصات التحلل المائي للمواد الليغنوسليلوزية باستخدام طرق فحص الجليكوم المُؤَسْتَلَة بيولوجيًا، هي عادةً أرابينوجالاكتانات اليورونيك (U) أو ميثيل يورونيك (MeU) والبكتين. وقد وُجِد مُعظمها أيضًا في دراستنا السابقة حول تحليل جليكانات المواد الصلبة غير المُتحللة (UHS)⁴³.
الكشف عن محددات المستضدات السكرية قليلة الوحدات المقاومة باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة موجه ضد غليكان جدار الخلية. الجزء "المحايد" هو جزء الأسيتونيتريل، والجزء "الحمضي" هو جزء حمض الفورميك. تشير درجات اللون الأحمر الأكثر سطوعًا على الخريطة الحرارية إلى محتوى أعلى من محددات المستضدات، بينما تشير درجات اللون الأزرق الأكثر سطوعًا إلى خلفية فارغة. تستند قيم الألوان على المقياس إلى قيم الامتصاص الضوئي الخام للتركيبات N=2. تظهر محددات المستضدات الرئيسية التي تتعرف عليها الأجسام المضادة على اليمين.
لم تتمكن معظم إنزيمات السليولاز والهيميسليولاز الشائعة في مزيج الإنزيمات التجارية المختبرة، والتي تشمل أكثر الإنزيمات التجارية استخدامًا، من تحليل هذه البنى غير السليلوزية. لذا، يلزم وجود إنزيمات مساعدة جديدة لتحليلها. وبدون هذه الإنزيمات المساعدة غير السليلوزية، تمنع هذه الروابط غير السليلوزية التحول الكامل إلى سكريات أحادية، حتى لو تم تحليل بوليمرات السكر الأصلية بشكل مكثف إلى أجزاء أقصر وإذابتها باستخدام مزيج الإنزيمات التجارية.
أظهرت دراسة إضافية لتوزيع الإشارة وقوة ارتباطها أن عدد المواقع المرتبطة بالأجسام المضادة كان أقل في أجزاء السكريات ذات درجة البلمرة العالية (A، B، C، درجة بلمرة تصل إلى 20+) مقارنةً بأجزاء السكريات ذات درجة البلمرة المنخفضة (D، E، F، درجة بلمرة أقل في الثنائيات) (الشكل 1). وتُعد الشظايا الحمضية أكثر شيوعًا في المواقع المرتبطة بالأجسام المضادة غير السليلوزية مقارنةً بالشظايا المتعادلة. تتوافق هذه الظواهر مع النمط الملاحظ في دراستنا السابقة، حيث كانت السكريات ذات درجة البلمرة العالية والجزيئات الحمضية أكثر مقاومة للتحلل الإنزيمي. لذلك، يُمكن أن يُساهم وجود مواقع مرتبطة بالأجسام المضادة غير السليلوزية واستبدالات اليوراسيل (U) وميثيل يوراسيل (MeU) بشكل كبير في استقرار السكريات قليلة الوحدات. تجدر الإشارة إلى أن كفاءة الارتباط والكشف قد تكون إشكالية بالنسبة للسكريات قليلة الوحدات ذات درجة البلمرة المنخفضة، خاصةً إذا كان الموقع المرتبط بالجسم المضاد ثنائيًا أو ثلاثيًا. يُمكن اختبار ذلك باستخدام سكريات قليلة الوحدات تجارية بأطوال مختلفة، يحتوي كل منها على موقع مرتبط واحد فقط يرتبط بجسم مضاد أحادي النسيلة (mAb) محدد.
وهكذا، كشف استخدام الأجسام المضادة النوعية للبنية عن أنواع معينة من الروابط المستعصية. وبناءً على نوع الجسم المضاد المستخدم، ونمط الربط المناسب، وقوة الإشارة التي ينتجها (الأكثر والأقل وفرة)، يمكن تحديد إنزيمات جديدة وإضافتها شبه كميًا إلى مزيج الإنزيمات لتحقيق تحويل جليكوزيلي أكثر اكتمالًا. وبأخذ تحليل قليل السكريات ACSH كمثال، يمكننا إنشاء قاعدة بيانات لروابط الجليكان لكل مادة من مواد الكتلة الحيوية. تجدر الإشارة هنا إلى ضرورة مراعاة اختلاف ألفة الأجسام المضادة، وإذا كانت ألفتها غير معروفة، فسيؤدي ذلك إلى صعوبات عند مقارنة إشارات الأجسام المضادة المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون مقارنة روابط الجليكان أكثر فعالية بين العينات لنفس الجسم المضاد. ويمكن بعد ذلك ربط هذه الروابط المستعصية بقاعدة بيانات CAZyme، والتي يمكننا من خلالها تحديد الإنزيمات، واختيار الإنزيمات المرشحة، واختبار الإنزيمات القادرة على كسر الروابط، أو تطوير أنظمة ميكروبية للتعبير عن هذه الإنزيمات لاستخدامها في المصافي الحيوية.
لتقييم كيفية تكامل الطرق المناعية مع الطرق البديلة لتوصيف السكريات قليلة التعدد ذات الوزن الجزيئي المنخفض الموجودة في مُحلِّلات الليغنوسليلوز، أجرينا تحليل MALDI (الشكل 4، S1-S8) وتحليل السكريات المُشتقة من TMS باستخدام GC-MS على نفس جزء السكريات قليلة التعدد (الشكل 5). يُستخدم MALDI لمقارنة ما إذا كان توزيع كتلة جزيئات السكريات قليلة التعدد يتطابق مع البنية المقصودة. يُظهر الشكل 4 توزيع الكتلة للمكونين المتعادلين ACN-A وACN-B. أكد تحليل ACN-A وجود مجموعة من سكريات البنتوز تتراوح درجة بلمرتها من 4 إلى 8 (الشكل 4) إلى 22 (الشكل S1)، والتي تتوافق أوزانها مع سكريات MeU-xylan قليلة التعدد. أكد تحليل ACN-B وجود سلسلة البنتوز والجلوكوكسيلان بدرجة بلمرة تتراوح من 8 إلى 15. في المواد التكميلية، مثل الشكل S3، تُظهر خرائط توزيع كتلة الجزء الحمضي FA-C نطاقًا من سكريات البنتوز المُستبدلة بـ(Me)U بدرجة بلمرة تتراوح بين 8 و15، وهي تتوافق مع الزيلانات المُستبدلة التي تم العثور عليها في فحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة القائم على تقنية ELISA. وتتوافق الحواتم.
طيف MALDI-MS للسكريات قليلة الوحدات غير المتوافقة القابلة للذوبان الموجودة في ACS. هنا، (أ) أجزاء ACN-A ذات الوزن المنخفض التي تحتوي على سكريات قليلة الوحدات من نوع غلوكوروكسيلان مستبدلة بحمض اليورونيك الميثيلي (DP 4-8) و (ب) سكريات قليلة الوحدات من نوع زيلان وحمض اليورونيك الميثيلي مستبدلة بغلوكوروكسيلان (DP 8-15).
تحليل تركيب بقايا الغليكان في السكريات قليلة الوحدات المقاومة للتحلل. يوضح الشكل (أ) تركيب سكريات TMS في مختلف أجزاء السكريات قليلة الوحدات التي تم الحصول عليها باستخدام تحليل GC-MS. يوضح الشكل (ب) تراكيب السكريات المختلفة المشتقة من TMS الموجودة في السكريات قليلة الوحدات. ACN: جزء الأسيتونيتريل الذي يحتوي على سكريات قليلة الوحدات متعادلة، وFA: جزء حمض الفيروليك الذي يحتوي على سكريات قليلة الوحدات حمضية.
تم التوصل إلى استنتاج آخر مثير للاهتمام من تحليل LC-MS لجزء السكريات قليلة الوحدات، كما هو موضح في الشكل S9 (يمكن الاطلاع على الطرق في الملحق الإلكتروني). لوحظت شظايا من الهكسوز ومجموعات -OAc بشكل متكرر أثناء ربط جزء ACN-B. لا تؤكد هذه النتيجة التجزئة الملاحظة في تحليل الجليكوم وMALDI-TOF فحسب، بل توفر أيضًا معلومات جديدة حول مشتقات الكربوهيدرات المحتملة في الكتلة الحيوية الليغنوسليلوزية المعالجة مسبقًا.
قمنا أيضًا بتحليل التركيب السكري لجزء السكريات قليلة الوحدات باستخدام اشتقاق السكريات بواسطة TMS. وباستخدام تقنية GC-MS، حددنا تركيب السكريات المحايدة (غير المشتقة) والحمضية (GluA وGalA) في جزء السكريات قليلة الوحدات (الشكل 5). وُجد حمض الجلوكورونيك في المكونين الحمضيين C وD، بينما وُجد حمض الجالاكتيورونيك في المكونين الحمضيين A وB، وكلاهما من مكونات السكريات الحمضية ذات درجة البلمرة العالية. لا تؤكد هذه النتائج بياناتنا من ELISA وMALDI فحسب، بل تتوافق أيضًا مع دراساتنا السابقة حول تراكم السكريات قليلة الوحدات. لذلك، نعتقد أن الطرق المناعية الحديثة التي تستخدم البيوتينيل للسكريات قليلة الوحدات والفحص اللاحق بتقنية ELISA كافية للكشف عن السكريات قليلة الوحدات الذائبة المقاومة في مختلف العينات البيولوجية.
نظراً للتحقق من صحة طرق فحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة القائمة على تقنية ELISA باستخدام عدة طرق مختلفة، فقد أردنا استكشاف إمكانات هذه الطريقة الكمية الجديدة بشكل أعمق. تم شراء نوعين تجاريين من السكريات قليلة الوحدات، وهما سكريات زيلوهيكساسكاريد قليلة الوحدات (XHE) و23-α-L-أرابينوفورانوزيل-زيلوتريوز (A2XX)، واختُبرا باستخدام نهج جديد للأجسام المضادة وحيدة النسيلة يستهدف غليكان جدار الخلية. يوضح الشكل 6 وجود علاقة خطية بين إشارة الارتباط البيوتينيلية ولوغاريتم تركيز السكريات قليلة الوحدات، مما يشير إلى نموذج امتزاز لانغموير محتمل. من بين الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، ارتبطت الأجسام المضادة CCRC-M137 وCCRC-M138 وCCRC-M147 وCCRC-M148 وCCRC-M151 بـ XHE، بينما ارتبطت الأجسام المضادة CCRC-M108 وCCRC-M109 وLM11 بـ A2XX ضمن نطاق يتراوح بين 1 نانومتر و100 نانومتر. ونظرًا لمحدودية كمية الأجسام المضادة المتاحة خلال التجربة، أُجريت تجارب محدودة لكل تركيز من السكريات قليلة الوحدات. تجدر الإشارة هنا إلى أن بعض الأجسام المضادة تتفاعل بشكل مختلف تمامًا مع نفس السكريات قليلة الوحدات كركيزة، ويُعزى ذلك على الأرجح إلى ارتباطها بمواقع محددة مختلفة قليلاً، واختلاف تقارب ارتباطها بشكل كبير. ستكون آليات وتداعيات تحديد المواقع المحددة بدقة أكثر تعقيدًا عند تطبيق منهج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الجديد على عينات حقيقية.
استُخدم نوعان من السكريات قليلة الوحدات التجارية لتحديد نطاق الكشف للأجسام المضادة وحيدة النسيلة المختلفة التي تستهدف السكريات. تشير الارتباطات الخطية مع لوغاريتم تركيز السكريات قليلة الوحدات إلى أنماط امتزاز لانغموير لكل من (أ) XHE مع الجسم المضاد وحيد النسيلة و(ب) A2XX مع الجسم المضاد وحيد النسيلة. تُشير الحواتم المقابلة إلى تراكيب السكريات قليلة الوحدات التجارية المستخدمة كركائز في التحليل.
يُعدّ استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المُستهدفة للسكريات (تحليل السكريات أو فحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة القائم على تقنية ELISA) أداةً فعّالةً لتوصيف مُعظم السكريات الرئيسية في جدار الخلية التي تُشكّل الكتلة الحيوية النباتية. مع ذلك، يقتصر تحليل السكريات التقليدي على توصيف السكريات الأكبر حجمًا في جدار الخلية، نظرًا لعدم تثبيت مُعظم السكريات قليلة التعدد بكفاءة على ألواح ELISA. في هذه الدراسة، تمّ تحلل سيقان الذرة المُعالجة مُسبقًا بتقنية AFEX إنزيميًا عند مُحتوى عالٍ من المواد الصلبة. استُخدم تحليل السكريات لتحديد تركيب الكربوهيدرات المُقاومة للتحلل في جدار الخلية في المُستخلص المائي. مع ذلك، يُقلّل تحليل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للسكريات قليلة التعدد الأصغر حجمًا في المُستخلصات المائية من أهميته، وهناك حاجة إلى أدوات إضافية لتثبيت السكريات قليلة التعدد بفعالية على ألواح ELISA.
نقدم هنا طريقة جديدة وفعالة لتثبيت السكريات قليلة الوحدات لفحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، وذلك بدمج عملية إضافة البيوتين إلى السكريات قليلة الوحدات متبوعةً بفحص ELISA على صفائح مطلية بـ NeutrAvidin™. أظهرت السكريات قليلة الوحدات المُثبتة والمُضاف إليها البيوتين ألفةً كافيةً للأجسام المضادة، مما مكّن من الكشف السريع والفعال عن السكريات قليلة الوحدات المقاومة. وقد أكد تحليل تركيب هذه السكريات قليلة الوحدات المقاومة، باستخدام مطياف الكتلة، نتائج هذا النهج الجديد في الفحص المناعي. وبذلك، تُبين هذه الدراسات أن الجمع بين إضافة البيوتين إلى السكريات قليلة الوحدات وفحص ELISA باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المُستهدفة للسكريات يُمكن استخدامه للكشف عن الروابط المتشابكة في السكريات قليلة الوحدات، ويمكن تطبيقه على نطاق واسع في دراسات كيميائية حيوية أخرى تُحدد بنية السكريات قليلة الوحدات.
تُعدّ هذه الطريقة لتحليل الغليكان باستخدام البيوتين أول طريقة قادرة على دراسة روابط الكربوهيدرات المعقدة في السكريات قليلة التعدد الذائبة في الكتلة الحيوية النباتية. وهذا يُساعد على فهم سبب صعوبة تحويل بعض أجزاء الكتلة الحيوية إلى وقود حيوي. تسدّ هذه الطريقة ثغرةً مهمةً في طرق تحليل الغليكوم، وتُوسّع نطاق تطبيقها ليشمل مجموعةً أوسع من المواد، تتجاوز السكريات قليلة التعدد النباتية. في المستقبل، قد نستخدم الروبوتات في عملية إضافة البيوتين، ونُطبّق الطريقة التي طوّرناها لتحليل العينات بكفاءة عالية باستخدام تقنية ELISA.
تم حصاد قش الذرة (CS) المزروع من بذور هجينة من نوع بايونير 33A14 في عام 2010 من مزارع كرامر في راي، كولورادو. وبموافقة مالك الأرض، يمكن استخدام هذه الكتلة الحيوية لأغراض البحث. تم تخزين العينات جافة بنسبة رطوبة أقل من 6% في أكياس محكمة الإغلاق في درجة حرارة الغرفة. تم تخزين العينات جافة بنسبة رطوبة أقل من 6% في أكياس محكمة الإغلاق في درجة حرارة الغرفة. يتم طحن المواد الغذائية عند انخفاض درجة الحرارة < 6% في العبوات بدرجة حرارة معتدلة. تم تخزين العينات جافة في أكياس مزودة بسحاب عند درجة حرارة الغرفة وبرطوبة أقل من 6%.يمكن أن تكون نسبة التخفيض أقل من 6%.نسبة التخفيض في الوزن أقل من 6% المواد المعبأة في العبوات آمنة تمامًا عند درجة حرارة منخفضة < 6%. يتم تخزين العينات في أكياس بسحاب في درجة حرارة الغرفة مع رطوبة أقل من 6%.التزمت الدراسة بالمعايير المحلية والوطنية. أُجري تحليل التركيب باستخدام بروتوكول المختبر الوطني للطاقة المتجددة (NREL). ووجد أن التركيب يحتوي على 31.4% غلوكان، و18.7% زيلان، و3.3% أرابينان، و1.2% غالاكتان، و2.2% أسيتيل، و14.3% ليغنين، و1.7% بروتين، و13.4% رماد.
إنزيم Cellic® CTec2 (بتركيز 138 ملغم بروتين/مل، رقم التشغيلة VCNI 0001) هو مزيج معقد من السليولاز، وبيتا-غلوكوزيداز، وإنزيم Cellic® HTec2 (بتركيز 157 ملغم بروتين/مل، رقم التشغيلة VHN00001) من شركة نوفوزيمز (فرانكلينتون، كارولاينا الشمالية، الولايات المتحدة الأمريكية). أما إنزيم Multifect Pectinase® (بتركيز 72 ملغم بروتين/مل)، وهو مزيج معقد من الإنزيمات المحللة للبكتين، فقد تبرعت به شركة دوبونت للعلوم الحيوية الصناعية (بالو ألتو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد تركيزات بروتين الإنزيم بتقدير محتوى البروتين (وطرح مساهمة النيتروجين غير البروتيني) باستخدام تحليل كيلدال للنيتروجين (طريقة AOAC 2001.11، شركة Dairy One Cooperative Inc.، إيثاكا، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء التراب الدياتومي 545 من شركة EMD Millipore (بيليريكا، ماساتشوستس). تم شراء الكربون المنشط (DARCO، حبيبات 100 مش)، و Avicel (PH-101)، وزيلان الزان، وجميع المواد الكيميائية الأخرى من شركة Sigma-Aldrich (سانت لويس، ميزوري).
أُجريت المعالجة المسبقة بتقنية AFEX في مختبر أبحاث تحويل الكتلة الحيوية (GLBRC) التابع لجامعة ولاية ميشيغان (MSU) في لانسينغ، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية. تمت المعالجة المسبقة عند درجة حرارة 140 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استُخدم مفاعل دفعي مكتبي مصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ (شركة بار إنسترومنتس) بنسبة 1:1 من الأمونيا اللامائية إلى الكتلة الحيوية، وبتركيز 60% (وزن/وزن). استغرقت المعالجة 30 دقيقة. بعد ذلك، رُفعت درجة حرارة المفاعل إلى 140 درجة مئوية، ثم أُطلقت الأمونيا بسرعة، مما سمح للكتلة الحيوية بالعودة سريعًا إلى درجة حرارة الغرفة. كان تركيب سيقان الذرة المعالجة مسبقًا بتقنية AFEX (ACS) مشابهًا لتركيب سيقان الذرة غير المعالجة (UT-CS).
تم تحضير مادة ACSH عالية الصلابة بنسبة 25% (وزن/وزن) (تحميل ديكستران بنسبة 8% تقريبًا) كمادة أولية لإنتاج السكريات قليلة التعدد على نطاق واسع. أُجري التحلل الإنزيمي لـ ACS باستخدام مزيج إنزيمي تجاري يتضمن Cellic® Ctec2 بتركيز 10 ملغ بروتين/غرام غلوكان (في الكتلة الحيوية المعالجة مسبقًا)، وHtec2 (نوفوزيمز، فرانكلينتون، كارولاينا الشمالية) بتركيز 5 ملغ بروتين/غرام غلوكان، وMultifect Pectinase (جينينكور، الولايات المتحدة الأمريكية). أُجري التحلل الإنزيمي في مفاعل حيوي سعة 5 لترات بحجم تشغيل 3 لترات، عند درجة حموضة 4.8، ودرجة حرارة 50 درجة مئوية، وسرعة دوران 250 دورة في الدقيقة. بعد عملية التحلل المائي التي استمرت 96 ساعة، جُمع المحلول الناتج عن طريق الطرد المركزي بسرعة 6000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة، ثم بسرعة 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة أخرى لإزالة المواد الصلبة غير المتحللة. بعد ذلك، خضع المحلول لعملية ترشيح معقمة باستخدام مرشح بمسام 0.22 مم. حُفظ المحلول المرشح في زجاجات معقمة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ثم فُصل باستخدام الكربون.
تحليل تكوين عينات الكتلة الحيوية القائمة على المستخلص وفقًا لإجراءات التحليل المختبري NREL: إعداد العينات لتحليل التركيب (NREL/TP-510-42620) وتحديد الكربوهيدرات الهيكلية واللجنين في الكتلة الحيوية (NREL/TP-510 – 42618)47.
أُجري تحليل قليل السكريات في تيار المُحلَّل المائي على نطاق 2 مل باستخدام طريقة التحلل المائي الحمضي في جهاز التعقيم بالبخار. يُخلط مُستخلص المُحلَّل المائي مع 69.7 ميكرولتر من حمض الكبريتيك بتركيز 72% في أنبوب اختبار سعة 10 مل ذي غطاء لولبي، ويُحضن لمدة ساعة واحدة على سطح طاولة عند درجة حرارة 121 درجة مئوية، ثم يُبرد على الجليد ويُرشح في قارورة جهاز كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC). حُدِّد تركيز قليل السكريات بطرح تركيز السكريات الأحادية في العينة غير المُحلَّلة من إجمالي تركيز السكريات في العينة المُحلَّلة حمضياً.
تم تحليل تركيزات الجلوكوز والزيلوز والأرابينوز في الكتلة الحيوية المُحللة حمضياً باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) من شركة شيمادزو، مزود بجهاز أخذ عينات تلقائي، وسخان عمود، ومضخة متساوية التركيز، وكاشف معامل انكسار، على عمود Bio-Rad Aminex HPX-87H. حُفظ العمود عند درجة حرارة 50 درجة مئوية، وتم غسله بتدفق 0.6 مل/دقيقة من محلول حمض الكبريتيك (H2SO4) بتركيز 5 ملي مولار في الماء.
تم تخفيف الراشح الناتج عن التحلل المائي وتحليله لتحديد محتواه من السكريات الأحادية والسكريات قليلة الوحدات. وتم تحليل السكريات الأحادية الناتجة عن التحلل المائي الأنزيمي باستخدام جهاز كروماتوغرافيا سائلة عالي الأداء (HPLC) مزود بعمود Aminex HPX-87P من شركة Bio-Rad (هيركوليس، كاليفورنيا) وعمود حماية من الرماد. وحُفظت درجة حرارة العمود عند 80 درجة مئوية، واستُخدم الماء كمرحلة متحركة بمعدل تدفق 0.6 مل/دقيقة. أما السكريات قليلة الوحدات، فقد تم تحديدها عن طريق التحلل المائي في حمض مخفف عند 121 درجة مئوية وفقًا للطرق الموضحة في المراجع 41 و48 و49.
أُجري تحليل السكريات على مخلفات الكتلة الحيوية الخام، والمعالجة مسبقًا بتقنية AFEX، وجميع مخلفات الكتلة الحيوية غير المُحللة (بما في ذلك إنتاج مستخلصات جدار الخلية المتسلسلة وفحصها باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة) باستخدام الإجراءات الموصوفة سابقًا 27، 43، 50، 51. ولتحليل الجليكوم، تُحضّر مخلفات جدار الخلية النباتية غير القابلة للذوبان في الكحول من مخلفات الكتلة الحيوية، وتُخضع لاستخلاص متسلسل باستخدام كواشف ذات فعالية متزايدة، مثل أكسالات الأمونيوم (50 ملي مولار)، وكربونات الصوديوم (50 ملي مولار و0.5% وزن/حجم)، ومحلول CON (1 مولار و4 مولار، كلاهما مع 1% وزن/حجم من بوروهيدريد الصوديوم)، وحمض الكلوريت، كما هو موضح سابقًا 52، 53. ثم خضعت المستخلصات لاختبار ELISA ضد مجموعة معقدة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة إلى جليكان جدار الخلية، وعُرضت تفاعلات ارتباط الأجسام المضادة على شكل خريطة حرارية. تم شراء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تستهدف جليكانات جدار الخلية النباتية من مخزونات المختبر (سلسلة CCRC و JIM و MAC).
عملية بيوتينية أحادية الخطوة للسكريات قليلة الوحدات. تم ربط الكربوهيدرات ببيوتين-LC-هيدرازيد باتباع الإجراء التالي: تم إذابة بيوتين-LC-هيدرازيد (4.6 ملغ/12 ميكرومول) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO، 70 ميكرولتر) مع التحريك المستمر والتسخين عند 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. أُضيف حمض الخليك الجليدي (30 ميكرولتر)، ثم صُب المزيج فوق سيانوبوروهيدريد الصوديوم (6.4 ملغ/100 ميكرومول) وذاب تمامًا بعد التسخين عند 65 درجة مئوية لمدة دقيقة تقريبًا. بعد ذلك، أُضيف من 5 إلى 8 ميكرولتر من مزيج التفاعل إلى السكريات قليلة الوحدات المجففة (1-100 نانومول) للحصول على فائض مولاري من العلامة بمقدار 10 أضعاف أو أكثر مقارنةً بالطرف المختزل. أُجري التفاعل عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة ساعتين، ثم نُقّيت العينات فورًا. لم يُستخدم سيانوبوروهيدريد الصوديوم في تجارب الوسم دون اختزال، وخضعت العينات للتفاعل عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة ساعتين ونصف.
طلاء وغسل عينات السكريات قليلة الوحدات المُؤَشَّرة بالبيوتين في اختبار ELISA. أُضيف 25 ميكرولتر من العينات المُؤَشَّرة بالبيوتين (100 ميكرولتر من كل عينة مُرَكَّزة مُخَفَّفة في 5 مل من محلول Tris المُخَفِّف بتركيز 0.1 مولار) إلى كل بئر من آبار الصفيحة المُغَطَّاة بالأفيدين. طُليت آبار التحكم بـ 50 ميكرولتر من البيوتين بتركيز 10 ميكروغرام/مل في محلول Tris المُخَفِّف بتركيز 0.1 مولار. استُخدم الماء منزوع الأيونات كطلاء للقياسات الفارغة. حُضِّن القرص لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غُسلت الصفيحة 3 مرات بحليب خالي الدسم بنسبة 0.1% في محلول Tris المُخَفِّف بتركيز 0.1 مولار باستخدام البرنامج رقم 11 لجهاز Grenier flat 3A.
إضافة الأجسام المضادة الأولية وغسلها. أضف 40 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي إلى كل بئر. حضّن الصفيحة الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم غُسلت الصفائح 3 مرات بمحلول حليب 0.1% في محلول TBS 0.1 مولار باستخدام برنامج الغسل رقم 11 لصفائح Grenier Flat 3A.
أضف الأجسام المضادة الثانوية واغسل. أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية للفأر/الجرذ (مخففة بنسبة 1:5000 في حليب بنسبة 0.1% في محلول ملحي 0.1 مولار) إلى كل بئر. حضّن الصفيحة الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم غُسلت الصفائح الدقيقة 5 مرات بحليب بنسبة 0.1% في محلول ملحي 0.1 مولار باستخدام برنامج غسل الصفائح Grenier Flat 5A رقم 12.
إضافة الركيزة. أضف 50 ميكرولتر من 3،3'،5،5'-رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) إلى الركيزة الأساسية (بإضافة قطرتين من المحلول المنظم، و3 قطرات من TMB، وقطرتين من بيروكسيد الهيدروجين إلى 15 مل من الماء منزوع الأيونات). حضّر ركيزة TMB (وقم بالرجّ جيدًا قبل الاستخدام). حضّن الصفيحة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
أكمل الخطوة واقرأ القرص. أضف 50 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 1N إلى كل بئر وسجل الامتصاص من 450 إلى 655 نانومتر باستخدام قارئ ELISA.
حضّر محاليل بتركيز 1 ملغم/مل من هذه المواد التحليلية في ماء منزوع الأيونات: أرابينوز، رامنوز، فوكوز، زيلوز، حمض جالاكتيورونيك (GalA)، حمض جلوكورونيك (GlcA)، مانوز، جلوكوز، جالاكتوز، لاكتوز، N-أسيتيل مانوزامين (manNAc)، N-أسيتيل جلوكوزامين (glcNAc)، N-أسيتيل جالاكتوزامين (galNAc)، إينوزيتول (معيار داخلي). تم تحضير معيارين بإضافة محاليل السكر بتركيز 1 ملغم/مل الموضحة في الجدول 1. تُجمّد العينات وتُجفف بالتجميد عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى إزالة الماء تمامًا (عادةً ما يستغرق ذلك حوالي 12-18 ساعة).
أضف 100-500 ميكروغرام من العينة إلى أنابيب ذات أغطية لولبية على ميزان تحليلي. سجّل الكمية المضافة. يُفضّل إذابة العينة في تركيز مُحدّد من المذيب وإضافتها إلى الأنبوب كجزء سائل. استخدم 20 ميكرولتر من محلول إينوزيتول بتركيز 1 ملغ/مل كمعيار داخلي لكل أنبوب عينة. يجب أن تكون كمية المعيار الداخلي المُضافة إلى العينة مساوية لكمية المعيار الداخلي المُضافة إلى أنبوب المعيار.
أضف ٨ مل من الميثانول اللامائي إلى قارورة ذات غطاء لولبي. ثم أضف ٤ مل من محلول حمض الهيدروكلوريك الميثانولي بتركيز ٣ مولار، وأغلق القارورة ورجّها جيداً. لا تستخدم هذه العملية الماء.
أضف 500 ميكرولتر من محلول حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1 مولار في الميثانول إلى عينات السكريات قليلة الوحدات وأنابيب TMS القياسية. حُضنت العينات طوال الليل (168 ساعة) عند 80 درجة مئوية في حاضنة حرارية. جفف ناتج التحلل الميثانولي في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجفف. أضف 200 ميكرولتر من الميثانول وجفف مرة أخرى. تُكرر هذه العملية مرتين. أضف 200 ميكرولتر من الميثانول، و100 ميكرولتر من البيريدين، و100 ميكرولتر من أنهيدريد الخل إلى العينة واخلط جيدًا. حُضنت العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ثم جُففت. أضف 200 ميكرولتر من الميثانول وجفف مرة أخرى.
أضف 200 ميكرولتر من محلول Tri-Sil، ثم سخّن الأنبوب لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 80 درجة مئوية، ثم برّده إلى درجة حرارة الغرفة. استخدم جهاز تجفيف لتجفيف العينة حتى يصل حجمها إلى حوالي 50 ميكرولتر. تجدر الإشارة إلى أننا لم نترك العينات تجف تمامًا.
أضف 2 مل من الهكسان واخلط جيدًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. املأ رؤوس ماصات باستور (5-8 مم) بقطعة من الصوف الزجاجي عن طريق إدخال الصوف الزجاجي في أعلى ماصة قطرها 5.75 بوصة. تم طرد العينات مركزيًا عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. تترسب أي رواسب غير ذائبة. جفف العينة حتى يصل حجمها إلى 100-150 ميكرولتر. تم حقن حجم 1 ميكرولتر تقريبًا في جهاز كروماتوغرافيا الغاز-مطياف الكتلة عند درجة حرارة ابتدائية 80 درجة مئوية وزمن ابتدائي دقيقتين (الجدول 2).